JP4843595B2 - 生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤及び除去阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、マクロファージによる生体内でアポトーシスを起こした細胞（以下「アポトーシス細胞」という）の除去促進剤や、マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤に関する。

生理的な条件下で細胞自らが積極的に惹起するようにプログラムされた細胞死、すなわちアポトーシスは、免疫系において老化した細胞や病態細胞などの生体にとって好ましくない細胞を排除するために生体に備わった機構であることが知られている。このアポトーシスは細胞サイズの急速な縮小と細胞核の変化を特徴とし、アポトーシス細胞は通常アポトーシス小体となり、最終的にはマクロファージ等の食細胞により貪食される。すなわち、まず細胞が縮小して隣接細胞から離れ、核のＤＮＡとタンパク質との複合体であるクロマチンが核膜周辺に凝縮し、核の濃縮が生じると共に細胞表面の微絨毛が消失して平滑化し、大小の突起が出現し、やがてそれらがくびれてちぎれ、膜に包まれた大小の球状のアポトーシス小体に断片化し、これらの小体がマクロファージや隣接する食細胞により貪食除去されることはよく知られている。

ところで、ガン細胞や悪性腫瘍細胞のような病態細胞の増殖を阻害して、これらの細胞に起因する疾病を治療するものとしては、これまで、アミノプテリン、メトトレキセート、８−アザグアニン、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、１−（２−テトラヒドロフリル）−５−フルオロウラシルなどの合成物質、マイトマイシンＣ、クロモマイシン、ブレオマイシンなどの抗生物質、インターフェロン、ＣＳＦ抑制物質、ＣＢＦなどが知られているが、これらはいずれも所定の細胞に作用して、それを壊死すなわちネクローシスを起こさせて病態細胞を排除するものである。ネクローシスは病理的要因によって起こるが、アポトーシスはネクローシスと異なり、病理的要因のみならず多様な生理的要因によっても生じるといわれている。

アポトーシスは、その初期過程において、細胞を構成する細胞膜リン脂質の配列変化を伴い、結果として負電荷のリン脂質であるホスファチジルセリン（phosphatidylserine）の細胞表面へ露出することが報告されている（非特許文献１，２参照）。この細胞表面の変化がマクロファージや隣接する細胞に認識され、貪食過程が進行すると考えられている。ホスファチジルセリンと選択的に結合するアネキシンＶにより前記貪食過程が阻害されることから、アポトーシス細胞の細胞表面にホスファチジルセリンが露出することが貪食機構に重要な役割を果たしているものと考えられている（非特許文献３，４参照）。また、アネキシンＶの標識体を用いて、アポトーシスの初期過程の検出がフローサイトメトリーにより行われている。

他方、脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８；milk fat globule-EGF factor8）は、母乳中に多く含まれる乳腺上皮由来の分泌蛋白質としてクローニングされ（非特許文献５参照）、その後、他の多くの正常組織やいくつかの腫瘍細胞で強く発現する分泌型糖タンパク質として知られている。ＭＦＧ−Ｅ８は、Ｎ末端側から２つのＥＧＦ（上皮増殖因子）ドメインと血液凝固因子Ｖ，VIIIのＣ１，Ｃ２ドメインとホモロジーのあるドメインで構成されている。ＭＦＧ−Ｅ８はヒト（ＢＡ４６，lactadherin）、マウス（ＭＦＧ−Ｅ８）、ラット（ｒＡＧＳ）、ブタ（Ｐ４７）、ウシ（ＰＡＳ−６，ＰＡＳ−７）を含め幾つかの哺乳類でそのホモログが報告されており、さらに、ＭＦＧ−Ｅ８とドメイン構造の類似性がある内皮細胞特異的細胞接着分子ＤＥＬ１がクローニングされており、ＭＦＧ−Ｅ８及びＤＥＬ１は２番目のＥＧＦドメイン内にはインテグリンと結合するＲＧＤ配列を含んでいる。一方、Ｃ末側のＣ１，Ｃ２ドメインは細胞膜のリン脂質に結合することが知られている。しかし、このＭＦＧ−Ｅ８は、酵素活性との関連やその生理機能について不明な点が多く、この点を明らかにするために、マウス脂肪球被膜糖蛋白質ＭＦＧ−Ｅ８のゲノム遺伝子と染色体マッピング、発生過程における遺伝子発現の動態、細胞内局在などについて検討されており、生殖原基がＭＦＧ−Ｅ８の発生初期の主要発現部位であり、発生の後期になると神経細胞や軟骨原基に特徴的な非常に強い発現があるとされている。また、生体内におけるＭＦＧ−Ｅ８の機能を探るために、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子欠損マウス作製の試みがなされている。

Immunol. Today, 14: 131-136, 1993 Cirk. Res., 77: 1136-1142, 1995 Biochem. Biophys. Res. Commun., 205: 1488-1493,1994 Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 93: 1624-1629,1996 Biochem. Biophys. Res. Commun. 254 (3), 522-528, 1999

アポトーシスは生体の恒常性維持に重要な役割を果たしている。アポトーシスを起こしている細胞（アポトーシス細胞）が分泌する有害な物質から正常細胞を保護するためにも、アポトーシス細胞は速やかにマクロファージによって除去する必要がある。例えば、ガン細胞にアポトーシスを積極的に誘導し、ガンの治療を行うこともできるが、かかる場合であってもアポトーシス細胞を速やかに除去する必要がある。本発明の課題は、マクロファージによって生体内のアポトーシス細胞を速やかに除去することができるアポトーシス細胞の除去促進剤や、マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去を阻害する除去阻害剤を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ）が、細胞がアポトーシスへ向かいはじめると細胞表面に露出するホスファチジルセリン（ＰＳ）などのアミノリン脂質を認識することで、アポトーシス細胞に特異的に結合し、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌがマクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用を促進することや、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの点変異誘導体であるＤ８９Ｅ変異体がマクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用を阻害することを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）１つの高プロリン／スレオニン含有ドメイン及び２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）を有するＭＦＧ−Ｅ８において、ＲＧＤモチーフに点変異をもち、かつマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８変異体を有効成分とすることを特徴とするマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤に関する。

また本発明は、（２）ＭＦＧ−Ｅ８変異体が、組換えＭＦＧ−Ｅ８変異体であることを特徴とする上記（１）記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤や、（３）組換えＭＦＧ−Ｅ８変異体が、組換えヒトＭＦＧ−Ｅ８変異体又は組換えマウスＭＦＧ−Ｅ８変異体であることを特徴とする上記（２）記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤や、（４）組換えＭＦＧ−Ｅ８変異体が、ヒト細胞中での翻訳産物であることを特徴とする上記（２）又は（３）記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤に関する。

