RO109865B1

RO109865B1 - Procedeu microbiologic, pentru prepararea acidului 5-hidrozipirazincarboxilic si /sau a sarurilor acestuia

Info

Publication number: RO109865B1
Application number: RO92-0827A
Authority: RO
Inventors: Andreas Kiener
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1991-06-21
Filing date: 1992-06-19
Publication date: 1995-06-30
Also published as: IL102071A; MX9202930A; EP0519512B1; KR930000688A; HU213020B; IL102071A0; US5273893A; CA2069596A1; RU2094461C1; IE921680A1; DK0519512T3; PL169635B1; HUT65850A; ZA923876B; ATE134385T1; CZ188592A3; AU1819792A; EP0519512A2; AU658632B2; JPH05244967A

Description

Invenția se referă la un procedeu microbiologic pentru prepararea acidului 5hidroxipirazincarboxilic și/sau a sărurilor acestuia.

Acidul 5-hidroxipirazincarboxilic se poate folosi de exemplu, ca produs intermediar pentru prepararea de produse farmaceutice, ca de exemplu, pentru prepararea analogilor de pirazin-nucleoside cu acțiune citostatică (M.Bobek, J.Heterociclic Chem., 1991, 28, pp. 1131).

Se cunoaște că acidul 5-hidroxipirazincarboxilic se formează în metabolismul câinilor și oamenilor din pirazinamidă prin acid pirazincarboxilic (J.Pharmaco. Exp. Ther., 1972, 180 (2), 411-434).

Se descrie un procedeu chimic în 5 trepte pentru obținerea de acid 5-hidroxipirazincarboxilic de exemplu, pornind de la furfurilglioxal (J.Heterocyclic Chem. 19, 1982, pp. 402). Acesta are însă dezavantajul că nu se poate aplica la scară mare, industrială.

Procedeul microbiologic pentru prepararea acidului 5-hidroxipirazincarboxilic și/sau a sărurilor acestuia conform invenției, constă în aceea că acidul pirazincarboxilic și/sau sărurile acestuia sunt transformate cu ajutorul microorganismelor care se dezvoltă cu acidul nicotinic și/sau sărurile sale ca unică sursă de carbon, azot de energie, în acidul 5-hidroxipirazincarboxilic și/sau sărurile sale care se acumulează în mediu.

în principiu, pentru acest procedeu se pretează toate microorganismele, care descompun acidul nicotinic prin acidul 6-hidroxinicotinic. Aceste microorganisme pot fi izolate cu ajutorul tehnologiilor microbiologice obișnuite de exemplu, din instalații de limpezire cu acid nicotinic ca substrat de creștere.

De exemplu, se pot utiliza microorganisme din specia Pseudomonas, Achromobacter, Bacillus, Azorhizobium, Sarcina și Mycobacterium, care sunt descrise deja în EPA 152948. Transformarea poate fi efectuată, atât cu amestecuri, cât și cu izolate pure din aceste microorganisme, steril sau nesteril.

în mod adecvat procedeul este efectuat cu microorganismele din speciile: Pseudomonas acidovorans DSM 4746, Achromohacter xylosoxysdansi DSM 2402, Achromohacter xylosoxydans DSM 2783, Pseudomonasputida NCIB 10521, Pseudomonas putida NCIB 8176, precum și cu descendenții și mutanții acestora, de preferință cu Pseudomonas acidovorans DSM 4746.

Microorganismele din specia Pseudomonas acidovorans DSM 4746 au fost depuse la 25 iulie 1988 la Colecția Germană de Microorganisme și Culturi Celulare GmbH, Mascheroderweg lb, D-3300 Braunschweig .

Microorganismele din specia Achromobacter xylosoxydans DSM 2402 și DSM 2783 sunt depuse, de asemenea, în Institutul menționat și au fost deja descrise în EP-A 152948.

Microorganismele din specia Pseudomonas putida NCIB 10521 și NCIB 8176 sunt depuse la Național Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB98DC , Scoția.

