ES2801926T3 - Nuevas inmunoproteasas - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión citolítica adecuada para inducir apoptosis en una célula diana que comprende al menos un primer polipéptido que comprende una estructura de unión para permitir la unión de la proteína de fusión a una estructura diana específica en la superficie de una célula enferma, y al menos un segundo polipéptido que comprende un serina proteasa citolítica, en donde la serina proteasa es granzima M, y en donde la estructura de unión permite que la proteína de fusión citolítica se una a un receptor seleccionado del grupo que consiste en CD64, CD30 CD25 y receptor de EGF, en donde la proteína de fusión citolítica comprende un secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEC ID NO. 8 y SEQ ID NO. 10, o en donde la proteína de fusión citolítica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEC ID NO. 8 o SEQID NO. 10.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevas inmunoproteasas

Campo de la descripción

La tecnología proporcionada en la presente memoria se refiere a nuevas inmunoproteasas adecuadas para inducir apoptosis en células diana enfermas seleccionadas, que comprende la serina proteasa granzima M, y métodos para el uso de tales proteínas de fusión citolíticas para el tratamiento de diversas enfermedades, en particular para el tratamiento del cáncer.

Antecedentes

En el tratamiento de tumores, enfermedades autoinmunitarias, alergias y reacciones de rechazo de tejidos, es una desventaja que los medicamentos disponibles actualmente, tales como agentes quimioterapéuticos, corticosteroides y agentes inmunosupresores, tengan un potencial de efectos secundarios que a veces es considerable, debido a su relativa no especificidad Se ha intentado moderar esto mediante varios conceptos terapéuticos. Especialmente el uso de agentes inmunoterapéuticos es un enfoque, que dio como resultado un aumento de la especificidad de los medicamentos, especialmente en el tratamiento de tumores.

Las inmunotoxinas son proteínas utilizadas para tratar, p. ej. el cáncer que están compuestas por un anticuerpo o un fragmento del mismo unido a una toxina. La inmunotoxina se une a un antígeno de superficie en una célula cancerosa, entra en la célula y la destruye. Las inmunotoxinas más potentes están preparadas a partir de toxinas bacterianas y vegetales. Los refinamientos durante muchos años han producido inmunotoxinas recombinantes; estas proteínas terapéuticas se preparan mediante ingeniería de proteínas. Las inmunotoxinas individuales están diseñadas para tratar cánceres específicos. Hasta la fecha, se ha logrado el mayor éxito en el tratamiento de tumores hematológicos. Los obstáculos para el tratamiento satisfactorio de tumores sólidos incluyen una penetración deficiente en las masas tumorales y una respuesta inmunitaria al componente toxina de la inmunotoxina, que limita la cantidad de dosis que se pueden administrar. Se están aplicando estrategias para superar estas limitaciones. Las toxinas celulares basadas en proteínas que se han utilizado principalmente hasta la fecha y, por lo tanto, están mejor caracterizadas, son las toxinas bacterianas toxina diftérica (DT) (Beaumelle, B. et al. 1992; Chaudhary, V. et al. 1990; Kuzel, T. M. et al. 1993; LeMaistre, C. et al. 1998), exotoxina A de Pseudomonas (PE) (Fitz Gerald, D. J. et al. 1988; Pai, LH y Pastan, I. 1998), y la ricina A derivada de plantas (Engert, A. et al. 1997; Matthey, B. et al. 2000; O'Hare, M. et al. 1990; Schnell, R. et al. 2000; Thorpe, PE et al. 1988; Youle, RJ y Neville, D. M. J. 1980). El mecanismo de actividad citotóxica es el mismo en todas estas toxinas a pesar de sus diferentes antecedentes evolutivos. El dominio catalítico inhibe la biosíntesis de proteínas mediante una modificación del factor de elongación EF-2, que es importante para la traducción, o de los ribosomas directamente, de modo que EF-2 ya no se puede unir (Endo, Y. et al. 1987; Iglewski, B. H. y Kabat, D. 1975).

En la mayoría de las construcciones empleadas hasta la fecha, la aplicación sistémica de inmunotoxinas da como resultado efectos secundarios más o menos fuertes. Además del síndrome de "fuga vascular" (Baluna, R. y Vitetta, E. S. 1997; Schnell, R. et al. 1998; Vitetta, E. S. 2000), se produce trombocitopenia, hemólisis, insuficiencia renal y nauseas, dependiendo de la construcción empleada y la dosis aplicada. También se pudo observar daño hepático reversible y dependiente de la dosis (Battelli, M. G. et al. 1996; Grossbard, M. L. et al. 1993; Harkonen, S. et al.

1987). Además de los efectos secundarios documentados, la inmunogenicidad de las construcciones empleadas que se deben observar en el uso de productos inmunoconjugados o inmunotoxinas es el problema clave de la inmunoterapia (Khazaeli, M. B. et al. 1994). Esto se aplica, en particular, a la defensa humoral contra los dominios catalíticos empleados, tales como la ricina (HARA) (Grossbard, M. L. et al. 1998), P. E. (Kreitman, RJ et al. 2000) o DT (LeMaistre, E. F. et al. 1992). Teóricamente, todas las estructuras no humanas pueden provocar una respuesta inmunitaria. Por lo tanto, la administración repetida de inmunotoxinas y de productos inmunoconjugados está sujeta a limitaciones. Una consecuencia lógica de estos problemas es el desarrollo de inmunotoxinas humanas, ahora llamadas proteínas de fusión citolíticas humanas (Rybak, S. et al. 1992).

Por ejemplo, los gránulos de linfocitos citotóxicos contienen perforina, una proteína formadora de poros y una familia de serina proteasas, denominadas granzimas. Las granzimas son serina proteasas que se expresan principalmente en linfocitos T citotóxicos y células asesinas naturales.

Las granzimas están implicadas en la muerte celular por apoptosis (Coughlin et al, 2000) pero también tienen otras funciones, incluida la regulación de la proliferación de células B, la escisión de las proteínas de la matriz extracelular, la inducción de la secreción de citocinas, la activación de las citocinas, el control de las infecciones virales (Trapani, 2001). Por ejemplo, la serina proteasa granzima B (GrB) (Lobe et al., 1986; Schmid y Weissman, 1987; Trapani et al., 1988) participa integralmente en la muerte celular apoptótica inducida en las células diana tras su exposición al contenido de gránulos citoplasmáticos de tipo lisosoma (o gránulos citolíticos) que se encuentran en los linfocitos T citotóxicos (CTL) y las células asesinas naturales (NK) (Henkart, 1985; Young y Cohn, 1986; Smyth y Trapani, 1995). El documento WO 01/80880 A1 describe el uso de la serina proteasa granzima B en una proteína de fusión citolítica (inmunoproteasa). La serina proteinasa granzima B de linfocitos citotóxicos induce la apoptosis de células anormales al escindir proteínas intracelulares en sitios similares a los escindidos por las caspasas. Sin embargo, la granzima B tiene varios inhibidores naturales eficaces como Serpina B9 que previenen la apoptosis mediada por la granzima B en ciertos tipos de células.

El documento WO 2008/011157 describe el uso combinatorio de dos o más agentes terapéuticos, que comprenden como mínimo una protoxina y un activador de protoxina, en donde en la granzima B y la Granzima M se mencionan como activadores potenciales de la protoxina.

Por lo tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención era proporcionar proteínas de fusión citolíticas novedosas y mejoradas para el tratamiento de una enfermedad.

Compendio de la descripción

La presente invención solo se define por las reivindicaciones. Los términos "realizaciones" y "aspectos", etc., que se enumeran a continuación son solo para fines ilustrativos.

En un primer aspecto, las realizaciones de la descripción proporcionan proteínas de fusión citolíticas adecuadas para inducir apotosis en una célula diana que comprende al menos un primer polipéptido que comprende una estructura de unión para permitir la unión de la proteína de fusión a una estructura diana específica en la superficie de una célula enferma, y al menos un segundo polipéptido que comprende una serina proteasa citolítica, en la que la serina proteasa es granzima M, formas modificadas, variantes, fragmentos funcionales o mutantes de la misma. En otro aspecto, la presente descripción se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión citolítica según la descripción, también combinada con una segunda proteína de fusión citolítica, también adecuada para inducir apotosis en una célula diana que comprende al menos un primer polipéptido que comprende una estructura de unión para permitir la unión de la proteína de fusión a una estructura diana específica sobre la superficie de una célula enferma, y al menos un segundo polipéptido que comprende una serina proteasa citolítica, en la que la serina proteasa es granzima B, formas modificadas, variantes, fragmentos funcionales o mutantes de la misma.

Además, la descripción se refiere a medicamentos que comprenden una proteína de fusión citolítica o una composición de la presente descripción combinada con un portador o diluyente farmacológicamente aceptables y su uso en el tratamiento de una enfermedad maligna, una alergia, reacción autoinmunitaria, reacción de rechazo de tejido o reacción de inflamación crónica, en particular cáncer.

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a métodos para preparar la proteína de fusión citolítica que comprende cultivar células anfitrionas y aislar la proteína de fusión citolítica del cultivo.

