ES2628049T3 - Variantes de receptor Fc gamma IIB - Google Patents

Abstract

Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de acuerdo con la SEQ ID No: 1.

Description

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DESCRIPCION

Variantes de receptor Fc gamma IIB Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que codifica una protema de SEQ ID NO: 1; a un vector que comprende dicha secuencia de acidos nucleicos y a una celula hospedadora que comprende dicha secuencia de acidos nucleicos o dicho vector. La presente invencion tambien se refiere a una protema obtenida o que se puede obtener mediante la expresion de dicha secuencia de acidos nucleicos o de dicho vector en una celula hospedadora. Ademas, la presente invencion se refiere a una protema codificada por una secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO: 6. Ademas en la presente invencion estan comprendidas composiciones farmaceuticas y un metodo de preparacion de las mismas. La presente invencion tambien se refiere a una composicion de materia que comprende una protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 y/o 3, composicion que puede comprender adicionalmente una protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 y/o 5.

Antecedentes

Los FcyRs pertenecen a la familia de receptores Fc (FcRs) que son fundamentales para defender al organismo humano frente a infecciones. En general, se debe distinguir la activacion de los FcyRs y la inhibicion de los FcyRs. de los tres FcyRs principales en seres humanos, el FcyRI se puede unir a la IgG monomerica, mientras que FcyRiI y FcyRIII se unen a complejos inmunologicos (CI) multivalentes formados por anticuerpos y antigenos (Takai, T. Nature Reviews Immunology 2002: 580-592.). Las funciones efectoras desencadenadas por los FcyRs incluyen, dependiendo del tipo de FcR expresado y de protemas asociadas, endocitosis con posterior neutralizacion de los agentes patogenos y presentacion de antfgenos, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), secrecion de mediadores o la regulacion de produccion de anticuerpos (Fridman et al., Immunol Rev. 1992125: 49-76, van de Winkel y Capel Immunol Today. 1993: 14 (5): 215-21).

El documento WO 00/32767 describe receptores Fc solubles (FcRs) que estan formados solamente por la parte extracelular del receptor y no estan glicosilados. Debido a la ausencia del dominio trans membrana y del peptido senal, estas protemas estan presentes en una forma soluble y no unida a celulas. Ademas, los FcRs descritos en el documento Wo 00/32767 se pueden producir de forma recombinante y se han sugerido para el tratamiento de enfermedades autoinmunes debido a su capacidad para unirse a la parte Fc de anticuerpo sin interferir con otros componentes del sistema inmunologico. El documento WO 00/32767 describe adicionalmente la estructura cristalina de ciertos FcRs y la posibilidad de encontrar sustancias que inhiban la interaccion de IgG con los FcRs con la ayuda de estas estructuras cristalinas. El esclarecimiento de la estructura cristalina permite el hallazgo de inhibidores de este tipo mediante identificacion sistematica de las bases de datos usando programas informaticos disponibles. La invencion que se ha definido en el documento WO 03/043648 desarrollo adicionalmente los hallazgos del documento WO 00/32767 y proporciona metodos de tratamiento especialmente para enfermedades como la esclerosis multiple (EM), lupus eritematoso sistemico (LES), y artritis reumatoide (AR) y tambien para enfermedades con un nivel elevado de linfocitos citolfticos naturales.

Cuando dichos receptores se produjeron de forma recombinante en procariotas y que por lo tanto estaban sin glicosilar, los inventores del documento WO 03/043648 encontraron de forma sorprendente que, aunque se esperaba que las protemas no glicosiladas fueran poco solubles, los receptores se pudieran purificar con altas concentraciones de FcyR en una forma soluble. El documento WO 03/043648 y otras publicaciones documentan que los FcRs desempenan un papel importante en reacciones de defensa del sistema inmunologico.

El documento EP1870422 desvela (SEQ ID NO: 1) dominio extracelular, FcYRllb N-terminal humano, que consiste en 181 restos y que es identico en 176 aa con la SEQ ID NO: 1 presente.

Los receptores Fc desempenan un papel fundamental en el sistema inmunologico en el que controlan del alcance y la fuerza de una respuesta inmunitaria. En particular se observo que un receptor Fc gamma IIB (sFcyRIIB) soluble (es decir, la parte extracelular de un receptor Fc gamma IIB), que compite con los FcyRs expresados en celulas inmunitarias para complejos inmunologicos patogenos es beneficioso en el tratamiento de enfermedades autoinmunes. La interferencia en una fase inicial de las reacciones inmunitarias que se producen en enfermedades de evita el desencadenamiento de la cascada que da como resultado inflamacion y destruccion de tejidos. De forma espedfica, mientras tanto sFcyRIIB esta en ensayos clmicos en fase II para la indicacion de Trombocitopenia Inmune Primaria (TIP) y Lupus Eritematoso Sistemico (LES). Como se sabe comunmente, para el material biologico de ensayos clmicos, aqrn se necesita sFcyRIIB que tenga preferentemente buenas propiedades de Qmmica, Preparacion y Control (CMC), tales como alta pureza y estabilidad durante la purificacion. Por lo tanto, un objeto de la presente invencion fue proporcionar protemas de FcyRIIB humano con buenas propiedades de CMC. Este objeto se resuelve mediante las realizaciones reflejadas en las reivindicaciones, que se describen en el presente documento, ilustradas en los Ejemplos y Figuras.

De forma sorprendente para las protemas tales como las que se describen en el presente documento se ha mostrado que se puede conseguir una purificacion mas elevada debido a una mejor solubilidad en concentraciones de sulfato de amonio que superan 1,5 M. La precipitacion con sulfato de amonio es util para retirar grandes

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cantidades de protemas contaminantes, como una primera etapa en muchos esquemas de purificacion. Cuanto mayor es la concentracion de sulfato de amonio, mejor es cuando se busca una protema altamente pura, pero se deposita mas estres sobre la protema, debido a la alta fuerza ionica del sulfato de amonio. Por lo tanto, cuanto mas resistente al estres es una protema, mayor puede ser la concentracion de sulfato de amonio y por lo tanto mayor sera la pureza de la protema. De forma espedfica, mediante la adicion de los productos secundarios de sulfato de amonio cosmotropico tales como especies desplegadas y plegadas de manera erronea, y ademas precipitan impurezas obtenidas a partir de celulas hospedadoras como componentes de la pared celular y protemas. Con el aumento de la concentracion de agente precipitante la eficacia de la precipitacion aumentara y, por lo tanto, se obtiene una preparacion de protema altamente purificada, siempre y cuando la protema de interes sea resistente a la precipitacion a concentraciones tan altas de sulfato de amonio. Como se ha mencionado, de forma sorprendente se encontro que una protema FcR como se describe en el presente documento es altamente soluble a concentraciones de sulfato de amonio iguales o superiores a 1,5 M. Esto no podfa esperarse, puesto que las protemas FcR de la tecnica anterior se comportaban de manera diferente como se muestra en los Ejemplos y no habfa directrices en absoluto disponibles con respecto a como modificar una protema FcR de modo que tiene el comportamiento y propiedades similares a las de la protema FcR proporcionada por la presente invencion. Como se ha mencionado, para la sorpresa de los presentes inventores, se encontro que las protemas que se describen en el presente documento son ciertamente resistentes a las concentraciones elevadas de sulfato de amonio, permitiendo de este modo una buena purificacion en comparacion con las protemas FcyRIIB de la tecnica anterior, tales como las protemas FcyRIIB que se describen en el documento WO 00/32767 o en el documento WO 03/043648.

Breve descripcion de la invencion

La presente invencion se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que codifica una protema de acuerdo con la SEQ ID No: 1. La presente invencion tambien proporciona secuencias de acidos nucleicos que codifica las protemas mostradas en la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, o 9. La secuencia de acidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 6 codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.

La presente invencion tambien se refiere a un vector que comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1. La presente invencion tambien se refiere a un vector que comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, o 9.

Ademas, la presente invencion tambien se refiere a una protema obtenida o que se puede obtener mediante expresion de la secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o el vector de la presente invencion en una celula hospedadora, preferentemente una celula hospedadora procariota, mas preferentemente en E. coli.

Ademas, la presente invencion tambien se refiere a una protema que esta codificada por una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6.

La presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica que comprende la protema obtenida o que se puede obtener mediante la expresion de la secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o el vector de la presente invencion en una celula hospedadora o una protema que esta codificada por una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6.

Ademas, la presente invencion se refiere a una composicion de materia que comprende una protema de acuerdo con la SEQ ID No: 2 y/o 3. Preferentemente, la composicion de materia es una composicion farmaceutica.

En una realizacion, la composicion de materia de la presente invencion comprende adicionalmente una protema de acuerdo con la SEQ ID No. 4 y/o 5. Preferentemente, la composicion de materia es una composicion farmaceutica.

En otra realizacion, la composicion de materia de la presente invencion tiene la cantidad de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 2 que supera a la de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 3.

En otra realizacion, la composicion de materia de la presente invencion tiene la cantidad de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 2 que supera a la de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 3 y la cantidad de las protemas de acuerdo con la SEQ ID No: 2 y 3 que supera a la de la protema de acuerdo con la sEq ID No: 4 y/o 5.

Ademas, la presente invencion se refiere a una composicion de materia que comprende una protema de acuerdo con la SEQ ID No: 9. Preferentemente, la composicion de materia es una composicion farmaceutica.

La presente invencion tambien se refiere a una celula hospedadora que comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o la celula hospedadora comprende el vector de la presente invencion que comprende la secuencia de acidos nucleicos de la reivindicacion 1. La presente invencion tambien se refiere a una celula hospedadora que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, o 9 o la celula hospedadora comprende el vector de la presente invencion que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, o 9.

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En una realizacion, la celula hospedadora de la presente invencion es una celula hospedadora procariota o eucariota.

En otra realizacion de la presente invencion, la celula hospedadora procariota es E. coli, preferentemente BL21 de E. coli, tal como BL21 (DE3).

La presente invencion tambien se refiere a un metodo para preparar una composicion farmaceutica que comprende cultivar la celula hospedadora de la presente invencion en condiciones que permitan la expresion de la protema codificada, y recuperar la composicion farmaceutica obtenida.

FIGURAS

Figura 1: a) Estructura cristalina de sFcyRII humano (entrada de PDB: 2FCB). La estructura nucleo invariable como se representa mediante la secuencia de aminoacidos de la variante 1 (SEQ ID No: 7) que es identica para todas las variantes de sFcR sometidas a ensayo en este estudio se muestra en color gris oscuro, los lazos que se supone que son importantes para la union a IgG se representan en color gris claro y las extensiones N- y C-terminales se muestran en color negro. Los dos puentes disulfuro se representan con representacion de bolas y varillas. La identidad de la estructura nucleo entre todas las variantes sometidas a ensayo tambien es evidente a partir del alineamiento de secuencias mostrado en la Figura 1b.

b) Alineamiento de secuencias de las variantes 1-4 de sFcR (abreviadas "var.") usadas en el presente estudio. SEQ ID NO: se abrevio como SEQ.

Figura 2: Resultados de la identificacion sistematica de precipitacion de FcR. Las variantes 1-4 de FcR se incubaron durante 1 h a 25 °C y al pH y a la concentracion de sulfato de amonio indicada. Despues de la centrifugacion, el contenido de FcR en el sobrenadante se determino midiendo la DO280 y se represento frente a la concentracion de sulfato de amonio.

