ES2334103T3 - La funcion de un receptor de haptoglobina-hemoglobina y los usos del mismo. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que es (i) un complejo de Hp-Hb o un fragmento del mismo que comprende la cadena pesada (β) de haptoglobina o (ii) un anticuerpo o un fragmento del mismo, en el que el complejo de Hp-Hb o el fragmento del mismo o el anticuerpo o el fragmento del mismo es capaz de unirse a un receptor CD163, para su uso en el suministro terapéutico de un medicamento a células presentadoras de CD163.
Description
La función de un receptor de
haptoglobina-hemoglobina y los usos del mismo.
La presente invención se refiere a un complejo
de haptoglobina-hemoglobina (Hp-Hb)
o una parte del mismo o un mimético del mismo que está unido
operativamente a una sustancia y que es capaz de unirse a un
receptor CD163. Además, la invención se refiere a una variante de
CD163, unida a membrana o soluble, capaz de unirse a al menos un
complejo de haptoglobina-hemoglobina
(Hp-Hb) y al uso del complejo de
Hp-Hb y el receptor CD163 para terapia.
La hemoglobina normal del adulto está
constituida por un tetrámero de cuatro cadenas de hemoglobina, dos
cadenas \alpha y dos cadenas \beta. El O_{2} se une a la
forma tetramérica de la hemoglobina y se transporta en la sangre.
La sangre fetal comprende hemoglobina fetal, un tetrámero que está
constituido por dos cadenas \alpha y dos cadenas \gamma. Se han
identificado otras cadenas de hemoglobina, tales como cadenas
\delta, cadenas \varepsilon, cadenas zeta, cadenas \tau o la
forma S que se sabe que es la mutación observada en hemoglobina de
individuos que padecen anemia de células falciformes.
La lisis intravascular de glóbulos rojos
(hemólisis) conduce a la liberación de hemoglobina al plasma. Este
fenómeno tiene lugar durante estados fisiológicos así como
patológicos. Las complicaciones patológicas son graves cuando se
aceleran en enfermedades infecciosas (por ejemplo, malaria),
hereditarias (por ejemplo, anemia de células falciformes) o
autoinmunes. Los tetrámeros de hemoglobina se convierten en dímeros
de hemoglobina capaces de unirse a haptoglobina. En el plasma, la
hemoglobina se captura por la proteína de fase aguda haptoglobina.
La haptoglobina es una proteína plasmática de la sangre que tiene un
peso molecular de aproximadamente 86.000 a 400.000 y desempeña un
papel importante en el metabolismo de la hemoglobina liberada al
torrente sanguíneo. Cuando se libera de manera excesiva en la
sangre, la hemoglobina se excreta a la orina a través de los túbulos
renales, dando como resultado no solamente una pérdida de hierro,
sino también trastornos de los túbulos renales. Debido a que la
haptoglobina se une selectivamente y de manera estrecha a la
hemoglobina in vivo y, de este modo, forma un complejo de
hemoglobina-haptoglobina, tiene funciones
importantes en la recuperación del hierro y en la prevención de
trastornos
renales.
renales.
La Hp se sintetiza como una cadena única, que se
escinde después de la traducción en una cadena \alpha
amino-terminal y una cadena \beta
carboxi-terminal. La estructura básica de Hp, como
se encuentra en la mayoría de los mamíferos, es un homodímero (Fig.
2a), en el que las dos moléculas de Hp están unidas por un único
enlace disulfuro por sus respectivas cadena \alpha de \sim 9
kDa. En el ser humano, también está presente una variante con una
cadena \alpha larga en todas las poblaciones. Esta variante surgió
aparentemente por una duplicación intragénica temprana, que se
origina probablemente de un entrecruzamiento desigual de dos alelos
básicos, dando como resultado una Hp con una cadena \alpha de -14
kDa. Las cadenas \alpha corta y larga se denominan \alpha^{1}
y \alpha^{2}, respectivamente. Ya que la cisteína que forma el
enlace disulfuro intermolecular entre las cadenas \alpha también
está duplicada, los seres humanos que llevan el alelo de la variante
larga muestran un fenotipo de Hp multimérico (Fig. 2a).
Las haptoglobinas humanas convencionales se han
estudiado bien; se descubrieron hace más de 40 años y se piensa que
su papel está en el transporte plasmático de hemoglobina libre.
Adicionalmente, se piensa que la haptoglobina tiene actividades
anti-inflamatorias, tales como su efecto decreciente
sobre el metabolismo de los neutrófilos, y un efecto sobre el
sistema inmune posiblemente modulando la proliferación de células B
y disminución de la producción de anticuerpos. Los mecanismos de la
influencia de la haptoglobina sobre la función inmune se
desconocen. Las potenciales rutas de señalización por las que la
haptoglobina media en sus efectos y la existencia de un receptor de
haptoglobina no se han descrito en la técnica anterior.
Sin embargo, Ghmati y col., 1996 describen un
estudio en el que la haptoglobina es un ligando de baja afinidad
alternativo para CD11b/CD18 en líneas celulares de monocitos.
CD11b/CD18 es parte de la familia de las integrinas y está
implicado en funciones inflamatorias e inmunológicas.
Otra molécula receptora más presente en
monocitos es CD163. Se identifica como un miembro de la superfamilia
rica en cisteína de receptor limpiador (SRCR) presente en células
de la familia monocítica, tal como la mayoría de los macrófagos.
Ritter y col., 1999 analizan la regulación, estructura del promotor
y organización genómica del receptor CD163. La función precisa de
CD163 no se ha descrito. Además, el trabajo previo sobre la función
biológica de CD163 está limitado a un estudio sobre el efecto de la
reticulación mediada por anticuerpo de CD163 sobre monocitos
cultivados (Van den Heuvel, M. M y col. Regulation of CD163 on human
macrophages: cross-linking of CD163 induces
signalling and activation. J. Leukoc. Bil. 66,
858-866 (1999). La ligación en superficie de CD163
induce una señal dependiente de tirosina cinasa que da como
resultado movilización de calcio intracelular, producción de
trifosfato de inositol y secreción aumentada de citocinas
anti-inflamatorias.
Los presentes inventores han identificado CD163
como el receptor de macrófagos de alta afinidad para complejos de
haptoglobina-hemoglobina. También han identificado
una forma soluble de CD163 en plasma de sujetos humanos normales y
han encontrado una correlación entre receptor unido a membrana y
soluble. En condiciones normales, está presente aproximadamente
100-500 \mug/l de CD163 soluble en el plasma. La
presente invención se refiere al uso del receptor CD163, unido a
membrana o soluble y/o una variante de CD163 y/o al uso de complejos
de haptoglobina-hemoglobina en el diagnóstico,
prevención y/o tratamiento de diversas enfermedades y
trastornos.
Por consiguiente, la invención describe un
complejo de Hp-Hb, o una parte del mismo o un
mimético del mismo que está unido operativamente a una sustancia,
donde el complejo de Hp-Hb es capaz de unirse a
CD163 y/o una variante de CD163. En el presente contexto, la
expresión complejo de Hp-Hb incluye un equivalente
funcional del mismo a menos que se indique de forma expresa de otro
modo.
En el presente contexto, el término
"sustancia" quiere decir un componente heterólogo al complejo
de Hp-Hb, tal como un fármaco, un gen, una
vesícula, un vector o similares.
Además, la invención se refiere al uso de al
menos un complejo de Hp-Hb para el suministro de al
menos un fármaco, o al menos un gen a una célula que expresa un
receptor CD163 y/o una variante de receptor CD163. La invención
también se refiere al uso de al menos un complejo de
Hp-Hb, que comprende además una variante de
receptor CD163 para la identificación de al menos un complejo de
Hp-Hb en el suero y/o plasma de un individuo.
En el presente contexto, la expresión receptor
CD163 abarca tanto el receptor limpiador convencional CD163 de
monocitos y la mayoría de los macrófagos tisulares como la forma
soluble de CD163, sHbSR a menos que se especifique de otro modo. El
término CD163 se usa de manera sinónima con la expresión receptor
CD163. El término sHbSR se usa de manera intercambiable con
receptor CD163 soluble.
La expresión una variante de receptor CD163 se
usa de manera sinónima con la expresión variante de CD163.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere al uso de al menos un complejo que comprende hemoglobina y
haptoglobina como un marcador para una célula que expresa una
variante de CD163, en el que al menos una de las moléculas de
hemoglobina o haptoglobina están marcadas.
Además, un complejo de Hp-Hb, o
una parte del mismo o un mimético del mismo que está unido
operativamente a una sustancia, en el que el complejo de
Hp-Hb es capaz de unirse a dicha molécula de CD163,
también pertenece al alcance de la invención.
En el presente contexto, el término medicamento
se usa con su significado normal como una composición a administrar
a un individuo con propósitos profilácticos, terapéuticos y/o de
diagnóstico.
Figura 1: es una ilustración de las etapas
implicadas en la unión Hp- Hb/CD163.
Figura 2: muestra ejemplos de 2a) un dímero de
haptoglobina, 2b) multímeros de haptoglobina, 2c) complejos de
Hp-Hb y 2d) un gel SDS-PAGE de mono-
y multímeros de haptoglobina.
Figura 3: muestra una molécula de CD163.
Figura 4: muestra 9 secuencias diferentes de
haptoglobina
Figura 5: muestra 4 secuencias diferentes de
CD163
Figura 6: unión de Hp-Hb a
CD163. a, ilustración de la organización de la subunidad y el enlace
disulfuro de las diversas Hp y complejos de Hp-Hb.
El recuadro muestra SDS-PAGE no reductora del
dímero Hp(1-1) y multímeros
Hp(2-2). b, análisis de resonancia de plasmón
superficial de la unión de Hp-Hb a CD163. Las
mediciones se realizaron a concentraciones de Hb que variaban de
cero a 100 \mug/ml en ausencia de Hp (panel izquierdo) o en
presencia de 50 \mug/ml de Hp(1-1) (panel
central) y 50 \mug/ml de Hp(2-2) (panel
derecho). No se observó unión con Hb o Hp en solitario y se obtuvo
la saturación de la unión a 50 \mug/ml de Hb para ambos fenotipos
de Hp. c, inhibición de la unión a CD163 de
Hp(1-1)-Hb marcado con
^{125}I (paneles izquierdos) y
Hp(2-2)-Hb (paneles derechos)
por IgG anti-CD163 policlonal, IgG de conejo no
inmune, EDTA (5 mM) y por diversas concentraciones de complejos no
marcados de Hp(1-1)-Hb y
Hp(2-2)-Hb. Se inmovilizó
CD163 en pocillos de placa de microtitulación.
Figura 7: endocitosis mediada por CD163 de
^{125}I-Hp-Hb. a, asociación
celular y degradación de
^{125}I-Hp(2-2)-Hb
en células CHO transfectadas de forma simulada (panel izquierdo) y
transfectadas con ADNc de CD163 (panel central). La adición de los
inhibidores lisosómicos cloroquina y leupeptina (ambos 100 \muM)
inhibió la degradación conduciendo a acumulación celular de
radiactividad (panel derecho). b, Inhibición de la captación de
^{125}I-Hp-Hb en células CHO
transfectadas con ADNc de CD163 (panel izquierdo) y en células
SU-DHL-1 obtenidas de linfoma
histiocítico que expresan CD163 (panel derecho). Ambos tipos
celulares mostraron una captación saturable inhibida por IgG
policlonal anti-CD163. Los recuadros en a y b
muestran inmunotransferencia de anti-CD163 de las
células.
Figura 8: Determinación de la concentración de
sCD163 en la sangre de un donante humano.
Figura 9: Fluorescencia estudiada en microscopio
confocal (ejemplo 6).
Figura 10: Sensograma del destino de HbSR y del
dominio 1-6 SRCR de HbSR.
Figura 11: Selección de fago de anticuerpo Fab
para complejos de Hp-Hb y CD163. La proporción de
salida frente a entrada, indicativa de la selección de los clones,
se ilustra en los paneles A y C para las selecciones
sobre complejos de Hp-Hb y CD163 aplicados como
revestimiento, respectivamente. En los paneles B y D
se muestran dos ELISA de fago representativos en los que se han
ensayado 10 clones aleatorios de la tercera ronda de selección. Los
clones 3, 9 y 10 en el panel B representan el clon Fab1 aislado de
las selecciones de complejo de Hp-Hb y los clones 8
y 9 en el panel D representan el clon Fab18 aislado de las
selecciones de CD163. En total, se exploraron 50 clones de cada
ronda.
Figura 12a: Unión de fago de Fab1
anti-Hp-Hb a complejos de
Hp-Hb, Hp y Hb. La unión a complejos de
Hp-Hb se representa por los círculos, a Hp, por los
cuadrados, a Hb, por los rombos y a BSA, por los triángulos. El
experimento se realizó por duplicado. Un fago de Fab irrelevante no
mostró unión a ninguno de los antígenos ensayados en estas
condiciones (no mostrado).
Figura12b: Unión de Fab1 a complejos de
Hp-Hb, Hp y Hb inmovilizados sobre un chip detector
de BIAcore. La unión de Fab1 a Hb se ilustra en el panel A, a
Hp, en el panel B y a complejos de Hp-Hb, en
el panel C. En cada caso, se usó un intervalo de
concentraciones de 0 a 200 nM de Fab1.
Figura 13: Inhibición por Fab de la unión del
complejo ^{125}I-Hp-Hb (2:2) a
CD163 aplicado como revestimiento. Las curvas representan los
efectos de concentraciones crecientes de Fab1
anti-Hp-Hb (rombos), Fab18
anti-CD163 (cuadrados) y FabA8 irrelevante
(triángulos) sobre la unión de una cantidad mínima de complejos de
^{125}I-Hp-Hb a CD163.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a un complejo de Hp-Hb o un equivalente
funcional del mismo que está unido operativamente a una sustancia,
siendo capaz dicho complejo y/o equivalente funcional del mismo de
unirse a un receptor CD163 y/o una variante de CD163. Un
equivalente funcional de un complejo de Hp-Hb se
tiene que comprender como cualquier parte (o fragmento) o cualquier
mimético capaz de unirse a un receptor CD163.
"Equivalencia funcional" como se usa en la
presente invención es de acuerdo con una realización preferida
establecida mediante referencia a la funcionalidad correspondiente
de un fragmento de Hp-Hb predeterminado.
En el presente contexto, la expresión
"complejo de Hp-Hb" significa un complejo de al
menos una cadena de haptoglobina y al menos una cadena de
hemoglobina denominado un complejo de Hp-Hb
monomérico. Preferiblemente, el complejo comprende al menos una
cadena de haptoglobina y al menos una forma dimérica de cadenas de
hemoglobina. En una realización preferida adicional, el complejo
comprende una forma multimérica de cadenas de haptoglobina tales
como una forma dimérica, uniéndose cada cadena de haptoglobina al
menos a una cadena de hemoglobina, preferiblemente un dímero de
cadenas de hemoglobina.
Se debe entender que fragmento del mismo es
cualquier parte del complejo de Hp-Hb capaz de
unirse al receptor CD163 o a una variante del mismo y, mediante
dicha unión, activar la captación del fragmento y/o la sustancia en
la célula presentadora de CD163.
Se debe entender que el mimético del mismo es
cualquier modificación del complejo de Hp-Hb
(denominado en el presente contexto también una variante del
complejo) o cualquier otra molécula capaz de unirse al receptor
CD163 o a una variante del mismo y, mediante dicha unión, activar la
captación del fragmento y/o la sustancia en la célula presentadora
de CD163. Los miméticos pueden ser péptidos, derivados peptídicos,
anticuerpos, así como compuestos no peptídicos, tales como
compuestos orgánicos pequeños, azúcares y grasas.
En una realización preferida, los miméticos
pueden ser anticuerpos capaces de unirse al receptor CD163, por
ejemplo, para provocar la captación de una sustancia unida al
anticuerpo.
Los fragmentos y/o miméticos se pueden
identificar mediante química combinatoria usando el receptor CD163,
técnica de presentación en fagos u otras técnicas conocidas para el
especialista en la técnica.
El fragmento o mimético del complejo de
Hp-Hb es preferiblemente capaz de unirse a una
región en los dominios SRCR I-IX del receptor
CD163, tal como capaces de unirse a una región en los dominios SRCR
I-VIII del receptor CD163, capaces de unirse a una
región en los dominios SRCR I-VII del receptor
CD163, capaces de unirse a una región en los dominios SRCR
I-VI del receptor CD163, capaces de unirse a una
región en los dominios SRCR I-V del receptor CD163,
capaces de unirse a una región en los dominios SRCR
I-IV del receptor CD163, capaces de unirse a una
región en los dominios SRCR I-III del receptor
CD163, capaces de unirse a una región en los dominios SRCR
I-II del receptor CD163 o una variante del
mismo.
Se prefiere que el complejo de
Hp-Hb o una parte del mismo o un mimético del mismo
esté disponible en una forma purificada y/o aislada.