また本発明は、（５）ＭＦＧ−Ｅ８変異体が、ＲＧＤモチーフの８９位のアスパルギン酸をグルタミン酸に置換した変異体であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤に関する。

また本発明は、（６）ＭＦＧ−Ｅ８変異体が、リポソームに封入又は包埋されていることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤や、（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載されたＭＦＧ−Ｅ８変異体をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有効成分とすることを特徴とするマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤に関する。

さらに本発明は、（８）上記（１）〜（５）のいずれかに記載されたＭＦＧ−Ｅ８変異体を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞を有効成分とすることを特徴とするマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤に関する。

本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤としては、脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ）や、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有効成分とするものであれば特に制限されるものではなく、ここでＭＦＧ−Ｅ８−Ｌとは長鎖ＭＦＧ−Ｅ８（ＭＦＧ−Ｅ８のロングフォーム）を意味し、例えばマウスＭＦＧ−Ｅ８−Ｌとしては配列表の配列番号１に示されるように４６３アミノ酸残基からなるＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを挙げることができ、また、マウスＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を挙げることができる。また、上記ＭＦＧ−Ｅ８−ＬやＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体の由来はマウスに限定されるものでなく、ヒト（別名；ＢＡ４６，lactadherin）、ラット（別名；ｒＡＧＳ）、ブタ（別名；Ｐ４７）、ウシ（別名；ＰＡＳ−６，ＰＡＳ−７）等に由来するＭＦＧ−Ｅ８−ＬやＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体も用いることができるが、マクロファージによるヒト生体内のアポトーシス細胞の除去促進には、ヒトＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを特に有利に用いることができる。

また、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌやマクロファージによるアポトーシス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体としては、組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又は組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体、好ましくは、組換えヒトＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ若しくは組換えマウスＭＦＧ−Ｅ８−Ｌや、組換えヒトＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体若しくは組換えマウスＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有利に用いることができる。これら組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌや組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体は、公知の方法により調製することができるが、宿主細胞としてヒト細胞を用いたヒト細胞中での翻訳産物であることが好ましい。ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの構造の中には、１つのシグナル配列、２つのＥＧＦドメイン（ＥＧＦ−１及びＲＧＤモチーフを有するＥＧＦ−２）、１つの高プロリン／スレオニン含有ドメイン（高Ｐ／Ｔ含有ドメイン）、２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）が存在するが、組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はマクロファージによるアポトーシス細胞の除去促進作用を有する組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体として、ＲＧＤモチーフを有するＥＧＦ−２ドメイン、高プロリン／スレオニン含有ドメイン、２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）を有するものが好ましい。

また、本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤としては、上述のＭＦＧ−Ｅ８−Ｌやマクロファージによるアポトーシス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体が、リポソームに封入又は包埋されている生体内アポトーシス細胞除去促進剤を挙げることができ、リポソーム膜を構成する脂質としては、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等のカチオン性リポソーム膜を好適に例示することができる。また、上記ＭＦＧ−Ｅ８−ＬやＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を含むリポソーム膜に、アポトーシス細胞に選択的に反応するモノクローナル抗体、例えば後述する抗ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌモノクローナル抗体を結合させ、イムノリポソームとすることもできる。

さらに、本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤として、上述のＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はマクロファージによるアポトーシス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有効成分とする生体内アポトーシス細胞除去促進剤を挙げることができる。上記組換えベクターとしては、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬをコードするＤＮＡ、例えば配列番号２に示される塩基配列からなるマウスＭＦＧ−Ｅ８遺伝子や、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体をコードするＤＮＡを含むベクターであれば特に制限されないが、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を宿主細胞内で発現させることができる発現系を含むものが好ましく、例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、より具体的には、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。

本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤として、上述のＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はマクロファージによるアポトーシス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞を有効成分とする生体内アポトーシス細胞除去促進剤を挙げることができる。ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体をコードするＤＮＡやかかるＤＮＡを含むベクターなどの上記発現系の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができるが、ヒト細胞が好ましい。

さらにまた、本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤として、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌやマクロファージによるアポトーシス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体に対する抗体を挙げることができる。かかる抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらの抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に、上記ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ若しくはＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体又はその一部、あるいは実施例に述べられているようにチオグリコレート刺激腹腔マクロファージを抗原として用いて作製することができるが、その中でも抗ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌモノクローナル抗体又は抗ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体モノクローナル抗体がマクロファージによるアポトーシス細胞の優れた除去促進作用の点でより好ましい。例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。さらに、一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することや、また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用することもできる。

本発明の生体内のアポトーシス細胞の除去方法としては、上述のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤を用いる方法であれば特に制限されるものではない。また、本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去不全に起因する疾病の治療薬や生体防御機能増強剤としては、上述のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進剤を含有するものであれば特に制限されるものではなく、かかるマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去不全に起因する疾病としては、アポトーシス減少に起因する疾患、例えば、各種癌、各種自己免疫疾患、各種ウイルス疾患等を挙げることができる。上記生体内アポトーシス細胞除去促進剤を治療薬や生体防御機能増強剤として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら治療薬や生体防御機能増強剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができ、あるいは、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができるが、経口投与の場合は生体内アポトーシス細胞除去促進剤を前述のリポソーム封入・包埋タイプとしておくことが好ましい。そしてまた、本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去不全に起因する疾病の治療方法としては、上記治療薬や生体防御機能増強剤を用いる治療方法であれば特に制限されるものではない。

本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤としては、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有効成分とするものであればどのようなものでもよいが、これらアポトーシス細胞除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体としては、組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体、好ましくは組換えヒトＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体若しくは組換えマウスＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有利に用いることができる。これら組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体は、公知の方法により調製することができるが、宿主細胞としてヒト細胞を用いたヒト細胞中での翻訳産物であることが好ましい。前記のように、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの構造の中には、１つのシグナル配列、２つのＥＧＦドメイン（ＥＧＦ−１及びＲＧＤモチーフを有するＥＧＦ−２）、１つの高プロリン／スレオニン含有ドメイン（高Ｐ／Ｔ含有ドメイン）、２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）が存在するが、アポトーシス細胞除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体として、１つの高プロリン／スレオニン含有ドメイン及び２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）を有しＲＧＤモチーフに点変異をもつＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体、例えばマウスＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの８９番目のアミノ酸Ｄ（アスパラギン酸）がＥ（グルタミン酸）に置換されたＤ８９Ｅ変異体を好適に例示することができる。

また、本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤としては、前記の生体内アポトーシス細胞除去促進剤の場合におけると同様に、上記ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体がリポソームに封入又は包埋されている生体内アポトーシス細胞除去阻害剤や、上記ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有効成分とする生体内アポトーシス細胞除去阻害剤や、上記ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞を有効成分とする生体内アポトーシス細胞除去阻害剤を挙げることができる。

