ES2386335T3

ES2386335T3 - Receptor Fc-gamma para el tratamiento de la esclerosis múltiple mediada por los linfocitos B

Info

Publication number: ES2386335T3
Application number: ES09782523T
Authority: ES
Inventors: Peter Buckel; Uwe Jacob
Original assignee: Suppremol GmbH
Current assignee: Suppremol GmbH
Priority date: 2008-09-05
Filing date: 2009-09-02
Publication date: 2012-08-17
Anticipated expiration: 2029-09-02
Also published as: AU2009289280A8; US20130303458A1; RU2011112857A; RU2522251C2; WO2010026168A2; WO2010026168A3; JP5519674B2; JP2012502000A; EP2161031A1; AU2009289280C1; AU2009289280B2; AU2009289280B8; EP2331114B1; US20110230391A1; EP2331114A2; CA2735085A1; NZ591140A; AU2009289280A1; CA2735085C

Abstract

Receptor Fcγ (receptor Fc-gamma) para su uso en el tratamiento de la esclerosis múltiple, en el que la esclerosismúltiple es una forma de esclerosis múltiple mediada por los linfocitos B y/o una forma de esclerosis múltipleactivada por anticuerpos.

Description

Receptor Fc-gamma para el tratamiento de la esclerosis múltiple mediada por los linfocitos B.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la biotecnología y terapéutica. La invención se refiere al receptor Fcy (receptor Fc-gamma) para su uso en el tratamiento de la esclerosis múltiple, en el que la esclerosis múltiple es una forma de esclerosis múltiple mediada por los linfocitos B y/o una forma de esclerosis múltiple activada por autoanticuerpos.

Antecedentes de la invención

Las hipótesis actuales favorecen la idea de que los linfocitos T desempeñan un papel fundamental en la patogénesis de la esclerosis múltiple (EM), que se basó inicialmente en la observación de que los linfocitos T son la clase linfocítica predominante presente en las lesiones de EM (Windhagen, et al., Citokine, secretion of myelin basic protein reactive T cells in patients with multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology, 91:1-9, 7998; Hafler D.A., et al., Oral administration of myelin induces antigen-specific TGF-beta 1 secreting cells in patients with multiple sclerosis. Annals of the New York Academy of Science, 835:120-131, 1997; Lovett-Racke, A.E., et al., Decreased dependence of myelin basic protein-reactive T cells on CD28-mediated costimulation in multiple sclerosis patients, Journal of Clinical Investigation, 101:725-730, 1998). Esta observación continúa siendo una característica distintiva cardinal de la enfermedad, y está apoyada por un número de observaciones. Por ejemplo, los linfocitos auxiliares T CD4+ activos que poseen receptores de linfocitos T antimielina (TCR) están presentes en el fluido cerebroespinal (CSF) de pacientes con EM. Además, se han detectado niveles elevados de citocinas semejantes a Th1 en el CSF de pacientes con EM, y se han correlacionado con el empeoramiento de la enfermedad en algunos casos (Calabresi et al, Cytokine expression in cells derived from CSF of multiple sclerosis patients. Journal of Neuroimmunology, 89:198-205, 1998).

Sin embargo, también ha habido ciertos signos de que los linfocitos B pueden estar implicados en el desarrollo y la perpetuación de la EM incluyendo:

(1): niveles inmunoglobulinicos elevados en el CSF de pacientes con EM (Link, H., et al., Immunoglobulins in multiple sclerosis and infections of the nervous system, Archives of Neurology, 25:326-344, 1971; Link, H., et al., Immunoglobulin class and light chain type of oligoclonal bands in CSF in multiple sclerosis determined by agarose gel electrophoresis and immunofixation. Ann Neurol, 6(2):107-110, 1979; Perez, L., et al., B cells capable of spontaneous IgG secretion in cerebrospinal fluid from patients with multiple sclerosis: dependancy on local IL-6 production. Clinical Experimental Immunology, 101:449-452, 1995),

(2): formación de bandas de inmonuglobulinas en el CSF de pacientes con EM (Link, H., et al., Immunoglobulin class and light chain type of oligoclonal bands in CSF in multiple sclerosis determined by agarose gel electrophoresis and immunofixation. Ann Neurol, 6(2):107-110, 1979),

(3): distorsión de la relación K:A en el CSF de pacientes con EM (Hauser, S.L., et al., Clonally restricted B cells in peripheral blood of multiple sclerosis patients: kappa/lambda staining patterns. Annals of Neurology, 11:408412,1982),

(4): la presencia de anticuerpos antimielina en el CSF de pacientes con EM (Sun, J. H., et al, B cell responses to myelin-oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Journal of Immunology, 146:1490-1495, 1991), y

(5): la demostración de que los anticuerpos procedentes del CSF de pacientes con EM pueden contribuir a la extensión global de la lesión tisular en estos pacientes (Lassmann, H., et al., Experimental allergic encephalomyelitis: the balance between encephalitogenic T lymphocytes and demyelinating antibodies determines size and structure of demyelinated lesions. Acta Neuropathology, 75:566-576, 1988).

