RO109707B1 - Anticorpi monoclonali, ai receptorului ige uman, procedeu de obtinere a acestora, metode de imunoanaliza, folosind acesti anticorpi si compozitie farmaceutica,ce ii contine - Google Patents

Description

Prezenta invenție se refera ia anticorpi monoclonali ai receptorului IgE uman, procedeu de obținere a acestora, metode de imunoanaliză, folosind acești anticorpi și compoziție farmaceutică, care îi conține.

Receptorul Fc de înaltă afinitate pentru imunogiobulina E (IgE). cunoscut ca BcERI, se găsește în mastocite și hazofile. Reticularea acestui receptor de către IgE și antigcn induce degranulare celulară și eliberarea mediatorilor pre formali, cum suni liislamina și scrolonina. Eliberarea acestor mediatori este cca care contribuie la starea alergică în care factorul de activare al sintezei leucotriene și plat clei este, de asemenea, sti mulat.

Prin urmare, 1‘cERl joacă un rol central în răspunsul alergic (Metzger,

H., Alcaraz, G., Hahman. R., J.P. Kinet, Publude V., și Quarto, R. (1986) Annu.Rev.ImmunoL 4, 419-470). La șobolan acest receptor constă din trei subunități diferite: un IgE ce leagă un lanț a, un lanț β și două lanțuri γ. Studiile anterioare au demonstrat că legarea IgE de mare afinitate a suprafeței celulei este dependentă de coexpresia acestor trei subunități (Blank, U., Ra, C., Miller, L, White, K, Metzger, H., and Kinet, J.-P. (1989) Nature 33Ί, 187-189; Ra, C., Jouvin,

M.-H.E., and Kinet, J.-P. (1989) J.Biol.Chem. 264: 15323-15327). în sistemul uman cel puțin subunitățile a și β trebuie să fie prezente pentru o legare de mare afinitate a suprafeței celulei (Kuster, H., Thompson, H.. and Kinet, J.-P. (1990) J.Biol.Chem. 265: 6448; Miller, L., Blank, U.Metzger, H„ and Kinet, J.-P. (1989) Science 244, 334- 337). Contribuția funcțională a subunităților β și/sau γ este în prezent necunoscută.

Clonele care codifică DNA complementar pentru subunitățile a (Kinet. J.-P.,

Metzger, H., Hakimi, J., and Kochan, J.

(1987) Biochemistry 26, 4605-4610; Shimizu, A., Tepler, I., Benfey, P.M., Berenstein, E., Siraganian, R.P., and Leder,

P.(1988) Proc.NatlA.cad.Sci.USA, 85,

1907-191 \)β (Kinet, J.-P.. Blank. U„ Ra, C., White, K., Metzger, II.. and Kochan, J. (1988) Proc.NatL4cadSci.USA, 85. 6483-6487) și y (Blank, U., Ra, Miller,

L. , White, K-, Metzger, 11., and Kinet,

J. -P. (1989) Nature 337, 187-189). la șobolan, pentru subunitățile a. β și y (Ra. C.. Jouvin. M.-H.E. and Kinet. j.-P. (1989) J.Biol.Chem., 264, 15323-15327), la șoarece și pentru subunitățile (Shimizu. A.. Tepler. I.. Benfey. P.M.. Berenstcin, E., Siraganian, R.P. and Leder. P. (1988) Proc.Natl.Acad.Sci.ljSA, 85, 1907-1911: Kochan, .1., Pettine. L.P., Hakimi. J., Kishi, K. and Kinet. J.- P. (1988) Nucleic Acids Res.. 16. 3584) și y umane (Kuster. 11.. Thompson. H.. and Kinet, J.-P. (1990) J.Biol.Chem.. 265: 6448) au fost izolate. Transfecția cDNA care codifică subunitățile^ umane și la șobolan sau subunitățile y umane (Kochan, J., Pettine, L.F., Hakimi, J„ Kishi,

K. and Kinet, J.-P. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 3584; Miller, L., Blank, U.Metzger, H., and Kinet J.- P. (1989) Science, 244,334-337) sau subunitatea a himerică umană singură [Hakimi, J., Seals, C., Pettine, UF. and Kochan, J. (1990) Science (in press^în celulele mamaie heterologe conducel la linii de celule capabile de legături IgE umane de mare afinitate.

cDNAs codifică proteine cu un semnal de peptide de 23 aminoacizi (șobolan și șoarece), sau 25 aminoacizi (uman), un domeniu extracelular de 180...181 aminoacizi, un domeniu transmembranar de 20...21 aminoacizi și un domeniu citoplasmic de 22 aminoacizi (șobolan), 25 aminoacizi (șoarece) sau 33 aminoacizi (uman). Cele trei subunități a sunt membre ale superfamiliei de imunoglobuline (Kinet, J.-P., Metzger, H., Hakimi, J. și Kochan, J. (1987), Biochemistry, 26. 4605-4610; Shimizu, A., Tepler, I., Benfey, P.N., Berenstein, E., Siraganian, R.P și Leder, P. (1988), Proc.NatlAcad.Sci. USA, 85, 1907-1911; Ra, C., Jouvin,