本発明の生体内のアポトーシス細胞の除去阻害方法としては、上述のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤を用いる方法であれば特に制限されるものでなく、また、本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害不全に起因する疾病の治療薬や治療方法も、マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤を利用するものであれば特に制限されるものではない。

本発明の生体内のアポトーシス細胞の検出剤としては、前述のＭＦＧ−Ｅ８−Ｌや、マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体や、又はこれらに対する抗体や、あるいはマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体の標識体、すなわち標識化ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ、標識化生体内アポトーシス細胞除去促進作用ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体、標識化抗ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ抗体、標識化抗生体内アポトーシス細胞除去促進作用ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体抗体、標識化生体内アポトーシス細胞除去阻害作用ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を有効成分とするものであればどのようなものでもよく、上記標識体としては、上記ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体等に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ又は³Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを結合させたものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を具体的に例示することができる。これら標識体は常法により作製することができ、これら標識体を用いることによって、生体内でアポトーシスを起こしている細胞や組織を検出することができる。また、上記標識体は、アポトーシス細胞・組織の検出剤のほか、例えば、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ等の精製や、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌと相互作用するタンパク質の検出や、当該分野の研究用試薬としても有用である。

本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進誘導物質又は除去促進抑制物質のスクリーニング方法としては、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ若しくはマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去促進作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体、又はこれらに対する抗体と、被検物質を接触させ、生体内におけるアポトーシス細胞の除去の程度を評価するスクリーニング方法であれば特に制限されるものではなく、また、本発明のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害誘導物質又は除去阻害抑制物質のスクリーニング方法としては、マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体と、被検物質を接触させ、生体内におけるアポトーシス細胞の除去阻害の程度を評価するスクリーニング方法であれば特に制限されるものではなく、上記ＭＦＧ−Ｅ８−ＬやＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体等として、それらを発現している細胞も使用することができる。

また、上記生体内におけるアポトーシス細胞の除去又は除去阻害の程度を評価する方法としては、例えば、インビボやインビトロで、被検物質とＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ等の存在下、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用を測定・観察し、被検物質が非存在下の対照の場合と比較・評価する方法を具体的に例示することができる。これらスクリーニング方法により得られる、生体内のアポトーシス細胞の除去促進誘導物質や除去阻害抑制物質は、マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去不全に起因する疾病の治療薬や生体防御機能増強剤として用いうる可能性があり、他方、除去促進抑制物質や除去阻害誘導物質は、マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害不全に起因する疾病の治療薬として用いうる可能性がある。そして、生体内のアポトーシス細胞の除去促進誘導物質としては、インテグリンα_Vβ₃をコードするＤＮＡの発現系やチオグリコール酸塩を、生体内のアポトーシス細胞の除去促進抑制物質としては、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部を含む発現系を挙げることができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例Ａ［材料と方法］
実施例Ａ−１（インテグリンα_Vβ₃発現マウスＮＩＨ３Ｔ３形質転換体の樹立）
ｐＭＸベクター（Exp. Hematol. 24, 324-329, 1996）中にマウスインテグリンα_V及びβ₃ ｃＤＮＡをもつレトロウィルス（J. Cell. Biol. 132, 1161-1176, 1996、J. Cell Biochem. 81, 320-332, 2001）をマウス繊維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８）に感染させ、インテグリンα_V及びβ₃を発現するマウスＮＩＨ３Ｔ３形質転換体を樹立した。

実施例Ａ−２（抗体の調製）
モノクローナル抗体を作製するため、１．５×１０⁷のチオグリコレート刺激腹腔マクロファージを、４週間間隔でアルメニアンハムスター（Oriental Yeast社製）に皮下注射した。フットパッドに細胞を注入し、最終ブースターとした。膝窩部リンパ節及び鼠径部リンパ節から得られた細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９７）とを常法により融合させ、ＨＡＴ培地中でハイブリドーマを選択した。ハイブリドーマの培養上澄液に対して貪食作用分析（phagocytosis assay）を行い、陽性ハイブリドーマをＧＩＴ培地（Nihon Seiyaku社製）で培養し、プロテインＡセファロース（Amersham-Pharmacia社製）で精製し、２４２２モノクローナル抗体を得た。

また、マウスＭＦＧ−Ｅ８に対するウサギ抗体をペプチド研究所（大阪府箕面市）で調製した。すなわち、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Pierce社製）と共にスカシガイヘモシアニンと結合したペプチド（ＣＮＳＨＫＫＮＩＦＥＫＰＦＭＡＲ；配列番号３）を用いてウサギを免疫した。かかるペプチドを結合させたＡＦ−アミノ−トヨパール（Toyopearl）（Tosoh社製）を使用して、ウサギ血清から抗体をアフィニティー精製した。

実施例Ａ−３（組換えＭＦＧ−Ｅ８の作製）
組換えＭＦＧ−Ｅ８の作製には、配列番号２に示されるマウスＭＦＧ−Ｅ８遺伝子を用いた。pEF-BOS-EXベクター（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3461-3466, 1998）を用いて、Ｃ末端にマーカーペプチドであるＦＬＡＧを結合させたＭＦＧ−Ｅ８を、常法によりヒト２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）中で発現させた。抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（Sigma社製）を用いて、培地中に分泌されたＭＦＧ−Ｅ８を精製した。ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの構造の中には、１つのシグナル配列、２つのＥＧＦドメイン（ＥＧＦ−１及びＲＧＤモチーフを有するＥＧＦ−２）、１つの高プロリン／スレオニン含有ドメイン（高Ｐ／Ｔ含有ドメイン）、２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）が存在する（図３上図参照）。そこで、組換えＰＣＲを利用して、以下のＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体をコードするＤＮＡを常法により作製し、上記pEF-BOS-EXベクターを用いて発現プラスミドを構築した。これら発現プラスミドをヒト２９３Ｔ細胞中で発現させ、高Ｐ／Ｔ含有ドメインを欠失したスプライスバリアントである“ＭＦＧ−Ｅ８−Ｓ”や、シグナル配列がインフレームでＣ２ドメインと融合した“Ｃ２変異体”や、シグナル配列がインフレームでＣ１−Ｃ２ドメインと融合した“Ｃ１Ｃ２変異体”や、Ｃ１及びＣ２ドメインを欠失した不完全な形態である“Ｅ１Ｅ２ＰＴ”や、ＲＧＤモチーフの８９位のアスパルギン酸をグルタミン酸に置換した“Ｄ８９Ｅ変異体”を作製した。