De acuerdo con la invención, la expresión
"complejo de Hp-Hb" quiere decir que incluye
equivalentes funcionales del complejo de Hp-Hb que
comprenden una secuencia predeterminada de aminoácidos. En el
presente contexto, la expresión "secuencia predeterminada de
aminoácidos de complejo de Hp-Hb" se refiere
tanto a la secuencia de haptoglobina como a la secuencia de
hemoglobina.
La secuencia predeterminada de una cadena de
haptoglobina puede ser cualquiera de las secuencias mostradas en la
Figura 4a y 4b, es decir, cualquiera de las secuencias que tienen la
identificación de secuencia en la base de datos de secuencia
SWISS-PROT (sp) o trEMBL (tr).
splP00737IHPT1_HUMAN
splP00738IHPT2_HUMAN
splP50417IHPT_ATEGE
trlQ60574IQ60574
trlQ61646IQ61646
splQ62558IHPT_MUSSA
splP06866IHPT_RAT
trlO35086IO35086
splP19006IHPT_CANFA
\vskip1.000000\baselineskip
Una secuencia predeterminada de aminoácidos para
una cadena de hemoglobina puede ser cualquiera de las secuencias
mencionadas a continuación junto con el Nº de acceso en la base de
datos de secuencia SWISS-PROT:
splP01922IHBA_CADENA ALFA DE
HEMOGLOBINA HUMANA - Homo sapiens (Ser humano), Pan
troglodytes (Chimpancé) y Pan paniscus (Chimpancé pigmeo)
(Bonobo).
VLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAV
AHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR
AHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR
\vskip1.000000\baselineskip
splP02023IHBB_CADENA BETA DE
HEMOGLOBINA HUMANA - Homo sapiens (Ser humano), Pan
troglodytes (Chimpancé) y Pan paniscus (Chimpancé pigmeo)
(Bonobo).
VHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLGA
FSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANAL
AHKYH
FSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANAL
AHKYH
\vskip1.000000\baselineskip
splP02042IHBD_CADENA DELTA DE
HEMOGLOBINA HUMANA - Homo sapiens (Ser
humano).
VHLTPEEKTAVNALWGKVNVDAVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSSPDAVMGNPKVKAHGKKVLGA
FSDGLAHLDNLKGTFSQLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLARNFGKEFTPQMQAAYQKWAGVANAL
AHKYH
FSDGLAHLDNLKGTFSQLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLARNFGKEFTPQMQAAYQKWAGVANAL
AHKYH
\vskip1.000000\baselineskip
splP02096IHBG_CADENAS
GAMMA-A Y GAMMA-G DE HEMOGLOBINA
HUMANA - Homo sapiens (Ser humano) y Pan troglodytes
(Chimpancé).
GHFTEEDKATITSLWGKVNVEDAGGETLGRLLWYPWTQRFFDSFGNLSSASAIMGNPKVKAHGKKVLTSLG
DAIKHLDDLKGTFAQLSELHCDKLHVDPENFKLLGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASALSSR
YH
DAIKHLDDLKGTFAQLSELHCDKLHVDPENFKLLGNVLVTVLAIHFGKEFTPEVQASWQKMVTAVASALSSR
YH
\vskip1.000000\baselineskip
splP09105IHBAT_CADENA
THETA-1 DE HEMOGLOBINA HUMANA - Homo sapiens
(Ser
humano).
ALSAEDRALVRALWKKLGSNVGVYTTEALERTFLAFPATKTYFSHLDLSPGSSQVRAHGQKVADALSLAVE
RLDDLPHALSALSHLHACQLRVDPASFQLLGHCLLVTLARHYPGDFSPALQASLDKFLSHVISALVSEYR
RLDDLPHALSALSHLHACQLRVDPASFQLLGHCLLVTLARHYPGDFSPALQASLDKFLSHVISALVSEYR
\newpage
splP02008IHBAZ_CADENA ZETA DE
HEMOGLOBINA HUMANA - Homo sapiens (Ser
humano).
SLTKTERTIIVSMWAKISTQADTIGTETLERLFLSHPQTKTYFPHFDLHPGSAQLRAHGSKVVAAVGDAVKS
IDDIGGALSKLSELHAYILRVDPVNFKLLSHCLLVTLAARFPADFTAEAHAAWDKFLSVVSSVLTEKYR
IDDIGGALSKLSELHAYILRVDPVNFKLLSHCLLVTLAARFPADFTAEAHAAWDKFLSVVSSVLTEKYR
\vskip1.000000\baselineskip
splP02100IHBE_CADENA EPSILON DE
HEMOGLOBINA HUMANA - Homo sapiens (Ser
humano).
VHFTAEEKAAVTSLWSKMNVEEAGGEALGRLLVVYPWTQRFFDSFGNLSSPSAILGNPKVKAHGKKVLTS
FGDAIKNMDNLKPAFAKLSELHCDKLHVDPENFKLLGNVMVIILATHFGKEFTPEVQAAWQKLVSAVAIALA
HKYH
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trlQ14510IQ14510 ARNM DE
BETA-HEMOGLOBINA FALCIFORME - Homo sapiens
(Ser
humano).
MVHLTPVEKSAVTAXWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVL
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Un "equivalente funcional" se define
como:
- i)
- equivalentes que comprenden una secuencia de aminoácidos capaces de ser reconocidos por un anticuerpo también capaz de reconocer la secuencia predeterminada de aminoácidos y/o
- ii)
- equivalentes que comprenden una secuencia de aminoácidos capaces de unirse a un resto de receptor también capaz de unirse a la secuencia predeterminada de aminoácidos y/o
- iii)
- equivalentes que tienen una afinidad de unión al menos sustancialmente similar o mayor a CD163 como al menos un complejo de Hp-Hb monomérico que comprende dicha secuencia predeterminada de aminoácidos.
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De acuerdo con la presente invención, un
equivalente funcional de un complejo de Hp-Hb o
fragmentos del mismo se pueden obtener por adición, sustitución o
deleción de al menos un aminoácido en cualquiera o ambas de la
secuencia de haptoglobina y la secuencia de hemoglobina. Por tanto,
un equivalente funcional del complejo de Hp-Hb
puede comprender una modificación de cualquiera de los componentes
del complejo o de ambos.
Cuando la secuencia de aminoácidos comprende una
sustitución de un aminoácido por otro, tal sustitución puede ser
una sustitución de aminoácidos conservativa. Los fragmentos del
complejo de acuerdo con la presente invención pueden comprender de
más de una de tales sustituciones, tal como, por ejemplo, dos
sustituciones de aminoácidos conservativas, por ejemplo, tres o
cuatro sustituciones de aminoácidos conservativas, tal como cinco o
seis sustituciones de aminoácidos conservativas, por ejemplo, siete
u ocho sustituciones de aminoácidos conservativas, tal como de 10 a
15 sustituciones de aminoácidos conservativas, por ejemplo, de 15 a
25 sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones se
pueden realizar dentro de uno cualquiera o más grupos de aminoácidos
predeterminados.
Los ejemplos de equivalentes que comprenden una
o más sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen una o más
sustituciones de aminoácidos conservativas dentro del mismo grupo de
aminoácidos predeterminados, o una pluralidad de sustituciones de
aminoácidos conservativas, donde cada sustitución conservativa se
genera por sustitución dentro de un grupo diferente de aminoácidos
predeterminados.
Por consiguiente, los miméticos del complejo, o
fragmentos del mismo de acuerdo con la invención pueden comprender,
dentro del mismo mimético, o fragmentos del mismo o entre diferentes
miméticos o fragmentos del mismo, al menos una sustitución, tal
como una pluralidad de sustituciones introducidas independientemente
entre sí. Los miméticos del complejo, o fragmentos del mismo, por
tanto, pueden comprender sustituciones conservativas
independientemente entre sí, donde al menos una glicina (Gly) de
dicho mimético o fragmentos del mismo se sustituye con un
aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido
por Ala, Val, Leu e Ile e independientemente de los mismos,
miméticos o fragmentos de los mismos, donde al menos una de dichas
alaninas (Ala) de dichos miméticos o fragmentos de los mismos se
sustituye con un aminoácido seleccionado entre el grupo de
aminoácidos constituido por Gly, Val, Leu e Ile, e
independientemente de los mismos; miméticos o fragmentos de los
mismos, donde al menos una valina (Val) de dicho mimético, o
fragmentos del mismo, se sustituye con un aminoácido seleccionado
entre el grupo de aminoácidos constituido por Gly, Ala, Leu e Ile, e
independientemente de los mismos, miméticos, o fragmentos de los
mismos, donde al menos una de dichas leucinas (Leu) de dicho
mimético, o fragmentos del mismo, se sustituye con un aminoácido
seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Gly,
Ala, Val e Ile, e independientemente de los mismos, miméticos, o
fragmentos de los mismos, donde al menos una isoleucina (Ile) de
dichos miméticos, o fragmentos de los mismos, se sustituye con un
aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido
por Gly, Ala, Val y Leu, e independientemente de los mismos,
miméticos o fragmentos de los mismos, donde al menos uno de dichos
ácidos aspárticos (Asp) de dicho mimético, o fragmentos de los
mismos, se sustituye con un aminoácido seleccionado entre el grupo
de aminoácidos constituido por Glu, Asn y Gln, e independientemente
de los mismos, miméticos, o fragmentos de los mismos, donde al
menos una de dichas fenilalaninas (Phe) de dichos miméticos, o
fragmentos de los mismos, se sustituye con un aminoácido
seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Tyr, Trp,
His, Pro y seleccionado preferiblemente entre el grupo de
aminoácidos constituido por Tyr y Trp, e independientemente de los
mismos, miméticos, o fragmentos de los mismos, donde al menos una
de dichas tirosinas (Tyr) de dichos miméticos, o fragmentos de los
mismos, se sustituye con un aminoácido seleccionado entre el grupo
de aminoácidos constituido por Phe, Trp, His, Pro, preferiblemente,
un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido
por Phe y Trp, e independientemente de los mismos, miméticos, o
fragmentos de los mismos, donde al menos una de dichas argininas
(Arg) de dicho fragmento se sustituye con un aminoácido seleccionado
entre el grupo de aminoácidos constituido por Lys e His, e
independientemente de los mismos, miméticos o fragmentos de los
mismos, donde al menos una lisina (Lys) de dichos miméticos, o
fragmentos de los mismos, se sustituye con un aminoácido
seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Arg e
His, e independientemente de los mismos, miméticos, o fragmentos de
los mismos, donde al menos una de dichas asparaginas (Asn) de dichos
miméticos, o fragmentos de los mismos, se sustituye con un
aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido
por Asp, Glu y Gln, e independientemente de los mismos, miméticos, o
fragmentos de los mismos, donde al menos una glutamina (Gln) de
dichos miméticos, o fragmentos de los mismos, se sustituye con un
aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido
por Asp, Glu y Asn, e independientemente de los mismos, miméticos,
o fragmentos de los mismos, donde al menos una prolina (Pro) de
dichos miméticos, o fragmentos de los mismos, se sustituye con un
aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido
por Phe, Tyr, Trp y His, e independientemente de los mismos,
miméticos, o fragmentos de los mismos, donde al menos una de dichas
cisteínas (Cys) de dichos miméticos, o fragmentos de los mismos, se
sustituye con un aminoácido seleccionado entre el grupo de
aminoácidos constituido por Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser,
Thr y Tyr.
Es evidente a partir del anterior resumen que el
mismo equivalente o fragmento del mismo puede comprender más de una
sustitución de aminoácidos conservativa de más de un grupo de
aminoácidos conservativos como se han definido anteriormente en
este documento.
Se pueden introducir sustituciones conservativas
en cualquier posición de un complejo de Hp-Hb
predeterminado preferido o fragmento del mismo. Sin embargo,
también puede ser deseable introducir sustituciones no
conservativas, particularmente, pero sin limitación, una
sustitución no conservativa en una cualquiera o más posiciones.
Una sustitución no conservativa que conduce a la
formación de un fragmento funcionalmente equivalente de las
secuencias en la Figura 1 ó 2, por ejemplo, i) diferiría
sustancialmente en polaridad, por ejemplo, un resto con una cadena
lateral polar tal como Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, o Gln o un
aminoácido cargado tal como Asp, Glu, Arg, o Lys sustituido por un
resto con una cadena lateral no polar (Ala, Leu, Pro, Trp, Val, Ile,
Leu, Phe o Met) o sustituyendo un resto no polar por uno cargado o
uno polar y/o ii) diferiría sustancialmente en su efecto sobre la
orientación de cadena principal del polipéptido tal como sustitución
de o por Pro o Gly por otro resto; y/o iii) diferiría
sustancialmente en carga eléctrica, por ejemplo, sustitución de un
resto cargado positivamente tal como Lys, His o Arg por un resto
cargado negativamente tal como Glu o Asp (y viceversa); y/o iv)
diferiría sustancialmente en volumen estérico, por ejemplo,
sustitución de un resto que tiene una cadena lateral menor, por
ejemplo, Ala, Gly o Ser por uno voluminoso tal como His, Trp, Phe o
Tyr (y viceversa).
La sustitución de aminoácidos, en una
realización, se puede realizar basándose en sus valores de
hidrofobicidad e hidrofilicidad y la relativa similitud de los
sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, incluyendo carga,
tamaño y similares. Las sustituciones ilustrativas de aminoácidos
que tienen en cuenta diversas de las anteriores características se
conocen bien por los especialistas en la técnica e incluyen:
arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina;
glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
La adición o deleción de un aminoácido puede ser
una adición o deleción de 2 a preferiblemente 10 aminoácidos, tal
como de 2 a 8 aminoácidos, por ejemplo, de 2 a 6 aminoácidos, tal
como de 2 a 4 aminoácidos. Sin embargo, en la presente invención
también están comprendidas adiciones de más de 10 aminoácidos, tales
como adiciones de 10 a 200 aminoácidos. En el análisis de las
deleciones y adiciones se hace referencia a una forma monomérica
del complejo, es decir, dos cadenas de hemoglobina y una cadena de
haptoglobina. En las formas multiméricas se pueden realizar
adiciones/deleciones individualmente en cada monómero del
multímero.
Por tanto, se entenderá que la invención se
refiere a complejos de Hp-Hb que comprenden al menos
un fragmento que es capaz de unirse a al menos un receptor CD163 o
una variante del mismo, incluyendo cualquier variante y
equivalentes funcionales de tal al menos un fragmento.
El complejo de Hp-Hb de acuerdo
con la presente invención, que incluye cualquier equivalente
funcional y fragmento del mismo, en una realización puede
comprender menos de 300 restos aminoacídicos, tal como menos de 275
restos aminoacídicos, tal como menos de 250 restos aminoacídicos,
tal como menos de 225 restos aminoacídicos, tal como menos de 200
restos aminoacídicos, tal como menos de 175 restos aminoacídicos,
tal como menos de 150 restos aminoacídicos, tal como menos de 125
restos aminoacídicos, tal como menos de 100 restos aminoacídicos,
tal como menos de 95 restos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 90
restos aminoacídicos, tal como menos de 85 restos aminoacídicos,
por ejemplo, menos de 80 restos aminoacídicos, tal como menos de 75
restos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 70 restos
aminoacídicos, tal como menos de 65 restos aminoacídicos, por
ejemplo, menos de 60 restos aminoacídicos, tal como menos de 55
restos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 50 restos aminoacídicos,
tal como menos de 45 restos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 40
restos aminoacídicos, tal como menos de 38 restos aminoacídicos,
por ejemplo, menos de 37 restos aminoacídicos, tal como menos de 36
restos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 35 restos
aminoacídicos, tal como menos de 34 restos aminoacídicos, por
ejemplo, menos de 33 restos aminoacídicos, tal como menos de 32
restos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 31 restos aminoacídicos,
tal como aproximadamente 30 restos aminoacídicos, por ejemplo,
menos de 30 restos aminoacídicos, tal como aproximadamente 29
restos aminoacídicos. El número de restos aminoacídicos se refiere
al número total de restos aminoacídicos en el complejo
independientemente de que el complejo sea una secuencia de
aminoácidos lineal o un complejo no lineal de secuencias de
aminoácidos.
Un fragmento que comprende la región de unión a
CD163 del complejo nativo de Hp-Hb se prefiere de
forma particular. Sin embargo, la invención no se limita a
fragmentos que comprenden la región de unión a receptor CD163. En
la presente invención también están comprendidas deleciones de tales
fragmentos que generan fragmentos funcionalmente equivalentes del
complejo que comprende menos que la región de unión al receptor
CD163. Los péptidos de complejo funcionalmente equivalentes y
fragmentos de los mismos de acuerdo con la presente invención pueden
comprender menos o más restos aminoacídicos que la región de unión
a receptor CD163.