în mod obișnuit înainte de transformarea propriu-zisă se realizează, atât cultivarea, cât și inducția microorganismelor cu acid nicotinic.

De preferință, cultivarea și inducția are loc cu acid nicotinic ca unică sursă de carbon, azot de energie.

înainte de adăugarea substratului (acidul pirazincarboxilic) microorganismelepot fi recoltate cu ajutorul unor procedee obișnuite și resuspendate în mediu proaspăt sau substratul (acidul pirazincarboxilic) poate fi adăugat direct la microorganismele în mediul inițial de creștere.

Pentru procedeul propriu-zis suspensia de celule se reglează în mod adecvat la o densitate optică la 650 nm, de 1 până la 100, de preferință de 10 până la 30.

Atât pentru cultivare, cât și pentru transformarea propriu-zisă se pot folosi toate mediile obișnuite din domeniul de specialitate.

De preferință, se folosește mediul, a cărui compoziție este indicată în tabelul 1.

Substratul poate fi adăugat în mod continuu sau discontinuu (substratul fiind acidul pirazincarboxilic).

în mod adecvat adăugarea de substrat are loc în așa fel încât, concentrația de substrat să nu depășească 20% în greutate, de preferință 5% în greutate. în mod obișnuit transformarea acidului pirazincarboxilic și/sau a sărurilor sale în acid 5-hidroxipirazincarboxilic și/sau la sărurile sale se face cu celule în repaus.

în mod adecvat transformarea se face în condiții aerobe la o valoare a pH-ului de 4,0 până la 10,0 de preferință la o valoare a pHului de 6,0 până la 8,0.

Temperatura se află în mod adecvat între 10 și 60°C, de preferință între 15 și 45°C.

Produsul se obține după un timp de transformare obișnuit de 4 până la 100 h, prin acidularea soluției lipsite de celule, care duce la precipitarea sa și apoi, precipitatul se prelucrează prin metode de prelucrare obișnuite în domeniul de specialitate respectiv, în cazul sării de sodiu al acidului 5-hidroxipirazincarboxilic, produsul precipită chiar în timpul transformării.

Se dau în continuare două exemple de realizare a invenției:

Exemplul 1. Pseudomonas acidovorans DSM 4746 a fost cultivat într-un mediu de săruri minerale (tabelul 1) cu un adaos continuu de nicotinat de sodiu (0,6 g/l/h) într-un fermentator la pH=7,0 și la o temperatură de 30 °C până la o densitate optică de 10 la 650 nm.

Apoi celulele au fost separate prin centrifugare și au fost resuspendate în 2 1 dintr-o soluție, conținând 1 mol (146 g) de sare de sodiu a acidului pirazincarboxilic, pH=7,0.

Densitatea optică la 650 nm a fost apoi de 20.

După un timp de incubare de 16 h în condiții aerobe la/?H=770 și o temperatură de 30°C, nu s-a mai putut detecta vreun educt, cu ajutorul spectroscopiei în UV. O parte din sarea de sodiu a acidului 5-hidroxipirazincarboxilic a cristalizat deja în aceste condiții de cercetare. Produsul precipitat a fost centrifugat împreună cu biomasa.

Sedimentul format a fost apoi resuspendat în 500 ml apă și recentrifugat din nou.

Supernatanții lipsiți de celule au fost unificați și concentrați cu un evaporator rotativ până la 300 ml, și răciți la 0°C. Cristalele formate au fost filtrate și uscate. în total s-au putut izola 0,67 mol (108g) de sare de sodiu a acidului 5-hidroxipirazincarboxilic, corespunzător unui randament de 67 % față de sarea acidului pirazincarboxilic introdus.

Exemplul 2. Pseudomonas acidovorans DSM 4746 a fost atras într-un mediu de săruri minerale (tabelul 1) cu un adaos continuu de nicotinat de sodiu (0,6 g) într-un fermentator lapH = 7,0 și la o temperatură de 30°C până la o densitate optică de 10 la 650 nm.

Apoi, celulele au fost separate prin centrifugare și resuspendate în 100 ml dintr-o soluție conținând 0,056 mol (7,9 g) sare de amoniu a acidului pirazincarboxilic, cu pH = 7,0.