M. -H.E. și Kinet, J.-P. (1989) J.Biol. Chem., 264, 15323-15327; Kochan, J., Pettine, L.F. Hakimi, J., Kishi, K și

Rinei. .1. 1< (198<8). Nucleic Acids Res.. 16,3584) și cele mai multe sunt omoloage cu oalîa și cu subunitatea a a receptorului șoarecelui FcyRIla (Kinet, J.-P.. Metzger, IL, llakimi. .1.. și Kochan, J. (1987), liiocliernislrw 26, 4605-4610; Shiniizu, A.. Tepler, 1., Benfev, Proc.Nail.Acud.Sci. (jSA. 85. 1907- 1911: Ra, C„ Jouviii. M.-H.E. și Rinei. .I.-P. ( 1989), .J.liioi. ('hem.. 264, 15323-15327; Ravetch. J.V.. Ϊ .ușier. A.l).. Vveinsiiank. R._ Kochan. .1.. i'Ovlovec. Λ.. Port nev. D.A.. Hiilmes. Pan. Y. C'.E.. și IJckDc:·. J.C. (1986), ScicHcc, 234. 7ÎS-725). in comparație cu • ilți membri ai superfamiliei de imuno gic>i.*uiiiic. ;->ecveiil.i pentru subunitatea c. codifica doua mele Jisultidice legate care înconjoară succesiunea de aminoacizi 51-93 și 132-176 din Întreaga lungime a secvenței subunității a (Shiniizu. A., Tepler, I., Benfev, P.N.. Berenstein, li., Siraganian. R.P.. și Leder. P. (1988), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85, 1907-191 1).

Studiile anterioare au descris dezvoltarea și caracterizarea anticorpilor monoclonali specifici pentru receptorii de imunoglobuline de înalta afinitate, de exemplu receptorul FcERI de șobolan (Basciano, L.FL, Berenstein, E.H., Kmak,

I-, și Siraganian, R.P, (1986), J.Biol. Chem., 261, 11823-11831; Stracke, M.L., Basciano, L.K., Fischler, C., Berenstein,

E.H., și Siraganian, R.P. (1987), Mol.bnmunol., 24, 347-356) și receptorul uman FcGRI (Guyre, P.M., Graziano, R.R., Vance, B.A., Morganelli, P.M., și Fanger, M.W. (1989), J.Immunol., 143, 16501655). Suplimentar, un alt studiu a descris izolarea anticorpului monoclonal care reacționează cu bazofile umane (Miroii,

A.A., și Spitz, M. (1987), J.Immunol.Methods, 97,185-190). întrucât legarea acestui anticorp monoclonal la bazofile umane a fost blocată de IgE umană, nu se poate exclude faptul că acest anticorp ar putea recunoaște afinitatea ridicată a receptorului FcIgE (Miroii, A.A, și Spitz, M. (1987), J.Immunol.Methods, 97,185-190). Totuși, referința (Miroii, A.A., și Spitz,

M. (1987), J.Immunol.Methods, 97, 185 |90) nu las;i să se vadă că acest anticorp monoclonal s-ar lega de vreo subunitate a acestui receptor.

Până în prezent s-a crezul ca pentru a avea o expresie de suprafaț ă este necesar ca subunitatea a a FcERI umană să fie complexată cu subunități adiționale de FcERI (Blank. IJ.. Ra.’C.. Miller. I . Wluie. K-, Metzger. IL si Rine! .1.-15 (1989). Nalurc. 337, I<87 189). 'lotuși. 1 iakimi și alții[/./>W.(7/em.. 2o5. 220792208 1, (1990)] armă că modificând subunitatea < pentru a construi o gena hibridă care să încorporeze regiuni ciîoplasmice sau atat citoplasmice cât si Iraiisntembranare ale altor receptori pentru a permite suprateței celulei expresia subunilății <: (precum receptorul 11.-2, receptorul IgE de activitate scăzută (CD 23), receptorul murină erilropoletin. receptorul uman IgGFc, FcGRII etc) rezult;) expresia dc suprafață a subunității «careva lega, de asemenea. IgE cu mare afinitate și permite expresia stabilă a acestei activități în celulele eucariotice permanent transfectate.

Anticorpii monoclonali, conform prezentei invenții, sunt capabili de legare specifică la cel puțin un epitop al subunității a a receptorului uman FcIgE de mare afinitate (FcERI). Ei asigură reactivi de analiză, de diagnostic și terapeutici, puternici, pentru purificarea prin imunoafinitate a subunităților a naturale și recombinate ale FcERI uman (subunități a), dezvoltarea analizelor imunologice, identificarea părții active a subunității a și asigură un tratament terapeutic pentru bolile alergice (prin folosirea fragmentului Fab sau a derivaților pentru a bloca legarea IgE la receptorii celulari FcERI ai bazofilelor umane și mastocitelor). Anticorpii monoclonali care recunosc diferiți epitopi ai subunităților a umane sunt folositori ca reactivi în analizele imunologice sensibile cu două situsuri pentru a măsura nivelele subunității a în fluidele biologice și din extractele de celule.

Anticorpii monoclonali din această invenție, care suni capabili de legare specifica a cel puțin unui epitop al subunității ct din receptorul uman de mare afinitate Iglpoale fi caracterizat, de exemplu, prin inducerea histaminei eliberate din bazofilele umane, imunopre< ipitarea subunităților a marcate și/sau blocarea legăturii IgE la subunitatea a recombinară sau naturală.

Acești anticorpi monoclonali pot fi utilizați ca reactivi de afinitate pentru purilicarea subunităților « umane naturale sau recombinate, ca reactivi pentru imuno-inceicări de enzime și radio imuno-incercari pentru a măsura subunitățile <; naturale si recombinate in fluidele biologice, pe membranele prismatice ale celulelor umane, ca reactivi pentru selecția medicamentelor, ca reactivi penlru analize imunologice sensibile cu două situsuri în vederea măsurării subunităților α în fluidele biologice și extractele de celule umane, ca reactivi în conjuncție cu subunități a recombinate în analize imunologice sensibile de captare pentru a măsura nivelele IgE în fluide biologice și extracte celulare, ca reactivi pentru a identifica părțile din subunitatea a care participă la legătura IgE și sub formă de fragmente Fab (ale anticorpilor monoclonali inhibitori), ca medicamente terapeutice pentru tratamentul bolilor alergice induse de IgE.