Un número de publicaciones demuestra tal mediación de los linfocitos B: Bourquin, et al., The journal of Immunology, 2003, 171: 455-461; Stromnes et al. Nature Protocols, Vol. 1, No. 4, 2006: 1810-1818; Stromnes et al Nature Protocols, Vol. 1, No. 4, 2006: 1952-19160; Oliver, et al., The Journal of Immunology, 2003, 171: 462-468.

El papel básico de los linfocitos B en el sistema inmunitario es mediar las respuestas inmunitarias humorales. Esto es, segregar proteínas denominadas anticuerpos (o inmunoglobulinas) que se unen a cuerpos extraños y los marcan para la eliminación del organismo por otras células inmunitarias, tales como células NK y macrófagos.

Se ha demostrado en múltiples ensayos clínicos dados a conocer en la bibliografía médica que la globulina inmunitaria intravenosa (IVIG) tiene un impacto sobre dos consideraciones importantes en la esclerosis múltiple recidivante-remitente. La IVIG reduce la frecuencia del empeoramiento agudo, y reduce la intensidad y duración del empeoramiento agudo. Aparentemente, un subconjunto de pacientes tiene una implicación destacada de linfocitos B en la esclerosis múltiple. Por tanto, seria ventajoso tener sustancias y métodos para el tratamiento de tales pacientes con esclerosis múltiple mediada por los linfocitos B.

La IVIG representa la inmunoglobulina humana reunida de muchos donantes. El mecanismo exacto mediante el cual la IVIG mejora las enfermedades mediadas por autoanticuerpos es desconocido. Sin embargo, se podría demostrar que a) la eficacia de IVIG depende de la expresión del receptor Fc, b) la relación de autoanticuerpos a inmoglobulina normal (IVIG) está desviada, lo que conduce a una degradación potenciada de autoanticuerpos, y c) la IVIG contiene la red completa de anticuerpos humanos y anticuerpos antiidiotípicos (anticuerpos contra anticuerpos), lo que conduce a la neutralización de anticuerpos.

Sumario de la invención

Se ha descubierto sorprendentemente que la hipótesis actual de que los linfocitos las B desempeñan un papel fundamental en la patogénesis de la esclerosis múltiple (EM) no es al menos totalmente correcta. Los inventores se centraron en la forma de esclerosis múltiple mediada por los linfocitos B, y sorprendentemente son capaces de proporcionar un tratamiento especial.

La invención se refiere al receptor Fcy (receptor Fc-gamma) para su uso en el tratamiento de esclerosis múltiple, en el que la esclerosis múltiple es una forma de esclerosis múltiple mediada por los linfocitos B y/o una fórmula de esclerosis múltiple activada por autoanticuerpos. La invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen el receptor Fcy (receptor Fc-gamma) para su uso en el tratamiento de esclerosis múltiple, en el que la esclerosis múltiple es una forma de esclerosis múltiple mediada por los linfocitos B y/o una forma de esclerosis múltiple activada por autoanticuerpos.

Los receptores Fc (FcR) desempeñan un papel clave a la hora de defender el organismo humano frente a infecciones. Después de que los patógenos obtienen acceso al torrente sanguíneo, son opsonizados por inmunoglobulinas (Igs). Los inmunocomplejos resultantes se unen, debido a su multivalencia, con gran avidez a células que poseen FcR, conduciendo al agrupamiento de los FcR, lo que dispara varias funciones efectoras (Metzger, H., 1992A). Estas incluyen, dependiendo del tipo de FcR expresado y de las proteínas asociadas, endocitosis con neutralización subsiguiente de los patógenos y presentación antigénica, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), secreción de mediadores o la regulación de producción de anticuerpos (Fridman, et al., 1992; van de Winkel y Capel, 1993).

Existen FcR específicos para todas las clases de Ig, siendo aquellos para IgG los más abundantes con la diversidad más amplia. Junto con el receptor de afinidad elevada para IgE (FcsRIa), FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIIIa (CD16) aparecen como proteínas transmembranarias de tipo I o en formas solubles (sFcR), pero también existe una forma del FcyRIII (FcyRIIIb) anclada a glucosilfosfatidilinositol. Además, los FcyRs aparecen en diversas isoformas (FcyRIa, b1, b2, c; FcyRIIa1-2, b1-3, c) y alelos (FcyRIIa1-HR, -LR; FcyRIIIb-NA1, -NA2) (van de Winkel y Capel, 1993). En contraste con las partes extracelulares homologas globales, el cruzamiento transmembranario y los dominios citoplásmicos difieren. Pueden estar suprimidos completamente, o pueden tener un tamaño de 8 kDa. Pueden contener un motivo de activación de inmunorreceptor a base de tirosina (ITAM) de 26 aminoácidos, como en FcyRIIa, o un motivo inhibidor (ITIM) de 13 aminoácidos respectivo en FcyRIIb implicado en la transducción de señales (Amigorena, et al., 1992).

