ES2872528T3 - Constructos de la variante de SIRP-alfa y usos de los mismos - Google Patents

Constructos de la variante de SIRP-alfa y usos de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2872528T3
ES2872528T3 ES16183261T ES16183261T ES2872528T3 ES 2872528 T3 ES2872528 T3 ES 2872528T3 ES 16183261 T ES16183261 T ES 16183261T ES 16183261 T ES16183261 T ES 16183261T ES 2872528 T3 ES2872528 T3 ES 2872528T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sirp
variant
cancer
construct
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16183261T
Other languages
English (en)
Inventor
Laura Deming
Corey Goodman
Jaume Pons
Bang Janet Sim
Marija Vrljic
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ALX Oncology Inc
Original Assignee
ALX Oncology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from TW104125902A external-priority patent/TWI702228B/zh
Application filed by ALX Oncology Inc filed Critical ALX Oncology Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2872528T3 publication Critical patent/ES2872528T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03048—Protein-tyrosine-phosphatase (3.1.3.48)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

Un constructo de la variante de la proteína α reguladora de la señal (SIRP­α), que comprende una variante de SIRP­ α unida a un péptido bloqueante basado en CD47 por medio de un enlazador escindible, en el que el péptido bloqueante basado en CD47 tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio IgSF de tipo salvaje de CD47 (SEQ ID NO: 35) o un fragmento de la misma que puede unirse a una variante de SIRP­α, y donde la variante de SIRP­α comprende la secuencia de aminoácidos establecida en EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5VGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 13), en donde X1 es L, I, o V; X2 es V, L, o, I: X3 es A o V; X4 es A, I, o L; X5 es I, T, S, o F; X6 es E, V, o L; X7 es K o R; X8 es E o Q; X9 es H, P, o R; X10 es L, T, o G; X11 es K o R; X12 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; X13 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X14 es V o I; X15 es F, L, o V; y X16 es F o V.

Description

DESCRIPCIÓN
Constructos de la variante de SIRP-alfa y usos de los mismos
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La proteína a reguladora de la señal (SIRP-a) es una proteína que se expresa ampliamente en la membrana de células mieloides. SIRP-a interactúa con CD47, una proteína ampliamente expresada en muchos tipos de células en el cuerpo. La interacción de SIRP-a con CD47 evita la absorción de las células "propias", que de otro modo podrían ser reconocidas por el sistema inmunológico. SIRP-a se descubrió por primera vez como un enlazador de SHP-2 (un dominio SH-2 que contiene tirosina fosfatasa). El CD47 se caracterizó temprano como un antígeno sobreexpresado en células de carcinoma de ovario.
En 2000, Oldenborg et al. mostraron que la administración de glóbulos rojos (RBC) deficientes en CD47 en un modelo de ratón dio como resultado un rápido aclaramiento de los RBC del sistema, demostrando que CD47 es una señal "protectora" en algún subconjunto de células "propias". Posteriormente, se exploró más a fondo el posible vínculo entre la SIRP-a y el cáncer. Se encontró que la alta expresión de CD47 en las células tumorales actuaba, en la leucemia mieloide aguda (AML) y varios cánceres de tumores sólidos, como un factor pronóstico negativo para la supervivencia. Las estrategias centradas en interrumpir la interacción entre CD47 y SIRP-a, como la administración de agentes que enmascaran CD47 o SIRP-a, se han explorado como terapias contra el cáncer potenciales.
El documento WO 2016/023040 describe constructos de variantes de SIRP-a y usos de los mismos. El documento WO 2010/070047 describe polipéptidos solubles de unión a CD47 para su uso en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios e inflamatorios.
Sin embargo, al considerar estas estrategias terapéuticas, es preocupante que SIRP-a pueda unirse a CD47 en muchos tipos de células diferentes en el cuerpo humano. Por tanto, existe la necesidad de diseñar SIRP-a para que se una preferentemente a CD47 solo en células enfermas o en células en un sitio enfermo.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención presenta constructos de la variante de la proteína a reguladora de la señal (SIRP-a). La presente invención proporciona un constructo de la variante de la proteína a reguladora de la señal (SIRP-a), que comprende una variante de SIRP-a unida a un péptido bloqueante basado en CD47 por medio de un enlazador escindible, en el que el péptido bloqueante basado en CD47 tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio IgSF de tipo salvaje de CD47 (SEQ ID NO: 35) o un fragmento de la misma que puede unirse a una variante de SIRP-a, y donde la variante de SIRP-a comprende la secuencia de aminoácidos establecida en EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 13), en donde X1 es L, I, o V; X2 es V, L, o, I; X3 es A o V; X4 es A, I, o L; X5 es I, T, S, o F; X6 es E, V, o L; X7 es K o R; X8 es E o Q; X9 es H, P, o R; X10 es L, T, o G; X11 es K o R; X12 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; X13 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X14 es V o I; X15 es F, L, o V; y X16 es F o V. Los constructos de la variante SIRP-a incluyen variantes de SIRP-a. En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a tienen actividad preferencial en un sitio enfermo (por ejemplo, en el sitio de un tumor que en un sitio no enfermo). En determinadas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a tienen una mayor afinidad de unión a CD47 en células enfermas (p. ej., células tumorales). En algunas realizaciones, las variantes de SIRP-a se unen con mayor afinidad a CD47 a pH ácido (p. ej., menos de alrededor de pH 7) y/o en condiciones hipóxicas que en condiciones fisiológicas. En algunas realizaciones, las variantes de SIRP-a contienen una o más sustituciones de aminoácidos con residuos de histidina o con otros aminoácidos que permiten la unión preferencial de constructos de la variante de SIRP-a en un sitio enfermo. En algunas realizaciones, se evita que los constructos de la variante de SIRP-a se unan a CD47 en un sitio no enfermo mediante un péptido bloqueante. En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a se dirigen al sitio enfermo (p. ej., el tumor) mediante un resto de direccionamiento (p. ej., un anticuerpo dirigido a un antígeno asociado al tumor o un péptido de unión a anticuerpo). La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden: a) una cantidad terapéuticamente efectiva del constructo de la variante de SIRP-a de la invención, y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable. La presente invención proporciona además los constructos de la variante de SIRP-a o las composiciones farmacéuticas de la invención para uso en métodos de tratamiento de diversas enfermedades, tales como cáncer, preferiblemente cáncer de tumor sólido y cáncer hematológico.
En un aspecto, la invención presenta un constructo de la variante de la proteína a reguladora de señal (SIRP-a), en donde el constructo de la variante de SIRP-a se une preferentemente a CD47 en células enfermas o en un sitio enfermo que en células no enfermas. En algunas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a se une a CD47 en células enfermas o en un sitio enfermo con mayor afinidad que se une a CD47 en células no enfermas.
En algunas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a incluye una variante de SIRP-a unida a un péptido bloqueante. En algunas realizaciones, el péptido bloqueante se une con mayor afinidad a una SIRP-a de tipo salvaje que a la variante de SIRP-a. En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a se une con mayor afinidad a una CD47 de tipo salvaje que al péptido bloqueante.
El péptido bloqueante es un péptido bloqueante basado en CD47. En algunas realizaciones, el péptido bloqueante basado en CD47 incluye una porción que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia del dominio IgSF de tipo salvaje de CD47 (SEQ ID NO: 35) o un fragmento del mismo que puede unirse una variante de SIRP-a. En algunas realizaciones, el péptido bloqueante basado en CD47 tiene la secuencia de SEQ ID NO: 38 o 40.
En el presente documento se proporcionan constructos de la variante de SIRP-a que comprenden una variante de SIRP-a descrita en el presente documento, en donde dicha variante de SIRP-a se une a un péptido bloqueante descrito en el presente documento mediante el uso de al menos un enlazador escindible. En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a puede comprender el mismo sitio de unión a CD47 que un SIRP-a de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a puede comprender una o más mutaciones o inserciones en comparación con una SIRP-a de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a puede ser una forma truncada de la SIRP-a de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el péptido bloqueante puede ser un mimético, variante o fragmento de CD47 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el péptido bloqueante puede presentar una mayor afinidad por un SIRP-a de tipo salvaje, en comparación con la variante SIRP-a en el constructo de la variante SIRP-a. En algunas realizaciones, el péptido bloqueante puede ser un polipéptido variante de CD47 que demuestra una afinidad menor por una variante de SIRP-a en comparación con el Cd 47 de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el enlazador entre la variante de SIRP-a y el péptido bloqueante puede ser al menos un enlazador que es opcionalmente escindible por una o más proteasas. En algunas realizaciones, el enlazador opcionalmente también comprende uno o más espaciadores.
La variante de SIRP-a se une a un péptido bloqueante por medio de un enlazador escindible y, opcionalmente, uno o más espaciadores. En algunas realizaciones, el enlazador escindible se escinde a pH ácido y/o condición hipóxica. En algunas realizaciones, el enlazador escindible es escindido por una enzima asociada al tumor. En algunas realizaciones, la enzima asociada al tumor es una proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa se selecciona del grupo que consiste en matriptasa (MTSP1), activador de plasminógeno de tipo urinario (uPA), legumaína, PSA (también llamado KLK3, peptidasa-3 relacionada con calicreína), metaloproteinasa de matriz-2 (MMP-2), MMP9, elastasa de neutrófilos humanos (HNE) y proteinasa 3 (Pr3). En algunas realizaciones, la proteasa es matriptasa. En algunas realizaciones, el enlazante escindible tiene la secuencia de LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47) o una cualquiera de las secuencias listadas en la Tabla 7. En algunas realizaciones, el enlazante escindible incluye uno o una combinación de las siguientes secuencias (véase, p. ej., Tabla 7): PRFKIIGG, PRFRIIGG, SSRHRRALD, RKSSIIIRMRDVVL, SSSFDKGKYKKGDDA, SSSFDKGKYKRGDDA, IEGR, IDGR, GGSIDGR, PLGLWA, GPLGIAGI, GPEGLRVG, YGAGLGVV, AGLGVVER, AGLGISST, DVAQFVLT, VAQFVLTE, AQFVLTEG, PVQPIGPQ, L/S/G-/R--/S-/D/N/H, - /s/gs/Rk-/rv/-/-/-, SGR-SA, L/S/G-/R--/S-/D/N/H, r/-/-/Rk-/v-/-/g/-, RQAR-VV, r/-/-/Rk/v/-/g, /Kr/RKQ/gAS/RK/A, L/S/G-/R-/S-/D/N/H, -/-/-/N/-/-/-, AAN-L, ATN-L, si/sq/-/yqrs/s/-/-, S/S/K/L/Q, -/p/-/- /li/- /-/-, g/pa/-/gl/-/g/-, G/P/L/G/I/A/G/Q, P/V/G/L/I/G, H/P/V/G/L/L/A/R, -/-/-/viat-/-/-/-, y -/y/y/vta -/-/-/-, donde"-" significa cualquier aminoácido (es decir, cualquier aminoácido que se produce de forma natural), la letra mayúscula indica una fuerte preferencia por ese aminoácido, la letra minúscula indica una preferencia menor por ese aminoácido, y "/" separa posiciones de aminoácido en casos donde es posible más de un aminoácido en una posición adyacente al "/".
En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a se une a un péptido de unión a anticuerpo. En algunas realizaciones, el péptido de unión a anticuerpo se une a una región constante de un anticuerpo de manera reversible o irreversible. En algunas realizaciones, el péptido de unión al anticuerpo se une a la región del fragmento de unión a antígeno (Fab) de un anticuerpo de forma reversible o irreversible. En algunas realizaciones, el péptido de unión a anticuerpo se une a una región variable de un anticuerpo de manera reversible o irreversible. En algunas realizaciones, el anticuerpo es Cetuximab. En algunas realizaciones, el péptido de unión al anticuerpo tiene al menos un 75% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de un péptido de localización de enfermedad (DLP) (CQFDLSTRRLKC (SEQ ID NO: 64) o CQYNLSSRALKC (SEQ ID n O: 65)) o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el péptido de unión al anticuerpo tiene la secuencia de SEQ ID NO: 64.
En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a se une a un monómero de dominio Fc. En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a se une a una albúmina de suero humano (HSA). En algunas realizaciones, la HSA incluye la sustitución de aminoácidos C34S y/o K573P, relativo a la SEQ ID NO: 67. En algunas realizaciones, la HSA tiene la secuencia de
DAHK SE VAEtRFKDLGEENFK AL VLIAF AQ YLQQ SPFEDHVKLVNE VTEF AKT C VA
DESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDN PNLPRLVRPEVD VMCT AFHDNEETFLKKYL YEIARRHP YF Y APELLFF AKRYKAA
FTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVAR
L S QRFPK AEF AE Y SKL YTDLTK VHTEC CHGDLLEC ADDRADL AK YICEN QD SIS SK
LKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGM
FLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEP
QNLIKQNCELFEQLGEYKF QNALLVRYTKKVPQ VSTPTLVEV SRNLGKVGSKCCK
HPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDE
T YVPKEFN AETF TFH ADIC TLSEKERQIKKQ T AL VEL VKHKPK ATKEQLK A VMDD
F A AF VEKC CK ADDKET CF AEEGKKL V A AS Q A ALGL (SEQ ID NO: 68).
En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a se une a un péptido de unión a albúmina. En algunas realizaciones, el péptido de unión a albúmina tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a se une a un polímero, en donde el polímero es una cadena de polietilenglicol (PEG) o una cadena de ácido polisiálico.
En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a se une a un anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo específico de tumor. En algunas realizaciones, el anticuerpo (p. ej., un anticuerpo específico de tumor) se selecciona del grupo que consiste en cetuximab, pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab, MEDI0680, MEDI6469, Ipilimumab, tremelimumab, urelumab, vantictumab, varlilumab, mogamalizumab, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CS1, herceptin, trastuzumab y pertuzumab. En algunas realizaciones, el anticuerpo (p. ej., un anticuerpo específico de tumor) puede unirse a uno o más de los siguientes: 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, fibronectina, FR-alfa, GCC, GD2, glypican-3, GPNMB, HER-2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, mesotelina, MUC16, MUC1, NaPi2b, Nectin-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-a, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEMI, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, y/o CSF-1 R.
En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene al menos un 80% (p. ej., al menos 85 %, 87 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %) de identidad de secuencia con una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 3-12 y 24-34.
En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene una secuencia de EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYN
QX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKG SPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 13), en donde X 1 es L, I, o V; X2 es V, L, o, I; X3 es A o V; X4 es A, I, o L; X5 es I, T, S, o F; X6 es E, V, o L; X7 es K o R; X8 es E o Q; X9 es H, P, o R; X10 es L, T, o G; X11 es K o R; X12 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; X13 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X14 es V o I; X15 es F, L, o V; y X16 es F o V.
En algunos aspectos, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene una secuencia de EEGX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQ
X7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSP DDVEX16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 16), en donde X 1 es L, I, o V; X2 es V, L, o, I; X3 es A o V; X4 es A, I, o L; X5 es I, T, S, o F; X6 es E, V, o L; X7 es K o R; X8 es E o Q; X9 es H, P, o R; X10 es L, T, o G; X11 es K o R; X12 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; X13 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X14 es V o I; X15 es F, L, o V; y X16 es F o V.
En algunos aspectos, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene una secuencia de EEEX1QX2IQPDKFVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX
7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPD DVEX16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 17), en donde X 1 es L, I, o V; X2 es V, L, o, I; X3 es A o V; X4 es A, I, o L; X5 es I, T, S, o F; X6 es E, V, o L; X7 es K o R; X8 es E o Q; X9 es H, P, o R; X10 es L, T, o G; X11 es K o R; X12 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; X13 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X14 es V o I; X15 es F, L, o V; y X16 es F o V.
En algunos aspectos, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene una secuencia de EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX
7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFPIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPD DVEX16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 18), en donde X 1 es L, I, o V; X2 es V, L, o, I; X3 es A o V; X4 es A, I, o L; X5 es I, T, S, o F; X6 es E, V, o L; X7 es K o R; X8 es E o Q; X9 es H, P, o R; X10 es L, T, o G; X11 es K o R; X12 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; X13 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X14 es V o I; X15 es F, L, o V; y X16 es F o V.
En algunos aspectos, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene una secuencia de EEEX1QX2 IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX 7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDD VEX16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 21), en donde X1 es L, I, o V; X2 es V, L, o, I; X3 es A o V; X4 es A, I, o L; X5 es I, T, S, o F; Xa es E, V, o L; X7 es K o R; X8 es E o Q; X9 es H, P, or R; X10 es L, T, o G; X11 es K o R; X12 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, t, V, W, or Y; X13 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X14 es V o I; X15 es F, L, o V; y X16 es F o V.
En algunos aspectos, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene una secuencia de EEEX1QX2 IQPDKSVSVAAGESX3 ILHCTX4TSLX5 PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7 X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTE XiaKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 14), en donde Xi es L, I, o V; X2 es V, L, o, I; X3 es A o V; X4 es V, I, o L; X5 es I, T, S, o F; Xa es E, V, o L; X7 es K o R; X8 es E o Q; X9 es H, P, o R; X10 es S, T, o G; X11 es K o R; X12 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; X13 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X14 es V o I; X15 es F, L, o V; y Xia es F o V.
En algunos aspectos, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene una secuencia de EEEXiQX2IQPDKSVSVAAGESX3ILLCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARXaLIYNQX7 X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTE XiaKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 15), en donde X1 es L, I, o V; X2 es V, L, o, I; X3 es A o V; X4 es V, I, o L; X5 es I, T, S, o F; Xa es E, V, o L; X7 es K o R; X8 es E o Q; X9 es H, P, o R; X10 es S, T, o G; X11 es K o R; X12 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; X13 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X14 es V o I; X15 es F, L, o V; y X1a es F o V.
En algunos aspectos, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene una secuencia de EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARXaLIYNQX7 X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTE X1aKSGAGTELSVRGKPS (SEQ ID NO: 19), en donde X1 es L, I, o V; X2 es V, L, o, I; X3 es A o V; X4 es V, I, o L; X5 es I, T, S, o F; Xa es E, V, o L; X7 es K o R; X8 es E o Q; X9 es H, P, o R; X10 es S, T, o G; X11 es K o R; X12 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; X13 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X14 es V o I; X15 es F, L, o V; y X1a es F o V.
En algunos aspectos, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene una secuencia de EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARXaLIYNQX7 X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTE X1aKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 22), en donde X1 es L, I, o V; X2 es V, L, o, I; X3 es A o V; X4 es V, I, o L; X5 es I, T, S, o F; Xa es E, V, o L; X7 es K o R; X8 es E o Q; X9 es H, P, o R; X10 es S, T, o G; X11 es K o R; X12 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; X13 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X14 es V o I; X15 es F, L, o V; y X1a es F o V.
En algunos aspectos, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene una secuencia de EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARXaLIYNQX 7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDT EX1aKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 20), en donde X1 es L, I, o V; X2 es V, L, o, I; X3 es A o V; X4 es A, I, o L; X5 es I, T, S, o F; Xa es E, V, o L; X7 es K o R; X8 es E o Q; X9 es H, P, o R; X10 es S, T, o G; X11 es K o R; X12 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; X13 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X14 es V o I; X15 es F, L, o V; y X1a es F o V.
En algunos aspectos, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene una secuencia de EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEXaX7X8LX9CTX10TSLXnPVGPIQWFRGAGPX12RX 13LIYNQX14X15GX1aFPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTY YCX2aKX27RKGSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS (SEQ ID NO: 23), en donde X 1 es E o G; X2 es L, I, o V; X3 es V, L, o, I; X4 es S o F; X5 es L o S; Xa es S o T; X7 es A o V; X8 es I o T; X9 es H o R; X10 es A, V, I, o L; X11 es I, T, S, o F; X12 es A o G; X13 es E, V, o L; X14 es K o R; X15 es E o Q; X1a es H, P, o R; X17 es D o E; X18 es S, L, T, o G; X19 es K o R; X20 es E o N; X21 es S o P; X22 es S o R; X23 es S o G; X24 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; X25 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X2a es V o I; X27 es F, L, V; X28 es D o ausente; X29 es T o V; X30 es F o V; y X31 es A o G.
En algunos aspectos, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene al menos un 80% (p. ej., al menos 85 %, 87 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 9a %, 97 %, 98 %, o 99 %) de identidad de secuencia con una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 13-23.
En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a no incluye la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 3-12 y 24-34.
En algunos aspectos, la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a incluye una o más sustituciones de residuos de aminoácidos con residuos de histidina. En algunos aspectos, la una o más sustituciones de residuos de aminoácidos con residuos de histidina se encuentran en una o más de las siguientes posiciones de aminoácidos: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 52, 53, 54, 66, 67, 68, 69, 74, 93, 96, 97, 98, 100, 4, 6, 27, 36, 39, 47, 48, 49, 50, 57, 60, 72, 74, 76, 92, 94, 103, con respecto a una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 3-12.
En algunas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a se une con al menos dos, al menos cuatro o al menos seis veces más afinidad por CD47 en células enfermas o en un sitio enfermo que en células no enfermas.
En algunas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a se une con al menos dos, al menos cuatro o al menos seis veces más afinidad por CD47 a pH ácido que a pH neutro.
En algunas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a se une con al menos dos, al menos cuatro o al menos seis veces más afinidad por CD47 en condiciones hipóxicas que en condiciones fisiológicas.
En algunas realizaciones, la célula enferma es una célula cancerosa de una enfermedad cancerosa.
En algunas realizaciones, el pH ácido es un pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 7.
En otro aspecto, la invención presenta una molécula de ácido nucleico que codifica una construcción de la variante de SIRP-a descrita en el presente documento.
En otro aspecto, la invención presenta un vector que incluye la molécula de ácido nucleico que codifica un constructo de la variante de SIRP-a descrita en el presente documento.
En otro aspecto, la invención presenta una célula huésped que expresa un constructo de la variante de SIRP-a descrita en este documento, en donde la célula huésped incluye una molécula de ácido nucleico que codifica un constructo de la variante de SIRP-a descrita en este documento o un vector que incluye la molécula de ácido nucleico, en donde el vector o la molécula de ácido nucleico se expresa en la célula huésped.
En otro aspecto, la invención presenta un método para preparar un constructo de la variante de SIRP-a descrita en este documento, en donde el método incluye: a) proporcionar una célula huésped que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica un constructo de la variante de SIRP-a descrita en este documento o un vector que incluye la molécula de ácido nucleico; b) expresar el vector o la molécula de ácido nucleico en la célula huésped en condiciones que permitan la formación del constructo de la variante de SIRP-a; y c) recuperar el constructo de la variante de SIRP-a.
En otro aspecto, la invención presenta una composición farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de un constructo de la variante de SIRP-a descrita en el presente documento, y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto, se describe en este documento un método para aumentar la fagocitosis de una célula diana en un sujeto que incluye administrar al sujeto un constructo de la variante de SIRP-a descrita en este documento o una composición farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de un constructo de la variante de SIRP-a descrito en este documento. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula cancerosa.
En otro aspecto, se describe en este documento un método para eliminar las células T reguladoras en un sujeto que incluye administrar al sujeto un constructo de la variante de SIRP-a descrita en este documento o una composición farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de un constructo de la variante de SIRP-a descrito en este documento.
En otro aspecto, se describe en este documento un método para matar una célula cancerosa, el método incluye poner en contacto la célula cancerosa con un constructo de la variante de SIRP-a descrita en este documento o la composición farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de un constructo de la variante de SIRP-a descrita en este documento.
En otro aspecto, se describe en el presente documento un método para tratar una enfermedad asociada con la actividad de SIRP-a y/o CD47 en un sujeto, el método incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del constructo de la variante de SIRP-a descrita en este documento o la composición farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de un constructo de la variante de SIRP-a descrita en este documento.
En otro aspecto, se describe en este documento un método para tratar una enfermedad asociada con la actividad de SIRP-a y/o CD47 en un sujeto, el método incluye: (a) determinar las secuencias de aminoácidos de SIRP-a del sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un constructo de la variante de SIRP-a descrita en el presente documento; en donde la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene la misma secuencia de aminoácidos que la de un SIRP-a del sujeto.
En otro aspecto, se describe en este documento un método para tratar una enfermedad asociada con la actividad de SIRP-a y/o CD47 en un sujeto, el método incluye: (a) determinar las secuencias de aminoácidos de SIRP-a del sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un constructo de la variante de SIRP-a descrita en el presente documento; en el que la variante de SIRP-a en el constructo de variante de SIRP-a tiene la misma secuencia de aminoácidos que la de una SIRP-a del sujeto.
En otro aspecto, se describe en este documento un método para tratar una enfermedad asociada con la actividad de SIRP-a y/o CD47 en un sujeto, el método incluye: administrar al sujeto un constructo de la variante de SIRP-a descrita en este documento, en donde el constructo de la variante de SIRP-a se une preferentemente a CD47 en células enfermas o en un sitio enfermo sobre CD47 en células no enfermas.