SECUENCIAS

Las siguientes secuencias proporcionan una vision de conjunto de las secuencias usadas en el presente documento:

SEQ ID No: 1 (en el presente documento tambien denominadas en ocasiones „ variante 3")

MAFFKAVLKL EPQWINVLQE DSVTLTCRGT HSFESDSIQW FHNGNLIPTH TQHSYftFKAN NtfDSGEYTCQ TGQtSLSDPV HLtVlSeMLV lQtPHLEfQE GET1VLF.CHS WKDKPLVKVT FFQNGKSKKF SRSDPWFSIP OMTHSHSGDY HCTGNIGYT1 YSSKPVTITV £AF3$$P

SEQ ID No: 2

APPKAVLKLE PQtfINVLQED SVTLTCR&TH SPEEDS IQtfF HNGNLIPTHT QPSYRFKANN ND5GEYTCQT GQT5L5DPVH LTVLSEWLVL OTFHLEFQEG ETIVLRCHSW KDKP LYKYTF

fgngkskkfs rsdpnfsipg anushsgdyei ctghigytly sskpvtitvo afsssl-

SEQ ID No: 3

PPKAYLKLEP QtflNVLQEDE VTLTCRGTHS FESDSIOWFH NGNLIPTHTQ PSYFFKANNN DSGEYTCQTG QTSLSDPVHL TVLSEWLVLQ TPHLEFQEGE TIVLRCHSWK DKFLVKVTFF QWGESEEFSR 5DPNFSIF0A NHSHSGDYHC TGNIGYTLYS SKPVTITVQA PSSSP

SEQ ID No: 4

PKAVLKLEPQ KINVLQEDSV TLTCRGTHSP ESD3IQWFHW GNLIPTHTQP SYKFKANNND SGEYTCQTGQ Y3L3DPVHLT VLSEWLVLQT PHLEFOEGET IVLRCHSWKD KPLVKVTFFO NGKSKKFSRS DFNFSIFQAN H5H5GDYHCT GNIGYTLYSS KPYTITYQAP SEEP

SEQ ID No: 5

AVLKLEFQWI NVLQED8VTL TCR&THGFES DSIQWFHNGW LIPTHTQFSY RFKANNNDSG

eytcqtgqts lsdevhltvl sewlvlqtph lefgegstiv lrc^swkdkp lvkvtffqng

KSKKFSRSDP NFSIPQAHHS HSGDYHCTGN IGYTLYSSKP VTITVOAP33 3P

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SEQ ID No: 6

atggtattgt gatagcgtta tttcf.ca.fl.cg aac gat a catctgaccg ggcgaaacca ttcttccaga eaggcgaatc tatagcagca

cgaaagtagt

ccctgacctg

gcaatctgat

g^gg^gaata

ttctgagcga.

ttgttctgcg

acggcaaaag

atsgccatag

aaccggtgac

tctgaaactg

tcgtggcacc

tccgacccat

tacctgtcag

atggctggtt

ttgccacagc

caaaaaattc

cggcgattat

catta-ccgtt

ga a c c g c agt c a t a g c c c gg acctagctga accggtitaga otgcagaccc tggaaagata agccgtagcg cattgtaccg caggcgccga

ggaLtaacgt tcL-juaggaa aaagcgatag cattcagtgg gctatcgttt taaacccaac ccagcctgag cgatccggtt cgcatctgga atttcaggaa aaccgctggt taaagttacc atccgaattt tagcattccg g&aacattgg ctataccctg gcagcagccc gtaa

SEQ ID NO: 7 (en el presente documento tambien denominada en ocasiones „ variante 1", esta secuencia se desvela como sEq ID No: 1 en el documento WO 03/043648)

MAVLKLE PQ W INVI ,QE I IS V r L\ r C RGT H S PE SDSIGW FHNG NM PT H T Q P S Y R FK AN N N l >S GEYTCQTGQT SLSDPVHLTV LSEWLVLQTP HLEFQEGETI VLRCHSWKDEt PLVEtVTFFQN GKSKKFSRSD PNFSIPQANH SHSGDYHCTG NIGYTLYSSEt PVTITV

SEQ 8 (en el presente documento tambien denominada en ocasiones „ variante 2", esta secuencia se desvela como SEQ ID NO: 3 en el documento WO 00/32767)

mgtp^appka vlklepgwin vlqiedsvtlt crgthspesd siqwfhhgwl tpthtgpsyr

FKAHHNDSGE YTCQTGGTSL SDPVKLTVLS EWLVEGTPHL EFQEGETIVL KCHSNKDKPL VKVTFFQHGK SKKFSRSDPN FSIPGANHSH SGDYHCTGNI GYTLYSSKPV TITVQAPSSS PMC-1 l

SEQ ID 9 (en el presente documento tambien denominada en ocasiones „ variante 4")

MTPAAPPKAV LKLEPQTflINV LQEDSVT1TC RGTflSPESDS IQWFHNGWLI PTHT^PSYRF KAtTlTtl ns gey tcqtggtsls DPVHLTVLSE WLVLGTPHLE FGEGETTVLR chswkdkplv KVTFFQNGKS KKFSRSDPWF SIFQANHSHS GDYHCTGWIG YTLYSSKFVT ITYQAPSSSP MG 1

Descripcion detallada de la invencion

Se debe indicar que, como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "uno(a)", "el" y “la”, incluyen referencias en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un reactivo" incluye uno o mas de tales reactivos diferentes y la referencia a "el metodo" incluye la referencia a etapas y a metodos equivalentes conocidos por los expertos habituales en la materia que se podnan modificar o sustituir por los metodos que se describen en el presente documento.

Todas las publicaciones y patentes citadas en la presente divulgacion se incorporan por referencia en su totalidad. En la medida en el que el material incorporado por referencia contradiga o sea incoherente con la presente memoria descriptiva, la memoria descriptiva reemplazara a cualquier material de ese tipo.

A menos que se indique de otro modo, se debe entender que la expresion "al menos" precediendo a una serie de elementos se refiere a cualquier elemento en la serie. Los expertos en la materia reconoceran, o seran capaces de comprobar, usando no mas que experimentacion de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones espedficas de la invencion que se describe en el presente documento. Tales equivalentes pretenden estar incluidos por la presente invencion.

En toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen a continuacion, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, se entendera que el termino "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implica la inclusion de un numero entero o etapa o grupo de numeros enteros o etapas indicados pero no la exclusion de ningun otro numero entero o etapa o grupo de numeros enteros o etapas. Cuando se usa en el presente documento, el termino "que comprende" se puede sustituir con el termino "que contiene" o en ocasiones cuando se usa en el presente documento con el termino "que tiene".

Cuando en el presente documento se usa "que consiste en" excluye a cualquier elemento, etapa un ingrediente no especificado en el elemento reivindicado. Cuando se usan el presente documento, "que consiste esencialmente en" no excluye materiales o etapas que no influyan de forma material en las caractensticas basicas y nuevas de la

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reivindicacion.

En el presente documento, en cada caso, cualquiera de las expresiones "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" se pueden sustituir con cualquiera de los otras dos expresiones.

En toda la presente memoria descriptiva se citan varios documentos. Cada unos de los documentos citados en el presente documento (incluyendo todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones cientificas, especificaciones del fabricante, instrucciones, etc.), ya sea anteriormente posteriormente, se incorporan por la presente por referencia en su totalidad. Nada de lo contenido en el presente documento se debe interpretar como una admision de que la invencion no da derecho a anticipar tal divulgacion en virtud de la invencion anterior.

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En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que codifica una protema de acuerdo con la SEQ ID No: 1.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "acidos nucleicos" y "secuencias de nucleotidos" o "secuencia de acidos nucleicos" incluyen moleculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genomico), moleculas de ARN (por ejemplo, ARNm), combinaciones de moleculas de ADN y ARN o moleculas de ADN/ARN hforidas, y analogos de moleculas de ADN o ARN. Los analogos de este tipo se pueden generar usando, por ejemplo, analogos de nucleotido, que incluyen, pero no se limitan a, inosina o bases de tritiladas. Los analogos de este tipo tambien pueden comprender moleculas de ADN o ARN que comprenden estructuras principales modificadas que prestan atributos beneficiosos a las moleculas tales como, por ejemplo, resistencia a nucleasas o un aumento de la capacidad para cruzar membranas celulares. Los acidos nucleicos o secuencias de nucleotidos pueden ser de una hebra, de doble hebra, pueden contener porciones tanto de una hebra como de dos hebras, y pueden contener porciones de tres hebras, pero preferentemente es ADN de dos hebras.

En el ADN y el ARN se puede realizar una diversidad de modificaciones; por lo tanto, la expresion "moleculas de acido nucleico" o "secuencia de acidos nucleicos" incluye formas modificadas por via qrnmica, enzimatica, o metabolica. Por ejemplo, una molecula de acido nucleico o una secuencia de acidos nucleicos de la presente invencion se pueden modificar despues de la traduccion o despues de la transcripcion.

La secuencia de acidos nucleicos de la presente invencion codifica la protema de SEQ ID NO: 1. La secuencia del polipeptido codificado por SEQ ID NO: 1 se puede modificar debido a modificaciones despues de la traduccion o despues de la transcripcion, dependiendo de la celula hospedadora que expresa el polipeptido codificado por la SEQ ID NO: 1.

Cuando en el presente documento se usa "protema de SEQ ID NO: X", con X siendo 1, 2, 3, 4, 5, o 9, se hace referencia a una protema que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada o como se representa en la SEQ ID NO: X, con X siendo 1, 2, 3, 4, 5 o 9.

El termino "polipeptido" o "protema", cuando se usa en el presente documento, se refiere a un peptido, una protema, o un polipeptido, que se usan indistintamente y que incluye cadenas de aminoacidos de una longitud dada, en las que los restos de aminoacidos estan unidos mediante enlaces peptfdicos covalentes. Sin embargo, los peptidomimeticos de tales protemas/polipeptidos en los que el aminoacido o aminoacidos y/o en la figura enlaces peptfdicos se han reemplazado con analogos funcionales tambien estan incluidos por la invencion asf como otros ademas de los 20 aminoacidos codificados geneticamente, tales como selenocistema. Peptidos, oligopeptidos y protemas se pueden denominar polipeptidos. Como se ha mencionado, a menudo los terminos polipeptido y protema se usan indistintamente en el presente documento. El termino polipeptido tambien se refiere a, y no excluye, modificaciones del polipeptido. Las modificaciones incluyen glicosilacion, acetilacion, acilacion, fosforilacion, aDP- ribosilacion, amidacion, union covalente de flavina, union covalente de un resto heme, union covalente de un nucleotido o derivado de nucleotido, union covalente de un lfpido o derivado de lfpido, union covalente de fosfotidilinositol, union cruzada, ciclado, formacion de enlace disulfuro, desmetilacion, formacion de uniones cruzadas covalentes, formacion de cistema, formacion de piroglutamato, formulacion, gamma-carboxilacion, glicosilacion, formacion de ancla de GPI, hidroxilacion, yodacion, metilacion, miristoilacion, oxidacion, pegilacion, procesamiento proteolftico, fosforilacion, prenilacion, racemizacion, selenoilacion, sulfacion, adicion de aminoacidos a protemas mediada por ARN de transferencia tal como arginilacion, y ubiquitinacion; vease, por ejemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983), pgs. 1-12; Seifter, Meth. Enzymol. 182 (1990); 626-646, Rattan, Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992); 48-62.

Las protemas de la presente invencion se muestran en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, o 9. Por lo tanto, la presente invencion proporciona protemas mostradas en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, o 9.

El termino "expresion" o "expresion de una secuencia de acidos nucleicos" se refiere la transcripcion de un acido

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nucleico espedfico o construccion genetica espedfica. El termino "expresion" o "expresion de acido nucleico" en particular se refiere a la transcripcion de una secuencia de acidos nucleicos o construccion genetica tal como un vector que comprende el acido nucleico de SEQ ID NO: 1 en ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con o sin posterior traduccion del ultimo en una protema. Preferentemente, la protema se traduce a continuacion. El proceso incluye la transcripcion de ADN y procesamiento del producto de ARNm resultante. A continuacion, el ARNm se traducen cadenas polipeptfdicas, que por ultimo se pliegan en los polipeptidos/protemas finales. Los investigadores de proteomica usan comunmente la expresion de protemas para indicar la medicion de la presencia y abundancia de una o mas protemas en una celula o tejido en particular. La expresion de una protema de una celula se puede medir mediante diversos medios. Por ejemplo, con inmunohistoqmmica o analisis de transferencia de Western. En el presente documento, los resultados obtenidos se pueden evaluar mediante una gran celula transfectada con un vector que comprende un acido nucleico de la presente invencion en comparacion con una celula transfectada de forma simulada. Una celula con una expresion mas elevada (hospedadora) muestra una tincion, que aumenta por ejemplo en intensidad, cuando se compara con una celula de control (simulada) en el mismo entorno. Ademas, la expresion del ARNm se puede medir por ejemplo mediante RT-PCR. El experto en la materia conoce diferentes tecnicas, como determinar la expresion de una cierta protema o ARNm de una celula. Tambien se conciben protemas, obtenidas debido a modificaciones despues de la transcripcion o despues de la traduccion.