Adicionalmente, las realizaciones de esta descripción se refieren generalmente al uso de la proteína de fusión citolítica y las composiciones según la presente descripción para la inducción de la muerte celular, en particular la inducción de la muerte celular por apoptosis. Ventajosamente, la proteína de fusión citolítica y de esta descripción se usan para tratar el cáncer.

Antes de que la descripción se exponga en detalle, se debe entender que esta descripción no se limita a las partes componentes particulares de los dispositivos descritos o las etapas del procedimiento de los métodos descritos, ya que dichos dispositivos y métodos pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no se pretende que sea limitante. Se debe observar que, como se emplea en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", “una”, “el” y "la" incluyen los referentes singulares y/o plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, se debe entender que, en caso de que se proporcionen intervalos de parámetros que están delimitados por valores numéricos, se considera que los intervalos incluyen estos valores de limitación.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra la estructura esquemática del plásmido pMS que contiene la secuencia para las realizaciones de las proteínas de fusión citolíticas según la presente descripción.

La FIG. 2 muestra una estructura esquemática de la construcción de ADN que codifica las realizaciones de proteínas de fusión citolíticas según la presente descripción.

La FIG. 3 muestra la Gm-H22 purificada (scFv) en un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie y Transferencia Western (A) y la actividad enzimática de la granzima M hacia Serpina B9 en una Transferencia Western (B).

La FIG. 4 muestra la Gm-Ki4 purificada (scFv) en un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie y Transferencia Western (A) y la actividad enzimática de la granzima M hacia Serpina B9 en una Transferencia Western (B).

La FIG. 5 muestra la Gm-425 purificada (scFv) en un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie y Transferencia Western (A) y la actividad enzimática de la granzima M hacia Serpina B9 en una Transferencia Western (B).

La FIG. 6 muestra la Gm-RFT5 purificada (scFv) en un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie y Transferencia Western.

La FIG. 7 muestra

análisis de unión de Gm-H22 (scFv) a HL60 CD64+ y el control negativo L428. La FIG. 8 muestra

análisis de unión de Gm-Ki4 (scFv) a líneas celulares CD30+ y el control negativo La FIG. 9 muestra el análisis de unión de Gm-425 (scFv) a A431 EGFR+ y el control negativo L540. La FIG. 10 muestra los resultados del ensayo de viabilidad de Gm-H22 (scFv) en la línea celular HL60 y controles negativos.

La FIG. 11 muestra los resultados de los ensayos de apoptosis de Gm-H22 (scFv) en la línea celular HL60 y el control negativo.

La FIG. 12 muestra los resultados del ensayo de viabilidad en Gm-H22 (scFv) en células CD64+ primarias.

La FIG. 13 muestra la expresión de PI9 dentro de las células CMML primarias.

La FIG. 14 muestra la expresión de PI9 dentro de diferentes líneas celulares diana CD30+ y los resultados de ensayos de viabilidad de Gm-Ki4 (scFv) en células L540cy.

La FIG. 15 muestra los resultados de los ensayos de apoptosis de Gm-Ki4 (scFv) en células PI9+ y PI9- .

La FIG. 16 muestra los resultados de los ensayos de viabilidad en Células K562 PI9+.

La FIG. 17 muestra los resultados de los ensayos de viabilidad y apoptosis de Gm-425 (scFv) en la línea celular diana A431 y el control negativo L540.

La FIG. 18 muestra en A) la secuencia de ácido nucleico de la granzima M humana de tipo salvaje (SEQ ID NO. 1) y en B) la secuencia de aminoácidos de la granzima M humana de tipo salvaje (SEQ ID NO. 2).

La FIG. 19 muestra en A) la secuencia de ácido nucleico de la variante de proteína de fusión citolítica Gm-H22 (scFv) (SEQ ID NO. 3) y en B) la secuencia de aminoácidos respectiva (S^eQ ID NO. 4).

La FIG. 20 muestra en A) la secuencia de ácido nucleico de la variante de proteína de fusión citolítica Gm-Ki4 (scFv) (SEQ ID NO. 5) y en B) la secuencia de aminoácidos respectiva (SEQ ID NO. 6).

La FIG. 21 muestra en A) la secuencia de ácido nucleico de la variante de proteína de fusión citolítica Gm-425 (scFv) (SEQ ID NO. 7) y en B) la secuencia de aminoácidos respectiva (SEQ ID NO. 8).

La FIG. 22 muestra en A) la secuencia de ácido nucleico de la variante de proteína de fusión citolítica Gm-RFT5 (scFv) (SEQ ID NO. 9) y en B) la secuencia de aminoácidos respectiva (SEQ ID NO. 10).

Descripción detallada de esta descripción

En la presente memoria se describen proteínas de fusión citolítica y composiciones útiles para el tratamiento de enfermedades malignas, alergias, reacciones autoinmunitarias, reacciones de rechazo de tejidos y/o reacciones de inflamación crónica induciendo apotosis en una célula diana enferma específica.

La presente descripción se refiere al uso de una nueva inmunoproteasa con un radical citotóxico/citolítico denominada granzima M para inducir apoptosis en células enfermas dirigidas. Los autores de la presente invención descubrieron que, además del potencial conocido de las inmunoproteasas basadas en granzima B, también la granzima M fusionada a diferentes aglutinantes específicos es un potente agente citotóxico antitumoral.

De acuerdo con la presente descripción, en algunas realizaciones ventajosas, los autores de la presente invención clonaron la granzima M aislada en fragmentos de cadena única específicos para la unión a marcadores tumorales que incluyen anti-CD64, anti-CD30, anti-EGFR y anti-CD25 y expresaron estos agentes inmunoterapéuticos en células HEK293T. Después de la purificación por afinidad, la identidad y la pureza de las proteínas obtenidas se confirmaron mediante SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie y transferencia Western. La unión específica se verificó mediante citometría de flujo y la citotoxicidad antitumoral específica se demostró finalmente en ensayos in vitro de apoptosis y viabilidad.

Sorprendentemente, los autores de la presente invención pudieron demostrar que la granzima M es una nueva enzima pro-apoptótica humana prometedora adecuada para la terapia contra el cáncer. Además, los autores de la presente invención descubrieron que las nuevas inmunoproteasas se pueden utilizar también en el contexto de otras enfermedades, tales como la inflamación. En particular, la combinación de granzima B y proteínas de fusión citolíticas basadas en granzima M conduce a un enfoque terapéutico mejorado. Como se muestra en la Fig. 16, la co-incubación de una proteína de fusión citolítica basada en una variante de granzima B (Gb-Ki4 R201K) y una proteína de fusión citolítica basada en granzima M w/t (Gm-Ki4) tiene un efecto mejorado sobre muerte celular inducida. En un aspecto, los autores de la presente invención utilizaron la proteína humana Granzima M para atacar las células cancerosas, incluidas las células leucémicas primarias, para evitar la inmunogenicidad asociada con toxinas bacterianas o vegetales en seres humanos.

Como se mencionó anteriormente, el componente citotóxico/citolítico utilizado en las proteínas de fusión citolíticas según la presente descripción es la granzima M. La granzima M (Gm) es una serina proteasa neutra, también conocida como Met-asa, Met-asa 1 linfocítica, Met-asa de células asesinas naturales.

La granzima M escinde específicamente después de leucina en la posición P15 y se expresa principalmente en células NK, células NKT, células yd-T y células T CD8+ efectoras6,7. Se ha encontrado que los sustratos prominentes de granzima M presentes dentro de las células tumorales incluyen ICAD, PARP, HSP75, ezrina, survivina, atubulina8'11.

Sorprendentemente, como se muestra en los resultados de la presente descripción, la granzima M fusionada a diferentes estructuras específicas funciona como un agente citotóxico altamente potente, en particular como un agente citotóxico antitumoral.

Algunas realizaciones ventajosas se refieren a proteínas de fusión citolíticas aisladas adecuadas para inducir apotosis en una célula diana que comprenden al menos un primer polipéptido aislado que comprende una estructura de unión para permitir la unión de la proteína de fusión a una estructura diana específica en la superficie de una célula enferma, y en al menos un segundo polipéptido aislado que comprende una serina proteasa citolítica, en la que la serina proteasa es granzima M, formas modificadas, variantes, fragmentos funcionales o mutantes de la misma.

El término "forma modificada" o "variante" significa que la enzima ha sido modificada a partir de su forma original (parental/tipo salvaje, wt) pero conserva las mismas características funcionales enzimáticas que la de la granzima M de tipo salvaje humana.