実施例Ａ−４（貪食作用分析）
１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に３％（ｗ／ｖ）のチオグリコール酸塩（Sigma社製）を注入した。チオグリコール酸塩で刺激された腹腔マクロファージを４日後に回収し、１０％のＦＣＳを含んだＤＭＥＭで培養した。貪食作用分析のために、４週齢から８週齢のＩＣＡＤ−Ｓｄｍマウス（Genes Dev. 14,549-558, 2000）の胸腺細胞を、１０％のＦＣＳを含んだＤＭＥＭにおいて、１０μＭのデキサメタゾンとともに３７℃で４時間インキュベーションした。４８ウェルの細胞培養プレート上で成長した２．５×１０⁵のマクロファージに、胸腺細胞（１×１０⁶）を添加し、１．５時間貪食させた。かかるプレートからマクロファージを分離し、２．５μｇ／ｍｌのラット抗マウスＦｃγIII／II受容体（BD PharMingen社製）の存在下で、４μｇ／ｍｌのフィコエリトリン結合ラット抗マウスＭａｃ−１抗体（BD PharMingen社製）を含むＦＡＣＳ染色緩衝液（２％のＦＣＳ及び０．０２％のＮａＮ₃を含むＰＢＳ）を用いて氷上で３０分間のインキュベーションを行った。かかる細胞を１％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１％のトリトンＸ−１００で処理して、１ｍＭのＣｏＣｌ₂及び０．０１％のＢＳＡを含む１００ｍＭのカコジル酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）１００μｌ中に懸濁した。１００単位／ｍｌの末端デオキシヌクレオチジル転移酵素（Takara Shuzo社製）及び２．５μＭのＦＩＴＣ標識ｄＵＴＰ（Roche Diagnostics社製）を用いて、ＴＵＮＥＬ反応を３７℃で４５分間行い、ＦＡＣＳキャリバー（Becton-Dickinson社製）を使用したフローサイトメトリーで分析した。

また、顕微鏡下での細胞観察によっても、貪食作用を評価した。すなわち、腹腔マクロファージ（１×１０⁵個）又はＮＩＨ３Ｔ３細胞（２×１０⁴個）を、０．１％のゼラチンでコーティングした８ウェルのＬａｂ−ＴｅｋIIチャンバースライド（Nalge Nunc社製）中で培養し、アポトーシス下の胸腺細胞への貪食作用を上記のとおり進行させた。固定後、Apoptag kit（Intergen社製）を用いて、かかる細胞をＴＵＮＥＬ反応させ、光学顕微鏡で観察した。

実施例Ａ−５（ＭＦＧ−Ｅ８の同定）
ジメチルピメリミデート（dimethyl pimelimidate）（ＤＭＰ、Pierce社製）を用いて、２４２２モノクローナル抗体をプロテインＡセファロース（蛋白質２ｍｇ／ｍｌベッド容積）に共有結合させた。２４２２モノクローナル抗体が認識した分子を、マウスＰ３８８Ｄ１細胞から免疫沈降法で精製した。すなわち、２．４×１０⁹の細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液（１％のトリトンＸ−１００、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０％のグリセロール、１ｍＭの[ｐ−アミジノフェニル]メタンスルホニルフルオライドハイドロクロライド([p-amidinophenyl] methanesulfonylfluoride hydrochloride)、１μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１μｇ／ｍｌのペプスタチンを含む５０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液[ｐＨ７．６]）に溶解した。３ｍｌのヒトＩｇＧセファロースでかかる溶解物をあらかじめ処理し、１５０μｌの２４２２モノクローナル抗体−プロテインＡセファロースとともに２時間インキュベーションした。０．５ＭのＮａＣｌを含んだＲＩＰＡ緩衝液で洗浄した後、０．１％のトリトンＸ−１００を含んだ１００ｍＭのトリエチルアミン（ｐＨ１１．５）で、ビーズに結合した蛋白質を溶出し、１０％のポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜にブロットした。かかる固定化した蛋白質を還元し、Ｓ−カルボキシメチル化し（S-carboxymethylated）、文献（J. Biochem. (Tokyo) 120, 29-34, 1996）記載のとおり、アクロモバクタープロテアーゼＩで分解した。かかる膜から解離したペプチドに、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を行った。

実施例Ａ−６（固相ＥＬＩＳＡ及び細胞接着分析）
文献（Biochemistry 36, 5441-5446, 1997）記載のとおり、リン脂質と結合したＭＦＧ−Ｅ８に対して固相ＥＬＩＳＡを行った。すなわち、リン脂質のメタノール溶液（３μｇ／ｍｌで１００μｌ）を９６ウェルのマイクロタイタープレートに添加し、風乾した。１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＰＢＳでかかるウェルを処理した。ＭＦＧ−Ｅ８をウェルに添加し、室温で１時間インキュベーションした。０．０５％のツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体及びペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いて、ウェルに結合したＭＦＧ−Ｅ８をＥＬＩＳＡで定量した。ペルオキシダーゼ検出キット（Sumitomo Bakelite社製）で、ペルオキシダーゼ活性を検出した。

細胞をリン脂質に結合させるＭＦＧ−Ｅ８の能力を分析するため、前述のとおり、リン脂質でコーティングしたマイクロタイタープレートにＭＦＧ−Ｅ８を結合させた。細胞（４×１０⁴）を含むタイロード緩衝液（５ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液[ｐＨ７．４]、１３５ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１．０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのグルコース、及び１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベーションした。励起波長４８５ｎｍ及び発光（emission）波長５２０ｎｍに設定した蛍光マイクロプレートリーダー（fluorescent microplate reader）（BioLumin 960、Molecular Dynamics社製）を用いたCyQUANT Cell Proliferation Assay kit（Molecular Probes社製）により、プレートに付着した細胞を定量した。

実施例Ｂ［結果］
実施例Ｂ−１（アポトーシス細胞への貪食作用を増大させるモノクローナル抗体の樹立）
カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ（ＣＡＤ）の阻害たんぱく質であるＩＣＡＤのカスパーゼ抵抗変異体を発現している細胞はアポトーシスによってＤＮＡが断片化することはないが、マクロファージに貪食されるとＤＮＡが切断される（GenesDev. 14, 549-558, 2000）。このシステムを利用して、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用について調べた。ＩＣＡＤ−Ｓｄｍ（短鎖カスパーゼ抵抗性ＩＣＡＤ）マウス由来の胸腺細胞をデキサメタゾンで４時間処理して、又は無処理のままで、フィコエリトリン結合アネキシンＶ（BD PharMingen社製）又はＦＩＴＣ結合ｄＵＴＰを用いたＴＵＮＥＬで染色した。図１ａに示される結果からわかるように、ＩＣＡＤ−Ｓｄｍマウスの胸腺細胞をデキサメタゾンで処理したところ、およそ５０％の細胞が４時間以内にアネキシンＶ陽性となったが、ＴＵＮＥＬによる染色はされなかった。