En la presente memoria, EAE es la encefalomielitis autoinmunitaria experimental.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere al receptor Fcy (receptor Fc-gamma) para su uso en el tratamiento de esclerosis múltiple, en el que la esclerosis múltiple es una forma de esclerosis múltiple mediada por los linfocitos B y/o una forma de esclerosis múltiple activada por autoanticuerpos.

La mediación de la esclerosis múltiple por linfocitos B y/o la forma de esclerosis múltiple activada por autoanticuerpos se caracterizan por una o más de las siguientes características: (a) la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a tratamiento con inmonuglobulina intravenosa (IVIG), y/o (b) la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a tratamiento con anticuerpos anti-CD20, y/o (c) la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a plasmaféresis, y/o (d) la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a inmunoadsorción, (e) la presencia de autoanticuerpos frente al antígeno glucoproteína oligodendrocítica mielínica (MOG), y/o (f) la presencia de autoanticuerpos frente al antígeno proteína básica mielínica (MBP), y/o (g) la presencia de autoanticuerpos frente a acuaporina 4.

La enfermedad de Devic es similar a la EM por cuanto el sistema inmunitario del cuerpo ataca a la mielina que rodea a las células nerviosas. A diferencia de la EM estándar, no se cree que los ataques estén mediados por los linfocitos T del sistema inmunitario, sino más bien por anticuerpos denominados NMO-IgG. Estos anticuerpos se dirigen contra una proteína denominada acuaporina 4 en las membranas celulares de astrocitos, que actúa como una canal para el transporte de agua a través de la membrana celular.

En una forma de realización preferida, la mediación de la esclerosis múltiple por los linfocitos B y/o la forma de esclerosis múltiple activada por autoanticuerpos está determinada, antes del uso del receptor Fcy, por medio de uno

: o más de los siguientes ensayos: (a) determinación de si la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a tratamiento con inmonuglobulina intravenosa (IVIG), y/o (b) la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a tratamiento con anticuerpos anti-CD20, y/o (c) la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a plamaféresis,

(d): la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a inmunoadsorción, (e) determinación de si los autoanticuerpos frente al antígeno glucoproteína oligodendrocítica mielínica (MOG) están presentes en el paciente, y/o (f) determinación de si los autoanticuerpos frente al antígeno proteína básica mielínica (MBP) están presentes en el paciente, y/o (g) determinación de la presencia de autoanticuerpos frente a acuaporina 4. Preferentemente, se lleva a cabo una selección de dos de los ensayos, más preferentemente se lleva a cabo una selección de tres de los ensayos, más preferentemente se lleva a cabo una selección de cuatro de los ensayos.

Un ejemplo de un tratamiento anti-CD20 es el Rituximab. Éste es un anticuerpo monoclonal. Lamentablemente, tiene efectos secundarios graves, que se podrían mejorar si se usase la presente proteína, es decir, polipéptidos, en lugar de Rituximab.

Durante la plasmaféresis, la sangre se extrae inicialmente del cuerpo a través de una aguja o un catéter previamente implantado. Entonces se elimina el plasma de la sangre mediante un separador celular. Habitualmente se usan tres procedimientos para separar el plasma de la sangre:

Centrifugación de flujo discontinuo:

Se necesita un tubo de catéter venoso. Típicamente, se elimina un lote de sangre de 300 ml de una sola vez y se centrifuga para separar el plasma de las células de la sangre.

Centrifugación de flujo continuo:

Se usan dos tubos venosos. Este método requiere que salga del cuerpo un volumen ligeramente menor de una sola vez, puesto que es capaz de eliminar continuamente el plasma por centrifugación.

Filtración del plasma:

Se usan dos tubos venosos. El plasma se filtra usando un equipo de hemodiálisis estándar. Este proceso continuo requiere extraer del cuerpo de una sola vez menos de 100 ml de sangre.

Durante la inmunoadsorción, la sangre de un paciente se aclara de inmunoglobulina mediante columna de cromatografía de afinidad extracorpórea.

Cada método tiene sus ventajas y sus desventajas. Después de la separación del plasma, las células de la sangre se devuelven a la persona sometida a tratamiento, mientras que el plasma que contiene los anticuerpos se trata en primer lugar y después se devuelve al paciente por plasmaféresis tradicional. (En el intercambio plasmático, el plasma eliminado se desecha y el paciente recibe plasma de donante de sustitución, o disolución salina con proteínas añadidas). Durante el procedimiento, generalmente se administra al paciente una medicación para evitar que la sangre se coagule (un anticoagulante). En enfermedades particulares, la plasmaféresis se usa como una terapia.

Un uso importante de la plasmaféresis es en la terapia de trastornos autoinmunitarios. Sin embargo, el método es extremadamente exigente para el paciente.

El documento WO 2008/017363 describe unos medios para estudiar la mediación de los linfocitos B. En particular, describe unos medios para detectar autoanticuerpos frente a MOG y acuaporina 4. El documento WO 2008/017363 se incorpora como referencia.

