JPS62244389A - Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はＤ　１．−３−フェニル乳酸を原料として微生
物の作用によりＬ−フェニルアラニンを製造する方法に
関する。し−フェニルアラニンは甘味料の原料その他に
広い用途をもつ有用な物質である。

従来の技」Ｌ 微生物を利用したし一フェニルアラニンの製造法として
は、前駆体としてフェニルピルビン酸を用いる方法がを
名で、これについて多くの特許出願がなされている。し
かしながら、フェニルピルビン酸は比１咬的高価であり
、また化学的に不安定であるため１、これを用いて工業
的な生産を行うことは不利である。

一方、化学的に安定で、より安価に入手し得るＤＬ−３
−フェニル乳酸を原料とする方法も種々提案されている
。例えば、アミン基供与体として、尿素、アミノ酸角の
存在下、ブレビバクテリウム属の微生物を用いてＬ−フ
ェニルアラニンを製造する方法〔醗酵工学会誌　５３４
４３　（１９７５）　）　、シュートモナス尿、の微生
物を用いて前駆物質添加醗酵による方法〔日本農芸化学
会誌　４Ｂ　２９７　（１９７４）　）、アミノ酸類の
アミノノン供与体の存在下、シェードモリス属、エアロ
バクター属、フラボバクテリウム属、セラチア属、エソ
シエリヒア属およびコリふハクテリウノ、属の微生物を
用いて製造する方法〔日本農芸化学会誌　４８３５１（
１９７４））　、シｓ　−ｔ’モナス属、アグロバクテ
リウム属、エソシェリヒア属、セラチア属、スタフィロ
コッカス属、バチルス属、コリネバクテリウム属、アル
スロバクタ−属およびブレビバクテリウム属の細菌を用
いて培養法により製造する方法〔特開昭５２−７９０８
０号公報〕およびンゾサソ力ロミセス属、ビヒア属、ク
リソ゛１・二２ソカス属、キャンプイタ属、トルロフ”
シス属および１：′Ｉドトルラ属の酵母を用いて培養法
により製造する方法〔特開昭５２−９６７９２号公報〕
等が挙げられる。これらＯＬ〜３−フェニル乳酸をＬ−
フェニルアラニンの製造原料とすることは工業的に有利
であるが、いずれも未だ反応速度的に充分とは言い雅い
。

ｊ口外ノと卓−党 かかる状、：Ｓｌにおいて、本発明者らは鋭意検討を重
ねた結果、以Ｆに示す特定の属に属する微生物を０Ｌ−
３−フェニル乳酸を添加した培地で培養するか、あるい
はこれら微生物体もしくはその処理物をアミノ基供与体
の存在下、Ｉｌｔ、−３−フェニル乳酸に作用さセるこ
とにより、効率よくＬ−フェニルアラニンを生成しく４
％ることを見出した６本発明はこの知見に基づいてなさ
れたものである。

すなわち、本発明は、ｆａ＋　　ミコバクテリウム（Ｍ
ｙｃｏｂａｃＬｅｒｉｕｍｕ）属、エンテロバクタ−（
Ｅｎｔｅｒｏ−ｂａｃｔｅｒ）　Ｍ、エルウィニア（Ｅ
ｒｗｉｎｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）　属
、クレブシラ（Ｋｌｅｂｓｉｌｌａ）属、ミクロコツカ
ス（Ｍｉｃｒｏｃｕｃｃｕｓ　）属、ノカルジア（Ｎｏ
ｃａｒｄ　ｉａ）属、グルコノバクタ−（ＧＩｕｃｏｎ
ｏｂａｃＬｅｒ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃ
ｃｕｓ）　属、アルカリゲネス（＾ＩｃａｌｉＲｅｎｅ
ｓ）　　属、ミコブラーナ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）属お
よびハンセヌーラ（Ｈａｎｓｅｎｕ　ｌａ）属よりなる
群から選ばれた微生物の１種または２種以上を、ＤＬ−
３−フェニル乳酸を添加した培地で培養し、培養法から
１．−フェニルアラニンを取得すること、または（ｂｌ
　　前記微生物の培養物もしくはその処理物を、水性媒
体中で−７ミノ基供与体の存在下、Ｉ）１．−３−フェ
ニル乳酸を作用させてし一フヱニルアラニンを生成せし
めること、を要旨とするものである。