次に、チオグリコレート刺激マウス腹腔マクロファージを、調製したばかりのＩＣＡＤ−Ｓｄｍマウス由来の胸腺細胞又はデキサメタゾンで処理したＩＣＡＤ−Ｓｄｍマウス由来の胸腺細胞とともにインキュベーションした。かかる細胞を、フィコエリトリン結合抗Ｍａｃ−１抗体で染色し、ついでＦＩＴＣ−ｄＵＴＰでＴＵＮＥＬ染色した。マクロファージを、調製したばかりの胸腺細胞ではなく、アポトーシス下のＩＣＡＤ−Ｓｄｍ胸腺細胞と共培養すると、およそ４０％のＭａｃ−１⁺細胞（マクロファージ様細胞株の細胞表面抗原Ｍａｃ−１発現細胞）がＴＵＮＥＬ陽性となった（図１ｂ下）。デキサメタゾン処理した胸腺細胞とインキュベーションする３０分前に、バフィロマイシン（１００ｎＭ）をマクロファージに添加した。このように、リソソームの酸化を妨げるバフィロマイシン（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7972-7976, 1988）でマクロファージを処理すると、ＴＵＮＥＬ陽性マクロファージの出現が阻害された。なお、図１ｂ上は、Ｍａｃ−１⁺群におけるＴＵＮＥＬ染色のプロフィールを示す。これらの結果より、かかるマクロファージはアポトーシス細胞を特異的に取り込み、その染色体ＤＮＡを分解することがわかった。

このプロセスを仲介する物質を同定するため、チオグリコレート刺激マウス腹腔マクロファージを用いて、アルメニアンハムスターを免疫し、ハイブリドーマを調製した。特定の抗体（２４２２モノクローナル抗体）が、貪食作用を促進することがわかった。すなわち、１２μｇ／ｍｌの正常ハムスターＩｇＧ、又は２４２２モノクローナル抗体の存在下又は非存在下で貪食作用を分析した。Ｍａｃ−１⁺群におけるＴＵＮＥＬ染色のＦＡＣＳのプロフィールを図１ｃに示す。数字は、Ｍａｃ−１⁺群におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の比率を示す。これらの結果から、２４２２モノクローナル抗体の存在下で、アポトーシス細胞を取り込むマクロファージの比率が４４％から５７％に上昇することがわかった。また、光学顕微鏡（×４００）で観察したところ、図１ｄに示されるように、２４２２モノクローナル抗体の存在下では、アポトーシス細胞を取り込むマクロファージの数だけではなく、１つのマクロファージが取り込むアポトーシス細胞の数も増大することがわかった。

実施例Ｂ−２（２４２２モノクローナル抗体認識蛋白質の同定）
２４２２モノクローナル抗体により認識される蛋白質を同定するため、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージ及びマクロファージ細胞株Ｐ３８８Ｄ１をビオチンで表面標識し、２４２２モノクローナル抗体により認識される蛋白質の免疫沈降を行った。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて免疫沈降物のウェスタンブロットを行ったところ、図２ａに示されるように、７２ｋＤａ及び５６ｋＤａのバンドが現れた。図２ａからわかるように、Ｐ３８８Ｄ１細胞株は腹腔マクロファージよりも豊富にかかる蛋白質を発現するため、Ｐ３８８Ｄ１細胞の大規模な培養を行い、２４２２モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物からかかる抗体が認識する蛋白質をアフィニティー精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＰＶＤＦ膜に移してPonceau-Sで染色した。結果を図２ｂに示す。図２ｂ中の矢印は、蛋白質配列分析にかけた蛋白質及びプロテインＡセファロースから解離したＩｇＧを示す。７２ｋＤａ及び５６ｋＤａの蛋白質から作製したペプチドの質量分析を行ったところ、それらがマウスＭＦＧ−Ｅ８であることがわかった（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8417-8421, 1990、Biochem.Biophys. Res. Commun. 254. 522-528, 1999）。

マウスＭＦＧ−Ｅ８配列を有するプライマーを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、マウス腹腔マクロファージからｃＤＮＡの２つのクラス（ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ及びＭＦＧ−Ｅ８−Ｓ）を単離した。次に、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージ及びＰ３８８Ｄ１細胞由来の全ＲＮＡ（７．５μｇ）を、１．５％のアガロースゲル上での電気泳動で分離し、³²Ｐ標識マウスＭＦＧ−Ｅ８ ｃＤＮＡを使用したノーザンハイブリダイゼーションで分析した（図２ｃ上図；図２ｃ下図では、フィルターを０．０５％（ｗ／ｖ）のメチレンブルーで染色している。）ノーザンブロット分析によって、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージ及びＰ３８８Ｄ１においてＭＦＧ−Ｅ８ ｍＲＮＡが豊富に発現していることがわかった。これに対し、休止期の腹腔マクロファージ及び胸腺細胞では、ＭＦＧ−Ｅ８ ｍＲＮＡがほとんど検出されなかった。Ｊ７７４Ａ．１及びＢＡＭ３など他のマクロファージ細胞株、並びに繊維芽細胞系ＮＩＨ３Ｔ３は、ＭＦＧ−Ｅ８ ｍＲＮＡをほとんど発現していなかった（図２ｃ）。

チオグリコレート刺激腹腔マクロファージ及びＰ３８８Ｄ１由来の全ＲＮＡ（０．３μｇ）をＲＴ−ＰＣＲで分析した。図２ｄ右図は、ＭＦＧ−Ｅ８ ｍＲＮＡの一部分を示す概略図である。矢印は、使用したプライマーの位置を示す：センスプライマーはATGCAGGTCTCCCGTGTGCT（配列番号４：Ｐ１）、アンチセンスプライマーはGCGGAAATCTGTGAATCAGC（配列番号５：Ｐ２）である。アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を分離した。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージ中のＭＦＧ−Ｅ８ ｍＲＮＡが主に長鎖（ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ）をコードするのに対し、Ｐ３８８Ｄ１細胞が発現するのは圧倒的に短鎖（ＭＦＧ−Ｅ８−Ｓ）であることがわかった。そこで、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージ及びＰ３８８Ｄ１を４８時間培養した。細胞溶解物と培養上澄液を２４２２モノクローナル抗体で免疫沈降し、ウサギ抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体を用いてウェスタンブロットを行った。結果を図２ｅに示す。図２ｅ中右側矢印は、ＭＦＧ−Ｅ８蛋白質を示す。ＭＦＧ−Ｅ８は、Ｎ−末端にシグナル配列を有しているが、推定膜貫通領域は有していないことから、分泌蛋白質であると示唆されている。これら結果に示されているように、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージの培養上澄液には、実際、７４ｋＤａのＭＦＧ−Ｅ８が大量に含まれている。一方、Ｐ３８８Ｄ１細胞は、その細胞溶解物中にはかなりの量のＭＦＧ−Ｅ８が含まれているにもかかわらず、無視できる程度のＭＦＧ−Ｅ８しか分泌していなかった。このことは、Ｐ３８８Ｄ１中で発現したＭＦＧ−Ｅ８が充分に分泌されていないことを示唆している。なお、図２ｅ中＊で示したバンドは、ＭＦＧ−Ｅ８の分解生成物と思われる。