En una forma de realización preferida de la invención, el receptor FcR es de origen humano. El receptor Fcy según la invención se selecciona preferentemente de entre el grupo de FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32), FcyRIIB1 (CD32), FcyRIIB2 (CD32). FcyRIIc (CD32), FcyRIIIA (CD16) y FcyRIIIB (CD16).

FcyRIIB1 (CD32) y FcyRIIB2 (CD32) también son denominadas isoformas, es decir, las isoformas 1 y 2.

Según la presente invención, la preparación de los receptores Fc solubles tienen lugar en células procariotas o eucariotas. También puede tener lugar en células eucariotas. Si tiene lugar en célula procariotas (véase el documento EP-B1 1 135 486), se forman cuerpos de inclusión insolubles que contienen la proteína recombinante, facilitando así la purificación mediante separación de los cuerpos de inclusión de otros componentes celulares antes de que tenga lugar la renaturalización de las proteínas contenidas en ellos. La renaturalización de los FcR según la presente invención, que están contenidos en los cuerpos de inclusión, puede tener lugar principalmente según métodos conocidos. La ventaja de la preparación en células procariotas, la preparación de cuerpos de inclusión y los receptores Fc solubles recombinantes así obtenidos, hace posible obtener una preparación de FcR muy pura y, en particular, también muy homogénea. También, debido a la ausencia de glucosilación, el producto obtenido es de una gran homogeneidad. Sin embargo, en algunos casos, puede ser deseada la glucosilación.

Una célula hospedante se manipula mediante ingeniería genética con el polinucleótido o el vector que codifica o que posee el FcR. Las células hospedantes que se pueden usar para los fines de la invención incluyen, pero no se limitan a, células procariotas tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis), que se pueden transformar con, por ejemplo, vectores de expresión recombinantes de ADN bacteriofágico, ADN plasmídico, o ADN cosmídico, que contienen las moléculas polinucleotídicas que codifican el FcR; células eucariotas simples, como levaduras (por ejemplo Saccharomyces y Pichia), que se pueden transformar con, por ejemplo, vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen la molécula polinucleotídica de la invención, es decir, las moléculas polinucleotídicas que codifican el FcR; sistemas de células de insectos, como, por ejemplo, las células Sf9 o Hi5, que se pueden infectar con, por ejemplo, vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las moléculas polinucleotídicas de la invención; Xenopus oocytes, que se puede inyectar con, por ejemplo, plásmidos; sistemas de células vegetales, que se pueden infectar con, por ejemplo, vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CaMV) o virus del mosaico del tabaco (TMV)), o se pueden transformar con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contiene un FcR o una secuencia nucleotídica variable; o sistemas celulares de mamíferos, por ejemplo células COS, CHO, BH, HEK293, VERO, HeLa, MDCK, Wi38, Swiss 3T3 y NIH 3T3), que se pueden transformar con constructos de expresión recombinantes que contienen, por ejemplo, promotores derivados de, por ejemplo, el genoma de células de mamíferos (por ejemplo, el promotor de metalotioneína), de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío adenovírico, CMV IE y el promotor de 7,5K del virus de la vacuna), o de células bacterianas (por ejemplo, se emplea la unión del represor de tet en el sistema de tet-on y tet-off). También son útiles como células hospedantes las células primarias o secundarias obtenidas directamente de un mamífero y transfectadas con un vector plasmídico o infectadas con un vector vírico. Dependiendo de la célula hospedante y del vector respectivo usado para introducir el polinucleótido de la invención, el polinucleótido se puede integrar, por ejemplo, en el cromosoma o en el ADN mitocondrial, o se puede mantener extracromosómicamente como, por ejemplo, episómicamente, o puede estar comprendido sólo transitoriamente en las células.

En la secuencia de FcyRIIb se encuentran tres sitios potenciales de N-glucosilación. Los tres sitios están sobre la superficie de la molécula, y son accesibles. Están situados en los bucles EIF (N61 y N142) de ambos dominios, y en la hebra E (N 135) del dominio C-terminal. Los FcR aislados de células de mamíferos están muy glucosilados. Puesto que FcR se glucosila in vivo, puede ser deseable escoger un sistema de expresión que proporcione una glucosilación fiable de la proteína. En consecuencia, se prefiere introducir los polinucleótidos que codifican el FcR de la presente invención en células eucariotas superiores, en particular en células de mamíferos, por ejemplo células COS, CHO, BHK, HEK293, VERO, HeLa, MDCK, Wi38, Swiss 3T3 o NIH 3T3.

Preferentemente, el receptor Fcy según la invención carece del dominio transmembranario y/o del péptido señal, y es soluble. Las formas solubles de los receptores Fc (sFcR) tales como FcyRIII median la regulación, específica del isotipo, del crecimiento de linfocitos B y la producción de inmonuglobulinas. En un modelo murino de mieloma, el sFcR suprime el crecimiento y la producción inmunoglobulínica de células tumorales (Muller, et al., 1985; Roman, et al., 1988; Teillaud, et al., 1990). Además, el sFcR se une a IgG de superficie en cultivos de células de mieloma que segregan IgG humanas y efectúa la supresión del crecimiento de células tumorales y la secreción de IgG. La exposición prolongada de estas células a sFcR da como resultado citolisis de las células tumorales (Hoover, et al., 1995).

