CZ279302B6

CZ279302B6 - Mikrobiologický způsob výroby kyseliny 5-hydroxy pyrazinkarboxylové

Info

Publication number: CZ279302B6
Application number: CS921885A
Authority: CZ
Inventors: Andreas Dr. Kiener
Original assignee: Lonza A.G.
Priority date: 1991-06-21
Filing date: 1992-06-19
Publication date: 1995-04-12
Also published as: RU2094461C1; HUT65850A; IL102071A; BG96511A; FI922125A0; IL102071A0; CA2069596A1; EP0519512A2; IE72211B1; FI922125A; SK188592A3; RO109865B1; KR930000688A; HU9202069D0; MX9202930A; ES2083623T3; US5273893A; CZ188592A3; AU658632B2; ATE134385T1

Abstract

Mikrobiologický způsob výroby kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové a/nebo jejích solí pomocí mikroorganismů zpracujících kyselinu nikotinovou a/nebo její soli.ŕ

Description

Způsob mikrobiologické výroby kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové

Oblast techniky

Vynález se týká nového způsobu výroby kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové a/nebo jejích solí pomocí mikroorganismů, zpracujících kyselinu nikotinovou a/nebo její soli, přičemž výchozí látkou je kyselina pyrazinkarboxylová a/nebo její soli.

V následujícím textu se pod pojmy kyselina nikotinová, kyselina pyrazinkarboxylová a kyselina 5-hydroxypyrazinkarboxylová rozumějí také jejich soli, jako jsou například jejich alkalické soli nebo amonné soli.

Dosavadní stav techniky

Kyselinu 5-hydroxypyrazinkarboxylovou lze použít například jako meziprodukt pro výrobu farmaceutických prostředků, jako například pro výrobu pyrazin-nukleosidových analogů s cytostatickým účinkem (M.Bobek, J.Heterocyclic Chem., 1991, 28, str. 1131).

Je známo, že se kyselina 5-hydroxypyrazinkarboxylová tvoří při metabolismu psů a lidí z pyrazinamidu přes kyselinu pyrazinkarboxylovou (J.Pharmacol. Exp. Ther., 1972, 180(2), 411-434).

Je popsán pětistupňový chemický způsob výroby kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové, při kterém se vychází například z furfurylglyoxalu (J. Heterocyclic Chem. 19, 1982, str. 402). Nevýhoda tohoto postupu však spočívá v tom, žé je nevhodný pro průmyslové měřítko.

Mikrobiologický způsob výroby kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové není až doposud znám.

Podstata vynálezu

Úkolem předloženého vynálezu je dát k použití jednoduchý, hospodárný a ekologický způsob výroby kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové.

Úkol byl vyřešen novým způsobem podle patentového nároku 1.

Podle vynálezu se kyselina pyrazinkarboxylová jako substrát přemění pomocí mikroorganismů, které rostou s kyselinou nikotinovou jako jediným zdrojem uhlíku, dusíku a energie, na kyselinu

5- hydroxypyrazinkarboxylovou. Tato kyselina se akumuluje v médiu.

Pro tento postup jsou vhodné v podstatě všechny mikroorganismy, které odbourávají kyselinu nikotinovou přes kyselinu

6- hydroxynikotinovou. Tyto mikroorganismy lze izolovat obvyklými mikrobiologickými postupy například z čisticích zařízeni pomoci kyseliny nikotinové jako růstového substrátu. Například lze použít takové mikroorganismy rodu Pseudomonas, Achromobacter, Bacillus, Azorhizobium, Sarcina a Mycobacterium, které jsou již popsány v EP-A 152 948. Reakci lze uskutečnit jak se směsmi, tak s čistými izoláty těchto mikroorganismů, sterilně nebo nesterilně.

Postup se provádí účelně s mikroorganismy druhu Pseudomonas acidovorans DSM 4746

Achromobacter xylosoxydans DSM 2402 Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 Pseudomonas putida NCIB 10521

Pseudomonas putida NCIB 8176 jakož i s jejich descendenty a mutanty, výhodně s Pseudomonas acidovorans DSM 4746.

Mikroorganismy druhu Pseudomonas acidovorans DSM 4746 byly uloženy 25. července 1988 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur s.r.o. (DSM), Mascheroderweg lb, D-3300 Braunschweig.

Mikroorganismy druhu Achromobacter xylosoxydans DSM 2402 a DSM 2783 jsou rovněž uloženy u výše jmenované instituce a jsou již popsány v EP-A 152 948.