En algunas realizaciones, la enfermedad es cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre cáncer de tumor sólido, cáncer hematológico, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, mieloma múltiple, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de cuello de útero, cáncer de endometrio, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de hígado, cáncer de ovarios, cáncer de colon y recto, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de vesícula biliar, cáncer de tumor del estroma gastrointestinal, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de orofaringe, cáncer de esófago, melanoma, cáncer no melanoma de piel, carcinoma de células de Merkel, cáncer inducido por virus, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de células renales, cáncer de pelvis renal, leucemia, linfoma, sarcoma, glioma, tumor cerebral, y carcinoma. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de tumor sólido. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer hematológico.
En algunos aspectos, la enfermedad es una enfermedad inmunológica. En algunos aspectos, la enfermedad inmunológica es una enfermedad autoinmune o una enfermedad inflamatoria. En algunos aspectos, la enfermedad autoinmune o inflamatoria es esclerosis múltiple, artritis reumatoide, una espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, una enfermedad inflamatoria o autoinmune mediada por anticuerpos, enfermedad de injerto contra huésped, sepsis, diabetes, psoriasis, aterosclerosis, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica progresiva, esclerodermia, síndrome coronario agudo, reperfusión isquémica, enfermedad de Crohn, endometriosis, glomerulonefritis, miastenia grave, fibrosis pulmonar idiopática, asma, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), vasculitis o miositis inflamatoria autoinmune.
En otro aspecto, se describe en este documento un método para aumentar el injerto de células madre hematopoyéticas en un sujeto que incluye modular la interacción entre SIRP-a y CD47 en el sujeto administrando al sujeto una variante de SIRP-a descrita en este documento o una composición farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de una variante de SIRP-a descrita en el presente documento.
En otro aspecto, se describe en este documento un método para alterar una respuesta inmune en un sujeto que incluye administrar al sujeto un constructo de la variante de SIRP-a descrita en este documento o una composición farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de un constructo de la variante de SIRP-a descrita en este documento, alterando de ese modo la respuesta inmune en el sujeto. En algunos aspectos, la respuesta inmune incluye la supresión de la respuesta inmune.
En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, preferiblemente el mamífero es un ser humano.
Definiciones
Como se usa en el presente documento, los términos "células enfermas" y "tejido enfermo" se refieren, por ejemplo, a células y tejidos cancerosos. En particular, el cáncer puede ser un cáncer de tumor sólido o un cáncer hematológico. Por ejemplo, si el cáncer es un cáncer de tumor sólido, las células enfermas son las células del tumor sólido. Las células enfermas a menudo viven en condiciones características de un sitio enfermo, como pH ácido e hipoxia. Las "células enfermas" y el "tejido enfermo" también pueden asociarse con otras enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, cáncer. Las "células enfermas" y el "tejido enfermo" también pueden asociarse con una enfermedad o trastorno inmunológico, una enfermedad o trastorno cardiovascular, una enfermedad o trastorno metabólico o una enfermedad o trastorno proliferativo. Un trastorno inmunológico incluye una enfermedad o trastorno inflamatorio y una enfermedad o trastorno autoinmune.
Como se usa en este documento, el término "células no enfermas" se refiere a células normales y sanas del cuerpo. Las células no enfermas a menudo viven en condiciones fisiológicas, como pH neutro y concentración de oxígeno adecuada que mantienen el metabolismo normal y las funciones reguladoras de las células.
Como se usa en este documento, el término "sitio enfermo" se refiere a la ubicación o área próxima a la ubicación de la enfermedad en el cuerpo. Por ejemplo, si la enfermedad es un cáncer de tumor sólido localizado en el hígado, entonces el sitio enfermo es el sitio del tumor en el hígado y áreas cercanas al tumor en el hígado. Las células en un sitio enfermo pueden incluir células enfermas así como células que apoyan la enfermedad en el sitio enfermo. Por ejemplo, si el sitio enfermo es el sitio de un tumor, las células en el sitio del tumor incluyen tanto células enfermas (p. ej., células tumorales) como células que apoyan el crecimiento tumoral en el sitio del tumor. De manera similar, el término "sitio del cáncer" se refiere a la ubicación del cáncer en el cuerpo.
Como se usa en el presente documento, el término "dominio D1 de SIRP-a" o "dominio D1" se refiere al dominio extracelular distal de la membrana de SIRP-a. El dominio D1 de SIRP-a se encuentra en el extremo N-terminal de una SIRP-a de tipo salvaje de longitud completa y media la unión a CD47. Las secuencias de aminoácidos de los dominios D1 se muestran en la Tabla 1.
Como se usa en el presente documento, el término "dominio D2 de SIRP-a" o "dominio D2" se refiere al segundo dominio extracelular de SIRP-a. El dominio D2 de SIRP-a incluye aproximadamente los aminoácidos 119 a 220 de un SIRP-a de tipo salvaje de longitud completa.
Como se usa en el presente documento, el término "dominio D3 de SIRP-a" o "dominio D3" se refiere al dominio extracelular distal de la membrana de SIRP-a. El dominio D3 de SIRP-a incluye aproximadamente los aminoácidos 221 a 320 de un SIRP-a de tipo salvaje de longitud completa.
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido SIRP-a" se refiere a un SIRP-a de tipo salvaje así como a una variante de SIRP-a, ya que cada término se define y describe en el presente documento.
Como se usa en este documento, el término "variante de SIRP-a" se refiere a un polipéptido que contiene un dominio D1 de SIRP-a, o una porción de unión a CD47 de un SIRP-a de longitud completa. En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a tiene al menos 80% (p. ej., al menos 85 %, 87 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %) de identidad de secuencia con una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 3-12 y 24-34. En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a tiene mayor afinidad por CD47 que una SIRP-a de tipo salvaje. En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a contiene una porción de SIRP-a humano de tipo salvaje (preferiblemente una porción de unión a CD47 del SIRP-a de tipo salvaje) y/o tiene una o más sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, una variante de SIRP-a puede contener sustituciones de uno o más (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, etc., con un máximo de 20) residuos de aminoácidos relativos a un SIRP-a de tipo salvaje. Por ejemplo, una variante de SIRP-a puede contener sustituciones de uno o más (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, etc., con un máximo de 20) residuos de aminoácidos con residuos de histidina. En algunas realizaciones, las variantes de SIRP-a tienen una porción que tiene al menos 80% (p. ej., al menos 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de SIRP-a humano de tipo salvaje o con cualquiera de las variantes de SIRP-a descritas en el presente documento (p. ej., con una secuencia de una porción de unión a CD47 de SIRP-a humano de tipo salvaje). Una porción de unión a c D47 de SIRP-a de tipo salvaje incluye el dominio D1 de SIRP-a de tipo salvaje (una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 3-12).
Como se usa en este documento, el término "constructo de la variante de SIRP-a" se refiere a un polipéptido que contiene una variante de SIRP-a unida a, por ejemplo, un péptido bloqueante, un monómero de dominio Fc, una h Sa , un péptido de unión a albúmina, un polímero , un péptido de unión a anticuerpos, un anticuerpo. En algunas realizaciones, un constructo de la variante de SIRP-a tiene actividad preferencial en un sitio enfermo. En algunas realizaciones, los constructos de las variantes de SIRP-a actividad preferencia en un sitio de enfermedad e incluyen una variante de IRP-a que tiene una porción que tiene al menos 80% (p. ej., al menos 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de SIRP-a humano de tipo salvaje o con cualquiera de las variantes de SIRP-a descritas en el presente documento (p. ej., con una secuencia de una porción de unión a CD47 de SIRP-a humano de tipo salvaje).
Como se usa en este documento, el término "porcentaje (%) de identidad" se refiere al porcentaje de residuos de aminoácido (o ácido nucleico) de una secuencia candidata, p. ej., una variante de SIRP-a, que son idénticos a los residuos de aminoácido (o ácido nucleico) de una secuencia de referencia, p. ej. una SIRP-a humana de tipo salvaje o una porción de unión a CD47 de la misma, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad (es decir, se pueden introducir huecos en una o ambas de las secuencias candidatas y de referencia para una óptima alineación y las secuencias no homólogas pueden descartarse con fines de comparación). La alineación a efectos de determinar el porcentaje de identidad se puede lograr de varias maneras conocidas para el experto en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de software informático disponible al público, tal como el software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima en la longitud completa de las secuencias que se están comparando. En algunas realizaciones, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de una secuencia candidata dada a, con o frente a una secuencia de referencia dada (que alternativamente puede expresarse como una secuencia candidata dada que tiene o incluye un cierto porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) a, con o frente a una secuencia de referencia dada) se calcula de la siguiente manera:
100 x (fraction of A/B)
donde A es el número de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) puntuados como idénticos en la alineación de la secuencia candidata y la secuencia de referencia, y donde B es el número total de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en la secuencia de referencia. En algunas realizaciones donde la longitud de la secuencia candidata no es igual a la longitud de la secuencia de referencia, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de la secuencia candidata a la secuencia de referencia no sería igual al porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de la secuencia de referencia a la secuencia candidata.
En realizaciones particulares, una secuencia de referencia alineada para fines de comparación con una secuencia candidata puede mostrar que la secuencia candidata exhibe del 50% al 100% de identidad en toda la longitud de la secuencia candidata o una porción seleccionada de residuos de aminoácidos contiguos (o ácidos nucleicos ) de la secuencia candidata. La longitud de la secuencia candidata alineada para fines de comparación es al menos 30%, p. ej., al menos 40%, p. ej., al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Cuando una posición en la secuencia candidata está ocupada por el mismo residuo de aminoácido (o ácido nucleico) que la posición correspondiente en la secuencia de referencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición.
Como se usa en este documento, el término "proteasa asociada a tumor" o "enzima tumoral" se refiere a una enzima, p. ej., una proteasa, que está presente en un nivel aumentado en un cáncer, p. ej., un cáncer de tumor sólido. En algunas realizaciones, la proteasa asociada a tumores puede escindir un enlazador escindible.
Como se usa en este documento, el término "péptido bloqueante" se refiere a un péptido que puede unirse a una variante de SIRP-a y bloquear o "enmascarar" la porción de unión a CD47 de la variante de slRP-a. En un constructo de la variante de SIRP-a, el péptido bloqueante puede unirse a una variante de SIRP-a por medio de un enlazador que es opcionalmente escindible, y opcionalmente uno o más espaciadores. El péptido bloqueante puede acoplarse mediante enlaces no covalentes a la variante de SIRP-a y escindirse en un sitio enfermo o célula enferma. En algunas realizaciones, el péptido bloqueante puede unirse a una SIRP-a de tipo salvaje en el sitio enfermo o célula enferma. Puede usarse un péptido bloqueante para reducir o minimizar la unión de la variante de SIRP-a con CD47 de tipo salvaje en condiciones fisiológicas normales o en un sitio no enfermo. En algunas realizaciones, el péptido bloqueante tiene una mayor afinidad de unión a una SIRP-a de tipo salvaje que a una variante de SIRP-a. El péptido bloqueante puede disociarse de la variante de SIRP-a para unirse a una SIRP-a de tipo salvaje en, p. ej., un sitio enfermo o en condiciones no fisiológicas. Un ejemplo de péptido bloqueante es un péptido bloqueante basado en CD47, que es un péptido derivado de CD47 o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, un péptido bloqueante basado en c D47 es la porción extracelular de unión a SIRP-a de CD47 (es decir, el dominio IgSF de CD47). En algunas realizaciones, un péptido bloqueante basado en CD47 incluye una o más sustituciones, adiciones, y/o deleciones de aminoácidos relativas al CD47 de tipo salvaje.
Como se usa en este documento, el término "enlazador escindible" se refiere a un enlazador entre dos porciones de un constructo de la variante de SIRP-a. En algunas realizaciones, un enlazador escindible puede unir covalentemente un péptido bloqueante a una variante de SIRP-a para bloquear la unión de la variante de SIRP-a a CD47 en condiciones fisiológicas. En algunas realizaciones, puede instalarse un enlazador escindible dentro de un péptido bloqueante, que puede estar asociado de forma no covalente con la variante de SIRP-a para bloquear la unión de la variante de SIRP-a a CD47 en condiciones fisiológicas. Un enlazador escindible se puede escindir en determinadas condiciones. Si el enlazador escindible está dentro de un péptido bloqueante, la escisión del enlazador inactivaría el péptido bloqueante. El enlazador escindible contiene un resto que actúa para escindir o inducir la escisión del enlazador en condiciones características de un sitio enfermo, tal como un sitio canceroso, p. ej., dentro de un tumor sólido. El enlazador escindible es estable en condiciones fisiológicas saludables (p. ej., pH neutro y concentración de oxígeno adecuada). El resto puede ser un grupo funcional químico sensible al pH (p. ej., acetales, cetales, tiomaleamatos, hidrazonas, enlaces disulfuro) capaz de hidrolizarse a pH ácido. El resto también puede ser un grupo funcional químico sensible a la hipoxia (p. ej., quinonas, N-óxidos y grupos nitro heteroaromáticos) o un aminoácido capaz de reducirse en condiciones hipóxicas. El resto en el enlazador escindible también puede ser un sustrato proteico capaz de ser reconocido y escindido por una proteasa, enzima o peptidasa asociada al tumor.
Como se usa en este documento, el término "espaciador" se refiere a un enlace covalente o no covalente entre dos porciones de un constructo de la variante de SIRP-a, tal como el enlazador (p. ej., enlazador escindible) y la variante de SIRP-a, o el péptido de unión a anticuerpos y la variante de SIRP-a. Preferiblemente, el espaciador es un enlace covalente. Un espaciador puede ser un enlace químico simple, p. ej., un enlace amida, o una secuencia de aminoácidos (p. ej., una secuencia de 3-200 aminoácidos). Un espaciador de aminoácidos es parte de la secuencia primaria de un polipéptido (p. ej., unido a los polipéptidos espaciados o dominios polipeptídicos a través de la estructura polipeptídica). Un espaciador proporciona espacio y/o flexibilidad entre las dos porciones. Un espaciador es estable en condiciones fisiológicas (p. ej., pH neutro y concentración de oxígeno adecuada) así como en condiciones características de un sitio enfermo, p. ej., pH ácido e hipoxia. Un espaciador es estable en un sitio enfermo, tal como un sitio de cáncer, p. ej., dentro de un tumor. Las descripciones de los espaciadores se proporcionan con más detalle en este documento.
Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos intactos, fragmento de anticuerpo, con la condición de que presenten la actividad biológica deseada, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos y anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos) formado a partir de al menos dos anticuerpos intactos. Preferiblemente, el anticuerpo es específico de una célula enferma, p. ej., una célula tumoral. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse específicamente a una proteína de la superficie celular en una célula enferma, p. ej., una célula tumoral.
Como se usa en este documento, el término "péptido que se une a albúmina" se refiere a una secuencia de aminoácidos de 12 a 16 aminoácidos que tiene afinidad por y funciona para unirse a la albúmina sérica. Un péptido de unión a albúmina puede ser de diferentes orígenes, p. ej., humano, ratón o rata. En algunas realizaciones de la presente invención, un constructo de la variante de SIRP-a puede incluir un péptido de unión a albúmina que se fusiona al extremo C-terminal de la variante de SIRP-a para aumentar la vida media en suero de la variante de SIRP-a. Un péptido que se une a la albúmina se puede fusionar, ya sea directamente o mediante un espaciador, a la variante de SIRP-a.
Como se usa en el presente documento, el término "albúmina de suero humano (HSA)" se refiere a la proteína de albúmina presente en el plasma sanguíneo humano. La albúmina de suero humano es la proteína más abundante en la sangre. Constituye aproximadamente la mitad de las proteínas del suero sanguíneo. En algunas realizaciones, una albúmina de suero humano tiene la secuencia de aminoácidos 25-609 (SEQ ID NO: 67) de UniProt ID NO: P02768. En algunas realizaciones, una albúmina de suero humano contiene además C34S en relación con la secuencia de SEQ ID NO: 67.
Como se usa en el presente documento, el término "monómero de dominio Fc" se refiere a una cadena polipeptídica que incluye dominios constantes de anticuerpo segundo y tercero (Ch2 y Ch3). En alguna realización, el monómero del dominio Fc también incluye un dominio bisagra. El monómero del dominio Fc puede ser cualquier isotipo de anticuerpo de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgE, IgM, IgA o IgD. Además, el monómero del dominio Fc puede ser un subtipo de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgG4). Un monómero de dominio Fc no incluye ninguna porción de una inmunoglobulina que sea capaz de actuar como una región de reconocimiento de antígenos, p. ej., un dominio variable o una región determinante de complementariedad (CDR). Los monómeros de dominio Fc pueden incluir hasta diez cambios de una secuencia de monómero de dominio Fc de tipo salvaje (p. ej., sustituciones, adiciones o deleciones de 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 aminoácidos) que alteran la interacción entre un dominio Fc y un receptor Fc. Los ejemplos de estas clases son conocidos en la técnica.
Como se usa en este documento, el término "dominio Fc" se refiere a un dímero de dos monómeros del dominio Fc. En el dominio Fc de tipo salvaje, los dos monómeros del dominio Fc se dimerizan mediante la interacción entre los dos dominios constantes del anticuerpo Ch3, así como uno o más enlaces disulfuro que se forman entre los dominios bisagra de los dos monómeros del dominio Fc dimerizantes. En algunas realizaciones, un dominio Fc puede mutar para carecer de funciones efectoras, típicas de un "dominio Fc muerto". En determinadas realizaciones, cada uno de los monómeros del dominio Fc en un dominio Fc incluye sustituciones de aminoácidos en el dominio constante del anticuerpo Ch2 para reducir la interacción o unión entre el dominio Fc y un receptor Fcy.
Como se usa en este documento, el término "afinidad" o "afinidad de unión" se refiere a la fuerza de la interacción de unión entre dos moléculas. Generalmente, afinidad de unión se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre una molécula y su compañero de unión, tal como una variante de SIRP-a y CD47. A menos que se indique lo contrario, afinidad de unión se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión. La afinidad de unión entre dos moléculas se describe comúnmente mediante la constante de disociación (Kd) o la constante de afinidad (Ka). Dos moléculas que tienen baja afinidad de unión entre sí generalmente se unen lentamente, tienden a disociarse fácilmente y presentan una gran kd. Dos moléculas que tienen una alta afinidad entre sí generalmente se unen fácilmente, tienden a permanecer unidas más tiempo y presentan una Kd pequeña. LaKD de dos moléculas que interactúan puede determinarse usando métodos y técnicas bien conocidos en la técnica, p. ej., resonancia de plasmón superficial. Kd se calcula como la relación de koff/kon.
Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a un vehículo que incluye los componentes celulares necesarios, p. ej., orgánulos, necesarios para expresar proteínas a partir de sus ácidos nucleicos correspondientes. Los ácidos nucleicos se incluyen típicamente en vectores de ácidos nucleicos que pueden introducirse en la célula huésped mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica (p. ej., transformación, transfección, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, etc.). Una célula huésped puede ser una célula procariota, p. ej., una célula bacteriana, o una célula eucariota, p. ej., una célula de mamífero (p. ej., una célula CHO). Como se describe en el presente documento, se usa una célula huésped para expresar una o más constructos de variante de SIRP-a.
Como se usa en este documento, el término "composición farmacéutica" se refiere a una formulación medicinal o farmacéutica que contiene un ingrediente activo así como excipientes y diluyentes para permitir que el ingrediente activo sea adecuado para el método de administración. La composición farmacéutica de la presente invención incluye componentes farmacéuticamente aceptables que son compatibles con el constructo de la variante de SIRP-a. La composición farmacéutica puede estar en forma de tableta o cápsula para administración oral o en forma acuosa para administración intravenosa o subcutánea.
Como se usa en este documento, el término "enfermedad asociada con actividad de SIRP-a y/o CD47 "se refiere a cualquier enfermedad o trastorno causado por y/o relacionado con la actividad de SIRP-a y/o CD47. Por ejemplo, cualquier enfermedad o trastorno causado por y/o relacionado con el aumento y/o disminución de la actividad de SIRP-a y/o CD47. Ejemplos de enfermedades asociadas con la actividad de SIRP-a y/o de CD47 incluye, pero no se limita a, cánceres y enfermedades inmunológicas (p. ej., enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias).
Como se usa en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un constructo de la variante de SIRP-a de la invención o una composición farmacéutica que contiene un constructo de la variante de SIRP-a de la invención efectiva para lograr el efecto terapéutico deseado en el tratamiento de una paciente que tiene una enfermedad, tal como un cáncer, p. ej., un tumor sólido o un cáncer hematológico. En particular, la cantidad terapéuticamente efectiva del constructo de la variante de SIRP-a evita los efectos secundarios adversos.
Como se usa en este documento, el término "afinidad optimizada" o "afinidad de unión optimizada" se refiere a una fuerza optimizada de la interacción de unión entre una variante de SIRP-a y CD47. En algunas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a se une principalmente o con mayor afinidad a CD47 en células en un sitio enfermo (es decir, células cancerosas) y no se une sustancialmente o se une con menor afinidad a CD47 en células en un sitio no enfermo. (es decir, células no cancerosas). La afinidad de unión entre la variante de SIRP-a y CD47 se optimiza de manera que la interacción no causa toxicidad clínicamente relevante. En algunas realizaciones, para conseguir una afinidad de unión optimizada entre la variante de SIRP-a y CD47, la variante de SIRP-a puede desarrollarse para tener una afinidad de unión a CD47 más baja que la que se puede alcanzar al máximo.
Como se usa en el presente documento, el término "inmunogenicidad" se refiere a la propiedad de una proteína (p. ej., una proteína terapéutica) que provoca una respuesta inmune en el huésped como si fuera un antígeno extraño. La inmunogenicidad de una proteína se puede ensayar in vitro en una variedad de formas diferentes, en particular a través de ensayos de proliferación de células T in vitro (ver, p. ej., Jawa et al., Clinical Immunology 149:534-555, 2013), algunos de los cuales están disponibles comercialmente (ver, p. ej., los servicios de análisis de inmunogenicidad ofrecidos por Proimmune).
Como se usa en este documento, el término "inmunogenicidad mínima" se refiere a la inmunogenicidad de una proteína (p. ej., una proteína terapéutica) que ha sido modificada, es decir, mediante sustituciones de aminoácidos, para que sea menor (p. ej., al menos 10%, 25%, 50%, o 100% más bajo) de lo que podría haber sido antes de que se introdujeran las sustituciones de aminoácidos. Una proteína (p. ej., una proteína terapéutica) se modifica para que tenga una inmunogenicidad mínima, lo que significa que provoca muy poca o ninguna respuesta inmunitaria del huésped, aunque sea un antígeno extraño.
Como se usa en este documento, el término "farmacocinética optimizada" se refiere a que los parámetros que están generalmente asociados con la farmacocinética de una proteína se mejoran y modifican para producir una proteína optimizada para uso in vitro y/o in vivo. Los parámetros que están asociados con la farmacocinética de una proteína son bien conocidos por un experto en la materia, que incluyen, por ejemplo, kd, valencia y semivida. En la presente invención, la farmacocinética de un constructo de la variante de SIRP-a de la invención se optimiza para su interacción con CD47 para uso en un contexto terapéutico.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra una parte de la estructura cocristalizada de CD47:SIRP-a (PDB: 4KJY, 4CMM), el N-terminal de CD47 existe como un piro-glutamato y hace interacciones de enlace de hidrógeno con Thr66 de una variante de SIRP-a o Leu66 de una SIRP-a de tipo salvaje.
La Figura 2 muestra modelos de cálculo del sitio de interacción entre CD47 que tiene T102Q y una SIRP-a de tipo salvaje que tiene A27 (izquierda) y el sitio de interacción entre CD47 que tiene T102Q y una variante de SIRP-a que tiene I27.
La Figura 3 muestra una SDS-PAGE de constructos de variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 48-56).
La Figura 4A muestra una SDS-PAGE del constructo de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 54) después de la escisión in vitro con uPA y matriptasa.
La Figura 4B muestra una SDS-PAGE del constructo de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 54) después de la escisión in vitro con diferentes cantidades de matriptasa.
La Figura 4C muestra una SDS-PAGE de diversos constructos de variantes de SIRP-a (SEQ ID NO: 57-63) después de la escisión in vitro con matriptasa.
La Figura 5A muestra un gráfico de barras que ilustra las diferentes afinidades de unión de diversos constructos de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 48-55) a CD47 antes y después de la escisión in vitro con matriptasa.
La Figura 5B muestra un gráfico de barras que ilustra las diferentes afinidades de unión de diversos constructos de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 52-63) y la variante de SIRP-a (SEQ ID No: 31) a CD47 antes y después de la escisión in vitro con matriptasa.
La Figura 6 muestra un sensorgrama que demuestra que un constructo de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 66) puede unirse a Cetuximab y CD47 simultáneamente.