Los polipéptidos del receptor Fcy pueden ser cualquiera de los descritos anteriormente, pero con no más de diez (por ejemplo, no más de: diez, nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos, o una) sustituciones conservadoras. Las sustituciones conservadoras son conocidas en la técnica, e incluyen típicamente la sustitución de, por ejemplo, un aminoácido polar por otro aminoácido polar, y un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido. En consecuencia, las sustituciones conservadoras incluyen preferentemente sustituciones con los siguientes grupos de aminoácidos: glicina, alanina, valina, prolina, isoleucina y leucina (cadena lateral alifática no polar); ácido aspártico y ácido glutámico (cadena lateral cargada negativamente); asparagina, glutamina, metionina, cisteína, serina y treonina (cadena lateral no cargada polar); lisina, histidina y arginina; y fenilalanina, triptófano y tirosina (cadena lateral aromática); y lisina, arginina e histidina (cadena lateral cargada positivamente). Es bien sabido en la técnica cómo determinar el efecto de una sustitución dada, por ejemplo sobre el pKI, etc. Todo lo que se necesita de un polipéptido que tenga una o más sustituciones conservadoras es que tenga al menos 50% (por ejemplo, al menos; 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99,5%; o 100% o más) de la actividad del receptor Fcy inalterado según la invención.

Tanto los polipéptidos como los péptidos se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante in vitro estándares y transgénesis in vivo, usando secuencias nucleotídicas que codifican los polipéptidos o péptidos apropiados. Para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes relevantes y señales de control transcripcionales/traduccionales apropiadas, se pueden usar métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, et al., Molecular cloning; A Laboratory Manual (2ª Ed.) [Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989], y Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology [Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989].

Los polipéptidos y fragmentos de la invención, es decir, polipéptidos aislados, también incluyen los descritos anteriormente, pero modificados para su uso in vivo mediante adición, en los extremos amino y/o carboxilo terminales, de agentes de bloqueo para facilitar la supervivencia del polipéptido relevante in vivo. Esto puede ser útil en las situaciones en las que los términos peptídicos tienden a ser degradados por proteasas antes de la absorción celular. Tales agentes de bloqueo pueden incluir, sin limitación, secuencias peptídicas relacionadas o no relacionadas adicionales que se pueden unir a los restos amino y/o carboxi terminales del péptido a administrar. Esto se puede hacer químicamente durante la síntesis del péptido, o mediante tecnología de ADN recombinante mediante métodos familiares para los expertos normales.

Como alternativa, se pueden unir agentes de bloqueo, tales como ácido piroglutámico u otras moléculas conocidas en la técnica, a los restos amino y/o carboxi terminales; o el grupo amino en el término amino, o el grupo carboxi en el término carboxi se puede sustituir por un resto diferente. Igualmente, los péptidos se pueden acoplar covalentemente o no covalentemente a proteínas “portadoras” farmacéuticamente aceptables, antes de la administración.

La expresión polipéptido “aislado” o fragmento peptídico, como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipéptido o a un fragmento peptídico que no tiene contraparte de origen natural o se ha separado o purificado a partir de componentes que lo acompañan de forma natural, por ejemplo en tejidos tales como lengua, páncreas, hígado, bazo, ovario, testículos, músculo, tejido articular, tejido neuronal, tejido gastrointestinal o tejido tumoral, o fluidos corporales tales como sangre, suero, u orina. Típicamente, el polipéptido o fragmento peptídico se considera “aislado” cuando se encuentra en por lo menos 70%, en peso seco, libre de las proteínas y otras moléculas orgánicas de origen natural con las que está asociado de forma natural. Preferentemente, una preparación de un polipéptido (o fragmento peptídico del mismo) de la invención es al menos 80%, más preferentemente al menos 90%, y lo más preferido al menos 99%, en peso seco, el polipéptido (o el fragmento peptídico del mismo), respectivamente, de la invención. De este modo, por ejemplo, una preparación de polipéptido x es al menos 80%, más preferentemente al menos 90%, y lo más preferido al menos 99%, en peso seco, polipéptido x. Puesto que un polipéptido que se sintetiza químicamente se separa, por su naturaleza, de los otros componentes que lo acompañan de forma natural, el polipéptido sintético está “aislado”.

Un polipéptido aislado (o fragmento peptídico) de la invención se puede obtener, por ejemplo, mediante extracción a partir de una fuente natural (por ejemplo, a partir de tejidos o fluidos corporales); mediante expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido; o mediante síntesis química. Un polipéptido que se produce en un sistema celular diferente de la fuente a partir de la que se origina de forma natural está “aislado”, debido a que estará necesariamente libre de componentes que lo acompañan de forma natural. El grado de aislamiento o pureza se puede medir mediante cualquier método apropiado, por ejemplo cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis de HPLC.