−３−握−ｐ」遜−的説明 本発明に用いられる微生物は、具体的には例えば、ミコ
バクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａ−ｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ＩＦＯ０３１５４、エ
ンテロバクタ−°エアロゲ不ス（ｒ！ｎｔｅｒｏｂａｃ
ｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｏｓ）ＪＡＭ＋２．３４８　、
エンテロバクタ−・クロアソセ−（Ｅｎｔ−ｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）ＪＡＭ　１６２４、エルウ
ィニア・力ロトポーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏ
ｖｏｒａ）［ＦＯ３３８０％　プロテウス・ブルガリス
（ｒ’ｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＪＡＭ　１０
２５、クレブシラ・ニエーモイエ（Ｋｌｅｂｓｉｌｌａ
　Ｐｎｅｕ＋ａｏｆｅ）ＡＴＣＣ９６２１、ミクロコツ
カス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃ−ｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅ
ｕｓ）ＡＴＣＣ０３８３およびＩＦＯ１２７０８、ノカ
ルディア・エリスロポリス（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｅｒｙ
Ｌｈｒｏ−ｐｏｌｉｓ）ＩＦＭ　１３２　、ノカルディ
ア・ルブラ（Ｎｏｃａｒｄ−ｉａ　ｒｕｂｒａ）　ＩＦ
Ｍ　１８　、ノカルディア・コラリーナ（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ　ｃｏｒａｌｌｉｎａ）ＩＦＭ　２５、グルコノバ
クタ−・サブオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔａ
ｒ　５ｕｂｏｘｙｄａｎｓ）［ＡＭ　１，８２９．１′
１ド］、カス・イクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕ
ｉｉ）　ＩＦＭ　１５２、ロドコッカス・ロドニ（Ｒｈ
ｏｄｏｃ−ｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｎｉｉ）ＩＦＭ　１４
８　、、アルカリゲネス・エントロパス（八Ｉｒ、ａｌ
ｉ）（ｅｎｅｓ　ｅｎｔｒｏｐｈｕｓ）ＩＡＭ　１２３
０５、ミコプラナ・ジモルフｙ　（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ
　ｄｉｍｏｒｐｈａ）＾ＴＣＣ４２７９およびハンセヌ
ラ・ミソ（ｔｌａｎ３ｏｎｕｌａ　ｍ１ｓｏ）ＩＰｏ　
０１４６等を挙げることができるが、これらの中特にク
レブシラ・ニューモイエＡＴＣＣ９６２１、エンテロバ
クターエアロゲネス　ｒＡＭ　１２３４８、エルウィニ
ア・カロトボーラ　ＩＦｏ　３３８０　、エンテロバク
タ−・クロアノセー　■へＭ　１６２４　、アルカリゲ
ネス・エントロパスＩＡＭ　１２３０５　　およびプロ
テウス・ブルガリス＋Ａ？！　１０２５等の微生物の使
用が好ましい。

これらの微生物はいずれも公知のものであり、八ｍｅｒ
ｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ（八ＴＣＣ）、　財団法人発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）　、東京大学応用微生物研究所（ＪＡＭ）　、千
葉大学生物活性研究所（ｒＦＭ）等の保存；穴間をＩｎ
シて容易に入手することができる。

本発明を実施するに当っては、炭素源としてネ１！！類
、廃１ノＭ　’、９．°頻、デンプン分解液、酢酸など
の有機ｈｑ　ｒｌ属、エタノールなどのアルコール蛸、
ローパラフィンなどの炭化水素類、窒素源として硝酸ア
ンモニラＪ１、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムな
どの無機塩類のほかにアミノ酸塩類、尿素、ペプ［・ン
、およびカリウムならびにリン酸分としてリン酸−水素
カリウム、リン酸二水素カリウム等の成分を適宜含有す
る培地が使用できる。これら旋素源、窒素源およびリン
酸塩の培地中の濃度は、通常それぞれ１〜１０重量％、
０．１〜０．５型理％および０．１　＝０．５　’ｆＪ
（＠％が適当である。これらの他に該培地には微Ｖのマ
グ名シウム、鉄、カルシウム、マンガン、亜鉛などの無
機金属塩および生長促進物′６としてビタミン類や肉エ
キス、酵母エキス、カザミノ酸などを添加してもよい。

本発明では、Ｆ記培地に０Ｌ−３−フェニル乳酸を通常
、０．１〜５重量％添加して前記微生物の培養を行うこ
とにより、Ｌ−フェニルアラニンを培養液中に生成、Ｈ
；積させることができる。培養温度としては２５〜３５
°Ｃ，ｐＨは６〜８、培養期間は２〜４０程度が適゛１
１である。

培８　？（９，からし−フェニルアラニンを取得するに
は通常の方法、すなわち遠心分離あるいは除菌フィルタ
ーによる濾過等の操作により培養液から菌体を除いた濾
液について、 ■　濾液のＩ’　Ｉｆ　ヲＬ−フェニルアラニンの等電
点に調整してし一フェニルアラニンを析出させる。