El término "proteínas de fusión" comprende todas las proteínas derivadas de la granzima M de tipo salvaje humana o cualquier variante de la misma mediante la fusión covalente de secuencias de aminoácidos adicionales en el extremo C- y/o N-terminal. La fuente y la composición de la secuencia de aminoácidos adicional es natural de cualquier organismo vivo o virus o no natural. En particular, la proteína de fusión puede ser un polipéptido "recombinante", que se define por su método de producción o su estructura. En referencia a su método de producción, p. ej., un producto preparado mediante un procedimiento, el procedimiento implicado utiliza técnicas de ácido nucleico recombinante. En referencia a la estructura, los polinucleótidos o polipéptidos recombinantes contienen secuencias de diferentes fuentes. En particular, abarca polipéptidos preparados mediante la generación de una secuencia que comprende dos o más fragmentos, que no están contiguos de forma natural ni están conectados operablemente entre sí. Así, por ejemplo, están abarcados los productos elaborados mediante la transformación de células con cualquier vector de origen no natural. El término también se puede interpretar como proteína de fusión que ha sido generada por la síntesis de una molécula de ADN que codifica la proteína de fusión y cuya molécula de ADN expresa una proteína de fusión, o una secuencia de aminoácidos que especifica la proteína de fusión, en donde la secuencia de ADN o aminoácidos se ha obtenido utilizando ADN sintético o tecnología de secuenciación de aminoácidos que está disponible y es bien conocida en la técnica. En una realización, la proteína de fusión citolítica según la presente descripción es una proteína de fusión recombinante y/o sintética.

El término "fragmento funcional" o "fragmento eficaz" significan un fragmento o porción de la granzima M de tipo salvaje humano o variantes de los mismos que conservan la misma función o efecto enzimático.

El término "polinucleótido" corresponde a cualquier material genético de cualquier longitud y cualquier secuencia, que comprende moléculas de ^a Dⁿ y ARN de hebra sencilla y de doble hebra, incluidos elementos reguladores, genes estructurales, grupos de genes, plásmidos, genomas completos y fragmentos de los mismos.

El término "variante de granzima M" significa cualquier molécula de granzima M obtenida por mutagénesis dirigida al sitio o aleatoria, inserción, deleción, recombinación y/o cualquier otro método de ingeniería de proteínas, que conduce a una granzima M que difiere en su secuencia de aminoácidos de la granzima M humana de tipo salvaje. Los términos "granzima M de tipo salvaje", "enzima de tipo salvaje" o "tipo salvaje" según la descripción describen una enzima serina proteasa con una secuencia de aminoácidos que se encuentra en la naturaleza o un fragmento de la misma.

El término "variante de granzima B" significa cualquier molécula de granzima B obtenida por mutagénesis dirigida al sitio o aleatoria, inserción, deleción, recombinación y/o cualquier otro método de ingeniería de proteínas, que conduce a la granzima M que difiere en su secuencia de aminoácidos de la granzima B humana de tipo salvaje. Los términos "granzima B de tipo salvaje", "enzima de tipo salvaje" o "tipo salvaje" según la descripción describen una enzima serina proteasa con una secuencia de aminoácidos encontrada en la naturaleza o un fragmento de la misma. El término "aislado" describe cualquier molécula separada a partir de su fuente natural.

El término "mutación" se refiere a la sustitución o reemplazo de tripletes de nucleótidos simples o múltiples, inserciones o deleciones de uno o más codones, recombinación homóloga o heteróloga entre diferentes genes, fusión de secuencias codificantes adicionales en cualquier extremo de la secuencia codificante, o inserción de secuencias codificantes adicionales o cualquier combinación de estos métodos, que dan como resultado una secuencia de ácido polinucleico que codifica la proteína deseada. Por lo tanto, el término "mutaciones" también se refiere a todos los cambios en la secuencia de polipéptidos codificados por la secuencia de ácido polinucleico modificada por uno o más de los cambios descritos anteriormente.

Se pretende que el término "molécula de ácido nucleico" o "ácido nucleico" indique cualquier molécula de ácido nucleico monocatenaria o bicatenaria que tenga su origen en ADNc, ADN genómico, ADN o ARN sintético, ácido peptidonucleico (PNA) u LNA.

El término "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda hibridará con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo concentración iónica definida, pH y concentración de ácido nucleico) a la que 50% de las sondas complementarias a la secuencia diana hibrida con la secuencia diana en equilibrio. (Puesto que las secuencias diana generalmente están presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal es inferior a aproximadamente 1,0 M de iones Na, típicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de iones Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas más largas. También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida y similares.

El término "variante de la molécula de ácido nucleico" se refiere en la presente memoria a una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente similar en estructura y actividad biológica a una molécula de ácido nucleico según una de las secuencias reivindicadas.

El término "homólogo de la molécula de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico cuya secuencia tiene uno o más nucleótidos añadidos, suprimidos, sustituidos o modificados químicamente en comparación con una molécula de ácido nucleico según una de las secuencias reivindicadas, con tal que el homólogo siempre conserve sustancialmente las mismas propiedades de unión que el último.

El término "derivado" como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene características de unión similares a una secuencia de ácido nucleico diana como una molécula de ácido nucleico según una de las secuencias reivindicadas.

Una "célula diana" como se utiliza en la presente descripción puede ser cualquier célula que tenga un receptor específico para un antígeno o anticuerpo u hormona o fármaco, o sea el foco de contacto de un virus o fagocito o fibra nerviosa, etc. En particular, una "célula diana" según la presente descripción es una célula enferma en un mamífero, en particular una célula enferma humana.

Como se utiliza en la presente memoria, el término "célula enferma" se refiere a cualquier célula que no funciona en su estado natural o en su forma bioquímica normal. Estas células deberían ser capaces de causar enfermedades. Por ejemplo, la palabra incluirá células que están sujetas a crecimiento incontrolado, mutación celular, metástasis o infección. El término también incluirá células que han sido infectadas por un virus o partícula viral, bacteria, exotoxinas o endotoxinas bacterianas, priones u otro tipo de materiales vivos o no vivos similares foráneos. El término puede referirse particularmente a células cancerosas o células infectadas por poliovirus, rinovirus, piconavirus, virus de la gripe o un retrovirus tal como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

El término "antígeno asociado a tumor" incluye antígenos que están altamente correlacionados con ciertas células tumorales. Por lo general, no se encuentran, o se encuentran en menor medida, en células normales.

El término "inmunotoxina" se refiere a un complejo que comprende una porción dirigida conectada a una toxina bacteriana/vegetal.

El término "proteína de fusión citolítica" o "proteína de fusión citolítica humana" se refiere a una proteína de fusión que comprende una enzima humana adecuada para la disolución o destrucción de una célula diana.

El término "inmunoproteasa" se refiere a una proteína de fusión citolítica que comprende una proteasa de origen humano.

El término "plásmido", "sistema vector" o "vector de expresión" significa una construcción susceptible de expresión in vivo o in vitro. En el contexto de la presente descripción, estas construcciones se pueden utilizar para introducir genes que codifican enzimas en las células anfitrionas.

El término "célula anfitriona" en relación con la presente descripción incluye cualquier célula que comprende la molécula de ácido nucleico o un vector de expresión como se describió anteriormente y que se utiliza en la producción recombinante de una enzima que tiene las propiedades específicas como se define en la presente memoria o en los métodos de la presente descripción.

También se entiende que la presente descripción comprende todas las moléculas que se obtienen a partir de los polinucleótidos de la descripción y todas sus variantes descritas en esta solicitud, por procesamiento postraduccional en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada genéticamente. Estas modificaciones postraduccionales comprenden, pero no se limitan a, escisión proteolítica de secuencias N-terminales tales como secuencias líder y/o pro-secuencias, eliminación proteolítica de extensiones C-terminales, glicosilación N y/u O, lipidación, acilación, desamidación, formación de piroglutamato, fosforilación y/u otros, o cualquier combinación de las mismas, tal como ocurren durante la producción/expresión por el anfitrión nativo o cualquier anfitrión de expresión adecuado. Estas modificaciones postraduccionales pueden o no influir en las propiedades físicas o enzimáticas de las enzimas como se explora en la presente memoria.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente descripción pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO: 1, una de sus variantes, formas modificadas, homólogos o derivados. En algunas realizaciones ventajosas, las moléculas de ácido nucleico de la presente descripción pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 9.

En particular, la descripción proporciona un sistema de plásmido o vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión citolítica como se describe en la presente memoria o un homólogo o derivado de la misma.

Las realizaciones de la presente descripción se refieren a proteínas de fusión citolíticas que comprenden una serina proteasa que tiene al menos 90 por ciento de identidad con SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones ventajosas, la proteína de fusión citolítica comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEC ID NO. 8 y SEQ ID NO. 10.

Otras realizaciones de la presente descripción se refieren a proteínas de fusión citolíticas que comprenden una serina proteasa que tiene al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones ventajosas, la proteína de fusión citolítica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99 por ciento de identidad con SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEC ID NO. 8 y SEQ ID NO. 10.

No hay ningún requisito de que las proteínas de fusión citolítica de la presente descripción comprendan una secuencia de polipéptidos nativos completa de la serina proteasa granzima M. Más bien, el polipéptido también puede tener una secuencia que se modifica a partir de una secuencia de polipéptidos nativos utilizando los mecanismos conocidos por los expertos en la técnica y/o enseñados en esta memoria descriptiva. En algunas realizaciones particulares, el polipéptido es una variante enzimática que comprende una secuencia que tiene función serina proteasa. Los expertos con un conocimiento práctico normal de la técnica entenderán que es posible reducir, aumentar o disminuir el número de aminoácidos en las variantes de polipéptidos según la presente descripción, siempre que se mantenga el sitio activo y la actividad del polipéptido que tiene actividad serina proteasa. Por ejemplo, existe una amplia variedad de variantes que se pueden preparar para satisfacer las necesidades según la presente descripción y las enseñanzas de este párrafo y el resto de la memoria descriptiva se puede utilizar para preparar variantes basadas en una gran cantidad de polipéptidos que tienen actividad granzima M.

