JP2018186833A

JP2018186833A - Ｆｃγ受容体ＩＩＢ変異体

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Publication number: JP2018186833A
Application number: JP2018149864A
Authority: JP
Inventors: ペーターゾンダーマン; Sondermann Peter; メーアドミニクター; Ter Meer Dominik; トマスポール; Pohl Thomas; レノヴィンター; Winter Reno; ウーベヤコブ; Jacob Uwe
Original assignee: Suppremol GmbH
Current assignee: Suppremol GmbH
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2018-08-09
Publication date: 2018-11-29
Also published as: PT2914624T; EA201590845A1; HUE032786T2; LT2914624T; KR102170674B1; JP6423351B2; JP2016503289A; HK1209765A1; AU2013340831B2; EP2914624A1; WO2014068012A1; BR112015008815A2; CA2887164A1; US20140120080A1; RS56075B1; CN104918955B; AU2013340831A1; HRP20170894T1; ES2628049T3; CL2015001127A1

Abstract

【課題】優れたCMC特性を有するヒトFcγRIIBタンパク質を提供する。【解決手段】特定の塩基配列を有する核酸にコードされるＦｃγ受容体ＩＩＢ変異体タンパク質を提供する。前記核酸配列を含むベクター、および前記核酸配列または前記ベクターを含む宿主細胞をも提供する。さらに前記Ｆｃγ受容体ＩＩＢ変異体タンパク質を含む薬学的組成物および薬学的組成物を製造方法を提供する。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列、前記核酸配列を含むベクター、および前記核酸配列または前記ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、宿主細胞における前記核酸配列または前記ベクターの発現によって得られた、または得ることができるタンパク質に関する。さらに、本発明は、SEQ ID NO:6の核酸配列によってコードされるタンパク質に関する。さらに本発明に含まれるものは、薬学的組成物および薬学的組成物を製造する方法である。さらに、本発明は、SEQ ID NO:2および/または3のタンパク質を含む組成物に関する。前記組成物はSEQ ID NO:4 および/または5のタンパク質をさらに含んでもよい。

背景
FcγRは、感染からヒト生物を防御するのに重要なFc受容体(FcR)ファミリーに属する。一般的に、FcγRの活性化とFcγRの阻害は区別されなければならない。ヒトにおける3つの主なFcγRのうち、FcγRIは単量体IgGに結合することができるのに対して、FcγRIIおよびFcγRIIIは、抗体および抗原からなる多価免疫複合体(IC)に結合する(Takai, T. Nature Reviews Immunology 2002: 580-592(非特許文献1))。FcγRによって誘発されるエフェクター機能には、発現されるFcRタイプおよび関連するタンパク質に応じて、エンドサイトーシスとその後の病原体中和および抗原提示、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、メディエーターの分泌または抗体生成の調節が含まれる(Fridman et al. Immunol Rev. 1992125:49-76(非特許文献2), van de Winkel and Capel Immunol Today. 1993: 14(5):215-21(非特許文献3))。

WO00/32767(特許文献1)は、受容体の細胞外部分のみからなり、グリコシル化されていない可溶性Fc受容体(FcR)について説明する。膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドが存在しないために、これらのタンパク質は可溶型で存在し、細胞に結合しない。さらに、WO00/32767に記載のFcRは組換えにより生成することができ、免疫系の他の成分に干渉することなく抗体Fc部分に結合することができるので自己免疫疾患の治療について提案されている。さらに、WO00/32767は、ある特定のFcRの結晶構造、およびこれらの結晶構造の助けを借りてIgGとFcRとの相互作用を阻害する物質を発見する可能性について説明する。結晶構造が解明されると、利用可能なコンピュータプログラムを用いてデータベースをスクリーニングすることによって、このような阻害剤を発見することが可能になる。WO03/043648(特許文献2)において定義された発明はWO00/32767の発見をさらに発展させ、特に、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、および慢性関節リウマチ(RA)のような疾患に対する治療方法を提供し、高レベルのナチュラルキラー細胞をもつ疾患に対する治療方法も提供する。

前記受容体が原核生物において組換えにより生成され、従って、グリコシル化されていないときに、驚いたことに、WO03/043648の発明者らは、非グリコシル化タンパク質の溶解度が低いと予想されたのもかかわらず、高濃度のFcγRが可溶型をとって前記受容体を精製できることを発見した。WO03/043648および他の刊行物は、FcRが免疫系の防御反応において重要な役割を果たしていることを記録している。

Fc受容体は免疫系において中心的な役割を果たしており、免疫応答の程度および強さを制御する。特に、可溶性(すなわち、Fcγ受容体IIBの細胞外部分)Fcγ受容体IIB(sFcγRIIB)は、免疫細胞上で発現しているFcγRと病原性免疫複合体において競合し、自己免疫疾患の治療において有益であるということが判明した。自己免疫疾患で起こる免疫反応の初期段階において干渉が生じると、炎症および組織破壊の原因となるカスケードの誘発が阻止される。具体的には、この間に、適応症である一次性免疫性血小板減少症(ITP)および全身性エリテマトーデス(SLE)に対するsFcγRIIBの第2相臨床試験が行われている。一般に知られているように、臨床試験の場合、生物学的材料、ここではsFcγRIIBは、好ましくは、優れた化学、製造および品質管理(CMC)特性、例えば、高い純度および精製中の安定性を有することが必要とされる。

従って、本発明の目的は、優れたCMC特性を有するヒトFcγRIIBタンパク質を提供することであった。この目的は、特許請求の範囲において反映され、本明細書において説明され、実施例および図面において例示される態様によって解決される。

驚いたことに、本明細書に記載のタンパク質のようなタンパク質について、1.5Mを上回る硫酸アンモニウム濃度での溶解度が高いために高い精製率を実現できることが示されている。多量の汚染タンパク質を除去するために、多くの精製法における第1の工程として硫安沈殿が有用である。硫酸アンモニウム濃度が高ければ高いほど、高純度のタンパク質を目標としているときにはうまくいくが、硫酸アンモニウムの高いイオン強度のためにタンパク質には大きなストレスがかかる。従って、タンパク質のストレス耐性が高ければ高いほど、硫酸アンモニウム濃度は高くなる可能性があり、従って、タンパク質純度は高くなるだろう。具体的には、コスモトロピック硫酸アンモニウムを添加することによって、折り畳まれていない種および誤って折り畳まれた種などの副産物だけでなく、細胞壁成分およびタンパク質のような宿主細胞由来不純物が沈殿される。沈殿剤濃度が増加するにつれて、沈殿効率は高まり、従って、関心対象のタンパク質が、このような高い硫酸アンモニウム濃度における沈殿に耐性がある限り、高度に精製されたタンパク質調製物が得られる。言われたように、驚いたことに、本明細書に記載のFcRタンパク質は、1.5Mに等しい、または1.5Mを上回る硫酸アンモニウム濃度において溶解度が高いということが判明した。実施例に示したように先行技術FcRタンパク質が異なったようにふるまい、利用可能なものが何であっても、その挙動および特性を有するように、本発明によって提供されるFcRタンパク質と同程度にFcRタンパク質を改変するガイダンスがなかったので、このことは予想外のことであった。言われたように、本発明者らがたいへん驚いたことには、本明細書に記載のタンパク質には確かに高い硫酸アンモニウム濃度に対する耐性があり、それによって、WO00/32767またはWO03/043648に記載のFcγRIIBタンパク質などの先行技術FcγRIIBタンパク質と比較して、うまく精製されるということが判明した。

WO00/32767 WO03/043648

Takai, T. Nature Reviews Immunology 2002: 580-592 Fridman et al. Immunol Rev. 1992125:49-76 van de Winkel and Capel Immunol Today. 1993: 14(5):215-21

本発明の簡単な説明
本発明は、SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列に関する。本発明はまた、SEQ ID NO:2、3、4、5、または9に示したタンパク質をコードする核酸配列を提供する。SEQ ID NO:6に示した核酸配列はSEQ ID NO:1のタンパク質をコードする。

本発明はまた、SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターに関する。本発明はまた、SEQ ID NO:2、3、4、5、または9のタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターに関する。

さらに、本発明はまた、宿主細胞、好ましくは、原核生物宿主細胞、より好ましくは、大腸菌におけるSEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列または本発明のベクターの発現によって得られた、または得ることができるタンパク質に関する。

さらに、本発明はまた、SEQ ID NO:6の核酸配列によってコードされるタンパク質に関する。

本発明はまた、宿主細胞におけるSEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列もしくは本発明のベクターの発現によって得られた、もしくは得ることができるタンパク質、またはSEQ ID NO:6の核酸配列によってコードされるタンパク質を含む、薬学的組成物に関する。

さらに、本発明は、SEQ ID NO:2および/または3のタンパク質を含む組成物に関する。好ましくは、組成物は薬学的組成物である。

1つの態様において、本発明の組成物は、SEQ ID NO:4および/または5のタンパク質をさらに含む。好ましくは、組成物は薬学的組成物である。

別の態様において、本発明の組成物は、SEQ ID NO:3のタンパク質の量を上回るSEQ ID NO:2のタンパク質の量を有する。

別の態様において、本発明の組成物は、SEQ ID NO:3のタンパク質の量を上回るSEQ ID NO:2のタンパク質の量、ならびにSEQ ID NO:4および/または5の量を上回るSEQ ID NO:2および3のタンパク質の量を有する。

また、本発明は、SEQ ID NO:9のタンパク質を含む組成物に関する。好ましくは、組成物は薬学的組成物である。

本発明はまた、SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列を含む宿主細胞または請求項1の核酸配列を含む本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、SEQ ID NO:2、3、4、5、もしくは9のタンパク質をコードする核酸配列を含む宿主細胞またはSEQ ID NO:2、3、4、5、もしくは9のタンパク質をコードする核酸配列を含む本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。