El receptor Fcy según la invención se puede modificar (mejorar) químicamente mediante PEGilación y/o manipulación mediante ingeniería genética.

Los enfoques conocidos implican la provisión de sitios de glucosilación adicionales (véanse, por ejemplo, los documentos WO 91/05867, WO 94/09257 y WO 01/81405). Tales análogos modificados pueden tener al menos una cadena de hidrato de carbono adicional enlazada mediante N y/o enlazada mediante O. Otros intentos para mejorar la semivida pueden implicar la adición de restos de polietilenglicol (PEG) de longitud variable a la cadena principal de aminoácidos (véanse, por ejemplo, los documentos WO 00/32772, WO 01/02017, WO 03/029291). Las moléculas se pueden modificar con al menos un oligosacárido enlazado mediante N y/o enlazado mediante O, que se modifica adicionalmente mediante oxidación, sulfatación, fosforilación, PEGilación o una combinación de los mismos (véase el documento WO 2005/025606). Todos estos enfoques se pueden emplear igualmente para prolongar la semivida de las variantes de la presente invención, y, en consecuencia, en una forma de realización preferida del receptor Fcy según la invención, la modificación se selecciona de entre el grupo constituido por oxidación, sulfatación, fosforilación, adición de oligosacáridos, o sus combinaciones. Si se desea la adición de otros oligonucleótidos enlazados mediante N o enlazados mediante O, es posible introducirlos introduciendo sitios de glucosilación adicionales. También se prefiere que la proteína sea modulada por afinidad.

En la práctica de un aspecto de la presente invención, una composición farmacéutica que comprende el receptor de la invención se puede administrar a un mamífero mediante cualquier vía que proporcione un nivel suficiente de actividad. Se puede administrar sistémicamente o localmente. Tal administración puede ser parenteralmente, transmucosalmente, por ejemplo oralmente, nasalmente, rectalmente, intravaginalmente, sublingualmente, submucosalmente o transdérmicamente. Preferentemente, la administración es parenteral, por ejemplo vía inyección intravenosa o intraperitoneal, y también incluye, pero no se limita a, la administración intraarterial, intramuscular, intradérmica y subcutánea. Si la composición farmacéutica de la invención se administra localmente, se puede inyectar directamente en el órgano o tejido a tratar. En casos de tratamiento del sistema nervioso, esta vía de administración incluye, pero no se limita a, las vías de administración intracerebral, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal, intracisternal, intraespinal y/o periespinal, que puede emplear agujas intracraneales e intravertebrales, y catéteres con o sin dispositivos de bombeo.

El receptor también puede estar glucosilado.

5 Lo más preferido, el receptor se selecciona de entre el grupo de FcyRIIA/B/C (CD32) y FcyRIIIA/B (CD16b). La invención también se refiere a las isoformas del mismo e isoformas de los FcR reivindicados en la presente memoria en general.

En una forma de realización preferida, la composición farmacéutica comprende un polipéptido del receptor FcR en

10 una forma de dosificación unitaria para tratar esclerosis múltiple, en la que la esclerosis múltiple es una forma de esclerosis múltiple mediada por los linfocitos B y/o una forma de esclerosis múltiple activada por autoanticuerpos, y la cantidad a administrar a un paciente en una única dosis está entre 1 y 20 mg/kg, preferentemente 2 y 10 mg/kg, más preferentemente entre 25 y 5 mg/kg, incluso más preferentemente entre 2,5 y 5 mg/kg.

15 Una composición farmacéutica puede comprender adicionalmente una o más de las siguientes sustancias: un detergente y/o un azúcar. Un detergente preferido es el Tween 20. Un azúcar preferido es el manitol.

El receptor Fcy según la invención tiene preferentemente las secuencias seleccionadas de entre el grupo de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC

20 ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12 y SEC ID nº 13. Estás se esquematizan en la Tabla 1.

El receptor Fcy según la invención comprende preferentemente sólo el dominio extracelular de dichas secuencias (forma soluble del receptor). Tal dominio es conocido a partir de alineamientos de secuencias, se caracteriza estructuralmente por cristalografía de rayos X, y comprende los primeros dos (CD16, CD32) o los primeros tres

25 (CD64) dominios semejantes a IgG del receptor maduro (Sondermann P., Kaiser J., Jacob U., Molecular basis for immune complex recognition: a comparison of Fc-receptor structures. J. Mol. Biol. 2001, 309, 737-749).