実施例Ｂ−３（アポトーシス細胞上に露出したアミノリン脂質へのＭＦＧ−Ｅ８の結合）
ＭＦＧ−Ｅ８がアポトーシス細胞に結合するかどうかを調べるため、ＦＬＡＧ結合組換えＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ（図３ａ）をヒト２９３Ｔ細胞中で作製し、精製して均一化した。調製したばかりの野生型胸腺細胞（５×１０⁵個）又はデキサメタゾンで４時間処理した胸腺細胞を、０．２５μｇ／ｍｌのＦＬＡＧ結合ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌとともに４℃で３０分間インキュベーションし、ついでビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体及びフィコエリトリン結合ストレプトアビジンで二重染色した。固定した後、ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰを用いて細胞をＴＵＮＥＬ染色し、ＦＡＣＳで分析した。結果を図３ｂに示す。図３ｂからもわかるように、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌは単離したばかりの胸腺細胞には結合しないが、デキサメタゾンで処理した胸腺細胞にはしっかりと結合した。かかるデキサメタゾンで処理した胸腺細胞を、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬとＴＵＮＥＬで二重染色すると、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬがＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス細胞に特異的に結合していることがわかる。

前記のように、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌには、１つのシグナル配列、２つのＥＧＦドメイン、１つの高プロリン／スレオニン含有ドメイン（高Ｐ／Ｔ含有ドメイン）、及び２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）がある。ＭＦＧ−Ｅ８−Ｓは、異なる形でスプライシングされたＭＦＧ−Ｅ８ ｍＲＮＡにコードされており、高Ｐ／Ｔ含有ドメインを欠失している。ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌのどのドメインがアポトーシス細胞への結合に関与しているのかを調べるために、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｓ及び一連のＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ変異体を用いて調べてみた。胸腺細胞をデキサメタゾンで６時間処理し、種々のＭＦＧ−Ｅ８誘導体０．２５μｇ／ｍｌとともにインキュベーションした。胸腺細胞に結合したＭＦＧ−Ｅ８に対し、ＦＩＴＣ標識抗ＦＬＡＧ抗体を用いたＦＡＣＳ分析を行った。結果を図３ｃに示す。なお、図３ｃ中の点線はＭＦＧ−Ｅ８非存在下での染色のプロフィールを示す。図３ｃに示すように、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌだけではなく、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｓ、ＲＧＤモチーフに点変異をもつＤ８９Ｅ、Ｃ１ドメインとＣ２ドメインのみを含むＣ１Ｃ２も、アポトーシス下の胸腺細胞に結合した。

ところで、アネキシンＶは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を認識することによってアポトーシス細胞に結合することが知られている（Blood 84, 1415-1420,1994）。そこで、デキサメタゾンで６時間処理した胸腺細胞を、１．２５μｇ／ｍｌのＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又は種々の変異体とともにインキュベーションし、フィコエリトリン結合アネキシンＶで染色した。結果を図３ｄ示す。図３ｄ中の点線は、ＭＦＧ−Ｅ８非存在下でのアネキシンＶ染色のプロフィールを示す。図３ｄからわかるように、アポトーシス下の胸腺細胞をＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＤ８９Ｅで前処理すると、アネキシンＶのアポトーシス細胞への結合が大きく阻害された。また、アネキシンＶの結合に対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの阻害効果は投与量依存的であり、０．２５μｇ／ｍｌのＭＦＧ−Ｅ８−Ｌで処理すると、アネキシンＶの結合が５０％阻害された。一方、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｓ又はＣ１Ｃ２の存在によってアネキシンＶのアポトーシス細胞への結合が阻害されることはなかった。このことから、アポトーシス細胞に対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｓの親和性は、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの親和性と比較してかなり低いことがわかる。

アネキシンＶのアポトーシス細胞への結合に対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの拮抗的作用から、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬがＰＳに結合することが示唆された。そこで、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの各種リン脂質への結合について調べてみた。ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）又はホスファチジルイノシトール（ＰＩ）でコーティングしたマイクロタイタープレートを、段階的に濃度を上昇させたＭＦＧ−Ｅ８−Ｌとともにインキュベーションし、ウェルに結合したＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたＥＬＩＳＡで定量した。結果を図３ｅに示す。図３ｅからわかるように、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌは、ＰＳ又はＰＥでコーティングしたプレートに飽和状態で結合したが、ＰＣ又はＰＩでコーティングしたプレートにはＭＦＧ−Ｅ８−Ｌは有意とされるほど結合しなかった。

次に、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌと同様にアネキシンＶのアポトーシス細胞への結合に対して拮抗作用を有する、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの点変異誘導体であるＤ８９Ｅ変異体についても、ホスファチジルセリンへの結合性について調べてみた。ＰＳでコーティングしたマイクロタイタープレートを、段階的に濃度を上昇させたＤ８９Ｅの他、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｓ又はＣ１Ｃ２変異体とともにインキュベーションし、ウェルに結合したＭＦＧ−Ｅ８を、ＥＬＩＳＡで定量した。結果を図３ｆに示す。図３ｆからもわかるように、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬのＤ８９Ｅ変異体は、野生型ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌと同程度の効率で、ＰＳでコーティングしたプレートに結合したが、ＰＳでコーティングしたプレートに対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｓ及びＣ１Ｃ２変異体の親和性は、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの親和性の８分の１であった。これらの結果から、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬがそのＣ１Ｃ２ドメインを介してアミノリン脂質を認識できること、及びＭＦＧ−Ｅ８−Ｌに存在する高Ｐ／Ｔ含有ドメインが、これらのリン脂質に対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの親和性に関与していることがわかった。