Anticorpii monoclonali, așa cum sunt denumiți în prezenta invenție, includ fragmente cu aceeași specificitate, cum sunt fragmentele Fab bivalente și monovalente. Așa cum este cunoscut, asemenea fragmente pot fi generate prin clivajul proteolitic al unei molecule de imunoglobulină. De exemplu, clivajul cu papaină produce două fragmente Fab monovalente, în timp ce clivajul cu pepsină produce un fragment Fab bivalent Aceste fragmente pot fi selectate pentru activitatea de legare a receptorului prin metode convenționale, așa cum sunt metodele descrise aici pentru selecția anticorpilor monoclonali întregi. Exemple sunt imunoprecipitarea, absorbția o

Western, inhibarea legăturii și alic încercări cum ar fi cele descrise în exemplul 3.

zVnlicorpii monoclonali din prezenta invenție pol fi de origine umană sau mamifere neumane, ca de exemplu șobolan, șoarece și iepure. Acești anticorpi pot fi de subtipuri IgA. IgM și IgG.înspecialdesublipul IgCit-Metodele pentru producerea acestor anticorpi sunt binecunoscute și date în exemple.

Prezenta invenție tace uz dc o subit niîatCfZ himerică care este exprimată pe suprafața unei celule gazdă independentă de alte subunități FclIRI. Ca urmare, prezenla invenție sc referă la anticorpi monoclonali care sunt capabili dc legare la unul sau mai mulți epitop: ai subunității a himerice exprimată pe suprafața unei celulegazdă, ca de exemplu o celulă COS sau o celulă CIIO și de asemenea la o subunitate a himerică izolată. Subunitatea a himerică este o polipeptidă hibridă cuprinzând o secvență de aminoacizi a subunității a funcționale și transmembrare și secvențe de aminoacizi, citoplasmice ale diferiților receptori, cum este receptorul IE-2 (descris mai departe).

Prezenta invenție se referă, de asemenea, la anticorpi monoclonali care sunt capabili să se lege la o subunitate a exprimată pe suprafața mastocitelor sau bazofilelor, în special a mastocitelor umane sau bazofilelor. IgE, o imunoglobulină bivalentă se leagă la receptorul ei de suprafață celulară (FcERI) prin porțiunea ei Fcsau origine. Fiecare din brațele sale Fab este legat la un antigen și două molecule IgE pot reticula printr-un antigen, fiecare IgE fiind legată de un braț la același antigen. Aceasta face ca receptorii legați la moleculele IgE să se aglomereze pe suprafața celulei. Aglomerarea receptorilor stimulează celula să degranuleze și să elimine histamină. Acesta este procesul care contribuie la răspunsul alergic.

Acești anticorpi se pot lega de un epitop la sau aproape de locul legăturii

IgE și astfel să blocheze legătura IgE.

Un exemplu de asemenea anticorp este anticorpul I5A5. Anticorpii pot provoca ei înșiși aglomerarea receptorului prin legarea unui receptor cu fiecare braț” !^;ab și să stimuleze eliminarea hislaminei. Acesta este cazul când se folosesc leale imunoglobulinele sau fragmentele i'ab. Acești anticorpi suni, in special, iililizaii pentru analize și purificări. Un ainii'orp inonovalent, de exemplu un fragment monovalenl lab. care blochează legătura IgE și nu produce aglomerarea întrucât el are doar o singură latură de legătură și ca atare nu se poate lega la mai mult decât un receptor, este folosii terapeutic întrucât el poate preveni ca IgEsa inducă eliminarea histamiriei. De asemenea, sunt descriși aici anticorpi monoclonali care se leagă la un epitop alsubunității« care nu este la sau aproape de latura dc legare IgE, de exemplu anticorpul monoclonai 11B4. Asemenea anticorpi nu blochează legătura IgE și nu induc eliminarea histaminei. Pentru a determina dacă anticorpul monoclonai blochează legătura IgE, se pot face încercări competitive utilizând IgE marcat prin metode cunoscute pentru a vedea dacă anticorpul reduce legătura IgE la subunitatea a. Subunitatea a himerică sau celula gazdă ce exprimă o subunitate a himerică (ambele descrise aici) este în mod special folosită pentru a realiza laturile de legătură în vederea probelor.

Anticorpii monoclonali, conform prezentei invenții, pot fi caracterizați, de exemplu, prin împărțirea în două mari categorii: 1) anticorpi care blochează legătura radiomarcată IgE la celulele FcERI de sprijin (clasa inhibitoare) și 2) cei care nu blochează această interacțiune ligand-receptor (clasa neinhibitoare).

Domeniul extracelular al subunității a umane conține 7 situsuri glicozilate potențial N-articulate (Shimizu, A., Tepler., I., Benfey, P.N., Berenstein, E.,

Siraganian, R.P. și Leder, P. (1988),

Proc.NatlAcad.Sci.USA, 85, 1907-1911;

Kochan, J., Pettine, L.F., Hakimi, J., Kishi, s

K. si Rinei, J.-P. (I9<8<8), Nucleic Acids Res.. Ib, 3584). Subunitatea a nativă și subunitatea a himerică recombinantă, cxprimală în celule ('HO, au greutăți moleculare aparente de aproximativ 50 kD (Conrad, D.H.. Berozi. I.. și Forese.