1つの態様において、本発明の宿主細胞は原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞である。

本発明の別の態様において、原核生物宿主細胞は、大腸菌、好ましくは、大腸菌BL21、例えば、BL21(DE3)である。

本発明はまた、コードされるタンパク質の発現を可能にする条件下で、本発明の宿主細胞を培養する工程および得られた薬学的組成物を回収する工程を含む、薬学的組成物を製造する方法に関する。
[本発明1001]
SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする、核酸配列。
[本発明1002]
本発明1001の核酸配列を含む、ベクター。
[本発明1003]
宿主細胞における本発明1001の核酸配列または本発明1002のベクターの発現によって得られた、または得ることができる、タンパク質。
[本発明1004]
宿主細胞が原核生物宿主細胞である、本発明1003のタンパク質。
[本発明1005]
宿主細胞が大腸菌である、本発明1003または1004のタンパク質。
[本発明1006]
SEQ ID NO:6の核酸配列によってコードされる、タンパク質。
[本発明1007]
本発明1003または1004のタンパク質を含む、薬学的組成物。
[本発明1008]
SEQ ID NO:2および/または3のタンパク質を含む、組成物。
[本発明1009]
SEQ ID NO:4および/または5のタンパク質をさらに含む、組成物。
[本発明1010]
SEQ ID NO:2のタンパク質の量がSEQ ID NO:3のタンパク質の量より多い、本発明1008の組成物。
[本発明1011]
SEQ ID NO:2および3のタンパク質の量がSEQ ID NO:4および/または5のタンパク質の量より多い、本発明1008〜1010いずれかの組成物。
[本発明1012]
本発明1001の核酸配列または本発明1002のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1013]
原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞である、本発明1012の宿主細胞。
[本発明1014]
大腸菌である、本発明1012の原核生物宿主細胞。
[本発明1015]
大腸菌BL21である、本発明1014の原核生物宿主細胞。
[本発明1016]
コードされるタンパク質の発現を可能にする条件下で本発明1012〜1015いずれかの宿主細胞を培養する工程および得られた薬学的組成物を回収する工程を含む、薬学的組成物を製造する方法。

a)ヒトsFcγRIIBの結晶構造(PDBエントリ:2FCB)。この研究において試験した全sFcR変異体に同一の、変異体1のアミノ酸配列(SEQ ID NO:7)によってされた不変コア構造を濃い灰色で示した。IgG結合に重要であると想像されるループを薄い灰色で図示した。N末端延長およびC末端延長を黒色で示した。2つのジスルフィド架橋をボール＆スティック表示で示した。試験した全変異体間のコア構造の同一性は、図1bに示した配列アラインメントからでも明らかである。b)この研究において使用したsFcR変異体1〜4(「変異体」と略した)の配列アラインメント。SEQ ID NO:をSEQと略した。 FcR沈殿スクリーニングからの結果。FcR変異体1〜4を、25℃ならびに示されたpHおよび硫酸アンモニウム濃度で1時間インキュベートした。遠心分離後、上清中のFcR含有率をOD₂₈₀測定によって求め、硫酸アンモニウム濃度に対してプロットした。

配列
以下の配列は、本明細書において用いられる配列の概略を示す。

本発明の詳細な説明
本明細書で使用する単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、特に文脈によってはっきり示されていない限り複数の言及を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「1つの試薬」についての言及は、このような異なる試薬の1つまたは複数を含み、「その試薬」についての言及は、本明細書に記載の方法の代わりに改変または使用することができる、当業者に公知の等価な工程および方法についての言及を含む。

本開示において引用された全ての刊行物および特許は、その全体が参照により組み入れられる。参照により組み入れられる資料が矛盾するか、または本明細書と一致しない範囲まで、本明細書は、このような資料に取って代わる。

特に定めのない限り、一連の要素の前にくる「少なくとも」という用語は、一連の要素の中にある全ての要素について言及していると理解しなければならない。当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識するか、または日常的な実験にすぎない実験を用いて突き止めることができるだろう。このような均等物は本発明に包含されることが意図される。

以下の本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、特に文脈によって必要とされない限り、単語「含む(comprise)」ならびに「含む(comprises)」および「含む(comprising)」などの語尾変化は、述べられた整数もしくは工程または整数もしくは工程の集まりを含むことを意味するが、他の任意の整数もしくは工程または整数もしくは工程の集まりを排除することを意味しないことが理解されるだろう。本明細書において用いられるとき、「含む(comprising)」という用語は、「含有する(containing)」という用語で置換されてもよく、時として、本明細書において用いられるとき「有する(having)」という用語で置換されてもよい。

本明細書において用いられるとき、「からなる」は、クレームエレメントにおいて明記されていない要素、工程、または成分を排除する。本明細書において用いられるとき、「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的な、かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料も工程も排除しない。

本明細書における、それぞれの場合において、「を含む」、「から本質的になる」、および「からなる」という用語はいずれも、他の2つの用語のいずれかと取り替えることができる。

いくつかの文書が本明細書の本文全体を通して引用される。上記または下記に関係なく、本明細書において引用された文書(全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書などを含む)はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書には、先行発明に基づいて本発明がこのような開示に先行する権利がないと認められると解釈されるものは何もない。

第1の局面において、本発明は、SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列に関する。

本明細書で使用する「核酸」および「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、DNA分子(例えば、cDNAもしくはゲノムDNA)、RNA分子(例えば、mRNA)、DNA分子およびRNA分子の組み合わせ、またはハイブリッドDNA/RNA分子、ならびにDNA分子もしくはRNA分子の類似体を含む。このような類似体は、例えば、イノシンまたはトリチル化塩基を含むが、これに限定されないヌクレオチド類似体を用いて作製することができる。このような類似体はまた、有益な特質、例えば、ヌクレアーゼ耐性または細胞膜を通過する高い能力を分子に与える改変されたバックボーンを含むDNA分子またはRNA分子を含んでもよい。核酸またはヌクレオチド配列は一本鎖、二本鎖でもよく、一本鎖部分および二本鎖部分を両方とも含有してもよく、三本鎖部分を含有してもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。

様々な改変をDNAおよびRNAに加えることができる。従って、「核酸分子」または「核酸配列」という用語は、化学的に、酵素的に、または代謝的に改変された形を含む。例えば、本発明の核酸分子または核酸配列は翻訳後または転写後に改変されてもよい。

本発明の核酸配列は、SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする。SEQ ID NO:1によってコードされるポリペプチドの配列は、SEQ ID NO:1によってコードされるポリペプチドを発現する宿主細胞に応じて翻訳後修飾または転写後修飾により修飾されてもよい。

本明細書において用いられるとき、Xが1、2、3、4、5、または9である「SEQ ID NO:Xのタンパク質」とは、Xが1、2、3、4、5、または9であるSEQ ID NO:Xに示された、または図示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。

本明細書において用いられるとき「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、同義に用いられ、かつ所定の長さのアミノ酸鎖を含むペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを意味する。ここで、アミノ酸残基はペプチド共有結合によって連結される。しかしながら、アミノ酸および/またはペプチド結合が機能的類似体ならびに20種類の遺伝子によってコードされているアミノ酸以外のアミノ酸、例えば、セレノシステインによって交換されている、このようなタンパク質/ポリペプチドのペプチドミメティックも本発明に包含される。ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質はポリペプチドと呼ばれることがある。述べられたように、ポリペプチドおよびタンパク質という用語は本明細書において同義に用いられることが多い。ポリペプチドという用語はまたポリペプチドの修飾を指し、これを排除しない。修飾には、グリコシル化、アセチル化、アシル化、リン酸化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール(phosphotidylinositol)の共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、共有結合架橋の形成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、製剤(formulation)、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化(selenoylation)、硫酸化、トランスファーRNAを介したタンパク質へのアミノ酸付加、例えば、アルギニル化、およびユビキチン結合が含まれる。例えば、PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983), pgs. 1-12; Seifter, Meth. Enzymol. 182 (1990); 626-646, Rattan, Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992); 48-62を参照されたい。

本発明のタンパク質をSEQ ID NO:1、2、3、4、5、または9に示した。従って、本発明は、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、または9に示したタンパク質を提供する。

「発現」または「核酸配列の発現」という用語は、特定の核酸または特定の遺伝子構築物の転写を意味する。「発現」または「核酸発現」という用語は、特に、SEQ ID NO:1の核酸を含むベクターのような核酸配列または遺伝子構築物から構造RNA(rRNA、tRNA)またはmRNAへの転写と、それに続く構造RNA(rRNA、tRNA)もしくはmRNAからタンパク質の翻訳、またはSEQ ID NO:1の核酸を含むベクターのような核酸配列または遺伝子構築物から構造RNA(rRNA、tRNA)またはmRNAへの転写のみを意味する。次いで、好ましくは、タンパク質は翻訳される。前記プロセスは、DNA転写および結果として生じたmRNA産物のプロセシングを含む。次いで、mRNAはポリペプチド鎖に翻訳され、最終的に、最終ポリペプチド/タンパク質に折り畳まれる。タンパク質発現は、ある特定の細胞または組織における1つまたは複数のタンパク質の存在および量の測定を指すためにプロテオミクス研究者によって一般的に用いられる。細胞のタンパク質の発現は、様々な手段によって、例えば、免疫組織化学またはウエスタンブロット分析を用いて測定することができる。ここで、得られた結果は、モックトランスフェクト細胞と比較して、本発明の核酸を含むベクターでトランスフェクトされた細胞によって評価することができる。高発現(宿主)細胞は、同じ環境の対照細胞(モック)と比較したときに増加した、例えば、強度が増加した染色を示す。mRNAの発現も、例えば、RT-PCRによって測定することができる。当業者は、細胞のある特定のタンパク質またはmRNAの発現を確かめる様々な技法を知っている。転写後修飾または翻訳後修飾により得られたタンパク質も想定される。