Por lo tanto, la descripción se refiere a la forma modificada del polipéptido que comprende granzima M que tiene al menos un porcentaje mínimo de identidad de secuencia y/o porcentaje de homología con las serina proteasas de SEQ ID NO. 2, en donde el porcentaje mínimo de identidad y/u homología es al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 93%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98 % o al menos 99%.

Los polipéptidos que tienen actividad de serina proteasa según la presente descripción pueden comprender, además del centro activo de serina proteasa, un segmento líder. Típicamente, estos segmentos líder serán segmentos de aminoácidos cargados positivamente que facilitan la translocación de proteínas al citosol de la célula. Los ejemplos de tales secuencias incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder IG-kappa. Por supuesto, es posible que un experto en la técnica diseñe y pruebe un número casi ilimitado de secuencias líder que se pueden utilizar en la invención. En la mayoría de los casos, estas secuencias simplemente requieren un segmento relativamente corto de aminoácidos principalmente cargados positivamente. Para una revisión general de tales secuencias líder, se puede revisar Ford et al. 2001

Como se mencionó anteriormente, las proteínas de fusión citolíticas comprenden al menos un primer polipéptido con una estructura de unión para unir la proteína de fusión a una estructura diana específica en la superficie de la célula diana.

La estructura diana específica puede ser una estructura específica de células cancerosas o una estructura específica de enfermedad de sustancias patógenas o materia patógena.

En algunas realizaciones, la estructura de unión comprende radicales que son radicales de afinidad de sustancias de afinidad o sustancias de afinidad en su totalidad seleccionadas del grupo que consiste en anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ligandos de receptor, sustratos enzimáticos, lectinas, citocinas, linfocinas, interleucinas, angiogénicas o factores de virulencia, alérgenos, alérgenos peptídicos, alérgenos recombinantes, anticuerpos alergénicos-idiotípicos, estructuras autoinmunitarias, estructuras inductoras de rechazo de tejidos, regiones constantes de inmunoglobulina y sus derivados, mutantes o combinaciones de los mismos.

Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las estructuras de unión como radicales de direccionamiento celular para su uso en la presente descripción son anticuerpos. En general, el término anticuerpo incluye, pero no se limita a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos humanizados, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, así como fragmentos de anticuerpos, tales como Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio único y cualquier mezcla de los mismos, en algunos casos se prefiere que el radical dirigido a la célula sea un anticuerpo de cadena sencilla (scFv). En una realización relacionada, el dominio de direccionamiento celular puede ser un polipéptido de avímero. Por lo tanto, en ciertos casos, las construcciones de direccionamiento celular de la invención son proteínas de fusión que comprenden un polipéptido según la presente descripción y un scFv o un avímero. En algunas realizaciones muy específicas, la construcción de direccionamiento celular es una proteína de fusión que comprende granzima M fusionada a un anticuerpo de cadena sencilla.

En ciertas otras realizaciones, la estructura de unión puede ser un factor de crecimiento. Por ejemplo, el factor de crecimiento transformante, el factor de crecimiento epidérmico, el factor de crecimiento similar a la insulina, el factor de crecimiento de fibroblastos, el estimulador de linfocitos B (BLyS), la heregulina, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o el factor inducible por hipoxia pueden ser utilizados como un radical de direccionamiento celular según la descripción. Estos factores de crecimiento permiten dirigir las construcciones a las células que expresan los receptores de factores de crecimiento afines.

En otros aspectos de la invención, la estructura de unión puede ser una hormona. Algunos ejemplos de hormonas para su uso en la descripción incluyen, pero no se limitan a, gonadotropina coriónica humana, hormona liberadora de gonadotropina, un andrógeno, un estrógeno, hormona estimulante de la tiroides, hormona estimulante del folículo, hormona luteinizante, prolactina, hormona del crecimiento, hormona adrenocorticotrópica, hormona antidiurética, oxitocina, hormona liberadora de tirotropina, hormona liberadora de hormona de crecimiento, hormona liberadora de corticotropina, somatostatina, dopamina, melatonina, tiroxina, calcitonina, hormona paratiroidea, glucocorticoides, mineralocorticoides, adrenalina, noradrenalina, progesterona, insulina, insulina, glucagón, amilina, eritropoyetina, calcitriol, calciferol, péptido atrio-natriurético, gastrina, secretina, colecistoquinina, neuropéptido Y, grelina, PYY3-36, factor de crecimiento similar a la insulina-1, leptina, trombopoyetina y angiotensinógeno.

En realizaciones adicionales de la presente descripción, las estructuras de unión también pueden ser citocinas. Por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 o IL-36, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de macrófagos, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, factor inhibidor de leucemia, eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, oncostatina M, factor inhibidor de leucemia, IFN-GAMMA, IFN-ALFA, IFN-BETA, LT-BETA, Ligando CD40, ligando Fas, ligando CD27, ligando CD30, 4-1BBL, TGF-BETA, IL-l alfa, IL-I BETA, IL-1RA (antagonista del receptor de interleucina 1), MIF e IGIF (factor inductor de IFN-gamma) se pueden utilizar todos como radicales de direccionamiento según la descripción.

Como se mencionó anteriormente, en ciertos aspectos de la descripción, la estructura de unión puede ser un radical dirigido a células, en particular un radical dirigido a células cancerosas. Es bien sabido que ciertos tipos de células cancerosas expresan aberrantemente moléculas de superficie que son únicas en comparación con el tejido circundante. Por lo tanto, los radicales que se dirigen a las células que se unen a estas moléculas de superficie permiten el suministro dirigido de los polipéptidos de la presente descripción específicamente a las células cancerosas. Por ejemplo, un radical dirigido a la célula se puede unir y ser internalizado por una célula de pulmón, mama, cerebro, próstata, bazo, páncreas, cuello uterino, ovario, cabeza y cuello, esofágico, hígado, piel, riñón, leucemia, hueso, testículo, colon o células de cáncer de vejiga. El experto en la técnica comprenderá que la eficacia de los polipéptidos dirigidos a células cancerosas de la presente descripción puede, en algunos casos, depender de la expresión o nivel de expresión de un marcador de cáncer particular en la célula cancerosa. Por lo tanto, en ciertos aspectos se proporciona un método para tratar un cáncer con polipéptidos específicos de la presente descripción que comprende determinar si (o en qué medida) la célula cancerosa expresa un marcador de superficie celular particular y administrar terapia dirigida por polipéptidos (u otra terapia contra el cáncer) a las células cancerosas dependiendo del nivel de expresión de un gen marcador o polipéptido.

En realizaciones ventajosas, la estructura de unión pertenece al grupo de polipéptidos/proteínas de unión a antígeno dirigidos a marcadores/estructuras específicas de tipo celular, en particular la estructura de unión está dirigida contra estructuras específicas de células cancerosas, estructuras específicas de enfermedad de sustancias patógenas o materia patógena o la estructura de unión se une a marcadores solubles de enfermedad/entorno/alimentos y seguridad alimentaria o biodefensa.

En particular, en realizaciones ventajosas, la estructura de unión comprende radicales que son radicales de afinidad de sustancias de afinidad o sustancias de afinidad en su totalidad seleccionadas del grupo que consiste en anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ligandos de receptores, sustratos enzimáticos, lectinas, citocinas, linfocinas, interleucinas, factores angiogénicos o de virulencia, alérgenos, alérgenos peptídicos, alérgenos recombinantes, anticuerpos alergénicos-idiotípicos, estructuras que provocan respuestas autoinmunitarias, estructuras inductoras de rechazo de tejidos, regiones constantes de inmunoglobulina y sus derivados, mutantes o combinaciones de los mismos. En realizaciones ventajosas adicionales, el fragmento de anticuerpo es un Fab, un scFv; un dominio único, o un fragmento del mismo, un bis scFv, Fab2, Fab3, minicuerpo, maxicuerpo, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo o diacuerpo en tándem “tandab”, en particular un fragmento variable de cadena sencilla (scFv).

En realizaciones ventajosas de la presente descripción, el scFv es específico para el receptor CD64, CD25, CD30 y/o EGF.

CD64 (Cúmulo de diferenciación 64) es un tipo de glicoproteína integrante de la membrana conocida como receptor de Fc que se une a los anticuerpos de tipo IgG monoméricos con alta afinidad (Hulett M et al., 1998, Mol Immunol 35). También se conoce como receptor 1 de Fc-gamma (F^cyRI). Después de unirse a IgG, CD64 interactúa con una cadena accesoria conocida como la cadena y común (cadena y), que posee un motivo ITAM que es necesario para desencadenar la activación celular. Estructuralmente, CD64 está compuesto por un péptido señal que permite su transporte a la superficie de una célula, tres dominios inmunoglobulina extracelulares del tipo C2 que utiliza para unir anticuerpos, un dominio transmembrana hidrófobo y una cola citoplasmática corta. Existen tres genes distintos (pero muy similares) en seres humanos para CD64 llamados F^cyRIA (CD64A), F^cyRIB (CD64B) y F^cyRIC (CD64C) que se encuentran en el cromosoma 1. Estos tres genes producen seis transcritos de ARNm diferentes; dos de CD64A, tres de CD64B y uno de CD64C; por empalme alternativo de los genes. La glicoproteína CD64 de 72 kDa (FcyRI) es el mediador de la endocitosis y la fagocitosis, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la producción de citocinas y superóxido. Está implicada en enfermedades inflamatorias y también se expresa en exceso en la superficie de las células leucémicas.