Densitatea optică la 650 nm a fost apoi 20. După un timp de incubare de 24 h în condiții aerobe la pH = 7,0 și la o temperatură de 30°C, nu s-a mai putut detecta vreun educt cu ajutorul spectroscopiei în UV.

Apoi, supernatantul lipsit de celule a fost acidulat cu acid sulfuric concentrat până la un pH de 2,0 pentru a precipita acid 5hidroxipirazincarboxilic. Apoi, suspensia a fost răcită la 4°C și filtrată. Reziduul de la filtrare a fost spălat de 2 ori cu 10 ml apă și uscat.

în total s-a putut izola 0,054 mol (7,56 g) de acid 5-hidroxipirazincarboxilic, corespunzând la un randament de 96, față de sarea de amoniu a acidului pirazincarboxilic folosită. Conținutul de acid 5-hidroxipirazin- carboxilic determinat cu ajutorul HPLC a fost de peste 90%.

6

Tabelul 1. Compoziția mediului de săruri minerale

- MgCl, . 6H₂0........................................................0,8 g/1;

- CaCl₂..................................................................0,16 g/1;

- N^SO,................................................................0,25 g/1;

- KH₂PO₄...............................................................0,4 g/1;

- NaJIPO,..............................................................0,9 g/1

- SLF....................................................................1 ml/1;

- FeEDTA........................... 15ml/1.

Compoziția elementelor nedozabile (SLF) în mediul de săruri minerale

- KOH.................................................................15g/1;

- EDTANa,. 2H₂0.................................................100g/1;

- ZnSO₄.7H₂O.........................................................9g/1;

- MnCl₂.4H₂O.........................................................4g/1;

- H₃BO₃.................................................................2,7 g/1;

- CoCl . 6H₂0.........................................................1,8 g/1;

- CuCl₂ . 2H₂0........................................................1,5 g/1;

- NiCl₂ ,6H₂0..........................................................0,18 g/1;

- Na₂MoO₄ . 2H₂0....................................................0,2 g/1.

Compoziția lui FeEDTA

- EDTA Na, . 2H₂0..................................................5 g/1;

- FeSO₄ . 7H₂0........................................................2 g/1.

(pH-ul soluției a fost reglat la 7,0)

Claims

Revendicări

1. Procedeu microbiologic pentru 35 prepararea acidului 5-hidroxipirazincarboxilic și/sau a sărurilor acestuia, caracterizat prin aceea că acidul pirazincarboxilic și/sau sărurile acestuia sunt transformate cu ajutorul microorganismelor, care se dezvoltă cu acidul 40 nicotinic și/sau sărurile sale cu unică sursă de carbon, azot și energie, în acidul 5hidroxipirazincarboxilic și/sau sărurile sale, ultimul acumulându-se în mediu.
2. Procedeu, conform revendicării 1, 45 caracterizat prin aceea că, transformarea se efectuează cu microorganisme din speciile Pseudomonas și/sau Achrobacter și/sau Bacillus și/sau Azorhizobium și/sau Sarcina (

și/sau Mycobacterium.
3. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că transformarea se efectuează cu microorganisme din specia Pseudomonas acidovorans DSM 4746 sau cu descendenți sau mutanții acestora.
4. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că transformarea se efectuează cu microorganisme din specia Pseudomonas putida NCIB 10521 și/sau cu microorganisme din specia Pseudomonas putida NCIB 8176 sau cu descendenți sau mutanții acestora.
5. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că transformarea se efectuează cu microorganisme din specia Achromobacter xylosoxydans DSM 2402 și/sau cu microorganisme din specia Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 sau cu descendenți și mutanții acestora.
6. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că transformarea are loc cu un adaos de substrat în mod continuu 5 sau discontinuu astfel, încât, concentrația de substrat să nu depășească 20% în greutate.
7. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că transformarea se efectuează în condiții aerobe la un pH de 4,0 până la 10,0 și la o temperatură de 10 până la 60°C.