ポリペプチドの「変異体」は、前記ポリペプチドと比較して1つまたは複数のアミノ酸残基が置換された、好ましくは、保存的に置換されたポリペプチドを含み、前記変異体は、好ましくは、抗体のFc部分(FcγRの結合を参照されたい)に結合することができ、おそらく、リンパ球に結合することができる。このような変異体には、当技術分野において公知の一般原則に従って選択された欠失、挿入、逆位、反復、および置換が含まれる。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作り方に関するガイダンスは、Bowie, Science 247: (1990) 1306-1310に示されている。ここで、著者らは、変更するアミノ酸配列の許容範囲を研究するための2つの主な戦略があることを示している。FcγRIIBの好ましい変異体をSEQ ID NO:1、2、3、4、5、または9に示した。SEQ ID NO:1に示したFcγRIIBが好ましい。

「Fcγ受容体」という用語は、本明細書において「FcgR」または「Fcγ受容体」または「FcγR」と同義に用いられ、膜FcγRおよび可溶性(すなわち、Fcγ受容体の細胞外部分)FcγRの両方を含む。Fcγ受容体はタンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、多くの造血系列上に見出される。その名前が表すように、Fc受容体は、抗体のFc(断片、結晶可能)部分、すなわち、抗体の2本の重鎖の2つのC末端ドメインに対応し、典型的には、エフェクター分子および細胞と相互作用する断片を認識し、結合する。

SEQ ID NO:1のタンパク質は可溶性FcγRであることが好ましい。同様に、SEQ ID NO:2、3、4、5、または9のタンパク質は可溶性FcγRであることが好ましい。SEQ ID NO:1、2、3、4、5、または9のタンパク質はそれ自体で、水性液体などの適切な液体に溶けることも好ましい。

FcγRはIgG抗体を認識する。ヒトには、血清中量の順で命名された4つのIgGサブクラス(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG1は最も豊富なIgGタイプである)がある。ヒトには、3つのFcγRクラス:FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、およびFcγRIIIA(CD16)がある。さらに、FcγRは、様々なアイソフォーム、すなわち、類似しているが、同一のアミノ酸配列でない機能的に類似するFcγ受容体の形で生じる。前記アイソフォームには、FcγRIA、B1、B2、C;FcγRIIA1-2、B1-3、C、さらに、いくつかの対立遺伝子(FcγRIIa1-HR、-LR; FcγRIIIb-NA1,-NA2)が含まれる(van de Winkel and Capel, Immunol. Today 1993, 14:215-221)。FcγRの異なるクラスおよびアイソフォームは、IgGに対する親和性、具体的には、異なるIgGサブクラスに対する親和性の点で異なる場合がある。典型的に、FcγRはI型膜貫通タンパク質として、または可溶型として生じるが、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型FcγRIII(FcγRIIIB)も存在する。

「可溶性FcγR」は「sFcγR」とも呼ばれる。本明細書で使用する「可溶性Fcγ受容体」という用語および類似用語はFcγ受容体の細胞外部分を指す。このような部分は液体に溶解することができる。一般的に、任意のFcγRクラス、アイソフォーム、または対立遺伝子の可溶型は、前にある「s」によって特定することができる。例えば、sCD32またはsFcγRIIとは可溶性FcγRII受容体を指す。典型的に、膜(すなわち、膜結合)FcγRとは対照的に、可溶性FcγRは膜貫通領域または細胞質内テールを含まない。

好ましくは、本発明のFcγRはヒト由来である、すなわち、ヒトFcγRである。「ヒト由来」という用語は最も広い意味で解釈される。一般的に、「ヒト由来」とは、FcγR(またはその領域もしくは断片)が、アミノ酸配列および/または構造の点でヒトFcγR(すなわち、ヒト体内で見出されるタンパク質)に似ているか、類似していることを意味する。

または、「ヒト由来」FcγRは、例えば、Sondermann and Jacob (1999)、Biol l. Chem. 380(6)、717-721に記載のように、宿主細胞における組換え核酸の発現によって得られた組換えFcγRでもよい。簡単に述べると、関心対象の遺伝子は生物から得られ、ベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスに導入され、次いで、これを用いて遺伝子が宿主細胞に導入され、宿主細胞は組換え遺伝子を発現し、組換えタンパク質産物を生成する。当業者であれば、FcγR、例えば、薬学的組成物の調製に適したFcγRを得るために、どの宿主細胞を選択すべきかが容易に分かるだろう。例えば、一部の態様において、非グリコシル化FcγRが望ましい場合がある。次いで、当業者であれば、タンパク質グリコシル化に必要な酵素機構を欠く、FcγR発現のための原核生物宿主細胞を選択することができる。1つの態様では、WO00/32767の説明に従って、FcγRを原核生物において発現させ、その後に精製し、再び折り畳むことができる。

別の態様において、FcγRは真核生物発現系において高純度で容易かつ安価に生成することができる。有用な系には、細胞外タンパク質生成のための特殊な装置を有する真核生物、例えば、B細胞が含まれる。可能性のある他の真核生物発現系には、CHO細胞またはHEK細胞が含まれるが、これに限定されない。従って、前記可溶性FcγRは組換え可溶性グリコシル化FcγRである。

本明細書において言及されるFcγRは、野生型FcγRと比較して、アミノ酸配列について改変または変化されており、例えば、さらなるグリコシル化部位などを含むFcγRをさらに含む。しかしながら、非グリコシル化型FcγRも想定され、FcγRの好ましい態様である。

本発明のFcγ受容体は、SEQ ID NO:1に示したアミノ酸配列(本明細書において変異体3とも呼ばれるSM101のアミノ酸配列)の少なくとも1つを含む。本発明のFcγRは、SEQ ID NO:6の核酸配列(本明細書において変異体3とも呼ばれるSM101をコードする核酸配列)の少なくとも1つによってコードされる。これらの配列は、組換え発現によって対応するFcγRを生成するように発現ベクターにクローニングされてもよい。

本発明はまた、SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターに関する。このようなベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、または別のベクター、例えば、遺伝子工学において従来より用いられる別のベクターでもよく、さらなる遺伝子、例えば、適切な宿主細胞において、かつ適切な条件下で前記ベクターの選択および/または複製を可能にするマーカー遺伝子を含んでもよい。好ましい態様において、前記ベクターは発現ベクターであり、発現ベクターの中で、本発明の核酸分子は、本明細書に記載の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞における発現を可能にする発現制御配列に機能的に連結されている。「機能的に連結された」という用語は、この文脈において用いられたとき、発現制御配列と適合する条件下で発現がなされるように、発現されるポリヌクレオチド中の1つまたは複数の発現制御配列とコード領域との間の連結を指す。

従って、本発明の核酸分子は、いくつかの市販のベクターに挿入されてもよい。非限定的な例には、哺乳動物細胞と適合するプラスミドベクター、例えば、pUC、pBluescript(Stratagene)、pET(Novagen)、pREP(Invitrogen)、pCRTopo(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMClneo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pUCTag、pIZD35、pLXINおよびpSIR(Clontech)、ならびにpIRES-EGFP(Clontech)が含まれる。好ましくは、本発明の核酸分子はベクター「pET」にIPTG誘導性T7プロモーターの制御下で挿入される。バキュロウイルスベクター、例えば、pBlueBac、BacPacz Baculovirus Expression System (CLONTECH)およびMaxBacTM Baculovirus Expression System、昆虫細胞およびプロトコール(Invitrogen)が市販されており、これも高収率の生物学的に活性なタンパク質を生成するために使用することができる(Miller (1993), Curr. Op. Genet. Dev., 3, 9; O'Reilly, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, p.127も参照されたい)。さらに、原核生物ベクター、例えば、pcDNA2;および酵母ベクター、例えば、pYes2は、本発明と使用するのに適した他のベクターの非限定的な例である。

本願の他の好ましい発現ベクターは、当技術分野において周知のショウジョウバエ(Drosophila)細胞においてタンパク質を発現させるための発現ベクター、例えば、InvitrogenのDES2シリーズである。好ましくは、前記ショウジョウバエ細胞発現ベクターはpMTBiP/V5-His B(Invitrogen)である。pMT/BiP/V5-Hisベクターは以下のさらなる特徴を提供する。これは、DNA収率を改善し、サブクローニング効率を高める小さなサイズ(3.6kb)を有し、抗V5抗体によって迅速に検出するためのC末端V5エピトープタグを有し、ニッケルキレーティング樹脂を用いた組換え融合タンパク質を簡単に精製するためのC末端6xHisタグを有する。

ベクター改変法については、Sambrook and Russel(2001)、同一引用箇所)を参照されたい。ベクターは、クローニングまたは発現のための1つまたは複数の複製・遺伝系、宿主における選択のための1つまたは複数のマーカー、例えば、抗生物質耐性、および1つまたは複数の発現カセットを含有してもよい。

ベクターに挿入されるコード配列は標準的な方法によって合成されてもよく、天然供給源から単離されてもよく、ハイブリッドとして調製されてもよい。コード配列と転写調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、および/もしくはインスレーター)ならびに/または他のアミノ酸をコードする配列との連結を、確立されている方法を用いて行うことができる。

さらに、ベクターは、本発明の核酸配列に加えて、適切な宿主におけるコード領域の適切な発現を可能にする発現制御エレメントを含んでもよい。このような制御エレメントは当業者に公知であり、プロモーター、翻訳開始コドン、翻訳部位および挿入部位、またはインサートをベクターに導入するための配列内リボソーム進入部位(IRES)(Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 1471-1476)を含んでもよい。好ましくは、本発明の核酸分子は、真核細胞または原核細胞における発現を可能にする前記発現制御配列に機能的に連結される。