A. (|676). Immunochemistrv, 13, 329-332: Kuiczycki. A.. Jr.. McNearnev. T.A.. și Parker. CAV. ( 1976), J.Immunol.. 117. 6(0-665). și aproximativ 45 kD (Ilakimi. J.. Seals. Pettine. I..P. și Kochan. ,1. (1061)ț. Vr/e/ice (in press)), respccliv, în iimpcc greutățile moleculare prezise ale îDaAs ale acestora suni ..6 kD si 2-1 kD. respectiv. Astfel, majoritatea din cele 7situsuri glicozilate pok ipial N- articulate apar a fi utilizate în proteinele mature, îndepărtarea carbohidtaților N-articulați din subunitatea himerică a prin digestie cu N-glicanază conduce la o schimbare a greutății moleculare de la aproximativ 45 kD la 25 kD. Proteina 25 kD se recunoaște ca urmare a anticorpilor monoclonali, conform prezentei invenții, prin recunoașterea miezului polipeptidic al subunității a.

Ambele clase de anticorpi se leagă de subunitatea a himerică cu afinități ce sunt aproape egale sau mai mari decât afinitatea IgE pentru subunitățile a. Aceste date arată că diferența dintre cele două clase de anticorpi nu este bazată pe afinitate, ci pe legăt ura epitopică la fiecare anticorp. Cu anticorpi monoclonali, conform prezentei invenții, au fost identificați 5 epitopi distincți în regiunea extracelulară a subunității a la receptorul uman FcERI: doi epitopi inhibitori și trei neinhibitori. Pentru a identifica epitopii recunoscuți ca urmare a anticorpilor din prezenta invenție, fiecare anticorp a fost testat cu E1A cu peptidele sintetice corespunzătoare succesiunii subunității a. Un epitop inhibitor (secvența 125-140) a fost identificat cu anticorpul 15A5 și un epitop neinhibitor (secvența 43-58) a fost identificat cu anticorpul 11B4 și 22E7. Epitopii altor anticorpi inhibitori și neinhibitori au fost apoi caracterizați printr-un test ce presupune o competiție <>

de încercări radioreceptor, utilizând anticorpi radiomarcați 15A5 și 22177.

Toți anticorpii inhibitori se leagă la sau cel puțin sferic alături de secvența 125-140, întrucât ei toți concură cu 1251. ISzVS pentru legare la subunitatea a himerică. Igl?) concură, de asemenea, cu 125|-|5A5 pentru legare la subunitatea a himerică, confirmând că IgE și 15A5 se leagă pentru suprapunerea domeniilor în receptor, dar probabil domeniile nu Mint identice. Numai un anticorp inhibitor, 4B4, blochează legătura 125|-kE la ambele subunități a atât la om cât și la șobolan și blochează legătura 1251 1 S/\5 la subunitatea a umana. Aceste date indica că epitopul 4B4 se suprapune, dar nu este identic cu epitopul 125-140 al anticorpului 15 A5.

anticorpi neinhibitori inhiba complet 125[- marcat 22E7 de legarea la subunitatea a himerică, indicând că cei mai mulți se leagă la sau stericalături de secvența 43-58 a subunității a himerice'. Trei anticorpi neinhibitori nu inhibă legarea anticorpului 22E7 radio-marcat la subunitatea a himerică, indicând astfel că acești anticorpi se leagă la un epitop diferit al proteinei. Un anticorp neinhibitor, 29C6, blochează ambele legături 125i-22E7 și 125i- 15A5 la subunitatea a himerică. IC50pentru inhibarea legăturii 125i-22E7 și 1251-15A5 la subunitatea a pentru 29C6 este 0,18 //g/ml și >120 /<g/ml, respectiv.

Celulele hibridoma care produc anticorpi monoclonali, conform prezentei invenții, sunt generate prin metode bine cunoscute.

Pe scurt, în metoda standard, un animal cum este șoarecele, șobolanul sau iepurele este imunizat cu un antigen și anume o polipeptidă, cuprinzând cel puțin un epitop al subunității a, cum ar fi întreaga subunitate a ca atare sau sub formă de subunitate a himerică. Celulele B sunt apoi izolate de la animal, testate pentru specificitate și fuzionate cu celule imortale de myeloma pentru a crea celule hibridoma. Celulele hibridoma sunt di10 luate și celule individuale sunt introduse în receptacule (cum sunt cavitățile dintr-o placa de microritrare). Anticorpii monoclonali produși de cionele de celule hibridoma individuale sunt, de asemenea, selectați pentru specificitate. Se pot. de asemenea, produce celule hibridoma. producând anticorpi de specificitate dorita, prin metoda DNA recombinând Anticorpi monoclonali de origine umana, pot li produși prin metoda recombinantă sau pot fi produși prin expunerea cehi lelor limfatice umane în cultură, la o subunitate <c. pentru a induce producerea anticorpului. După 3...5 zile celulele producătoare de anticorpi sunt fuzionate cu celule myeloma, iar selecția anticorpilor antisubunitatcft este realizată așa cum s-a descris mai sus.

Sepol utiliza orice metode convenționale. pentru a selecta anticorpii monoclonali sau fragmente ale acestora, conform prezentei invenții. O asemenea metodă utilizează celula descrisă aici care reprezintă o subunitate a himerică pe suprafața sa. De exemplu, anticorpii monoclonali pot fi marcați fluorescent și apoi adăugați la un glisaj conținând aceste celule. Când glisajul este văzut sub un microscop fluorescent, anticorpii având specificitatea descrisă se vor lega la celulă și detecta vizual. O alta metodă este imunoprccipitarea. Subunitatea a izolata, așa cura este descrisă aici, este detectabilă prin marcare cu metode bine cunoscute. Anticorpii cu specificitate dorită se vor lega la subunita tea a marcată pentru a forma un complex. Complexul poate fi izolat prin adăugare de anticorpi cuplați la un suport solid care se leagă de anticorpii legați la subunitatea a.