実施例Ｂ−４（ＭＦＧ−Ｅ８を介したＮＩＨ３Ｔ３細胞のアミノリン脂質への結合）
ＭＦＧ−Ｅ８の第２ＥＧＦドメインには、細胞接着に関与する細胞膜貫通受容体であるインテグリンファミリーのいくつかのメンバーが認識可能なＲＧＤモチーフが存在する（Cell 69, 11-25, 1992）。そのため、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌがアミノリン脂質を発現するアポトーシス細胞とインテグリンを発現する貪食細胞との掛け橋の役割を果たすとの可能性について考察した。マウスα_Vβ₃インテグリンを発現するＮＩＨ３Ｔ３形質転換体を、フィコエリトリン結合ハムスター抗マウスインテグリンα_V抗体又はフィコエリトリン結合ハムスター抗マウスインテグリンβ₃抗体を使用してＦＡＣＳで分析した。結果を図４ａに示す。図４ａ中の点線は、ＮＩＨ３Ｔ３親細胞に対するＦＡＣＳ染色のプロフィールを示す。図４ａからわかるように、マウスＮＩＨ３Ｔ３親細胞は、α_Vインテグリンやβ₃インテグリンを低レベルで発現するが、α_V及びβ₃インテグリン発現ベクターでこの親細胞株を形質転換したところ、α_Vインテグリン及びβ₃インテグリンの両方を豊富に発現した。

ＦＬＡＧ結合ＭＦＧ−Ｅ８を用いたＦＡＣＳ分析では、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬとＮＩＨ３Ｔ３又はそのα_Vβ₃インテグリン形質転換体との間に特異的な結合は見られなかった。そこで、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌがインテグリン発現細胞に結合するのは、かかる細胞がリン脂質に結合された後なのではないかとの可能性について調べてみた。ＰＳ又はＰＥでコーティングしたマイクロタイターウェルについて、三種類の濃度（０．１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ及び２．０μｇ／ｍｌ）のＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＤ８９Ｅを用いて、及び、ＮＩＨ３Ｔ３（３Ｔ３／ＷＴ）又はα_Vβ₃インテグリン発現形質転換体（３Ｔ３／α_Vβ₃）を用いて、連続してインキュベーションし、細胞接着アッセイを行った。ウェルに付着した細胞の数を、実施例Ａ−６記載の方法で定量した。結果を図４ｂに示す。図４ｂに示すように、ＮＩＨ３Ｔ３親細胞（３Ｔ３／ＷＴ）は、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの非存在下ではＰＳでコーティングしたプレートに接着しなかった。一方、ＰＳでコーティングしたプレートをＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ存在下でプレインキュベーションしていた場合は、かなりの数のＮＩＨ３Ｔ３細胞がウェルに接着した。Ｄ８９Ｅ変異体はＰＳでコーティングしたウェルへのＮＩＨ３Ｔ３細胞の接着を仲介することができなかった。これは、このＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの効果がそのＲＧＤモチーフによるものであることを示している。α_Vβ₃インテグリンを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（３Ｔ３／α_Vβ₃）を標的として使用すると、ＰＳでコーティングしたウェルへの細胞の接着に対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの作用は、さらに劇的なものになった。すなわち、無処理のウェル又はＤ８９Ｅで処理したウェルには２０個の細胞が接着したに過ぎないのに対し、１．０μｇ／ｍｌのＭＦＧ−Ｅ８−Ｌで前処理したウェルには約７０００個の細胞が接着していた。ＰＥに対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの結合能力に関しては、ＰＳでコーティングしたウェルの場合と同様の効率で、ＰＥでコーティングしたウェルについても、ＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換体の接着を助けた。

実施例Ｂ−５（ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌによるアポトーシス細胞の取り込み）
次に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を刺激してアポトーシス細胞を取り込ませることが、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌに可能かどうかを調べてみた。ＮＩＨ３Ｔ３（３Ｔ３／ＷＴ）又はα_Vβ₃インテグリンを発現するその形質転換体（３Ｔ３／α_Vβ₃）を、０．１μｇ／ｍｌのＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｓ又はＤ８９Ｅの存在下又は非存在下（-）で、ＩＣＡＤ−Ｓｄｍマウスから調製したばかりの胸腺細胞（Ｄｅｘ（-））とともに、又はデキサメタゾンで４時間処理した胸腺細胞（Ｄｅｘ（+））とともにインキュベーションした。胸腺細胞を４個以上取り込んだＮＩＨ３Ｔ３細胞を計数し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞総数（１５０個）に対するこうした細胞の比率を求めた。３つ一組の実験を少なくとも２回行った。その平均値をＳＤ（バー）として図５ａに示す。図５ａからわかるように、ＩＣＡＤ−Ｓｄｍマウスから調製したばかりの胸腺細胞をＮＩＨ３Ｔ３細胞と２時間共培養したところ、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの存在下又は非存在下で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に付着されたり取り込まれたりする胸腺細胞は皆無であったが、デキサメタゾンで処理した胸腺細胞とＮＩＨ３Ｔ３細胞とを共培養した場合は、およそ６％のＮＩＨ３Ｔ３細胞が、それぞれ４個以上の胸腺細胞を取り込んでいた。また、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの存在により、４個以上の胸腺細胞を内部に取り込んだＮＩＨ３Ｔ３細胞の比率は２３％に上昇した。

次に、α_Vβ₃インテグリンを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換体を、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＤ８９Ｅの存在下又は非存在下（コントロール）で、アポトーシス下の胸腺細胞とともにインキュベーションし、光学顕微鏡（×２００）で観察した。結果を図５ｂに示す。図５に示されるように、貪食作用に対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの影響は、α_Vβ₃インテグリンを発現するＮＩＨ３Ｔ３形質転換体を貪食細胞として使用する場合にはさらに明白なものとなった。この場合、４個以上の胸腺細胞を取り込んだＮＩＨ３Ｔ３形質転換体の比率は、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを分析混合系に添加すると９％から４６％に上昇し、およそ２０％の細胞が７個以上の胸腺細胞を内部に取り込んでいた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の貪食活動に対するＭＦＧ−Ｅ８−ＳやＤ８９Ｅの影響は、ほとんどなかった。

α_Vβ₃インテグリンを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換体を、段階的に濃度を上昇させたＭＦＧ−Ｅ８−Ｌ又はＤ８９Ｅの存在下で、アポトーシス下の胸腺細胞と共培養し、４個以上の胸腺細胞を取り込んだ細胞の比率を測定した。３つで一組とした２回の実験で得られた平均数値をＳＤ（バー）でプロットした結果を図５ｃに示す。各種濃度のＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを用いた図５ｃに示される結果より、貪食作用を増大させるためのＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの至適濃度が存在することがわかった。０．１μｇ／ｍｌ以下では、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌは投与量依存的に貪食作用を増大させるが、その濃度を超えると、阻害的な影響が現れる。この阻害作用は、２４２２モノクローナル抗体の添加によって消滅する。