Los fragmentos que comprenden la región de unión
a receptor CD163 del complejo de Hp-Hb comprenden
preferiblemente regiones capaces de unirse a los dominios SRCR
I-IX del receptor CD163, tal como capaces de unirse
a una región en los dominios SRCR I-VIII del
receptor CD163, capaces de unirse a una región en los dominios SRCR
I-VII del receptor CD163, capaces de unirse a una
región en los dominios SRCR I-VI del receptor CD163,
capaces de unirse a una región en los dominios SRCR
I-V del receptor CD163, capaces de unirse a una
región en los dominios SRCR I-IV del receptor
CD163, capaces de unirse a una región en los dominios SRCR
I-III del receptor CD163, capaces de unirse a una
región en los dominios SRCR I-II del receptor
CD163.
Los fragmentos del complejo comprenden
preferiblemente al menos la cadena pesada (\beta) de haptoglobina
o una parte de dicha cadena que es capaz de formar un complejo con
la hemoglobina.
En particular, los fragmentos pueden comprender
una secuencia correspondiente a los aa 103-347 de
splP00737 en la Figura 4 o a los aa 162-406 de
splP00738.
En una realización, se puede comprender que un
mimético muestra secuencias de aminoácidos que difieren gradualmente
de la secuencia predeterminada preferida, tal como el número y el
alcance de inserciones, deleciones y sustituciones que incluyen
sustituciones conservativas. Esta diferencia se mide como una
reducción en la homología entre la secuencia predeterminada y el
mimético.
Todos los equivalentes funcionales de complejos
de Hp-Hb se incluyen dentro del alcance de esta
invención, sin tener en cuenta el grado de homología que muestran
con una secuencia predeterminada de complejos de
Hp-Hb. La razón de esto es que algunas regiones del
complejo pueden mutar de forma más probable de manera sencilla o
son capaces de ser completamente delecionadas, sin ningún efecto
significativo sobre la actividad de unión del fragmento
resultante.
Un equivalente funcional obtenido por
sustitución puede mostrar alguna forma o grado de actividad de
Hp-Hb nativo y, todavía, ser menos homólogo, si los
restos que contienen cadenas laterales de aminoácidos funcionalmente
similares están sustituidos. Funcionalmente similar a este respecto
se refiere a características dominantes de las cadenas laterales
tales como hidrófobas, básicas, neutras o ácidas, o la presencia o
ausencia de volumen estérico. Por consiguiente, en una realización
de la invención, el grado de identidad entre i) un equivalente de
complejo dado capaz de función y ii) un fragmento predeterminado
preferido, no es una medida principal del fragmento como una
variante o equivalente funcional de un fragmento de complejo
predeterminado preferido de acuerdo con la presente invención.
Los fragmentos que comparten al menos cierta
homología con un fragmento de complejo predeterminado preferido de
al menos 50 aminoácidos, más preferiblemente al menos 100
aminoácidos, se tiene que considerar que pertenecen al alcance de
la presente invención cuando tienen una homología de al menos
aproximadamente el 40 por ciento con el complejo de
Hp-Hb predeterminado preferido o fragmento del
mismo, tal como al menos aproximadamente el 50 por ciento de
homología, por ejemplo, al menos aproximadamente el 60 por ciento de
homología, tal como al menos aproximadamente el 70 por ciento de
homología, por ejemplo, al menos aproximadamente el 75 por ciento
de homología, tal como al menos aproximadamente el 80 por ciento de
homología, por ejemplo, al menos aproximadamente el 85 de
homología, tal como al menos aproximadamente el 90 por ciento
homología, por ejemplo, al menos el 92 por ciento de homología, tal
como al menos el 94 por ciento de homología, por ejemplo, al menos
el 95 por ciento de homología, tal como al menos el 96 por ciento
de homología, por ejemplo, al menos el 97 por ciento de homología,
tal como al menos el 98 por ciento de homología, por ejemplo, al
menos el 99 por ciento de homología con el fragmento de complejo
predeterminado. En una realización preferida, los anteriores
porcentajes de homología también se refieren al porcentaje de
identidad.
El complejo de Hp-Hb está
constituido preferiblemente por al menos dos cadenas diferentes
(secuencias) donde una cadena constituye la parte de haptoglobina
del complejo y la otra cadena constituye la parte de hemoglobina.
Sin embargo, un mimético del complejo de Hp-Hb puede
estar constituido por una cadena (secuencia) o multímeros de dicha
cadena, donde la cadena es un equivalente estérico del complejo de
Hp-Hb.
Además de los miméticos descritos en este
documento, se pueden formular variantes estéricamente similares
para que imiten las porciones clave de la estructura variante y
tales compuestos también se pueden usar del mismo modo que las
variantes de la invención. Esto se puede conseguir mediante técnicas
de modelado y diseño químico conocidas por los especialistas en la
técnica. Se comprenderá que todas estas construcciones estéricamente
similares pertenecen al alcance de la presente invención.
En una realización, el complejo de
Hp-Hb o partes del mismo o miméticos del mismo se
sintetiza por síntesis automatizada. Se puede emplear cualquiera de
las técnicas en fase sólida disponibles en el mercado, tales como
el procedimiento de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que
se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena de aminoácidos
creciente. El equipamiento para la síntesis automatizada de
polipéptidos está disponible en el mercado en proveedores tales
como Applied Biosystems, Inc. de Foster City, Calif., y se puede
accionar generalmente de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. La síntesis en fase sólida permitirá la incorporación
de sustituciones de aminoácidos deseables en cualquier complejo de
Hp-Hb de acuerdo con la presente invención. Se
entenderá que las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier
subcombinación de las mismas se pueden combinar para conseguir una
secuencia final de un equivalente funcional. Se debe entender que
las inserciones incluyen fusiones amino-terminales
y/o carboxi-terminales, por ejemplo, con una
proteína hidrófoba o inmunogénica o un vehículo tal como cualquier
polipéptido o estructura de armazón capaz de servir como un
vehículo.
Los complejos de Hp-Hb de
acuerdo con la invención se pueden sintetizar tanto in vitro
como in vivo. Los procedimientos para la síntesis in
vitro se conocen bien. Cuando se sintetizan in vivo, una
célula huésped se transforma con vectores que contienen ADN que
codifica diversas partes del complejo de Hp-Hb. Un
vector se define como una construcción de ácido nucleico que se
puede replicar. Los vectores se usan para mediar en la expresión
del complejo de Hp-Hb. Un vector de expresión es una
construcción de ADN que se puede replicar en la que una secuencia
de ácido nucleico que codifica el complejo de Hp-Hb
predeterminado, o cualquier equivalente funcional del mismo que se
pueda expresar in vivo, está unida operativamente a
secuencias de control adecuadas capaces de realizar la expresión de
la variante o equivalente en un huésped adecuado. Tales secuencias
de control se conocen bien en la
técnica.
técnica.
Una secuencia de ADN que codifica las diversas
partes del complejo de Hp-Hb quiere decir una
secuencia de ADN que codifica la parte de haptoglobina y una
secuencia de ADN que codifica la parte de hemoglobina. En otra
realización, la secuencia de ADN puede ser una secuencia que
codifica una secuencia peptídica que se escinde después de la
traducción en la parte de haptoglobina y la parte de hemoglobina. En
otra realización más, un péptido que constituye ambas partes no se
escinde, pero debido a plegamiento y/o procesamiento después de la
traducción funciona como el complejo.
Por consiguiente, un aspecto de la invención se
refiere a una secuencia de ADN que codifica un complejo de
Hp-Hb como se ha definido anteriormente, la
secuencia de ADN puede ser una secuencia de ADN genómico, una
secuencia de ADNc o una mezcla de una secuencia de ADN genómico y de
ADNc.
Además, la invención se refiere a un vector que
comprende la secuencia de ADN, así como a una célula que comprende
dicho vector, siendo capaz dicha célula de expresar la secuencia de
ADN, como un complejo de Hp-Hb liberado al medio de
cultivo celular o un complejo de Hp-Hb anclado a la
membrana celular.
Los cultivos de células se pueden obtener de
células procariotas y eucariotas. En principio, es factible
cualquier cultivo de células eucariotas superiores, de cultivo de
vertebrado o invertebrado, pero se prefieren células humanas. Los
ejemplos de líneas de células huésped útiles son líneas celulares de
E. coli, levadura o humanas. Las células huésped preferidas
son células eucariotas que se sabe que sintetizan haptoglobina y/o
hemoglobina endógena. Los cultivos de tales células huésped se
pueden aislar y usar como una fuente de la variante o se pueden
usar en procedimientos terapéuticos de tratamiento, que incluyen
procedimientos terapéuticos que tienen por objeto procedimientos de
diagnóstico realizados en el cuerpo humano o animal.
Para aumentar la afinidad de unión el complejo
de Hp-Hb o parte del mismo o mimético del mismo es
preferiblemente dimérico. En una realización más preferida, el
complejo de Hp-Hb o una parte del mismo o un
mimético del mismo es multimérico. Dimérico y multimérico se
refiere al número de monómeros de haptoglobina. La hemoglobina puede
ser monomérica o dimérica para cada cadena de haptoglobina. Existe
una correlación entre el tipo de formas multiméricas del complejo
de Hp-Hb y el grado de unión a un receptor CD163 o
una variante de CD163 de la invención. Una forma multimérica de un
complejo de Hp-Hb debido a su tamaño tendrá una
exposición aumentada para encontrarse con variantes de CD163 que
cuando se compara con una forma monomérica, o incluso una dimérica,
y, por tanto, se observa una afinidad funcional aumentada por
variantes de CD163. Además, la forma multimérica del complejo puede
unirse a más de un receptor sobre la célula presentadora de CD163
que conduce a una avidez aumentada de la unión.
Los multímeros se pueden crear por un resto de
engarce común, tal como puentes S-S como en la
haptoglobina de origen natural. El resto de engarce común se
localiza preferiblemente de tal manera que no se altera la
formación de complejos con la hemoglobina. Se prefiere que el resto
de engarce común se localice en la cadena ligera de la
haptoglobina.
\newpage
De acuerdo con la invención, el complejo de
Hp-Hb, o una parte del mismo que se une
operativamente a una sustancia como se ha descrito anteriormente,
puede ser para el uso como un medicamento. Tal medicamento puede
funcionar mediante un procedimiento, en el que el complejo de
Hp-Hb o una parte del mismo se usa en un
procedimiento de tratamiento de un individuo, que comprende las
etapas de:
- i)
- proporcionar un complejo de Hp-Hb, o una parte del mismo o un mimético del mismo capaz de unirse al receptor CD163 y/o la variante de CD163,
- ii)
- unirse operativamente una sustancia como se ha definido anteriormente al complejo de Hp-Hb o una parte del mismo o un mimético del mismo,
- iii)
- administrar el medicamento que comprende la sustancia unida operativamente al complejo de Hp-Hb a un individuo que lo necesite.
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La expresión unido operativamente significa que
la sustancia está acoplada o unida al complejo de tal manera que la
sustancia se transporta a la célula que presenta un receptor CD163 o
una variante de CD163, después de lo cual, la sustancia se puede
liberar del complejo si es apropiado.
Debido a la unión del complejo o fragmento o
mimético del mismo al receptor CD163 y/o una variante de CD163, la
sustancia comprendida en o unida al complejo de
Hp-Hb se capta por las células presentadoras de
CD163 o al menos se localiza en el entorno próximo a las células.
De este modo, es posible concentrar la sustancia en o alrededor de
la célula que presenta el receptor CD163. A continuación se describe
un ensayo para analizar la captación opcional en el Ejemplo 4.
En una realización de la invención, el complejo
de Hp-Hb, o una parte del mismo, se puede unir
operativamente a una sustancia, tal como un medicamento, un gen,
una vesícula, vector o similares.
El medicamento puede ser cualquier medicamento
para el que sea deseable dirigir el fármaco a un tejido particular
o células particulares. En particular, el medicamento es un agente
antimicrobiano o un fármaco anticanceroso.
El medicamento preferiblemente es un medicamento
contra enfermedades relacionadas con monocitos, tales como
macrófagos. En particular, la invención se refiere a un complejo que
está unido operativamente a un fármaco
anti-VIH.
En otra realización, la sustancia es un
medicamento contra linfomas, tales como linfomas histiocíticos.
En otra realización más, la sustancia puede
estimular los macrófagos para que produzcan interleucina 6.
En una realización adicional, la sustancia es un
antígeno con propósitos vacunales.
En otra realización, la sustancia del complejo
de Hp-Hb, o un equivalente funcional del mismo,
comprende un gen, es decir, una construcción génica. El gen puede
ser cualquier gen que codifique una función biológica particular.
Por ejemplo, el gen puede comprender un ácido nucleico, tal como
PNA, LNA, ADN o ARN o el gen puede comprender ADNc. El gen también
puede comprender menos de los genes de longitud completa o de ADNc,
tal como fragmentos de los mismos. El complejo de
Hp-Hb que comprende un gen se puede usar en terapia
de suministro génico, por lo que el gen se capta por la célula que
presenta el receptor CD163 o una variante del mismo.
Las construcciones se pueden introducir como una
o más moléculas o construcciones de ADN. Las construcciones se
preparan de maneras convenientes, donde los genes y regiones
reguladoras se pueden aislar, por ejemplo, ligar, clonar en un
huésped de clonación apropiado, analizar por restricción o
secuenciación u otros medios convenientes. Usando PCR, se pueden
aislar fragmentos individuales que incluyen todo o porciones de una
unidad funcional, donde se pueden introducir una o más mutaciones
usando "reparación con cebador", ligación, mutagénesis in
vitro, etc., cuando sea apropiado. La construcción o las
construcciones una vez completadas y demostrado que tienen las
secuencias apropiadas, se pueden introducir después en células
huésped mediante cualquier medio conveniente, como se analiza con
más detalle más adelante.
Las construcciones se pueden introducir como una
única molécula de ADN que codifica todos los genes, o moléculas
diferentes de ADN que tienen uno o más genes. Las construcciones se
pueden introducir simultánea o consecutivamente, cada una con los
mismos o diferentes marcadores.
El gen se puede unir al complejo como tal o
proteger mediante cualquier sistema adecuado usado normalmente para
la transfección tal como vectores virales o envuelta viral
artificial, liposomas o micelas, donde el sistema se une al
complejo.
Se conocen numerosas técnicas para introducir
ADN en células eucariotas para el especialista en la técnica. Con
frecuencia esto se realiza mediante vectores y, con frecuencia, en
forma de ácido nucleico encapsidado con una envuelta proteinácea
(frecuentemente similar a virus). Se pueden aplicar sistemas de
suministro de genes a una amplia variedad de aplicaciones clínicas
así como experimentales.
Los vectores que contienen elementos útiles
tales como marcadores de selección y/o amplificables, elementos de
promotor/potenciador para expresión en células de mamífero,
particularmente humanas, y que se pueden usar para preparar
soluciones madre de ADN de construcción y para realizar
transfecciones se conocen bien en la técnica. Muchos están
disponibles en el mercado.
Se han desarrollado diversas técnicas para la
modificación de tejido diana y células in vivo. Se conoce que
varios vectores virales, analizados más adelante, permiten la
transfección e integración aleatoria del virus en el huésped.
Véase, por ejemplo, Dubensky y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 81: 7529-7533; Kaneda y col., (1989) Science
243: 375-378; Hiebertetal. (1989) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 86: 3594-3598; Hatzoglu y col., (1990) J.
Biol. Chem. 265: 17285-17293; Ferry y col. (1991)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 8377-8381. Las vías
y los modos de administrar el vector incluyen inyección, por
ejemplo, administración por vía intravascular o por vía
intramuscular, inhalación u otra administración parenteral.
Las ventajas de vectores de adenovirus para
terapia génica humana incluyen el hecho de que la recombinación es
poco frecuente, no se conoce que ninguna neoplasia humana esté
asociada con tales virus, el genoma del adenovirus es ADN de doble
cadena que se puede manipular para aceptar genes extraños de hasta
7,5 kb de tamaño y el adenovirus vivo es un organismo vacunal
humano seguro.
Otro vector que puede expresar la molécula de
ADN de la presente invención y es útil en terapia génica,
particularmente en seres humanos, es el virus vaccinia, que se
puede convertir en no replicante (Patentes de Estados Unidos Nº
5.225.336; 5.204.243, 5.155.020, 4.769.330).
Basándose en el concepto de la mimeticidad
viral, se diseñan envueltas víricas artificiales (AVE) basándose en
la estructura y la composición de una membrana vírica, tal como
VIH-1 o RSV y se usan para suministrar genes en
células in vitro e in vivo. Véase, por ejemplo, la
Patente de Estados Unidos Nº 5.252.348, Schreier, H. y col., J.