Una "variante" de un polipeptido incluye un polipeptido en el que se sustituyen uno o mas restos de aminoacidos, preferentemente sustituido de forma conservativa en comparacion con dicho polipeptido y en el que dicha variante es capaz preferentemente de unirse a la parte Fc de los anticuerpos (vease la union de of FcyR) y posiblemente a linfocitos. Las variantes de este tipo incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones, y sustituciones seleccionadas de acuerdo con las reglas generales conocidas en la tecnica. Por ejemplo, en Bowie, Science 247: (1990) 1306-1310 se proporciona una directriz con respecto a como preparar sustituciones de aminoacido fenotfpicamente silencioso, en la que los autores indican que hay dos estrategias principales para estudiar la tolerancia al cambio de una secuencia de aminoacidos. Las variantes preferentes de FcyRIIB se muestran en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, o 9, siendo preferente FcyRIIB que se muestra en la SEQ ID NO: 1.

La expresion "receptor Fc gamma" se usa en el presente documento indistintamente con "FcgR" o "receptor Fcy" o "FcyR" y comprende tanto FcyRs membranosos FcyRs como solubles (es decir, la parte extracelular de un receptor Fcy). Los receptores Fc gamma pertenecen a la superfamilia de protemas inmunoglobulinas y se encuentran en muchos linajes hematopoyeticos. Como su nombre indica, los receptores Fc reconocen y se unen a la parte de Fc (fragmento, cristalizable) de anticuerpos, es decir, el fragmento que corresponde a los dos dominios C-terminales de ambas cadenas pesadas del anticuerpo y por lo general interactua con moleculas y celulas efectoras.

Es preferente que la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 sea un FcyR soluble. De forma analoga, es preferente de la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, o 9 sea un FcyR soluble. Tambien es preferente que una protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, o 9 sea como tal soluble en un lfquido adecuado, tal como un lfquido acuoso.

Los FcyRs reconocen anticuerpos de IgG. En seres humanos existen cuatro subclases de IgG, nombradas en orden de su abundancia en el suero (IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, con IgG 1 siendo el tipo de IgG mas abundante). En seres humanos existen tres clases de FcyRs: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIIIA (CD16). Ademas, los FcyRs se producen en diversas isoformas, es decir, receptores Fc gamma funcionalmente similares que tienen una secuencia de aminoacidos similar pero no una identica. Dichas isoformas incluyen FcyRIA, B1, B2, C; FcyRIIA1-2, B1-3, C y, ademas, varios alelos (FcYRlla1-HR, -LR; FcYRlllb-NA1,-NA2) (van de Winkel y Capel, Immunol. Today 1993, 14: 215-221). Las diferentes clases e isoformas de FcyR pueden diferir con respecto a su afinidad hacia IgG y de forma espedfica hacia las diferentes subclases de IgG. Por lo general, FcyR se produce como protemas trans membrana de tipo I o en formas solubles pero tambien existe una forma del FcyRiII (FcyRIIIB) anclada a glicosilfosfatidilinositol.

Los "FcyRs solubles" tambien se denominan "sFcyRs". Como se usa en el presente documento, la expresion "receptor Fcy soluble" y expresiones analogas se refieren a la parte extracelular del receptor Fcy. Tal parte se puede disolver en un lfquido. En general, las formas solubles de cualquier clase, isoforma o alelo de FcyR se pueden identificar mediante una "s" precedente, por ejemplo, sCD32 o sFcyRII se refiere al receptor Fc gamma Rll soluble. Por lo general, a diferencia del FcyR membranoso (es decir, unido a membrana), el FcyR soluble no comprende una region transmembrana o una cola intracitoplasmatica.

Preferentemente, el FcyR de la invencion es de origen humano o un FcyR humano. La expresion "de origen humano" se debe interpretar en su sentido mas amplio. En general, se refiere a que un FcyR (o una region o fragmento del mismo) se parece o es similar a un FcyR humano (es decir, la protema encontrada en el cuerpo humano) en terminos de secuencia y/o estructura de aminoacido.

Como alternativa, el FcyR "de origen humano" puede ser un FcyR recombinante que se obtiene mediante la expresion de un acido nucleico recombinante en una celula hospedadora, por ejemplo como lo describen Sondermann y Jacob (1999), Bioll. Chem. 380 (6), 717-721. En resumen, un gen de interes se obtiene a partir de un organismo y se introduce en un vector, por ejemplo un plasmido o un virus, que a continuacion se usa para transferir el gen en una celula hospedadora que expresa el gen recombinante y produce un producto de protema

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recombinante. El experto en la materia sabra rapidamente que celula hospedadora seleccionar para obtener un FcyR que sea, por ejemplo, adecuado para la preparacion de una composicion farmaceutica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se puede desear un FcyR no glicosilado. El experto en la materia puede seleccionar despues una celula hospedadora procariota para la expresion del FcyR que esta desprovisto de la maquinaria enzimatica necesaria para la glicosilacion de protemas. En una realizacion los FcyRs se pueden expresar en procariotas y posteriormente purificar y volver a plegar de acuerdo con la descripcion del documento of WO 00/32767.

En otra realizacion los FcyRs se pueden producir de forma facil y barata con una pureza elevada en sistemas de expresion eucariota. Los sistemas utiles incluyen eucariotas con un aparato especializado para la produccion de protemas extracelulares, por ejemplo linfocitos B. Otros sistemas de expresion eucariota posibles incluyen, pero no se limitan a, celulas CHO o HEK. Por lo tanto, dicho FcyR soluble es FcyR recombinante, soluble y glicosilado.

En el presente documento los FcyRs como se ha mencionado incluyen adicionalmente FcyRs que, en comparacion con el FcyR de tipo silvestre, se han modificado o alterado con respecto a la secuencia de aminoacidos, e incluyen, por ejemplo, sitios de glicosilacion adiciona lo similares. Sin embargo, tambien se conciben formas no glicosiladas de FcyRs y son una realizacion preferente de FcyRs.

El receptor Fcy de la presente invencion comprende al menos una de las secuencias de aminoacidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1 (secuencia de aminoacidos de SM101, tambien denominada variante 3 en el presente documento). El FcyR de la presente invencion esta codificado por al menos una de una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 (secuencia de acidos nucleicos que codifica SM101, tambien denominada variante 3 en el presente documento). Estas secuencias se pueden clonar en un vector de expresion para producir el FcyR correspondiente mediante expresion recombinante.

La presente invencion tambien se refiere a un vector que comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1. Un vector de este tipo pueden ser, por ejemplo, un plasmido, cosmido, virus, bacteriofago u otro vector usado por ejemplo de forma convencional en ingeniena genetica, y puede comprender genes adicionales tales como genes marcadores que permitan la seleccion y/o replicacion de dicho vector en una celula hospedadora adecuada y en condiciones adecuadas. En una realizacion preferente, dicho vector es un vector de expresion, en el que la molecula de acido nucleico de la presente invencion se une de forma operativa y la secuencia o secuencias de control de la expresion que permiten la expresion en celulas hospedadoras procariotas o eucariotas como se describe en el presente documento. La expresion "unido de forma operativa", como se usa en el presente contexto, se refiere a una union entre una o mas secuencias de control de la expresion y la region codificante en el polinucleotido a expresar de un modo tal que la expresion se consigue en condiciones compatibles con la secuencia de control de la expresion.

Por lo tanto, las moleculas de acido nucleico de la presente invencion se pueden insertar en varios vectores disponibles en el mercado. Los ejemplos no limitantes incluyen vectores de plasmido compatibles con celulas de mairnfero, tales como pUC, pBluescript (Stratagene), pET (Novagen), pREp (Invitrogen), pCRTopo (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMCl neo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO- pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pUCTag, plZD35, pLXIN y pSIR (Clontech) y pIRES-EGFP (Clontech). Preferentemente, las moleculas de acido nucleico de la presente invencion se insertan en el vector "pET" bajo el control del Promotor T7 inducible por IPTG. Los vectores de baculovirus tales como pBlueBac, Sistema de Expresion de Baculovirus BacPacz (CLONTECH), y Sistema de Expresion de Baculovirus MaxBacTM, celulas de insecto y protocolos (Invitrogen) estan disponibles en el mercado y tambien se pueden usar para producir altos rendimientos de protema biologicamente activa. (Vease tambien, Miller (1993), Curr. Op. Genet. Dev., 3, 9; O'Reilly, Bacullovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, p. 127). Ademas, los vectores procariotas tales como pcDNA2; y vectores de levadura tales como pYes2 son ejemplos no limitantes de otros vectores adecuados para su uso con la presente invencion.

Otros vectores de expresion preferentes de la presente solicitud son aquellos para expresar protemas en celulas de Drosophila que se conocen bien en la tecnica, tales como la serie DES2 de Invitrogen. Preferentemente, dicho vector de expresion celular de Drosophila es pMTBiP/V5-His B (Invitrogen). El vector pMT/BiP/V5-His ofrece las siguientes caractensticas adicionales. Tiene un tamano pequeno (3,6 kb) para mejorar los rendimientos de ADN y aumentar la eficacia de subclonacion, tiene una etiqueta de epftopo V5 C-terminal para deteccion rapida con Anticuerpo Anti-V5 y tiene una etiqueta 6xHis C-terminal para purificacion simple de protemas de fusion recombinantes que usan una resina quelante de mquel.

Para tecnicas de modificacion de vectores, vease Sambrook y Russel (2001), loc. cit. Los vectores pueden contener uno o mas sistemas de replicacion y herencia para clonacion o expresion, uno o mas marcadores para seleccion en el hospedador, por ejemplo, resistencia a antibioticos, y uno o mas casetes de expresion.

Las secuencias codificantes insertadas en el vector se pueden sintetizar mediante metodos convencionales, aislado a partir de fuentes naturales, o preparados como tnbridos. La ligacion de las secuencias codificantes a elementos reguladores de la transcripcion (por ejemplo, promotores, potenciadores, y/o aislantes) y/o a otras secuencias que codifican aminoacidos se puede realizar usando metodos establecidos.

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Ademas, los vectores pueden comprender, ademas de las secuencias de acidos nucleicos de la invencion, elementos de control de expresion, que permiten la expresion apropiada de las regiones codificantes en hospedadores adecuados. Tales elementos de control son conocidos por el experto en la materia y pueden incluir un promotor, un codon de inicio de la traduccion, un sitio de traduccion e insercion o sitios de entrada ribosomicos internos (IRES) (Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 1471-1476) para introducir una insercion en el vector. Preferentemente, la molecula de acido nucleico de la invencion esta unida de forma operativa a dichas secuencias de control de la expresion permitiendo la expresion en celulas eucariotas o procariotas.

Los elementos de control que aseguran la expresion en celulas eucariotas y procariotas son bien conocidos por los expertos en la materia. Como se ha mencionado anteriormente, normalmente comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripcion y opcionalmente las senales poli-A asegurando la terminacion de la transcripcion y la estabilizacion de la transcripcion. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores de la transcripcion, asf como potenciadores de la traduccion, y/o regiones del promotor asociadas de forma natural o heterologas. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresion por ejemplo en celulas hospedadoras de mairnfero comprenden el promotor de CMV-HSV de timidina quinasa, SV40, promotor de RSV (virus del sarcoma de Rous), promotor del factor 1 alfa de elongacion humano, potenciador de CMV, promotor de CaM-quinasa o potenciador de SV40.

