JPH0216998A - １２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−２０α−カルボン酸及び／又はその塩の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 アルカリゲネス属に属する細菌による１２α−ヒドロキ
シプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−２０α−カル
ボン酸及び／又はその塩の製造法に関し、詳しくはＩ２
α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−
２０α−カルボン酸及び／又はその塩を生産し得るアル
カリゲネス属に属する細菌を、デオキシコール酸及び／
又はその塩を含む培地に培養して上記目的物質を得るに
際し、ｔＩＮ質を含む栄養源を断続的もしくは連続的に
加えて流加培養することにより、１２α−ヒドロキシプ
レグナ−１゜４−ジエン−３−オン−２０α−カルボン
Ｉｌび／又はその塩を効率良く得るものである。

〔従来の技術〕

アルカリゲネス属に属する細菌を培養して１２α−ヒド
ロキジプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−２０α−
カルボン酸及び／又はその塩を得る方法として、特開昭
５８−１３４９９９号が知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

この培養法に於いては、目的物質を生産させる際、培養
中に１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４ジエン−３−
オン−２０α−カルボン酸の１２位がケトン化したプレ
グナ−１，４−ジエン−３，１２−ジオン−２０α−カ
ルボン酸（副産物）が多量に蓄積すると共に目的物質で
ある１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３
−オン−２０α−カルボン酸の収率も劣化する等の難点
がある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は上記難点を解消すべく鋭意検討を重ねた結
果、１２α−ヒドロキシプレグナ−Ｌ４ジエン−３−オ
ン−２０α−カルボン酸及び／又はその塩を生産し得る
アルカリゲネス属に属する細菌を培養するに際し、培地
中に糖質を含む栄養源を断続的もしくは連続的に加え流
加培養することにより、副産物であるプレグナ−１，４
−ジエン３．１２−ジオン−２０α−カルボン酸の生成
を抑制することを可能とすると共に目的物である１２α
−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−２
０α−カルボン酸及び／又はその塩を効率良く得ること
が出来ることを知り本発明を完成した。

即ち本発明は、１２α−ヒドロキシプレグナ−１゜４−
ジエン−３−オン−２０α−カルボン酸及ヒ／又はその
塩を生産し得るアルカリゲネス属に属する細菌をデオキ
シコール酸及び／又はその塩を含む培地に培養して１２
α−ヒドロキシプレグナ−１４−ジエン−３−オン−２
０α−カルボン酸及［’／又はその塩を生産するに際し
、糖質を含む栄養源を断続的もしくは連続的に加え、流
加培養することを特徴とする１２α−ヒドロキシプレグ
ナ−１，４ジエン−３−オン−２０α〜カルボン酸及び
／又はその塩の製造法である。

以下、本発明を詳述する。

先ず本発明に用いられる微生物としては、１２αヒドロ
キシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン２０α−カル
ボン酸及び／又はその塩を生産し得るアルカリゲネス属
に属する菌株であるならば何れを用いても良く、例えば
アルカリゲネス・フェカリスに−１等が具体例として挙
げられる。

上記アルカリゲネス・フェカリスに一１株は土壌より分
離して得た菌株で、該菌株の菌学的性質は以下の通りで
ある。

（注１）：生理学的性質において、＋、士及び−は次の
ことを意味する。

＋・・・その性質又はその生成あり ±・・・その性質又はその生成の有無が判定し難い ・・・その性質又は生成なし く注２）：ヒュー・アンド・ライフソン培地の炭素源を
それぞれ糖類１〜１５と代えた培地での菌によるＩ！類
からの酸の生成及びガス＋・・・酸の生成又はガスの発
生あり ±・・・酸の生成又はガスの発生の有無が判定し難い ・・・酸の生成又はガスの発生なし 上記の表に示した菌学的性質に基づき、アルカリゲネス
・フェカリスに一１菌株は、桿菌であること、周鞭毛を
有していること、ダラム染色が陰性であることなどの顕
微鏡的所見並びにオキシダーゼ反応及びカタラーゼ反応
がともに陽性であること、好気性であること、Ｏ−Ｆテ
ストの結果が酸化的（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ）であること
などの生理学的性質からパージエイズ・マニュアル・オ
ン・デイターミネイティブ・バタテリオロジー第７版及
び第８版に基づき、アルカリゲネス属に属する細菌であ
ると同定した。さらにゼラチンを液化しない点、ミルク
がアルカリ性となる以外に変化しない点及び脱窒反応が
ない点から、アルカリゲネス属のフェカリス種に属する
細菌であると判定した。

なおアルカリゲネス・フェカリスに−１は、工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１００８４号（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−１００８４）として寄託されている。

次に上記１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン
−３−オン−２０α−カルボン酸及び／又はその塩を生
産し得るアルカリゲネス属に属する細菌を、デオキシコ
ール酸及び／又はその塩を含む培地に培養することによ
り行なう。