La Figura 7A muestra un esquema del complejo cuaternario que contiene EGFR, Cetuximab, un constructo de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 66) y CD47.
La Figura 7B muestra un sensorgrama que demuestra la formación del complejo cuaternario mostrado en la Figura La Figura 7C es una imagen del sensorgrama mostrado en la Figura 7B.
La Figura 8 es un gráfico de dispersión que muestra la fagocitosis inducida por el constructo de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 66) y la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 31).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención presenta constructos de la variante de la proteína reguladora de la señal a (SIRP-a) que tienen actividad preferencial en un sitio enfermo (p. ej., en el sitio de un tumor que en un sitio no enfermo). En determinadas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a tienen una mayor afinidad de unión a CD47 en células enfermas (p. ej., células tumorales). En algunas realizaciones, las variantes de SIRP-a pueden contener una o más sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, los aminoácidos pueden sustituirse con residuos de histidina. En algunas realizaciones, los aminoácidos pueden sustituirse con otros residuos aminoácido que no son de histidina. En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a se unen con mayor afinidad a CD47 en células enfermas o en un sitio enfermo que en células no enfermas y en condiciones características de un sitio enfermo, como un sitio canceroso, p. ej., en el sitio de o dentro de un tumor. En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a se unen con mayor afinidad a CD47 a pH ácido (p. ej., menos de alrededor de pH 7) y/o en condiciones hipóxicas que en condiciones fisiológicas. En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a incluyen una variante de SIRP-a y un péptido bloqueante; se evita que la variante de SIRP-a se una a CD47 mediante el péptido bloqueante a menos que se encuentren en condiciones características de un sitio enfermo. En algunas realizaciones, las variantes de SIRP-a se fusionan con un monómero de dominio Fc, una albúmina de suero humano (HSA), un péptido de unión a albúmina o un polímero (p. ej., un polímero de polietilenglicol (PEG)). En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a tienen su inmunogenicidad, afinidad, y/o farmacocinética optimizada para uso en un contexto terapéutico. En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a se dirigen preferentemente a sitios enfermos, p. ej., un tumor, por medio de un resto de direccionamiento, por ejemplo, un anticuerpo específico de la diana. La invención presenta métodos y composiciones farmacéuticas que contienen constructos de variante de SIRP-a para tratar diversas enfermedades, tales como cáncer, preferiblemente tumores sólidos o cáncer hematológico, así como métodos para matar células cancerosas y métodos para fabricar constructos de variante de SIRP-a y composiciones farmacéuticas que contienen tales constructos de variante de SIRP-a.
En algunas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a incluye una variante de SIRP-a unida a un péptido bloqueante. En algunas realizaciones, la unión preferencial de la variante de SIRP-a en el constructo de la variante SIRP-a a CD47 en células enfermas o sitios enfermos puede obtenerse uniendo el péptido bloqueante a la variante de SIRP-a mediante el uso de un enlazador escindible, que se escinde en las células enfermas o en los sitios enfermos. En algunas realizaciones, la unión preferencial de la variante SIRP-a en el constructo de la variante SIRP-a a CD47 en células enfermas o sitios enfermos puede obtenerse uniendo el péptido bloqueante a la variante de SIRP-a, en donde el péptido bloqueante puede separarse o simplemente disociarse de la variante de SIRP-a en las células enfermas o en los sitios enfermos.
I. Variantes de SIRP-a
Existen al menos diez variantes naturales de SIRP-a humano de tipo salvaje. Las secuencias de aminoácidos de los dominios D1 de las diez variantes de SIRP-a humana de tipo salvaje se muestran en las SEQ ID NOs: 3-12 (véase la Tabla 1). En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a tiene al menos 80% (p. ej., al menos 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia con una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 3-12. La Tabla 2 enumera las posibles sustituciones de aminoácidos en cada variante del dominio D1 (SEQ ID NOs: 13-23). En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a se une con una afinidad de unión optimizada a CD47. En algunas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a que incluye una variante de SIRP-a se une principalmente o con mayor afinidad a CD47 en células cancerosas y no se une sustancialmente o se une con menor afinidad a CD47 en células no cancerosas. En algunas realizaciones, la afinidad de unión entre el constructo de la variante de SIRP-a y CD47 se optimiza de manera que la interacción no causa toxicidad clínicamente relevante. En algunas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a tiene una inmunogenicidad mínima. En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a tiene los mismos aminoácidos que la del polipéptido de SIRP-a en una muestra biológica del sujeto, excepto por los cambios de aminoácidos introducidos para aumentar la afinidad de la variante SIRP-a. Las técnicas y métodos para generar variantes de SIRP-a y determinar sus afinidades de unión a CD47 se describen con más detalle en el presente documento.
La Tabla 2 enumera las sustituciones de aminoácidos específicas en una variante de SIRP-a, en relación con cada secuencia de variante del dominio D1. Una variante de SIRP-a puede incluir una o más (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez) de las sustituciones enumeradas en la Tabla 2. En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a incluye como máximo diez sustituciones de aminoácidos con respecto a un dominio D1 de tipo salvaje. En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a incluye como máximo siete sustituciones de aminoácidos con respecto a un dominio D1 de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a es una variante de SIRP-a quimérica que incluye una porción de dos o más variantes de dominio D1 de tipo salvaje (p. ej., una porción de una variante de dominio D1 de tipo salvaje y una porción de otra variante de dominio D1 de tipo salvaje). En algunas realizaciones, una variante quimérica de SIRP-a incluye al menos dos porciones (p. ej., tres, cuatro, cinco, etc.) de variantes de dominio D1 de tipo salvaje, en
donde cada una de las porciones es de una variante de dominio D1 de tipo salvaje diferente . En algunas realizaciones,
una variante de SIRP-a quimérica incluye además una o más sustituciones de aminoácidos enumeradas en la Tabla
2. En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a tiene al menos 80% (p. ej., al menos 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia con una secuencia de una cualquiera de las SEQ
ID NOs: 24-34 en la Tabla 3.
Tabla 1. Secuencias de dominios D1 de SIRP-a de tipo salvaje
Figure imgf000013_0002
Figure imgf000013_0003
Tabla 2. Sustituciones de aminoácidos en una variante de SIRP-a, en relación con cada variante de dominio D1
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Tabla 3. SEQ ID NOs: 24-34
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000016_0001
Deseablemente, los constructos de la variante de SIRP-a de la invención se unen con mayor afinidad a CD47 en condiciones características de un sitio enfermo, tal como un sitio de cáncer, p. ej., dentro de un tumor, que en condiciones fisiológicas (p. ej., pH neutro y adecuada concentración de oxígeno). Las condiciones características de un sitio enfermo, tal como un sitio de cáncer, p. ej., dentro de un tumor, son, p. ej., pH ácido e hipoxia. En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a de la invención pueden diseñarse para unirse preferentemente a células enfermas sobre células no enfermas. En particular, las células de la enfermedad pueden ser células cancerosas de una enfermedad cancerosa, p. ej., un tumor sólido o un cáncer hematológico. Preferiblemente, los constructos de la variante de SIRP-a se unen con mayor afinidad a CD47 a pH ácido (p. ej., menos de alrededor de pH 7) que a pH neutro, p. ej., pH 7,4. Preferiblemente, los constructos de la variante de SIRP-a se unen con mayor afinidad a CD47 en condiciones hipóxicas que en condiciones con una concentración de oxígeno adecuada. En algunas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a incluye una variante de SIRP-a unida a un péptido bloqueante. En algunas realizaciones, la unión preferencial de la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a a CD47 en células enfermas o sitios enfermos puede obtenerse uniendo el péptido bloqueante a la variante de SIRP-a mediante el uso de un enlazador escindible, que se escinde en las células enfermas o en sitios enfermos. En algunas realizaciones, la unión preferencial de la variante SIRP-a en el constructo de la variante SIRP-a a CD47 en células enfermas o sitios enfermos puede obtenerse uniendo el péptido bloqueante a la variante de SIRP-a, en donde el péptido bloqueante puede separarse o simplemente disociarse de la variante de SIRP-a en las células enfermas o en los sitios enfermos.
En algunas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a incluye una variante de SIRP-a unida a un péptido bloqueante. En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a puede unirse a un péptido bloqueante a través de un enlazador (p. ej., un enlazador escindible). El péptido bloqueante sirve para bloquear el sitio de unión de CD47 de la variante de SIRP-a para evitar la unión de la variante de SIRP-a a CD47 en condiciones fisiológicas (p. ej., pH neutro y concentración de oxígeno adecuada). El enlazador escindible es un enlazador capaz de escindirse solo en condiciones características de un sitio enfermo (tal como un sitio canceroso, p. ej., dentro de un tumor), como pH ácido e hipoxia. En algunas realizaciones, el enlazador escindible es escindido por una proteasa asociada a un tumor en un sitio enfermo. En algunas realizaciones, el enlazador no se escinde y el péptido bloqueante simplemente se disocia de la variante de SIRP-a en un sitio enfermo de manera que la variante de SIRP-a está libre para unirse a CD47 cercano en células enfermas, p. ej., células tumorales. Por lo tanto, solo cuando la variante de SIRP-a se encuentre en un sitio enfermo, se liberaría del péptido bloqueante y estaría libre para unirse a CD47 cercano en células enfermas, p. ej., células tumorales. Los péptidos bloqueantes y los enlazadores (p. ej., enlazadores escindibles) se describen con más detalle en este documento.
En algunas realizaciones, un constructo de la variante de SIRP-a incluye una variante de SIRP-a y un resto de direccionamiento. En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a puede unirse a un resto de direccionamiento, como un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo específico de tumor, u otra proteína o péptido, p. ej., un péptido de unión a anticuerpo, que presenta afinidad de unión a una célula enferma. Después de la administración, el anticuerpo específico del tumor o el péptido de unión al anticuerpo sirve como un resto de direccionamiento para llevar la variante de SIRP-a al sitio enfermo, tal como un sitio de cáncer, p. ej., dentro de un tumor sólido, donde el SIRP-a puede interactuar. específicamente con CD47 en células enfermas. En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a puede fusionarse con una proteína o péptido, p. ej., un péptido que se une a un anticuerpo, capaz de unirse a un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo específico de tumor), es decir, unirse a una región constante o variable del anticuerpo. Las variantes de SIRP-a capaces de unirse a uno o más anticuerpos se describen con más detalle en el presente documento. En otras realizaciones, otras variantes de SIRP-a, tales como las descritas en la publicación internacional No. WO2013109752, pueden unirse a un anticuerpo específico de tumor o a una proteína o péptido, p. ej., un péptido de unión a anticuerpo, capaz de unirse a un anticuerpo específico de tumor. En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a puede unirse al anticuerpo in vitro (antes de la administración a un ser humano) o in vivo (después de la administración).
En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a puede incluir además un dominio D2 y/o D3 de una SIRP-a humana de tipo salvaje. En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a puede unirse a un monómero de dominio Fc, una albúmina de suero humano (HSA), una proteína o péptido de unión a suero, o una molécula orgánica, p. ej., un polímero (p. ej., un polietilenglicol (PEG)), con el fin de mejorar las propiedades farmacocinéticas de la variante de SIRP-a, p. ej., aumentar la vida media en suero. Los monómeros del dominio Fc, las proteínas HSA, las proteínas o péptidos de unión a suero y las moléculas orgánicas tales como un PEG que sirven para aumentar la vida media en suero de las variantes de SIRP-a de la invención se describen con más detalle en el presente documento. En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a no incluye la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NOs: 3-12 y 24-34.
II. Sustituciones de aminoácidos con residuos de histidina en variantes de SIRP-a
En algunas realizaciones, además de las sustituciones de aminoácidos en una variante de SIRP-a enumerada en la Tabla 2, la variante de SIRP-a puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos con residuos de histidina. Los constructos de la variante de SIRP-a que incluyen una variante de SIRP-a se unen con mayor afinidad a CD47 en células enfermas o en un sitio enfermo que en células no enfermas y en condiciones características de un sitio enfermo (p. ej., pH ácido, hipoxia) que en condiciones fisiológicas. Los residuos de aminoácidos que se van a sustituir por residuos de histidina pueden identificarse utilizando mutagénesis de barrido de histidina, estructuras de cristal de proteínas y métodos de diseño y modelado computacionales. Las técnicas y métodos que pueden usarse para generar variantes de SIRP-a y las formas para determinar sus afinidades de unión a CD47 en células enfermas y no enfermas se describen con más detalle en el presente documento. Las sustituciones de residuos de histidina pueden estar ubicadas en la interfaz de una variante de SIRP-a y CD47 o pueden estar en regiones internas de una variante de SIRP-a. Preferiblemente, las sustituciones de residuos de histidina se encuentran en la interfaz de una variante de SIRP-a y CD47. La Tabla 4 enumera aminoácidos SIRP-a específicos que pueden sustituirse con residuos de histidina. La numeración de aminoácidos en la Tabla 4 es relativa a la secuencia de SEQ ID NO: 3; uno o más aminoácidos en las posiciones correspondientes en una cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 4-12 también pueden estar sustituido con residuos de histidina. Los residuos de contacto son los aminoácidos ubicados en la interfaz de una variante de SIRP-a y CD47. Los residuos del núcleo son los aminoácidos internos que no participan directamente en la unión entre una variante de SIRP-a y CD47. Las variantes de SIRP-a pueden incluir una o más (p. ej., una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, etc., o todas) de las sustituciones enumeradas en la Tabla 4. Las variantes de SIRP-a pueden contener un máximo de 20 sustituciones de histidina.
Tabla 4. Sustituciones de aminoácidos de SIRP-a (la numeración de aminoácidos es relativa a la secuencia de SEQ ID NO: 3)
Figure imgf000017_0001
III. Unión dependiente del pH
Los estudios han mostrado que el metabolismo oncogénico mediado por células tumorales genera una gran cantidad de ácido láctico y protones, lo que lleva a la reducción de los valores de pH extracelular a tan solo 6 en el tejido tumoral (Icard et al., Biochim. Biophys. Acta. 1826:423-433, 2012). En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a que incluyen una variante de SIRP-a se diseñan para unirse con alta afinidad a CD47 a pH ácido que a pH neutro (p. ej., alrededor de pH 7,4). Por lo tanto, los constructos de la variante de SIRP-a de la invención se diseñan para unirse selectivamente a CD47 en células enfermas (p. ej., células tumorales) o en células en un sitio enfermo (p. ej., células en el microambiente tumoral que apoyan el crecimiento del tumor), sobre CD47 en células no enfermas.
En una realización, para diseñar la unión dependiente del pH de un constructo de la variante de SIRP-a de la invención, se puede realizar mutagénesis de histidina en la variante de SIRP-a, especialmente en la región de SIRP-a que interactúa con CD47. Las estructuras cristalinas de un complejo de SIRP-a y CD47 (ver, p. ej., PDB ID No. 2JJS) y modelado por computadora pueden usarse para visualizar el sitio de unión tridimensional de SIRP-a y CD47. El diseño computacional y los métodos de modelado útiles en el diseño de una proteína con propiedades de unión sensibles al pH se conocen en la bibliografía y se describen, p. ej., en Strauch et al., Proc Natl Acad Sci. 111:675-80, 2014. En algunas realizaciones, el modelado informático puede usarse para identificar residuos de contacto clave en la interfaz de SIRP-a y CD47. Los residuos de contacto clave identificados pueden sustituirse por residuos de histidina utilizando el software de diseño de proteínas disponible (p. ej., RosettaDesign), que puede generar varios diseños de proteínas que pueden optimizarse, filtrarse y clasificarse en función de la energía de unión calculada y la complementariedad de la forma. Por lo tanto, pueden identificarse sustituciones de histidina energéticamente favorables en determinadas posiciones de aminoácidos utilizando métodos de diseño computacional. El modelado computacional también puede usarse para predecir el cambio en la estructura tridimensional de SIRP-a. Se pueden evitar las sustituciones de histidina que generan un cambio significativo en la estructura tridimensional de SIRP-a.
Una vez que se identifican las sustituciones de aminoácidos óptimas desde el punto de vista energético y estructural, los aminoácidos pueden sustituirse sistemáticamente con residuos de histidina. En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, etc., con un máximo de 20) de SIRP-a pueden sustituirse con residuos de histidina. En particular, los aminoácidos ubicados en la interfaz de SIRP-a y CD47, preferiblemente, los aminoácidos directamente implicados en la unión de SIRP-a a CD47, pueden sustituirse por residuos de histidina. La variante de SIRP-a puede incluir una o más (p. ej., una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, etc., con un máximo de 20) sustituciones de residuos de histidina. En otras realizaciones, los residuos de histidina de origen natural de SIRP-a pueden sustituirse por otros residuos de aminoácidos. En otras realizaciones más, uno o más aminoácidos de SIRP-a pueden sustituirse con residuos que no son histidina para ejercer efecto en la unión de residuos de histidina de origen natural o sustituidos con CD47. Por ejemplo, la sustitución de los aminoácidos que rodean un residuo de histidina de origen natural por otros aminoácidos puede "enterrar" el residuo de histidina de origen natural. En algunas realizaciones, los aminoácidos que no participan directamente en la unión con CD47, es decir, los aminoácidos internos (p. ej., los aminoácidos ubicados en el núcleo de SIRP-a) también pueden sustituirse con residuos de histidina. La Tabla 4 enumera aminoácidos SIRP-a específicos que pueden sustituirse con residuos de histidina o que no son de histidina. Los residuos de contacto son los aminoácidos ubicados en la interfaz de SIRP-a y CD47. Los residuos del núcleo son los aminoácidos internos que no participan directamente en la unión entre SIRP-a y CD47. Las variantes de SIRP-a pueden incluir una o más (p. ej., una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, etc., o todas) las sustituciones enumeradas en la Tabla 4.
Las variantes de SIRP-a que contienen una o más (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, etc., con un número máximo de 20) pueden ensayarse sustituciones de residuos de histidina para determinar su unión a CD47 en diferentes condiciones de pH (p. ej., a pH 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,4, 8). En algunas realizaciones, se puede usar proteína CD47 purificada para ensayar la unión. Se pueden usar varias técnicas conocidas por los expertos en la técnica para medir la constante de afinidad (Ka) o la constante de disociación (Kd) de un complejo de variante de SIRP-a/CD47 en diferentes condiciones de pH (p. ej., a pH 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,4, 8). En una realización preferida, la afinidad de unión de una variante de SIRP-a a un CD47 puede determinarse usando resonancia de plasmón de superficie (p. ej., sistema de resonancia de plasmón de superficie (SPR) Biacore3000™, Biacore, INC, Piscataway N.J.). En una realización ilustrativa, una variante de SIRP-a con unión dependiente del pH, que se une específicamente a un CD47 con mayor afinidad a pH 6 que a pH 7,4, presenta una Kd menor a pH 6 que a pH 7,4.
IV. Unión dependiente de hipoxia
La hipoxia tumoral es la afección en la que las células tumorales se han visto privadas de oxígeno. A medida que un tumor crece, su suministro de sangre se redirige constantemente a las partes de crecimiento más rápido del tumor, dejando partes del tumor con una concentración de oxígeno significativamente más baja que en los tejidos sanos.
En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a puede unirse a un profármaco activado por hipoxia, que puede actuar para aumentar la eficacia de una variante de SIRP-a frente a las células enfermas relevantes en condiciones específicamente hipóxicas. Los profármacos activados por hipoxia son conocidos en la bibliografía, como los descritos por Kling et al. (Biotecnología de la naturaleza, 30:381, 2012).
V. Unión de anticuerpos
Otra estrategia para proporcionar actividad selectiva de SIRP-a en un sitio enfermo que en un sitio no enfermo es unir la proteína SIRP-a a una proteína o péptido que puede unirse a una región de un anticuerpo. Preferiblemente, el anticuerpo es específico de una célula enferma, p. ej., una célula tumoral. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse específicamente a una proteína de la superficie celular en una célula enferma, p. ej., una célula tumoral. La proteína SIRP-a puede unirse al anticuerpo de forma reversible o irreversible.
Unión general de anticuerpos
En algunas realizaciones, para diseñar una proteína SIRP-a que pueda unirse a diferentes anticuerpos independientemente de la especificidad del anticuerpo, la proteína SIRP-a puede fusionarse a una proteína o péptido que reconoce la región constante de un anticuerpo, p. ej., el dominio constante de CH2 o CH3 del dominio Fc de un anticuerpo. Una proteína SIRP-a es capaz de unirse a CD47 y tiene al menos un 50% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de SIRP-a de tipo salvaje (p. ej., variante 1 (SEQ ID NO: 1, que se muestra a continuación)) o con una secuencia de una porción de unión a CD47 de una SIRP-a de tipo salvaje (p. ej., una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 3-12 enumeradas en la Tabla 1).
SEQ ID NO: 1
1 MEFAGFAPGR LGFLLCLLLA ASCAWSGVAG EEELQVIQPD KSVLVAAGET ATLRCTATSL
Figure imgf000019_0001
Una porción de unión a CD47 de una SIRP-a de tipo salvaje incluye el dominio D1 de una SIRP-a de tipo salvaje (p. ej., una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 3-12 enumeradas en la Tabla 1). Se conocen en la técnica proteínas y péptidos que presentan unión general a la región constante de un anticuerpo. Por ejemplo, las proteínas de unión a anticuerpos bacterianos, p. ej., las proteínas A, G y L, se unen a las regiones constantes de un anticuerpo. Las proteínas A y G se unen a los dominios Fc, mientras que la proteína L se une a la región constante de la cadena ligera. En una realización ilustrativa, la proteína A, G o L pueden fusionarse al extremo N o C de una proteína SIRP-a. Preferiblemente, en esta realización, la proteína de fusión de la proteína A, G o L y la proteína SIRP-a pueden unirse, es decir, mediante conjugación química, a un anticuerpo antes de la administración para evitar que la proteína de fusión se una a varios otros anticuerpos en suero. La proteína A, G o L también se puede desarrollar y cribar usando técnicas convencionales en el campo (es decir, bibliotecas de evolución y presentación dirigidas) para una mayor afinidad de unión a las regiones constantes de un anticuerpo. En algunas realizaciones, una proteína SIRP-a puede unirse directamente a un anticuerpo usando técnicas convencionales de conjugación genética o química en la técnica. En otras realizaciones, una proteína SIRP-a también puede unirse a un anticuerpo por medio de un espaciador, lo que permite una flexibilidad espacial y estructural adicional de la proteína. En el presente documento se describen con más detalle varios espaciadores. En algunas realizaciones, la proteína SIRP-a puede unirse, ya sea directamente o a través de una proteína o péptido de unión al anticuerpo, al anticuerpo de forma reversible o irreversible. Además, el cribado de anticuerpos modificados que se puede utilizar de acuerdo con las realizaciones de la invención descrita en el presente documento se puede llevar a cabo como se describe, p. ej., en la publicación de patente de EE.UU. No. US 20100189651.
Otras proteínas o péptidos capaces de unirse a una región constante de un anticuerpo y los métodos de cribado de dichas proteínas o péptidos se describen en la publicación de patente de EE.UU. No. US20120283408.
Unión específica de anticuerpos
En algunas realizaciones, para proporcionar un direccionamiento selectivo de variantes de SIRP-a en un sitio enfermo y para diseñar una variante de SIRP-a capaz de unirse a un anticuerpo específico, p. ej., un anticuerpo específico de tumor, el constructo de la variante de SIRP-a puede incluyen una variante de SIRP-a y una proteína o péptido específico de anticuerpo. La variante de SIRP-a puede fusionarse con una proteína o péptido específico de anticuerpo (p. ej., un péptido de unión a anticuerpo). Preferiblemente, la proteína o péptido se une específicamente a un anticuerpo específico de tumor. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la variante de SIRP-a y la proteína o péptido de unión al anticuerpo pueden coadministrarse con el anticuerpo específico de tumor en una terapia de combinación. En otras realizaciones, la proteína de fusión y el anticuerpo específico de tumor se pueden administrar por separado, es decir, con unas horas de diferencia entre sí, preferiblemente, el anticuerpo se administra primero. En otras realizaciones más, antes de la administración, la proteína de fusión puede unirse covalentemente al anticuerpo específico de tumor usando métodos genéticos o químicos comúnmente conocidos en la técnica.
Ejemplos de péptidos que se unen a anticuerpos incluyen un péptido de localización de enfermedades (DLP) (SEQ ID NO: 64 o 65), un péptido pequeño que puede unirse al centro de la región de unión al antígeno del fragmento (Fab) de Cetuximab (ver, p. ej., Donaldson et al., Proc Natl Acad Sci USA. 110: 17456-17461, 2013). Cetuximab es un anticuerpo IgG 1 anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Los péptidos de unión a anticuerpos que se pueden fusionar con una variante de SIRP-a también incluyen, pero no se limitan a, péptidos que tienen al menos 75% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de la DLP (SEQ ID NO: 64 o 65) o una fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el péptido de unión al anticuerpo tiene la secuencia de SEQ ID NO: 64.