Para la expresion en celulas procariotas, se ha descrito una multitud de promotores que incluyen, por ejemplo, el promotor tac-lac, el promotor lacUV5 o el promotor trp. Junto a elementos que son responsables del inicio de la transcripcion, tales elementos reguladores pueden comprender tambien senales de terminacion de la transcripcion, tales como el sitio SV40-poli-A o el sitio tk-poli-A, cadena abajo del polinucleotido. En este contexto, se conocen vectores de expresion adecuados en la tecnica tales como el vector de expresion de ADNc de Okayama-Berg, pcDVl, (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (In-Vitrogene, como se usa, entre otros en los ejemplos adjuntos), pSPORTl (GIBCO BRL) r pGEMHE (Promega), o vectores de expresion procariotas, tales como lambda gt11.

Un vector de expresion con la presente invencion es al menos capaz de dirigir la replicacion, y preferentemente la expresion, de los acidos nucleicos y protema de la presente invencion. Los ongenes de replicacion adecuados incluyen, por ejemplo, los ongenes de replicacion del Col E1, el virus SV40 y del M13. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus (CMV), el promotor de lacZ, el promotor de gal10 y el promotor poliedrico del virus de la polihedrosis nuclear multiple de Autographa californica (AcMNPV). Las secuencias de terminacion adecuadas incluyen, por ejemplo, la hormona de crecimiento bovino, SV40, lacZ y senales de poliadenilacion poliedrica de AcMNPV. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen neomicina, ampicilina, y resistencia a higromicina y similares, preferentemente kanamicina. Los vectores disenados de forma espedfica permiten el transporte de ADN entre diferentes celulas hospedadoras, tales como celulas de bacterias-levaduras, o bacterias-animales, o celulas de bacterias-fungicas, o celulas de bacterias e invertebrados.

Ademas de las moleculas de acido nucleico de la presente invencion, el vector puede comprender adicionalmente secuencias de acido nucleico que codifican senales de secrecion. Tales secuencias senal de secrecion son muy conocidas por el experto en la materia. Ademas, dependiendo del sistema de expresion usado se pueden anadir secuencias lfder capaces de dirigir el polipeptido expresado a un compartimento a la secuencia codificante de las moleculas de acido nucleico de la invencion y son bien conocidas en la tecnica. La secuencia o secuencias lfder (se ensambla o ensamblan en una fase apropiada con secuencias de traduccion, inicio y terminacion, y preferentemente una secuencia lfder capaz de dirigir la secrecion de protema traducida, por una parte de la misma, a, entre otros, la membrana extracelular. Opcionalmente, la secuencia heterologa puede codificar una protema de fusion que incluye un peptido de identificacion C- o N-terminal que imparte caractensticas deseadas, por ejemplo, estabilizacion o purificacion simplificada del producto recombinante expresado. Una vez que el vector se ha incorporado en el hospedador apropiado, el hospedador se mantiene en condiciones adecuadas para la expresion de alto nivel de las secuencias de nucleotidos y, si se desea, puede seguir la recogida y purificacion de las protemas, fragmentos antigenicos o protemas de fusion de la invencion. Por supuesto, el vector el tambien puede comprender regiones reguladoras de organismos patogenos.

El vector puede ser preferentemente un vector de expresion inducible por ejemplo, un vector inducible por IPTG.

Ademas, dicho vector tambien puede ser, ademas de un vector de expresion, un vector de transferencia genetica y/o de orientacion genetica. La terapia genetica, que se basa en la introduccion de genes terapeuticos (por ejemplo para vacunacion) en celulas mediante tecnicas ex vivo o in vivo, es una de las aplicaciones mas importantes de la transferencia genetica. Los vectores, sistemas de vector y metodos adecuados para terapia genetica in vitro o in vivo se describen en la bibliograffa y son conocidos por el experto en la materia; vease, por ejemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714716; documento Wo 94/29469; documento WO 97/00957; Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635640 o Verma, Nature 389 (1997), 239-242 y referencias citadas en ese documento.

Las moleculas de acido nucleico de la invencion y los vectores como se ha descrito anteriormente en el presente documento anteriormente se pueden disenar para introduccion directa o para introduccion a traves de liposomas, o

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vectores virales (por ejemplo, adenoviral, retroviral) en la celula. Ademas, se pueden usar sistemas de baculovirus o sistemas basados en virus Vaccinia o Virus del bosque de Semliki como sistema de expresion eucariota para las moleculas de acido nucleico de la invencion. Ademas de la produccion recombinante, se pueden producir fragmentos de la protema, protema de fusion o fragmentos antigenicos de la invencion mediante smtesis peptfdica directa usando tecnicas en fase solida (vease Stewart et al., 1969), Freeman Co, San Francisco Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154). La smtesis de protemas in vitro se puede realizar usando tecnicas manuales o automatizadas. La smtesis automatizada se puede conseguir, por ejemplo, usando el Sintetizador de Peptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer, Foster City CA) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Diversos fragmentos se pueden sintetizar por via qmmica por separado y se pueden combinar usando metodos qmmicos para producir la molecula de longitud completa.

La presente invencion tambien se refiere a una celula hospedadora que comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o el vector que comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.

Dicho "hospedador", se puede producir introduciendo dicho vector o secuencia de nucleotidos en una celula hospedadora que despues de su presencia en la celula media la expresion de una protema codificada por la secuencia de nucleotidos de la invencion o que comprende una secuencia de nucleotidos o un vector de acuerdo con la invencion en el que la secuencia de nucleotidos y/o el polipeptido codificado es extrano para la celula hospedadora. El termino "hospedador", cuando se usa en el presente documento, incluye celulas hospedadoras.

Por "extrano" se hace referencia a que la secuencia de nucleotidos y/o el polipeptido codificado es heterologo con respecto al hospedador, esto se refiere a que se obtiene a partir de una celula un organismo con un antecedente genomico diferente, o es homologo con respecto al hospedador pero esta situado en un entorno genomico diferente al del homologo de origen natural de dicha secuencia de nucleotidos. Esto significa que, si la secuencia de nucleotidos es homologa con respecto al hospedador, no esta situada en su posicion natural en el genoma de dicho hospedador, en particular esta rodeada por diferentes genes. En este caso, la secuencia de nucleotidos puede estar bajo el control de su propio promotor o bajo el control de un promotor heterologo. La posicion de la molecula de acido nucleico o el vector introducidos puede determinarla el experto en la materia usando metodos muy conocidos para el experto en la materia, por ejemplo, Transferencia de Southern. El vector o secuencia de nucleotidos de acuerdo con la invencion que esta presente en el hospedador se puede integrar en el genoma del hospedador o se puede mantener en alguna forma por via extracromosomica. En este sentido, tambien se debe entender que la secuencia de nucleotidos de la invencion se puede usar para restablecer o crear un gen mutante a traves de recombinacion homologa.

En una realizacion, la celula hospedadora que comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o el vector que comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 es una celula hospedadora procariota o eucariota. Preferentemente, la celula hospedadora procariota es E. coli, mas preferentemente BL21 de E. coli, tal como BL21 (DE3).

Las celulas procariotas/bacterianas adecuadas son aquellas que se usa por lo general para clonacion similar a E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens o Bacillus subtilis. Dicho hospedador eucariota puede ser una celulas de mairnfero, una celula de anfibio, una celula de pescado, una celular insecto, una celula fungica, una celula vegetal o una celula bacteriana (por ejemplo, las cepas HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 y JM101 de E. coli). Las celulas hospedadoras recombinantes procariotas son preferentes, con E. coli siendo la mas preferente.

Los ejemplos adicionales de celulas hospedadoras procariotas incluyen, pero no se limitan a, celulas de levadura, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis o Pichia pastoris, lmeas celulares de origen humano, bovino, porcino, mono, y roedor, asf como celulas de insecto, que incluyen, pero no se limitan a, celulas de insecto de Spodoptera frugiperda y celulas de insecto obtenidas a partir de Drosophila asf como celulas de pez cebra. Las lmeas celulares obtenidas a partir de especies de marnfferos adecuadas para su uso y disponibles en el mercado incluyen, pero no se limitan a, celulas L, celulas CV-1, celulas COS-1 (ATCC CRL 1650), celulas COS-7 (ATCC CRL 1651), celulas HeLa (ATCC CCL 2), celulas C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) y MRC-5 (ATCC CCL 171).

Dichas celulas obtenidas a partir de Drosophila pueden ser S2 de Drosophila (ATCC CRL-1963) que se usan, preferentemente, para expresion de protema heterologa en sistemas de expresion de Drosophila, por ejemplo, el Sistema de Expresion de Drosophila (DES®).

Las lmeas celulares obtenidas a partir de especies de mamfferos adecuadas para su uso y disponibles en el mercado incluyen, pero no se limitan a, celulas L, celulas CV-1, celulas COS-1 (ATCC CRL 1650), celulas COS-7 (ATCC CRL 1651), celulas HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) y MRC-5 (ATCC CCL 171).

En otra realizacion mas preferente, dicha celula de anfibio es un oocito. En una realizacion incluso mas preferente dicho oocito es un oocito de rana, de forma particularmente preferente un oocito de Xenopus laevis.

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En una realizacion mas preferente, el hospedador de acuerdo con la invencion es un organismo transgenico no humano. Dicho organismo no humano puede ser un mairnfero, anfibio, un pescado, un insecto, uno hubo una planta. Los animales transgenicos no humanos particularmente precedentes son especies de Drosophila, Caenorhabditis elegans, especies de Xenopus, pez cebra, Spodoptera frugiperda, Autographa californica, ratones y ratas. Las plantas transgenica comprenden, pero no se limitan a, trigo, tabaco, perejil y Arabidopsis.

En la tecnica tambien se conocen bien los hongos transgenicos y comprenden, entre otros, levaduras tales como S. pombe o S. cerevisae, o especies de Aspergillus, Neurospora o Ustilago o especies de Pichia.

La presente invencion tambien se refiere a una protema obtenida o que se puede obtener mediante la expresion de la secuencia de acidos nucleicos que codifica una protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o el vector que comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica una protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 en una celula hospedadora, preferentemente una celula hospedadora procariota, mas preferentemente en E. coli, lo mas preferentemente en BL21 de E. coli, tal como BL21 de E. coli (D3).

En el presente documento se describen metodos para producir el polipeptido codificado por una molecula de acido nucleico de la invencion que comprende cultivar/ reproducir el hospedador de la invencion y aislar el polipeptido producido.

En la tecnica existe un gran numero de metodos adecuados para producir polipeptidos en hospedadoras apropiados. Si el hospedador es un organismo unicelular o una celula de mai^ero o de insecto, el experto en la materia puede volver a una diversidad de condiciones de cultivo que se pueden optimizar adicionalmente sin una carga excesiva de trabajo. De forma conveniente, la protema producida se cosecha a partir del medio de cultivo o a partir de cuerpos de inclusion aislados (biologicos) mediante tecnicas establecidas. Ademas, el polipeptido producido se puede aislar directamente a partir de la celula hospedadora. Dicha celula hospedadora puede ser parte de o se puede obtener a partir de una parte de un organismo hospedador, por ejemplo dicha celula hospedadora debe ser parte del tejido, por ejemplo SNC, piel, etc., de un animal o la parte cosechable de una planta. Ademas, el polipeptido producido se puede aislar a partir de fluidos obtenidos a partir de dicho hospedador, tales como sangre, leche o lfquido cefalorraqmdeo.

Ademas la presente invencion se refiere a polipeptidos que estan codificados por la secuencia de nucleotidos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 de la invencion.

Por consiguiente con el polipeptido de la invencion se puede producir mediante metodos microbiologicos o mediante marnfferos transgenicos. Tambien se concibe que el polipeptido de la invencion se recupere a partir de plantas transgenicas. Como alternativa, el polipeptido de la invencion se puede producir por via sintetica o por via semisintetica.