Odată denumiți, anticorpii întregi, dimerii lor, lanțurile individuale, ușoare și grele sau alte forme de imunoglobulină, conform prezentei invenții, pot fi purificate în conformitate cu procedurile standard, incluzând precipitarea cu sulfat de amoniu, coloane de afinitate, coloană cromatografică, gel-electroforeză și altele de acest fel (Scopes, R., Purificarea proteinelor, springer-Verlag, N.Y.. 1982). Suni preferate imunoglobulinele substanțial pure cu omogenitate de cel puțin ‘>0 la 95% .și cele mai preferate sunt cele cu omogenitate de 98...99% sau mai 5 mare, pentru uz farmaceutic. Odată purificate, parțial sau până la omogenitate;', dorită, peptidele pot li utilizate apoi terapeulic (inclusiv exl incorporai) sau in elaborarea .și realizarea procedurilor de ·0 testare, colorări imunofluorescentv :>i altele asemănătoare. (I.efcnvits si Por u is. Metode imnnoiogice. voi. 1 și 11, Ed. Academic Press. Ncw York. XY, 1979 m !'’>.!). ^!

O metodă pentru producerea .tini corpilor monoclonali capabili de legarea la unul sau mai mulți epitopi ai subunității ' c a receptorului uman de mare afinitate Igl i sau a subunilății a himerică constă 20 în izolarea acestor anticorpi din mediul celulelor hibridoma descris mai sus. Anticorpii pot fi, de asemenea, izolați direct dintr-un animal imunizat, ut ilizând metoda selecției descrisă mai sus. 25

Această invenție descrie metodele pentru detectarea sau purificarea subunității a dintr-o probă, cum ar fi o probă de fluid biologic conținând subunitatea a liberă sau o probă conținând celule 30 și/sau membrane legate de subunitatea

a. Anticorpul monoclonal capabil de legarea specifică la un epitop sau la epitopul subunității a a receptorului uman de mare afinitate IgE, în special la un 35 epitop sau epitopi ai subunității a himerice, este contactat cu proba în condiții bine cunoscute, astfel ca anticorpul monoclonal să lege subunitatea a din probă. Anticorpul monoclonal poate fi în soluție 40 sau legat la un suport solid, cum ar fi o coloană, o placă sau o membrană. Dacă este legat la un suport solid, subunitatea a poate fi eluată §i purificată prin metode cunoscute. în soluție, anticorpul mono- 45 clonal marcat poate fi detectat prin mijloace adecvate marcării, folosite pentru a indica prezența subunității a în probă. O altă metodă de detectare folosește un anticorp monoclonal nemarcat, pentru 50 a lega .subunitatea o din probă, care este apoi contactată cu un anticorp rnarcal care se leagă de anticorpul nemarcat. în oricare din metode, cantitatea de anticorp marcat, daca este cunoscută, poate fi utilizată pentru a cuanlilica cantitatea de subunitate a din probă. Marcarea este bine cunoscută. Marcările adecvate pot fi radioactive, cum este 125], fluorescent, biolina sau enzimatic, cum este peroxidaza.

Prezcnl.i invenție include· o metodă pciiiru a delecta și cuantifica Igl·. prezent inii -o probă care este capabil să se lege deosubunilaleu. Anticorpul monoclonal capabil dc < · icgarc specifică la o subunitate uvsiecuplat la uri suport solid (cum sunt siralurile utilizate în coloana de afinitate sau suprafața unei plăci de microtitrare sau alte suporturi bine cunoscute) și contactat cu o cantitate cunoscută de subunitate a. Anticorpul monoclonal se leagă de subunitatea a, pentru a forma un complex care este la rândul lui legat de suportul solid. Acest complex este contactat cu proba. în probă, îgE activ și nu cel denaturat sau inactiv va lega o subunita te a. Cantitatea de IgE prezenta în probă poate fi apoi cuantificată prin contactarea complexului cu anticorpul detectabil marcat, capabil să se lege la IgE și măsurând cantitatea de marcaj. Tehnicile pentru producerea anticorpilor monoclonali cu specificitate selectată, cum sunt anticorpii anti-IgE. sunt bine cunoscute. De asemenea, anticorpi antiIgE se obțin ușor din surse biologice. Deși IgE poate fi detectat într-o proba utilizând numai anticorp anti-IgE, o asemenea încercare nu ar fi capabilă să facă distincție între IgE activ și inactiv, de exemplu IgEcapabil sau incapabil să lege o subunitate a. O probă utilizând subunitatea a poate fi folosită în acest scop.

Prezenta invenție se referă și la o compoziție farmaceutică cuprinzând un fragment monovalent Fab, care este capabil de legare specifică la un epitop sau mai mulți epitopi ai subunității a a receptorului IgE uman de mare afinitate, asl lel încâl legal ura lgl: sa fie inhibată. Anticorpul din această invenție poate fi legat de toxine, cum este difteria sau toxinapseudomonas și utilizai pentru a elimina selectiv receptorul ce dă naștere la celule.