Mol. Recognit., 1995, 8: 59-62; Schreier H y col.,
J. Biol. Chem., 1994, 269: 9090-9098; Schreier, H.,
Pharm. Acta Helv. 1994, 68: 145-159; Chander, R y
col. Life Sci., 1992, 50: 481-489, cuyas referencias
se incorporan en este documento por referencia en su totalidad. La
envuelta se produce preferiblemente en un procedimiento de diálisis
de dos etapas en el que se forma inicialmente la envuelta
"desnuda", seguido de inserción unidireccional de la
glucoproteína de superficie vírica de interés. Este procedimiento y
las características físicas de la AVE resultante se describen con
detalle por Chander y col., (anteriormente). Los ejemplos de
sistemas de AVE son: (a) una AVE que contiene la glucoproteína de
superficie de VIH-1 gp160 (Chander y col.,
anteriormente; Schreier y col., 1995, anteriormente) o gp120 unido a
glicosil fosfatidilinositol (GPI) (Schreier y col., 1994,
anteriormente), respectivamente, y (b) una AVE que contiene
glucoproteínas unión (G) y de fusión (F) del virus sincitial
respiratorio (RSV) (Stecenko, A. A. y col., Pharm. Pharmacol. Lett.
1: 127-129 (1992)). Por tanto, se construyen
vesículas que imitan las membranas naturales de virus envueltos en
su capacidad de unirse a y suministrar materiales a células que
llevan receptores de superficie correspondientes.
Las AVE se usan para suministrar genes tanto por
inyección intravenosa como por instilación a los pulmones. Por
ejemplo, las AVE se fabrican para imitar RSV, que muestran la
glucoproteína de superficie F de RSV que proporciona entrada
selectiva en células epiteliales. Las F-AVE se
cargan con un plásmido que codifica el gen de interés (o un gen
indicador tal como CAT no presente en tejido de mamífero).
El sistema de AVE descrito en este documento es
física y químicamente esencialmente idéntico al virus natural
aunque es completamente "artificial", ya que se construye a
partir de fosfolípidos, colesterol y glucoproteínas de superficie
vírica recombinantes. Por tanto, no existe transmisión de
información genética viral y no existe riesgo de infección vírica
inadvertida. La construcción de las AVE en dos etapas independientes
permite la producción a granel de las envueltas lipídicas sencillas
que, en una segunda etapa separada, después se pueden marcar con la
glucoproteína viral deseada, también permitiendo la preparación de
formulaciones de combinado de proteínas, si se desea.
Otro vehículo de suministro para el uso en la
presente invención se basa en la descripción reciente de
Shigella atenuada como un sistema de suministro de ADN
(Sizemore, D. R. y col., Science 270: 299-302
(1995), cuya referencia se incorpora por referencia en su
totalidad). Esta estrategia aprovecha la capacidad de
Shigella de entrar en células epiteliales y escapar a la
vacuola fagocítica como un procedimiento para suministrar la
construcción genética al citoplasma de la célula diana. La invasión
con tan sólo de una a cinco bacterias puede dar como resultado la
expresión del ADN plasmídico extraño suministrado por estas
bacterias.
Un tipo preferido de mediador de transfección no
viral in vitro e in vivo son los lípidos catiónicos
(derivatizados con amonio). Estos lípidos cargados positivamente
forman complejos con ADN cargado negativamente, dando como
resultado neutralización y compactación de ADN cargado. Los
complejos experimentan endocitosis después de la asociación con la
membrana celular y el ADN de alguna manera escapa al endosoma,
obteniendo acceso al citoplasma. Los complejos de lípido
catiónico:ADN parecen altamente estables en condiciones normales.
Los estudios sobre el lípido catiónico DOTAP sugieren que el
complejo se disocia cuando la capa interna de la membrana celular
se desestabiliza y los lípidos aniónicos de la capa interna
desplazan el ADN del lípido catiónico. Están disponibles en el
mercado varios lípidos catiónicos. Dos de estos, DMRI y
DC-colesterol, se han usado en experimentos
clínicos humanos. Los lípidos catiónicos de primera generación son
menos eficaces que los vectores víricos. Para el suministro al
pulmón, cualquier respuesta inflamatoria que acompaña a la
administración de liposoma se reduce cambiando el modo de
suministro a la administración en aerosol que distribuye la dosis de
forma más uniforme.
El gen puede ser cualquier gen expresado
apropiadamente por las células presentadoras de CD163. En una
realización, el gen puede ser un gen para CD163 como una terapia
génica para individuos que tienen expresión de
CD-163 reducida.
En otra realización, el gen codifica un antígeno
para una vacunación génica. En cualquier situación, puede ser una
ventaja que los macrófagos no se multipliquen, por lo que este tipo
de terapia génica es una forma apropiada de terapia génica
temporal.
La estrategia de terapia génica se puede
utilizar de un modo específico de sitio para suministrar un vector
retroviral al tejido u órgano de elección. Por tanto, por ejemplo,
se puede usar un sistema de suministro con catéter. (Nabel, E. G. y
col., Science 244: 1342 (1989)). Tales procedimientos, que usan un
vector retroviral o un vector de liposoma, son particularmente
útiles para suministrar el gen a una pared de vaso sanguíneo.
También se pueden usar otros vectores de virus,
en particular, para terapia génica humana, incluyendo vectores de
adenovirus recombinantes.
Recientemente se ha descrito un procedimiento no
tóxico y eficaz basado en el virus Sendai, también conocido como
virus hemoaglutinante de Japón (HVJ).
HVJ-liposome-mediated gene transfer
is performed Morishita R y col., Hypertension (1993) 21:
894-89.
Además, la sustancia del complejo de
Hp-Hb, o una parte del mismo, también puede
comprender un trazador o un marcador, tal como cromóforos,
fluoróforos, biotina, isótopos, enzimas, para identificar las
células que presentan el receptor CD163 o una variante del mismo.
De este modo, también se puede usar el complejo de
Hp-Hb con propósitos de diagnóstico.
En una realización, el complejo de
Hp-Hb o fragmento del mismo o mimético del mismo que
está unido operativamente a una sustancia es capaz de unirse
solamente a una variante de CD163, para evitar la unión al receptor
CD163 de origen natural sobre macrófagos. De este modo es posible
dirigir una sustancia a un subgrupo de células que presentan
solamente la variante de CD163.
Es otro objeto de la presente invención usar una
molécula de CD163 como un medicamento. El uso de una molécula de
CD163 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de
hemólisis en un individuo que necesita tal tratamiento. Existen
varios campos de aplicación, donde uno es el uso de una molécula de
CD163 para la eliminación de al menos un complejo de
Hp-Hb en suero y/o plasma de un individuo. Una
segunda aplicación es el uso de una molécula de CD163 para la
determinación de la velocidad de hemólisis de un individuo. Además,
el uso de al menos un complejo que comprende hemoglobina y
haptoglobina como un marcador para una célula, tal como un
macrófago que expresa una molécula de CD163, en el que al menos una
de las moléculas de hemoglobina o haptoglobina están marcadas, es
otra área de aplicación más.
De acuerdo con la invención, la expresión
"variante de CD163" quiere decir que incluye equivalentes
funcionales de CD163, o un fragmento de CD163, comprendiendo dicho
CD163 una secuencia predeterminada de aminoácidos. Por tanto, una
variante de CD163 es diferente de CD163 nativo. Una "variante"
se define como:
- iv)
- variantes que comprenden una secuencia de aminoácidos capaz de ser reconocida por un anticuerpo también capaz de reconocer la secuencia predeterminada de aminoácidos, y/o
- v)
- variantes que comprenden una secuencia de aminoácidos capaz de unirse a un complejo de Hp-Hb también capaz de unirse a la secuencia predeterminada de aminoácidos y/o
- vi)
- variantes que tienen una afinidad al menos sustancialmente similar a al menos un complejo de Hp-Hb como dicha secuencia predeterminada de aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Con la expresión "secuencia predeterminada de
aminoácidos" se quiere decir cualquiera de las secuencias de
aminoácidos ilustradas en las Figuras 5a y 5b, es decir, cualquiera
de las secuencias para CD163 que tienen la siguiente identificación
de secuencia en la base de datos de secuencia trEMBL:
trlQ07898IQ07898
trlQ07901IQ07901
trlQ07900IQ07900
trlQ07899IQ07899
\vskip1.000000\baselineskip
"Equivalencia funcional" como se usa en la
presente invención se establece de acuerdo con una realización
preferida mediante referencia a la funcionalidad correspondiente de
un fragmento de CD163 predeterminado.
De acuerdo con la presente invención, un
equivalente funcional de una variante de CD163 o fragmentos de la
misma se puede obtener mediante adición, sustitución o deleción de
al menos un aminoácido. Cuando la secuencia de aminoácidos
comprende una sustitución de un aminoácido por otro, tal sustitución
puede ser una sustitución de aminoácidos conservativa. Los
fragmentos de CD163 de acuerdo con la presente invención pueden
comprender más de una de tales sustituciones, tal como, por
ejemplo, dos sustituciones de aminoácidos conservativas, por
ejemplo, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos conservativas,
tal como cinco o seis sustituciones de aminoácidos conservativas,
por ejemplo, siete u ocho sustituciones de aminoácidos
conservativas, tal como de 10 a 15 sustituciones de aminoácidos
conservativas, por ejemplo, de 15 a 25 sustituciones de aminoácidos
conservativas. Las sustituciones se pueden realizar en uno
cualquiera o más grupos de aminoácidos predeterminados.
Los ejemplos de fragmentos que comprenden una o
más sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen una o más
sustituciones de aminoácidos conservativas dentro del mismo grupo de
aminoácidos predeterminados o una pluralidad de sustituciones de
aminoácidos conservativas, donde cada sustitución conservativa se
genera por sustitución dentro de un grupo diferente de aminoácidos
predeterminados.
Una variante de CD163 de origen natural es el
CD163 soluble, que puede ser de longitud completa o estar truncado,
tal como acortado con la cola citoplasmática y/o segmento
transmembrana.
Por consiguiente, una variante de CD163, o
fragmentos de la misma de acuerdo con la invención puede comprender,
dentro de la misma variante de CD163, o fragmentos de la misma, al
menos una sustitución, tal como una pluralidad de sustituciones
introducidas independientemente entre sí. Las variantes de CD163, o
fragmentos de las mismas, por tanto, pueden comprender
sustituciones conservativas independientemente entre sí, donde al
menos una glicina (Gly) de dichas variantes de CD163, o fragmentos
de las mismas de CD163 se sustituye con un aminoácido seleccionado
entre el grupo de aminoácidos constituido por Ala, Val, Leu e Ile e
independientemente de los mismos, variante de CD163, o fragmentos
de la misma, donde al menos una de dichas alaninas (Ala) de dicha
variante de CD163, o fragmentos de la misma se sustituye con un
aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido
por Gly, Val, Leu e Ile, e independientemente de los mismos;
variante de CD163, o fragmentos de la misma, donde al menos una
valina (Val) de dicha variante de CD163, o fragmentos de la misma,
se sustituye con un aminoácido seleccionado entre el grupo de
aminoácidos constituido por Gly, Ala, Leu e Ile, e
independientemente de los mismos, variantes de CD163, o fragmentos
de las mismas, donde al menos una de dichas leucinas (Leu) de dicha
variante de CD163, o fragmentos de la misma, se sustituye con un
aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido
por Gly, Ala, Val e Ile, e independientemente de los mismos,
variantes de CD163, o fragmentos de las mismas, donde al menos una
isoleucina (Ile) de dichas variantes de CD163, o fragmentos de las
mismas, se sustituye con un aminoácido seleccionado entre el grupo
de aminoácidos constituido por Gly, Ala, Val y Leu, e
independientemente de los mismos, variantes de CD163, o fragmentos
de las mismas, donde al menos uno de dichos ácidos aspárticos (Asp)
de dichas variantes de CD163, o fragmentos de las mismas, se
sustituye con un aminoácido seleccionado entre el grupo de
aminoácidos constituido por Glu, Asn y Gln, e independientemente de
los mismos, variantes de CD163, o fragmentos de las mismas, donde al
menos una de dichas fenilalaninas (Phe) de dichas variantes de
CD163, o fragmentos de las mismas, se sustituye con un aminoácido
seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Tyr,
Trp, His, Pro y seleccionado preferiblemente entre el grupo de
aminoácidos constituido por Tyr y Trp, e independientemente de los
mismos, variantes de CD163, o fragmentos de las mismas, donde al
menos una de dichas tirosinas (Tyr) de dichas variantes de CD163, o
fragmentos de las mismas, se sustituye con un aminoácido
seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Phe,
Trp, His, Pro, preferiblemente un aminoácido seleccionado entre el
grupo de aminoácidos constituido por Phe y Trp, e
independientemente de los mismos, variantes de CD163, o fragmentos
de las mismas, donde al menos una de dichas argininas (Arg) de
dicho fragmento de CD163 se sustituye con un aminoácido seleccionado
entre el grupo de aminoácidos constituido por Lys e His, e
independientemente de los mismos, variantes de CD163, o fragmentos
de las mismas, donde al menos una lisina (Lys) de dichas variantes
de CD163, o fragmentos de las mismas, se sustituye con un
aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido
por Arg e His, e independientemente de los mismos, variantes de
CD163, o fragmentos de las mismas, donde al menos una de dichas
asparaginas (Asn) de dichas variantes de CD163, o fragmentos de las
mismas, se sustituye con un aminoácido seleccionado entre el grupo
de aminoácidos constituido por Asp, Glu y Gln, e independientemente
de los mismos, variantes de CD163, o fragmentos de las mismas, donde
al menos una glutamina (Gln) de dichas variantes de CD163, o
fragmentos de las mismas, se sustituye con un aminoácido
seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Asp, Glu
y Asn, e independientemente de los mismos, variantes de CD163, o
fragmentos de las mismas, donde al menos una prolina (Pro) de
dichas variantes de CD163, o fragmentos de las mismas, se sustituye
con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos
constituido por Phe, Tyr, Trp y His, e independientemente de los
mismos, variantes de CD163, o fragmentos de las mismas, donde al
menos una de dichas cisteínas (Cys) de dichas variantes de CD163, o
fragmentos de las mismas, se sustituye con un aminoácido
seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Asp, Glu,
Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr y Tyr.
Es evidente a partir del anterior resumen que la
misma variante o fragmento de la misma puede comprender más de una
sustitución de aminoácidos conservativa de más de un grupo de
aminoácidos conservativos como se han definido anteriormente en
este documento.
Se pueden introducir sustituciones conservativas
en cualquier posición de una variante de CD163, o fragmentos de la
misma, predeterminada preferida. Sin embargo, también puede ser
deseable introducir sustituciones no conservativas,
particularmente, pero sin limitación, una sustitución no
conservativa en una cualquiera o más posiciones.
Una sustitución no conservativa que conduce a la
formación de un fragmento funcionalmente equivalente de CD163, por
ejemplo, i) diferiría sustancialmente en hidrofobicidad, por
ejemplo, un resto hidrófilo tal como Arg, Lys, Trp o Asn sustituido
por un resto hidrófobo (Val, Ile, Leu, Phe o Met) o un resto
hidrófobo sustituido por un resto hidrófilo tal como Thr, Ser, His,
Gln, Asn, Lys, Asp, Glu o Trp y/o ii) diferiría sustancialmente en
su efecto sobre la orientación de cadena principal del polipéptido
tal como sustitución de o por Pro o Gly por otro resto; y/o iii)
diferiría sustancialmente en carga eléctrica, por ejemplo,
sustitución de un resto cargado positivamente tal como Lys, His o
Arg por un resto cargado negativamente tal como Glu o Asp (y
viceversa); y/o iv) diferiría sustancialmente en volumen estérico,
por ejemplo, sustitución de un resto que tiene una cadena lateral
menor, por ejemplo, Ala, Gly o Ser por uno voluminoso tal como His,
Trp, Phe o Tyr (y viceversa).
La sustitución de aminoácidos, en una
realización, se puede realizar basándose en sus valores de
hidrofobicidad e hidrofilicidad y la relativa similitud de los
sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, incluyendo carga,
tamaño y similares. Las sustituciones ilustrativas de aminoácidos
que tienen en cuenta diversas de las anteriores características se
conocen bien por los especialistas en la técnica e incluyen:
arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina;
glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
La adición o deleción de un aminoácido puede ser
una adición o deleción de 2 a preferiblemente 10 aminoácidos, tal
como de 2 a 8 aminoácidos, por ejemplo, de 2 a 6 aminoácidos, tal
como de 2 a 4 aminoácidos. Sin embargo, en la presente invención
también están comprendidas adiciones de más de 10 aminoácidos, tales
como adiciones de 10 a 200 aminoácidos.
Por tanto, se entenderá que la invención se
refiere a variantes de CD163 que comprenden al menos un fragmento
que es capaz de unirse a al menos un complejo de
Hp-Hb, incluyendo cualquier variante y equivalentes
funcionales de tal al menos un fragmento.