Por ejemplo, se puede usar smtesis qmmica, tal como el procedimiento en fase solida descrito por Houghton Proc. Natl. Acad. Sci. USA (82) (1985), 5131-5135. Otro metodo es la traduccion de ARNm in vitro. Un metodo preferente implica la produccion recombinante de protema en celulas hospedadoras como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, las secuencias de nucleotidos que comprende en toda o una parte de una cualquiera de las secuencias de nucleotidos de acuerdo con la invencion se pueden sintetizar mediante PCR, se pueden insertar en un vector de expresion, y una celula hospedadora transformada con el vector de expresion. A partir de ese momento, la celula hospedadora se cultiva para producir el polipeptido deseado, que se afsla y se purifica. El aislamiento y purificacion de protemas se puede conseguir mediante una cualquiera de varias tecnicas conocidas; por ejemplo, y no limitado a ello, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa por filtracion en gel y cromatograffa por afinidad, cromatograffa lfquida a alta presion (HPLC), HPLC en fase inversa, electroforesis preparativa en gel de disco. Ademas, para producir los polipeptidos de la presente invencion se pueden usar sistemas de traduccion sin celulas. Los sistemas de expresion sin celulas adecuados para su uso de acuerdo con la presente invencion incluyen lisado de reticulocitos de conejo, extracto de germen de trigo, membranas microscopicas pancreaticas caninas, extracto de S30 de E. coli, sistemas de transcripcion/traduccion acoplados tales como el sistema TNT (Promega). Estos sistemas permiten la expresion de polipeptidos o peptidos recombinantes despues de la adicion de vectores de clonacion, fragmentos de ADN, o secuencias de aRn que contienen regiones codificantes y elementos promotores apropiados. Como se ha mencionado anteriormente, las tecnicas de aislamiento/purificacion de protemas pueden requerir la modificacion de las protemas de la presente invencion usando metodos convencionales. Por ejemplo, una etiqueta de histidina se puede anadir a la protema para permitir su purificacion en una columna de mquel. Otras modificaciones pueden producir una actividad mayor o menor, pueden permitir niveles mas elevados de produccion de protema, o pueden simplificar la purificacion de la protema. Otras etiquetas tambien incluyen la etiqueta flag. Tales etiquetas se usan preferentemente para hospedadores eucariotas.

La protema de la presente invencion tiene preferentemente la secuencia de aminoacidos codificada por una molecula de acido nucleico de la presente invencion como se describe en el presente documento o se obtiene o se puede obtener mediante la expresion de dicha secuencia de acidos nucleicos que se describe en el presente documento. Como tal tambien se pueden usar vectores que comprenden la SEQ iD NO: 1 tales como por ejemplo, en vectores de expresion, para conseguir la expresion de una protema obtenida o que se puede tener mediante la

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expresion de la secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO: 1.

Por ejemplo, las cepas de BL21 de E. coli (DE3) se pueden usar para mediar la expresion de la protema de SEQ ID NO: 1 o el vector que comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1. En la tecnica se conoce la construccion de un vector por ejemplo a la expresion bajo el control del Promotor T7 inducible por IPTG inducible. Las celulas BL21 de E. coli (DE3) electrocompetentes se pueden transformer con ADN plasmido por ejemplo un vector de expresion como se ha descrito anteriormente. Las celulas procesadas a continuacion se cultivan en medio. Despues del cultivo, las celulas se cosechan mediante centrifugacion o se pueden lisar directamente por ejemplo mediante sonicacion y la suspension se centrifuga o se trata a continuacion como se ha ejemplificado en el ejemplo. El sedimento, es decir, los cuerpos de inclusion en bruto, se pueden volver a suspender a continuacion en tampon por ejemplo tampon de crisis. Los cuerpos de inclusion humedos se solubiliza a continuacion. Despues de otra centrifugacion, se puede obtener la protema de interes o antes de que la protema se pueda volver a plegar por ejemplo como se ejemplifica en el ejemplo. La expresion de protemas, interrupcion celular, recuperacion de cuerpos de inclusion, y nuevo plegamiento de cuerpos de inclusion por lo general se realiza como se sabe en la tecnica y, por ejemplo, como se describe en el presente documento en los Ejemplos.

Una forma para purificar una protema incluye precipitacion con sulfato de amonio ya que se trata de un metodo usado para purificar protemas mediante la alteracion de su solubilidad. Es un caso espedfico de una tecnica mas general conocida como desalado. El sulfato de amonio se usa normalmente ya que su solubilidad es tan elevada que se permiten soluciones salinas con fuerza ionica elevada. La solubilidad de las protemas vana de acuerdo con la fuerza ionica de la solucion, y por lo tanto de acuerdo con la concentracion de la sal. Se observan dos efectos distintos: a concentraciones de sal bajas, la solubilidad de la protema aumenta con el aumento de la concentracion de sal (es decir, aumentando la fuerza ionica), un efecto denominado salting in. A medida que la concentracion de sal (fuerza ionica) aumenta adicionalmente, la solubilidad de la protema comienza a disminuir. A una fuerza ionica suficientemente elevada, la protema precipitara casi completamente de la solucion (salting out).

Dado que las protemas se diferencian notablemente en sus solubilidades a fuerza ionica elevada, el salting-out es un procedimiento muy util para ayudar en la purificacion de una protema dada. Mediante la adicion de sulfato de amonio cosmotropico, los productos secundarios de plegamiento tales como especies no plegadas y con plegamiento erroneo y ademas impurezas obtenidas a partir de celulas hospedadoras tales como componentes de la pared celular y protemas precipitan. Con un aumento de la concentracion del agente precipitan, la eficacia de la precipitacion aumentara y por lo tanto se obtiene una preparacion de FcR altamente purificada siempre y cuando la variante de FcR sea resistente a la precipitacion con tales concentraciones de de sulfato de amonio elevadas. Por lo tanto, es deseable tener una variante de FcR que sea altamente soluble a concentraciones de sulfato de amonio iguales o incluso que superen 1,5 M.

A continuacion, la protema precipitada se retira por centrifugacion y a continuacion la concentracion de sulfato de amonio aumenta hasta un valor que precipitara la mayor parte de la protema de interes a la vez que deja la cantidad maxima de contaminantes de protema todavfa en solucion. La protema precipitada de interes se recupera mediante centrifugacion y se disuelve en tampon recien preparado para la siguiente etapa de purificacion.

Preferentemente, la protema de la presente invencion tiene una alta solubilidad en concentraciones de sulfato de amonio iguales o superiores a 1,5 M.

La presente invencion tambien se refiere a una protema que esta codificada por una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6.

Una protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, o 9 se puede codificar con la secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6, en la que

(i) el primer codon (ATG) se omite de la SEQ ID NO: 6 que da como resultado una protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 2,

(ii) el primer (ATG) y el segundo codon (GCA) se omiten de la SEQ ID NO: 6 que da como resultado una protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 3,

(iii) el primer (ATG), segundo (GCA) y tercer codon (CCG) se omiten de la SEQ ID NO: 6 que da como resultado una protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 4,

(iv) el primer (ATG), segundo (GCA), tercer (CCG), cuarto (CCG) y quinto (AAA) codon se omiten de la SEQ ID NO: 6 que da como resultado una protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 5,

(v) los codones que codifican los aminoacidos TPA desde el extremo N- al C-Terminal se anaden entre el primer (ATG) y el segundo (GCA) codon a partir de la SEQ ID NO: 6 y los codones que codifican la secuencia de aminoacidos MGI se anaden en la posicion 3' con respecto al penultimo codon (CCG) de la SEQ ID NO: 6 que da como resultado una protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 9.

La presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica que comprende la protema obtenida o que se puede obtener mediante la expresion del acido nucleico que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o el vector que comprende el acido nucleico que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o una protema

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codificada por la secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO: 6.

El termino "composicion", como se usa de acuerdo con la presente invencion, se refiere a

(a) composicion o composiciones que comprende(n) al menos una protema obtenida o que se puede obtener mediante la expresion del acido nucleico que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1;

(b) o el vector que comprende el acido nucleico que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, o

9;

(c) o una protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO: 6;

(d) o una secuencia de acidos nucleicos que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 o 9.

Se concibe que las composiciones de la presente invencion que se describen a continuacion en el presente documento comprendan las protemas mencionadas anteriormente en cualquier combinacion. Opcionalmente, puede comprender moleculas adicionales que sean capaces de unirse a otras protemas por ejemplo anticuerpos o linfocitos. La composicion puede estar en forma solida, lfquida o gaseosa y puede estar, entre otros, en forma de (un) polvo(s), (un) comprimido(s), (una) solucion o soluciones, (un) aerosol(es), granulos, pfldoras, suspensiones, emulsiones, capsulas, jarabes, lfquidos, elixires, extractos, tintura o extractos fluidos en una forma que sea particularmente adecuada para administracion oral o parental o topica.

Otra composicion preferente de la presente invencion es una composicion farmaceutica que comprende ademas opcionalmente un vehnculo y/o excipiente farmaceuticamente aceptable. Dicha composicion farmaceutica comprende, entre otros, la secuencia de acidos nucleicos de la presente invencion o el polipeptido de la presente invencion que se puede acoplar a un polipeptido adicional, por ejemplo un anticuerpo hubo otra protema presente en el suero.

La composicion farmaceutica se puede administrar con un vehnculo fisiologicamente aceptable a un paciente, como se describe en el presente documento. En una realizacion espedfica, la expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a aprobado por una agencia reguladora u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y mas particularmente en seres humanos.

El termino "vehnculo" se refiere a un diluyente, adyuvante, o vehnculo con el que se administra la composicion farmaceutica. Tales vehnculos farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles, tales como agua y aceites. El agua es un vetnculo preferente cuando la composicion farmaceutica se administra por via intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol tambien se pueden usar como vehnculos lfquidos, en particular para soluciones inyectables.

Los excipientes farmaceuticos adecuados incluyen almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sflice, estearato sodico, monoestearato de glicerol, talco, ion sodio, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, agua etanol y similares. La composicion, si se desea, tambien puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulgentes, o agentes tampon de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsion, comprimidos, pfldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y similar. La composicion se puede formular como un supositorio, con tradicionales y vehnculos aglutinantes tales como trigliceridos. La formulacion oral puede incluir vehnculos convencionales tales como las calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. los ejemplos de vehnculos farmaceuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. Las composiciones de este tipo contendran una cantidad terapeuticamente eficaz de los compuestos mencionados anteriormente, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehnculo para proporcionar la forma adecuada de administracion al sujeto. La formulacion debena adecuarse al modo de administracion.

En otra realizacion preferente, la composicion se formula de acuerdo con procedimientos de rutina tales como una composicion farmaceutica adaptada para administracion intravenosa a seres humanos. Por lo general, las composiciones para administracion intravenosa son soluciones en tampon acuoso isotonico esteril. Cuando sea necesario, la composicion puede tambien incluir un agente solubilizante y un anestesico local tal como lidocama para aliviar el dolor en el sitio de la inyeccion. Por lo general, los ingredientes se suministran por separado o se mezclan juntos en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en forma de polvo seco liofilizado o concentrado libre de agua en un recipiente sellado hermeticamente tal como una ampolla o una bolsita indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composicion se va a administrar por infusion, se puede dispensar con una botella de infusion que contiene agua o solucion salina esteril de calidad farmaceutica. Cuando la composicion se administra por inyeccion, se puede proporcionar una ampolla de agua esteril para inyeccion o solucion salina, de manera que los ingredientes se puedan mezclar antes de su administracion.

La composicion farmaceutica de la invencion se puede formular como formas neutras o de sal. Las sales

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farmaceuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como los obtenidos a partir de los acidos clortudrico, fosforico, acetico, oxalico, acido tartarico, etc., y las formadas con cationes tales como los obtenidos a partir de sodio, potasio, amonio, calcio, hidroxidos ferricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procama, etc.