En un estudio reciente, se ha demostrado que SIRP-a potencia la fagocitosis in vitro de células DLD-1 en combinación con el anticuerpo Cetuximab (Weiskopf et al., Science 341: 88-91, 2013 ). En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a puede fusionarse con un péptido de unión a anticuerpo específico, p. ej., un DLP que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 64. En estas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a que incluye una variante de SIRP-a y una DLP puede dirigir su actividad en tumores que expresan EGFR unidos a Cetuximab. Esto, a su vez, puede mejorar aún más el suministro del constructo de la variante de SIRP-a que incluye una variante de SIRP-a y DLP y Cetuximab a pacientes que responden a anti-EGFR. Un ejemplo de un constructo de la variante de SIRP-a que incluye una variante de SIRP-a y DLP se muestra en SEQ ID nO: 66, en la que la parte subrayada simple indica la DLP y la parte en negrita indica la variante SIRP-a. La secuencia de la variante de SIRP-a (parte en negrita) en SEQ ID NO: 66 puede reemplazarse por una secuencia de cualquier variante de SIRP-a descrita en el presente documento. También se pueden fusionar otros péptidos de unión a anticuerpo a una variante de SIRP-a. Dichos péptidos de unión a anticuerpo incluyen, entre otros, péptidos que pueden unirse específicamente a anticuerpos como cetuximab, pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab, MEDI0680, MEDI6469, ipilimumab, tremelimumab, urelumab, vantictumab, varlilumab, mogamalizumab, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CSI, herceptin, trastuzumab y/o pertuzumab.
SEQ ID NO: 66
fC)FDLSrRP.LKf,c;r,rir,snr1r;3;-,i',c'.;]r]r-’ ;'.,-;i^;^EEELQIIQPDKSVLVMGETATLECTITSLFPVGPIQWF RGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKRNKMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGT ELSVRAKPSC-5GG5GGGGSC-G GGSGGGGáC n-n i .STPPl .FC
En algunas realizaciones, un constructo de la variante de SIRP-a que incluye una variante de SIRP-a y un DLP puede combinarse además con un péptido bloqueante basado en CD47 descrito en este documento para bloquear la unión de la variante SIRP-a en el constructo antes de que el constructo alcance el sitio enfermo donde se puede escindir el enlazador escindible. En estas realizaciones, la ventana terapéutica se puede expandir como el constructo de la variante de SIRP-a que contiene una variante de SIRP-a, un péptido bloqueante basado en CD47 y un DLP se acumula en el sitio enfermo y solo es activo en el sitio enfermo después de la escisión del enlazador inducida por una proteasa (p. ej., una proteasa específica de tumor) u otras características del sitio enfermo (p. ej., pH ácido, hipoxia).
En algunas realizaciones, pueden identificarse proteínas o péptidos capaces de unirse a anticuerpos específicos de tumores usando técnicas comúnmente utilizadas en la técnica, tales como bibliotecas de evolución y presentación dirigidas, p. ej., una biblioteca de presentación de fagos. Se conocen en la técnica métodos y técnicas dirigidos a identificar proteínas y péptidos capaces de unirse a anticuerpos específicos de tumores, tales como los descritos por Donaldson et al. (Proc Natl Acad Sci 110:17456-61,2013). En una biblioteca de presentación de fagos, una proteína o péptido potencial específico de anticuerpo se une típicamente covalentemente a una proteína de la cubierta del bacteriófago. El enlace resulta de la traducción de un ácido nucleico que codifica la proteína o péptido fusionado a la proteína de la cubierta. Los bacteriófagos que presentan el péptido se pueden cultivar y recolectar usando métodos estándar de preparación de fagos, p. ej., precipitación con PEG a partir de medios de crecimiento. A continuación, estos fagos de presentación pueden cribarse frente a otras proteínas, p. ej., anticuerpos específicos de tumor, para detectar la interacción entre la proteína presentada y los anticuerpos específicos del tumor. Una vez que se identifica la proteína o el péptido específico de tumor, el ácido nucleico que codifica la proteína o el péptido específico del tumor seleccionado puede aislarse de las células infectadas con los fagos seleccionados o del propio fago, después de la amplificación. Se pueden recoger colonias o placas individuales y se puede aislar y secuenciar el ácido nucleico. Después de identificar y aislar la proteína o el péptido específico del anticuerpo, la proteína o el péptido puede fusionarse con el extremo N o C de una variante de SIRP-a. En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a puede unirse directamente a un anticuerpo específico de tumor usando técnicas convencionales de conjugación genética o química en la técnica. En otras realizaciones, una variante de SIRP-a también puede unirse a un anticuerpo específico de tumor por medio de un espaciador, lo que permite una flexibilidad espacial y estructural adicional de la proteína. En el presente documento se describen con más detalle diversos espaciadores. En algunas realizaciones, la variante de SIRP-a puede unirse, ya sea directamente o a través de una proteína o péptido de unión al anticuerpo, al anticuerpo de forma reversible o irreversible.
En otras realizaciones, una SIRP-a de tipo salvaje o el dominio D1 extracelular de la SIRP-a de tipo salvaje (p. ej., una secuencia de una cualquiera de las s Eq ID NOs: 3-12 enumeradas en la Tabla 1) puede unirse a un anticuerpo específico de tumor. Preferiblemente, el dominio D1 de SIRP-a se une al anticuerpo específico de tumor. El anticuerpo específico de tumor sirve como un resto de direccionamiento para llevar la SIRP-a de tipo salvaje o el dominio D1 al sitio enfermo, p. ej., un sitio de cáncer, p. ej., dentro de un tumor sólido, donde la SIRP-a de tipo salvaje o el dominio D1 puede interactuar con CD47 en células enfermas. En algunas realizaciones, una SIRP-a de tipo salvaje o el dominio D1 extracelular de la SIRP-a de tipo salvaje puede unirse directamente a un anticuerpo específico de tumor usando técnicas convencionales de conjugación genética o química en la técnica. En otras realizaciones, una SIRP-a de tipo salvaje o el dominio D1 extracelular de la SIRP-a de tipo salvaje también se puede unir a un anticuerpo específico de tumor por medio de un espaciador, lo que permite una flexibilidad espacial y estructural adicional de la proteína. En el presente documento se describen con más detalle diversos espaciadores. En otras realizaciones, una SIRP-a de tipo salvaje o el dominio D1 extracelular de la SIRP-a de tipo salvaje puede fusionarse con la proteína o péptido antes mencionado capaz de unirse a un anticuerpo específico de tumor. En aún otras realizaciones, otros polipéptidos SIRP-a, tales como los descritos en la publicación internacional No. WO2013109752, pueden unirse a un anticuerpo específico de tumor o a una proteína o péptido capaz de unirse a un anticuerpo específico de tumor. En algunas realizaciones, la proteína SIRP-a de tipo salvaje o el dominio D1 puede unirse, ya sea directamente o a través de una proteína o péptido de unión al anticuerpo, al anticuerpo de forma reversible o irreversible.
VI. Péptidos bloqueantes
Un péptido bloqueante puede unirse a una variante de SIRP-a por medio de un enlazador escindible. En algunas realizaciones, un péptido bloqueante también puede unirse de forma no covalente a una variante de SIRP-a. El péptido bloqueante actúa para bloquear el sitio de unión de CD47 de la variante de SIRP-a de manera que la variante de SIRP-a no puede unirse a CD47 en la superficie celular de células no enfermas en condiciones fisiológicas (p. ej., pH neutro y concentración de oxígeno adecuada). En condiciones anormales (es decir, un ambiente ácido y/o hipóxico o un ambiente con expresión de proteasa aumentada) en un sitio enfermo, como un sitio de cáncer, p. ej., dentro de un tumor, el enlazador escindible puede escindirse para liberar la variante de SIRP-a del péptido bloqueante. La variante de SIRP-a estaría libre para unirse a CD47 en las células tumorales cercanas. Los ejemplos de enlazadores escindibles se describen con más detalle en el presente documento.
En algunas realizaciones, el péptido bloqueante tiene mayor afinidad por SIRP-a de tipo salvaje que la variante de SIRP-a manipulada. Una vez que se escinde el enlazador, el péptido bloqueante se disocia de la variante de SIRP-a y puede unirse a una SIRP-a de tipo salvaje. Un péptido bloqueante con diferentes afinidades de unión a la variante de SIRP-a y SIRP-a de tipo salvaje puede identificarse usando métodos y técnicas comúnmente conocidas en la técnica, p. ej., bibliotecas de evolución y presentación dirigida (p. ej., presentación en fagos o levaduras). En una realización ilustrativa, se puede mutar y/o recombinar al azar un nucleótido que codifica la región de unión a SIRP-a de CD47 o un nucleótido que codifica la región variable de un anticuerpo anti-SIRP-a para crear una gran biblioteca de variantes de genes usando técnicas tales como, p. ej., PCR propensa a errores y barajado de ADN. Una vez que se crea una biblioteca genética, los péptidos mutantes codificados por los nucleótidos pueden cribarse para determinar su capacidad para unirse a la variante de SIRP-a y variante de SIRP-a de tipo salvaje usando, por ejemplo, presentación en fagos o levadura. Los péptidos identificados que pueden unirse tanto a la variante de SIRP-a de tipo salvaje como a la variante de SIRP-a pueden someterse a un segundo proceso de selección de modo que las proteínas que se unen con mayor afinidad a la variante de SIRP-a de tipo salvaje que a la variante de SIRP-a puedan aislarse. Los péptidos identificados, una vez unidos a la variante SIRP-a o SIRP-a de tipo salvaje, deberían evitar la unión de CD47 a la variante SIRP-a o SIRP-a de tipo salvaje. Se pueden usar varias técnicas conocidas por los expertos en la técnica para medir la constante de afinidad (Ka) o la constante de disociación (Kd) de un complejo variante de SIRP-a/péptido bloqueante o un complejo SIRP-a de tipo salvaje/péptido bloqueante. Un péptido bloqueante puede unirse con una afinidad al menos tres veces mayor a una SIRP-a de tipo salvaje que una variante de SIRP-a.
Péptidos bloqueantes basados en CD47
Un péptido bloqueante puede ser un polipéptido mimético de CD47, o un fragmento de CD47 que puede unirse a una variante de SIRP-a descrita en el presente documento. Algunos péptidos bloqueantes pueden unirse a una variante de SIRP-a en un sitio que es diferente del sitio de unión de CD47. Algunos péptidos bloqueantes pueden unirse a una variante de SIRP-a de una manera que es diferente de CD47. En algunos casos, el péptido bloqueante puede comprender al menos un enlace disulfuro estabilizador. Un péptido bloqueante puede comprender una secuencia polipeptídica de CERVIGTGWVRC, o un fragmento o variante de la misma. Un péptido bloqueante variante puede contener una o más modificaciones conservadoras o no conservadoras. En algunos casos, una variante del péptido bloqueante puede contener modificaciones de una cisteína a una serina y/o una o más modificaciones de una asparagina a una glutamina. Un péptido bloqueante puede unirse a la variante SIRP-a en el mismo sitio que un péptido que comprende una secuencia polipeptídica de CERVIGTGWVRC, o una variante o fragmento de la misma. Un péptido bloqueante puede comprender una secuencia polipeptídica de GNYTCEVTELTREGETIIELK, o un fragmento o variante de la misma. Un péptido bloqueante puede unirse a la variante SIRP-a en el mismo sitio que un péptido que comprende una secuencia polipeptídica de GNYTCEVTELTREGETIIELK, o una variante o fragmento de la misma. En algunos casos, un péptido bloqueante puede comprender una secuencia polipeptídica de EVTELTREGE, o un fragmento o variante de la misma. Un péptido bloqueante puede unirse a la variante de SIRP-a en el mismo sitio que un péptido que comprende una secuencia polipeptídica de EVTELTREGE, o una variante o fragmento de la misma. Un péptido bloqueante puede comprender una secuencia polipeptídica de CEVTELTREGEC, o un fragmento o variante de la misma. Un péptido bloqueante puede unirse a la variante de SIRP-a en el mismo sitio que un péptido que comprende una secuencia polipeptídica de CEVTELTREGEC, o una variante o fragmento de la misma.
En el presente documento se proporcionan constructos de variante de SIRP-a que comprenden una variante de SIRP-a y un péptido bloqueante, en donde el péptido bloqueante puede comprender una secuencia polipeptídica de SEVTELTREGET, o un fragmento o variante de la misma. Un péptido bloqueante puede unirse a la variante de SIRP-a en el mismo sitio que un péptido que comprende una secuencia polipeptídica de SEVTELTREGET, o una variante o fragmento de la misma. En algunos casos, un péptido bloqueante puede comprender una secuencia polipeptídica de GQYTSEVTELTREGETIIELK, o un fragmento o variante de la misma. Un péptido bloqueante puede unirse a la variante de SIRP-a en el mismo sitio que un péptido que comprende una secuencia polipeptídica de GQYTSEVTELTREGETIIELK, o una variante o fragmento de la misma.
En algunos casos, el péptido bloqueante puede ser un polipéptido variante de CD47, que presenta una mayor afinidad por la SIRP-a de tipo salvaje, en comparación con la variante SIRP-a. En comparación con el CD47 de tipo salvaje, el polipéptido bloqueante puede comprender al menos una de las siguientes mutaciones: T102Q, T102H, L101Q, L101H, y L101Y. En comparación con el CD47 de tipo salvaje, el polipéptido bloqueante puede comprender una introducción de un residuo de glicina adicional en o cerca del extremo N-terminal. La glicina se puede introducir junto a una glutamina y/o una leucina en o cerca del extremo N-terminal de CD47. En algunas realizaciones, un péptido bloqueante puede ser un polipéptido variante de CD47 que demuestra una afinidad menor por una variante de SIRP-a en comparación con un CD47 de tipo salvaje. Tales polipéptidos variantes de CD47 se identifican y se ensayan fácilmente usando los métodos descritos en el presente documento.
En el presente documento se proporcionan constructos de la variante de SIRP-a que comprenden una variante de SIRP-a descrita en el presente documento, en donde dicha variante de SIRP-a está conectada a un péptido bloqueante descrito en el presente documento mediante el uso de al menos un enlazador. La variante de SIRP-a puede comprender el mismo sitio de unión a CD47 que un SIRP-a de tipo salvaje. La variante de SIRP-a puede comprender una o más mutaciones o inserciones en comparación con una SIRP-a de tipo salvaje. La variante de SIRP-a puede ser una forma truncada de SIRP-a de tipo salvaje. El péptido bloqueante puede ser un mimético, variante o fragmento de CD47 descrito en el presente documento. El péptido bloqueante puede presentar una mayor afinidad por SIRP-a de tipo salvaje, en comparación con la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a. El péptido bloqueante puede ser un polipéptido variante de CD47 que demuestra una afinidad menor por una variante de SIRP-a en comparación con un CD47 de tipo salvaje. El enlazador puede ser al menos un enlazador que es opcionalmente escindible por una o más proteasas, y opcionalmente también comprende uno o más espaciadores. El enlazador escindible puede comprender la secuencia LSGRSDNH. Los espaciadores pueden comprender una o más unidades de espaciadores de glicina-serina, cada unidad de los cuales puede comprender la secuencia GGGGS.
En algunas realizaciones, el péptido bloqueante que se une a una variante de SIRP-a por medio de un enlazador escindible es un péptido de unión a SIRP-a derivado de CD47 (es decir, un péptido bloqueante basado en CD47). En algunas realizaciones, el péptido bloqueante basado en CD47 se deriva de la porción de unión a SIRP-a de CD47. La porción de unión a SIRP-a de CD47 a menudo se denomina el dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) de CD47, cuya secuencia se muestra a continuación (SEQ ID NO: 35; Ref. NP_0017681).
SEQ ID NO: 35: wild-type, IgSF domain of human CD47
1-50 QLLFNKTKSV EFTFCNDTW IPCFVTNMEA QNTTEVYVKW KFKGRDIYTF
51-100 DGALNKSTVP TDFSSAKIEV SQLLKGDASL KMDKSDAVSH TGNYTCEVTE
101-123 LTREGETIIE LKYRWSWFS PNE
En algunas realizaciones, el péptido bloqueante basado en CD47 contiene el dominio IgSF de longitud completa de CD47 (SEQ ID NO: 35) o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el péptido bloqueante basado en CD47 contiene una o más sustituciones, deleciones, y/o adiciones relativas al dominio IgSF de tipo salvaje de CD47 (SEQ ID NO: 35) o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, un péptido bloqueante basado en CD47 tiene al menos un 80% (p. ej., 83%, 86%, 90%, 93%, 96%, etc.) de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia del dominio IgSF de tipo salvaje de CD47 (SEQ ID NO: 35) o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones, las sustituciones, deleciones, y/o las adiciones de aminoácidos en el péptido bloqueante basado en CD47 dan como resultado que el péptido bloqueante basado en CD47 tiene baja afinidad de unión por una variante de SIRP-a y una afinidad de unión relativamente mayor por la SIRP-a de tipo salvaje. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos en el péptido bloqueante basado en CD47 están ubicadas en la interfaz de CD47 y SIRP-a. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos T102Q en el dominio IgSF de CD47 choca estéricamente con la sustitución de aminoácidos A27I en una variante de SIRP-a, mientras que un SIRP-a de tipo salvaje que tiene A27 no chocaría estéricamente con la sustitución de aminoácidos T102Q (ver Figura 2). Por tanto, un péptido bloqueante basado en CD47 que tiene T102Q se uniría con mayor afinidad a una SIRP-a de tipo salvaje que tiene A27 que a una variante de SIRP-a que tiene A27I. En la Tabla 5 se enumeran ejemplos de sustituciones de aminoácidos en un péptido bloqueante basado en CD47 que pueden crear choques estéricos con aminoácidos específicos en una variante de SIRP-a. Cada una de estas sustituciones de aminoácidos en un péptido bloqueante basado en CD47 puede reducir la afinidad de unión del péptido bloqueante basado en CD47 por una variante de SIRP-a, dependiendo del aminoácido específico en la variante de SIRP-a en el sitio de interacción SIRP-a-CD47.
Tabla 5: Ejemplos de sustituciones de aminoácidos en un péptido bloqueante basado en CD47 que pueden crear choques estéricos con aminoácidos específicos en una variante de SIRP-a
Figure imgf000022_0001
Además de crear choques estéricos entre un péptido bloqueante basado en CD47 y una variante de SIRP-a, las sustituciones, adiciones, y/o deleciones de aminoácidos también pueden usarse para romper interacciones no covalentes específicas entre un péptido bloqueante basado en CD47 y una variante de SIRP-a, reduciendo así la afinidad de unión del péptido bloqueante basado en CD47 a la variante de SIRP-a. En algunas realizaciones, extender el extremo N-terminal del péptido bloqueante basado en CD47 en uno o más aminoácidos (p. ej., un aminoácido), ya sea añadiendo uno o más aminoácidos directamente al N-terminal y/o insertando uno o más aminoácidos entre otros aminoácidos en el extremo N-terminal, rompe las interacciones no covalentes (p. ej., interacciones de enlace de hidrógeno) entre el extremo N del péptido bloqueante basado en CD47 y una variante de SIRP-a. Por ejemplo, una adición de aminoácidos, p. ej., una adición de glicina, en el extremo N-terminal del péptido bloqueante basado en CD47 evitará la ciclación de glutamina a piroglutamato en el extremo N-terminal y también creará contactos e interacciones no deseados que probablemente interrumpirán las interacciones de enlace de hidrógeno entre el piroglutamato N-terminal del extremo N-terminal del péptido bloqueante basado en CD47 y el aminoácido L66 en una SIRP-a de tipo salvaje o sustitución de aminoácidos l66T en una variante de SIRP-a (véase también el Ejemplo 5). En algunas realizaciones, se añade un residuo de aminoácido, p. ej., glicina, en el extremo N-terminal del péptido bloqueante basado en CD47 de manera que el extremo N-terminal de CD47 se cambia de QLLFNK a GQl Lf NK o QGLLFNK. La elección de las sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos en un péptido bloqueante basado en CD47 dependería de las sustituciones de aminoácidos específicas en una variante de SIRP-a.
Además, la fusión del extremo N-terminal del péptido bloqueante basado en CD47 con el extremo C-terminal de una variante de SIRP-a a través de un enlazador escindible y, opcionalmente, uno o más espaciadores también afecta las interacciones de unión entre el péptido bloqueante basado en CD47 y la variante de SIRP-a y reduce la afinidad de unión del péptido bloqueante basado en CD47 a la variante de SIRP-a. En algunas realizaciones, en un constructo de la variante de SIRP-a, el extremo N-terminal de un péptido bloqueante basado en CD47 se fusiona con el extremo C-terminal de una variante de SIRP-a por medio de un enlazador escindible y opcionalmente uno o más espaciadores. En algunas realizaciones, en un constructo de variante de SIRP-a, el extremo C-terminal de un péptido bloqueante basado en CD47 se fusiona con el extremo N-terminal de una variante de SIRP-a por medio de un enlazador escindible y opcionalmente uno o más espaciadores. Los ejemplos de espaciadores y enlazadores escindibles se describen con más detalle en el presente documento.
En la Tabla 6 se muestran péptidos bloqueantes basados en CD47 ilustrativos. En algunas realizaciones, el péptido bloqueante basado en CD47 tiene o incluye la secuencia SEVTELTREGET (SEQ ID NO: 38). En algunas realizaciones, el péptido bloqueante basado en CD47 tiene o incluye la secuencia g Qy TSEVTELTREGETIIELK (SEQ ID NO: 40).
Tabla 6
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
VII. Enlazadores escindibles
En algunas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a incluye una variante de SIRP-a unida a un péptido bloqueante. En algunas realizaciones, el constructo de la variante de SIRP-a incluye una SIRP-a de tipo salvaje unida a un péptido bloqueante. Un enlazador usado para fusionar una variante de SIRP-a o una SIRP-a de tipo salvaje y un péptido bloqueante puede ser un enlazador escindible o un enlazador no escindible. En algunas realizaciones, la unión preferencial de la variante de SIRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a a CD47 en células enfermas o sitios enfermos puede obtenerse uniendo el péptido bloqueante a la variante de SIRP-a mediante el uso de un enlazador escindible, que se escinde en las células enfermas o en los sitios enfermos.
En algunas realizaciones, se usa un enlazador escindible entre una variante de SIRP-a y un péptido bloqueante. En algunas realizaciones, puede instalarse un enlazador escindible dentro de un péptido bloqueante, que puede estar asociado de forma no covalente con la variante de SIRP-a para bloquear la unión de la variante de SIRP-a a CD47 en condiciones fisiológicas. Un enlazador escindible se puede escindir en determinadas condiciones. Si el enlazador escindible está dentro de un péptido bloqueante, la escisión del enlazador inactivaría el péptido bloqueante. En condiciones características de un sitio enfermo, como un sitio canceroso, p. ej., dentro de un tumor, el enlazador se escinde para liberar la variante de SIRP-a del péptido bloqueante de modo que la variante de SIRP-a pueda unirse al CD47 cercano en la superficie de la célula de células enfermas, p. ej., células tumorales. De esta manera, en un constructo de SIRP-a que incluye una variante de SIRP-a y un péptido bloqueante, la variante de SIRP-a solo puede unirse a CD47 en células enfermas (p. ej., células tumorales) o células en un sitio enfermo (p. ej., células en el microambiente tumoral que apoya el crecimiento del tumor), y es incapaz de unirse a CD47 en células no enfermas en condiciones fisiológicas, ya que el enlazador escindible permanece estable en condiciones fisiológicas y el sitio de unión a CD47 de la variante de SIRP-a sería bloqueado por el péptido bloqueante. Un enlazador escindible puede incluir aminoácidos, moléculas pequeñas orgánicas o una combinación de aminoácidos y moléculas pequeñas orgánicas que escinden o inducen la escisión del enlazador en condiciones características de un sitio enfermo, tal como pH ácido, hipoxia y aumento de la expresión de proteasas. Los enlazadores escindibles son estables en condiciones fisiológicas (p. ej., pH neutro y concentración de oxígeno adecuada). En algunas realizaciones, el enlazador escindicle puede no escindirse y el péptido bloqueante puede simplemente disociarse de la variante de SIRP-a en un sitio enfermo de manera que la variante de SIRP-a está libre para unirse a CD47 cercano en células enfermas, p. ej., células tumorales. En estas realizaciones, las variantes de SIRP-a pueden diseñarse para que tengan una unión a CD47 dependiente del pH, cuyos detalles se describen previamente. Las variantes de SIRP-a pueden diseñarse para unirse con alta afinidad a CD47 a pH ácido de un sitio enfermo que a pH neutro (p. ej., alrededor de pH 7,4) de un sitio no enfermo. Por tanto, el péptido bloqueante (p. ej., un péptido bloqueante basado en CD-47 o una proteína bloqueante del dominio IgSF de CD47) puede separarse por disociación de la variante de SIRP-a al pH ácido de un sitio enfermo. En algunas realizaciones, para diseñar la unión dependiente del pH de una variante de SIRP-a a CD47 en un sitio enfermo, se puede realizar mutagénesis de histidina en la SIRP-a, especialmente en la región de SIRP-a que interactúa con CD47.