■　イオン交換樹脂を用いてし一フェニルアラニンを吸
着あるいは溶出させる。

■　イオン交換膜等を利用して電気的にし一フェニルア
ラニンを分離する。

■　有機？８削を添加してＬ−フェニルアラニンを結晶
化させる。

■　ＩＩｉ液に金属イオンを添加して難溶性の金属塩と
してし−フェニルアラニンを析出させる。

等の方法を採用することができる。

また、本発明では以上の培養法によるほかに、前記培地
を使用して得た微生物体もしくはその処理物（微生物体
の破砕物または微生物体より分離抽出した酵素、あるい
はこれらの固定物等）を水性媒体中でアミノ基供与体の
存在下、Ｄ　１．−３−フェニル乳酸に作用させてし一
フェニルアラニンを生成させてもよい。微生物体として
は微生物体そのもの、ならびに微生物体を含む培養液が
用いられる。

反応は、水性媒体中、旧、−３−フェニル乳酸０．５〜
５０重量％（スラリー状であってもよい）、微生物体ま
たはその処理物０．０１〜１０重量％（微生物体換ｎ）
、これにアミノ基供与体として各種アミノ酸、アンモニ
ウム塩、尿素などをロシー３−フェニル乳酸に対して１
〜２倍モル加え、温度２０〜６０℃、Ｐ１１６〜１１の
条件で行うのが適当であり、反応時間は０．１〜１００
時間程度である。水性媒体としては例えば、生理食塩水
、リン酸バッファーが使用できる。

また、反応液からし一フヱニルアラニンを取得する方法
としては前記した方法が同様に採用できる。

尚、上記’＋Ｙｌ′に生物の培養物を得るに際して、酵
素活性を高めるために０．０５〜０．２重量％程度の０
Ｌ−３−フェニル乳酸を添加することもできる。

次に実施例により本発明をさらに詳しく説明する。

尚、下記実施例中、％は重量％である。

実施例１〜１７ グルコール　５χ、肉エキス０３０５χ、Ｌｌ’ルタミ
ン西（ナトリウム１χ、硝酸アンモニウム　ＩＸ　、リ
ン酸−水素カリウム０．１Ｘ　、硫酸マグネシウム０．
０５Ｘ、塩化第二鉄０．００５χ、炭酸カルシウム２χ
および０Ｌ−３−フェニル乳酸０．３７％から成る培ｎ
　？＆（ＰＨ７，０）１０ｍβを試験管に分注し１２０
℃で２０分殺菌した後、第１表に示す閑株を１白金耳植
菌し、３０℃で２日間培養した。培養終了後遠心分離、
除菌フィルターにより除菌し、高速液体クロマトグラフ
ィーによりろ液中のし一フェニルアラニンを分析し第１
表に示す結果を得た。

第　　１　　表 実施例１８〜２Ｉ ゲルコール２χ、ペプトン０．５χ、肉エキス０．５χ
、酵ハトエキス０．３％、塩化アンモニウム０．５％、
塩化ナトリウノ、０．５χ、リン酸水素二カリウム　０
．０５２、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１χおよ
び旧７．３−フェニル乳酸０．２％から成る培養液（Ｐ
　１１７　、５　）１００ｍ　ｌを三角フラスコに採り
、１２０℃、２０分間殺菌した後、第２表に示す菌株を
１白金耳植菌し、３０℃で２日間培養した。培養後、遠
心分離し、リン酸バッファーで洗浄して得た湿菌体を、
グルコース１％、ｌ）　Ｌ　−３−フェニル乳酸０．５
％、塩化アンモニウム０．１％を含有するアンモニアに
より予めＰＩ＋７．５に調整した反応液に懸濁し、３０
°Ｃで２日間反応を行った。反応後反応液中のし一フェ
ニルアラニンのＶを高速液体クロマトグラフィーにて分
析し第２表に示す結果を得た。

第　　２　　表

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （ａ）ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
   ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）
   属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、プロテウス（
   Ｐｒｏｔｅｕｓｕ）属、クレブシラ（Ｋｌｅｂｓｉｌｌ
   ａ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏ−ｃｏｃｃｕｓ）
   属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、グルコノバ
   クター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドコッカ
   ス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａ
   ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ミコプラーナ（Ｍｙｃｏｐ
   ｌａｎａ）属およびハンセヌーラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
   ）属よりなる群から選ばれた微生物の１種または２種以
   上を、ＤＬ−３−フェニル乳酸を添加した培地で培養し
   、培養液からＬ−フェニルアラニンを取得すること、ま
   たは（ｂ）前記微生物体もしくはその処理物を、水性媒
   体中でアミノ基供与体の存在下、ＤＬ−３−フェニル乳
   酸に作用させてＬ−フェニルアラニンを生成せしめるこ
   と、を特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造方法。