真核細胞および原核細胞における発現を確実にする制御エレメントは当業者に周知である。前述のように、制御エレメントは、通常、転写の開始を確実なものにする制御配列、任意で、転写の終結および転写物の安定化を確実なものにするポリAシグナルを含む。さらなる調節エレメントは、転写エンハンサーおよび翻訳エンハンサーならびに/または天然に関連するプロモーター領域もしくは異種プロモーター領域を含んでもよい。発現、例えば、哺乳動物宿主細胞における発現を可能にする、可能性のある調節エレメントは、CMV-HSVチミジンキナーゼプロモーター、SV40、RSV-プロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、ヒト伸長因子1α-プロモーター、CMVエンハンサー、CaM-キナーゼプロモーター、またはSV40-エンハンサーを含む。

原核細胞における発現のために、例えば、tac-lac-プロモーター、lacUV5またはtrpプロモーターを含む複数のプロモーターが述べられている。転写開始を担うエレメントに加えて、このような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、例えば、SV40-ポリA部位またはtk-ポリA部位も含んでよい。これに関連して、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(特に、最後に加えられた実施例において用いられるIn-Vitrogene)、pSPORT1(GIBCO BRL)もしくはpGEMHE(Promega)、または原核生物発現ベクター、例えば、λgt11などの適切な発現ベクターが当技術分野において公知である。

本発明の発現ベクターは、少なくとも、本発明の核酸およびタンパク質の複製、好ましくは、発現を方向付けることができる。適切な複製起点には、例えば、ColE1、SV40ウイルス、およびM13複製起点が含まれる。適切なプロモーターには、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、lacZプロモーター、gal10プロモーター、およびオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcMNPV)多角体プロモーターが含まれる。適切な終結配列には、例えば、ウシ成長ホルモン、SV40、lacZ、およびAcMNPV多角体ポリアデニル化シグナルが含まれる。選択マーカーの例には、ネオマイシン、アンピシリン、およびハイグロマイシン耐性など、好ましくはカナマイシンが含まれる。特別設計のベクターを用いると、異なる宿主細胞、例えば、細菌-酵母、または細菌-動物細胞、または細菌-真菌細胞、または細菌無脊椎動物細胞の間でのDNAシャトリングが可能になる。

本発明の核酸分子に加えて、前記ベクターは、分泌シグナルをコードする核酸配列をさらに含んでもよい。このような分泌シグナル配列は当業者に周知である。さらに、使用される発現系に応じて、本発明の核酸分子のコード配列に、発現ポリペプチドを細胞区画に向けることができるリーダー配列が付加されてもよく、当技術分野において周知である。リーダー配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列、好ましくは、翻訳されたタンパク質またはその一部を、特に、細胞外膜に分泌することができるリーダー配列と適切な相(phase)で組み立てられる。任意で、異種配列は、望ましい特徴、例えば、発現組換え産物の安定化または簡単な精製を付与するC末端特定ペプチドまたはN末端特定ペプチドを含む融合タンパク質をコードしてもよい。ベクターが適切な宿主に組み込まれたら、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で維持され、所望に応じて、本発明のタンパク質、抗原性断片、または融合タンパク質の収集および精製が続いてもよい。もちろん、前記ベクターは、病原性生物に由来する調節領域も含んでよい。

ベクターは、好ましくは、誘導性発現ベクター、例えば、IPTG誘導性ベクターでもよい。

さらに、前記ベクターはまた、発現ベクターに加えて、遺伝子導入ベクターおよび/または遺伝子ターゲティングベクターでもよい。遺伝子療法は、エクスビボ法またはインビボ法によって治療遺伝子(例えば、ワクチン接種用)を細胞に導入することに基づいており、遺伝子導入の最も重要な用途の1つである。適切なベクター、ベクター系、およびインビトロ遺伝子療法またはインビボ遺伝子療法のための方法が文献に記載されており、当業者に公知である。例えば、Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957; Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 または Verma, Nature 389 (1997), 239-242、およびこれらの中で引用された参考文献を参照されたい。

本明細書において前述されたように本発明の核酸分子およびベクターは、細胞への直接導入用、またはリポソームもしくはウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス)を介した導入用に設計されてもよい。さらに、ワクシニアウイルスまたはセムリキ森林ウイルスに基づくバキュロウイルス系が本発明の核酸分子の真核生物発現系として使用することができる。組換え生成に加えて、本発明のタンパク質の断片、融合タンパク質、または抗原性断片は、固相技法を用いた直接ペプチド合成によって生成されてもよい(Stewart et al. (1969) Solid Phase Peptide Synthesis; Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154を参照されたい)。インビトロタンパク質合成は、手作業の技法を用いて、または自動化によって行われてもよい。自動合成は、例えば、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City CA)を用いて、製造業者によって提供される説明書に従って達成されてもよい。完全長分子を生成するために様々な断片が別々に化学合成されてもよく、化学的方法を用いて組み合わされてもよい。

本発明はまた、SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列またはSEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞に関する。

前記「宿主」は、前記ベクターもしくはヌクレオチド配列を、前記ベクターもしくはヌクレオチド配列が存在すると、本発明のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現を媒介する宿主細胞に導入することによって、または本発明のヌクレオチド配列もしくはベクターを含むことによって生成されてもよい。ここで、ヌクレオチド配列および/またはコードされるポリペプチドは宿主細胞とって外来のものである。本明細書において用いられるとき、「宿主」という用語は宿主細胞を含む。

「外来」とは、前記ヌクレオチド配列および/もしくはコードされるポリペプチドが宿主に関して異種であることを意味し、このことは、異なるゲノムバックグラウンドを有する細胞または生物に由来することを意味する。または、「外来」とは、前記ヌクレオチド配列および/もしくはコードされるポリペプチドが宿主と相同であるが、前記ヌクレオチド配列の天然対応物とは異なるゲノム環境に位置することを意味する。このことは、ヌクレオチド配列が宿主と相同であれば、前記宿主ゲノム内の天然の場所に位置しない、特に、異なる遺伝子に囲まれていることを意味する。この場合、ヌクレオチド配列は、それ自身のプロモーターの制御下にあってもよく、異種プロモーターの制御下にあってもよい。導入された核酸分子またはベクターの場所は、当業者に周知の方法、例えば、サザンブロッティングを用いて当業者によって確かめることができる。宿主に存在する本発明のベクターまたはヌクレオチド配列は宿主ゲノムに組み込まれてもよく、ある形では染色体外に維持されてもよい。この点において、本発明のヌクレオチド配列を用いて、相同組換えを介して変異遺伝子を元に戻す、または作り出すことができることも理解しなければならない。

1つの態様において、SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列またはSEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞は原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞である。好ましくは、原核生物宿主細胞は、大腸菌(E.coli)、より好ましくは、大腸菌BL21、例えば、BL21(DE3)である。

適切な原核生物細胞/細菌細胞は、大腸菌、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、霊菌(Serratia marcescens)、または枯草菌(Bacillus subtilis)のようなクローニングに一般的に用いられるものである。前記真核生物宿主は、哺乳動物細胞、両生類細胞、魚類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞、または細菌細胞(例えば、大腸菌株HB101、DH5a、XL1 Blue、Y1090、およびJM101)でもよい。原核生物組換え宿主細胞が好ましく、大腸菌が最も好ましい。

真核生物宿主細胞のさらなる例には、酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クリベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、またはピキア・パストリス(Pichia pastoris)細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サル、およびげっ歯類由来の細胞株、ならびにヨトウガ(Spodoptera frugiperda)昆虫細胞およびショウジョウバエ由来昆虫細胞を含むが、これに限定されない昆虫細胞、ならびにゼブラフィッシュ細胞が含まれるが、これに限定されない。使用に適しており、かつ市販されている哺乳動物種由来細胞株には、L細胞、CV-1細胞、COS-1細胞(ATCC CRL 1650)、COS-7細胞(ATCC CRL 1651)、HeLa細胞(ATCC CCL 2)、C1271(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)、およびMRC-5(ATCC CCL 171)が含まれるが、これに限定されない。

前記ショウジョウバエ由来細胞は、好ましくは、ショウジョウバエ発現系、例えば、ショウジョウバエ発現系(DES(登録商標))における異種タンパク質発現に用いられるショウジョウバエS2(ATCC CRL-1963)でもよい。

使用に適しており、かつ市販されている哺乳動物種由来細胞株には、L細胞、CV-1細胞、COS-1細胞(ATCC CRL 1650)、COS-7細胞(ATCC CRL 1651)、HeLa細胞(ATCC CCL 2)、C1271(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)、およびMRC-5(ATCC CCL 171)が含まれるが、これに限定されない。

別のさらに好ましい態様において、前記両生類細胞は卵母細胞である。なおさらに好ましい態様において、前記卵母細胞はカエル卵母細胞であり、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞が特に好ましい。

さらに好ましい態様において、本発明の宿主は非ヒトトランスジェニック生物である。前記非ヒト生物は、哺乳動物、両生類、魚類、昆虫、菌類、または植物でもよい。特に好ましい非ヒトトランスジェニック動物は、ショウジョウバエ種、線虫(Caenorhabditis elegans)、ゼノパス属(Xenopus)種、ゼブラフィッシュ、ヨトウガ、オートグラファ・カリフォルニカ、マウス、およびラットである。トランスジェニック植物は、コムギ、タバコ、パセリ、およびシロイヌナズナ属(Arabidopsis)を含むが、これに限定されない。

トランスジェニック菌類も当技術分野において周知であり、特に、S.ポンベ(S.pombe)もしくはS.セレビジエ(S.cerevisae)のような酵母、またはアスペルギルス属、ニューロスポラ属(Neurospora)、もしくはウスチラゴ属(Ustilago)種、もしくはピキア属(Pichia)種を含む。

さらに、本発明は、宿主細胞、好ましくは、原核生物宿主細胞、より好ましくは、大腸菌、最も好ましくは、大腸菌BL21、例えば、大腸菌BL21(D3)における、SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列またはSEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターの発現によって得られた、または得ることができるタンパク質に関する。