Enlazadores escindibles dependientes del pH
Una de las características de un sitio de cáncer, p. ej., dentro de un tumor, es el pH ácido. En algunas realizaciones, un enlazador se puede escindir a pH ácido (p. ej., menos de alrededor de pH 7). Un enlazador sensible al ácido es estable a pH fisiológico (p. ej., alrededor de pH 7,4). La escisión a pH ácido puede ser a través de hidrólisis ácida o por proteínas presentes y activas a pH ácido de un sitio enfermo, tal como un sitio canceroso, p. ej., dentro de un tumor. Los enlazadores sensibles a los ácidos pueden incluir un resto, tal como un grupo o compuesto químico funcional, capaz de hidrolizarse a pH ácido. Los grupos y compuestos químicos funcionales sensibles a los ácidos incluyen, pero no se limitan a, p. ej., acetales, cetales, tiomaleamatos, hidrazonas y enlaces disulfuro. Los enlazadores sensibles al ácido, así como los grupos y compuestos químicos sensibles al ácido, que pueden usarse en el constructo de enlazadores sensibles al ácido, son bien conocidos en la técnica y se describen en las patentes de Estados Unidos Nos. 8.748.399,5.306.809 y 5.505.931, Laurent et al., (Bioconjugate Chem. 21:5-13, 2010),Castaneda et al. (Chem. Commun. 49:8187-8189, 2013) y Ducry et al. (Bioconjug. Chem. 21:5-13, 2010). En una realización, se puede instalar un enlace disulfuro en un enlazador escindible usando un sintetizador de péptidos y/o técnicas convencionales de síntesis química. En otra realización, un enlazador de ácido tiomaleámico (Castaneda et al. Chem. Commun. 49:8187-8189, 2013) se puede utilizar como enlazador escindible. En esta realización, para insertar un enlazador de ácido tiomalemico entre una variante de SIRP-a y un péptido bloqueante, uno de los dos grupos tiol del enlazador de ácido tiomalemico (ver, p. ej., Esquema 2, Castaneda et al.) puede unirse al extremo C-terminal de una variante de SIRP-a, mientras que el grupo éster del enlazador tiomalemico puede unirse al extremo N-terminal del péptido bloqueante.
Enlazadores escindióles dependientes de hipoxia
En algunas realizaciones, un enlazador se puede escindir en condiciones hipóxicas, que es otra característica de un sitio canceroso, p. ej., dentro de un tumor. Se evita que una variante de SIRP-a unida a un péptido bloqueante por medio de un enlazador sensible a la hipoxia se una a CD47 en células no enfermas mientras que el enlazador permanece estable en condiciones fisiológicas (p. ej., pH neutro y concentración de oxígeno adecuada). Una vez que la proteína de fusión está en el sitio canceroso, p. ej., dentro de un tumor, donde la concentración de oxígeno es significativamente menor que en los tejidos sanos, el enlazador se escinde para liberar la variante de SIRP-a del péptido bloqueante, que luego puede unirse a la superficie celular CD47 en células tumorales. El enlazador sensible a la hipoxia puede incluir un resto, p. ej., un aminoácido o un grupo funcional químico, capaz de escindirse en condiciones hipóxicas. Algunos ejemplos de restos químicos que pueden escindirse, es decir, escindirse mediante reducción, en condición hipóxica incluyen, pero no se limitan a, quinonas, N-óxidos y grupos nitro heteroaromáticos. Estos restos químicos pueden instalarse en el enlazador escindible usando técnicas convencionales de síntesis química y de péptidos. También se conocen en la técnica ejemplos de aminoácidos sensibles a la hipoxia, tales como los descritos por Shigenaga et al. (European Journal of Chemical Biology 13:968-971, 2012).
En una realización preferida, el aminoácido sensible a la hipoxia descrito por Shigenaga et al. (European J. Chem, Biol. 13:968-971,2012 ) puede insertarse entre una variante de SIRP-a y un péptido bloqueante. Por ejemplo, el grupo amino del aminoácido sensible a la hipoxia puede unirse al extremo C-terminal de la variante de SIRP-a a través de un enlace peptídico, y de manera similar, el grupo de ácido carboxílico del aminoácido sensible a la hipoxia puede unirse a el extremo N-terminal del péptido bloqueante a través de un enlace peptídico. En condiciones hipóxicas, la reducción del grupo nitro induce la escisión del enlace peptídico entre el aminoácido sensible a la hipoxia y el extremo N-terminal del péptido bloqueante, liberando así con éxito la variante de SIRP-a del péptido bloqueante. La variante de SIRP-a puede unirse entonces a CD47 en células tumorales.
En otra realización, el grupo 2-nitroimidazol sensible a la hipoxia descrito por Duan et al. (J. Med. Chem. 51:2412-2420, 2008 ) puede insertarse entre una variante de SIRP-a y un péptido bloqueante o instalarse en un enlazador escindible insertado entre una variante de SIRP-a y un péptido bloqueante. En condiciones hipóxicas, la reducción del grupo nitro induce una reducción adicional, que finalmente conduce a la eliminación del grupo 2-nitroimidazol de su unión, p. ej., la variante de SIRP-a, el péptido bloqueante o el enlazador escindible.
Enlazadores escindióles dependientes de enzimas asociados a tumores
En otras realizaciones, un constructo de la variante de SIRP-a puede incluir una variante de SIRP-a unida a un péptido bloqueante por medio de un enlazador (p. ej., un enlazador escindible) y opcionalmente uno o más espaciadores (ejemplos de espaciadores se describen con más detalle en el presente documento). En algunas realizaciones, el enlazador (p. ej., enlazador escindible) puede escindirse mediante una enzima asociada al tumor. En algunas realizaciones, un enlazador, que puede ser escindido por una enzima asociada a un tumor, puede estar contenido dentro de un péptido bloqueante, que puede estar unido de forma no covalente a una variante de SIRP-a. Una vez que la proteína de fusión está en el sitio canceroso, p. ej., dentro de un tumor, el enlazador es escindido por una enzima asociada al tumor para liberar la variante de SIRP-a del péptido bloqueante, que luego puede unirse a la superficie celular CD47 en células tumorales. Un enlazador sensible a una enzima asociada a un tumor puede contener un resto, p. ej., un sustrato proteico, capaz de ser escindido específicamente por una enzima, p. ej., una proteasa, que solo está presente en el sitio canceroso, p. ej., dentro de un tumor. El resto se puede seleccionar basándose en el tipo de enzima, p. ej., una proteasa, presente en el sitio canceroso, p. ej., dentro de un tumor. Un enlazador escindible ilustrativo que puede escindirse por una enzima asociada a un tumor es LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47), que puede escindirse mediante múltiples proteasas, p. ej., matriptasa (MTSP1), activador de plasminógeno de tipo urinario (uPA), legumaína PSA (también llamado KLK3, peptidasa-3 relacionada con calicreína), metaloproteinasa-2 de matriz (MMP-2), MMP9, elastasa de neutrófilos humanos (HNE) y proteinasa 3 (Pr3). También están disponibles otros enlazadores escindibles que son susceptibles de escisión por enzimas (p. ej., proteasas). Además de las proteasas mencionadas anteriormente, otras enzimas (p. ej., proteasas) que pueden escindir un enlazador escindible incluyen, pero no se limitan a, uroquinasa, activador de plasminógeno tisular, tripsina, plasmina y otra enzima que tiene actividades proteolíticas. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, una variante de SIRP-a o un SIRP-a de tipo salvaje se une a un péptido bloqueante por medio de un enlazador (p. ej., un enlazador escindible) susceptible de escisión por enzimas que tienen actividades proteolíticas, tales como como uroquinasa, un activador del plasminógeno tisular, plasmina o tripsina.
En algunas realizaciones, las secuencias de enlazadores escindibles pueden derivarse y seleccionarse juntando varias secuencias basadas en diferentes preferencias enzimáticas. En la Tabla 7 se muestran ejemplos no limitados de varias proteasas potenciales y sus correspondientes sitios de proteasa. En la Tabla 7, "-" significa cualquier aminoácido (es decir, cualquier aminoácido de origen natural), mayúsculas indica una fuerte preferencia por ese aminoácido, minúscula indica una preferencia menor por ese aminoácido, y "/" separa posiciones de los aminoácidos en los casos en que más de un aminoácido en una posición adyacente a la "/' es posible. Otras secuencias escindibles incluyen, pero no se limitan a, una secuencia de un colágeno de hígado humano (cadena a1(III) (p. ej., GPLGIAGI (SEQ ID NO: 100))), una secuencia de una PZP humana (p. ej., YGAGLGVV (SEQ ID NO: 101), AGLGVVER (SEQ ID NO: 102) o AGLGlSST (SEQ ID NO: 103)) y otras secuencias que son autolíticas (p. ej., VAQFVLTE (SEQ ID NO: 104), AQFVLTEG (SEQ ID NO: 105) o PVQPIGPQ (SEQ ID NO: 106)).
Tabla 7
Figure imgf000026_0001
Hay informes en la bibliografía de niveles aumentados de enzimas que tienen sustratos conocidos en diversos tipos de cánceres, p. ej., tumores sólidos. Véase, p. ej., La Rocca et al., Brit. J. Cáncer 90:1414-1421 y Ducry et al., Bioconjug. Chem. 21:5-13, 2010). Las enzimas asociadas a tumores también pueden identificarse usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, p. ej., inmunohistoquímica de células tumorales. En una realización ilustrativa, el resto sensible a enzima en un enlazador puede ser un sustrato de metaloproteinasa de matriz (MMP), que puede ser escindido por una MMP presente en el sitio del cáncer, p. ej., dentro de un tumor. En otra realización ilustrativa, el resto sensible a enzima en un enlazador puede ser un enlazador dipéptido que contiene maleimido (ver, p. ej., la Tabla 1 en Ducry et al.), que puede escindirse mediante proteólisis por proteasas (p. ej., catepsina o plasmina) presente a niveles elevados en ciertos tumores (Koblinski et al., Chim. Acta 291:113-135, 2000). En esta realización, el grupo maleimida del enlazador dipéptido que contiene maleimido puede conjugarse con un residuo de cisteína de la variante de SIRP-a y el grupo ácido carboxílico en el extremo C-terminal del enlazador dipéptido que contiene maleimido puede conjugarse con el amino grupo en el extremo N-terminal del péptido bloqueante. De forma similar, el grupo maleimida del enlazador dipéptido que contiene maleimido puede conjugarse con un residuo de cisteína de la variante de SIRP-a y el grupo ácido carboxílico en el extremo C-terminal del enlazador dipéptido que contiene maleimido puede conjugarse con el grupo amino en el extremo N-terminal de la variante de SIRP-a. La espectrometría de masas y otras técnicas disponibles en el campo de la proteómica pueden usarse para confirmar la escisión de los enlazadores escindibles dependientes de enzimas asociados a tumores. Otros restos sensibles a enzimas se describen en la patente de EE. UU. No. 8.399.219. En algunas realizaciones, el resto sensible a una enzima asociada a un tumor, p. ej., un sustrato proteico, puede insertarse entre una variante de SIRP-a y un péptido bloqueante usando biología celular de moléculas convencionales y técnicas de conjugación química bien conocidas en la técnica.
VIII. Albúmina en suero
La fusión con albúmina sérica puede mejorar la farmacocinética de los productos farmacéuticos proteicos y, en particular, una variante de SIRP-a descrita en este documento puede unirse con una albúmina sérica. La albúmina sérica es una proteína globular que es la proteína sanguínea más abundante en los mamíferos. La albúmina sérica se produce en el hígado y constituye aproximadamente la mitad de las proteínas del suero sanguíneo. Es monomérico y soluble en sangre. Algunas de las funciones más importantes de la albúmina sérica incluyen el transporte de hormonas, ácidos grasos y otras proteínas en el cuerpo, amortiguar el pH y mantener la presión osmótica necesaria para la distribución adecuada de los fluidos corporales entre los vasos sanguíneos y los tejidos corporales. En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a puede fusionarse con una albúmina de suero. En realizaciones preferidas, la albúmina de suero es albúmina de suero humano (HSA). En algunas realizaciones de la presente invención, el extremo N-terminal de una HSA se une al extremo C-terminal de la variante de SIRP-a para aumentar la vida media en suero de la variante de SIRP-a. Una HSA se puede unir, ya sea directamente o mediante un enlazador, al extremo C-terminal de la variante de SIRP-a. Unir el extremo N-terminal de una HSA al extremo C-terminal de la variante de SIRP-a mantiene el extremo N-terminal de la variante de SIRP-a libre para interactuar con CD47 y el extremo proximal del extremo C-terminal de la HSA para interactuar con FcRn. Una HSA que se puede usar en los métodos y composiciones descritos en el presente documento es generalmente conocida en la técnica. En algunas realizaciones, la HSA incluye los aminoácidos 25-609 (SEQ ID NO: 67) de la secuencia de UniProt ID NO: P02768. En algunas realizaciones, la HSA incluye una o más sustituciones de aminoácidos (p. ej., C34S y/o K573P) relativas a la SEQ ID NO: 67. En algunas realizaciones, la HSA tiene la secuencia de SEQ ID NO: 68.
IX. Péptidos que se unen a albúmina
La unión a proteínas séricas puede mejorar la farmacocinética de los productos farmacéuticos proteicos y, en particular, las variantes de SIRP-a descritas en el presente documento pueden fusionarse con péptidos o proteínas de unión a proteínas séricas. En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a puede fusionarse con un péptido de unión a albúmina que muestra actividad de unión a albúmina sérica para aumentar la vida media de la variante de SIRP-a. Los péptidos que se unen a la albúmina que se pueden usar en los métodos y composiciones descritos en el presente documento son generalmente conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Dennis et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043, 2002 y Miyakawa et al., J. Pharm. Sci. 102:3110-3118, 2013. En una realización, el péptido de unión a albúmina incluye la secuencia DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 2). Un péptido de unión a albúmina puede fusionarse genéticamente con una variante de SIRP-a o unirse a una variante de SIRP-a mediante medios químicos, p. ej., conjugación química. Si se desea, se puede insertar un espaciador entre la variante SIRP-a y el péptido de unión a albúmina para permitir una flexibilidad espacial y estructural adicional de la proteína de fusión. Los espaciadores específicos y sus secuencias de aminoácidos se describen con más detalle en el presente documento. En algunas realizaciones, un péptido de unión a albúmina puede fusionarse al extremo N o C de una variante de SIRP-a. En un ejemplo, el extremo C-terminal del péptido de unión a albúmina puede fusionarse directamente con el extremo N-terminal de la variante de SIRP-a a través de un enlace peptídico. En otro ejemplo, el extremo N-terminal del péptido de unión a albúmina puede fusionarse directamente con el extremo C-terminal de la variante de SIRP-a a través de un enlace peptídico. En otro ejemplo más, el ácido carboxílico en el extremo C-terminal del péptido que se une a la albúmina puede fusionarse con un residuo de aminoácido interno, es decir, el grupo amino de la cadena lateral de un residuo de lisina de la variante de SIRP-a usando técnicas de conjugación química convencionales. Sin estar ligado a una teoría, se espera que la fusión de un péptido de unión a albúmina a una variante de SIRP-a pueda conducir a una retención prolongada de la proteína terapéutica a través de su unión a albúmina sérica.
X. Dominios Fc
En algunas realizaciones, un constructo de la variante de SIRP-a puede incluir una variante de SIRP-a y un monómero de dominio Fc. En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a puede fusionarse con un monómero de dominio Fc de una inmunoglobulina o un fragmento de un monómero de dominio Fc. Como se conoce convencionalmente en la técnica, un dominio Fc es la estructura proteica que se encuentra en el extremo C-terminal de una inmunoglobulina. Un dominio Fc incluye dos monómeros del dominio Fc que están dimerizados por la interacción entre los dominios constantes del anticuerpo Ch3. Un dominio Fc de tipo salvaje forma la estructura mínima que se une a un receptor Fc, p. ej., FcyRI, FcYRIIa, FcyRIib, FcYRIIIa, FcYRIIIb, FcyRIV. En la presente invención, un monómero de dominio Fc o un fragmento de un dominio Fc fusionado a una variante de SiRP-a para aumentar la vida media en suero de la variante de SIRP-a puede incluir un dímero de dos monómeros de dominio Fc o un monómero de dominio Fc, siempre que el monómero del dominio Fc pueda unirse al receptor Fc (p. ej., un receptor FcRn). Además, un dominio Fc o un fragmento del dominio Fc fusionado a una variante de SIRP-a para aumentar la vida media en suero de la variante de SIRP-a no induce ninguna respuesta relacionada con el sistema inmunológico. En algunas realizaciones, un dominio Fc puede mutar para carecer de funciones efectoras, típicas de un dominio Fc "muerto". Por ejemplo, un dominio Fc puede incluir sustituciones de aminoácidos específicas que se sabe que minimizan la interacción entre el dominio Fc y un receptor Fcy. En algunas realizaciones, un monómero de dominio Fc o un fragmento del dominio Fc puede fusionarse al extremo N o C-terminal de una variante de SIRP-a mediante medios genéticos o químicos convencionales, p. ej., conjugación química. Si se desea, se puede insertar un enlazador (p. ej., un espaciador) entre la variante de SIRP-a y el monómero del dominio Fc.
Heterodimerización de monómeros de dominio Fc
En algunas realizaciones, cada uno de los dos monómeros del dominio Fc en un dominio Fc incluye sustituciones de aminoácidos que promueven la heterodimerización de los dos monómeros. La heterodimerización de los monómeros del dominio Fc se puede promover mediante la introducción de sustituciones diferentes, pero compatibles, en los dos monómeros del dominio Fc, tales como pares de residuos de "botón en ojal" y pares de residuos de carga. El uso de pares de residuos de "botón en ojal" está descrito por Carter y colaboradores (Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-612, 1996; Atwell et al., J Mol Biol. 270:26-35, 1997; Merchant et al., Nat Biotechnol. 16:677-681, 1998). La interacción botón y ojal favorece la formación de heterodímeros, mientras que la interacción botón-botón y ojal-ojal dificulta la formación de homodímeros debido al choque estérico y la deleción de interacciones favorables. La técnica "botón en ojal" también se describe en la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. No. 8.216.805, Merchant et al., Nature Biotechnology 16:677-681, 1998, y Merchant et al., Proc Natl Acad Sci USA. 110:E2987-E2996, 2013. Un ojal es un vacío que se crea cuando un aminoácido original en una proteína se reemplaza con un aminoácido diferente que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño. Un botón es una protuberancia que se crea cuando un aminoácido original en una proteína se reemplaza con un aminoácido diferente que tiene un volumen de cadena lateral mayor. Específicamente, el aminoácido que se reemplaza está en el dominio constante del anticuerpo Ch3 de un monómero del dominio Fc y está involucrado en la dimerización de dos monómeros del dominio Fc. En algunas realizaciones, se crea un agujero en un dominio constante de anticuerpo Ch3 para acomodar un botón en otro dominio constante de anticuerpo Ch3, de modo que los aminoácidos del botón y del ojal actúen para promover o favorecer la heterodimerización de los dos monómeros del dominio Fc. En algunas realizaciones, se crea un agujero en un dominio constante del anticuerpo CH3 para acomodar mejor un aminoácido original en otro dominio constante del anticuerpo CH3. En algunas realizaciones, se crea un botón en un dominio constante del anticuerpo CH3 para formar interacciones adicionales con los aminoácidos originales en otro dominio constante del anticuerpo CH3.
Se puede construir un agujero reemplazando los aminoácidos que tienen cadenas laterales más grandes, como tirosina o triptófano, con aminoácidos que tienen cadenas laterales más pequeñas, como alanina, valina o treonina, como la mutación Y407V en el dominio constante del anticuerpo Ch3. De manera similar, se puede construir un botón reemplazando los aminoácidos que tienen cadenas laterales más pequeñas con aminoácidos que tienen cadenas laterales más grandes, como la mutación T366W en el dominio constante del anticuerpo Ch3. En una realización preferida, un monómero de dominio Fc incluye la mutación de botón T366W y el otro monómero de dominio Fc incluye mutaciones de agujero T366S, L358A e Y407V. Una variante de SIRP-a D1 de la invención puede fusionarse con un monómero de dominio Fc que incluye la mutación de botón T366W para limitar la formación de homodímeros de botónbotón no deseados. En la Tabla 8 se incluyen ejemplos de pares de aminoácidos de botón en ojal, sin limitación.
Tabla 8
Figure imgf000028_0001
Además de la estrategia de ojal en agujero, también se puede usar la estrategia de dirección electrostática para controlar la dimerización de los monómeros del dominio Fc. La dirección electrostática es la utilización de interacciones electrostáticas favorables entre aminoácidos con carga opuesta en péptidos, dominios de proteínas y proteínas para controlar la formación de moléculas de proteínas de orden superior. En particular, para controlar la dimerización de los monómeros del dominio Fc usando dirección electrostática, uno o más residuos de aminoácidos que forman la interfaz Ch3-Ch3 se reemplazan con residuos de aminoácidos cargados positiva o negativamente de modo que la interacción se vuelva electrostáticamente favorable o desfavorable dependiendo de los aminoácidos cargados específicos introducidos. En algunas realizaciones, un aminoácido cargado positivamente en la interfase, como lisina, arginina o histidina, se reemplaza con un aminoácido cargado negativamente como ácido aspártico o ácido glutámico. En algunas realizaciones, un aminoácido cargado negativamente en la interfaz se reemplaza por un aminoácido cargado positivamente. Los aminoácidos cargados pueden ser introducidos en uno de los dominios constantes de anticuerpo Ch3 que interactúan, o ambos. Introducir aminoácidos cargados en los dominios constantes de anticuerpos Ch3 que interactúan de los dos monómeros de dominio Fc puede promover la formación selectiva de heterodímeros de monómeros dominio Fc como controlada por los efectos de dirección electrostática que resultan de la interacción entre aminoácidos cargados. La técnica de dirección electrostática también se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 20140024111, Gunasekaran et al., J Biol Chem. 285:19637-46, 2010 y Martens et al., Clin Cancer Res. 12:6144-52, 2006. En la Tabla 9 se incluyen ejemplos de pares de aminoácidos de dirección electrostática, sin limitación.
Tabla 9
Figure imgf000029_0001
XI. Polímeros de polietilenglicol (PEG)
En algunas realizaciones, una variante de SIRP-a también puede fusionarse con un polímero, p. ej., polietilenglicol (PEG). La unión de un polímero a un producto farmacéutico proteico puede "enmascarar" el producto farmacéutico proteico del sistema inmunológico del huésped (Milla et al., Curr Drug Metab. 13:105-119, 2012). Además, ciertos polímeros, p. ej., polímeros hidrófilos, también pueden proporcionar solubilidad en agua a proteínas y fármacos hidrófobos (Gregoriadis et al., Cell Mol. Life Sci. 57:1964-1969, 2000; Constantinou et al., Bioconjug. Chem. 19:643-650, 2008). Diversos polímeros, como PEG, cadena de ácido polisálico (Constantinou et al., Bioconjug. Chem. 19:643-650, 2008) y la cadena PAS (Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 26:489-501,2013), son conocidos en la técnica y pueden usarse en la presente invención. En algunas realizaciones, un polímero, p. ej., PEG, puede unirse covalentemente a una variante de SIRP-a, ya sea en el extremo N- o C-terminal o en una ubicación interna, usando métodos químicos convencionales, p. ej., conjugación química. En algunas realizaciones, un polímero, p. ej., PEG, puede unirse covalentemente a una sustitución o adición de cisteína en la variante de SIRP-a. La sustitución de cisteína en la variante de SIRP-a puede ser I7C, A16C, S20C, T20C, A45C, G45C, G79C, S79C o A84C, con respecto a la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 13-23. La adición de un residuo de cisteína en la variante de SIRP-a puede introducirse usando técnicas convencionales en la técnica, p. ej., síntesis de péptidos, modificación genética y/o clonación molecular. El polímero, p. ej., PEG, puede unirse al residuo de cisteína usando una conjugación de cisteína-maleimida bien conocida por los expertos en la técnica.
Además de las realizaciones descritas anteriormente, también están disponibles otras tecnologías de extensión de la vida media y pueden usarse en la presente invención para aumentar la vida media en suero de las variantes de SIRP-a. Las tecnologías de extensión de la vida media incluyen, pero no se limitan a, y EXTEN (Schellenberger et al., Nat. Biotechnol. 27:1186-1192, 2009) y etiqueta Albu (Trussel et al., Bioconjug Chem. 20:2286-2292, 2009).