Anticorpii și compozițiile farmaceutice din prezenta invenție sunt. în special, folositori penlrn administrarea parenteralâ, de exemplu subcutanat, tnlramuscular. sau intravenos. Compozițiile pentru administrare parenterală conțin. în generai. o soluție dcani i< orp sau un amestec de anticorpi dizolvat într-un purtător acceptabil, preferabil un purtător apos. Au fost utilizați o varietate de purtători apoși, cum ar ti: apă. apă tamponată, saramură 0,4%, glicină 0.3% și altele asemenea. Aceste soluții sunt sterile și, în general, libere de macroparticule. Aceste compoziții pot fi sterilizate prin tehnici de sterilizare convenționale bine cunoscute. Compozițiile pot conține substanțe auxiliare acceptate farmaceutic, cerute pentru a realiza condițiile fiziologice, cum este ajustarea/rH-ului și agenți de tamponare, agenți de ajustare a toxicității și altele asemănătoare, cum ar fi acetat de sodiu, clorură de sodiu, clorură de potasiu, clorură de calciu, lactat de sodiu etc. Concentrația anticorpului în aceste formulrăi poate varia larg, de exemplu de la mai puțin de 0,5%, în generai de cel puțin 1 până la 15 sau 20% în greutate și vor fi selectați în primul rând pe baza volumului fluidului, viscozității etc., în concordanță cu modul particular de administrare selectat

Astfel o compoziție tipica farmaceutică pentru injecție intramusculară ar putea conține până la 1 ml apă tamponată sterilă și 50 mg de ant icorp. O compoziție tipică pentru infuzie intravenoasă poate fi făcută să conțină 250 ml de soluție sterilă Ringer și 150 mg de anticorp.

Anticorpii, conform prezentei invenții, pot fi liofilizați pentru depozitare și reconstitui ți într-un purtător adecvat înainte de utilizare. Această tehnică s-a arătat a fi eficace cu imunoglobulinele

I 1 convenționale, iar tehnicile de Iiniilizare și reconstituire cunoscule pot li aplicate. Se apreciază că liofilizarea și reconstituirea pot conduce la o pierdere a activității anticorpului de grade diferite (de exemplu, cu imunoglobulineie convenționale anticorpii IgM linei să prezinte o pierdere a activității mai mare decât anticorpii 1θ(τ) și că nivelele de utilizare ar trebui ajustate pentru a compensa aceasta.

('ompo/ițiile conținând fragmente l'ab ale ant ίουρίίοι mon<><. lena li act uaîi sau un amestec al acestora pol li administrate pentru tratamente profilactice sau/șt terapeutice. In aplicarea terapeutică. compozițiile suni administrate pacientului suferind deja de răspunsuri alergice într-o măsură suficientă pentru a vindeca sau cel puțin a opri parțial boala și complicațiile ei. O cantitate adecvată pentru a realiza aceasta este definită ca doză terapeutică eficace. Cantitățile efective pentru această utilizare vor depinde de severitatea răspunsului dar, în general, domeniul este de 1 până Ia 200 mg dc anticorp per doză.

In aplicațiile profilactice, compozițiile conținând anticorpii actuali sau un amestec al acestora se administrează pacientului ce nu este încă în stare de boală într-o cantitate suficientă pentru a bloca IgE din bazofilele proprii. O asemenea cantitate este definitiv a fi doză profilactică eficace. In această utilizare cantitățile precise depind, de asemenea, de starea de sănătate a pacientului, dar nivelul obișnuit de circulație antigen specific IgE variază de la 0,1 la 25 mg per doză.

Producerea unuia dintre posibilii antigeni, care pot fi utilizați în practică conform prezentei invenții, și anume subunitatea a himerică cuprinde un număr de faze care includ prepararea genelor codificând succesiunea de gene hibride, inserția acestei gene într-un vehicul clonal adecvat pentru a produce un vector recombinat ce conține succesiunea de gene hibride, transferul vehi ruli'.hi! ί ΐοη.ι! reeombinanî într-un orna nism gazdii omp.ilibii. selectarea ș i creșterea unei asemenea gazde modificate care poate exprima succesiunile de gene introduse și identificarea și purificarea produsului genei.

Prepararea genelor codificând subunitatea a himerică este însoțită de izolarea in primul rând a porțiunilor potriviie ale PcFRI și de regiunile ciloplasmice și iransmembranare ale receptorului II.-2.

Secvența dc nudcolide a subunilății c umane este publicata în Nucleic Acids i<escar< /;. voi. 1 o (δ). 3584 (1988 >. Secven la de nucleotide a receptorului uman p55 Π. 2 este publicată in Nulure, 311. 631 i 1984) si regiuni ie ciloplasmica și transmembranară a receptorului II.-2 măsoară aproximativ 890 Ia 1030 nucleo lide. Secvența de nucleotide a subunității a poate fi obținută dintr-o varietate de surse cum sunt bazofilele umane, mastocilesau linia de celule Ku812 (Kishi. Leu 5 kctiui Rescarcli. 9.381 (1985). Secvența de nucleolidca receptorul ui IL-2 poate fi. de asemenea, obținută dintr-o varietate de surse, cum sunt celulele umane T, liniile de celule i’sau limfocitelc sanguine peri10 feriah*.

Sunt de preferat pentru utilizare conform prezentei invenții genele hibride ce conțin secvența de nucleotide 121-710 a subunități < î umane la care au fost legate 15 nueleotidele 876-j016 ale reeeplorului 11.-2.

Aceasta conduce ia o genă hibridă cu următoarea secvență de nucleotide:

TACTAAGAGTClCCAGCATCC’lCCACCTX/TCi’ACCACCGAGCATGGGCCT’ATATTTCvVXGCCT TAGA'lCTCTCCAGCACAG'l'AzXGCACCAGGAGTCCAT GAAGAAG ATG GCT CCI’ GCC AGG

atc cit g

CTC

ACT

CTA

CFG

TGT

GTA

GCC

ΤΓΑ

CTG

rrc

TIC

GCT

CCA

GAT

GGC GTG

ΊΤΑ

GCA

GTC

CCT

CAG

AAA

CCT’

AAG

CTC

TCC

TTG

AAC

CCT

CCA

TGG AAT

AGA

ATA

ΊΤΤ

AAA

GGA

GAG

AAT

GTG

ACT

CTT

ACA

TGT

AAT

GGC

AAC AAT

TTC

TTT

GAA

Gl’C

AGT

TCC

ACC

AAA

TGG

TTC

CAC

AAT

GGC

AGC’