本発明に用いられる培地としては、上記デオキシコール
酸及び／又はその塩を１〜２０χ（Ｗ／Ｖ）、好ましく
は１〜１０χ（Ｗ／Ｖ）程度含み、かつ前記微生物の利
用出来る窒素源、炭素源、無機塩類、ビタミン類等を適
宜含有させた液体培地が通常用いられる。

又、本発明に於ける流加培養時に、該培地に連続的もし
くは断続的に添加する糖質を含む栄養源としては、糖質
、更に必要に応じて窒素源、無機塩類、ビタミン類等を
含有させたものが用いられる。

−Ｊ二記した糖質としては、グルコース、グリセロール
等が挙げられ、窒素源としてはペプトン、アミノ酸等の
有機窒素源、硫安、硝安、硝酸塩等の無機窒素源等が用
いられ、炭素源としてはグルコース、シュークロース等
が用いられ、無機塩類としてはリン酸１カリ、リン酸２
カリ、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、モリブデン酸ナトリ
ウム等が挙げられ、又ビタミン類としては酵母エキス等
が用いられる。

流加培養は、発酵槽内の培養液に対し、培養液中の糖質
濃度として０．００１χ（ｗ／ｖ）以上、好ましくは０
．０１χ（ｉｙ／ｖ）以上となるように糖質を含む栄養
源を連続的もしくは５分間以上の間隔で断続的に加えて
流加培養を行なう。又、流加培養の開始時期としては、
発酵生産中何れの時期でも良いが、溶菌が生じ易い培養
開始後２０時時間以降が望ましい。

培養方法としては、通常の振盪培養、撹拌培養、通気培
養等の適当な液体培養法で行ない、培養ｐＨ７〜１０、
培養温度２５〜３５°Ｃ１培養全期間１０時間〜７日間
程度培養を行なう。

培養終了物より、１２α−ヒドロキシプレグナ１．４−
ジエン−３−オン−２０α−カルボン酸及び／又はその
塩を採取する手段としては、公知の採取方法例えば該培
養終了液より菌体を除去した後、酸性状態とすることに
より１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３
−オン−２０α−カルボン酸を沈澱させ、この沈澱物を
遠心分離もしくは濾過等により分離、採取することが出
来る。更に、得られた目的物を、例えば水／エタノール
等の溶媒を用いて再結晶することにより容易に高純度の
１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オ
ン−２０α−カルボン酸及び／又はその塩を採取するこ
とが出来る。

又、１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン３−
オン−２０α−カルボン酸は水溶液中でＮａ０ＩＩ等の
塩基性物質で中和した後、減圧もしくは吸引等により乾
燥することにより目的とする酸の塩として採取すること
が出来る。

〔発明の効果〕

本発明の培養法によれば、プレグナ−１，４−ジエン−
３，１２−ジオン−２０α−カルボン酸（酸化物）の生
成を確実に抑制することが出来、高純度の１２α−ヒド
ロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−２０α−
カルボン酸及び／又はその塩を効率良く得ることが出来
るのであって、本発明は産業上極めて有意義である。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を具体的に示す。

実施例１ デオキシコール酸２χ（−／ν）、水酸化ナトリウム０
．２３Ｘ（ｗ／ｖ）、リン酸１カリウム０．０５χ（ｗ
／ｖ）、リン酸２カリウム０．３χ（ｗ／ｖ）、硫酸マ
グネシウム０．００７５２（ｗ／ｖ）、硝酸アンモニウ
ム０．２２ｈ／ｖ）、酵母エキス０．０５χ（ｗ／ｖ）
、グルコース０．０５χ（ｗ／ｖ）、ペプトン０．１χ
（ｗ／ν）、硫酸第１鉄１０ｐｐｍ　、硫酸マンガン２
．５　ｐｐｍ　、モリブデン酸ナトリウム０．５ｐｐｍ
、アデカノール０．ＯＩχ（ｗ／ｖ）を含む培地（ｐＨ
８，５）１００　ｍｌを５００　ｍＺ容振盪フラスコに
分注し、１２０°Ｃ１１０分間加圧殺菌した後、冷却し
、これにアルカリゲネス・フェカリスに−１〔微工研菌
寄第１００８４号（ＦＥＲＭＰ−１００８４）　）を予
じめ肉汁寒天斜面培地で培養したものより１白金耳採取
したものを接種し、２８°Ｃ１２４時間振盪培養し種培
養液を得た。得られた種培養液の全景を、上記と同一組
成の培地２１を入れた３１容ミニジヤーに接種し、２８
°Ｃ１撹拌速度３００ｒｐｍ、通気量０．５シシｍ、の
条件で培養を行ない、培養開始後２４時時間上り予じめ
１２０″Ｃ１１０分間殺菌後、冷却した５％グルコース
含有水溶液を１０＋＋／／ｈｒで連続的に流加しつつ全
体で５６時間流加培養した。

この間、第１表に示す如＜　２４ｈｒ、３２ｈｒ、４０
ｈｒ、　４８ｈ「経過時に試料（本発明）を採取し分析
を行なった。なお対照は、上記連続流加培養経過時に、
５％グルコース水溶液を添加しない他、全く同一な培養
条件で培養を行なったものである。