Los ensayos in vitro se pueden usar opcionalmente para ayudar a identificar los intervalos de dosificacion optimos. La dosis precisa que se usara en la formulacion tambien dependera de la via de la administracion y de la gravedad de la enfermedad o trastorno y se debena decidir de acuerdo con el criterio del experto en medicina y las circunstancias de cada sujeto. Las dosis eficaces se pueden extrapolar a partir de curvas de dosis-respuesta obtenidas a partir de sistemas de ensayo de modelo in vitro o animal. Preferentemente, la composicion farmaceutica se administra directamente o en combinacion con un adyuvante.

La composicion farmaceutica se puede disenar para la aplicacion en terapia genetica. La tecnica de terapia genetica ya se ha descrito anteriormente en relacion con las celulas hospedadoras de la invencion y todo lo que se ha dicho tambien se aplica en relacion con la composicion farmaceutica. Por ejemplo, la molecula de acido nucleico o la protema que comprende la protema obtenida o que se puede obtener mediante la expresion del acido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o el vector que comprende el acido nucleico que codifica la protema de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o una protema codificada por la secuencia de acidos nucleicos de SEQ ID NO: 6 en la composicion farmaceutica esta preferentemente en una forma que permita su introduccion, expresion y/o integracion estable en celulas de un sujeto individual a tratar.

Para terapia genetica, se pueden usar diversos vectores virales que pueden usar, por ejemplo, adenovirus, virus del herpes, vaccinia o, preferentemente, un virus de ARN tal como un retrovirus. LOs ejemplos de vectores retrovirales en los que se puede insertar un unico gen extrano, incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Un numero de vectores retrovirales adicionales tambien pueden incorporar multiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de modo que las celulas transducidas se puedan identificar y generar. Los vectores retrovirales se pueden hacer espedficos de la diana insertando, por ejemplo, un polinucleotido que codifica un azucar, un glicolfpido, o una protema. Los expertos en la materia sabran de, o pueden averiguar facilmente sin excesiva experimentacion, las secuencias de polinucleotidos espedficas que se pueden insertar en el genoma retroviral para permitir la administracion espedfica de diana del vector retroviral que contiene la secuencia de polinucleotidos insertada.

Dado que los retrovirus recombinantes son preferentemente defectuosos, estos requieren asistencia para producir partmuias vectoriales infecciosas. Esta ayuda se puede proporcionar, por ejemplo, usando lmeas de celulas auxiliares que contienen plasmidos que codifican todos los genes estructurales del retrovirus bajo el control de secuencias reguladoras dentro de la LTR. A estos plasmidos les falta una secuencia de nucleotidos que permite al mecanismo de empaquetamiento para reconocer una transcripcion de ARN para la encapsulacion. Las lmeas de celulas auxiliares que tienen deleciones de la senal de empaquetamiento incluyen, pero no se limitan a w2, PA317 y PA12, por ejemplo. Estas lmeas celulares producen viriones vados, ya que no se empaqueta ningun genoma. Si se introduce un vector retroviral en tales celulas en las que la senal de empaquetamiento esta intacta, pero los genes estructurales estan sustituidos por otros genes de interes, el vector se puede empaquetar y producir el virion vector. Como alternativa, las celulas NIH 3T3 u otras celulas de cultivo tisular se pueden transfectar directamente con plasmidos que codifican los genes estructurales retrovirales gag, pol y env, mediante transfeccion convencional con fosfato de calcio. Estas celulas se transfectan a continuacion con el plasmido vector que contiene los genes de interes. Las celulas resultantes liberan el vector retroviral en el medio de cultivo. Otro sistema de administracion dirigido para las moleculas de acido nucleico de la presente invencion es un sistema de dispersion coloidal. Los sistemas de dispersion coloidal incluyen complejos de macromoleculas, nanocapsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lfpidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal preferente de la presente invencion es un liposoma. Los liposomas son vesmulas de membrana artificiales que son utiles como vehuculos de administracion in vitro e in vivo. Se ha demostrado que las vesmulas unilamelares grandes (LUV), cuyo tamano vana de 0,2-4,0 pm pueden encapsular un porcentaje sustancial de un tampon acuoso que contiene macromoleculas grandes. Ademas de las celulas de mairnfero, se han usado liposomas para la administracion de polinucleotidos en celulas de plantas, levaduras y bacterianas. Para que un liposoma sea un vehmulo de transferencia genetica eficaz, debenan estar presentes las siguientes caractensticas: (1) encapsulacion de los genes de interes con alta eficacia sin comprometer su actividad biologica; (Mannino, et al., Biotechniques, 6: 682, 1988). La composicion del liposoma es normalmente una combinacion de fosfolfpidos, en particular fosfolfpidos de alta temperatura de transicion de fase, normalmente en combinacion con esteroides, especialmente colesterol. Tambien se pueden usar otros fosfolfpidos u otros lfpidos. Las caractensticas ffsicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza ionica y la presencia de cationes divalentes. Los ejemplos de lfpidos utiles en la produccion de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolfpidos, cerebrosidos y gangliosidos. Los diacilfosfatidilgliceroles son particularmente utiles, en los que el resto lipfdico contiene de 14-18 atomos de carbono, en particular de 16-18 atomos de carbono, y esta saturado. Los fosfolfpidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina. La orientacion de los liposomas se puede clasificar basandose en factores anatomicos y mecanicos. La clasificacion anatomica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo,

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espedfica de organo, espedfica de celula y espedfica de organulo. La orientacion mecanica se puede distinguir en funcion de si es pasiva o activa. La orientacion pasiva usa la tendencia natural de los liposomas para distribuirse a las celulas del sistema reticuloendotelial (RES) en organos que contienen capilares sinusoidales.

En el contexto de la presente invencion el termino "sujeto" se refiere a un individuo que necesita un tratamiento de un trastorno afectivo. Preferentemente, el sujeto es un vertebrado, incluso mas preferente un mairnfero, particularmente preferente un ser humano. En una realizacion, el ser humano es un paciente o un individuo.

El termino "administrado" se refiere a la administracion de una dosis terapeutica o diagnosticamente eficaz de la molecula de acido nucleico mencionada anteriormente que codifica el polipeptido de la presente invencion a un individuo.

Como se usa en el presente documento, una "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad del componente o agente terapeutico activo que es suficiente para tratar o mejorar una enfermedad o trastorno, retrasar el inicio de una enfermedad o proporcionar cualquier beneficio terapeutico en el tratamiento o gestion de una enfermedad.

Como se sabe en la tecnica y se ha descrito anteriormente, pueden ser necesarios ajustes para la administracion sistemica con respecto a la localizada, edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administracion, interaccion de farmacos y la gravedad de la afeccion, y no podran establecer los expertos en la materia con la experimentacion de rutina. Los metodos se pueden aplicar tanto en terapia humana como en aplicaciones veterinarias. Los compuestos descritos en el presente documento que tienen la actividad terapeutica deseada se pueden administrar a un paciente en un vedculo fisiologicamente aceptable, como se describe en el presente documento. Dependiendo de la forma de introduccion, los compuestos se pueden formular en una diversidad de formas como se discute a continuacion. La concentracion de compuesto terapeuticamente activo en la formulacion puede variar en aproximadamente un 0,1-100%. Los agentes se pueden administrar solos o en combinacion con otros tratamientos.

La administracion de la composicion farmaceutica se puede realizar de diversas maneras como se ha discutido anteriormente, que incluyen, pero no se limitan a, por via oral, subcutanea, intravenosa, intraarterial, intranodal, intramedular, intratecal, intraventricular, intranasal, intrabronquial, transdermica, intranodal, intrarrectal, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal o intraocular. En algunos casos, por ejemplo, en el tratamiento de heridas e inflamacion, los agentes candidatos se pueden aplicar directamente como una solucion de pulverizacion seca.

Preferentemente la composicion farmaceutica se inyecta. Esta inyeccion se administra usando infusiones intravenosas, por via subcutanea o intramuscular. Ademas, la composicion farmaceutica puede comprender otros vedculos y/o excipientes farmaceuticamente aceptables. La expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a la farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y mas particularmente en seres humanos.

Cuando la composicion se va a administrar por infusion, se puede distribuir con un frasco de infusion que contiene agua o solucion salina esteril de calidad farmaceutica. Cuando la composicion se administra por inyeccion, se puede proporcionar una ampolla de agua esteril o solucion salina para inyeccion, de manera que los ingredientes se puedan mezclar antes de su administracion. Ademas, la composicion farmaceutica se puede administrar en combinacion con uno u otros agentes o anticuerpos terapeuticos mas, tales como esteroides o inmunoglobulina intravenosa, en particular corticosteroides, profarmacos glucocorticoides, por ejemplo prednisona, IVIG, anti-D, alcaloides de la vinca, por ejemplo vincristina o vinblastina, danazol, agentes inmunosupresores, por ejemplo azatioprina, ciclofosfamida o ciclosporina A, dapsona, agentes trombopoyeticos, rituximab, micofenolato mofetilo, romiplostim, eltrombopag, micofenolato mofetilo. Como se usa en el presente documento, la expresion "en combinacion" se refiere al uso de mas de un agente profilactico y/o terapeutico. El uso de la expresion "en combinacion" no limita el orden en que se administran los agentes profilacticos y/o terapeuticos a un paciente.

El medico asistente y los factores clfnicos determinaran el regimen de dosificacion. Como es bien sabido en las artes medicas, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamano del paciente, area de superficie corporal, edad, el compuesto en particular que se va a administrar, sexo, tiempo y via de administracion, salud general y otros farmacos que se estan administrando de forma simultanea. Una dosis habitual puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 1000 |jg; sin embargo, se preven dosis por debajo o por encima de este intervalo a modo de ejemplo, especialmente considerando los factores mencionados anteriormente.

Las dosificaciones se administran preferentemente una vez a la semana, sin embargo, durante la evolucion del tratamiento, las dosificaciones se pueden administrar en intervalos de tiempo mucho mas largos y si hubiera necesidad se pueden administrar en intervalos de tiempo mucho mas cortos, por ejemplo, diariamente. En un caso precedente, la respuesta inmunitaria se controla usando metodos que se describen en el presente documento y metodos adicionales conocidos por los expertos en la materia y las dosificaciones se optimizan, por ejemplo, en tiempo, cantidad y/o composicion. Las dosificaciones variaran pero una dosificacion preferente para administracion intravenosa de aDn es de aproximadamente 106 a 1012 copias de la molecula de ADN. Si el regimen es una infusion

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continua, tambien debena estar en el intervalo de 1 pg a 10 mg de unidades por kilogramo de peso corporal por minuto, respectivamente. La evolucion se puede controlar mediante una evaluacion periodica. La composicion farmaceutica de la invencion se puede administrar por via local o por via sistematica. La administracion sera preferentemente por v^a parenteral, por ejemplo, por via intravenosa. Las preparaciones para administracion parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas esteriles. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehmulos acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcoholicas/acuosas, incluyendo solucion salina y medios tamponados. Los vehmulos parenterales incluyen solucion de ion sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa e ion sodio, solucion de Ringer con lactato, o aceites no volatiles. Los vehmulos intravenosos incluyen sustituyentes de lfquidos y nutrientes, sustituyentes de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. Tambien pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares.

Tambien se preve que las composiciones farmaceuticas se usen en enfoques de coterapia con otros agentes, por ejemplo, utiles para detectar ADN metilado y, por lo tanto, utiles para diagnosticar neoplasias que pueden mostrar un patron metilado tfpico.

La presente invencion proporciona kits que se pueden usar para los metodos descritos anteriormente. Un experto en la materia tambien sabe bien que la composicion farmaceutica puede estar en forma de un kit de dosificacion multiple que contiene cantidades suficientes de dosis de administracion de FcyR para tratar o prevenir de forma eficaz enfermedades inflamatorias y/o enfermedades autoinmunes en un paciente. En una realizacion, el envase o kit farmaceutico comprende uno o mas envases llenos con la composicion farmaceutica de la invencion. Ademas, uno o mas agentes profilacticos o terapeuticos adicionales utiles para el tratamiento de una enfermedad tambien se pueden incluir en el envase o kit farmaceutico.