CTT TCA

GAA

GAG

ACA

AAT

'TCA

AGT

TFG

AAT

ΑΊΤ

GTG

AAT

GCC

AAA

TTT

GAA GAC

AGT

GGA

GAA

TAC

AAA

TGT

CAG

CAC

CAA

CAA

GTT

AAT

GAG

AGT

GAA CCT

GTG

TAC

CFG

GAA

GTC

TTC

AGT

GAC

TGG

CTG

CTC

CIT

CAG

GCC

TCT GCT

GAG

GTG

GTG

ATG

GAG

GGC

CAG

CCC

CTC

TTC

CTC

AGG

TGC

CAT

GGT TGG

AGG

AAC

TGG

GAT

GTG

TAC

AAG

GTG

ATC

TAT

TAT

AAG

GAT

GGT

GAA GCT

CTC

AAG

TAC

TGG

TAT

GAG

AAC

CAC

AAC

ATC

TCC

ΑΊΤ

ACA

AAT

GCC ACA

GrlT

GAA

GAC

AGT

GGA

ACC

TAC

TAC

TGT

ACG

GGC

AAA

GTG

TGG

CAG CFG

GAC

TAT

GAG

TCF

GAG

CCC

ACTC AAC ATT ACT GTA ATA AAA GCT

CCG CGT

GAG

AAG T ACC AGG TAG CAG TGG CCG GCT GUG TTT TCC TGC TGA

TCA CCG

TCC

TCC

TCC

TCA

CTG

GGC

TCA

CCT

GGC

AGC

GGA GAC

AGA

GTA

AGA GTA

GAA

CAA

TAT

TCT

AGA

AAA

CCA

AAA

GAA

CAA

GAA TTT

CTT

GGT

AAG AAG

CCG

Totuși, este recunoscut că în cons- 20 trucția genei hibride diferitele endonucleaze de restricție vor deplasa fiecare secvență de nucleotide într-o poziție diferită, ceea ce va avea drept rezultat gene hibride care nu au exact aceeași 25 secvență ca cea descrisă mai sus. Atâta timp cât gena hibridă conține cel puțin o secvență de nucleotide care reprezintă op subsecvență polipeptidică funcțională a subunității a (care este orice subsecvență 30 ce va lega IgE) și de asemenea dacă orice subsecvență corespunde regiunilor citoplasmice și transmembranare ale receptorului IL-2, ea poate fi utilizată conform prezentei invenții. Pe lângă aceasta, exprimarea este adecvată pentru regiunile citoplasmice sau transmembranare ale oricărui alt receptor sau proteină transmembranară a cărei secvență poate fi adăugată la subsecvență polipeptidică funcțională a subunității a și ține seama de suprafața celulei funcționale. Exemple de asemenea subsecvențesunt numeroase, cum s-a arătat înainte. In fiecare clipă ar fi posibil să fuzioneze domeniile legăturii IgEa subunității a umane cu domeniile transmembranare și citoplasmice a următoarelor proteine (trebuie notat că în fiecare exemplu subunitatea singulară a109707 linge supralața celulei în absenta oricărei alic .subunităț i); receptorul Igl·' dc a finita te scăzuta sau CD23 (Kikutani și alții. ('cil. 4⁷. 657. 1968): receptorul murină critropoiclin (D’Andrena și alții, Cell. 57. 277, 1989): receptorul uman IgG l'c. IcGRII (Stuart și alții.././iv/?z..We</.. 166X. 1987): receptorul poliovirtis uman (Mendelsohn și alții, Cel/. 5<n 855. 1989); receptorul uman f'D4 (Madden și alții. <77/, 42.93. !^,:'S5);receptorul uman I’DGl·' ( Yaj'dcn si alții. .Nalure. 323. 226. 1988): receptorul uman de afinitate marc IX > !^;c iΛ<7<7a.i.. 24o. 3/8); receptorul uman tntcrleron țAguet si aii ii. (7/7 ss 277 p receplorul uirmn interleukiii 1 (Simc și alții, Λ\ϊ<75<:·<·, 24 1, 585): sau ani igenul di torențial <71.)19 (Slamenkovic si Seed. J.Expi.Med.. 168, 1205).

Regiunile mai mici ale subunității a care leagă Igl: și cuprind, lotuși, un epitop pentru a li recunoscute de către anticorpii conform prezentei invenții, pol 5 ti sistematic determinate prin eliminare secvențială a trei nucleotide la fiecare din capetele 5‘ sau 3'. Secvența de nucleolidecea mai scurtă care este capabilă să codifice o legătură Igle a subunității 10 polipeplidke va delini unitatea minimă pentru o proteină funcțională. In gena hibridă porțiunea din secvența de nuclee (ide ualuială a siibutittații <r poate ti substituita pentru a tace posibil ca endo15 nuclcaza de restricție aleasă să taie secvența de nucleotide in poziția dorită. Unsitus Bamlli poale fi creai în pozițiile 119 126 prin substituirea subunității c umane naturale după cum urmează:

	107	110	113 115
natura!	ATG	(.( i	(’( 1 GC(

modificat

Subunitatea a umană poate fi mai departe modificată pentru a crea un situs

119	122	125	128	131	134
ATC	GAA	TCC	CCT	ACT	CIA
G	ATG	CI'
SÎ1U.S Li i	BamHI	credit

EcoRV pentru endonuclează de restricție în pozițiile 878-890 după cum urmează:

866 869	872	875	878	882	884	887	890	893	896
natural CCC ΑΛΑ	AAC	AAC	TGA	TAT	AAT	TAC	TCA	AGA	AAT
modificat					GGG	AT	C
			Situsul	EcoRV	creat

Orice substituție minoră a subunității a naturale sau a secvenței de nucleotide a receptorului 1L-2, pentru a facilita clivajul endonucleazei de rest ricție dorită, 25 poate fi obținută prin metode cunoscute. După izolarea secvențelor de nucleotide adecvate ale ambelor subunități, ele pot fi împreunate de ligaza adecvată. Deși, pentru sintetizarea genei hibride se uti- 30 lizează tehnologia DNA recombinant, este de asemenea posibil a o sintetiza prin metodele sintezei chimice cunoscute.