（本頁以下余白） 第１表の如く、本発明の１！質を含む栄養源を加え流加
培養したものは、対照に比ベプレグナー１４−ジエンー
３，１２〜ジオン−２０α−カルボン酸（酸化物）の生
成が著しく少なく、かつ目的とする】２α−ヒドロキシ
プレグナ−１，４−ジエン−３オン−２０α−カルボン
酸の収率も著しく向上することが認められた。

実施例２ デオキシコール酸２χ（ｗ／ｖ）、水酸化ナトリウム０
．２３χ（ｗ／ｖ）、リン酸１カリウム０．０５χ（ｗ
／ｖ）、リン酸２カリウム０．３χ（ｗ／ｖ）、硫酸マ
グネシウム０．００７５χ（ｗ／ｖ）、硝酸アンモニウ
ム０．２χ（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．０５χ（ｗ／ｖ
）、グルコース０．０５χ（ｗ／ｖ）、ペプトン０．１
χ（−／ν）、硫酸第１鉄１０ｐｐｍ　、硫酸マンガン
２．５ｐｐｍ、モリブデン酸ナトリウム０．５ｐｐｍ、
アデカノール０．０１χ（ｗ／ｖ）を含む培地（ｐＨ８
，５）１００ＴｎＩを５０〇−容振盪フラスコに分注し
、１２０°Ｃ１１０分間加圧殺菌した後冷却し、これに
アルカリゲネス・フェカリスに−１［微工研菌寄第１０
０８４号（ＰＥＲＭ　Ｐ−１００８４）　］を予じめ肉
汁寒天斜面培地で培養したものより１白金耳採取したも
のを接種し、２８°Ｃ１２４時間振盪培養し種培養液を
得た。得られた種培養液の全量を、上記と同一組成の培
地２Ｐを入れた３Ｉ！、容ミニジャーに接種し、２８°
Ｃ１撹拌速度３００ｒｐｍ、通気量０．５νｖｍ、の条
件で培養を行ない、培養開始後８時間目より予じめ１２
０°Ｃ１１０分間殺菌した、デオキシコール酸２０！（
ｕ／ｖ）、水酸化ナトリウム２，１８％（賀／Ｖ）、リ
ン酸１カリウム０．０５χ（ｗ／ｖ）、リン酸２カリウ
ム０．３χ（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム０．００７５
％（−／ν）、硝酸アンモニウム０．４χ（ｗ／ｖ）　
、酵母エキスＯ，Ｉ　！（ｗ／ｖ）、グルコース０．１
χ（ｉｖ／ｖ）、ペプトン０．２χ（ｗ／ｖ）、硫酸第
１鉄ＩＱｐｐｍ　、硫酸マンガン２．５ｐｐｍ、モリブ
デン酸ナトリウムｏ、ｓｐｐｍの組成よりなる流加液を
ＩＯｍ／ｈｒで２８時間目まで連続的に、流加した後、
流加を２０時間停止し培養４８時間目より、予じめ１２
０°Ｃ１１０分間殺菌後冷却した５％グルコース含有水
溶液を１０ｍｆ／ｈｒで再度、連続的に流加しつつ、全
体で７２時間流加培養した。この培養液を集め遠心分離
により菌を除去した後、得られた培養液上清に塩酸を加
えることによりこの培養液上清のｐｔｒを３とした。生
じた沈澱を濾過し、十分水洗後、乾燥させることにより
、１２αヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オ
ン２０α−カルボン酸を６５．７６ｇ得た。上記１２α
ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン２０α
−カルボン酸をメタノールに５χ（ｗ／ｖ）濃度となる
ように溶解した後、１０μｆｆｉをＴＳＫｇｅｌ　００
Ｓ−８０Ｔ台カラムを備えたＨＰＬＣ（東ソー社製、Ｃ
ＣＰＭ）に注入した。移動相としてｐＨ４，０に調整し
た７３％メタノール水溶液（ν／ν）を流速ｆｍｌ／ｓ
ｉｎで流し、検出をＲｒ検出器で行った。得られたＨＰ
ＬＣにおける各ピークの面積比を積分針（ＳＩＣ社製、
クロマトコーダ１１）で求め、この面積比から１２α−
ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−２０
α−カルボン酸の純度を求めたところ９７．４８％であ
った。

同様にプレグナ−１，４−ジエン−３，１２−ジオン２
０α−カルボン酸は、０，０６％であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オ
   ン−２０α−カルボン酸及び／又はその塩を生産し得る
   アルカリゲネス属に属する細菌をデオキシコール酸及び
   ／又はその塩を含む培地に培養して１２α−ヒドロキシ
   プレグナ−１，４−ジエン−３−オン−２０α−カルボ
   ン酸及び／又はその塩を生産するに際し、糖質を含む栄
   養源を断続的もしくは連続的に加え、流加培養すること
   を特徴とする１２α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジ
   エン−３−オン−２０α−カルボン酸及び／又はその塩
   の製造法