Tabla 1

FCgamma RIA humano (SEC ID nº 1): SEC ID nº 14

FCgamma RIB humano (SEC ID nº 2): SEC ID nº 15

FCgamma RIB humano (SEC ID nº 3): SEC ID nº 16

FCgamma Rlla humano (SEC ID nº 4): SEC ID nº 17

Isoforma 1 de FCgamma RIIB humano (SEC ID nº 5): SEC ID nº 18

Isoforma 2 de FCgamma RIIB humano (SEC ID nº 6): SEC ID nº 19

Isoforma 3 de FCgamma RIIB humano (SEC ID nº 7): SEC ID nº 20

Isoforma 4 de FCgamma Rllb humano (SEC ID nº 8): SEC ID nº 21

Isoforma 1 de FCgamma RIIc humano (SEC ID nº 9): SEC ID nº 22

Isoforma 2 de FCgamma RIIC humano (SEC ID nº 10): SEC ID nº 23

Isoforma 3 de FCgamma RIIC humano (SEC ID nº 11): SEC ID nº 24

FCgamma RIIIA humano (SEC ID nº 12): SEC ID nº 25

FCgamma RIIIB humano (SEC ID nº 13): SEC ID nº 26

Los FcR preferidos están codificados por los siguientes ácidos nucleicos: FCgammaRIA humano (SEC ID nº 1) está codificado por la secuencia según SEC ID nº 14.

FCgammaRIB humano (SEC ID nº 2) está codificado por la secuencia según SEC ID nº 15. FCgammaRIB humano (SEC ID nº 3) está codificado por la secuencia según SEC ID nº 16.

10 FCgammaRIIa humano (SEC ID nº 4) está codificado por la secuencia según SEC ID nº 17. La isoforma 1 de FCgammaRIIB humano (SEC ID nº 5) está codificada por la secuencia según SEC ID nº 18. La isoforma 2 de FCgammaRIIB humano (SEC ID nº 6) está codificada por la secuencia según SEC ID nº 19.

La isoforma 3 de FCgammaRIIB humano (SEC ID nº 7) está codificada por la secuencia según SEC ID nº 20. La isoforma 4 de FCgammaRIIb humano (SEC ID nº 8) está codificada por la secuencia según SEC ID nº 21.

20 La isoforma 1 de FCgammaRIIc humano (SEC ID nº 9) está codificada por la secuencia según SEC ID nº 22. La isoforma 2 de FCgammaRIIC humano (SEC ID nº 10) está codificada por la secuencia según SEC ID nº 23. La isoforma 3 de FCgammaRIIC humano (SEC ID nº 11) está codificada por la secuencia según SEC ID nº 24.

FCgammaRIIIA humano (SEC ID nº 12) está codificado por la secuencia según SEC ID nº 25.

FCgammaRIIIB humano (SEC ID nº 13) está codificado por la secuencia según SEC ID nº 26.

5 Se prefiere que el FcyR sea un FcyRIIb soluble humano no glucosilado recombinante, seleccionado preferentemente de entre el grupo deSEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7 y SEC ID nº 8.

Ejemplos

10 El compuesto biológicamente activo, la molécula de FcyRIIb soluble humano recombinante, es producido en cuerpos de inclusión mediante fermentación de E. coli manipulada mediante ingeniería genética.

El sFcyRIIb es producido mediante fermentación en la cepa BL21 (DE3) de E. coli, que se ha transformado con una 15 secuencia de ADNc optimizada para la expresión de sFcyRIIb.

El sFcyRIIb contiene 4 cisteínas para formar 2 enlaces de disulfuro intramoleculares entre las posiciones Cys26-Cys68 y Cys107-Cys151. La secuencia N-terminal corresponde a la secuencia de consenso de la peptidasa señal eucariota. El término C se generó mediante introducción de un codón de parada tras el motivo SER-SER-PRO. No

20 se introdujeron modificaciones adicionales.

El sFcyRIIb tiene una masa molecular de 19.668,9 en condiciones nativas, y de 19.692,9 en condiciones reductoras.

En la Tabla 2 se da un resumen del procedimiento de preparación de la sustancia farmacéutica: 25 Tabla 2

Un vial de WCB

Fermentación de sustrato celular de E. coli

Recolección de sustrato celular de E. coli

Aislamiento de cuerpos de inclusión

Replegamiento de sFcyRIIb a partir de cuerpos de inclusión

Purificación de sFcyRIIb para producir material a granel

Almacenamiento de la masa de sFcyRIIb a -80ºC

Encabezamientos de las figuras

30 Figura 1

Se indujo EAE en el día cero en ratones hembra C57/BI6j de 6-8 semanas mediante inyección subcutánea de 100 Ig de MOG de rata en adyuvante completo de Freund (CFA). En el día 0 y en el día 2 se administraron

35 intraperitonealmente 250 ng de toxina tosferínica. Los ratones se trataron intraperitonealmente con 200 IgdesFcR después de que aparecieron los primeros síntomas en el día 8, 11 y 14. El esquema de puntuación fue según el grado de parálisis: 0 = sin parálisis, 1 = parálisis de la cola, 2 = parálisis de las patas traseras, 3 = parálisis de las patas delanteras, 4 = parálisis completa, 5 = muerte.