CD30, también conocido como TNFRSF8, es una proteína de la membrana celular de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral y el marcador tumoral. Este receptor se expresa mediante células T y B activadas, pero no en reposo. TRAF2 y TRAF5 pueden interactuar con este receptor y mediar la transducción de señales que conduce a la activación de NF-kappaB. Es un regulador positivo de la apoptosis, y también se ha demostrado que limita el potencial proliferativo de células T efectoras CD8+ autorreactivas y protegen el organismo contra la autoinmunidad. Se ha informado sobre dos variantes de transcripción que han experimentado alternativamente corte y empalme de este gen que codifica distintas isoformas. CD30 está asociado con el linfoma anaplásico de células grandes. Resultó ser una diana prometedora para el tratamiento del linfoma de Hodgkin en estudios previos (Schwab, Stein et al.

1982; Gruss, Pinto et al. 1996).

CD25 es la cadena alfa del receptor de IL-2. Es una proteína transmembrana de tipo I presente en células T activadas, células B activadas, algunos timocitos, precursores mieloides y oligodendrocitos que se asocia con CD122 para formar un heterodímero que puede actuar como un receptor de alta afinidad para IL-2. CD25 se expresa en la mayoría de las neoplasias de células B, algunas leucemias agudas no linfocíticas, neuroblastomas y linfocitos infiltrantes de tumores. Su forma soluble, llamada sIL-2R, puede estar elevada en estas enfermedades y ocasionalmente se utiliza para rastrear la progresión de la enfermedad. CD25 se induce eficazmente tras la activación de las células T, no es detectable en células T en reposo, células B o monocitos y se expresa en exceso en células Hodgkin y Reed-Sternberg. También está presente en leucemia de células T adultas, leucemia/linfomas de células T periféricas, linfoma cutáneo de células T, linfomas no Hodgkin de células B, leucemia de células pilosas, leucemia linfocítica crónica y leucemia mieloblástica aguda18.

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (Receptor de EGF, o EGFR) es una glucoproteína de la superficie celular compuesta de una sola cadena de polipéptidos que se une al péptido factor de crecimiento epidérmico (EGF). El receptor de EGF consta de un dominio de unión a ligandos extracelulares, una única región transmembrana y un dominio tirosina quinasa intrínseco citoplásmico. Tras la unión del ligando, el receptor de EGF se autofosforila, activando el dominio tirosina quinasa del receptor de EGF. Los péptidos EGFR y similares a EGF a menudo se expresan en exceso en carcinomas humanos. Por ejemplo, las células A431 son una línea celular modelo (carcinoma epidermoide) utilizada en la investigación biomédica. Más específicamente, se utilizan en estudios del ciclo celular y las vías de señalización celular asociadas al cáncer, ya que expresan niveles anormalmente altos de EGFR.

En algunas realizaciones, las proteínas de fusión citolítica de la presente descripción comprenden uno o más componentes complementarios además de la estructura de unión y la serina proteasa. Por su experiencia anterior, el experto en la técnica sabe que las características y propiedades adicionales pueden tener una importancia crítica para la preparación eficaz y/o la efectividad de las proteínas de fusión citolíticas de la presente descripción. Debido a la distinción de las enfermedades que se deben tratar con la fusión citolítica según la descripción, puede ser necesaria una adaptación de las proteínas de fusión citolítica a las circunstancias concretas respectivas.

Como componente complementario, las proteínas de fusión citolítica pueden comprender uno o más polipéptidos adicionales seleccionados del grupo que consiste en una secuencia líder capaz de controlar la biosíntesis de proteínas, una etiqueta de proteína, una secuencia anfifática del dominio de translocación susceptible de translocar la proteína de fusión en la diana célula y una secuencia anfifática de pro-serina proteasa sintética susceptible de activación intracelular de la serina proteasa.

En realizaciones ventajosas, el polipéptido adicional es una secuencia líder para la expresión secretora y/o el polipéptido componente es un sitio de escisión de enteroquinasa que permite la activación de la proteasa granzima M y/o el polipéptido es una etiqueta HIS o etiqueta de afinidad, que permite la purificación de proteínas de fusión citolíticas.

Como se utiliza en la presente memoria, las "etiquetas de proteína" son secuencias peptídicas injertadas genéticamente en una proteína recombinante. En general, estas etiquetas son eliminables por agentes químicos o por medios enzimáticos, tales como la proteólisis o corte y empalme.

Las etiquetas de afinidad se adosan a las proteínas para que puedan ser purificadas de su fuente biológica bruta utilizando una técnica de afinidad. Estas incluyen la proteína de unión a quitina (CBP), la proteína de unión a maltosa (MBP) y la glutatión-S-transferasa (GST). En una realización ventajosa, se utiliza una etiqueta de poli(His) en las proteínas de fusión recombinantes según la presente descripción.

También se pueden utilizar etiquetas de solubilización, especialmente si las proteínas de fusión recombinantes se expresan en especies deficientes en chaperonas tales como E. coli, para ayudar a plegar adecuadamente las proteínas y evitar que precipiten. Estas incluyen tiorredoxina (TRX) y poli(NANP). Algunas etiquetas de afinidad tienen un doble papel como agente de solubilización, tales como MBP y GST.

Las etiquetas de cromatografía se pueden utilizar para alterar las propiedades cromatográficas de las proteínas de fusión para proporcionar una resolución diferente a través de una técnica de separación concreta. A menudo, estas consisten en aminoácidos polianiónicos, tales como la etiqueta FLAG.

Las etiquetas epitópicas son secuencias peptídicas cortas que se pueden elegir debido a que los anticuerpos de alta afinidad se pueden producir de manera fiable en muchas especies diferentes. Estos generalmente se obtienen a partir de genes virales, lo que explica su alta inmunorreactividad. Las etiquetas epítópicas incluyen la etiqueta V5, la etiqueta c-myc y la etiqueta HA. Estas etiquetas son particularmente útiles para los experimentos de transferencia Western, inmunofluorescencia e inmunoprecipitación, aunque también encuentran uso en la purificación de anticuerpos.

Las etiquetas de fluorescencia se pueden utilizar para proporcionar una lectura visual de una proteína. La GFP y sus variantes son las etiquetas de fluorescencia más utilizadas. Las aplicaciones más avanzadas de la GFP incluyen su uso como informador del plegamiento (fluorescente si hay plegamiento, incolora si no).

En algunas realizaciones, la proteína de fusión citolítica según la presente descripción comprende una serina proteasa citolítica adicional, en donde la serina proteasa es preferiblemente granzima B, un mutante o un homólogo de la misma.

En una realización adicional de la descripción, se proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica un polipéptido como se describe anteriormente. Por lo tanto, una secuencia de ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos o proteínas de fusión de polipéptidos descritos en la presente memoria también se incluye como parte de la presente invención. El experto en la técnica entenderá que se puede utilizar una variedad de secuencias de ácido nucleico para codificar polipéptidos idénticos en vista de la degeneración del código genético. En ciertos casos, por ejemplo, el codón que codifica cualquier aminoácido concreto se puede alterar para mejorar la expresión celular.

Las moléculas de ácido nucleico según la presente descripción se seleccionan del grupo que consiste en

a) una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión citolítica según la presente descripción; b) una molécula de ácido nucleico que codifica una forma modificada de proteína de fusión citolítica según la presente descripción, preferiblemente en la que uno o más residuos de aminoácidos están sustituidos de forma conservativa;

c) una molécula de ácido nucleico que es una fracción, variante, homólogo, derivado o fragmento de la molécula de ácido nucleico presentada como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9; d) una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridar con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de los apartados a) - c) en condiciones rigurosas;

e) una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridar con el complemento de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de los apartados a) - d) en condiciones rigurosas;

f) una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de los apartados a) - e) y que codifica una proteína de fusión citolítica; g) una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos 70% con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de los apartados a) - f) y que codifica una proteína de fusión citolítica; h) o un complemento de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de los apartados a) - g).

En aspectos preferidos, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión citolítica de esta descripción está comprendida en un casete de expresión. Como se utiliza en la presente memoria, el término "casete de expresión" significa que se incluyen secuencias de ácidos nucleicos adicionales que permiten la expresión de los polipéptidos en una célula, o más concretamente en una célula eucariota. Tales secuencias adicionales pueden comprender, por ejemplo, un promotor, un potenciador, secuencias de intrones o una secuencia señal de poliadenilación.