XII. Espaciadores
En algunas realizaciones, se pueden usar espaciadores en el constructo de la variante de SIRP-a. Por ejemplos, un constructo de la variante de SIRP-a puede incluir una variante de SIRP-a unida a un péptido bloqueante por medio de un enlazador (p. ej., un enlazador escindible). En tales constructos SIRP-a, se puede insertar un espaciador entre la variante de SIRP-a y el enlazador (p. ej., un enlazador escindible), y/o entre el enlazador (p. ej., un enlazador escindible) y el péptido bloqueante. Para optimizar el espaciado entre la variante de SIRP-a y el enlazador, y/o el espaciado entre el enlazador y el péptido bloqueante, puede usarse uno cualquiera o más de los espaciadores descritos a continuación. En algunas realizaciones de un constructo de la variante de SIRP-a que incluye una variante de SIRP-a unida a un péptido bloqueante por medio de un enlazador (p. ej., un enlazador escindible), el espaciador sirve para colocar el enlazador escindible lejos del núcleo de la variante de SIRP-a y el péptido bloqueante de manera que el enlazador escindible sea más accesible a la enzima responsable de la escisión. Debería entenderse que la unión de dos elementos en un constructo de la variante SIRP-a, por ejemplo, una variante de SIRP-a y un enlazador (p. ej., un enlazador escindible) en un constructo de la variante de SIRP-a que incluye (p. ej., en este orden ) una variante de SIRP-a, un enlazador y un péptido bloqueante, no necesitan ser de un modo particular de unión o mediante una reacción particular. Es aceptable cualquier reacción que proporcione un constructo de la variante de SIRP-a de estabilidad y compatibilidad biológica adecuadas.
Un espaciador se refiere a un enlace entre dos elementos en un constructo de la variante de SIRP-a, p. ej., una variante de SIRP-a y un enlazador (p. ej., un enlazador escindible) en un constructo de la variante de SIRP-a que incluye (p. ej., en este orden ) una variante de SIRP-a, un enlazador y un péptido bloqueante, un enlazador (p. ej., un enlazador escindible) y un péptido bloqueante en un constructo de la variante de SIRP-a que incluye (p. ej., en este orden) una variante de SIRP-a, un enlazador y un péptido bloqueante, una variante de SIRP-a y un péptido o proteína de unión a proteínas séricas, p, ej., un péptido de unión a albúmina. Un espaciador también puede referirse a un enlace que puede insertarse entre una variante de SIRP-a o una SIRP-a de tipo salvaje y un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo específico de tumor o un péptido de unión a anticuerpo. Un espaciador puede proporcionar estructuras adicionales y/o flexibilidad espacial del constructo de la variante de SIRP-a. Un espaciador puede ser un enlace químico simple, p. ej., un enlace amida, una molécula orgánica pequeña (p. ej., una cadena de hidrocarburo), una secuencia de aminoácidos (p. ej., una secuencia de 3-200 aminoácidos) o una combinación de una pequeña, molécula orgánica (p. ej., una cadena de hidrocarburo) y una secuencia de aminoácidos (p. ej., una secuencia de 3-200 aminoácidos). Un espaciador es estable en condiciones fisiológicas (p. ej., pH neutro y concentración de oxígeno adecuada) así como en condiciones características de un sitio enfermo, p. ej., pH ácido e hipoxia. Un espaciador es estable en un sitio enfermo, tal como un sitio de cáncer, p. ej., dentro de un tumor.
Un espaciador puede incluir 3-200 aminoácidos. Los espaciadores de péptidos adecuados son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, enlazadores de péptidos que contienen residuos de aminoácidos flexibles, tales como glicina y serina. En determinadas realizaciones, un espaciador puede contener motivos, por ejemplo, motivos múltiples o repetidos, de GS, GGS, GGGGS, GGSG o SGGG. En determinadas realizaciones, un espaciador puede contener de 2 a 12 aminoácidos que incluyen motivos de GS, por ejemplo, GS, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, o GSGSGSGSGSGS. En ciertas otras realizaciones, un espaciador puede contener de 3 a 12 aminoácidos que incluyen motivos de GGS, p. ej., GGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, y GGSGGSGGSGGS. En otras realizaciones más, un espaciador puede contener de 4 a 12 aminoácidos que incluyen motivos de GGSG, por ejemplo, GGSG, GGSGGGSG, o GGSGGGSGGGSG. En otras realizaciones, un espaciador puede contener motivos de (GGGGS)n, donde n es un número entero de 1 a 10. En otras realizaciones, un espaciador también puede contener aminoácidos distintos de glicina y serina, p. ej., GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, o GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS. En algunas realizaciones en la presente invención, se pueden usar uno o más espaciadores de péptidos de 12 o 20 aminoácidos en un constructo de la variante de SIRP-a. Los espaciadores de péptidos de 12 y 20 aminoácidos pueden contener secuencias GGGSGGGSGGGS y SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, respectivamente. En algunas realizaciones, pueden usarse uno o más espaciadores de péptidos de 18 aminoácidos que contienen la secuencia GGSGGGSGGGSGGGSGGS en un constructo de la variante de SIRP-a.
En algunas realizaciones, un espaciador también puede tener la estructura general en donde W es NH o CH2, Q es un aminoácido o un péptido y n es un número entero de 0 a 20.
XIII. Fusión de un péptido bloqueante a una variante de SIRP-a
Un péptido bloqueante (p. ej., un péptido bloqueante basado en CD47 que tiene una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 36-46 en la Tabla 6) puede fusionarse con el extremo N o C terminal de una variante de SIRP-a por medio de un enlazador, p. ej., un enlazador escindible (p. ej., LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47)), y opcionalmente uno o más espaciadores (p. ej., (GGGGS) n, fusionado genéticamente al extremo N o C terminal del enlazador, en donde n es un número entero de 1 a 10). Se muestran ejemplos de secuencias de constructos de variantes de SIRP-a que incluyen un péptido bloqueante basado en CD47 fusionado a una variante de SIRP-a mediante un enlazador escindible y uno o más espaciadores en las secuencias de SEQ ID NO: 48-63. La longitud de los espaciadores puede cambiarse para lograr la unión más optimizada entre el péptido bloqueante basado en CD47 y la variante de SIRP-a.
XIV. Métodos de producción de constructos de variantes de SIRP-a
Los constructos de la variante de SIRP-a de la invención se pueden producir a partir de una célula huésped. Una célula huésped se refiere a un vehículo que incluye los componentes celulares necesarios, p. ej., orgánulos, necesarios para expresar los polipéptidos y los constructos descritos en el presente documento a partir de sus correspondientes ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden incluirse típicamente en vectores de ácidos nucleicos que pueden introducirse en la célula huésped mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica (p. ej., transformación, transfección, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, etc.). La elección de los vectores de ácido nucleico depende en parte de las células huésped que se utilizarán. Generalmente, las células huésped preferidas son de origen procariótico (p. ej., bacteriano) o eucariótico (p. ej., de mamífero).
Constructo de vectores de ácidos nucleicos y células huésped
Se puede preparar una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de un constructo de la variante de SIRP-a mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio) y mutagénesis por PCR. Puede obtenerse una molécula de polinucleótido que codifica un constructo de la variante de SIRP-a de la invención usando técnicas estándar, p. ej., síntesis de genes. Alternativamente, una molécula de polinucleótido que codifica una SIRP-a de tipo salvaje puede mutarse para contener sustituciones de histidina específicas usando técnicas estándar en la técnica, p. ej., mutagénesis QuikChange™. Los polinucleótidos se pueden sintetizar usando un sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR.
Las secuencias de polinucleótidos que codifican los constructos de la variante de SIRP-a pueden insertarse en un vector capaz de replicar y expresar los polinucleótidos en células huésped procariotas o eucariotas. Muchos vectores están disponibles en la técnica y pueden usarse para el propósito de la invención. Cada vector puede contener diversos componentes que se pueden ajustar y optimizar para que sean compatibles con la célula huésped particular. Por ejemplo, los componentes del vector pueden incluir, pero no se limitan a, un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia señal, una secuencia de polinucleótidos que codifica un constructo de la variante de SIRP-a de la invención. y una secuencia de terminación de la transcripción. En algunas realizaciones, un vector puede incluir un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) que permite la expresión de constructos de variantes de SIRP-a múltiples. Algunos ejemplos de vectores de expresión bacteriana incluyen, pero no se limitan a, la serie de vectores pGEX (p. ej., pGEX-2T, pGEX-3X, pGEX-4T, pGEX-5X, pGEX-6P), la serie de vectores pET (p. ej., pET-21, pET-2la, pET-21b, pET-23, pET-24), serie de vectores pACYC (p. ej., pACYDuet-1), serie de vectores pDEST (p. ej., PDEST14, pDESTl5, pDEST24, pDEST42) y pBR322 y sus derivados (véase, p. ej., la patente de e E. UU. No. 5.648.237). Algunos ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pCDNA3, pCDNA4, pNICE, pSELECT, y pFLAG-CMV. Otros tipos de vectores de ácido nucleico incluyen vectores virales para expresar una proteína en una célula (p. ej., una célula de un sujeto). Dichos vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores poxvirales (p. ej., vectores virales de vaccinia, tales como Vaccinia Ankara Modificada (MVA)), vectores virales adenoasociados y vectores alfavirales.
En algunas realizaciones, las células de E. coli se utilizan como células huésped para la invención. Ejemplos de cepas de E. coli incluyen, pero no se limitan a, E. coli 294 (ATCC® 31.446), E. coli A 1776 (ATCC® 31,537, E. coli BL21 (DE3) (ATCC® BAA-1025), y E. coli RV308 (ATCC®31,608). En otras realizaciones, se utilizan células de mamífero como células huésped para la invención. Los ejemplos de tipos de células de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, células de riñón embrionario humano (HEK), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células PC3, células Vero y células MC3T3. Las células huésped diferentes tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y modificación postraduccional de productos proteicos. Las líneas celulares o sistemas huésped apropiados se pueden elegir para asegurar la modificación y procesamiento correcto de la proteína expresada. Los vectores de expresión descritos anteriormente pueden introducirse en células huésped apropiadas usando técnicas convencionales en la técnica, p. ej., transformación, transfección, electroporación, precipitación con fosfato cálcico y microinyección directa. Una vez que los vectores se han introducido en las células huésped para la producción proteica, las células huésped se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados según sea adecuado para la inducción de promotores, selección de transformantes o amplificación de genes que codifican las secuencias deseadas.
Producción, recuperación y purificación de proteínas
Las células huésped utilizadas para producir los constructos de la variante de SIRP-a de la invención pueden cultivarse en medios conocidos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células huésped seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados para células huésped bacterianas incluyen caldo Luria (LB) más los suplementos necesarios, tales como un agente de selección, p. ej., ampicilina. Los ejemplos de medios adecuados para células huésped de mamíferos incluyen Medio Esencial Mínimo (MEM), Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), DMEM con suero bovino fetal suplementado (FBS) y Rp M i-1640.
Las células huésped se cultivan a temperaturas adecuadas, tales como de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 39 °C, por ejemplo, de 25 °C a aproximadamente 37 °C. El pH del medio es generalmente de aproximadamente 6,8 a 7,4, p. ej., 7,0, dependiendo principalmente del organismo huésped. Si se usa un promotor inducible en el vector de expresión de la invención, la expresión de proteínas se induce en condiciones adecuadas para la activación del promotor.
La recuperación de proteínas normalmente implica la alteración de la célula huésped, generalmente por medios tales como choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez que las células se rompen, los restos celulares se pueden eliminar mediante centrifugación o filtración. Las proteínas se pueden purificar adicionalmente, por ejemplo, mediante cromatografía de resina de afinidad. Pueden emplearse métodos estándar de purificación de proteínas conocidos en la técnica. Los siguientes procedimientos son ilustrativos de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico, SDS-PAGE y filtración en gel.
Alternativamente, los constructos de la variante de SIRP-a pueden ser producidas por las células de un sujeto (p. ej., un ser humano), p. ej., en el contexto de la terapia, mediante la administración de un vector (p. ej., un vector retroviral, vector adenoviral, vector poxviral (p. ej., vector viral de vaccinia, como Vaccinia Ankara modificada (MVA)), vector viral adenoasociado y vector alfaviral) que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el constructo de la variante de SIRP-a. El vector, una vez dentro de una célula del sujeto (p. ej., por transformación, transfección, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, infección, etc.) promoverá la expresión del constructo de la variante de SIRP-a, que luego se secreta de la célula.
XV. Composiciones y preparaciones farmacéuticas
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener uno o más constructos de variantes de SIRP-a de la invención como proteínas terapéuticas. Además de una cantidad terapéutica de proteína, las composiciones farmacéuticas pueden contener un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, que puede formularse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más constructos de variantes de SIRP-a de la invención (p. ej., en un vector, tal como un vector viral). La molécula de ácido nucleico que codifica un constructo de la variante de SIRP-a puede clonarse en un vector de expresión apropiado, que puede administrarse mediante métodos bien conocidos en terapia génica.
Los vehículos y excipientes aceptables en las composiciones farmacéuticas no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Los vehículos y excipientes aceptables pueden incluir tampones como fosfato, citrato, HEPES y TAE, antioxidantes como ácido ascórbico y metionina, conservantes como cloruro de hexametonio, cloruro de octadecildimetilbencil amonio, resorcinol y cloruro de benzalconio, proteínas como albúmina de suero humano, gelatina, dextrano e inmunoglobulinas, polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona, aminoácidos como glicina, glutamina, histidina y lisina, e hidratos de carbono como glucosa, manosa, sacarosa y sorbitol. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar por vía parenteral en forma de formulación inyectable. Las composiciones farmacéuticas para inyección se pueden formular usando una disolución estéril o cualquier líquido farmacéuticamente aceptable como vehículo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua estéril, disolución salina fisiológica y medios de cultivo celular (p. ej., medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio Eagles a-modificado (a-MEM), medio F-12).
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar en microcápsulas, tales como hidroxilmetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli(metacrilato de metilo). Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden preparar en otros sistemas de administración de fármacos tales como liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas. Estas técnicas se describen en Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20a edición (2000). Las composiciones farmacéuticas a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden preparar como una formulación de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen los constructos de la variante de SIRP-a de la invención. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, poliactidas (patente de EE.UU. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y y etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™, y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Algunas formulaciones de liberación sostenida permiten la liberación de moléculas durante unos pocos meses, p. ej., de uno a seis meses, mientras que otras formulaciones liberan composiciones farmacéuticas de la invención durante períodos de tiempo más cortos, p. ej., de días a semanas.
La composición farmacéutica puede formarse en forma de dosis unitaria según sea necesario. La cantidad de un componente activo, p. ej., un constructo de la variante de SIRP-a de la invención, incluida en las preparaciones farmacéuticas es tal que se proporciona una dosis adecuada dentro del intervalo designado (p. ej., una dosis dentro del intervalo de 0,01-100 mg/kg de peso corporal).
La composición farmacéutica para terapia génica puede estar en un diluyente aceptable o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que está incrustado el vehículo de administración de genes. Los vectores que se pueden usar como vehículo de suministro de genes in vivo incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores poxvirales (p. ej., vectores virales de vaccinia, tales como Vaccinia Ankara Modificada (MVA)), vectores virales adenoasociados y vectores alfavirales. En algunas realizaciones, un vector puede incluir un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) que permite la expresión de constructos de variantes de SIRP-a múltiples. Otros vehículos y métodos para la administración de genes se describen en las patentes de EE.UU. Nos. 5.972.707, 5.697.901 y 6.261.554.
Otros métodos para producir composiciones farmacéuticas se describen en, p. ej., las patentes de EE.UU. Nos.
5.478.925,8.603.778, 7.662.367 y 7.892.558.
XVI. Vías, dosis y momento de administración
Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen uno o más constructos de las variantes de SIRP-a como las proteínas terapéuticas pueden formularse para administración parenteral, administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intra-arterial, administración intratecal o administración intraperitoneal. La composición farmacéutica también puede formularse o administrarse por vía nasal, en spray, oral, en aerosol, rectal o vaginal. Los métodos de administración de proteínas terapéuticas se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 6.174.529, 6.613.332, 8.518.869, 7.402.155 y 6.591.129, y las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. Nos. US20140051634, WO1993000077 y US20110184145. Se pueden usar uno o más de estos métodos para administrar una composición farmacéutica de la invención que contiene uno o más constructos de variantes de SlRP-a de la invención. Para formulaciones inyectables, se conocen en la técnica diversos vehículos farmacéuticos efectivos. Véase, p. ej., Pharmaceutics and Pharmacy Practice, JB Lippincott Company, Filadelfia, Pensilvania, Banker y Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982), y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a ed., páginas 622-630 (1986).
La dosificación de las composiciones farmacéuticas de la invención depende de factores que incluyen la vía de administración, la enfermedad a tratar y las características físicas, p. ej., edad, peso, salud general del sujeto. Normalmente, la cantidad de un constructo de la variante de SIRP-a de la invención contenida en una dosis única puede ser una cantidad que trate eficazmente la enfermedad sin inducir una toxicidad significativa. Una composición farmacéutica de la invención puede incluir una dosis de un constructo de la variante de SIRP-a que varía de 0.001 a 500 mg (p.ej., 0,05, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,7, 0,8, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg, o 500 mg) y, en una realización más específica, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg y, en una realización más específica, de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 20 mg. La dosis puede ser adaptada por el médico de acuerdo con factores convencionales, tales como la extensión de la enfermedad y distintos parámetros del sujeto.
Una composición farmacéutica de la invención se puede administrar en una cantidad desde aproximadamente 0,001 mg hasta aproximadamente 500 mg/kg/día (p. ej., 0,05, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,7, 0,8, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg o 500 mg/kg/día). Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen un constructo de la variante de SIRP-a se pueden administrar a un sujeto que lo necesite, por ejemplo, una o más veces (p. ej., 1-10 veces o más) al día, semanalmente, mensualmente, bianualmente, anualmente, o según sea médicamente necesario. Las dosis se pueden proporcionar en un régimen de dosificación único o múltiple. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cantidad efectiva es una dosis que varía de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/kg/día, de aproximadamente 0,2 mg a aproximadamente 20 mg del constructo de la variante de SIRP-a por día, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg del constructo de la variante SIRP-a por día, de aproximadamente 0,7 mg a aproximadamente 210 mg del constructo de la variante SIRP-a por semana, 1,4 mg a aproximadamente 140 mg del constructo de la variante SIRP-a por semana, aproximadamente 0,3 mg a aproximadamente 300 mg del constructo de la variante SIRP-a cada tres días, aproximadamente 0,4 mg a aproximadamente 40 mg de la variante SIRP-a construcción cada dos días, y de aproximadamente 2 mg a aproximadamente 20 mg del constructo de la variante de SIRP-a cada dos días. El tiempo entre administraciones puede disminuir a medida que mejora la afección médica o aumentar a medida que disminuye la salud del paciente.
XVII. Método de tratamiento
La invención proporciona constructos de variantes de SIRP-a y composiciones farmacéuticas para uso en métodos de tratamiento y que pueden usarse para tratar pacientes que padecen enfermedades y trastornos asociados con actividad de SIRP-a y/o de CD47, como cánceres y enfermedades inmunológicas. En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a descritos en el presente documento pueden administrarse a un sujeto en un método para aumentar la fagocitosis de una célula diana (p. ej., una célula cancerosa) en el sujeto. En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a pueden administrarse a un sujeto en un método para eliminar las células T reguladoras en el sujeto. En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a pueden administrarse a un sujeto en un método para destruir células cancerosas en el sujeto. En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a pueden administrarse a un sujeto en un método de tratamiento de una enfermedad asociada con actividad de SIRP-a y/o de CD47 en el sujeto, en donde el constructo de la variante de SIRP-a se une preferentemente a CD47 en células enfermas o en un sitio enfermo sobre CD47 en células no enfermas. En algunas realizaciones, las variantes de SIRP-a pueden administrarse a un sujeto en un método para aumentar el injerto de células madre hematopoyéticas en el sujeto, en donde el método incluye modular la interacción entre SIRP-a y CD47 en el sujeto. En algunas realizaciones, los constructos de la variante de SIRP-a pueden administrarse a un sujeto en un método para alterar una respuesta inmune (es decir, suprimir la respuesta inmune) en el sujeto.
En algunas realizaciones, antes de tratar una enfermedad (p. ej., cáncer) en un sujeto, la(s) secuencia(s) de aminoácidos de SIRP-a en el sujeto se determinan, por ejemplo, a partir de cada uno de los dos alelos que codifican el gen de SIRP-a. En este método de la invención, el método determina las secuencias de aminoácidos del polipéptido de SIRP-a en una muestra biológica del sujeto, y luego administra al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un constructo de la variante de SIRP-a. En este método, la variante de SlRP-a en el constructo de la variante de SIRP-a tiene la misma secuencia de aminoácidos que la de un polipéptido de SIRP-a en la muestra biológica del sujeto, excepto por los cambios de aminoácidos introducidos para aumentar la afinidad de la variante de SIRP-a. El constructo de la variante de SIRP-a tiene una inmunogenicidad mínima en el sujeto después de su administración.
Los constructos de la variante de SIRP-a y las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse en diversas terapias contra el cáncer. Los cánceres susceptibles de tratamiento se acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, cáncer de tumor sólido, cáncer hematológico, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, mieloma múltiple, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de cuello de útero, cáncer de endometrio, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de hígado, cáncer de ovarios, cáncer de colon y recto, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de vesícula biliar, cáncer de tumor del estroma gastrointestinal, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de orofaringe, cáncer de esófago, melanoma, cáncer no melanoma de piel, carcinoma de células de Merkel, cáncer inducido por virus, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de células renales, cáncer de pelvis renal, leucemia, linfoma, sarcoma, glioma, tumor cerebral, y carcinoma. En algunas realizaciones, las afecciones cancerosas susceptibles de tratamiento según la invención incluyen cánceres metastásicos. En algunas realizaciones, el cáncer susceptible de tratamiento según la invención es un tumor sólido o cáncer hematológico.
Los constructos de la variante de SIRP-a y las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse en diversas terapias para tratar enfermedades inmunológicas. En algunos aspectos, la enfermedad inmunológica es una enfermedad autoinmune o una enfermedad inflamatoria, tal como la esclerosis múltiple, artritis reumatoide, una espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, una enfermedad inflamatoria o autoinmune mediada por anticuerpos, enfermedad de injerto contra huésped, sepsis, diabetes, psoriasis, aterosclerosis, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica progresiva, esclerodermia, síndrome coronario agudo, reperfusión isquémica, enfermedad de Crohn, endometriosis, glomerulonefritis, miastenia grave, fibrosis pulmonar idiopática, asma, síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), vasculitis o miositis inflamatoria autoinmune.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Métodos
Producción de constructos de variantes de SIRP-a
Todos los constructos de genes se generan utilizando síntesis de genes y codones optimizados para la expresión en células de mamíferos (DNA2.0). Los genes se clonan en vectores de expresión de mamíferos y se expresan usando el promotor del intrón CMVa. Se ha diseñado una secuencia líder en el extremo N-terminal de los constructos para garantizar la señalización y el procesamiento adecuado para la secreción. La expresión de las proteínas de fusión SIRP-a se lleva a cabo utilizando células Expi293F™ (Life Technologies). Esta línea celular está adaptada al cultivo en suspensión sin suero de alta densidad en el medio de expresión Expi293F™ y es capaz de producir altos niveles de proteínas recombinantes. Los procedimientos de transfección se han realizado de acuerdo con el manual del fabricante. El sobrenadante se recolecta típicamente a los 5-7 días después de la transfección. Los constructos de proteínas están diseñados para llevar una etiqueta de afinidad 6xhistidina y esto permite la purificación por cromatografía de afinidad. La columna se equilibró primero con imidazol 5 mM, Tris HCl 100 mM (pH 8), NaCl 500 mM. El medio clarificado que expresa las diversas construcciones de variantes de SIRP-a se carga en resina de afinidad Hi-Trap Ni Sepharose excel en Avant 25 (GE Healthcare). Se realiza otra etapa de equilibrado. Después de eso, la columna se lava con imidazol 40 mM, Tris 100 mM, NaCl 500 mM y posteriormente se eluye con imidazol 250 mM, Tris 100 mM, NaCl 500 mM. Las fracciones eluidas que contienen los constructos de la variante de SIRP-a se combinan y luego se intercambian con tampón en 1X PBS.
Escisión in vitro de proteínas SIRP-a
La uPA humana recombinante y la matriptasa se compran de R&D systems. Se añaden 3 pM de proteínas SIRP-a a cantidades respectivas de uPA y matriptasa (0,1 a 44 ng) en Tris HCl 50 mM (pH 8,5), Tween al 0,01% como se describe. Las reacciones de digestión se incuban típicamente durante 18-24 horas a 37 °C. Para detener la reacción, se añade tinte de carga SDS-PAGE a la reacción y se calienta a 95 °C durante 3 minutos. Para evaluar la escisión, las muestras digeridas se separan en una SDS-PAGE de Tris-Glicina al 4-20%.