40 Figura 2

Se indujo EAE en el día cero en ratones hembra SJL de 6-8 semanas mediante inyección subcutánea de 100 Ig de MOG de rata en adyuvante completo de Freund (CFA). En el día 0 y en el día 2 se administraron intraperitonealmente 250 ng de toxina tosferínica. Los ratones se trataron intraperitonealmente con 200 Ig de sFcR

45 después de que aparecieron los primeros síntomas en el día 9, 12 y 15. El esquema de puntuación fue según el grado de parálisis: 0 = sin parálisis, 1 = parálisis de la cola, 2 = parálisis de las patas traseras, 3 = parálisis de las patas delanteras, 4 = parálisis completa, 5 = muerte.

Listado de secuencias

<110> SuppreMol GmbH

<120> SUSTANCIAS Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE MEDIADA POR

LOS LINFOCITOS B 55

<130> P1673 PCT BLN

<160> 26 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 5 <211> 374

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1 10

<210> 2

<211> 291

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3 5 <211> 280

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3 10

<210> 4 5 <211> 316

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4 10

<210> 5 5 <211> 310

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5 10

<210> 6

<211> 290

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 291

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 309

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 323

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 276

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>: 11 10

<210> 12

<211> 254

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 85

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 1125 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 567

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 843

<212>: ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 951

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 933

<212>: ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 18 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400>: 19 10

<210> 20

<211>876 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens 10

<400> 21

<210> 22

<211> 972

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 831

<212> ADN 10 <213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 804

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 24

10 <210> 25

<211> 873

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15 <400> 25

<210> 26

<211> 702

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 26

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Receptor Fcy (receptor Fc-gamma) para su uso en el tratamiento de la esclerosis múltiple, en el que la esclerosis múltiple es una forma de esclerosis múltiple mediada por los linfocitos B y/o una forma de esclerosis múltiple activada por anticuerpos.
2.

Receptor Fcy para su uso según la reivindicación 1, en el que la mediación por linfocitos B de la esclerosis múltiple y/o la forma de esclerosis múltiple accionada por autoanticuerpos está caracterizada porque presenta una o más de las siguientes características

a.

la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a un tratamiento con inmonuglobulina intravenosa (IVIG), y/o

b.

la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a un tratamiento con anticuerpos anti-CD20, y/o

c.

la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a plasmaféresis, y/o

d.

la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a inmunoadsorción,

e.

la presencia de autoanticuerpos frente al antígeno glucoproteína oligodendrocítica mielínica (MOG), y/o

f.

la presencia de autoanticuerpos frente al antígeno proteína básica mielínica (MBP), y/o

g.

la presencia de autoanticuerpos frente a la acuaporina 4.
3. Receptor Fcy para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que la mediación por linfocitos B de la esclerosis múltiple y/o la forma de esclerosis múltiple activada por autoanticuerpos se determina antes del uso del receptor Fcy por medio de uno o más de los siguientes ensayos

a.

determinar si la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a un tratamiento con inmonuglobulina intravenosa (IVIG), y/o

b.

la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a un tratamiento con anticuerpos anti-CD20, y/o

c.

la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a plasmaféresis, y/o

d.

la esclerosis múltiple mejora si el paciente se somete a inmunoadsorción,

e.

determinar si los autoanticuerpos frente al antígeno glucoproteína oligodendrocítica mielínica (MOG) están presentes en el paciente, y/o

f.

determinar si los autoanticuerpos frente al antígeno proteína básica mielínica (MBP) están presentes en el paciente, y/o

g.

determinar si los autoanticuerpos frente a la acuaporina 4 están presentes en el paciente.
4.

Receptor Fcy para su uso según las reivindicaciones 1 a 3, en el que el FcyR se selecciona de entre el grupo de FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32), FcyRIIB1 (CD32), FcyRIIB2 (CD32), FcyRIIc (CD32), FcyRIIIA (CD16) y FcyRIIIB (CD16).
5.

Receptor Fcy para su uso según las reivindicaciones 1 a 4, en el que el receptor carece del dominio transmembranario y/o el péptido señal, y es soluble.
6.

Receptor Fcy para su uso según las reivindicaciones 1 a 5, en el que el receptor es modificado químicamente mediante PEGilación y/o es modulado por afinidad.
7.

Receptor Fcy para su uso según las reivindicaciones 1 a 6, en el que el receptor no está glucosilado.
8.

Receptor Fcy para su uso según las reivindicaciones 1 a 7, en el que el receptor es el FcyRIIB/C (CD32) o el FcyRIIIA/B (CD16/b)
9.

Receptor Fcy para su uso según las reivindicaciones 1 a 8, en una disolución acuosa, en el que la cantidad que se debe administrar a un paciente en una dosis única se encuentra entre 1 y 20 mg/kg.
10.

Receptor Fcy para su uso según las reivindicaciones 1 a 9, en el que el receptor tiene una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12 y SEC ID nº 13.
11.

Receptor Fcy para su uso según las reivindicaciones 1 a 10, en el que el FcyR es un FcyRIIb soluble humano no glucosilado recombinante, seleccionado preferentemente de entre el grupo de SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7 y SEC ID nº 8.