En otros aspectos adicionales de la descripción, una secuencia codificante para los polipéptidos puede estar comprendida en un vector de expresión tal como un vector de expresión viral (véase la Fig. 1). Los vectores de expresión virales para su uso según la invención incluyen, pero sin limitación, adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes, SV-40, retrovirus y sistemas vectores de virus vaccinia.

Las realizaciones se refieren también a composiciones que comprenden una proteína de fusión citolítica de la presente descripción, en particular a composiciones farmacéuticas, de diagnóstico o cosméticas.

En realizaciones adicionales, las composiciones comprenden una segunda proteína de fusión citolítica, también adecuada para inducir apotosis en una célula diana que comprende al menos un primer polipéptido que comprende una estructura de unión para permitir la unión de la proteína de fusión a una estructura diana específica en la superficie de una célula enferma, y al menos un segundo polipéptido que comprende una serina proteasa citolítica, en donde la serina proteasa es granzima B, un mutante o un homólogo de la misma.

En algunas realizaciones, la estructura de unión comprendida en el primer polipéptido de la primera proteína de fusión citolítica que comprende granzima M es diferente al primer polipéptido de la segunda proteína de fusión citolítica que comprende granzima B. En realizaciones ventajosas, la primera y la segunda proteína de fusión citolítica se unen a diferentes estructuras diana específicas en la superficie de la misma célula diana.

Como se muestra en la Fig. 16, la co-incubación de una proteína de fusión citolítica basada en una variante de granzima B (Gb-Ki4 R201K) y una proteína de fusión citolítica basada en granzima M w/t (Gm-Ki4) tiene un efecto mejorado sobre muerte celular inducida. En realizaciones ventajosas adicionales, la combinación de Gm-RFT5 (scFv) y Gb-Ki4 (scFv), o Gb-RFT5 (scFv) y Gm-Ki4 (scFv), o Gb-RFT5 (scFv) y Gm-RFT5 (scFv) en células L540 que son positivas tanto para CD30 como para CD25 muestra un efecto aditivo y un efecto mejorado sobre la muerte celular inducida. Por lo tanto, las composiciones que comprenden estas combinaciones de proteínas de fusión citolítica son útiles para inducir apoptosis en células diana enfermas, en particular para el tratamiento del cáncer. La composición según la presente descripción puede ser una composición farmacéutica, diagnóstica o cosmética y se puede utilizar con un "portador farmacéuticamente aceptable" que incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (p. ej., agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizadores de fármacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, edulcorantes, agentes aromatizantes, colorantes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como conocería un experto con un conocimiento práctico normal de la técnica. Un portador farmacéuticamente aceptable se formula preferiblemente para la administración a un ser humano, aunque en ciertas realizaciones puede ser deseable utilizar un vehículo farmacéuticamente aceptable que se formula para la administración a un animal no humano, tal como un cánido, pero que no sería aceptable (p. ej., debido a regulaciones gubernamentales) para la administración a un ser humano. Excepto en la medida en que cualquier portador convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.

La cantidad de dosificación real de una composición de la presente invención administrada a un sujeto se puede determinar por medio de factores físicos y fisiológicos tales como peso corporal, gravedad de la afección, el tipo de enfermedad que se vaya a tratar, intervenciones terapéuticas previas o concurrentes, idiopatía del paciente y la vía de administración. El profesional responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración de ingrediente o ingredientes activos en una composición y las dosis apropiadas para el sujeto individual.

Por "farmacéuticamente eficaz" se entiende la capacidad de curar, reducir o prevenir uno o más síntomas clínicos causados o asociados con las células enfermas del mamífero paciente, que incluyen, entre otros, proliferación celular no controlada, infección bacteriana e infección viral.

En realizaciones ventajosas, el polipéptido según la descripción se utiliza para preparar un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad como alergia, reacción autoinmunitaria, reacción de rechazo de tejido o reacción de inflamación crónica, preferiblemente cáncer.

Por lo tanto, en una realización específica, se proporciona un método para tratar a un paciente con cáncer que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de una composición terapéutica que comprende una proteína de fusión citolítica según la presente descripción o un vector de expresión de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión citolítica como se describió anteriormente. En aspectos preferidos, los métodos descritos en la presente memoria se pueden utilizar para tratar a un paciente humano.

Como se describió anteriormente, en ciertos aspectos, la descripción proporciona métodos para tratar el cáncer. Por lo tanto, en ciertos casos, los métodos descritos se pueden utilizar para limitar o reducir las células tumorales mediante apoptosis, reduciendo así el crecimiento tumoral o la metástasis. Se puede tratar una variedad de tipos de cáncer con los métodos de la presente descripción, por ejemplo, un cáncer para su tratamiento puede ser un cáncer de vejiga, sangre, hueso, médula ósea, cerebro, mama, colon, esófago, ojo, gastrointestinal, encía, cabeza, riñón, hígado, pulmón, nasofaringe, cuello, ovario, próstata, piel, estómago, testículos, lengua o útero. Además, se pueden utilizar terapias anticancerosas adicionales combinadas o junto con los métodos de la invención. Tales terapias adicionales se pueden administrar antes, después o concomitantemente con los métodos de la descripción. Por ejemplo, una terapia anticancerosa adicional puede ser quimioterapia, terapia quirúrgica, inmunoterapia o radioterapia.

Se contempla que los polipéptidos, composiciones y/o complejos de la descripción se puedan administrar a un paciente localmente o sistémicamente. Por ejemplo, los métodos de la invención pueden implicar la administración de una composición por vía tópica, intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostatica, intrapleural, intratraqueal, intraocular, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarectal, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, por inhalación, por inyección, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada bañando directamente las células diana, mediante un catéter o mediante un lavado.

Adicionalmente, las realizaciones de esta descripción se refieren al uso de las proteínas y composiciones de fusión citolítica según la presente descripción para la preparación de una composición farmacéutica, diagnóstica o cosmética. En algunas realizaciones, la descripción se refiere a medicamentos que comprenden la proteína de fusión citolítica o la composición de la descripción combinada con un portador o diluyente farmacológicamente aceptable como se definió anteriormente.

En otro aspecto, la descripción se refiere a métodos para tratar una enfermedad maligna, una alergia, reacción autoinmunitaria, reacción de rechazo de tejido o reacción de inflamación crónica que comprende administrar una cantidad eficaz de una proteína de fusión citolítica o una composición según la presente descripción a un paciente que lo necesite.

En la Figura 2 se muestran ejemplos ventajosos para las proteínas de fusión citolíticas según la presente descripción:

scFv Anti-CD30 "Ki-4" contra las líneas celulares L540, L428, L1236 de linfoma de Hodgkin y la línea celular CML K562, scFv Anti-CD64 "H22" contra las líneas celulares AML HL60 y CD64+ células primarias de pacientes con CMML, scFv Anti-EGFR "425" contra la línea celular A431 de carcinoma epidermoide humano, scFv Anti-CD25 "RFT5" contra la línea celular L540 de linfoma de Hodgkin.

Además, los compartimentos celulares o células anfitrionas que sintetizan proteínas de fusión citolíticas completas según la descripción o sus componentes individuales después de la transformación o transfección con las moléculas de ácido nucleico o los vectores según la descripción también se reivindican según la invención.

Los compartimentos celulares o las células anfitrionas según la descripción son de origen procariótico, especialmente de E. coli, B. subtilis, S. carnosus, S. coelicolor, Marinococcus sp., u origen eucariótico, especialmente de Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Spodoptera sp., P. pastoris, células de mamífero primarias o cultivadas, líneas celulares eucarióticas (p. ej., CHO, Cos o 293) o sistemas vegetales (p. ej. N. tabacum) En una realización ventajosa, las proteínas de fusión citolítica se expresan en células HEK293T.

Los siguientes métodos y ejemplos se ofrecen solo con fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente descripción de ninguna manera.

Métodos y ejemplos

En los siguientes ejemplos, se proporcionan materiales y métodos de la presente descripción, incluida la determinación de las propiedades catalíticas de las proteínas de fusión citolíticas según la presente descripción. Se debe entender que estos ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos y no se debe interpretar que limitan esta descripción de ninguna manera.

Ejemplo 1: Técnicas recombinantes para la generación de inmunotoxinas basadas en granzima M

La secuencia codificante para la granzima M se amplificó a partir de ARN derivado de sangre humana. La construcción de los plásmidos pMS15 que codifican la secuencia de Gb-H22 (scFv) (proteína de fusión de granzima B (Gb) y cadena sencilla H22) ya se ha descrito16. A través de los sitios de restricción integrados Xbal/Blpl, la secuencia codificante para Gb fue intercambiada por la de granzima M. De acuerdo con los mismos procedimientos, la construcción de Gm-Ki4 (scFv) se realizó sobre la base de la secuencia ya publicada para la cadena sencilla Ki417. De la misma manera, todas las otras construcciones descritas en la presente memoria se han generado utilizando métodos básicos de biología molecular.