本発明の宿主を培養/産生する工程および生成されたポリペプチドを単離する工程を含む、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドを生成するための方法が本明細書において説明される。

ポリペプチドを適切な宿主において生成するための多数の適切な方法が当技術分野に存在する。宿主が単細胞生物または哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞であれば、当業者は、過度の仕事の負担なく、さらに最適化することができる様々な培養条件に戻ることができる。都合のいいことに、生成されたタンパク質は、確立されている技法によって培養培地から、または単離された(生物学的)封入体から収集される。さらに、生成されたポリペプチドは宿主細胞から直接単離されてもよい。前記宿主細胞は宿主生物の一部でもよく、宿主生物の一部から得られてもよい。例えば、前記宿主細胞は、動物の組織、例えば、CNS、皮膚などの一部または植物の採集可能な部分でもよい。さらに、生成されたポリペプチドは、血液、乳、または脳脊髄液のような前記宿主に由来する体液から単離されてもよい。

さらに、本発明は、本発明のSEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるポリペプチドに関する。

従って、本発明のポリペプチドは微生物学的方法またはトランスジェニック哺乳動物によって生成することができる。本発明のポリペプチドはトランスジェニック植物から回収されることも想定される。または、本発明のポリペプチドは合成または半合成により生成することができる。

例えば、化学合成、例えば、Houghton Proc. Natl. Acad. Sci. USA (82) (1985), 5131-5135記載の固相法を使用することができる。別の方法はmRNAのインビトロ翻訳である。好ましい方法は、前記のように宿主細胞においてタンパク質を組換えにより生成することを伴う。例えば、本発明のヌクレオチド配列のいずれか1つの全てまたは一部を含む核酸配列はPCRによって合成され、発現ベクターに挿入され、宿主細胞は発現ベクターで形質転換されてもよい。その後、宿主細胞は望ましいポリペプチドを生成するように培養され、望ましいポリペプチドは単離および精製される。タンパク質の単離および精製は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、逆相HPLC、調製用ディスクゲル電気泳動などがあるが、それに限定されるわけではない、いくつかの公知の技法のいずれか1つによって実現することができる。さらに、本発明のポリペプチドを生成するために無細胞翻訳系を使用することができる。本発明に従って使用するのに適した無細胞発現系には、ウサギ網状赤血球溶解産物、コムギ胚抽出物、イヌ膵臓ミクロソーム膜、大腸菌S30抽出物、および共役転写/翻訳系、例えば、TNT系(Promega)が含まれる。これらの系によって、コード領域および適切なプロモーターエレメントを含有するクローニングベクター、DNA断片、またはRNA配列が添加されたときに組換えポリペプチドまたはペプチドの発現が可能になる。前述のように、タンパク質単離/精製法は、従来の方法を用いた本発明のタンパク質の改変を必要とする場合がある。例えば、ニッケルカラムによる精製を可能にするためにヒスチジンタグがタンパク質に付加されてもよい。他の改変によって、さらに高いまたは低い活性が引き起こされ、高レベルのタンパク質生成が可能になり、タンパク質の精製が単純化される場合がある。他のタグはflagタグも含む。このようなタグは好ましくは真核生物宿主に用いられる。

本発明のタンパク質は、好ましくは、本明細書に記載の本発明の核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有するか、または本明細書に記載の前記核酸配列を発現させることによって得られる、もしくは得ることができる。従って、SEQ ID NO:1の核酸配列の発現によって得られた、または得ることができるタンパク質の発現を実現するために、SEQ ID NO:1 を、例えば、発現ベクター中に含むベクターも利用することができる。

例えば、大腸菌BL21株(DE3)を利用して、SEQ ID NO:1のタンパク質またはSEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターの発現を媒介することができる。ベクターの構築、例えば、IPTG誘導性T7-プロモーターの制御下で発現するためのベクターの構築は当技術分野において公知である。エレクトロコンピテント大腸菌BL21(DE3)細胞が、前記のようにプラスミドDNA、例えば、発現ベクターによって形質転換されてもよい。次いで、処理された細胞は培地中で増殖される。培養後、細胞は遠心分離によって収集されるか、または例えば、超音波処理によって直接溶解されてもよく、次いで、懸濁液は遠心分離されるか、実施例において例示されたように処理される。次いで、ペレット、すなわち粗封入体が、緩衝液、例えば、溶解緩衝液に再懸濁されてもよい。次いで、湿った封入体は可溶化される。関心対象のタンパク質が、もう1回遠心分離された後に得られてもよく、またはその前に、例えば、実施例において例示されたように再び折り畳まれてもよい。タンパク質の発現、細胞の破壊、封入体の回収、および封入体の再折り畳みは、典型的には、当技術分野において公知のように、例えば、本明細書の実施例に記載のように行われる。

タンパク質を精製する手法の1つに硫安沈殿が含まれる。なぜなら、硫安沈殿は、タンパク質の溶解度を変えることによってタンパク質を精製するのに用いられる方法だからである。硫安沈殿は、塩析として知られている一般的な技法の具体的な事例である。硫酸アンモニウムは、一般的に、溶解度が非常に高いので、高いイオン強度をもつ塩溶液が可能になるために使用される。タンパク質の溶解度は溶液のイオン強度によって、従って、塩濃度によって変化する。2つの特異な効果が観察される。低い塩濃度では、塩濃度が増加する(すなわち、イオン強度が増加する)につれて、タンパク質の溶解度は増加する。この効果は塩溶と呼ばれる。塩濃度(イオン強度)がさらに増加したときに、タンパク質の溶解度は減少し始める。十分に高いイオン強度では、タンパク質は溶液からほぼ完全に沈殿する(塩析)。

高いイオン強度ではタンパク質の溶解度は大きく異なるので、塩析は、ある特定のタンパク質の精製を助ける非常に役に立つ手順である。コスモトロピック硫酸アンモニウムを添加することによって、折り畳まれていない種および誤って折り畳まれた種のような折り畳み副産物だけでなく、細胞壁成分およびタンパク質のような宿主細胞に由来する不純物も沈殿する。沈殿剤の濃度が増加するにつれて、沈殿効率は上昇し、従って、このような高い硫酸アンモニウム濃度での沈殿に対する耐性がFcR変異体にある限り、高度に精製されたFcR調製物が得られる。従って、1.5Mに等しいか、または1.5Mを上回る硫酸アンモニウム濃度で高溶解度のFcR変異体を有することが望ましい。

次いで、沈殿タンパク質は遠心分離によって取り出され、次いで、関心対象のタンパク質の大部分を沈殿させるが、最大量のタンパク質汚染物質を溶解したままにする値まで硫酸アンモニウム濃度が上げられる。関心対象の沈殿タンパク質は遠心分離によって回収され、精製の次の段階のために新鮮な緩衝液に溶解される。

好ましくは、本発明のタンパク質は、1.5Mに等しい、または1.5Mを上回る硫酸アンモニウム濃度において高い溶解度を有する。

さらに、本発明は、SEQ ID NO:6の核酸配列によってコードされるタンパク質に関する。

SEQ ID NO:2、3、4、5、または9のタンパク質はSEQ ID NO:6の核酸配列によってコードされてもよく、
(i)第1のコドン(ATG)がSEQ ID NO:6から取り除かれると、SEQ ID NO:2のタンパク質が得られ、
(ii)第1のコドン(ATG)および第2のコドン(GCA)がSEQ ID NO:6から取り除かれると、SEQ ID NO:3のタンパク質が得られ、
(iii)第1のコドン(ATG)、第2のコドン(GCA)、および第3のコドン(CCG)がSEQ ID NO:6から取り除かれると、SEQ ID NO:4のタンパク質が得られ、
(iv)第1のコドン(ATG)、第2のコドン(GCA)、第3のコドン(CCG)、第4のコドン(CCG)、および第5のコドン(AAA)がSEQ ID NO:6から取り除かれると、SEQ ID NO:5のタンパク質が得られ、
(v)N末端からC末端にかけてアミノ酸TPAをコードするコドンが、SEQ ID NO:6の第1のコドン(ATG)と第2のコドン(GCA)コドンとの間に付加され、アミノ酸配列MGIをコードするコドンが、SEQ ID NO:6の最後から2番目のコドン(CCG)の3'側に付加されると、SEQ ID NO:9のタンパク質が得られる。

本発明はまた、SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸もしくはSEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸を含むベクターの発現によって得られた、もしくは得ることができるタンパク質、またはSEQ ID NO:6の核酸配列によってコードされるタンパク質を含む薬学的組成物に関する。

「組成物」という用語は、本発明に従って用いられたときに、
(a)SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸の発現によって得られた、もしくは得ることができる少なくとも1つのタンパク質を含む組成物;または
(b)SEQ ID NO:1、2、3、4、5、もしくは9のタンパク質をコードする核酸を含むベクター;または
(c)SEQ ID NO:6の核酸配列によってコードされるタンパク質;
(d)SEQ ID NO:1、2、3、4、5、もしくは9のタンパク質をコードする核酸配列
に関する。

本明細書の下記に記載の本発明の組成物は、上述のタンパク質を任意の組み合わせで含むことが想定される。本発明の組成物は、任意で、他のタンパク質、例えば、抗体またはリンパ球に結合することができる、さらなる分子を含んでもよい。前記組成物は固体、液体、または気体の形をとってもよく、特に、散剤、錠剤、溶液、エアロゾル、顆粒剤、丸剤、懸濁液、エマルジョン、カプセル、シロップ、液体、エリキシル剤、抽出物、チンキ剤、もしくは流体抽出物の形をとってもよく、経口投与または非経口投与または局所投与に特に適した形をとってもよい。