Ademas, la composicion farmaceutica de la presente invencion se puede usar para el tratamiento y prevencion de trastornos o enfermedades.

Como se usa en el presente documento, el termino "que trata" y terminos analogos se refieren a una gestion y cuidado de un paciente y/o el combate de una enfermedad o trastorno. Como se usa en el presente documento, los terminos "prevenir", "que previene" y "prevencion" se refiere la prevencion de la aparicion o inicio de uno o mas smtomas un trastorno en un sujeto que resulta de la administracion de un agente profilactico o terapeutico.

Como se usa en el presente documento, los terminos "trastorno" y "enfermedad" se usan indistintamente para hacer referencia a una afeccion en un sujeto. En particular, la expresion "enfermedad autoinmune" se usa indistintamente con la expresion "trastorno autoinmune" para hacer referencia a una afeccion en un sujeto caracteriza la por lesion de celulas, tejidos y/u organos causada por una reaccion inmunologica del sujeto a sus propias celulas, tejidos y/u organos. La expresion "enfermedad inflamatoria" se usa indistintamente con la expresion "trastorno inflamatorio" para hacer referencia a una afeccion en un sujeto caracteriza la por inflamacion, preferentemente inflamacion cronica. Los trastornos autoinmunes pueden estar o no asociados con inflamacion. Ademas, la inflamacion puede o no estar causada por un trastorno autoinmune. Por lo tanto, ciertos trastornos se pueden caracterizar como trastornos tanto autoinmunes como inflamatorios.

En una realizacion preferente, la enfermedad inflamatoria que se puede tratar con el presente metodo es Trombocitopenia Inmune Primaria (TIP), Lupus Sistemico Eritematoso Sistemico (LES), Artritis Reumatoide (AR) o Anemia Hemolttica Autoinmune (AHAI).

La presente invencion tambien se refiere a una composicion de materia que comprende una protema de acuerdo con la SEQ ID No: 2 y/o 3.

El termino "composicion de materia" se refiere a todas las composiciones de dos o mas sustancias y a todas las sustancias compuestas, tanto si son el resultado de union qrnmica, o de mezcla mecanica, o un producto biologico. Una composicion de materia se puede formar mediante la mezcla de dos o mas ingredientes. La mezcla de ingredientes en una composicion de materia se puede producir mediante operaciones mecanicas o qrnmicas o mediante procesos biologicos.

La composicion de materia puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas principios activos. Con "principio activo" se hace referencia a un ingrediente terapeuticamente eficaz. Un principio activo de este tipo se puede unir a los anticuerpos de IgG como se describe en el presente documento y posiblemente se puede unir a linfocitos, por ejemplo linfocitos T, linfocitos B, linfocitos citoltticos naturales. Un principio activo de este tipo solo se une a la region constante. En una composicion de materia es preferente que una protema de la presente invencion sea el unico principio activo como se ha descrito anteriormente.

En una realizacion la composicion de materia comprende una protema de acuerdo con la SEQ ID No: 2 y 3. En otra realizacion la composicion de materia comprende una protema de acuerdo con la SEQ ID No: 2 o 3. En otra realizacion la composicion de materia comprende una protema de acuerdo con la SEQ ID No: 2. En otra realizacion la composicion de materia comprende una protema de acuerdo con la SEQ ID No: 3.

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En una realizacion la composicion de materia de la presente invencion comprende adicionalmente una protema de acuerdo con la SEQ ID No. 4 y/o 5. En otra realizacion la composicion de materia de la presente invencion comprende adicionalmente una protema de acuerdo con la SEQ ID No. 4 y 5. En otra realizacion la composicion de materia de la presente invencion comprende adicionalmente una protema de acuerdo con la SEQ ID No. 4 o 5.

En otra realizacion la composicion de materia de la presente invencion comprende adicionalmente una protema de acuerdo con la SEQ ID No. 4. En otra realizacion la composicion de materia de la presente invencion comprende adicionalmente una protema de acuerdo con la SEQ ID No. 5.

En otra realizacion la composicion de materia de la presente invencion se caracteriza por que la cantidad de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 2 supera a la de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 3.

En otra realizacion la composicion de materia de la presente invencion se caracteriza por que la cantidad de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 3 supera a la de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 2.

En otra realizacion la composicion de materia de la presente invencion se caracteriza por que la cantidad de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 2 supera a la de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 3 y la cantidad de las protemas de acuerdo con la SEQ ID No: 2 y 3 supera a la de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 4 y/o 5.

En una realizacion la composicion de materia comprende una protema de acuerdo con la SEQ ID No: 9.

La composicion de materia es, en una realizacion preferente, una composicion farmaceutica.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo para preparar una composicion farmaceutica que comprende cultivar la celula hospedadora de la presente invencion en condiciones que permitan la expresion de la protema codificada, y recuperar la composicion farmaceutica obtenida.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran la invencion. Estos ejemplos no se debenan interpretar como limitantes del alcance de la presente invencion. Los ejemplos se incluyen para fines de ilustracion y la presente invencion esta limitada solamente por las reivindicaciones.

Materiales y Metodos

Produccion de variantes de FcR

Se inocularon 75 ml de LB suplementado con 50 pg/ml de Kanamicina en un matraz conico con tabique deflector de 250 ml con 5 pl de una solucion de reserva de glicerol y se agito durante 15 h a 37 °C, 170 rpm (Multitron Standard, Infors HT). Posteriormente, se inoculo 1 l de LB en un matraz conico con tabique deflector de 2 l con 10 ml del cultivo durante una noche culture y se agito a 37 °C, 170 rpm. A una DO600 de 1,6, la expresion se indujo mediante la adicion de IPTG 1 mM. Despues del cultivo durante otras 3 h a 37 °C, 170 rpm, las celulas se cosecharon mediante centrifugacion (10 min a 5.000 g, 4 °C ), se lavaron una vez con 200 ml de PBS enfriado con hielo y se almacenaron a -20 °C .

Interrupcion celular y aislamiento de cuerpos de inclusion

Se descongelaron 6 - 8 g de celulas de E. coli congeladas a temperatura ambiente y se volvieron a suspender en 30 ml de tampon de lisis (Tris/HCI 50 mM, NaCI 25 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0) suplementado con 100 pg/ml de lisozima usando un homogeneizador de teflon en vidrio. Despues de incubacion durante 15 min en hielo, las celulas se interrumpieron mediante sonicacion (ajuste de potencia en 6, ciclo de tareas al 30 %, 30 min, Sonicador 250 equipado con una micropunta, Branson) y la suspension se centrifugo (45 min a 13.000 g, 4 °C). Se tomaron muestras de 1 ml del sobrenadante y el lfquido restante se descarto. El sedimento, es decir, los cuerpos de inclusion en bruto, se volvieron a suspender en 35 ml de tampon de lisis suplementado con un 0,5 % (v/v) de Polisorbato 20 usando un homogeneizador de teflon en vidrio y se centrifugo (15 min a 13.000 g, 4 °C). Despues de una etapa de lavado adicional con detergente, se realizo una etapa de lavado final usando tampon de lisis solo. Los cuerpos de inclusion lavados se almacenaron a -20 °C hasta su uso.

Replegamiento y purificacion de variantes de FcR

Los cuerpos de inclusion humedos se solubilizaron a 200 mg/ml en Tris/HCI 20 mM, guanidina 6 M, EDTA 3 mM, DTT 5 mM, pH 8,0 durante 2,5 h a 20 °C con agitacion constante (400 rpm) en un tubo de centrifugadora cerrado. Despues de la centrifugacion (20.000 g, 10 min, 20 °C) del sobrenadante se recogio por decantacion y el contenido de FcR se determino despues de una dilucion a 1:60 con RP-HPLC en Knauer Bioselect C4. Basandose en los resultados analtticos, los cuerpos de inclusion solubilizados se diluyeron con Tris/HCI 20 mM, guanidina 6 M, EDTA 3 mM, DTT 5 mM, pH 8,0 hasta un contenido de FcR de 21 mg/ml y una parte de la solucion diluida de FcR se

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anadio gota a gota a 20 partes de tampon de replegamiento agitado (800 rpm) (Tris/HCI 20 mM, urea 2 M, arginina 0,5 M, cisteamina 2 mM, cistamina 2 mM, pH 7,7 a 6 °C). Despues de incubacion durante 16 h a 10 °C en un recipiente sellado sin agitacion, la solucion de replegamiento se calento a temperatura ambiente. La solucion de replegamiento caliente se ajusto a (NH4)2SO4 1,1 M mediante la adicion gota a gota de (NH4)2SO4 3,5 M, NH4H2PO4 20 mM, pH 7,0 con agitacion constante (400 rpm). Despues de agitar durante otra 1 h a 200 rpm la suspension se centrifugo (20.000 g, 20 min, 20 °C), el sobrenadante se filtro (0,2 pm de Durapore®, Millipore) y el filtrado se cargo a

4 ml/min, < 4 mg de protema/ml de resina sobre una columna de Fenil Sepharose HP de 35 ml (h = 6,6 cm, d = 2,6 cm, GE Healthcare) equilibrada en (NH4)2SO4 1,2 M, NH4H2PO4 20 mM, pH 7,0. La columna se lavo con 100 ml de (NH4)2SO41,2 M, NH4H2PO4 20 mM, pH 7,0 y la protema unida se eluyo con 350 ml de gradiente lineal de (NH4)2SO4 de 1, 2 M a 0 M en NH4H2PO4 20 mM, pH 7,0 a 5 ml/min. El eluato se recogio en fracciones de 7,5 ml, que se sometieron a analisis de RP-HPLC en Phenomenex Jupiter C4. Las fracciones con una pureza superior a un 85 % con respecto a la variante de FcR buscara a continuacion se combinaron, se concentraron aprox. dos veces y diafiltraron frente a L-histidina 20 mM a pH 6,5 mediante filtracion de flujo tangencial (Vivaflow 50, 5 kDa de MWCO, 0,01 m2, flujo cruzado de 200 ml/min, pIN = 200 kPa; Sartorius) hasta que la conductividad se redujo a aprox.

5 mS/cm. Despues de intercambiar el tampon la solucion se cargo a 2 ml/min, < 20 mg de protema/ml de resina sobre una columna de SP Sepharose HP de 9 ml (h = 4,5 cm, d = 1,6 cm, GE Healthcare) equilibrada en L-histidina 20 mM, pH 6,5. La columna se lavo con 30 ml de L-histidina 20 mM, NaCI 30 mM, pH 6,5 y la protema unida se eluyo con un gradiente lineal de 90 ml de NaCI de 20 mM a 400 mM en 20 mM L-histidina, pH 6,5 a 3 ml/min. Las fracciones que comprendfan el pico principal se combinaron, se ajustaron a 15,4 mS/cm con L-histidina 20 mM a pH 6,5, se concentraron a aprox. 20 mg/ml mediante ultrafiltracion (4.000 g, 5 kDa de MWCO, Vivaspin 20, Sartorius) y se diluyeron a 15 mg/ml con L-histidina 20 mM, NaCI 150 mM, pH 6,5. La solucion de FcR diluida se filtro (0,45 pm de membrana de PES, Puradisc™ 25 mm, Whatman) se tomaron almuotas, se congelo de forma ultrarrapida en nitrogeno lfquido y se almaceno a -80 °C.

Identificacion Sistematica de Precipitacion

El FcR se ajusto a 0,7 mg/ml en presencia de histidina 20 mM, NaCI 150 mM y sulfato de amonio 0 - 2,8 M mediante la adicion de la cantidad apropiada de ddH2O, 10X de solucion de reserva de histidina/NaCI (histidina 20 mM, NaCI 1,5 M) y solucion de reserva de sulfato de amonio (4 M en ddH2O). El pH se ajusto a 6, 7 o 8 usando una solucion de reserva de 10X de histidina/NaCI y sulfato de amonio con el pH apropiado. Cada condicion se ajusto por duplicado. Las muestras se incubaron durante 1 h a 25 °C, se centrifugaron (20.000 x g, 10 min) y se transfirieron 30 pl del sobrenadante a una placa de 384 pocillos (ptransparente, sin union, de color negro, Greiner Bio-one). La absorbancia a 280 nm se midio (Spectrofluor plus, Tecan) y el contenido de protema se calculo de acuerdo con la Ley de Lambert Beer usando un coeficiente de extincion de masa de 1,5625 ml x mg-1 x cm-1 y una longitud de paso de 0,24 cm. La absorbancia de un pocillo de muestra se corrigio mediante la absorbancia de un pocillo que conterna solamente tampon de blanco.