La especificidad de los compañeros de unión de las proteínas de fusión citolítica es la siguiente: H22 (scFv) es una cadena individual humanizada específica para el receptor gamma Fc I (CD64) mientras que Ki4(scFv) murina se une a CD30. Como se describió anteriormente, la glicoproteína CD64 de 72 kDa (FcyRI) es el mediador de la endocitosis y la fagocitosis, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la producción de citocinas y superóxido. Está implicada en enfermedades inflamatorias y también se expresa en exceso en la superficie de las células leucémicas. CD30 es una proteína transmembrana de tipo I glicosilada y pertenece a la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral. Resultó ser una diana prometedora para el tratamiento del linfoma de Hodgkin en estudios previos (Schwab, Stein et al. 1982; Gruss, Pinto et al. 1996). RFT5 (scFv) se une a CD25, un receptor a de IL-2 de baja afinidad de 55 kDa que es inducido eficazmente tras la activación de las células T, no detectable en células T, células B o monocitos en reposo y se expresa en exceso en células de Hodgkin y Reed-Sternberg. También está presente en leucemia de células T adultas, leucemia/linfomas de células T periféricas, linfoma cutáneo de células T, linfomas no Hodgkin de células B, leucemia de células pilosas, leucemia linfocítica crónica y leucemia mieloblástica aguda18. 425(scFv) se une a EGFR, una glucoproteína de la superficie celular compuesta de una sola cadena de polipéptidos que se une al péptido Factor de Crecimiento Epidérmico.

El plásmido pMS que contiene el casete de clonación para las proteínas de fusión, incluida la granzima M y una cadena sencilla (aquí H22(scFv)) se puede encontrar en la Figura 1. La FIG. 18-22 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas sencillas utilizadas fusionadas a granzima M (Fig. 19-22) y la secuencia de granzima M sola (Fig. 18). La estructura esquemática de las realizaciones de las proteínas de fusión citolítica según la presente descripción se muestra en la Figura 2. Las abreviaturas en la Figura 2 significan lo siguiente: pMS-IV es el sistema de vector utilizado, IG^k es la secuencia líder para permitir la expresión secretora, ECS es una secuencia que codifica un sitio de enteroquinasa para la activación de Granzima M in vitro, IVS/IRES es un sitio de entrada al ribosoma intrón/interno sintético.

Ejemplo 2: Líneas celulares y células primarias

Las líneas celulares utilizadas L540, L428, L1236 y HL60 y la línea celular de expresión HEK293T (Graham et al., 1977) se mantuvieron en medio complejo RPMI (RPMI 1640 más Gluta-MAX-I) con un suplemento de FCS al 10% (v/v) y 100 |jg/ml de penicilina y estreptomicina (abreviados como R10) a 37°C y CO2 al 5%. Después de la transfección de células HEK293T, se añadieron 100 jg/ml de Zeocina para fines de selección.

L428 (ACC-197), L540 (ACC-72) y L1236 (ACC-530) son líneas celulares derivadas de Hodgkin. L1236 se estableció a partir de la sangre periférica de un hombre de 34 años de edad con linfoma de Hodgkin (celularidad mixta, estadio IV, refractario, terminal, tercera recaída) en 1994, L428 se estableció a partir del derrame pleural de una mujer de 37 años de edad con linfoma de Hodgkin (estadio IVB, esclerosis nodular, refractario, terminal) en 1978 y L540 se establece a partir de la médula ósea de una mujer de 20 años de edad con linfoma de Hodgkin (esclerosis nodular; estadio iVb , estadio pre-terminal). K562 (ACC-10) se establece a partir del derrame pleural de una mujer de 53 años de edad con leucemia mieloide crónica (LMC) en crisis blástica en 1970. La línea celular HL60 se establece a partir de la sangre periférica de una mujer de 35 años de edad con leucemia mieloide aguda (AML FAB M2) en 1976.

Las células primarias de pacientes con CMML (leucemia mielomonocítica crónica) se obtuvieron después del consentimiento informado y con la aprobación de la Junta de Ética de Investigación Clínica de la Universidad de Aquisgrán. Las células mononucleares se aislaron de la sangre periférica mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando solución de separación Biocoll (Biochrom AG) y se cultivaron en R10. Para los ensayos de viabilidad se añadieron 200 U/ml de interferón ^y para retener la activación de la expresión de CD64 durante el cultivo.

Ejemplo 3: Detección de Serpina B9 en líneas celulares tumorales y células tumorales primarias mediante análisis de Transferencia Western

Para la detección de la expresión endógena de la Serpina B9 (también denominada PI9) dentro de líneas celulares tumorales o células tumorales primarias de pacientes leucémicos, se lisaron 106 células en 50 pl de tampón de lisis (solución salina tamponada con fosfato (PBS) con un suplemento de Triton X-100 al 1%) durante 30 minutos en hielo. El extracto celular se aclaró mediante centrifugación y la concentración de proteína se determinó con reactivo de Bradford (BioRad). Se cargaron 40 pg de proteína soluble total en un gel SDS para análisis de transferencia western. Después de la electrotransferencia sobre membranas de nitrocelulosa y el bloqueo con PBS con un suplemento con Tween-20 al 0,05% y leche en polvo al 2,5%, se detectó la Serpina B9 con anti-PI9 humana (Santa Cruz, clon 7D8) y mAb anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa (1:5.000, Sigma) y se visualizó mediante un sistema mejorado de quimioluminiscencia (ECL) (BD BioScience) y LAS-3000 (Fujifilm).

La FIG. 14A muestra la expresión de PI9 dentro de las líneas celulares utilizadas L428, L1236, K562 y L540. HL60 son como L540 negativas para PI9. La FIG. 13 muestra la expresión de PI9 dentro del material del paciente de CMML.

Ejemplo 4: Expresión de proteínas en células de mamíferos y purificación

Las células HEK293T se utilizaron como línea celular de expresión. Las células se transfectaron con 1 pg de ADN según las instrucciones del fabricante utilizando RotiFect (Roth). El plásmido pMS utilizado codifica el informador bicistrónico EGFP para que la expresión de la proteína diana pueda verificarse mediante fluorescencia verde mediante microscopía de fluorescencia.

La proteína secretada podría purificarse del sobrenadante del cultivo celular mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) y Cromatografía Líquida de Rendimiento Rápido (FPLC). Al sobrenadante aclarado se le añadió un suplemento de imidazol 10 mM y se cargó en una columna XK16/20 (Amersham/GE Healthcare) que contenía 8 ml de resina Sepharose 6 Fast Flow (Clontech/Takara). Los tampones utilizados, tales como tampón de incubación, lavado y elución, se describieron anteriormente15. La proteína eluida se volvió a tamponar en Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 250 mM, se concentró, se dividió en alícuotas y se almacenó a

-80°C. Para la activación antes de su uso se añadió Enteroquinasa a la proteína (0,02 U/pg) con CaCh 3 mM durante 16 h de incubación a 23°C. Las proteínas purificadas o los extractos celulares se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y tinción con Coomassie. Las transferencias Western se realizaron según técnicas convencionales. La concentración de proteína se calculó a partir de geles SDS teñidos con Coomassie utilizando diferentes concentraciones de seralbúmina bovina como patrón y el soporte lógico AIDA Image Analyzer.

Las Figuras 3A, 4A, 5A y 6 muestran geles de SDS teñidos con Coomassie y las transferencias Western correspondientes de las proteínas purificadas. La detección en las transferencias Western se realizó con antigranzima M humana (Abnova) y un mAb anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (1:5.000; Sigma) seguido de tinción con Tris-HCI (pH 8,0) y 0.2 mg/ml de Naphtol-AS-Bi-phosphate (Sigma, Alemania) con un suplemento de 1 mg/ml de Fast-Red (Serva) o un mAb anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa (GAM-PO, 1:5.000, Sigma) para la detección de quimioluminiscencia (reactivos de BD Thermoscientific y detección con LAS-3000 (Fujifilm)).

Ejemplo 5: Determinación de la actividad de la granzima M mediante la formación de complejos con PI9 La formación de complejos entre Serpina B9 recombinante (expresada y purificada como se describió anteriormente20) y Gm-H22 (scFv), Gm-Ki4 (scFv) o Gm-425 (scFv) tuvo lugar a 25°C en tampón de ensayo que contenía HEPES 100 mM, pH 7,4, NaCl 200 mM, Tween 20 al 0,01% y DTT 1 mM a una razón molar 1:3. Después de 24 horas, la mezcla de reacción se analizó mediante SDS-PAGe y transferencia Western según técnicas convencionales utilizando anti-PI9 humana (clon 7D8, Santa Cruz) y GAM-Po (Sigma) como segundo anticuerpo. Se realizó un seguimiento de la señal quimioluminiscente con LAS-3000 (Fujifilm).

Las FIG. 3B, 4B y 5B muestran las transferencias Western resultantes con Serpina B9 escindida después de la incubación con las construcciones de granzima M. Todas las construcciones son activas según su actividad enzimática.

Ejemplo 6: Análisis de unión

La unión de las construcciones de granzima M a las líneas celulares diana se evaluó mediante citometría de flujo. Se lavaron 4*105 células con PBS y se incubaron con 1 |jg de proteína purificada en 100 |jl de PBS durante 30 minutos sobre hielo. Después de 2 ciclos de lavado (Dade Serocent) las células se incubaron con Alexa 488 anti-His durante 30 minutos sobre hielo en la oscuridad. Los anticuerpos no unidos se eliminaron mediante lavado con PBS. La unión específica se determinó con la ayuda del citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson).