Ejemplo 2 - Diseño de constructos de la variante de SIRP-a que se activarán específicamente en tejido tumoral
El objetivo es diseñar constructos de la variante de SIRP-a que permanecerán inertes hasta que se activen localmente para unirse a CD47 en el tejido tumoral. Esto limitará la unión de SIRP-a a CD47 en la superficie celular de las células no enfermas y evitará la toxicidad indeseable "en la diana" "fuera del tejido". Para generar tales constructos de la variante de SIRP-a, los péptidos de bloqueo (p. ej., un péptido bloqueante basado en CD47) se fusionan genéticamente con la variante de SIRP-a por medio de un enlazador escindible. Los péptidos bloqueantes explorados se basan en sitios de interacción CD47 con SIRP-a y las secuencias se describen a continuación (secciones (a)-(c)). Los espaciadores que contienen unidades repetidas de GGGGS están diseñados para flanquear el enlazador escindible, que a menudo codifica un sitio de reconocimiento de proteasa. En algunas realizaciones, el sitio de escisión de la proteasa elegido es LSGRSDNH, pero son posibles muchas otras. El sitio de escisión de la proteasa LSGRSDNH se selecciona por su sensibilidad a numerosas proteasas que se regulan positivamente en una variedad de carcinomas humanos, por ejemplo, matriptasa (MTSP1), activador del plasminógeno de tipo urinario (uPA), legumaína, PSA (también llamado KLK3, peptidasa-3 relacionada con calicreína), metaloproteinasa-2 de matriz (MMP-2), MMP9, elastasa de neutrófilos humanos (HNE) y proteinasa 3 (Pr3) (Ulisse et al., Curr. Cancer Drug Targets 9:32-71, 2009; Uhland et al., Cell. Mol. Life Sci. 63:2968-2978, 2006; LeBeau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 110:93-98, 2013; Liu et al., Cancer Res. 63:2957-2964, 2003).
(a) Bloqueo de SIRP-a por péptidos bloqueadores basados en CD47
Los péptidos bloqueantes basados en CD47 se describen previamente. Estos péptidos se unen a SIRP-a con diferentes afinidades y bloquean su función. El extremo N-terminal de CD47 es importante para la interacción con SIRP-a, por lo tanto, el análisis estructural predijo la fusión de SIRP-a con el extremo C-terminal de CD47. Para comprender mejor los resultados, se exploran las fusiones de los extremos N-terminal y C-terminal con diferentes longitudes de espaciadores. Diferentes péptidos bloqueantes basados en CD-47 (p. ej., péptidos enumerados en la Tabla 6) se fusionan al extremo N- o C-terminal de una variante de SIRP-a con un enlazador escindible y uno o más espaciadores. Se muestran secuencias ilustrativas de proteínas de fusión que contienen un péptido bloqueante basado en CD47 fusionado a una variante de SIRP-a por medio de un enlazador escindible y uno o más espaciadores en las secuencias de SEQ ID NOs: 48-56, en las que la parte subrayada simple indica el péptido bloqueante basado en CD47, la parte subrayada doble indica el enlazador escindible y la parte en negrita indica la variante de SIRP-a. Las secuencias de SEQ ID NOs: 48-51 contienen péptidos bloqueantes basados en CD47 que incluyen 12 o 21 aminoácidos y espaciadores de 2-3 repeticiones de GGGGS. Las secuencias de SEQ ID NOs: 52-56 contienen péptidos bloqueantes basados en CD47 que incluyen el dominio IgSF de CD47 (truncado en VVS) que tiene una sustitución C15S y espaciadores de 2-5 repeticiones de GGGGS o 3-6 repeticiones de GGS. Además, en algunas realizaciones, una Hs A puede fusionarse con el extremo C-terminal de cualquiera de las secuencias de SEQ ID NOs: 48-56. Además, en algunas realizaciones, un monómero de dominio Fc o una HSA (SEQ ID NO: 68) puede fusionarse con el extremo N o C-terminal de una cualquiera de las proteínas de fusión enumeradas en la Tabla 10.
Tabla 10
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
(b) Bloqueo de la variante de SIRP-a por un muíante CD47 de baja afinidad que tiene un extremo N extendido
Debido a la alta afinidad de la variante de SIRP-a por CD47, existe una posibilidad de que después de escindir el enlazador, la proteína de fusión no se disocie y la variante de SIRP-a pueda permanecer bloqueada. Para resolver esto, estudiamos la estructura del complejo SIRP-a-CD47 y diseñamos mutantes CD47 con afinidad de unión reducida para la variante de SIRP-a en relación con la afinidad de unión por una SIRP-a de tipo salvaje. Por tanto, después de la escisión por proteasa del enlazador, el mutante CD47 se disociará de la variante SIRP-a. Los mutantes CD47 diseñados se describen a continuación. Los experimentos iniciales se realizarán fusionando la variante de SIRP-a con el CD47 de tipo salvaje. Estos constructos de la variante de SIRP-a que incluyen una variante de SIRP-a y un mutante de CD47 o CD47 de tipo salvaje se escindirán in vitro, se analizarán mediante SDS-page para asegurar la escisión y se medirán con biacore para ver su capacidad de unión a CD47 (es decir, la unión de la variante de SIRP-a a CD47 de tipo salvaje después de que el mutante CD47 se disocie de la variante de SIRP-a). Si los constructos iniciales de la variante de SIRP-a que contienen una variante de SIRP-a fusionada con el CD47 de tipo salvaje se expresan, pueden bloquear la unión de CD47 antes de la escisión de proteasa y pueden unirse a CD47 después de la escisión de proteasa, es posible que no se necesiten mutantes de CD47. Si estos constructos de la variante de SIRP-a iniciales están inactivos (es decir, pueden escindirse pero no se unen a CD47 después de la escisión de proteasa debido a la falta de disociación), entonces se ensayarán otras proteínas de fusión que contienen una variante de SIRP-a fusionada a los mutantes de CD47 de baja afinidad.
En la estructura co-cristalizada de CD47:SIRP-a (PDB: 4KJY, 4CMM), el extremo N-terminal de CD47 existe como un piro-glutamato y hace interacciones de enlace de hidrógeno con Thr66 de una variante de SIRP-a o Leu66 de una SIRP-a de tipo salvaje (Figura 1). Se plantea la hipótesis de que extender el extremo N-terminal de CD47 mediante la adición de un aminoácido, p. ej., una glicina, evitará la ciclación de glutamina a piroglutamato y también creará otros contactos e interacciones no deseados que probablemente interrumpirán las interacciones de enlace de hidrógeno con Thr66 o Leu66 y, por lo tanto, perturbarán la unión de CD47 a SIPR-a. Las secuencias de las proteínas de fusión que contienen un mutante de dominio de IgSF de CD47 de baja afinidad y una variante de SIRP-a se muestran en SEQ ID NOs: 57-59 en la Tabla 11, en la que la parte subrayada simple indica el mutante de dominio de IgSF de CD47 de baja afinidad que contiene aminoácidos. 1-118 y C15S, con respecto a SEQ ID NO: 46 en la Tabla 6, la parte subrayada doble indica el enlazador escindible y la parte en negrita indica la variante de SIRP-a. Las SEQ ID NOs: x10-x12 también incluyen espaciadores de 3-5 repeticiones de GGGGS. Se pueden diseñar y expresar secuencias similares a las SEQ ID NOs: x10-x12 en las que un mutante de dominio IgSF de CD47 de baja afinidad se fusiona con el extremo C-terminal de una variante de SIRP-a por medio de un enlazador escindible y uno o más espaciadores.
Tabla 11
Figure imgf000036_0002
Figure imgf000037_0002
(c) Bloqueo de SIRP-a por un muíante de dominio de igSF de CD47 de baja afinidad que tiene sustituciones de aminoácidos
CD47 se une a un bolsillo profundo a SIRP-a (código PDB: 4KJY y 4CMM). Se ha realizado un modelado computacional para identificar residuos de aminoácidos en la región de bolsillo de CD47, que, cuando se mutan, reducirían la afinidad de unión de CD47 a la variante de SIRP-a, pero mantendrían la afinidad de unión de CD47 a SIPR-a de tipo salvaje. Los residuos de CD47 identificados son Ll01Q, L101H, L101Y, T102Q y T102H. Se plantea la hipótesis de que un mutante de dominio de IgSF de CD47 de baja afinidad que contenga una de estas sustituciones será capaz de bloquear la variante de SIRP-a de manera eficaz en el modo anclado. Sin embargo, al alcanzar el sitio del tumor y la escisión por proteasas en el enlazador localmente, el mutante del dominio IgSF de CD47 de baja afinidad se disociará de la variante de SIRP-a para unirse a una SIRP-a de tipo salvaje, dejando libre a la variante de SIRP-a. para unirse a CD47 en la superficie celular de las células tumorales. El mutante de dominio de IgSF de CD47 de baja afinidad disociado ahora puede bloquear la actividad de SIRP-a de tipo salvaje. Esto potencialmente dará como resultado una actividad de doble bloqueo mejorada del mutante del dominio IgSF de CD47 de baja afinidad liberado y la variante de SIRP-a. Para ilustrar cómo se seleccionan los residuos de aminoácidos y el principio de cómo esto puede resultar en bloqueo diferencial de SIRP-a de tipo salvaje y variante de SIRP-a, se muestra un ejemplo usando Ala27 de un SIRP-a de tipo salvaje (Figura 2). Por ejemplo, Ala27 del SIRP-a de tipo salvaje es un residuo más pequeño que IIe27 en la variante de SIRP-a. Por lo tanto, al mutar Thr102 en el CD47 de tipo salvaje a un aminoácido más grande como Gln102, Gln102 en el mutante del dominio IgSF de CD47 de baja afinidad puede dar como resultado un choque estérico con IIe27 en la variante de SIRP-a en el sitio de interacción correspondiente. Sin embargo, se conservaría la interacción entre el mutante CD47 que tiene sustitución de Thr102Gln y la SIRP-a de tipo salvaje que tiene Ala27. Por consiguiente, el mutante CD47 tendría una baja afinidad de unión a la variante de SIRP-a y una afinidad de unión relativamente mayor a la SIRP-a de tipo salvaje. Las secuencias de algunos mutantes de dominio de IgSF de CD47 de baja afinidad ilustrativas se muestran en las SEQ ID NOs: 41-45 en la Tabla 6. Secuencias de los constructos de la variante de SIRP-a que contienen un mutante de dominio de IgSF de CD47 de baja afinidad que tiene sustituciones de aminoácidos y una variante de SIRP-a se muestran en las SEQ ID NOs: 60-63 en la Tabla 12, en la que la parte subrayada simple indica el mutante del dominio IgSF de CD47 de baja afinidad que contiene la sustitución de aminoácidos L10lQ, L101Y, T102Q y T102H, respectivamente, la parte subrayada doble indica la enlazador escindible y la parte en negrita indica la variante de SIRP-a. Las SEQ ID NOs: 60-63 también incluyen espaciadores de 3-5 repeticiones de GGGGS. Se pueden diseñar y expresar secuencias similares a las SEQ ID NOs: 60-63 en las que un mutante de dominio IgSF de CD47 de baja afinidad se fusiona con el extremo C-terminal de una variante de SIRP-a por medio de un enlazador escindible y uno o más espaciadores.
Tabla 12
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
Ejemplo 3 - Expresión y producción de constructos de la variante de SIRP-a para estudios in vitro
Diversos constructos de la variante de SIRP-a (SEQ ID NOs: 48-56) que incluyen una variante de SIRP-a y un péptido bloqueante basado en CD47 se expresaron en células de mamífero Expi293-F. Todas los constructos se diseñaron con una secuencia líder que permitió su expresión como proteínas secretadas en el medio. Todas los constructos se expresaron en la forma soluble y se purificaron usando aislamiento de IMAC en una etapa hasta un alto grado de pureza (Figuras 3A y 3B). La Figura 3A muestra un gel de SDS-PAGE reducido de constructos de variante de SIRP-a de SEQ ID NOs: 48-56 y la Figura 3B muestra un gel SDS-PAGE no reducido de los constructos de la variante de SIRP-a. Los datos de exclusión por tamaño indicaron que los constructos de la variante de SIRP-a no están agregadas (datos no mostrados).
Ejemplo 4- Escisión in vitro de proteínas de fusión SIRP-a y CD47
Para determinar si los constructos de la variante de SIRP-a (p. ej., SEQ ID NOs: 48-63) se escindirían específicamente in vivo en tejidos tumorales, se realizaron experimentos in vitro utilizando proteasas uPA y matriptasa, que comúnmente se sabe que están reguladas positivamente en cánceres, para escindir los constructos de la variante de SIRP-a. Los experimentos iniciales se realizaron usando el constructo de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 54) para determinar la escisión de proteasa y optimizar las condiciones de escisión. La Figura 4A muestra los resultados de los ensayos de escisión por uPA y matriptasa. Se incubó el constructo de la variante de SIRP-a 3 ^M (SEQ ID NO: 54) durante 18 horas a 37 °C usando un exceso de uPA o matriptasa. El carril 1 de la Figura 4A muestra el experimento de control sin adición de proteasa y los carriles 2 y 3 muestran la incubación del constructo de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 54) con uPA y matriptasa, respectivamente. Los datos obtenidos como se muestra en la Figura 4A demuestra claramente que el constructo de la variante SIRP-a (SEQ ID No: 54) se puede escindir y liberar in vitro digiriendo el constructo de la variante SIRP-a con exceso de uPA y matriptasa durante 18 horas a 37 °C. La variante de SIRP-a escindida migra como una banda de peso molecular de ~ 17 KDa. El CD47 escindido migra con bandas de frotis, muy probablemente debido a la glicosilación, alrededor de 36-40 kDa. Comparando la cantidad de constructo de la variante de SIRP-a sin cortar en los carriles 2 y 3 de la Figura 4A, parece que se logró una escisión más completa usando matriptasa en comparación con el uso de uPA.
Por lo tanto, se realizó una optimización adicional de las condiciones de escisión usando solo matriptasa y los resultados se muestran en la Figura 4B. Se ensayaron diferentes cantidades de matriptasa y la escisión se realizó durante 18 horas a 37 °C. El carril 1 de la Figura 4B muestra el experimento de control sin adición de matriptasa y los carriles 2-4 cada uno muestra la escisión realizada con 44 ng, 0,44 ng y 0,167 ng de matriptasa, respectivamente. Los datos obtenidos indican que 0,44 ng de enzima son suficientes para la escisión completa en las condiciones actuales. A continuación, se ensayó la escisión de los constructos de la variante de SIRP-a restantes utilizando las condiciones de escisión optimizadas. Como ejemplo y se muestra en la Figura 4C, los respectivos constructos de la variante de SIRP-a (SEQ ID NOs: 57-63) se escindieron con éxito in vitro mediante matriptasa utilizando las condiciones de escisión optimizadas. Los carriles 1-7 de la Figura 4C corresponden a las proteínas de fusión no escindidas de las SEQ ID NOs: 57-63, respectivamente. Los carriles 8-14 de la Figura 4C corresponden a las proteínas de fusión de las SEQ ID NOs: 57-63, respectivas, escindidas con matriptasa.
Ejemplo 5: afinidades de unión de constructos de la variante de SIRP-a
La unión de CD47-hFc humano (R&D Systems, número de catálogo 4670-CD) a constructos de la variante de SIRP-a se analizó en un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) usando disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) suplementada con Tween-20 al 0,01% como tampón de funcionamiento.
Se inmovilizaron 370 unidades de resonancia (RU) de CD47-hFc en la celda de flujo 2 de un chip sensor CM4 (GE Healthcare) mediante acoplamiento de amina estándar. La celda de flujo 1 se activó con EDC/NHS y se bloqueó (con etanolamina) para que sirva de referencia. Todas los constructos de la variante de SIRP-a se inyectaron a 50 nM o 100 nM durante dos minutos a una velocidad de flujo de 30 pL/min y seguido de diez minutos de tiempo de disociación. Después de cada inyección, la superficie se regeneró utilizando una mezcla 2:1 de tampón de elución Pierce IgG (Life Technologies, número de catálogo 21004) y NaCl 4 M. La regeneración completa de la superficie se confirmó inyectando las variantes de SIRP-a al comienzo y al final del experimento. Todos los sensogramas fueron doblemente referenciados usando la celda de flujo 1 y una inyección de tampón.
Para todas las muestras, se determinó la señal de unión a 100 nM después de 50 segundos de asociación, se normalizó por el peso molecular del constructo de la variante de SIRP-a y se expresó como porcentaje de la respuesta de unión máxima. La unión de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 31) a 100 nM normalizada por su PM se usó como respuesta de unión máxima. Los resultados en la Figura 5A muestran que los constructos de la variante de SIRP-a (SEQ ID NOs: 48-51) no bloquean las variantes de SIRP-a para que no se unan a CD47 en el chip. Después de la escisión del enlazador, la actividad de unión aumenta modestamente. Los constructos de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 52-54) bloquearon eficazmente la unión de la variante de SIRP-a a CD47 en el chip. Sin embargo, después de la escisión del enlazador, la actividad de unión de la variante de SIRP-a a CD47 en el chip solo aumentó modestamente, lo que sugiere que la alta afinidad de interacción entre la variante de SIRP-a y el dominio IgSF de CD47 mantiene el complejo unido y por lo tanto, el dominio IgSF de CD47 continúa bloqueando la variante de SIRP-a incluso después de que se escinda el enlazador. Sorprendentemente, cuando el dominio IgSF de CD47 se fusiona con el extremo C-terminal de SIRP-a (SEQ ID NO: 55), el constructo de la variante de SIRP-a intacta se bloquea eficazmente para que no se una a CD47 en el chip (lo mismo que las proteínas de fusión de SEQ ID NOs: 52-54), pero la escisión del enlazador restaura el 100% de la unión de la variante SIRP-a a CD47 en el chip, lo que sugiere que el dominio IgSF de CD47 se disocia de la variante SIRP-a después de la escisión del enlazador, por tanto, la variante SIRP-a es libre de unirse a CD47 en el chip. Posteriormente se ensayó otro constructo con CD47 fusionado al extremo C-terminal de una variante de SIRP-a (véase la Figura 5B). Este constructo (SEQ ID NO: 56), que contiene un espaciador más largo, también recuperó la actividad después de la escisión, lo que confirma el enfoque general de unir el extremo N-terminal de un péptido bloqueante basado en CD47 al extremo C-terminal de una variante SIRP-a para obtener constructos de SIRP-a en los que el péptido bloqueante basado en CD47 bloquea eficientemente la variante de SIRP-a y se disocia después de la escisión del enlazador escindible.
Para examinar más a fondo la afinidad de unión de los constructos de la variante de SIRP-a, se analizaron los constructos de la variante de SIRP-a de SEQ ID NOs: 52-63 en el instrumento Biacore siguiendo el mismo protocolo descrito anteriormente. Los constructos de la variante de SIRP-a de SEQ ID NOs: 52-54 contienen el dominio IgSF de CD47 que tiene los aminoácidos 1-117 y C15S, en relación con CD47 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 35) fusionado al extremo N-terminal de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 31) a través del enlazador escindible LSGRSd Nh y múltiples espaciadores de diferentes longitudes. Los constructos de la variante de SIRP-a de SEQ ID NOs: 55 y 56 contienen el dominio IgSF de CD47 que tiene los aminoácidos 1-117 y C15S, en relación con CD47 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 35) fusionado al extremo C-terminal de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 31) a través del enlazador escindible LSGRSDNH y múltiples espaciadores de diferentes longitudes. Los constructos de la variante de SIRP-a de SEQ ID NOs: 57-59 contienen el dominio IgSF de CD47 que tiene los aminoácidos 1-118 y C15S, en relación con la SEQ ID NO: 46 en la Tabla 6 fusionados al extremo N-terminal de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 31) a través del enlazador escindible LSGRSDNH y múltiples espaciadores de diferentes longitudes. Los constructos de la variante de SIRP-a de SEQ ID NOs: 60-63 contienen el dominio IgSF de CD47 que tiene los aminoácidos 1-117 de SEQ ID NOs: 41, 42, 44 y 45 en la Tabla 6, respectivamente, fusionado al extremo N-terminal de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 31) a través del enlazador escindible LSGRSDNH y múltiples espaciadores de diferentes longitudes.
La Figura 5B muestra que los constructos de la variante de SIRP-a de las SEQ ID NOs: 55 y 56 se bloquearon eficazmente de la unión a CD47 en el chip antes de la escisión del enlazador, pero la escisión del enlazador restaura el 100% de la actividad de unión. Se observaron resultados similares para los constructos de la variante de SIRP-a de SEQ ID NO: 57-63. Observamos que al extender el extremo N-terminal del péptido bloqueante basado en CD47 por un residuo de glicina generó un constructo de la variante de SIRP-a que se bloqueó de manera eficiente antes de que el enlazador se escindiera y posteriormente se recuperó cerca del 100% de la actividad de unión de CD47 después del tratamiento de proteasa (SEQ ID NOs: 57-59), lo que demuestra la disociación del péptido bloqueante basado en CD47 de la variante de SIRP-a después de la escisión del enlazador.
Este resultado sugiere que la variante de SIRP-a fusionada con el extremo N-terminal del péptido bloqueante basado en CD47 a través de un enlazador escindible y espaciadores funciona bien. El enlazador escindible estabiliza el complejo de fusión y, una vez escindido, el extremo N-terminal extendido del péptido bloqueante basado en CD47, que incluye un fragmento del enlazador escindible unido al extremo N-terminal del péptido bloqueante basado en CD47, evita la unión del péptido bloqueante basado en CD47 a la variante de SIRP-a. El mismo efecto se obtiene fusionando un péptido bloqueante basado en CD47 que tiene una o más adiciones de aminoácidos, p. ej., una adición de glicina (p. ej., secuencias de SEQ ID NO: 46 en la Tabla 6), en el extremo N-terminal del péptido bloqueante-CD47 al extremo C-terminal de una variante de SIRP-a por medio de un enlazador escindible y uno o más espaciadores. Este mismo efecto también se observa fusionando un péptido bloqueante basado en CD47 que tiene una o más sustituciones de aminoácidos, p. ej., L101Q, L101Y, L101H, T102Q o T102H (p. ej., secuencias de SEQ ID NOs: 41­ 45 en la Tabla 6), al extremo C-terminal de una variante de SIRP-a por medio de un enlazador escindible y uno o más espaciadores. Hemos demostrado que los péptidos bloqueantes basados en CD47 se pueden fusionar al extremo C-terminal de una variante de SIRP-a y pueden bloquear la unión de la variante de SIRP-a a CD47 antes de la escisión del enlazador y liberar la variante de SIRP-a después de la escisión del enlazador (ver, p. ej., SEQ ID NO: 55 en la Figura 5A y SEQ ID NOs: 55 y 56 en la Figura 5B).
Con base en esta información, podemos crear proteínas de fusión de variantes de SIRP-a bloqueadas por CD47, es decir, fusionando un monómero de dominio Fc o HSA con una variante de SIRP-a, eligiendo la orientación (p. ej., fusión extremo N- o C-terminal) que da mejores resultados en farmacocinética, eficacia, seguridad, producción y estabilidad del producto.
Ejemplo 6 - Direccionamiento específico de variantes de SIRP-a a través del péptido de unión al anticuerpo
Primero, usamos Cetuximab, que se sabe que contiene un sitio de unión para el DLP que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 64, para verificar si el constructo de la variante de SIRP-a que incluye una variante de SIRP-a y el DLP es capaz de concentrarse en el anticuerpo unido. Inmovilizamos Cetuximab usando química de EDC/NHS en un chip CM4 biacore (2000RU) y fluyó el constructo de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 66) a 100 nM y 50 nM usando Pb S 0,01% P20 como tampón de ejecución y muestra a 30 pL/min en el chip (biacore T100). La Figura 6 muestra la unión del constructo de la variante de SIRP-a, pero no la variante de SIRP-a sola, en el chip. Luego inyectamos CD47-ECD y vimos la unión de CD47 en el caso en el que se usó el constructo de la variante de SIRP-a, demostrando que el constructo de la variante de SIRP-a puede unirse a EGFR y CD47 simultáneamente (Figura 6). Por lo tanto, el constructo de la variante de SIRP-a que incluye una variante de SIRP-a y una DLP inyectada a un paciente con cáncer se concentraría en el sitio donde se acumula el anticuerpo terapéutico (p. ej., Cetuximab), aumentando la eficacia y reduciendo la toxicidad.