SDS page

Para moderar el posterior intercambio de disulfuro, los tioles libres se alquilaron con yodoacetamida mezclando 18 pl de IBs solubilizado o caldo de cultivo de replegamiento con 2 pl de yodoacetamida 250 mM recien preparada en H2O. La mezcla se incubo durante 45 min a 30 °C, 750 rpm en la oscuridad y se uso directamente para la preparacion de muestras por SDS-PAGE de acuerdo con el manual de NuPAGE® Novex® (Invitrogen). Las protemas se separaron en un gel de Bis-Tris al 4-12% en tampon de desarrollo MES (ambos de NuPAGE® Novex®, Invitrogen) de acuerdo con los insurgentes del fabricante. Los geles se lavaron tres veces con ddH2O y se tineron con Tincion Segura Simply Blue™ (Invitrogen) durante al menos 6 h a temperatura ambiente. Como marcador molecular se aplicaron 10 pl de patron pre-tincion SeeBlue® Plus2 (Invitrogen).

LC-MS

La masa molecular de la protema intacta expresada se determino mediante espectrometna de masas en colaboracion con el MPI de Bioqmmica (Martinsried). Las muestras se analizaron en un analizador de masas ESI- TOF (microTOF, Bruker) equipado con una columna Phenomenex Aeris™ Widepore C4 (100 mm x 2,1 mm, tamano de partroula de 3,6 pm, tamano de poro de 300 A) previamente equilibrada en acetonitrilo al 30 %, TFA al 0,05 %. Las muestras que conternan FcR se inyectaron a 0,25 ml/min, 20 °C y la protema unida se eluyo con un gradiente lineal de 15 min de acetonitrilo de un 30% a un 80%, TFA al 0,05 %.

Espectroscopia de UV/VIS

Si fuera necesario, la solucion de protema se dilrna con el respectivo tampon a una DO280 entre 0,2 y 0,8. Se transfirieron 400 pl de la solucion a una microcubeta de UV-micro (UV-micro cubeta, Brand). La absorbancia a 280 nm y 320 nM se registro (TidasE, J&M Analytik) y la concentracion de protema en mg/ml se calculo de acuerdo con la siguiente ecuacion:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

c protema = ( DOjiffl - DOjzo) x 0,64 Ilig.'Oll

Como blanco se uso el respectivo tampon. El ensayo se realizo por triplicado y se hizo un promedio de los resultados.

Ejemplo 1: Identificacion sistematica de precipitacion

La preparacion de la protema de FcR mediante un proceso basado en replegamiento normalmente implica una etapa de precipitacion con sulfato de amonio. Mediante la adicion de sulfato de amonio cosmotropico precipitan productos secundarios como especies sin plegar y con plegamiento erroneo y ademas con impurezas obtenidas a partir de celula hospedadora tales como componentes de la pared celular y protemas. Con el aumento de la concentracion del agente precipitante, la eficacia de la precipitacion aumentada y por lo tanto se obtiene una preparacion de FcR altamente purificada siempre y cuando la variante de siempre y cuando la protema de interes sea resistente a la precipitacion a concentraciones tan altas de sulfato de amonio. Por lo tanto, es deseable tener una variante de FcR que sea altamente soluble a concentraciones de sulfato de amonio iguales o superiores a 1,5 M. ademas de la precipitacion directa de impurezas, las concentraciones elevadas de sulfato de amonio facilitaran una union eficaz a una resina de HIC. Dado que una capacidad de union dinamica alta siempre es una diana de desarrollo fundamental para una etapa de captura cromatografica, la solubilidad en presencia de concentraciones elevadas de sulfato de amonio es obligatoria.

Para evaluar la solubilidad de las variantes de FcR en presencia de sulfato de amonio, cada variante se incubo con concentraciones crecientes de sulfato de amonio a pH de 6 a 8. Despues de 1 hora a 25 °C, la concentracion de FcR en el sobrenadante se determino mediante espectroscopfa de UV/vis. Como se muestra en la Figura 2, la variante 3 esta mas resistente a la precipitacion con sulfato de amonio con una precipitacion semimaxima de (NH^SO4 de 2,05 M a 2,13 M. Por el contrario, la "variante 2" (SEQ ID NO: 8) y la "variante 4" (SEQ ID NO: 9) son menos solubles a concentraciones elevadas de sulfato de amonio, lo que muestra una precipitacion semimaxima a concentraciones de (NH4)2SO4 en el intervalo de 1,70 M - 1,76 M. sin embargo, la "variante 4" todavfa es soluble a una concentracion elevada de sulfato de amonio. La dependencia del pH de la solubilidad era insignificante para todas las variantes de FcR.

Observese que no es posible el realizar una identificacion sistematica de precipitacion y, por lo tanto, determinar la solubilidad de la "variante 1" en concentraciones elevadas de sulfato de amonio, dado que la "variante 1" no se repliega suficientemente y, por lo tanto, no se puede obtener protema soluble para la identificacion sistematica de precipitacion.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Suppremol GmbH

<120> Variantes de receptor Fc gamma IIB

<130> SUP14715PCT

<150> US13/663.527 <151>

<160>9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 177 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> Variante de receptor Fc gamma IIB <400> 1

5

10

imagen1

<210>2 <211> 176 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> Variante de receptor Fc gamma IIB <400> 2

Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gin Trp lie Asn Val 15 10 15

Leu Gin Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro 20 25 30

Glu Ser Asp Ser lie Gin Trp Phe His Asn Gly Asn Leu lie Pro Thr 35 40 45

His Thr Gin Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly 50 55 60

Glu Tyr Thr Cys Gin Thr Gly Gin Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His 65 70 75 80

Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gin Thr Pro His Leu Glu 85 90 95

Phe Gin Glu Gly Glu Thr lie Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp 100 105 110

Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gin Asn Gly Lys Ser Lys Lys 115 120 125

Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser lie Pro Gin Ala Asn His Ser 130 135 140

His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn lie Gly Tyr Thr Leu Tyr 145 150 155 160

Ser Ser Lys Pro Val Thr lie Thr Val Gin Ala Pro Ser Ser Ser Pro 165 170 175

<210>3 <211> 175 5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Variante de receptor Fc gamma IIB

<400> 3

Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gin Trp lie Asn Val Leu 15 10 15

Gin Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu 20 25 30

Ser Asp Ser lie Gin Trp Phe His Asn Gly Asn Leu lie Pro Thr His 35 40 45

Thr Gin Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu 50 55 60

Tyr Thr Cys Gin Thr Gly Gin Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu 65 70 75 80

Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gin Thr Pro His Leu Glu Phe 85 90 95

Gin Glu Gly Glu Thr lie Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys 100 105 110

Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gin Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe 115 120 125

Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser lie Pro Gin Ala Asn His Ser His 130 135 140

Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn lie Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser 145 150 155 160

Ser Lys Pro Val Thr lie Thr Val Gin Ala Pro Ser Ser Ser Pro 165 170 175

<210>4 <211> 174 5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Variante de receptor Fc gamma IIB

<400> 4

imagen2

<210>5 <211> 172 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> Variante de receptor Fc gamma IIB <400> 5

imagen3

5

lie Gin Trp Phe His Asn Gly Asn Leu lie Pro Thr His Thr Gin Pro 35 40 45

Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys 50 55 60

Gin Thr Gly Gin Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His lieu Thr Val lieu 65 70 75 80

Ser Glu Trp Leu Val Leu Gin Thr Pro His Leu Glu Phe Gin Glu Gly 85 90 95

Glu Thr lie Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val 100 105 110

Lys Val Thr Phe Phe Gin Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg Ser 115 120 125

Asp Pro Asn Phe Ser lie Pro Gin Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp 130 135 140

Tyr His Cys Thr Gly Asn lie Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys Pro 145 150 155 160

Val Thr lie Thr Val Gin Ala Pro Ser Ser Ser Pro 165 170

<210>6 <211> 534 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Variante de receptor Fc gamma IIB

10

<400> 6

atggcaccgc

cgaaagcagt tctgaaactg gaaccgcagt ggattaacgt tctgcaggaa 60

gatagcgtta

ccctgacctg tcgtggcacc catagcccgg aaagcgatag cattcagtgg 120

tttcacaacg

gcaatctgat tccgacccat acccagccga gctatcgttt taaagcgaac 130

aacaacgata

gcggcgaata tacctgtcag accggtcaga ccagcctgag cgatccggtt 240

catctgaccg

ttctgagcga atggctggtt ctgcagaccc cgcatctgga atttcaggaa 300

ggcgaaacca

ttgttctgcg ttgccacagc tggaaagata aaccgctggt taaagttacc 360

ttcttccaga

acggcaaaag caaaaaattc agccgtagcg atccgaattt tagcattccg 420

caggcgaatc

atagccatag cggcgafctat catfcgtaccg gcaacattgg ctataccctg 430

tatagcagca

aaccggtgac cattaccgtt caggcgccga gcagcagccc gtaa 534

<210>7 <211> 166 <212> PRT 5 <213> artificial

<220>

<223> Variante de receptor Fc gamma IIB 10 <400> 7

imagen4

<210> 8

15 <211> 185

<212> PRT <213> artificial

<220>

20 <223> Variante de receptor Fc gamma IIB

<400> 8

5

10

imagen5

<210>9 <211> 183 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> Variante de receptor Fc gamma IIB <400> 9

Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Una secuencia de acidos nucleicos que codifica una protema de acuerdo con la SEQ ID No: 1.
2. 2. Un vector que comprende la secuencia de acidos nucleicos de la reivindicacion 1.
3. 3. Una protema obtenida mediante la expresion de la secuencia de acidos nucleicos de la reivindicacion 1 o el vector de la reivindicacion 2 en una celula hospedadora.
4. 4. La protema de la reivindicacion 3, en la que la celula hospedadora es una celula hospedadora procariota.
5. 5. La protema de la reivindicacion 3 o 4, en la que la celula hospedadora es E. coli.
6. 6. Una protema que esta codificada por una secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6.
7. 7. Una composicion farmaceutica que comprende la protema de la reivindicacion 3 o 4.
8. 8. Una composicion de materia que comprende una protema de acuerdo con la SEQ ID No: 2 y/o 3.
9. 9. La composicion de materia de la reivindicacion 8 que comprende adicionalmente una protema de acuerdo con la SEQ ID No. 4 y/o 5.
10. 10. La composicion de materia de acuerdo con la reivindicacion 8 o 9, en la que la cantidad de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 2 supera a la de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 3.
11. 11. La composicion de materia de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que la cantidad

    de las protemas de acuerdo con la SEQ ID No: 2 y 3 supera a la de la protema de acuerdo con la SEQ ID No: 4 y/o
12. 5.
13. 12. Una celula hospedadora que comprende la secuencia de acidos nucleicos de la reivindicacion 1 o el vector de la reivindicacion 2.
14. 13. La celula hospedadora de la reivindicacion 12, que es una celula hospedadora procariota o eucariota.
15. 14. La celula hospedadora procariota de la reivindicacion 13, que es E. coli, preferentemente BL21 de E. coli.
16. 15. Un metodo de preparacion de una composicion farmaceutica que comprende cultivar la celula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 en condiciones que permitan la expresion de la protema codificada, y recuperar la composicion farmaceutica obtenida.

    imagen1

    {NH4)2so, [M]

    ■o

    ■o

    •a

    z

    x ■p

    00

    <n

    Solubilidad [mg/ml]

    Solubilidad [mg/ml]

    Solubilidad [mg/ml]

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