本発明の別の好ましい組成物は、任意で、薬学的な許容される担体および/または賦形剤をさらに含む薬学的組成物である。前記薬学的組成物は、特に、さらなるポリペプチド、例えば、抗体または血清中に存在する別のタンパク質と結合され得る、本発明の核酸配列または本発明のポリペプチドを含む。

薬学的組成物は、本明細書に記載のように、生理学的に許容される担体を用いて患者に投与されてもよい。ある特定の態様において、「薬学的に許容される」という用語は、規制当局、または動物、特にヒトにおいて使用するための一般に認められている他の薬局方によって認可されていることを意味する。

「担体」という用語とは、薬学的組成物と共に投与される希釈剤、アジュバント、またはビヒクルを指す。このような薬学的担体は水および油などの滅菌液体でもよい。薬学的組成物が静脈内投与されるときに、水が好ましい担体である。食塩水ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液も液体担体、特に、注射液用の液体担体として使用することができる。

適切な薬学的な賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、ナトリウムイオン、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。前記組成物はまた、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤またはpH緩衝剤を含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、徐放性製剤などの形をとってもよい。前記組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体を用いて坐剤として処方されてもよい。経口製剤は、標準的な担体、例えば、薬学グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含んでもよい。適切な薬学的担体の例は、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、対象への正しい投与のための形となるように適量の担体と共に治療的有効量の上述の化合物を、好ましくは、精製された形で含有する。前記製剤は投与方法に適合しなければならない。

別の好ましい態様において、前記組成物は、ヒトへの静脈内投与に合わせられた薬学的組成物として日常的な手順に従って処方される。典型的に、静脈内投与用の組成物は、滅菌した等張性水性緩衝液に溶解した溶液である。必要な場合、前記組成物は、可溶化剤および注射部位の疼痛を和らげる局所麻酔薬、例えば、リドカインを含んでもよい。一般的に、前記成分は、例えば、活性薬剤の量を表示するアンプルまたはサシェなどの密封封止容器に入れられた、乾燥した凍結乾燥粉末として、または無水濃縮物として、単位剤形の形で別々に、または一緒に混合されて供給される。前記組成物が注入によって投与される場合、滅菌した薬学グレードの水または食塩水を含む輸液ボトルを用いて供給されてもよい。前記組成物が注射によって投与される場合、滅菌した注射用水または食塩水のアンプルは、前記成分が投与前に混合できるように提供されてもよい。

本発明の薬学的組成物は中性または塩の形で処方することができる。薬学的に許容される塩には、アニオンを用いて形成される塩、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから得られる塩、およびカチオンを用いて形成される塩、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから得られる塩が含まれる。

最適な投与量範囲を特定するのを助けるために、任意で、インビトロアッセイが用いられてもよい。製剤中に用いられる正確な用量は投与経路および疾患または障害の深刻さによっても決まり、医師の判断および対象一人一人の事情に従って決めなければならない。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外挿されてもよい。好ましくは、薬学的組成物は直接、またはアジュバントと組み合わせて投与される。

薬学的組成物は、遺伝子療法における適用に合わせて設計することができる。遺伝子療法の技法は本発明の宿主細胞に関連して既に前述されており、前述されたことは全て薬学的組成物に関連して当てはまる。例えば、薬学的組成物中の、SEQ ID NO:1の核酸の発現によって得られた、もしくは得ることができるタンパク質、または SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする核酸を含むベクター、またはSEQ ID NO:6の核酸配列によってコードされるタンパク質を含む核酸分子またはタンパク質は、好ましくは、治療される対象一人一人の細胞への導入、発現、および/または安定な組み込みを可能にする形をとる。

遺伝子療法のために、様々なウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または好ましくは、レトロウイルスなどのRNAウイルスを利用することができる。1種類の外来遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳癌ウイルス(MuMTV)、およびラウス肉腫ウイルス(RSV)が含まれるが、これに限定されない。さらなる多数のレトロウイルスベクターは複数種の遺伝子も組み込むことができる。形質導入細胞を特定および作製することができるように、これらのベクターは全て選択マーカーの遺伝子を導入または組み込むことができる。例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって、レトロウイルスベクターを標的特異的にすることができる。当業者であれば、挿入されたポリヌクレオチド配列を含むレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にするためにレトロウイルスゲノムに挿入することができる特定のポリヌクレオチド配列について知っているか、または過度の実験なく容易に突き止めることができる。

組換えレトロウイルスは欠損性であることが好ましいので、感染性ベクター粒子を生成するために補助を必要とする。この補助は、例えば、LTR内の制御配列の制御下でレトロウイルス構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞株を用いることによって提供することができる。これらのプラスミドは、パッケージング機構がキャプシド形成のためのRNA転写物を認識するのを可能にするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルが欠失しているヘルパー細胞株には、例えば、w2、PA317、およびPA12が含まれるが、これに限定されない。これらの細胞株は、ゲノムがパッケージングされないので空ビリオンを生成する。このような細胞に、パッケージングシグナルは損なわれておらず、構造遺伝子が関心対象の他の遺伝子によって置換されているレトロウイルスベクターが導入されたらパッケージングされ、ベクタービリオンが生成される。または、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによって、レトロウイルス構造遺伝子gag、pol、およびenvをコードするプラスミドを用いてNIH 3T3または他の組織培養細胞が直接トランスフェクトされてもよい。次いで、これらの細胞は、関心対象の遺伝子を含むベクタープラスミドを用いてトランスフェクトされる。結果として生じた細胞はレトロウイルスベクターを培養培地に放出する。本発明の核酸分子のための別の標的化送達系はコロイド分散系である。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質をベースとする系が含まれる。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞である。サイズが0.2〜4.0pmの範囲の大きな単層リポソーム(large unilamellar vesicle)(LUV)が、大きな高分子を含有する、かなりのパーセントの水性緩衝液を封入できることが示されている。RNA、DNA、および損なわれていないビリオンを水性内部に封入し、生物学的に活性な形で細胞に送達することができる(Fraley, et.al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981) 。動物細胞に加えて、植物細胞、酵母細胞、および細菌細胞におけるポリヌクレオチド送達のためにリポソームが用いられてきた。リポソームが効率的な遺伝子導入ビヒクルであるためには、以下の特徴:(1)生物学的活性を損なうことなく高効率で関心対象の遺伝子を封入すること;(2)非標的細胞と比較して標的細胞に優先的かつ多量に結合すること;(3)標的細胞細胞質に小胞の水性内容物を高効率で送達すること;および(4)遺伝情報を正確かつ効果的に発現することが存在しなければならない(Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988)。リポソームの組成物は、通常、リン脂質、特に、高い相転移温度リン脂質と、通常、ステロイド、特に、コレステロールとの組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質が用いられてもよい。リポソームの物理的特徴はpH、イオン強度、および二価カチオンによって決まる。リポソーム生成において有用な脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドが含まれる。脂質部分が14-18炭素原子、特に、16-18炭素原子を含有し、飽和しているジアシルホスファチジルグリセロールが特に有用である。例示的なリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。リポソームの標的化は解剖学的要因および機構的要因に基づいて分類することができる。解剖学的分類は、選択性、例えば、臓器特異的選択性、細胞特異的選択性、および細胞小器官特異的選択性のレベルに基づく。機構的標的化は、受動的または能動的かどうかに基づいて区別することができる。受動的標的化は、リポソームが、洞様毛細血管を含む臓器中にある細網内皮系(RES)の細胞に分布する天然傾向を利用する。

本発明の文脈において「対象」という用語は、情動障害の治療を必要とする個体を意味する。好ましくは、対象は脊椎動物であり、哺乳動物がさらに好ましく、ヒトが特に好ましい。1つの態様において、ヒトは患者または個体である。

「投与される」という用語は、本発明のポリペプチドをコードする上述の核酸分子の治療または診断に有効な用量を個体に投与することを意味する。

本明細書で使用する「治療的有効量」とは、疾患もしくは障害を治療する、もしくは寛解させるのに十分な、疾患の発症を遅らせるのに十分な、または疾患の治療もしくは管理における任意の治療利益を提供するのに十分な治療活性のある成分または薬剤の量を指す。

当技術分野において公知であり、かつ前記のように、全身送達対局所送達、年齢、体重、身体全体の健康、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、および状態の重篤度に対する調整が必要な場合があり、当業者による日常的な実験を用いて突き止めることができる。前記方法はヒト療法および獣医学用途の両方に適用することができる。望ましい治療活性を有する本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載のように、生理学的に許容される担体に入れて患者に投与することができる。導入方法に応じて、前記化合物は、後述するように様々なやり方で処方することができる。製剤中の治療活性化合物の濃度は約0.1〜100wt％でもよい。薬剤は単独で、または他の治療と組み合わせて投与されてもよい。

薬学的組成物の投与は、前述のように、経口、皮下、静脈内、動脈内、節内(intranodal)、髄内、くも膜下腔内、室内、鼻腔内、気管支内、経皮、節内(intranodally)、直腸内、腹腔内、筋肉内、肺内、膣、直腸、または眼内を含むが、これに限定されない様々なやり方で行うことができる。場合によっては、例えば、創傷および炎症の治療において、候補薬剤は溶液乾燥スプレー(solution dry spray)として直接適用されてもよい。

薬学的組成物は好ましくは注射される。この注射は、静脈内注入、皮下、または筋肉内を用いて投与される。さらに、薬学的組成物は他の薬学的に許容される担体および/または賦形剤を含んでもよい。「薬学的に許容される」という用語は、動物、特にヒトにおいて使用するための一般に認められている薬局方を意味する。