La variante de CD163 de acuerdo con la presente
invención, que incluye cualquier equivalente funcional y fragmento
de la misma, en una realización puede comprender menos de 1000
restos aminoacídicos, tal como menos de 950 restos aminoacídicos,
por ejemplo, menos de 900 restos aminoacídicos, tal como menos de
850 restos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 800 restos
aminoacídicos, tal como menos de 750 restos aminoacídicos, por
ejemplo, menos de 700 restos aminoacídicos, tal como menos de 650
restos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 600 restos
aminoacídicos, tal como menos de 550 restos aminoacídicos, por
ejemplo, menos de 500 restos aminoacídicos, tal como menos de 450
restos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 400 restos
aminoacídicos, tal como menos de 380 restos aminoacídicos, por
ejemplo, menos de 370 restos aminoacídicos, tal como menos de 360
restos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 350 restos
aminoacídicos, tal como menos de 340 restos aminoacídicos, por
ejemplo, menos de 330 restos aminoacídicos, tal como menos de 320
restos aminoacídicos, por ejemplo, menos de 310 restos
aminoacídicos, tal como aproximadamente 300 restos aminoacídicos,
por ejemplo, menos de 300 restos aminoacídicos, tal como
aproximadamente 290 restos aminoacídicos.
Un fragmento que comprende la región de unión a
Hp-Hb de CD163 nativo se prefiere de forma
particular. Sin embargo, la invención no se limita a fragmentos que
comprenden la región de unión a Hp-Hb. En la
presente invención también están comprendidas deleciones de tales
fragmentos que generan fragmentos funcionalmente equivalentes de
CD163 que comprenden menos que la región de unión a
Hp-Hb. Los péptidos de CD163 funcionalmente
equivalentes y fragmentos de los mismos de acuerdo con la presente
invención pueden comprender menos o más restos aminoacídicos que la
región de unión a Hp-Hb.
Los fragmentos que comprenden la región de unión
a Hp-Hb comprenden los dominios SRCR
I-IX del receptor CD163, tal como capaces de unirse
a una región en los dominios SRCR I-VIII del
receptor CD163, capaces de unirse a una región en los dominios SRCR
I-VII del receptor CD163, capaces de unirse a una
región en los dominios SRCR I-VI del receptor
CD163, capaces de unirse a una región en los dominios SRCR
I-V del receptor CD163, capaces de unirse a una
región en los dominios SRCR I-IV del receptor CD163,
capaces de unirse a una región en los dominios SRCR
I-III del receptor CD163, capaces de unirse a una
región en los dominios SRCR I-II del receptor CD163
o una variante de los mismos.
En una realización preferida, los fragmentos que
comprenden la región de unión a Hp-Hb comprenden
preferiblemente los dominios SRCR I-IX del receptor
CD163, tal como capaces de unirse a una región en los dominios SRCR
III-IX del receptor CD163, capaces de unirse a una
región en los dominios SRCR III-VIII del receptor
CD163, capaces de unirse a una región en los dominios SRCR
III-VII del receptor CD163, capaces de unirse a una
región en los dominios SRCR III-VI del receptor
CD163, capaces de unirse a una región en los dominios SRCR
III-V del receptor CD163, capaces de unirse a una
región en los dominios SRCR III-IV del receptor
CD163, capaces de unirse a una región en los dominios SRCR III o IV
del receptor CD163 o una variante de los mismos.
Los dominios en una realización se disponen del
siguiente modo con respecto a la secuencia de CD163:
Los dominios definidos por la posición de los
restos de cisteína se corresponden a
D1: aa 46-146
D2: aa 154-253
D3: aa 261-360
D4: aa 368-467
D5: aa 473-572
D6: aa 578-677
D7: aa 714-814
D8: aa 819-920
D9: aa 924-1023
\vskip1.000000\baselineskip
Numeración de acuerdo con la secuencia de ADN
traducida (Nº de acceso de GenBank Z22968).
Se comprenderá que los equivalentes funcionales
de variantes de CD163 muestran secuencias de aminoácidos que
difieren gradualmente de la secuencia predeterminada preferida, ya
que el número y el alcance de inserciones, deleciones y
sustituciones incluyendo sustituciones conservativas aumenta. Esta
diferencia se mide como una reducción en la homología y/o identidad
entre la secuencia predeterminada preferida y el fragmento o
equivalente funcional.
Todos los fragmentos o equivalentes funcionales
de variantes de CD163 se incluyen dentro del alcance de esta
invención, sin tener en cuenta el grado de homología que muestran
con una secuencia predeterminada preferida de variantes de CD163.
La razón de esto es que algunas regiones de CD163 pueden mutar de
forma más probable de manera sencilla o son capaces de ser
completamente delecionadas, sin ningún efecto significativo sobre
la actividad de unión del fragmento resultante.
Una variante funcional obtenida por sustitución
puede mostrar alguna forma o grado de actividad de CD163 nativo y,
todavía, ser menos homóloga, si los restos que contienen cadenas
laterales de aminoácidos funcionalmente similares están
sustituidos. Funcionalmente similar a este respecto se refiere a
características dominantes de las cadenas laterales tales como
hidrófobas, básicas, neutras o ácidas, o la presencia o ausencia de
volumen estérico. Por consiguiente, en una realización de la
invención, el grado de identidad entre i) un fragmento de CD163
dado capaz de función y ii) un fragmento predeterminado preferido,
no es una medida principal del fragmento como una variante o
equivalente funcional de un fragmento de CD163 predeterminado
preferido de acuerdo con la presente invención.
Los fragmentos que comparten al menos cierta
homología con un fragmento de CD163 predeterminado preferido de al
menos 50 aminoácidos, preferiblemente al menos 100 aminoácidos, se
tiene que considerar que pertenecen al alcance de la presente
invención cuando tienen una homología de al menos aproximadamente el
40 por ciento con la variante de CD163 predeterminada o fragmento
de la misma, tal como al menos aproximadamente el 50 por ciento de
homología, por ejemplo, al menos aproximadamente el 60 por ciento de
homología, tal como al menos aproximadamente el 70 por ciento de
homología, por ejemplo, al menos aproximadamente el 75 por ciento de
homología, tal como al menos aproximadamente el 80 por ciento de
homología, por ejemplo, al menos aproximadamente el 85 de
homología, tal como al menos aproximadamente el 90 por ciento
homología, por ejemplo, al menos el 92 por ciento de homología, tal
como al menos el 94 por ciento de homología, por ejemplo, al menos
el 95 por ciento de homología, tal como al menos el 96 por ciento
de homología, por ejemplo, al menos el 97 por ciento de homología,
tal como al menos el 98 por ciento de homología, por ejemplo, al
menos el 99 por ciento de homología con el fragmento de CD163
predeterminado. En una realización preferida, los porcentajes que se
han mencionado anteriormente también se refieren a porcentajes de
identidad.
Además de las variantes descritas en este
documento, se pueden formular variantes estéricamente similares
para que imiten las porciones clave de la estructura variante y
tales compuestos también se pueden usar del mismo modo que las
variantes de la invención. Esto se puede conseguir mediante técnicas
de modelado y diseño químico conocidas por los especialistas en la
técnica. Se comprenderá que todas estas construcciones estéricamente
similares pertenecen al alcance de la presente invención.
En una realización, la variante de CD163 se
sintetiza por síntesis automatizada. Se puede emplear cualquiera de
las técnicas en fase sólida disponibles en el mercado, tales como el
procedimiento de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que
se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena de aminoácidos
creciente. El equipamiento para la síntesis automatizada de
polipéptidos está disponible en el mercado en proveedores tales
como Applied Biosystems, Inc. de Foster City, Calif., y se puede
accionar generalmente de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. La síntesis en fase sólida permitirá la incorporación de
sustituciones de aminoácidos deseables en cualquier variante de
CD163 de acuerdo con la presente invención. Se entenderá que las
sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier subcombinación de
las mismas se pueden combinar para conseguir una secuencia final de
un equivalente funcional. Se debe entender que las inserciones
incluyen fusiones amino-terminales y/o
carboxi-terminales, por ejemplo, con una proteína
hidrófoba o inmunogénica o un vehículo tal como cualquier
polipéptido o estructura de armazón capaz de servir como un
vehículo.
Las variantes de CD163 de acuerdo con la
invención se pueden sintetizar tanto in vitro como in
vivo. Los procedimientos para la síntesis in vitro se
conocen bien. Cuando se sintetizan in vivo, una célula
huésped se transforma con vectores que contienen ADN que codifica
la variante de CD163. Un vector se define como una construcción de
ácido nucleico que se puede replicar. Los vectores se usan para
mediar en la expresión de la variante de CD163. Un vector de
expresión es una construcción de ADN que se puede replicar en la que
una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de CD163
predeterminada, o cualquier equivalente funcional de la misma que
se pueda expresar in vivo, está unida operativamente a
secuencias de control adecuadas capaces de realizar la expresión de
la variante o equivalente en un huésped adecuado. Tales secuencias
de control se conocen bien en la técnica.
Por consiguiente, un aspecto de la invención se
refiere a una secuencia de ADN que codifica una variante de CD163
como se ha definido anteriormente, la secuencia de ADN puede ser una
secuencia de ADN genómico, una secuencia de ADNc o una mezcla de
una secuencia de ADN genómico y de ADNc.
Además, la invención se refiere a un vector que
comprende la secuencia de ADN, así como a una célula que comprende
dicho vector, siendo capaz dicha célula de expresar la secuencia de
ADN, como una variante de CD163 liberada al medio de cultivo
celular o una variante de CD163 anclada a la membrana celular.
Los cultivos de células obtenidas de organismos
multicelulares representan células huésped preferidas. En
principio, es factible cualquier cultivo de células eucariotas
superiores, de cultivo de vertebrado o invertebrado. Los ejemplos
de líneas de células huésped útiles son líneas celulares de E.
coli, levadura o humanas. Las células huésped preferidas son
células eucariotas que se sabe que sintetizan CD163 endógeno. Los
cultivos de tales células huésped se pueden aislar y usar como una
fuente de la variante o se pueden usar en procedimientos
terapéuticos de tratamiento, que incluyen procedimientos
terapéuticos que tienen por objeto procedimientos de diagnóstico
realizados en el cuerpo humano o animal.
Los multímeros y dímeros, que incluyen
homodímeros y heterodímeros de variantes de CD163 de acuerdo con la
invención, también se proporcionan y pertenecen al alcance de la
invención. Se pueden producir equivalentes funcionales y fragmentos
de CD163 como homodímeros o heterodímeros con otras secuencias de
aminoácidos o con secuencias nativas de CD163. Los heterodímeros
incluyen dímeros que contienen una variante de CD163 que se une a
al menos un complejo de Hp-Hb cuando está presente
en un homodímero y un fragmento de CD163 que no necesita tener o
ejercer ninguna actividad biológica.
La afinidad de unión de la variante de CD163 de
la invención y un complejo dimérico de Hp-Hb tiene
preferiblemente un valor de kD entre 10-100 nM, tal
como entre 20-80 nM, por ejemplo, entre
40-60 nM, tal como entre 45-55
nM.
La variante de CD163 de la invención tiene
preferiblemente una kD de afinidad de unión por un complejo
multimérico de Hp-Hb de la invención entre
2-10 nM.
Un complejo dimérico de Hp-Hb
tiene preferiblemente una afinidad de unión por dos receptores CD163
en una célula en el intervalo de 0,05 a 1,0 nM.
La afinidad de unión se puede determinar como se
analiza más adelante en los Ejemplos 2 y 3.
Un aspecto de la invención se refiere a una
composición que comprende al menos un receptor CD163 purificado y/o
al menos un variante de receptor CD163 purificado como se ha
definido anteriormente.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición que comprende un complejo de Hp-Hb o una
parte del mismo o un mimético del mismo como se ha definido
anteriormente.
La composición o las composiciones son
particularmente útiles en la fabricación de un medicamento para
cualquiera de los usos analizados más adelante.
El medicamento es preferiblemente adecuado para
administración parenteral, tal como administración intravenosa,
intramuscular, subcutánea o intravenosa. Por tanto, el medicamento
puede comprender además cualquier vehículo, adyuvante y/o aditivo
adecuado usado de forma convencional para la preparación de
medicamentos, en particular, medicamentos para administración
parenteral. Otra vía de administración adecuada es por
inhalación.
La presente invención se refiere además a las
siguientes aplicaciones de complejos de Hp-Hb y/o
una variante del mismo. Uno de tales usos es la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de afecciones relacionadas con
hemólisis en un individuo que necesite tal tratamiento. Otro de
tales usos de al menos un CD163 o una variante del mismo es para la
eliminación de al menos un complejo de Hp-Hb en
suero y/o plasma de un individuo. La invención también se puede
usar para la determinación de la velocidad de hemólisis de un
individuo. Esto se puede realizar determinando el nivel de la
actividad de unión entre la variante de CD163 y los complejos de
Hp-Hb, como una indicación de la velocidad con la
que se lisan los glóbulos rojos.
En otro aspecto más, la invención se refiere a
los usos de al menos un complejo que comprende hemoglobina y
haptoglobina. Por ejemplo, el complejo se puede usar como un
marcador para una célula que expresa CD163 o una variante de CD163,
donde al menos una de las moléculas de hemoglobina o haptoglobina
está marcada. Tal célula puede ser un macrófago. Otro uso es para
el suministro de al menos un fármaco/medicamento o al menos un gen
a una célula que exprese CD163 o una variante de CD163. Los
procedimientos de suministro de fármaco y de gen se han mencionado
anteriormente.
El propósito del suministro de fármaco o de gen
es localizar el fármaco en el sitio diana. Tales sistemas de
suministro dirigidos adoptan con frecuencia la forma de inyectables
compuestos por liposomas y microesferas hechas de proteínas. Los
sistemas poliméricos comparten algunas de las ventajas de sistemas
liposómicos tales como farmacocinética y biodistribución alteradas.
Aunque los liposomas pueden tener mejores perspectivas de
biocompatibilidad y potencial de fusión con células, las
microesferas poliméricas tienen cinéticas de liberación más
controlables, mejor estabilidad en almacenamiento y mayores niveles
de carga de fármaco para algunas clases de compuestos. El sistema
de suministro se dirige por un enlace a al menos un complejo de
Hp-Hb capaz de unirse a CD163 o una variante del
mismo.
El suministro se puede realizar in vivo o
in vitro, siendo el último en particular para propósitos
experimentales.
En particular, los fármacos y genes
suministrados se pueden seleccionar de los medicamentos que se han
analizado anteriormente.
La introducción intencionada de ADN que codifica
un gen deseado, en condiciones en las que el gen se puede expresar
dentro de la célula y conduce a la producción de ARN y/o proteína,
puede ser deseable para provocar cualquiera de una amplia variedad
de respuestas biológicas útiles. El complejo de
Hp-Hb puede llevar genes heterólogos bajo el
control de promotores capaces de provocar su expresión en
vectores.
En otro aspecto de la invención, la terapia
génica comprende introducir una secuencia de ácido nucleico para
regular positivamente o regular negativamente la expresión de un gen
diana en la célula huésped, mediante una proteína codificada por la
secuencia de ácido nucleico introducida o mediante un relación
anti-sentido entre el ARN codificado por el ácido
nucleico introducido y una molécula de ácido nucleico diana
correspondiente a un producto génico endógeno.
Un ejemplo de fármaco
anti-aterosclerótico a suministrar a macrófagos por
formación de complejo con Hp-Hb y captación
posterior por HbSR/CD163:
Agonistas de receptor activado por
proliferador de peroxisoma (PPAR) específicos o no específicos
tales como ácido graso poli-insaturado (FA), Fas
modificado, Fas conjugado, Fas oxidado, eicosanoides procedentes de
FA, agentes normolipidémicos de fibrato (por ejemplo, fenofibrato),
gliazonas antidiabéticas.
Un efecto de estos fármacos puede ser estimular
la actividad de PPAR y, por lo tanto, el flujo de salida de
colesterol en células espumosas procedentes de macrófagos en
lesiones ateroscleróticas.
En otra realización más, la sustancia unida al
complejo de Hp-Hb o una parte del mismo o un
mimético del mismo también puede ser un anticuerpo dirigido a una
diana que se desea aclarar del plasma, que se consigue cuando el
anticuerpo se une a la diana y el complejo de Hp-Hb
o una parte del mismo o un mimético del mismo unido al anticuerpo
se une a un receptor CD163 sobre, por ejemplo, un macrófago seguido
de captación celular y degradación opcional de la diana. Esta
realización se puede usar, por ejemplo, para aclarar la mioglobina
de plasma después de lesiones musculares, usando un anticuerpo
dirigido a mioglobina.
En otra realización más, el mimético de complejo
de Hp-Hb unido a una sustancia puede ser una
proteína de fusión de un anticuerpo dirigido a un complejo de
Hp-Hb o receptor CD163 y un anticuerpo dirigido a
una diana que se desea aclarar del plasma como se ha analizado
anteriormente.
En una realización adicional, se administran
complejos de Hp-Hb para inhibir la captación de
complejos de Hp-Hb nativos de nuevo lo que conduce
a una hemosiderosis menos grave.