En segundo lugar, demostramos que el constructo de la variante de SIRP-a que incluye una variante de SIRP-a y un DLP puede primero unirse a Cetuximab que está unido a EGFR y luego unirse a CD47. Un esquema del complejo de unión se muestra en la Figura 7A. Inmovilizamos 3000 RU de hrEGFR-Fc (R&D Systems) a un chip CM4 usando química de EDC/NHS. Usando PBS 0,01% P20 como muestra y tampón de ejecución a 30 pL/min (biacore T100), inyectamos diferentes concentraciones (4, 20 y 100 nM) de Cetuximab. Se observó la unión de Cetuximab al hrEGFR-Fc inmovilizado. A continuación, inyectamos el constructo de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 66) a 100 nM y observamos la unión. No se observó unión cuando se inyectó la variante de SIRP-a sola. Luego inyectamos CD47-ECD a 100 nM y observamos la unión. Los datos se muestran en las Figuras 7B y 7C. Por lo tanto, demostramos que es posible la formación del constructo de la variante del complejo cuaternario EGFR-Cetuximab-SIRP-a de SEQ ID NO: 66-CD47. El constructo de la variante de SIRP-a que incluye una variante de SIRP-a y un DLP es capaz de unirse e inhibir CD47 cuando el constructo se preconcentra en el sitio de la enfermedad uniéndose específicamente a un anticuerpo específico de tumor (p. ej., Cetuximab). Además, siguiendo el mismo concepto, un constructo de la variante de SIRP-a que incluye una variante de SIRP-a, un DLP y un péptido bloqueante basado en CD47 también puede unirse e inhibir CD47 cuando el constructo se concentra previamente en el sitio enfermo mediante la unión específicamente a un anticuerpo específico de tumor (p. ej., Cetuximab).
Ejemplo 7: ensayo de fagocitosis
El constructo de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 66), que incluye una variante de SIRP-a unida a DLP a través de espaciadores, y una variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 31) se ensayaron en un ensayo de fagocitosis en células DLD1 (Figura 8). El ensayo de fagocitosis se realizó como se describe en, p. ej., Weiskofp et al, Science 341:88-91,2013. A continuación se describe un protocolo experimental. El constructo de la variante de SIRP-a (SEQ ID NO: 66) mostró una potencia más alta que la variante de SIRP-a sola (SEQ ID NO: 31), presumiblemente debido a una mayor acumulación en las células enfermas.
Se obtuvieron capas leucocitarias del Stanford Blood Center de donantes anónimos, y las células mononucleares de sangre periférica se enriquecieron mediante centrifugación en gradiente de densidad sobre Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare). Los monocitos se purificaron usando Macs Miltenyi Biotec Monocyte Isolation Kit II de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este es un sistema de etiquetado magnético indirecto para el aislamiento de monocitos de PBMC humanas. Los monocitos aislados se diferencian en macrófagos mediante cultivo en medio RPMI 1640 complementado con suero AB humano inactivado por calor al 10% y GlutaMax al 1% y penicilina al 1% y estreptomicina (GIBCO Life Technologies) durante 6-10 días. Para el ensayo de fagocitosis, se colocaron en placa 100.000 GFP+ DLD-1 células en pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo en U de unión ultra baja (Corning 7007). Se añadieron 50 pL/pocillo de o bien de isotipo control de IgG1k a 4 pg/ml o Cetuximab a 4 pg/ml (Absolute Antibody, Ab00279-10.0) a células tumorales DLD-1 y se preincubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, se añadieron variantes de SIRP-a a 50 pL/pocillo y también se añadieron a cada pocillo macrófagos a 50 pL/pocillo (1 x 106/ml) (50.000 macrófagos). La dilución final de los anticuerpos y las muestras del constructo SIRP-a es 1:4. La concentración final de cetuximab es 1 pg/ml. El cocultivo de macrófagos, células tumorales, anticuerpos y constructos de la variante de SIRP-a se lleva a cabo durante 2 horas a 37 ° C. Para el análisis, las muestras de células se fijaron, tiñeron y analizaron con BD FACS Canto. Los macrófagos humanos primarios se identificaron mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-CD14, anti-CD45 o anti-CD206 (BioLegend). Las células muertas se excluyeron del análisis mediante tinción con DAPI (Sigma). La fagocitosis se evaluó como el porcentaje de macrófagos g Fp y se normalizó a la respuesta máxima de cada donante independiente frente a cada línea celular.
Ejemplo 8: Modelado de la unión dependiente del pH de variantes de SIRP-a a CD47
Para diseñar la unión dependiente del pH de un constructo de la variante de SIRP-a de la invención, se puede realizar mutagénesis de histidina en la variante de SIRP-a, especialmente en la región de SIRP-a que interactúa con CD47. Las estructuras cristalinas de un complejo de SIRP-a y CD47 (ver, p. ej., PDB ID No. 2JJS) y modelado computacional pueden usarse para visualizar el sitio de unión tridimensional de SIRP-a y CD47. El diseño computacional y los métodos de modelado útiles en el diseño de una proteína con propiedades de unión sensibles al pH se conocen en la bibliografía y se describen, p. ej., en Strauch et al., Proc Natl Acad Sci. 111:675-80, 2014, que se incorpora por referencia a la presente en su totalidad. En algunas realizaciones, el modelado computacional puede usarse para identificar residuos de contacto clave en la interfaz de SIRP-a y CD47. Los residuos de contacto clave identificados pueden sustituirse por residuos de histidina utilizando el software de diseño de proteínas disponible (p. ej., RosettaDesign), que puede generar diversos diseños de proteínas que pueden optimizarse, filtrarse y clasificarse en función de la energía de unión calculada y la complementariedad de la forma. Por lo tanto, pueden identificarse sustituciones de histidina energéticamente favorables en determinadas posiciones de aminoácidos utilizando métodos de diseño computacional. El modelado computacional también puede usarse para predecir el cambio en la estructura tridimensional de SIRP-a. Se pueden evitar las sustituciones de histidina que generan un cambio significativo en la estructura tridimensional de SIRP-a.
Una vez que se identifican las sustituciones de aminoácidos óptimas desde el punto de vista energético y estructural, los aminoácidos pueden sustituirse sistemáticamente con residuos de histidina. En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, etc., con un máximo de 20) de SIRP-a pueden sustituirse con residuos de histidina. En particular, los aminoácidos ubicados en la interfaz de SIRP-a y CD47, preferiblemente, los aminoácidos directamente implicados en la unión de SIRP-a a CD47, pueden sustituirse por residuos de histidina. Las variantes de SIRP-a de la invención pueden incluir una o más (p. ej., una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, etc., con un máximo de 20) sustituciones de residuos de histidina. En otras realizaciones, los residuos de histidina de origen natural de SIRP-a pueden sustituirse por otros residuos de aminoácidos. En otras realizaciones más, uno o más aminoácidos de SIRP-a pueden sustituirse con residuos que no son histidina para ejercer efecto en la unión de residuos de histidina de origen natural o sustituidos con CD47. Por ejemplo, la sustitución de los aminoácidos que rodean un residuo de histidina de origen natural por otros aminoácidos puede "enterrar" el residuo de histidina de origen natural. En algunas realizaciones, los aminoácidos que no participan directamente en la unión con CD47, es decir, los aminoácidos internos (p. ej., los aminoácidos ubicados en el núcleo de SIRP-a) también pueden sustituirse con residuos de histidina. La Tabla 4 enumera aminoácidos SIRP-a específicos que pueden sustituirse con residuos de histidina. Los residuos de contacto son los aminoácidos ubicados en la interfaz de SIRP-a y CD47. Los residuos del núcleo son los aminoácidos internos que no participan directamente en la unión entre SIRP-a y CD47. Las variantes de SIRP-a pueden incluir una o más (p. ej., una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, etc., o todas) de las sustituciones enumeradas en la Tabla 4.
Ejemplo 9: Generación y selección de variantes de SIRP-a con unión a CD47 dependiente del pH
Las variantes de SIRP-a que contienen una o más (p. ej., una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, etc., con un máximo de 20) sustituciones de aminoácidos con residuos de histidina pueden generarse utilizando técnicas convencionales de clonación molecular y expresión de proteínas. Una molécula de ácido nucleico que codifica una variante de SIRP-a de la invención puede clonarse en un vector optimizado para la expresión en bacterias usando técnicas de biología molecular bien conocidas. A continuación, el vector se puede transformar en células bacterianas (p. ej., células de E. coli), que se pueden cultivar hasta una densidad óptima antes de la inducción de la expresión de proteínas. Después de la inducción de la expresión de proteínas (es decir, usando IPTG), se puede permitir que las células bacterianas crezcan durante 24 horas más. Se pueden recolectar células y la proteína variante de SIRP-a expresada se puede purificar del sobrenadante del cultivo celular usando, p. ej., cromatografía en columna de afinidad. La variante de SIRP-a purificada puede analizarse mediante SDS-PAGE seguida de tinción con azul de Coomassie para confirmar la presencia de bandas de proteínas del tamaño esperado.
Las variantes de SIRP-a purificadas pueden seleccionarse para determinar la unión dependiente del pH a CD47 usando técnicas disponibles en la técnica, tales como presentación de fagos, presentación de levadura, resonancia de plasmón superficial, ensayos de centelleo de proximidad, ELISA, inmunoensayo ORIGEN (IGEN), extinción de fluorescencia y/o transferencia de fluorescencia. La unión también se puede evaluar usando un bioensayo adecuado. La variante de SIRP-a deseada se une con mayor afinidad a CD47 a pH ácido (p. ej., menos de pH 7 (p. ej., pH 6)) que a pH neutro (p. ej., pH 7,4). El Kd de un complejo SIRP-a/CD47 a pH 6 sería menor que Kd de un complejo SIRP-a/CD47 a pH 7,4.
Ejemplo 10: Ensayo de variantes de SIRP-a con unión dependiente del pH a CD47 en ratones
Pueden usarse modelos de ratón diseñados genéticamente de varios cánceres, p. ej., tumor sólido y cáncer hematológico, para ensayar la unión dependiente del pH de las variantes de SIRP-a de la invención a CD47 en un sitio enfermo en un modelo de ratón. Se puede inyectar una variante de SIRP-a directa o indirectamente en el sitio enfermo en un ratón, que se puede diseccionar posteriormente para detectar la presencia del complejo de variante de SIRP-a y CD47 en el sitio enfermo. Pueden usarse en la detección anticuerpos específicos para la variante de SIRP-a o CD47.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un constructo de la variante de la proteína a reguladora de la señal (SIRP-a), que comprende una variante de SIRP-a unida a un péptido bloqueante basado en CD47 por medio de un enlazador escindible,
en el que el péptido bloqueante basado en CD47 tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de dominio IgSF de tipo salvaje de CD47 (SEQ ID NO: 35) o un fragmento de la misma que puede unirse a una variante de SIRP-a, y donde la variante de SIRP-a comprende la secuencia de aminoácidos establecida en EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5VGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 13), en donde X i es L, I, o V; X2 es V, L, o, I; X3 es A o V; X4 es A, I, o L; X5 es I, T, S, o F; Xa es E, V, o L; X7 es K o R; X8 es E o Q; X9 es H, P, o R; X10 es L, T, o G; X11 es K o R; X12 es N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; X13 es P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, o Y; X14 es V o I; X15 es F, L, o V; y X ia es F o V.
2. El constructo de la variante de SIRP-a de la reivindicación 1, en la que la variante de SIRP-a tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOs: 3-12 y 24-34.
3. El constructo de la variante de SIRP-a de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el péptido bloqueante basado en CD47 tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NOs: 36-46.
4. El constructo de la variante de SIRP-a de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el enlazador escindible comprende uno o más espaciadores.
5. El constructo de la variante de SIRP-a de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el enlazador escindible es escindible bajo pH ácido y/o condición hipóxica.
6. El constructo de la variante de SIRP-a de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el enlazador escindible es escindible por una enzima asociada al tumor, opcionalmente donde la enzima asociada al tumor es una proteasa seleccionada del grupo que consiste en matriptasa (MTSP1), activador del plasminógeno de tipo urinario (uPA), legumaína, PSA (también llamado KLK3, peptidasa 3 relacionada con la calicreína), metaloproteinasa 2 de matriz (MMP-2), MMP9, elastasa de neutrófilos humanos (HNE) y proteinasa 3 (Pr3) , preferiblemente matriptasa (MTSP1).
7. El constructo de la variante de SIRP-a de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el enlazador escindible comprende una secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID NOs: 47 o 69-99, preferiblemente LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47).
8. El constructo variante de SIRP-a de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el constructo variante de SIRP-a tiene una secuencia de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOs: 48-63.
9. El constructo de la variante de SIRP-a de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la variante de SIRP-a está unida a un péptido de unión a anticuerpo, opcionalmente en el que el péptido de unión a anticuerpo tiene al menos 75% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de un péptido de localización de la enfermedad (DLP) (SEQ ID NO: 64 o 65) o un fragmento del mismo.
10. El constructo de la variante de SIRP-a de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que dicha variante de SIRP-a está unida a un monómero de dominio Fc.
11. Una composición farmacéutica que comprende: a) una cantidad terapéuticamente efectiva del constructo de la variante de SIRP-a de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. El constructo de la variante de SIRP-a de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para uso como medicamento.
13. El constructo de la variante de SIRP-a de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para uso en el tratamiento de un cáncer, opcionalmente en donde dicho cáncer se selecciona de cáncer de tumor sólido, cáncer hematológico, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, mieloma múltiple, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de cuello de útero, cáncer de endometrio, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de hígado, cáncer de ovarios, cáncer de colon y recto, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de vesícula biliar, cáncer de tumor del estroma gastrointestinal, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de orofaringe, cáncer de esófago, melanoma, cáncer no melanoma de piel, carcinoma de células de Merkel, cáncer inducido por virus, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de células renales, cáncer de pelvis renal, leucemia, linfoma, sarcoma, glioma, tumor cerebral, y carcinoma.
14. Un ácido nucleico que codifica el constructo de la variante de SIRP-a según una cualquiera de las reivindicaciones
15. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 14.
16. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 14 o el vector de la reivindicación 15.
17. Un método para preparar el constructo de la variante de SIRP-a de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende:
(a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 16 en las condiciones en las que se produce el constructo, y; (b) recuperar el constructo producida por la célula huésped.
ES16183261T 2015-08-07 2016-08-08 Constructos de la variante de SIRP-alfa y usos de los mismos Active ES2872528T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562202779P 2015-08-07 2015-08-07
US201562202775P 2015-08-07 2015-08-07
US201562202772P 2015-08-07 2015-08-07
TW104125902A TWI702228B (zh) 2014-08-08 2015-08-10 信號調節蛋白α（ｓｉｇｎａｌ-ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α， ＳＩＲＰ-α）變體構築物及其用途
US14/971,931 US20160319256A9 (en) 2014-08-08 2015-12-16 Sirp-alpha variant constructs and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2872528T3 true ES2872528T3 (es) 2021-11-02

Family

ID=57624246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16183261T Active ES2872528T3 (es) 2015-08-07 2016-08-08 Constructos de la variante de SIRP-alfa y usos de los mismos

Country Status (23)

Country Link
EP (2) EP3128005B1 (es)
JP (2) JP6901834B2 (es)
KR (1) KR20170017846A (es)
AU (2) AU2016210755B2 (es)
BR (1) BR102016018074A2 (es)
CO (1) CO2016000671A1 (es)
CY (1) CY1124272T1 (es)
DK (1) DK3128005T3 (es)
EA (1) EA034582B1 (es)
ES (1) ES2872528T3 (es)
HR (1) HRP20211079T1 (es)
HU (1) HUE055605T2 (es)
IL (2) IL247114B (es)
LT (1) LT3128005T (es)
MX (2) MX2016010259A (es)
NZ (1) NZ722947A (es)
PH (1) PH12016000277A1 (es)
PL (1) PL3128005T3 (es)
PT (1) PT3128005T (es)
RS (1) RS62150B1 (es)
SG (2) SG10201912880PA (es)
SI (1) SI3128005T1 (es)
ZA (2) ZA201605435B (es)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018127919A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Kahr Medical Ltd. A SIRP1 alpha-41BBL FUSION PROTEIN AND METHODS OF USE THEREOF
KR102233993B1 (ko) * 2017-07-24 2021-03-31 한국과학기술원 면역 회피성 박테리오파지
WO2019173903A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Trillium Therapeutics Inc. Improvements in cd47 blockade therapy by egfr antibody
US20210214417A1 (en) * 2018-07-11 2021-07-15 Kahr Medical Ltd. SIRPalpha-4-1BBL VARIANT FUSION PROTEIN AND METHODS OF USE THEREOF
WO2020047326A2 (en) * 2018-08-31 2020-03-05 ALX Oncology Inc. Decoy polypeptides
CN109535263B (zh) * 2018-12-04 2022-06-17 江苏东抗生物医药科技有限公司 SIRPα突变体及其融合蛋白
US20220363779A1 (en) * 2021-05-13 2022-11-17 ALX Oncology Inc. Combination therapies for treating cancer
CN116178561A (zh) * 2021-11-26 2023-05-30 杭州尚健生物技术有限公司 包含SIRPα突变体的融合蛋白

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US5697901A (en) 1989-12-14 1997-12-16 Elof Eriksson Gene delivery by microneedle injection
JPH04334377A (ja) 1990-12-31 1992-11-20 Akzo Nv 酸−不安定性リンカー分子
ES2109362T3 (es) 1991-06-21 1998-01-16 Univ Cincinnati Unas proteinas administrables oralmente y metodo para hacerlas.
US6613332B1 (en) 1991-06-21 2003-09-02 The University Of Cincinnati Oral administration of therapeutic proteins
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5505931A (en) 1993-03-04 1996-04-09 The Dow Chemical Company Acid cleavable compounds, their preparation and use as bifunctional acid-labile crosslinking agents
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
WO1997005266A1 (en) 1995-07-25 1997-02-13 Introgene B.V. Methods and means for targeted gene delivery
IL125756A (en) 1996-02-15 2003-05-29 Biosense Inc Catheter for use in surgery
EP0920339A2 (en) 1996-07-09 1999-06-09 The Johns Hopkins University Gene delivery system
US6613026B1 (en) 1999-12-08 2003-09-02 Scimed Life Systems, Inc. Lateral needle-less injection apparatus and method
US7662367B2 (en) 2000-03-02 2010-02-16 Xencor, Inc. Pharmaceutical compositions for the treatment of TNF-α related disorders
TWI327597B (en) 2001-08-01 2010-07-21 Centocor Inc Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
WO2004041862A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
EP1737481A4 (en) 2004-02-27 2008-04-02 Vaxconsulting PEPTIDES OF IL1 BETA AND TNF ALPHA AND METHOD OF TREATMENT COMPRISING THE USE THEREOF
EP1737480A2 (de) 2004-03-29 2007-01-03 Seth Hallström Pharmazeutisches kombinationspr parat enthaltend ein therape utisches protein
US8377448B2 (en) * 2006-05-15 2013-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders
PL2235064T3 (pl) 2008-01-07 2016-06-30 Amgen Inc Sposób otrzymywania cząsteczek przeciwciał z heterodimerycznymi fc z zastosowaniem kierujących efektów elektrostatycznych
MX2011006621A (es) * 2008-12-19 2011-07-12 Novartis Ag Polipeptidos solubles para uso en el tratamiento de trastornos autoinmunes e inflamatorios.
JP5851842B2 (ja) 2009-01-12 2016-02-03 サイトムエックス セラピューティクス, インク.CytomX Therapeutics, Inc. 改変した抗体組成物、それを作製および使用する方法
AU2010215761B2 (en) 2009-02-23 2017-04-06 Cytomx Therapeutics, Inc Proproteins and methods of use thereof
WO2011011315A1 (en) * 2009-07-20 2011-01-27 National Cheng Kung University POLYPEPTIDES SELECTIVE FOR AV β3 INTEGRIN CONJUGATED WITH A VARIANT OF HUMAN SERUM ALBUMIN (HSA) AND PHARMACEUTICAL USES THEREOF
KR101632312B1 (ko) 2009-11-03 2016-06-21 삼성전자주식회사 항체 불변 영역에 특이적으로 결합하는 융합 단백질, 그의 제조 방법 및 이를 이용한 항체 분리 방법
CA2785139A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-30 Novartis Ag Tetravalent cd47-antibody constant region fusion protein for use in therapy
WO2012048332A2 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 John Williams A monoclonal antibody framework binding interface for meditopes, meditope delivery systems and methods for their use
US8609621B2 (en) 2010-11-15 2013-12-17 E I Du Pont De Nemours And Company Acid-cleavable linkers exhibiting altered rates of acid hydrolysis
WO2012109267A2 (en) * 2011-02-07 2012-08-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel peptides and methods using same
EP2721073A1 (en) * 2011-06-16 2014-04-23 Novartis AG Soluble proteins for use as therapeutics
WO2013063076A1 (en) * 2011-10-25 2013-05-02 Indiana University Research & Technology Corporation Compositions for and methods of modulating complications, risks and issues with xenotransplantation
WO2013109752A1 (en) * 2012-01-17 2013-07-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High affinity sirp-alpha reagents
US9428553B2 (en) * 2012-02-10 2016-08-30 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
PE20150643A1 (es) * 2012-06-22 2015-05-29 Cytomx Therapeutics Inc Anticuerpos de reaccion cruzada anti-jagged 1/jagged 2 anticuerpos anti-jagged activables y metodos de uso de los mismos
HUE047221T2 (hu) * 2012-12-17 2020-04-28 Trillium Therapeutics Inc A CD47+ kóros sejtek kezelése SIRP alfa-FC fúziókkal
WO2014121093A1 (en) * 2013-01-31 2014-08-07 Thomas Jefferson University Fusion proteins that facilitate cancer cell destruction
CN114106099B (zh) * 2014-01-31 2024-05-24 西托姆克斯治疗公司 蛋白裂解酶和u型纤溶酶原激活物的底物和其它可裂解部分及其使用方法
TWI759810B (zh) * 2014-08-08 2022-04-01 美商Ａｌｘ腫瘤技術股份有限公司 信號調節蛋白α(signal-regulatory proteinα, SIRP-α)變體構築物及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021215151B2 (en) 2023-05-18
AU2016210755B2 (en) 2021-05-13
EP3128005B1 (en) 2021-04-14
SI3128005T1 (sl) 2021-09-30
EA201691384A3 (ru) 2017-03-31
BR102016018074A2 (pt) 2021-11-16
HRP20211079T1 (hr) 2021-10-01
RS62150B1 (sr) 2021-08-31
PT3128005T (pt) 2021-06-02
DK3128005T3 (da) 2021-06-28
SG10201606520SA (en) 2017-03-30
EA034582B1 (ru) 2020-02-21
KR20170017846A (ko) 2017-02-15
IL287825A (en) 2022-01-01
ZA201902673B (en) 2024-04-24
IL247114B (en) 2021-12-01
JP2021166521A (ja) 2021-10-21
NZ722947A (en) 2022-12-23
SG10201912880PA (en) 2020-02-27
IL247114A0 (en) 2016-12-29
CO2016000671A1 (es) 2018-02-09
AU2016210755A1 (en) 2017-02-23
HUE055605T2 (hu) 2021-12-28
MX2016010259A (es) 2017-04-25
MX2020011759A (es) 2022-01-06
PH12016000277A1 (en) 2018-02-12
IL287825B2 (en) 2023-04-01
AU2021215151A1 (en) 2021-09-02
PL3128005T3 (pl) 2021-11-29
ZA201605435B (en) 2020-12-23
CY1124272T1 (el) 2022-07-22
EP3913050A1 (en) 2021-11-24
JP2017060462A (ja) 2017-03-30
LT3128005T (lt) 2021-07-12
IL287825B (en) 2022-12-01
JP6901834B2 (ja) 2021-07-14
EA201691384A2 (ru) 2017-02-28
EP3128005A1 (en) 2017-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210388329A1 (en) Sirp-alpha variant constructs and uses thereof
ES2872528T3 (es) Constructos de la variante de SIRP-alfa y usos de los mismos
ES2775207T3 (es) Moléculas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T biespecíficas específicas para CD3 y CEA
ES2881771T3 (es) Constructos que tienen un dominio de SIRP-alfa o variante del mismo
ES2659764T3 (es) Moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T
ES2947230T3 (es) Moléculas biespecíficas para linfocitos T activadas por proteasa
ES2734178T3 (es) Moléculas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T biespecíficas
US20200188528A1 (en) Peptide-antibody compositions and methods of use thereof
BR112014003598B1 (pt) Molécula de ligação de antígeno biespecífica, composição farmacêutica e uso da molécula de ligação de antígeno biespecífica
ES2955852T3 (es) Anticuerpos de unión a STEAP-1
WO2024012539A1 (zh) 抗Nectin-4抗体及其应用
WO2022207521A1 (en) Protease-activated polypeptides
AU2009253623B2 (en) A soluble tumor necrosis factor receptor mutant
CA2938180C (en) Sirp-alpha variant constructs and uses thereof