前記組成物が注入によって投与される場合、滅菌した薬学グレードの水または食塩水を含む輸液ボトルを用いて供給されてもよい。前記組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合できるように、滅菌した注射用水または食塩水のアンプルが準備されてもよい。さらに、薬学的組成物は、1種類または複数種の他の治療剤または抗体、例えば、ステロイドまたは静脈内免疫グロブリン、特に、コルチコステロイド、グルココルチコイドプロドラッグ、例えば、プレドニゾン、IVIG、抗D、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチンまたはビンブラスチン、ダナゾール、免疫抑制剤、例えば、アザチオプリン、シクロホスファミドまたはシクロスポリンA、ダプソン、血小板新生剤、リツキシマブ、ミコフェノール酸モフェチル、ロミプロスチム、エルトロンボパグ、ミコフェノール酸モフェチルと組み合わせて投与されてもよい。本明細書で使用する「組み合わせて」という用語とは、複数種の予防剤および/または治療剤の使用を指す。「組み合わせて」という用語の使用は、予防剤および/または治療剤が患者に投与される順番を制限しない。

主治医および臨床要因によって投与計画が決まる。医学分野において周知なように、どの患者の投与量も、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、時間および投与経路、身体全体の健康、ならびに同時に投与されている他の薬物を含む多くの要因によって決まる。典型的な用量は、例えば、0.001〜1000μgの範囲内でよい。しかしながら、特に、上述の要因を考慮して、この例示的な範囲より少ない、またはこれより多い用量が考えられる。

投薬は好ましくは週1回行われる。しかしながら、治療の進行中に、投薬は週1回よりかなり長い間隔で行われてもよく、困っているときには、週1回よりかなり短い間隔で、例えば、毎日、行われてもよい。好ましい場合において、免疫応答は、本明細書に記載の方法および当業者に公知のさらなる方法を用いてモニタリングされ、投薬は、例えば、時間、量、および/または組成が最適化される。投与量は変化するが、DNAを静脈内投与するための好ましい投与量は約10⁶〜10¹²コピーのDNA分子である。療法が連続注入であれば、投与量も1μg〜10mg単位/体重キログラム/分の範囲になるはずである。定期的な評価によって進行をモニタリングすることができる。本発明の薬学的組成物は局所または全身に投与されてもよい。投与は、好ましくは非経口投与、例えば、静脈内投与である。非経口投与用の調製物には、滅菌した水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体には、食塩水および緩衝化培地を含む、水、アルコール溶液/水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、ナトリウムイオン溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよびナトリウムイオン、乳酸加リンガー液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、体液補充薬および栄養分補充薬、電解質補充薬(例えば、リンガーデキストロースをベースとする電解質補充薬)などが含まれる。防腐剤および他の添加物、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および希ガスなども存在してよい。

薬学的組成物は、他の薬剤、例えば、メチル化DNAの検出において有用な、従って、例えば、典型的なメチル化パターンを示し得る悪性腫瘍の診断において有用な他の薬剤との併用療法アプローチにおいて用いられることも想定される。

本発明は、前記方法に使用することができるキットを提供する。薬学的組成物は、患者における炎症性疾患および/または自己免疫疾患を有効に治療または予防するのに十分な量の投与用量のFcγRを含むマルチドーズキットの形をとってもよいことも当業者に周知である。1つの態様において、薬学的パックまたはキットは、本発明の薬学的組成物が充填された1つまたは複数の容器を含む。さらに、薬学的パックまたはキットには、疾患の治療に有用な1つまたは複数のさらなる予防剤または治療剤も含まれてよい。

さらに、本発明の薬学的組成物は障害または疾患の治療および予防に使用することができる。

本明細書で使用する「治療する」という用語および類似用語は、患者の管理およびケアならびに/または疾患もしくは障害と戦うことを意味する。本明細書で使用する、「予防する(prevent)」、「予防する(preventing)」、および「予防」という用語は、予防剤または治療剤の投与に起因する、対象における障害の1つまたは複数の症状の再発または発症の予防を指す。

本明細書で使用する「障害」および「疾患」という用語は、対象における状態を指すために同義に用いられる。特に、「自己免疫疾患」という用語は、対象自身の細胞、組織、および/または臓器に対する対象の免疫反応によって引き起こされる細胞損傷、組織損傷、および/または臓器損傷を特徴とする対象における状態を指すために「自己免疫障害」という用語と同義に用いられる。「炎症性疾患」という用語は、炎症、好ましくは慢性炎症を特徴とする対象における状態を指すために「炎症性障害」という用語と同義に用いられる。自己免疫障害は炎症に関連してもよく、関連しなくてもよい。さらに、炎症は自己免疫障害によって引き起こされてもよく、引き起こされなくてもよい。従って、ある特定の障害は自己免疫障害および炎症性障害の両方を特徴としてもよい。

好ましい態様において、本発明の方法によって治療することができる炎症性疾患は、一次性免疫性血小板減少症(ITP)、全身性エリテマトーデス(SLE)、慢性関節リウマチ(RA)、または自己免疫性溶血性貧血(AIHA)である。

本発明はまた、SEQ ID NO:2および/または3のタンパク質を含む組成物に関する。

「組成物」という用語は、化学結合、または機械的混合、または生物学的産物の結果であるかに関係なく2種類以上の物質からなる全ての組成物および全ての複合物質を意味する。組成物は、2種類以上の成分の混合によって形成することができる。組成物中の成分の混合物は機械操作もしくは化学操作または生物学的プロセスによって生成されてもよい。

前記組成物は、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、またはそれより多い活性成分を含んでもよい。「活性成分」とは治療に有効な成分を意味する。このような活性成分は、本明細書に記載のようにIgG抗体に結合することができ、おそらく、リンパ球、例えば、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞に結合することができる。このような活性成分は定常領域にしか結合しない。本発明のタンパク質が、組成物中にある前記のような唯一の活性成分であることが好ましい。

1つの態様において、前記組成物はSEQ ID NO:2および3のタンパク質を含む。別の態様において、前記組成物はSEQ ID NO:2または3のタンパク質を含む。別の態様において、前記組成物はSEQ ID NO:2のタンパク質を含む。別の態様において、前記組成物はSEQ ID NO:3のタンパク質を含む。

1つの態様において、本発明の組成物はSEQ ID NO:4および/または5のタンパク質をさらに含む。別の態様において、本発明の組成物はSEQ ID NO:4および5のタンパク質をさらに含む。別の態様において、本発明の組成物はSEQ ID NO:4または5のタンパク質をさらに含む。別の態様において、本発明の組成物はSEQ ID NO:4のタンパク質をさらに含む。別の態様において、本発明の組成物はSEQ ID NO:5のタンパク質をさらに含む。

別の態様において、本発明の組成物は、SEQ ID NO:2のタンパク質の量がSEQ ID NO:3のタンパク質の量を上回ることを特徴とする。

別の態様において、本発明の組成物は、SEQ ID NO:3のタンパク質の量がSEQ ID NO:2のタンパク質の量を上回ることを特徴とする。

別の態様において、本発明の組成物は、SEQ ID NO:2のタンパク質の量がSEQ ID NO:3のタンパク質の量を上回り、SEQ ID NO:2および3のタンパク質の量がSEQ ID NO:4および/または5のタンパク質の量を上回ることを特徴とする。

1つの態様において、前記組成物はSEQ ID NO:9のタンパク質を含む。

前記組成物は、好ましい態様において、薬学的組成物である。

本発明はまた、コードされるタンパク質の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程および得られた薬学的組成物を回収する工程を含む、薬学的組成物を製造する方法に関する。

以下の実施例は本発明を例示する。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものであると解釈してはならない。実施例は例示目的で含まれ、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。

材料および方法
FcR変異体の生成
250mLバッフル付コニカルフラスコに入っている50μg/mLカナマイシンを添加したLB 75mLにグリセロールストック5μLを接種し、37℃、170rpmで15時間、振盪した(Multitron Standard, Infors HT)。その後に、2Lバッフル付コニカルフラスコに入っているLB 1Lに一晩培養物10mLを接種し、37℃、170rpmで振盪した。OD₆₀₀1.6になったら、1mM IPTGを添加することによって発現を誘導した。37℃、170rpmでさらに3時間、培養した後に、細胞を遠心分離(5,000gで10分、4℃)によって収集し、200mL氷冷PBSで1回、洗浄し、-20℃で保管した。

細胞破壊および封入体単離
6〜8gの凍結大腸菌細胞を室温で解凍し、100μg/mLリゾチームを添加した溶解緩衝液(50mM Tris/HCl、25mM NaCl、2mM EDTA、pH8.0)30mLをテフロン・イン・ガラス(teflon-in-glass)ホモジナイザーを用いて再懸濁した。氷上で15分インキュベートした後に、細胞を超音波処理によって破壊し(出力設定6、デューティサイクル30％、30分、マイクロチップを備えたsonifier 250, Branson)、懸濁液を遠心分離(13,000gで45分、4℃)した。上清1mLをサンプリングし、残っている液体を捨てた。ペレット、すなわち、粗封入体を、0.5％(v/v) Polysorbate20を添加した溶解緩衝液35mLにテフロン・イン・ガラスホモジナイザーを用いて再懸濁し、遠心分離(13,000gで15分、4℃)した。界面活性剤を用いて、もう1回、洗浄工程を行った後、溶解緩衝液だけを用いて最終洗浄工程を行った。洗浄された封入体を使用するまで-20℃で保管した。