Las FIG. 7-9 muestran los resultados del análisis de unión. Para cada construcción se muestra un control negativo que no expresa el receptor correspondiente (L428 para Gm-H22 (scFv), HL60 para Gm-Ki4 (scFv) y L540 para Gm-425 (scFv)). Todas las construcciones se unen específicamente a sus líneas celulares diana y no se detectó ninguna unión inespecífica.

Ejemplo 7: Ensayo de apoptosis

La apoptosis se documentó mediante tinción con Anexina V/Yoduro de propidio (PI). Se incubaron 2*105 células/ml a 37°C y CO2 al 5% con proteína de fusión citolítica en placas de 12 pocillos. Después de la incubación, las células se lavaron en PBS y el sedimento se resuspendió en 450 j l de sobrenadante de cultivo libre de células a partir de células HEK293T que expresaban proteína fluorescente verde marcada con anexina V con un suplemento de tampón de unión a Anexina V 10x (H^e PES 100 mM, pH 7,5, NaCl 1,5 M, KCl 50 mM y CaCl220 mM) así como 5 jg/ml de PI. La incubación tuvo lugar durante 20 minutos en hielo en la oscuridad y el análisis se realizó mediante mediciones de citometría de flujo. El canal FL1 (eje X) detecta la fluorescencia GFP por lo que el canal FL3 (eje Y) determina la PI. Explicación de las gráficas de puntos correspondientes: cuadrante superior derecho = células apoptóticas tardías (positivas para anexina V y PI), cuadrante superior izquierdo = células necróticas (negativas para anexina V y positivas para PI), cuadrante inferior derecho = células apoptóticas tempranas (positivas para anexina V y negativas para PI), cuadrante inferior izquierda = células viables (negativas para Anexina V y PI).

La FIG. 11 muestra los resultados del ensayo de anexina V con Gm-H22 (scFv) en HL60 positiva para CD64 y K562 negativa para CD64. Se puede observar que el efecto citotóxico es inducido por la apoptosis y que es específico. Las células se incubaron con proteína 66 nM durante 48 horas.

La FIG. 15A presenta los efectos apoptóticos de Gm-Ki4 (scFv) sobre las líneas celulares L928 y L1236 positivas para PI9 y la línea celular L540 negativa para PI9. El análisis se realizó después de la incubación de las células con proteína de fusión citolítica 11 nM o 33 nM, respectivamente, durante 48 horas. Se muestra una comparación con Gb-Ki4 (scFv) que no induce apoptosis en células positivas para PI9 en contraste con Gm-Ki4 (scFv).

La FIG. 17A-B muestra los resultados de un ensayo de Anexina V después de la incubación de la línea celular A431 negativa para PI9 con Gm-425 100 nM (scFv) en comparación con GbR201K-425 100 nM (scFv). Como control negativo, las células L540 se incubaron con la misma cantidad de proteína. En la Figura 17B, los efectos apoptóticos se convirtieron en viabilidad y el control de tampón se ajustó al 100%.

Ejemplo 8: Ensayo de viabilidad

Se realizó un seguimiento de los efectos citotóxicos dependientes de la dosis utilizando la capacidad de las células metabólicas activas para reducir la sal de tetrazolio XTT a compuestos de formazán de color naranja. La intensidad de la luz se midió con un lector de microplacas y es directamente proporcional al número de células vivas. Se sembraron en placa 5000 células para las líneas celulares y 20.000 células para células primarias en 100 j l de R10 en placas de 96 pocillos en diluciones seriadas 1:5 o 1:3. En otro enfoque, se añadieron concentraciones de una sola proteína 11 o 21 nM (si no se indica lo contrario) de la proteína de fusión citolítica respectiva a 3*105 células en placas de 12 pocillos y se incubó a 37°C y CO2 al 5%. Después de 48 horas de incubación, se transfirieron 100 j l de la suspensión celular a placas de 96 pocillos y se añadieron 50 j l de XTT. La lectura se realizó a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 650 nm. Se utilizó la misma configuración para mediciones dependientes de la dosis con la línea celular L540.

La FIG. 10 muestra las curvas dependientes de la dosis detectadas mediante XTT para Gm-H22 (scFv) en células HL60 estimuladas y no estimuladas con interferón y y en la línea celular L428 (las dos últimas utilizadas como controles negativos). La toxicidad específica en células HL60 estimuladas se confirmó con una CI50 de 1,2 nM. La FIG. 12A muestra el efecto tóxico de la construcción sobre las células de AML o CMML primarias (probadas para que fueran positivas para PI9 como se muestra en la Figura 13) por medio de lo cual se añadieron concentraciones de una sola proteína de fusión citolítica 21 nM a las células y se incubaron durante 48 horas. A modo de comparación, también se muestran los resultados de Gb-H22 (ScFv) y su mutante Gb-H22 (scFv) R201K. La FIG.

12B muestra la citotoxicidad dependiente de la dosis de Gm-H22 (scFv) en células de AML primarias.

La FIG. 15B presenta la medición de viabilidad después de la incubación de células L428 positivas para PI9 con Gm-Ki4 (scFv) y Gb-Ki4 (scFv) R201K como control. El análisis se realizó después de la incubación de las células con proteína de fusión citolítica 11 nM durante 48 horas. La apoptosis es inducida tanto por Gm-Ki4 (scFv) como por el control Gb-Ki4 (scFv) R201K, por lo que Gb-Ki4 (scFv) de tipo salvaje no induce apoptosis. Por lo tanto, la proteína de fusión granzima M puede desencadenar la muerte celular en presencia de Serpina B9 que se asocia con la resistencia al tratamiento (2011_Ray, 2012_Soriano).

La FIG. 14B muestra la curva de toxicidad dependiente de la dosis para Gm-Ki4 (scFv) en células L540 con una CI50 272 nM. La FIG. 16 presenta la viabilidad de las células K562 positivas para PI9 después de la incubación con Gb-Ki (scFv), Gb-Ki4 (scFv) R201K 11 nM y la incubación conjunta de Gb-Ki4 (scFv) R201K y Gm-Ki4 (scFv), con lo que Gm-Ki4 (scFv) se añadió 24 horas antes que Gb-Ki4 (scFv) R201K. Se confirmó un efecto aditivo mediante la adición de Gm-Ki4 (scFv). La variante de la granzima B comprendida en Gb-Ki4 (scFv) R201K tiene una sustitución en la posición 201 de la granzima B humana de tipo salvaje y muestra una mayor actividad apoptótica en comparación con la granzima B de tipo salvaje y una sensibilidad reducida a las sustancias que inhiben la actividad.

La FIG. 17C muestra los resultados de un ensayo de viabilidad evaluado mediante XTT después de la incubación de la línea celular A431 negativa para PI9 con Gm-425 (scFv) 100 nM en comparación con Gb-425 (scFv) R201K 100 nM durante 72 horas. Ambas construcciones inducen apoptosis dentro de las células diana en la misma medida.

Referencias

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión citolítica adecuada para inducir apoptosis en una célula diana que comprende al menos un primer polipéptido que comprende una estructura de unión para permitir la unión de la proteína de fusión a una estructura diana específica en la superficie de una célula enferma, y al menos un segundo polipéptido que comprende un serina proteasa citolítica, en donde la serina proteasa es granzima M, y en donde la estructura de unión permite que la proteína de fusión citolítica se una a un receptor seleccionado del grupo que consiste en CD64, CD30 CD25 y receptor de EGF, en donde la proteína de fusión citolítica comprende un secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEC ID NO. 8 y SEQ ID NO. 10, o en donde la proteína de fusión citolítica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEC ID NO. 8 o SEQID NO. 10.

2. La proteína de fusión citolítica según la reivindicación 1, que comprende uno o más polipéptidos adicionales seleccionados del grupo que consiste en una secuencia líder capaz de controlar la biosíntesis de proteínas, una etiqueta de proteína, una secuencia anfifática del dominio de translocación capaz de translocar la proteína de fusión al citosol de la célula diana y una secuencia anfifática de pro-serina proteasa sintética susceptible de activación intracelular de la serina proteasa.

3. La proteína de fusión citolítica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la proteína de fusión citolítica comprende un fragmento variable de cadena sencilla, una secuencia líder para la expresión secretora, un sitio de escisión de enteroquinasa, una etiqueta HIS y un polipéptido que comprende una serina proteasa citolítica, en donde la serina proteasa es la granzima M.

4. Una molécula de ácido nucleico, que codifica la proteína de fusión citolítica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4.

6. Una célula anfitriona que se transforma con el vector de la reivindicación 5 y/o que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4.

7. Un método para preparar la proteína de fusión citolítica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar una célula anfitriona y aislar la proteína de fusión citolítica del cultivo.

8. Una composición farmacéutica que comprende un primer polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. La proteína de fusión citolítica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y/o una composición farmacéutica según la reivindicación 8, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad seleccionada de una lista que comprende alergia, reacción autoinmunitaria, reacción de rechazo de tejido, reacción de inflamación crónica y/o cáncer.