En un aspecto adicional más de la invención, la
variante de CD163 se usa en un procedimiento para la eliminación de
al menos un complejo de Hp-Hb en suero y/o plasma de
un individuo. Ya que los presentes inventores han establecido ahora
que CD163 y las variantes de CD163 como la proteína de captura
regulada por fase aguda para complejos de Hp-Hb, la
variante de CD163 se puede aplicar a un individuo que necesite
aclaramiento de hemoglobina de plasma.
Esto se puede conseguir mediante terapia génica,
por administración de genes que codifican CD163 o una variante del
mismo, para producir células capaces de ayudar a los macrófagos en
el caso de aclaramiento de hemoglobina de plasma.
En otra realización de la invención, la variante
de CD163 se usa en un procedimiento de diagnóstico. Uno de tales
procedimientos de diagnóstico es para marcar una célula que expresa
una variante de CD163, donde al menos una de las moléculas de
hemoglobina o haptoglobina o partes de la misma están marcadas. Es
posible identificar variantes de CD163 in vitro así como
in vivo poniendo en contacto al menos un complejo de
Hp-Hb con un entorno que comprende variantes de
CD163. Las moléculas individuales de hemoglobina o haptoglobina se
pueden marcar con un marcador como se ha analizado anteriormente.
En un aspecto de la invención, la variante de CD163 se usa en un
procedimiento de diagnóstico para identificar monocitos y/o
macrófagos en un individuo o in vitro.
Además, el complejo de Hp-Hb
unido a un marcador se puede usar para la identificación de
monocitos, tales como macrófagos, en tejidos, tales como secciones
de tejidos, por ejemplo, mediante exámenes microscópicos.
En otra realización, el complejo de
Hp-Hb unido a un marcador se puede usar para la
detección de CD163, CD163 unido a membrana y/o CD163 soluble. En
particular, el complejo de Hp-Hb unido a un marcador
se puede usar para la detección de CD163 soluble en una muestra,
tal como una muestra de sangre. Esto también podría ser la
detección usando un complejo marcado de Hp-Hb. El
marcador podría ser un cromóforo, un fluorocromo, un isótopo
radiactivo, biotina o una enzima.
La invención también se refiere a las siguientes
aplicaciones de detección de CD163 soluble. Se puede detectar CD163
mediante cualquiera de los procedimientos que se han descrito
anteriormente en relación a complejo de Hp-Hb.
Además, se puede detectar CD163 mediante cualquier otro
procedimiento conocido por el especialista en la técnica, tal como
mediante el uso de anticuerpos, monoclonales y/o policlonales,
dirigidos a CD163. Esto también podría ser detección usando
anticuerpos marcados. El marcador podría ser un cromóforo, un
fluorocromo, un isótopo radiactivo, biotina o una enzima.
Además, se puede detectar CD163 usando
hemoglobina (Hb) marcada y/o haptoglobina, marcada como se ha
analizado anteriormente para anticuerpos.
La detección de CD163 soluble se puede usar como
herramientas en el diagnóstico, supervisión y control de
pacientes.
Por ejemplo, un uso de CD163 soluble es como un
marcador de diagnóstico en el diagnóstico, la supervisión y el
control de pacientes con hemólisis y/u otras afecciones
hematológicas (por ejemplo, anemia aplásica, anemia por deficiencia
de hierro, anemia megaloblástica, anemia de células falciformes,
policitemia, malaria, leucemia, mielodisplasia, linfoma,
leucopenia, esplenectomía).
Otro uso de CD163 es como un marcador de fase
aguda, debido a que el CD163 soluble está regulado positivamente
durante la respuesta de fase aguda. Por tanto, se puede usar CD163
soluble en el diagnóstico, supervisión y control de pacientes con
inflamación (infección, cáncer, autoinmunidad) así como en el
diagnóstico, supervisión y control de pacientes con
inmunodeficiencia.
Otro uso más es en la supervisión y el control
de pacientes tratados con glucocorticoides y/o citostáticos y/u
otras medicaciones.
La concentración de CD163 soluble se puede
determinar usando cualquier procedimiento adecuado. Es
particularmente adecuada una de las siguientes técnicas:
Un ensayo podría ser un ELISA de tipo sándwich
y/o ELISA competitivo usando un sistema de detección, que podría
ser un sistema de anticuerpo marcado con peroxidasa/OPD, otras
enzimas diferentes de la peroxidasa, quimioluminiscencia,
fluorescencia, sistemas de biotina-avidina.
Otro ensayo podría ser ensayos nefelométricos o
turbidimétricos, radio- inmuno-ensayos (RIA),
purificación de CD163, por ejemplo, mediante cromatografía o
electroforesis y detección, por ejemplo, mediante fotometría,
cromatografía combinada con espectrofotometría de masas.
La concentración de CD163 se podría determinar
en suero y plasma, que se podría estabilizar con EDTA, citrato o
heparina, así como en sangre, orina, líquido cefalorraquídeo y otros
fluidos corporales de origen humano y/o animal. Además, los ensayos
se pueden usar para medir la concentración de CD163 en medio
artificial, por ejemplo, medio de cultivo celular.
La Hp humana (1-1,
2-2 y fenotipos mixtos) y Hb humana (formas A_{0},
A_{2} y S) eran de Sigma. Se preparó una columna de cinco ml de
Hp-Hb Sepharose CL-4B
(Pharmacia-Amersham) acoplando complejos de Hp (5
mg, fenotipos mixtos) y Hb (4 mg, tipo A_{0}). La columna se
cargó con 100 ml de Triton X-100 \sim1% de
membranas solubilizadas (de bazo, placenta e hígado humano),
preparadas como se ha descrito previamente (Moestrup, S. K.,
Kaltoft, K., Sottrup-Jensen, L. & Gliemann, J.
The human \alpha2-macroglobulin receptor contains
high affinity calcium binding sites important for receptor
conformation and ligand recognition. J. Biol. Chem. 265,
12623-12628 (1990). La proteína purificada de 130
kDa que se une a Hp-Hb se eluyó en NaH_{2}PO_{4}
10 mM (pH 6), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM y CHAPS al 0,5% (Aldrich). La
proteína separada por gel de SDS se procesó para digestión tríptica
y espectrometría de masas MALDI por Protana (Odense, Dinamarca). La
diferencia en masas calculadas y medidas fue para todos los
péptidos inferior a 0,042 kDa. Se usaron los anticuerpos
monoclonales de CD163 murinos EDHu-1 (Serotec) y
GHI/61 (Research Diagnostics) para la transferencia de Western. Se
generó un anticuerpo de CD163 policlonal por inmunización de un
conejo con receptor purificado por afinidad de ligando.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el análisis de resonancia de plasmón
superficial como se describe por Moestrup, S. K. y col. El complejo
de \beta2-glucoproteína-1
(apolipoproteína H) y
\beta2-glucoproteína-1-fosfolípido
alberga un sitio de reconocimiento para el receptor endocítico
megalina. J. Clin. Invest 102, 902-909 (1998). Se
inmovilizó CD163 purificado en el chip detector de BIAcore CM5
(BIAcore AB) a una concentración de hasta 50 \mug/ml en acetato
sódico 10 mM, pH 4,0 y los sitios de unión remanentes se bloquearon
con etanolamina 1 M pH 8,5. La señal de resonancia de plasmón
superficial generada de CD163 inmovilizado se correspondió a
55-66 fmol de receptor/mm^{2}. La muestra y el
flujo de tampón fue Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 0,5 mM, pH
7,4. Los chips detectores se regeneraron con
glicina-HCl 1,6 M, pH 3. El ensayo de unión para
medir la unión de ^{125}I-Hp-Hb a
CD163 humano inmovilizado en pocillos de placa de microtitulación
(Nunc) se realizó como ha descrito Birn, H. y col. Characterization
of an epithelial approximately 460-kDa protein that
facilitates endocytosis of intrinsic factor-vitamin
B12 and binds receptor-associated protein. J. Biol.
Chem. 272, 26497-26504 (1997).
Las placas de microtitulación se revistieron a
4ºC durante 20 h con CD163 purificado en NaHCO_{3} 50 mM que
contenía 250 ng de CD163 por pocillo (para unir
^{125}I-Hp(1-1)-Hb)
o 125 ng de CD163 por pocillo (para unir
^{125}I-Hp(2-2)-Hb).
La yodación de Hp-Hb se realizó con el procedimiento
de cloramina-T. Se realizó la transferencia de
ligando como se ha descrito usando 10^{6} cpm de radioligando/ml
(Moestrup, S. K. & Gliemann, J. Analysis of ligand recognition
by the purified \alpha2-macroglobulin receptor
(low density lipoprotein receptor-related protein).
Evidence that high affinity of
\alpha2-macroglobulin-proteinase
complex is achieved by binding to adjacent receptors. J. Biol. Chem.
266, 14011-14017 (1991).\alpha.
La Hp se sintetiza como una cadena única, que se
escinde después de la traducción en una cadena \alpha
amino-terminal y una cadena \beta
carboxi-terminal. La estructura básica de Hp, como
se encuentra en la mayoría de los mamíferos, es un homodímero (Fig.
2a), en el que las dos moléculas de Hp están unidas por un único
enlace disulfuro por sus respectivas cadenas \alpha de -9
kDa^{14}. En el ser humano, también está presente en todas las
poblaciones una variante con una cadena \alpha larga. Esta
variante surge aparentemente por una duplicación intragénica
temprana, que se origina probablemente por un entrecruzamiento
desigual de dos alelos básicos, dando como resultado una Hp con una
cadena \alpha de -14 kDa. Las cadenas \alpha corta y larga se
denominan \alpha1 y \alpha2, respectivamente. Ya que la cisteína
que forma el enlace disulfuro intermolecular entre las cadenas
\alpha también está duplicado, los seres humanos que llevan el
alelo de variante larga muestran un fenotipo de Hp multimérico
(Fig. 2a).
El análisis de la unión de los complejos de
Hp-Hb (Fig. 2a) a CD163 inmovilizado mostró una
unión de alta afinidad de complejos de Hp-Hb tanto
diméricos como multiméricos (Fig. 2b y c). La Figura 2b muestra un
análisis de resonancia de plasmón superficial de la unión a CD163
del complejo dimérico de Hp(1-1) y el
complejo multimérico de
Hp(2-2)-Hb. No se detectó
unión de Hb que no forma complejos (Fig. 2b, panel izquierdo) ni
Hp(1-1) o Hp(2-2)
(Fig. 2b, paneles centrales y derecho) indicando por tanto que se
expresa un neoepítope para la unión al receptor en el complejo de
Hp-Hb. Por consiguiente, se midió la unión máxima de
receptor cuando la capacidad de unión a Hb de Hp alcanzó la
saturación (Fig. 2b, paneles centrales y derecho) a concentraciones
equimolares de Hb y Hp. El complejo de
Hp(2-2)-Hb produjo una mayor
respuesta y la disociación fue más lenta en comparación con el
complejo de Hp(1-1)-Hb. Los
resultados mostrados se obtuvieron usando la forma A_{0}
(\alpha_{2}\beta_{2}) de Hb. Se obtuvieron resultados
similares usando la
forma A_{2} (\alpha_{2}\delta_{2}) o la forma S (Hb con la mutación para la enfermedad de células falciformes) ^{15} (datos no mostrados).
forma A_{2} (\alpha_{2}\delta_{2}) o la forma S (Hb con la mutación para la enfermedad de células falciformes) ^{15} (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un ensayo en fase sólida con CD163
inmovilizado en pocillos de microtitulación para diversos
experimentos de inhibición (Fig. 6c). Este análisis puso de
manifiesto que la eliminación de Ca^{2}+ con EDTA o la adición de
IgG anti-CD163 policlonal anuló completamente la
unión de Hp-Hb a CD163. La medición de la afinidad
verdadera de una interacción de un sitio de la unión de
Hp-Hb a CD163 se impidió por la divalencia
(Hp(1 -1)) y multivalencia (Hp(2-2))
sugerida del ligando en términos de sitios de reconocimiento de
receptor. Sin embargo, la competición por la unión a CD163 de
Hp-Hb marcado con ^{125}I por complejos no
marcados de Hp(1-1)-Hb y
Hp(2-2)-Hb mostró, como
forma anticipada de los experimentos de resonancia de plasmón
superficial, una afinidad funcional (avidez) \sim10 veces
superior de los complejos multiméricos de
Hp(2-2)-Hb (Fig. 6c). La
concentración del complejo no marcado de
Hp(1-1)-Hb que provoca el 50%
de la inhibición de la unión de
Hp(1-1)-Hb marcado con
^{125}I fue -0,3 \mug/ml, dando una "K_{d} aparente" de
\sim 2 nM del complejo dimérico de
Hp(1-1)-Hb. Por el contrario,
el 50% de punto de inhibición para
Hp(2-2)-Hb fue en -0,1
\mug/ml dando una "K_{d} aparente" de \sim 0,2 nM (con
la suposición de la distribución de multímero 2-2
calculada previamente y Wejman, J. C, Hovsepian, D., Wall, J. S.,
Hainfeld, J. F. & Greer, J. Structure and assembly of
haptoglobin polymers by electron microscopy. J. Mol. Biol. 174,
343-368 (1984). La mayor afinidad funcional del
complejo de tipo 2-2 se debe probablemente a su
mayor valencia. Se conoce bien un efecto de bonificación similar de
la multivalencia en otros sistemas biológicos, por ejemplo, la
unión de la molécula de IgM pentamérica a varios antígenos de
superficie idénticos.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc que codifica la variante más abundante
de CD163 (Nº de acceso de Genbank/EMBL Z22968) Law, S. K. y col. A
new macrophage differentiation antigen which is a member of the
scavenger receptor superfamily. Eur. J. Immunol. 23,
2320-2325 (1993) se ligó en los sitios KpnI y NotI
del vector de expresión de mamífero pcDNA3.1/Zeo(+) (Invitrogen).
Se establecieron clones de CHO transfectados de manera estable que
expresaban CD163 por dilución limitada y selección con 500
\mug/ml de Zeocina (Invitrogen). Se analizaron los productos de
expresión por inmunotransferencia de medio de cultivo y lisado
celular usando el anticuerpo policlonal de conejo frente al CD163
humano purificado por afinidad de ligando.
La endocitosis de
^{125}I-Hp-Hb en células CHO
transfectadas con CD163 y transfectadas de manera simulada que se
desarrollaban como monocapas adherentes confluentes en placas de 24
pocillos se analizó como se ha descrito previamente Moestrup, S. K.
& Gliemann, J. Analysis of ligand recognition by the purified
\alpha2 macroglobulin receptor (low density lipoprotein
receptor-related protein). Evidence that high
affinity of
\alpha2-macroglobulin-proteinase
complex is achieved by binding to adjacent receptors. J. Biol. Chem.
266, 14011-14017 (1991).Se analizó la endocitosis
en células de linfoma histiocítico
SU-DHL-1 soluble (2 x 10^{6}
células/ml) como se ha descrito Moestrup, S. K., Christensen, E. I.,
Sottrup-Jensen, L. & Gliemann, J. Binding and
receptor-mediated endocytosis of pregnancy zone
protein-proteinase complex in rat macrophages.
Biochim. Biophys. Acta 930, 297-303 (1987).
Se estudió la endocitosis mediada por CD163 de
complejos de ^{125}I-Hp-Hb en
células de Ovario de Hámster Chino (CHO) transfectadas con ADNc de
CD163 (la forma CD163 abundante, Nº de Acceso de Genbank/EMBL
Z22968). La Figura 7a (panel central) muestra el desarrollo en el
tiempo de radiactividad asociada a células y radiactividad soluble
de ácido tricloroacético (TCA) (que representa ligando degradado) en
el medio. La radiactividad asociada a células alcanzó una meseta
después de una hora de incubación y, aproximadamente este momento,
la radiactividad soluble de TCA aumentó significativamente en el
medio. De manera coherente con una captación endocítica de
Hp-Hb, un experimento similar realizado en presencia
de los inhibidores lisosómicos, cloroquina y leupeptina, mostró un
aumento continuo en la radiactividad unida a células durante 3 horas
sin esencialmente radiactividad soluble de TCA detectada (Fig. 7a,
panel derecho).
La endocitosis de complejos de
Hp-Hb estaba mediada por CD163, ya que no se detectó
captación, y, por consiguiente, ninguna radiactividad soluble de
TCA, en incubaciones con células CHO que no expresaban el antígeno
de CD163 (Fig. 7a, panel izquierdo). Además, la captación y
degradación de Hp(2-2)-Hb
marcado con ^{125}I se puede inhibir mediante IgG purificada de
suero anti-CD163 y por complejos no marcados de
Hp(2-2)-Hb (Fig. 7b, panel
izquierdo). Se obtuvieron resultados similares (Figura 7b, panel
derecho) con la línea celular
SU-DHL-1
mielo-monocítica (Epstein, A. L. y col. Biology of
the human malignant lymphomas. IV. Functional characterization of
ten diffuse histiocytic lymphoma cell lines. Cancer 42,
2379-2391 (1978), the only cell line Pulford, K.,
Micklem, K., Law, S. K. & Mason, D. Y. en Leukocyte Typing VI.