Mikroorganismy druhu Pseudomonas putida NCIB 10521 a NCIB 8176 jsou uloženy u Národní sbírky průmyslových bakterií, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB98DC, Scotland.

Obvykle se před vlastní reakcí provádí jak kultivace, tak také indukce mikroorganismů pomocí kyseliny nikotinové. Výhodně se kultivace a indukce uskutečňuje pomocí kyseliny nikotinové jako jediného zdroje uhlíku, dusíku a energie.

Před přidáním substrátu kyseliny pyrazinkarboxylové mohou se bud’ mikroorganismy získat pomocí obvyklých dělicích postupů a resuspendovat v čerstvém médiu, nebo se substrát kyselina pyrazinkarboxylová přidává přímo k mikroorganismům v původním růstovém médiu. Pro vlastní postup se pak buněčná suspenze účelně upraví na hodnotu optické hustoty při 650 nm od 1 do 100, výhodně od 10 do 30.

Jako média se jak pro kultivaci, tak pro vlastní reakci používají média, obvyklá v oboru. Výhodně se používá médium, jehož složení je uvedeno v tabulce 1. Substrát kyselina pyrazinkarboxylová se přidává jednorázově nebo kontinuálně. Substrát se účelně přidává tak, aby koncentrace substrátu nepřesáhla 20 % hmotnostních, výhodně 5 % hmotnostních. Obvykle se přeměna kyseliny pyrazinkarboxylové a/nebo jejích solí na kyselinu 5-hydroxypyrazinkarboxylovou a/nebo její soli provádí s buňkami v klidu.

Reakce se účelně provádí za aerobních podmínek při hodnotě pH od 4 do 10, výhodně při hodnotě pH od 6 do 8. Teplota je účelně mezi 10 a 60 °C, výhodně mezi 15 a 45 ’C, Po obvyklé době reakce od 4 do 100 hodin se produkt vysráží okyselením bezbuněčného roztoku a získá se pomocí v oboru běžně užívaných metod zpracování. V případě sodné soli kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové se produkt vysráží již během reakce.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Pseudomonas acidovorans DSM 4746 se pěstuje v médiu, obsahujícím minerální soli (tabulka 1), za kontinuálního přidávání nikotinátu sodného (0,6 g/l/h) ve fermentoru při pH 7,0 a při teplotě 30 C až k optické hustotě 10 při 650 nm. Pak se buňky odstředí a resuspendují ve 2 1 roztoku, který obsahuje 1 mol (146 g) sodné soli kyseliny pyrazinkarboxylové, pH 7,0. Hodnota optické hustoty při 650 nm pak je 20. Po inkubační době 16 hodin za aerobních podmínek při pH 7,0 a teplotě 30 °C se již nedá prokázat pomocí UV-spekroskopie žádný edukt. Část vytvořené sodné soli kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové vykrystalizuje již za těchto podmínek pokusu. Vysrážený produkt se odstředí spolu s biomasou. Vytvořený sediment se pak resuspenduje v 500 ml vody a znovu odstředí. Bezbuněčné supernatanty se spojí a zahustí až na 300 ml pomocí rotačního odpařovacího zařízení a ochladí na 0 °C. Vytvořené krystaly se zfiltrují a vysuší. Celkově se získá 0,67 mol (108 g) sodné soli kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové. To odpovídá výtěžku 67 %, vztaženo na vnesenou sodnou sůl kyseliny pyrazinkarboxylové.

Příklad 2

Pseudomonas acidovorans DSM 4746 se pěstuje v médiu, obsahujícím minerální soli (tabulka 1), za kontinuálního přidávání nikotinátu sodného (0,6 g/l/h) ve fermentoru při pH 7,0 a při teplotě 30 °C až k optické hustotě 10 při 650 nm. Pak se buňky odstředí a resuspendují ve 100 ml roztoku, který obsahuje 0,056 mol (7,9 g) amonné soli kyseliny pyrazinkarboxylové, pH 7,0. Hodnota optické hustoty při 650 nm pak je 20. Po inkubační době 24 hodin za aerobních podmínek při pH 7,0 a teplotě 30 °C se již nedá prokázat pomocí UV-spektroskopie žádný edukt. Pak se bezbuněčný supernatant okyselí koncentrovanou kyselinou sírovou až na pH 2,0, aby se vysrážela kyselina 5-hydroxypyrazinkarboxylová. Pak se suspense ochladí na 4 °C a filtruje. Zbytek po filtraci se dvakrát promyje 10 ml vody a vysuší. Celkově se získá 0,054 mol (7,56 g) kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové. To odpovídá výtěžku 96 %, vztaženo na vnesenou amonnou sůl kyseliny pyrazinkarboxylové. Obsah kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové je pomocí HPLC větší než 90 %.