他方、野生型ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌとは異なり、Ｄ８９Ｅ変異体はＮＩＨ３Ｔ３及びその形質転換体の貪食活動を、広い濃度範囲で阻害する（図５ａ及び５ｃ）。Ｄ８９Ｅのこの特性を使って、腹腔マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食に対するＭＦＧ−Ｅ８−Ｌの関与について評価した。ＩＣＡＤ−Ｓｄｍマウス由来の胸腺細胞をデキサメタゾンで４時間処理し、図５ｄに示す濃度のＤ８９Ｅの存在下で、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージと共培養した。反応終了後、フィコエリトリン結合抗Ｍａｃ−１抗体でかかる細胞を染色し、ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰでＴＵＮＥＬを行った。Ｍａｃ−１⁺細胞群におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞のＦＡＣＳのプロフィールを図５ｄに示す。図５ｄ中の数字は、２つの別個の実験で得られたＴＵＮＥＬ陽性マクロファージの比率を示す。図５ｄに示すように、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージを、デキサメタゾンで処理したＩＣＡＤ−Ｓｄｍマウス由来の胸腺細胞と共培養すると、およそ４２％のマクロファージがＴＵＮＥＬ陽性となる。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の出現及びマクロファージによる胸腺細胞の貪食は、Ｄ８９Ｅによって投与量依存的に大きく阻害された。これにより、マクロファージ中に発現したＭＦＧ−Ｅ８−Ｌがアポトーシス細胞の貪食に重要な役割を果たしたことがわかる。

実施例Ｃ［まとめ］
貪食細胞中に発現する多くの蛋白質が、アポトーシス細胞の取り込みに関与する受容体として報告されている（Trends Cell Biol. 8, 365-372, 1998、Cell Death Differ. 5, 551-562, 1998、 Nature 407, 784-788, 2000）。しかし、こうした受容体が直接アポトーシス細胞に結合するかどうかは、はっきりとしていなかった。本発明者らはここに、ＭＦＧ−Ｅ８−ＬがＰＳやＰＥなどのアミノリン脂質を認識することで、アポトーシス細胞に特異的に結合することを示した。増殖期又は休止期の細胞の原形質膜内部小葉（inner leaflet）に局在するアミノリン脂質は、細胞がアポトーシスへ向かいはじめると、細胞表面に露出する（J. Immunol. 149, 4029-4035, 1992, Exp. Cell Res. 232, 430-434, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6349-6354, 1998）。リポソームトランスファー法を用いてＰＳを発現させた細胞は、貪食細胞により認識され取り込まれる（J.Biol. Chem. 270, 1071-1077, 2001）。これらのことから、露出状態のＰＳは、「食べろ」シグナルとしての基準を満たしていることがわかる。アポトーシス細胞の受容体として挙げられている分子の多くは、ＰＳだけではなくＰＩにも結合する（Cell Death Differ. 5, 551-562, 1998、J. Biol. Chem. 276, 16221-16224, 1995）。一方、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌが結合するのはＰＳとＰＥだけであり、ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌがアポトーシス細胞を特異的に認識するとの考えを裏付けている。

インテグリンは、いくつかのシステムにおけるアポトーシス細胞に対する受容体であると示唆されている（Nature 343, 170-173, 1990、Nature 392, 86-89,1998）。しかし、α_Vβ₃インテグリンもα_Vβ₅インテグリンもＰＳとは結合できないため、こうしたインテグリンがアポトーシス細胞を認識する方法は不明である。ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌによってこのジレンマが解消し、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージ中のアポトーシス細胞に対する受容体としてインテグリンが認められるものと思われる。他の貪食細胞がこのシステムを使用しているのか、それともＰＳＲ（Nature 405, 85-90, 2000）やＭＥＲ（Nature 411, 207-211, 2001）といった他のシステムを使用しているのかについては、さらなる研究を待つ必要がある。

ＭＦＧ−Ｅ８は本来、乳脂肪小球体（milk fat globules）の膜中にもっとも豊富に存在する蛋白質の１つとして同定されたものである（Proc. Natl. Acad.Sci. USA 87, 8417-8421, 1990）。授乳や搾乳をしなくなると、乳腺はかなり退縮する（J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 4, 129-136, 1999）。この過程で、大量の上皮細胞がアポトーシスにより死滅する。そして、浸潤したマクロファージや生存上皮細胞により、そうしたアポトーシス細胞を除去して、次回の乳汁分泌に向けて乳腺を再構築できるようにする必要がある（J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 4, 203-211, 1999）。アポトーシス細胞を認識する分子としてＭＦＧ−Ｅ８−Ｌを同定することは、乳汁分泌終了時の乳腺の退縮と再構築の背後にある分子的機構を解明するのに有用である。

本発明によると、マクロファージによって生体内のアポトーシス細胞を速やかに除去することができるアポトーシス細胞の除去促進剤や、マクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去を阻害する除去阻害剤を提供することができる。

アポトーシス細胞への貪食作用を増大させるモノクローナル抗体の樹立に関する実験結果を示す図である。 ＭＦＧ−Ｅ８の同定及びその発現に関する実験結果を示す図である。 アポトーシス細胞上に露出したアミノリン脂質へのＭＦＧ−Ｅ８の結合に関する実験結果を示す図である。 ＭＦＧ−Ｅ８を介したＮＩＨ３Ｔ３細胞のアミノリン脂質への結合に関する実験結果を示す図である。 ＭＦＧ−Ｅ８−Ｌによるアポトーシス細胞の取り込みに関する実験結果を示す図である。

Claims (8)

1. １つの高プロリン／スレオニン含有ドメイン及び２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）を有するＭＦＧ−Ｅ８において、ＲＧＤモチーフに点変異をもち、かつマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害作用を有するＭＦＧ−Ｅ８変異体を有効成分とすることを特徴とするマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤。
2. ＭＦＧ−Ｅ８変異体が、組換えＭＦＧ−Ｅ８変異体であることを特徴とする請求項１記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤。
3. 組換えＭＦＧ−Ｅ８変異体が、組換えヒトＭＦＧ−Ｅ８変異体又は組換えマウスＭＦＧ−Ｅ８変異体であることを特徴とする請求項２記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤。
4. 組換えＭＦＧ−Ｅ８変異体が、ヒト細胞中での翻訳産物であることを特徴とする請求項２又は３記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤。
5. ＭＦＧ−Ｅ８変異体が、ＲＧＤモチーフの８９位のアスパルギン酸をグルタミン酸に置換した変異体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤。
6. ＭＦＧ−Ｅ８変異体が、リポソームに封入又は包埋されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤。
7. 請求項１〜５のいずれかに記載されたＭＦＧ−Ｅ８変異体をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを有効成分とすることを特徴とするマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤。
8. 請求項１〜５のいずれかに記載されたＭＦＧ−Ｅ８変異体を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞を有効成分とすることを特徴とするマクロファージによる生体内のアポトーシス細胞の除去阻害剤。

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