(eds. Kishimoto, T. y col.) 1089-1091 (Garland
Publishing Inc, New York, 1997) que se sabe que expresa el antígeno
de CD163 y con complejos marcados con ^{125}I de
Hp(1-1)-Hb aunque se observó
una menor velocidad de captación en comparación con los complejos
marcados con ^{125}I de
Hp(2-2)-Hb (datos no
mostrados). La línea celular de SU-DHL expresa,
además de la variante más abundante de CD163, también dos variantes
menos abundantes Law, S. K. y col. A new macrophage differentiation
antigen which is a member of the scavenger receptor superfamily.
Eur. J. Immunol. 23, 2320-2325 (1993) con
diferentes colas citoplasmáticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha detectado CD163 soluble en plasma en
sujetos humanos normales por ELISA y transferencia de Western. La
transferencia de Western muestra una proteína de movilidad
electroforética idéntica que HbSR/CD163 de longitud completa
indicando que la proteína en plasma representa la proteína de
longitud completa o solamente una proteína ligeramente truncada.
Debido a que la proteína es soluble en el plasma, se denomina CD163
soluble (sHbSR).
Se ha desarrollado el siguiente ensayo de tipo
ELISA sándwich para medir la concentración de sHbSR:
- -
- Anticuerpo policlonal (antiCD163 de conejo, producido por DAKO para S. K. Moestrup) se aplica como revestimiento sobre pocillos de microtitulación (concentración en tampón 4 mg/l). Las placas se mantienen a 4ºC hasta el uso. Los pocillos se lavan 3 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y posteriormente se añaden a los pocillos 100 microlitros (\mul) de cada muestra (por ejemplo, plasma o suero, diluido 50 veces en PBS con albúmina). Las muestras se incuban durante 1 hora a 22ºC con agitación.
- -
- Los pocillos se lavan de nuevo 3 veces en PBS, y a cada pocillo se añaden 100 \mul de antiCD163 monoclonal (GHI/6, producido por PharMingen, diluido 500 veces en PBS con albúmina). El anticuerpo se incuba durante 1 hora a 22ºC con agitación.
- -
- Los pocillos se lavan de nuevo 3 veces en PBS y se añaden a cada pocillo 100 \mul de anticuerpo policlonal marcado con peroxidasa (anticonejo de cabra (P447) producido por DAKO, diluido 8000 veces en PBS con albúmina). El anticuerpo se incuba durante 1 hora a 22ºC con agitación.
- -
- Los pocillos se lavan de nuevo 3 veces en PBS y se añaden 100 \mul de una solución de sustrato (OPD, orto-fenildiamina, con H_{2}O_{2} añadido) a cada pocillo y el desarrollo de color posteriormente se detiene después de 15-30 min por adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} 1 M.
- -
- La intensidad del color es proporcional a la concentración de sHbSR en la muestra y se mide en un lector de microplaca a una longitud de onda de 495 nm (usando 620 nm como una referencia). Se analizan patrones con concentraciones conocidas de sHbSR del mismo modo en la misma placa y se puede producir una curva patrón. Por lo tanto, la intensidad de color de la muestra se puede transformar en concentración por comparación con la curva patrón (Fig. 8).
\vskip1.000000\baselineskip
Precisión de ensayo: Coeficiente de variación =
2-4% en el intervalo de medición (intraserie) Límite
de detección (la concentración medible mínima): aproximadamente 0,2
\mug/l Desviación: no se ha observado ningún efecto de matriz en
las muestras plasmáticas de diferente dilución Especificidad: en
transferencias de Western (de suero después de purificación por
afinidad con anti-CD163 policlonal y transferencia
posterior con antiCD163 monoclonal) se observa una única banda, con
un tamaño molecular que se corresponde a HbSR soluble. Para la
transferencia de Western, sHbSR en 100 \mul de plasma se capturan
inicialmente por un anticuerpo anti-HbSR/CD163
humano unido a Sepharose. Las perlas se lavan y se someten a
electroforesis en gel de SDS no reductor tradicional y
transferencia de Western con un anticuerpo
anti-HbSR/CD163 humano monoclonal. El reactivo de
captura y el reactivo de detección se pueden modificar como en el
ensayo ELISA que se ha descrito anteriormente.
La concentración media de sHbSR en plasma de 31
donantes de sangre fue 265 \mug/l. La concentración en 31
muestras de suero emparejadas no era diferente 264 \mug/l),
indicando que ambos tipos de muestra se pueden usar en el ensayo.
En experimentos preliminares, las muestras ensayadas de forma
aleatoria de pacientes de un departamento hematológico han mostrado
valores que varían de los valores normales observados en donantes
de sangre a valores 5-10 veces superiores.
La captación se ensayó en células CHO
transfectadas que expresaban recombinantemente HbSR wt (Kristiansen,
M., Graversen, J. H., Jacobsen, C., Sonne, O., Hoffman, H., Law, A.
S. K. y K., M. S. K. (2001) Identification of the hemoglobin
scavenger receptor, Nature 409, 198-201), células
CHO que expresaban el receptor humano cubilina (Kristiansen, M.,
Kozyraki R., Jacobsen, C., Nexo, E., Verroust, P. J. y Moestrup, S.
K. (1999) Molecular dissection of the intrinsec
factor-vitamin B12 receptor, cubilin, discloses
regions important for membrane association and ligand binding, J.
Biol. Chem. 274, 20540-20544) se usó como el
control. Las células se cultivaron en portaobjetos con cámara (Lab
Tek permanox slide Nalge Nunc International) a 37ºC y CO_{2} al 5%
durante 20 horas. Cada pocillo se incubó durante 1 hora a 37ºC y
CO_{2} al 5% con 300 \mul de medio de CHO
(hyQ-CCM5, HyClone (Utah, EEUU)) se añadió
Hp(2-2)-Hb marcado con Alexa
Flour 488 (marcado usando el Kit de Marcado con Proteína Alexa
Flour 488 (Molecular Probes, Oregon)) hasta una concentración final
de 0,1 \muM. Los pocillos se lavaron dos veces con PBS pH 7,4 y
se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con tampón Ellis
(PBS pH 7,4 y formaldehído al 4%). Se lavan tres veces con PBS pH
7,4, Triton X-100 al 0,05% y se incuban durante 1
hora a temperatura ambiente con PBS pH 7,4, Tritón
X-100 al 0,05% se añade anticuerpo policlonal
procedente de conejo que reconoce HbSR o cubilina (células de
control), con una concentración final de anticuerpo de 10
\mug/ml. Los pocillos se lavan tres veces en PBS pH 7,4, Triton
X-100 al 0,05% y se incuban durante 1 hora a
temperatura ambiente con PBS pH 7,4, Triton X-100 al
0,05%, se añade IgG de cabra anti-conejo marcado
con Alexa Flour 594 (Molecular Probes, Oregon) a una concentración
de 5 \mug/ml. Finalmente, los pocillos se lavaron tres veces con
PBS pH 7,4, Triton X-100 al 0,05% y se cubrieron con
una placa de cubrición y se estudió la fluorescencia en el
microscopio confocal, véase la figura 9.
Como se puede observar, ambos receptores
reaccionan positivamente con su anticuerpo respectivo; color rojo.
Solamente las células que expresan HbSR también captan
Hp-Hb marcado con Alexa Flour 488; color verde,
mientras que las células simuladas, que expresan cubilina, no
captan Hp-Hb. El patrón de coloración distinto de
Alexa Flour 488 en células CHO que expresan HbSR indica que el
complejo se degrada en los lisosomas de la célula. Este resultado
muestra que se puede acoplar un resto heterogéneo a
Hp-Hb y captar selectivamente por células que
expresan HbSR, que, in vivo, de forma nativa serán
macrófagos.
Un derivado de HbSR soluble recombinante que
consistía en el dominio extracelular (SRCR 1-9) sin
segmento transmembrana y cola citoplasmática se expresó en células
de Ovario de Hámster Chino (CHO) transfectadas de forma estable con
un fragmento de ADNc de HbSR que codifica los aminoácidos
1-1045 de HbSR humano. El plásmido de ADNc se
generó por el siguiente procedimiento: inicialmente, un fragmento de
ADNc correspondiente a las bases 3045 a 3135 con la adición de un
codón de terminación y un sitio Not I se creó por PCR usando los
cebadores: 5' caa gga aga cgc tgc agt gaa ttg c3' y 5' tca gcg gcc
gcc tag gat gac tga cgg gat gag cg3' con ADNc de HbSR de longitud
completa (Kristiansen, M., Graversen, J. H., Jacobsen, C., Sonne,
O., Hoffman, H., Law, A. S. K. y K., M. S. K. (2001) Identification
of the hemoglobin scavenger receptor, Nature 409,
198-201) como molde. El fragmento de ADN generado
por PCR se ligó en el sitio Pst I internos (posición
3056-3061) y el sitio de clonación Not del plásmido
pcDNA(+) de HbSR de longitud completa que se ha descrito previamente
(Kristiansen, M., Graversen, J. H., Jacobsen, C., Sonne, O.,
Hoffman, H., Law, A. S. K. y K., M. S. K. (2001) Identification of
the hemoglobin scavenger receptor, Nature 409,
198-201). Este procedimiento sustituyó las bases
3136 a 3351, que codifican la región transmembrana y la cola
citoplasmática de HbSR, con un codón de terminación. El producto de
expresión de las células CHO transfectadas se secretó como se
esperaba al medio como una proteína soluble. Se purificaron
cantidades menores del medio por cromatografía de afinidad de
haptoglobina-hemoglobina como se ha descrito
previamente (Kristiansen, M., Graversen, J. H., Jacobsen, C., Sonne,
O., Hoffman, H., Law, A. S. K. y K., M. S. K. (2001) Identification
of the hemoglobin scavenger receptor, Nature 409,
198-201).
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc que codifica el dominio
1-6 SRCR y el dominio 5-9 SRCR
extendido con sitios de restricción Hind III y Xho I se
amplificaron por reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) usando
ADNc de HbSR de longitud completa (Kristiansen, M., Graversen, J.
H., Jacobsen, C., Sonne, O., Hoffman, H., Law, A. S. K. y K., M. S.
K. (2001) Identification of the hemoglobin scavenger receptor,
Nature 409, 198-201) como molde. Los productos de
PCR se subclonaron en el vector de expresión pSecTag2B (Invitrogen,
Groningen, Países Bajos) mediante el uso de los sitios de
restricción HindIII y XhoI. Los plásmidos se introdujeron por
transformación en células de E. coli DH5\alpha (Clontech,
Palo Alto, CA, EE.UU.) y el ADN plasmídico se aisló y se secuenció
antes de la transfección. Se usaron los siguientes cebadores para
la construcción de los fragmentos: dominio 1-6 SRCR:
directo
5'-caagcttggaacagacaaggagctg-3' e
inverso
5'-cctcgagtcctgagcagattacagag-3'.
Dominio 5-9 SRCR: directo
5'-caagcttcacagggaacccagactg-3' e
inverso
5'-cctcgagatctgtgcaattcactgc-3'.
Las células CHO-K1 se
transfectaron con plásmidos y los productos de expresión se
detectaron por transferencia de Western usando un anticuerpo
policlonal de conejo contra HbSR humano, como se ha descrito
(Kristiansen, M., Graversen, J. H., Jacobsen, C., Sonne, O.,
Hoffman, H., Law, A. S. K. y K., M. S. K. (2001) Identification of
the hemoglobin scavenger receptor, Nature 409,
198-201). El SRCR 1-6 de HbSR
recombinante se purificó por cromatografía de afinidad de
Hp-Hb como se ha descrito para HbSR recombinante de
longitud completa, mientras que el dominio 5-9 SRCR
de HbSR no consiguió unirse a
Hp-Hb-Sepharose. La unión de
Hp-Hb al derivado de HbSR correspondiente al
dominio 1-6 SRCR inmovilizado en un chip BIACore CM5
se confirmó por análisis de unión BIACore (Biacore International
AB, Uppsala, Suecia) como se ha descrito (Kristiansen, M.,
Graversen, J. H., Jacobsen, C., Sonne, O., Hoffman, H., Law, A. S.
K. y K., M. S. K. (2001) Identification of the hemoglobin scavenger
receptor, Nature 409, 198-201). Para el sensograma
mostrado en la figura 10, la densidad de HbSR y el dominio
1-6 SRCR de HbSR acoplado en el chip fue 0,0659 y
0,0370 pmol/mm^{2}, respectivamente, la concentración de
Hp(1-1)-Hb usada fue 280 nM o
0,04 mn/ml y el tampón usado fue CaHBS de BIACore.
\vskip1.000000\baselineskip
En el procedimiento para purificar HbSR, un
producto autoproteolítico de HbSR se co-purificó en
Hp-Hb-sepharose. La secuenciación
N-terminal del fragmento puso de manifiesto la
siguiente secuencia de la forma principal: DGVTE, correspondiente a
los restos aminoacídicos 265-269 de HbSR. Estimado
por la movilidad en análisis de SDS-PAGE, el
fragmento se corresponde a los restos aminoacídicos de HbSR
265-1116, por tanto, todos los de HbSR excepto el
dominio 1 y 2 de SRCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos de HbSR que contienen dominios
1-6 y 3-9 SRCR se unieron a
Hp-Hb, mientras que un fragmento que contenía el
dominio 5-9 de HbSR no consiguió unirse a
Hp-Hb. Por lo tanto, los dominios 3 y 4 SRCR son
necesarios para la unión de HbSR a Hp-Hb.
Dos bibliotecas de anticuerpo Fab expresados en
fago para aislar anticuerpos Fab para análisis de
estructura-función en la interacción de complejo de
Hp-Hb-CD163.
Proteínas y agentes químicos- Se purificó
CD163 humano como se ha descrito (Kristiansen, M., Graversen, J.
H., Jacobsen, C., Sonne, O., Hoffman, H., Law, S. K. y Moestrup, S.
K. (2001) Nature 409(6817), 198-201). Hb y
Hp (fenotipos mixtos, formas 1:1 o 2:2) adquiridas en Sigma, se
mezclaron en hielo en cantidades molares iguales para permitir la
formación del complejo y se dializaron frente tampón que contenía
HEPES a pH 7,4 antes del uso. Se adquirieron anticuerpos
anti-Hb y anti-Hp en Sigma. Se
adquirió un anticuerpo acoplado a
anti-M13-peroxidasa y
desoxi-nucleótidos mixtos en
Amersham-Pharmacia Biotech. Se adquirieron enzimas
modificadoras del ADN en Invitrogen y New England Biolabs. Se
obtuvieron oligonucleótidos de DNAtechnology, la Taq polimerasa era
de Promega. Las proteínas se marcaron usando el procedimiento de
cloramina-T. Todos los demás reactivos y agentes
químicos eran de calidad de reactivo (Sigma y Merck).
Construcción de bibliotecas de Fab
presentados en fagos- Se construyeron bibliotecas de
presentación en fago usando el sistema pCOMB3X
(Andris-Widhopf, J., Rader, C., Steinberger, P.,
Fuller, R. y Barbas, C. F., 3rd. (2000) J Immunol Methods
242(1-2), 159-81). El
fagémido pCOMB3X se suministró por cortesía del Dr. C. F. Barbas
(the Scripps Research Institute en La Jolla, EE.UU). Dos ratones
Balb/C se inmunizaron tres veces con 10 \mug de complejos de
Hp-Hb purificados diluidos en adyuvante incompleto
de Freund durante un periodo de 6 semanas. Posteriormente, los
ratones se sacrificaron y se aislaron los bazos. Usando un filtro,
se obtuvieron suspensiones de una sola célula que se suspendieron
en reactivo Trizol (Invitrogen, Países Bajos) y se aisló el ARN
siguiendo las instrucciones del proveedor. Usando aproximadamente
10 \mug de ARN total, se realizó la síntesis de la primera cadena
usando el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript II
(Invitrogen, Países Bajos) y cebadores de extremo 3' específicos
para el primer dominio constante de ratón de la cadena pesada o para
el dominio constante de cadena ligera kappa de ratón (Kang, A. S.,
Burton, D. R. y Lerner, R. A. (1991) Methods: A Companion to
Methods in Exymology 2(2), 111-118) siguiendo
exactamente el procedimiento del proveedor. En un conjunto extenso
de reacciones en cadena de la polimerasa usando cebadores bien
descritos (Kang, A. S., Burton, D. R. y Lerner, R. A. (1991)
Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2(2),
111-118), se amplificaron ADNc específicos que
codificaban los dominios variable y el primero constante de las
cadenas pesadas de IgG1 e IgG2a y las cadenas ligeras kappa
completas de IgG1 e IgG2a. Se clasificaron las condiciones óptimas
de temperatura usando un Robociclador de Stratagen. Los productos
amplificados se purificaron, digirieron y ligaron posteriormente en
los sitios de restricción de pCOMB3X escindido como se describe en
(Kang, A. S., Burton, D. R. y Lerner, R. A. (1991) Methods: A
Companion to Methods in Enzymology2(2),
111-118). Se transformaron células
electrocompetentes de Escherichia coli
XL1-Blue (Stratagene) usando un electroporador
Eppendorf y se determinaron la eficacia de ligación y el tamaño de
la biblioteca. Después de la infección con fago auxiliar VCS M13
(Stratagene) se obtuvieron en bibliotecas de anticuerpo de fago que
consistían como promedio en 5x10^{5} colonias individuales.