Příklad 3

Achromobacter xylosoxydans DSM 2738 se pěstuje ve čtyřech 500 ml Erlenmeyerových baňkách, obsahujících každá 200 ml média s minerálními solemi (tabulka 1), na třepacím zařízení při teplotě 30 °C. Jako zdroj uhlíku a energie se k médiu přidají 2 g/1 (13,7 mmol na litr) nikotinátu sodného. Po 36 hod. se biomasa odstředí a jednou se promyje ve stejném médiu bez kyseliny nikotinové. Pak se buňky resuspendují ve 100 ml stejného média, které obsahuje 35,3 g/1 (24,2 mmol) sodné soli kyseliny pyrazinkarboxylové. Hodnota optické hustoty buněčné suspenze je 20 při 650 nm. Po další 16 hod. inkubaci při 30 °C na třepacím zařízení se

-3CZ 279302 B6 v bezbuněčném supernatantu spektrofotometricky neprokáže žádná kyselina pyrazinkarboxylová. Koncentrace kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové je 36 g/1 (25,7 mmol) pomocí UV-spektroskopie. To odpovídá kvantitativnímu výtěžku, vztaženo na vnesenou kyselinu pyrazinkarboxylovou. Pro výpočet koncentrace kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové se použije molární extinkční koeficient 5' 603 M^-1 cm”·¹· při 308 nm, H₂0, pH 7,0.

Tabulka 1:

Složení média, obsahujícího minerální soli

- MgCl₂ . 6H₂O	0,8	g/1
Cacl2	0,16	g/1
	0,25	g/i
- kh₂po₄	0,4	g/i
- Na₂HPO₄	0,9	g/i
- SLF	1	ml/l
FeEDTA	15	ml/1

Složení stopových prvků (SLF) v médiu, obsahujícím minerální soli

- KOH	15	g/1
- EDTANa₂ . 2H₂O	100	g/i
- ZnSO₄ . 7H₂O	9	g/i
- MnCl₂ . 4H₂O	4	g/i
- h₃bo₃	2,7	g/i
CoCl₂ . 6H₂O	1,8	g/i
- CuCl₂ . 2H₂O	1,5	g/i
- NÍC1₂ . 6H₂O	0,18	g/i
- Na₂Mo0₄ . 2H₂O	0,2	g/i
Složení FeEDTA:
- EDTA Na₂ . 2H₂O	5	g/i
- FeSO₄ . 7H₂O	2	g/i

(pH roztoku se upraví na hodnotu 7,0)

Průmyslová využitelnost

Kyselinu 5-hydroxypyrazinkarboxylovou lze jako meziprodukt pro výrobu farmaceutických

použít například prostředků, jako

například pro výrobu pyrazin-nukleosidových analogů s cytostatickým účinkem.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Způsob mikrobiologické výroby kyseliny 5-hydroxypyrazinkarboxylové a/nebo jejích solí, vyznačující se t í m, že se kyselina pyrazinkarboxylová a/nebo její soli jako substrát přemění pomocí mikroorganismů rodů Pseudomonas a/nebo Achromobacter, které rostou s kyselinou nikotinovou a/nebo jejími solemi jako jediným zdrojem uhlíku, dusíku a energie, na kyselinu 5-hydroxypyrazinkarboxylovou a/nebo její soli, které se akumulují v médiu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se reakce provádí s mikroorganismy druhu Pseudomonas acidovorans DSM 4746 a/nebo s jejich spontánními mutanty.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se reakce provádí s mikroorganismy druhu Pseudomonas putida NCIB 10521 a/nebo s mikroorganismy druhu Pseudomonas putida NCIB 8176 a/nebo s jejich spontánními mutanty.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se reakce provádí s mikroorganismy druhu Achromobacter xylosoxydans DSM 2402 a/nebo s mikroorganismy druhu Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 a/nebo s jejich spontánními mutanty.
5. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se reakce provádí při jednorázovém nebo kontinuálním přidávání substrátu, tak aby koncentrace substrátu nepřesáhla 20 % hmotnostních.
6. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se reakce provádí za aerobních podmínek při hodnotě pH od 4 do 10 a při teplotě od 10 do 60 °C.