FcR変異体の再折り畳みおよび精製
湿った封入体を、20mM Tris/HCl、6Mグアニジン、3mM EDTA、5mM DTT、pH8.0に溶解して200mg/mLで、密閉した遠心管に入れて一定に攪拌(400rpm)しながら20℃で2.5時間、可溶化した。遠心分離(20,000g、10分、20℃)後、上清をデカンテーションによって収集し、1:60に希釈した後に、FcR含有率をRP-HPLCによってKnauer Bioselect C4で求めた。分析結果に基づいて、可溶化封入体を、FcR含有率21mg/mLまで20mM Tris/HCl、6Mグアニジン、3mM EDTA、5mM DTT、pH8.0で希釈した。希釈されたFcR溶液の一部を、20部の攪拌(800rpm)されている再折り畳み用緩衝液(20mM Tris/HCl、2M尿素、0.5Mアルギニン、2mMシステアミン、2mMシスタミン、6℃でpH7.7)に滴下した。攪拌せずに密閉容器に入れて10℃で16時間インキュベートした後に、再折り畳み用溶液を室温まで温めた。一定に攪拌(400rpm)しながら、3.5M(NH₄)₂SO₄、20mM NH₄H₂PO₄、pH7.0を滴下することによって、温かい再折り畳み溶液を1.1M(NH₄)₂SO₄に調整した。200rpmでもう1時間、攪拌した後、懸濁液を遠心分離(20,000g、20分、20℃)し、上清を濾過(0.2μm Durapore(登録商標), Millipore)し、濾液を、1.2M(NH₄)₂SO₄、20mM NH₄H₂PO₄、pH7.0で平衡化した35mL フェニルセファロースHPカラム(h=6.6cm、d=2.6cm、GE Healthcare)に、4mL/分、<4mgタンパク質/mL樹脂でロードした。カラムを1.2M(NH₄)₂SO₄、20mM NH₄H₂PO₄、pH7.0 100mLで洗浄した。結合タンパク質を、20mM NH₄H₂PO₄、pH7.0に溶解した1.2M〜0M(NH₄)₂SO₄の350mL直線勾配を用いて5mL/分で溶出した。溶出液を7.5mL画分に収集し、Phenomenex Jupiter C4によるRP-HPLC分析に供した。求められているFcR変異体に対して85％を超える純度を有する画分をプールし、約2倍に濃縮し、伝導率が約5mS/cmに低下するまでタンジェンシャルフロー・フィルトレーション(Vivaflow 50、5kDa MWCO、0.01m²、クロスフロー200mL/分、pIN=2bar; Sartorius)で20mM L-ヒスチジンpH6.5に対してダイアフィルター(diafilter)した。緩衝液交換の後、溶液を、20mM L-ヒスチジン、pH6.5で平衡化した9mL SP Sepharose HPカラム(h=4.5cm、d=1.6cm、GE Healthcare)に、2mL/分、<20mgタンパク質/mL樹脂でロードした。カラムを、20mM L-ヒスチジン、30mM NaCl、pH6.5 30mLで洗浄し、結合タンパク質を、20mM L-ヒスチジン、pH6.5に溶解した20mM〜400mM NaClの90mL直線勾配を用いて3mL/分で溶出した。主ピークを含む画分をプールし、20mM L-ヒスチジンpH6.5を用いて15.4mS/cmに調整し、限外濾過(4,000g、5kDa MWCO, Vivaspin 20, Sartorius)によって約20mg/mLに濃縮し、20mM L-ヒスチジン、150mM NaCl、pH6.5を用いて15mg/mLまで希釈した。希釈されたFcR溶液を濾過(0.45μm PES膜、Puradisc(商標)25mm, Whatman)し、分注し、液体窒素で瞬間凍結し、-80℃で保管した。

沈殿スクリーニング
適量のddH2O、10Xヒスチジン/NaCl原液(200mMヒスチジン、1.5M NaCl)、および硫酸アンモニウム原液(ddH2Oに溶解して4M)を添加することによって、FcRを20mMヒスチジン、150mM NaCl、および0〜2.8M硫酸アンモニウムの存在下で0.7mg/mLに調整した。適切なpHの10Xヒスチジン/NaClおよび硫酸アンモニウムストックを使用することによって、pHを6、7、または8に設定した。各条件について2つ同じものを準備した。試料を25℃で1時間インキュベートし、遠心分離(20,000xg、10分)し、30μLの上清を384ウェルプレート(μclear, non-binding, black, Greiner Bio-one)に移した。280nmでの吸光度を測定し(Spectrofluor plus, Tecan)、タンパク質含有率をランバート・ベールの法則に従って1.5625mLxmg-1xcm-1の質量吸光係数および0.24cmの経路の長さ(path length)を用いて計算した。試料ウェルの吸光度をブランク緩衝液しか含まないウェルの吸光度で補正した。

SDS page
後のジスルフィド交換を抑制するために、可溶化IBまたは再折り畳み用ブロス18μLを、H₂Oに溶解した新たに調製された250mMヨードアセトアミド2μLと混合することによって、遊離チオールをヨードアセトアミドでアルキル化した。混合物を30℃、750rpmで45分間、暗所でインキュベートし、NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)マニュアル(Invitrogen)に従ってSDS-PAGE試料調製に直接使用した。タンパク質を、MESランニング緩衝液(NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標), Invitrogen)の中に入れた4〜12％Bis-Trisゲルによって製造業者の説明書に従って分離した。ゲルをddH₂Oで3回洗浄し、Simply Blue(商標) Safe Stain(Invitrogen)を用いて室温で少なくとも6時間、染色した。分子量マーカーとして、10μLのSeeBlue(登録商標)Plus2 pre-stained standard(Invitrogen)を適用した。

LC-MS
インタクトな発現タンパク質の分子量を、MPI of Biochemistry(Martinsried)と協力して質量分析法によって求めた。30％アセトニトリル、0.05％TFAで予め平衡化されたPhenomenex Aeris(商標)Widepore C₄カラム(100mmx2.1mm、3.6μM粒径、300Å孔径)を備えたESI-TOF質量分析計(microTOF, Bruker)によって試料を分析した。FcR含有試料を0.25mL/分、20℃で注入し、結合タンパク質を、30％〜80％アセトニトリル、0.05％TFAの15分直線勾配によって溶出した。

UV/VIS分光法
必要に応じて、タンパク質溶液を、それぞれの緩衝液を用いて0.2〜0.8のOD₂₈₀まで希釈した。400μLの溶液をUV-マイクロキュベット(UV-cuvette micro,Brand)に移した。280nmおよび320nMでの吸光度を記録し(TidasE, J&M Analytik)、タンパク質濃度、mg/mLを以下の式に従って計算した：
C_{タンパク質}=(OD₂₈₀-OD₃₂₀)x0.64mg/mL

ブランクとして、それぞれの緩衝液を使用した。アッセイを3回繰り返して行い、結果を平均した。

実施例1:沈殿スクリーニング
再折り畳みに基づくプロセスによるFcRタンパク質の製造には、普通、硫安沈殿工程が必要である。コスモトロピック硫酸アンモニウムを添加することによって、折り畳まれていない種および誤って折り畳まれた種のような折り畳み副産物だけでなく、細胞壁成分およびタンパク質のような宿主細胞に由来する不純物も沈殿する。沈殿剤の濃度が増加するにつれて、沈殿効率は上昇し、従って、このような高い硫酸アンモニウム濃度での沈殿に対する耐性がFcR変異体にある限り、高度に精製されたFcR調製物が得られる。従って、1.5Mに等しいか、または1.5Mを上回る硫酸アンモニウム濃度で溶解度の高いFcR変異体を有することが望ましい。高い硫酸アンモニウム濃度は簡単な不純物沈殿に加えてHIC樹脂への効率的な結合を促進する。高い動的結合能は常にクロマトグラフィー捕獲工程の重要な開発目標であるので、高い硫酸アンモニウム濃度の存在下での可溶性は必須である。

硫酸アンモニウムの存在下でFcR変異体の溶解度を評価するために、それぞれの変異体をpH6〜8で漸増濃度の硫酸アンモニウムとインキュベートした。25℃で1時間後に、上清中のFcR濃度をUV/vis分光法によって求めた。図2に示したように、変異体3は硫酸アンモニウムによる沈殿に対して最も耐性が高く、2.05M〜2.13Mの(NH₄)₂SO₄で最大半量が沈殿する。これとは反対に、「変異体2」(SEQ ID NO:8)および「変異体4」(SEQ ID NO:9)は高い硫酸アンモニウム濃度での溶解度が低く、範囲1.70M〜1.76Mの(NH₄)₂SO₄濃度において最大半量が沈殿する。それにもかかわらず、「変異体4」は高い硫酸アンモニウム濃度において依然として可溶性を示す。溶解度のpH依存性は、全てのFcR変異体について、ごくわずかであった。

「変異体1」は十分に再折り畳みせず、従って、沈殿スクリーニング用に可溶性タンパク質を得ることができないので、高い硫酸アンモニウム濃度において「変異体1」の沈殿スクリーニングを行うことはできず、従って、「変異体1」の溶解度を求めることはできないことに留意されたい。

Claims

SEQ ID NO:1のタンパク質をコードする、核酸配列。
請求項1記載の核酸配列を含む、ベクター。
宿主細胞における請求項1記載の核酸配列または請求項2記載のベクターの発現によって得られた、または得ることができる、タンパク質。
宿主細胞が原核生物宿主細胞である、請求項3記載のタンパク質。
宿主細胞が大腸菌である、請求項3または4記載のタンパク質。
SEQ ID NO:6の核酸配列によってコードされる、タンパク質。
請求項3または4記載のタンパク質を含む、薬学的組成物。
SEQ ID NO:2および/または3のタンパク質を含む、組成物。
SEQ ID NO:4および/または5のタンパク質をさらに含む、組成物。
SEQ ID NO:2のタンパク質の量がSEQ ID NO:3のタンパク質の量より多い、請求項8記載の組成物。
SEQ ID NO:2および3のタンパク質の量がSEQ ID NO:4および/または5のタンパク質の量より多い、請求項8〜10いずれか一項記載の組成物。
請求項1記載の核酸配列または請求項2記載のベクターを含む、宿主細胞。
原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞である、請求項12記載の宿主細胞。
大腸菌である、請求項12記載の原核生物宿主細胞。
大腸菌BL21である、請求項14記載の原核生物宿主細胞。
コードされるタンパク質の発現を可能にする条件下で請求項12〜15いずれか一項記載の宿主細胞を培養する工程および得られた薬学的組成物を回収する工程を含む、薬学的組成物を製造する方法。