Selecciones de fago de anticuerpo
anti-Hb-Hp y
anti-CD163- Se realizaron las selecciones de
fago en placas de 96 pocillos (NUNC, Dinamarca) revestidas con 1
\mug de complejos de Hp-Hb purificados o CD163 y
se bloquearon con BSA. Se realizaron las selecciones esencialmente
como se ha descrito (Horn, I. R., Moestrup, S. K., van den Berg, B.
M., Pannekoek, H., Nielsen, M. S. y van Zonneveld, A. J. (1995) J
Biol Chem 270(20), 11770-5). Durante la
bioselección, los fagos se eluyeron usando ácido clorhídrico 50 mM
ajustado con glicina, pH 2,1. Se repitieron rondas de selección
otras 3 veces y se calculó la proporción de entrada/salida después
de la titulación de fago. Esas proporciones indican los valores de
enriquecimiento de fago durante el procedimiento. En la Figura 11
se muestran las proporciones de entrada/salida por ronda de
selección así como los resultados de un ELISA de fago. Como se
puede observar en la figura, en ambas selecciones tuvo lugar un
fuerte enriquecimiento en de fago de Fab de unión, ascendiendo a
aproximadamente 100 veces para la selección de complejo de
Hp-Hb y a 1000 veces para la selección de
anti-CD163. Después del ensayo de clones
seleccionados aleatoriamente de cuatro rondas de selecciones
consecutivas, se encontraron clones de unión en la tercera ronda de
selección para ambos antígenos. Los resultados de dos ensayos ELISA
se muestran en la Figura 11, paneles B y D. En total,
se exploraron cien clones de la segunda y tercera ronda de
selección. Los clones positivos no se enriquecieron adicionalmente
en la cuarta ronda de selección. Para investigar si los clones
seleccionados eran diferentes, se realizó identificación genética
con PCR con diferentes enzimas de restricción en todos los clones
positivos. El experimento mostró que en ambas selecciones, se aisló
un tipo de anticuerpo de Fab (datos de identificación genética no
mostrados). Se seleccionó el Fab1 de las selecciones de complejo de
Hp-Hb y Fab18 de la selección de CD163.
Exploración del complejo
anti-Hp-Hb seleccionado y
repertorios anti-CD163- Para identificar el fago
de anticuerpo Fab de unión a complejo de Hp-Hb y
CD163, se realizó un ELISA en el que los complejos de
Hp-Hb o CD163 se aplicaron como revestimiento y se
incubaron aproximadamente 10^{10} fagos expresados por colonias
individuales. Los fagos unidos se detectaron posteriormente usando
un conjugado de fago anti-M13. El procedimiento se
realizó como se ha descrito (Horn, I. R., Moestrup, S. K., van den
Berg, B. M., Pannekoek, H., Nielsen, M. S. y van Zonneveld, A. J.
(1995) J Biol Chem 270(20), 11770-5)). El
número de Fab únicos se determinó por identificación genética de
PCR con dos enzimas de restricción de corte fino diferentes (Marks,
J. D., Hoogenboom, H. R., Bonnet, T. P., McCafferty, J., Griffiths,
A. D. y Winter, G. (1991) J Mol Biol 222(3),
581-97). Los resultados de la unión del fago de
Fab1 a estos antígenos se muestran en la Figura 2A. Como se puede
concluir de la figura, el fago de Fab1 reacciona intensamente con
el complejo de Hp-Hb, mientras que se mide la baja
unión a Hb y Hp. La unión de fago de Fab2 no se pudo detectar con
ninguno de los antígenos, indicando que el propio fago no
interacciona específicamente con ninguno de los antígenos (no
mostrado). Las diferencias observadas no se pueden explicar por
diferentes eficacias de revestimiento, ya que en un experimento de
control, sueros policlonales contra los diferentes antígenos
reaccionan con las proteínas que no forman complejos y con las que
forman complejos en el mismo alcance (datos no mostrados).
Preparación de Fab solubles y análisis de
SPR- El vector pCOMB3X permite la expresión de Fab soluble
cambiando cepas bacterianas debido a la presencia de un codón ámbar
entre el primer dominio constante de cadena pesada y la secuencia
que codifica el producto del gen III de M13 (13.
Andris-Widhopf, J., Rader, C., Steinberg, P.,
Fuller, R. y Barbas, C. F., 3rd. (2000) J Immunol Methods
242(1-2), 159-81). Se usó la
cepa de E. coli no supresora HB2151, que se suministró por
cortesía del dr. P. Kristensen (departamento de Biología Molecular,
Universidad de Aarhus). El Fab1 de anticuerpo
anti-complejo de Hp-Hb se purificó
del sobrenadante bacteriano después de expresión durante una noche
en medio super broth que contenía
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
1 mM. El Fab18 de anticuerpo anti-CD163 se purificó
de las células bacterianas después de sonicación en solución salina
tamponada con Tris que contenía
fenil-metil-sulfonil fluoruro. Ambos
anticuerpos se purificaron hasta homogeneidad después de filtración
en un procedimiento de cromatografía de afinidad de una sola etapa
usando un anticuerpo acoplado a Sepharose de cadena ligera kappa
anti-ratón de Zymed Laboratories (AH Diagnostics,
Dinamarca). Las preparaciones se concentraron en concentradores
Amicon y se determinaron las cantidades usando el procedimiento de
ácido bicinconínico de Pierce. La pureza se comprobó por
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida
(SDS-PAGE) en combinación con tinción con placa. Se
determinó la actividad de Fab en un ELISA usando un conjugado
anti-HA-biotina
(Hoffman-La Roche).
Se realizaron análisis de SPR en un instrumento
BIAcore^{TM}2000 (BIAcore AB, Suecia) como se ha descrito (1,
16). Se inmovilizaron chips detectores CM5 con aproximadamente
55-66 fmol por mm^{2} de CD163, Hp, Hb o complejo
de Hp-Hb. Como tampón de procesamiento se usó tampón
HEPES 10 mM que contenía CaCl_{2} 150 mM y 0,5 mM a pH 7,4. Los
datos se representaron y se ajustaron posteriormente usando el
software BIAevaluation 3.0. Para establecer adicionalmente las
características de unión del fago de Fab aislado. Este procedimiento
produjo aproximadamente 0,5 mg de Fab puro por litro de cultivo
bacteriano. La pureza de los Fab se ha determinado por un gel de
poliacrilamida teñido con plata. Se determinaron las cantidades
exactas de proteínas recombinantes aplicando el procedimiento de
ácido bicinconínico. Después de reevaluar la actividad de unión de
anticuerpos de Fab puros para ELISA, la unión de Fab1 a complejos
de Hp-Hb se investigó adicionalmente con resonancia
de plasmón superficial. Usando un chip detector inmovilizado con Hb,
Hp y complejos de Hp-Hb que permite mediciones
cinéticas, se obtuvo una constante de K_{D} de 3,9 nM para la
unión de Fab1 a complejos de Hp-Hb. No se pudo
detectar unión a los demás antígenos, demostrando de este modo la
especificidad por complejo de Fab1. Estos resultados están en línea
con los datos de ELSIA (de fago). Las curvas de unión se ilustran en
la Figura 2B. El Fab18 anti-CD163 demuestra una
baja afinidad por CD163 que está en el intervalo micromolar (no
mostrado).
Ensayos de unión de complejo de
Hp-Hb-^{125}I-CD163-
Los ensayos para medir la unión del complejo de
Hp-Hb marcado con ^{125}Yodo a CD163 en presencia
o ausencia de anticuerpos de competición se realizaron esencialmente
como se ha descrito (Kristiansen, M., Graversen, J. H., Jacobsen,
C., Sonne, O., Hoffman, H., Law, S. K. y Moestrup, S. K. (2001)
Nature 409(6817), 198-201) (Birn, H.,
Verroust, P. J., Nexo, E., Hager, H., Jacobsen, C., Christensen, E.
I. y Moestrup, S. K. (1997) J Biol Chem 272(42),
26497-504)). En primer lugar se determinan las
condiciones de revestimiento óptimas usando diluciones de receptor
seriadas seguido de incubación con complejos de
Hp-Hb [tipos (1:1) y (2:2)], marcados con
^{125}Yodo usando el procedimiento de cloramina T. Se realizaron
ensayos de unión usando aproximadamente 3000 recuentos por
minuto/pocillo. La radiactividad se contó usando un contador gama
Packard.
Experimentos de captación y degradación
celular usando complejos de Hp-Hb marcados con
^{125}Yodo- Se han descrito la internalización y degradación
posterior en células COS1 previamente (Kozyraki, R., Fyfe, J.,
Kristansen, M., Gerdes, C., Jacobsen, C., Cui, S., Christensen, E.
I., Aminoff, M., de la Chepelle, A., Crahe, R., Verroust, P. J. y
Moestrup, S. K. (1999) Nat Med 5(6), 656-61).
En resumen, células confluentes se trataron con 3000 recuentos por
minuto de complejos de Hp-Hb marcados con ^{125}I
y se incubaron de forma concomitante con una variedad de
concentraciones de anticuerpo de Fab hasta cantidades micromolares.
El sobrenadante se recontó cada 30 minutos para evaluar la
velocidad de degradación y después de 4 horas, las células se
lavaron de forma rigurosa seguido de recuento de radiactividad
internalizada. Como se puede observar en la Figura 13, prácticamente
a concentraciones nanomolares se mide una inhibición del 50% de la
unión. En anticuerpo Fab18 anti-CD163 también
inhibe la unión, aunque a concentraciones micromolares. En presencia
de cantidades micromolares de un anticuerpo Fab irrelevante (FabA8,
(Horn, I. R., Moestrup, S. K., van den Berg, B. M., Pannekoek, H.,
Nielsen, M. S. y van Zonneveld, A. J. (1995) J Biol Chem
270(20), 11770-5.)) al menos el 80% de
trazador todavía está unido. Los datos se obtuvieron usando la
forma de Hp (2:2), sin embargo, en un conjunto de experimentos
usando la forma (1:1) se obtuvieron resultados similares, de forma
coherente con los datos de competición que se han descrito
previamente (1. Kristiansen, M., Graversen, J. H., Jacobsen, C.,
Sonne, O., Hoffman, H. J., Law, S. K. y Moestrup, S. K. (2001)
Nature 409(6817), 198-201). Usando
procedimientos ELISA y SPR también se pudo demostrar la inhibición
de la unión del complejo de Hp-Hb a CD163 por Fab1
(datos no mostrados).
Claims (36)
1. Un compuesto que es (i) un complejo de
Hp-Hb o un fragmento del mismo que comprende la
cadena pesada (\beta) de haptoglobina o (ii) un anticuerpo o un
fragmento del mismo, en el que el complejo de Hp-Hb
o el fragmento del mismo o el anticuerpo o el fragmento del mismo
es capaz de unirse a un receptor CD163, para su uso en el
suministro terapéutico de un medicamento a células presentadoras de
CD163.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el complejo está en una forma purificada.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el complejo está en una forma aislada.
4. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que el complejo es
dimérico.
5. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que el complejo es
multimérico.
6. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, en el que el medicamento
comprende un fármaco para ser suministrado a una célula que expresa
una molécula de CD163.
7. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que el complejo o un
fragmento del mismo que comprende la cadena pesada (\beta) de
haptoglobina o un anticuerpo o un fragmento del mismo es capaz de
unirse a una región en uno o más de los dominios
D1-D9 de SRCR del receptor CD163, en el que dichos
dominios se corresponden a los siguientes aminoácidos en una
secuencia de ADNc traducida con el Nº de acceso de Genbank Z22968:
D1: aa 46-146, D2: aa 154-253, D3:
aa 261 -360, D4: aa 368-467, D5: aa
473-572, D6: aa 578-677, D7: aa
714-814, D8: aa 819-920 y D9: aa
924-1023.
8. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, en el que el complejo de
Hp-Hb o el fragmento del mismo o el anticuerpo o el
fragmento del mismo se une a un medicamento.
9. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
8, en el que el medicamento comprende al menos un fármaco.
10. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que el medicamento se selecciona de
antibióticos y fármacos anticancerosos.
11. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que el medicamento se selecciona de
fármacos anti-VIH.
12. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que el medicamento comprende al menos un gen
a suministrarse a una célula que expresa un receptor CD163.
13. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el gen comprende un ácido nucleico, tal
como PNA, LNA, ADN o ARN.
14. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 12 ó 13, en el que el gen codifica CD163.
15. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 9-14, en el que la célula es un
macrófago.
16. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que el medicamento comprende un anticuerpo o
un antígeno.
17. Un complejo de Hp-Hb
(complejo de haptoglobina-hemoglobina) o un
fragmento del mismo que comprende la cadena pesada (\beta) de
haptoglobina que está unida a una sustancia, donde el complejo de
Hp-Hb o la parte del mismo es capaz de unirse a un
receptor CD163 y donde la sustancia comprende
- a.
- un medicamento seleccionado de fármacos anti-VIH o
- b.
- un gen que codifica CD163.
\vskip1.000000\baselineskip
18. El complejo de Hp-Hb o
fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 17, en una
forma purificada.
19. El complejo de Hp-Hb o
fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 17, en una
forma aislada.
20. El complejo de Hp-Hb o
fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 17, en el que
el complejo es dimérico.
21. El complejo de Hp-Hb o
fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 17, en el que
el complejo es multimérico.
22. El complejo de Hp-Hb de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
17-22, capaz de unirse a una región en uno o más de
los dominios D1-D9 de SRCR del receptor CD163, en el
que dichos dominios se corresponden a los siguientes aminoácidos en
una secuencia de ADNc traducida con el Nº de acceso de Genbank
Z22968: D1: aa 46-146, D2: aa
154-253, D3: aa 261-360, D4: aa
368-467, D5: aa 473-572, D6: aa
578-677, D7: aa 714-814, D8: aa
819-920 y D9: aa 924-1023.
23. El complejo de Hp-Hb o
fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 17, en el que
el gen comprende un ácido nucleico, tal como PNA, LNA, ADN o
ARN.
24. Uso de un complejo de Hp-Hb
o un fragmento del mismo para la preparación de un diagnóstico en
relación a un receptor CD163.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24,
en el que el diagnóstico es para marcar una célula que expresa una
molécula CD163, en el que al menos una de las moléculas de
hemoglobina o haptoglobina están marcadas.
26. El uso de acuerdo con la reivindicación 24
para identificar macrófagos en una muestra biológica de un
individuo.
27. El uso de acuerdo con la reivindicación 24
para la detección de CD163 soluble en una muestra.
28. Un equivalente funcional de un complejo de
Hp-Hb, en el que dicho equivalente es un anticuerpo
o un fragmento del mismo y en el que dicho anticuerpo o un
fragmento del mismo se une a un medicamento y es capaz de unirse a
un receptor CD163, para el uso en un procedimiento de tratamiento en
el que el anticuerpo o un fragmento del mismo unido al medicamento
se capta en una célula presentadora de receptor CD163.
29. Un equivalente funcional de acuerdo con la
reivindicación 28, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo
es capaz de unirse a una región en uno o más dominios
D1-D9 de SRCR del receptor CD163, en el que dichos
dominios se corresponden a los siguientes aminoácidos en una
secuencia de ADNc traducida con el Nº de acceso de Genbank Z22968:
D1: aa 46-146, D2: aa 154-253, D3:
aa 261-360, D4: aa 368-467, D5: aa
473-572, D6: aa 578-677, D7: aa
714-814, D8: aa 819-920 y D9: aa
924-1023.
30. Un equivalente funcional de acuerdo con la
reivindicación 28, en el que el medicamento se selecciona de un
agente antimicrobiano, un fármaco anticanceroso, un fármaco
anti-VIH, un medicamento contra linfomas y un
antígeno.
31. Un equivalente funcional de acuerdo con la
reivindicación 28, en el que el medicamento es un anticuerpo.
32. Un equivalente funcional de acuerdo con la
reivindicación 31, en el que el anticuerpo se dirige a una diana
que se desea aclarar de plasma.
33. Un equivalente funcional de acuerdo con la
reivindicación 32, en el que la diana que se desea aclarar del
plasma es mioglobina.
34. Un equivalente funcional de acuerdo con la
reivindicación 28, en el que el medicamento comprende un gen.
35. Un equivalente funcional de acuerdo con la
reivindicación 34, en el que el gen comprende un ácido nucleico,
tal como PNA, LNA, ADN o ARN.
36. Un equivalente funcional de acuerdo con la
reivindicación 28, en el que la célula presentadora de receptor
CD163 es un macrófago.
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