Odată construită gena hibridă, ea poate fi introdusă în orice vector de 35 expresie convenabil, fag sau plasmidă în orice mod cunoscut (Laboratory Manual,

Sambrook și al. Molecular Cloning, Cold

Spring Harber Laboratory, 1989).

Metode generale pentru prepararea unor asemenea molecule recombinante DNA sunt, de asemenea cunoscute (US 4237224 și US 4304863).

Metodele pentru exprimarea secvențelor DNA care codifică proteinele hibride, așa cum sunt ele folosite conform prezentei invenții, includ transformarea bazei adecvate cu un vector recombinant, având numita secvență de DNA legată operativ la expresia secvenței de control a vectorului, cultivarea gazdei în condiții adecvate de creștere și extragerea și separarea proteinei hibride din cultură. Specialistul în domeniu poate selecta dintre aceste metode cunoscute pe cele care sunt mai eficace pentru expresia unei gene particulare, iar selecția unei gazde speciale, pentru a fi utilizată conform prezentei invenții, depinde de un numărde factori recunoscuți în domeniu. Aceasta include, dc exemplu, compaîihi litalea cu expresia aleasă a vectorului. 5 loxicilatea proteinelor codificate pentru plasmida hibridă, cazul recuperării pro leinei dorite, caracteristicile recuperării proteinei dorite, caracteristicile expresiei. biosiguranța și corturiIc. 10 ( eluleleCOS sunt gazdele preferate, conform prezentei invenții. ( ciulele ('OS -uni - .cric de celule din rinichii maimuței airicane verzi transformate de către un genorn viral SV40 de origine minus si 15 este disponibil din ATCC sub fir. dc acces < Ki ib:> i. (. ciulele CIK ) sunt, de aseme nea adecvate și disponibile pe scară largă. Metode alternative pentru amplificarea genei aplicabilă la orice serie de cel ule cucariolice. reprezintă utilizarea sistemului select iv de amplificare adenozin-deaminază sau sistemul de amplificare a genei reductazei dihidrofolate negative (dhlr). O varietate de sisteme procariotice și eucariotice sunt gazde adecvate pentru exprimarea regiunii extraciloplasmice prclucraic a subunității < (resturile 262n i μ

Polipeptida hibrid, utilizată conform prezenici invenții, poate avea următoare.·: secvență de amino,acid:

Ala

Pro

Ala

Met

Glu

Ser

Pro

1 hr

I eu

leu

( :vs

Va 1

Ala

leu

Leu

Phe

Phe

Ala

Pro

Asp

Glv

Vai

Leu

Val

Aia

Pro

Gin

I vs

Pro

Lys

Val

Ser

Leu

Asn

Pro

Pro

lip

Asn

Arg

Ile

Phe

Lys

Gly

O Iu

Asn

Val

Thr

J.X’U

Thr

Cys

Asn

Gly

Asn

Asn

Phe

Phe

Glu

Val

Ser

Ser

Ί hr

Lys

Trp

Phe

His

Asn

Glv

Ser

leu

Ser

Glu

Glu

Thr

Asn

Ser

Ser

Leu

Asn

Ile

Vai

Asn

Ala

Lys

Phe

Glu

Asp

Ser

Gly

Glu

Tyr

Lvs

Cys

Gin

His

Gin

Gin

Val

Asn

Glu

Ser

Glu

Pro

Val

Tyr

LeU

Glu

Val

Phe

Ser

Asp

Trp

Leu

Leu

Leu

Gin

Ala

Ser

Ala

Glu

Val

Val

Met

Glu

Gly

Gin

Pro

Leu

Phe

Leu

Arg

Cys

Ilis

Gly

Trp

Arg

Asn

Trp

Asp

Vai

Tvr ✓

Lvs

Val

Ile

Tyr

Tyr

Lys

Asp

Glv

Glu

Ala

Leu

Jvs

Tyr

Trp

Tyr

Glu

Asn

His

Asn

Ile

Ser

Ile

Thr

Asn

Ala

Thr

Val

Glu

Asp

Ser

Gly

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Thr

Gly

Lys

Val

Trp

Gin

leu

Asp

Tvr

Glu

Ser

Giu

Pro

Leu

Asn

Ile

Thr

Val

Ile

Lys

Ala

Pro

Arg

Glu

Lys

Tyr

Gin

Val

Ala

Vai

Ala

Glv

Lys

Val

Phe

leu

Leu

Ile

Ser

Val

leu

Leu

Leu

Ser

Gly

Le:u

Thr

Trp

Gin

Arg

Arg

Gin

Arg

Lys

Ser

Arg

Arg

Thr

Ile

Proteina hibridă, conform prezentei invenții, poate fi sintetizată, utilizând metodele generale de fază solidă Merriefield, Joumal of American Chemical Society, 85, 2149, 1963).

Polipeptidele hibride pot fi produse prin metode recombinante prin inserția secvenței genei hibride în vectorul recombinat adecvat și transformând o gazdă (Culler, Metods in Enzymology, 152, 648-704,1987). Transformantul este apoi cultivat în condiții de cultură adecvate pentru a obține polipeptidele hibride corespunzătoare.

In cele ce urmează, este descrisă mai detaliat prepararea subunității a himerice care poate fi utilizată, ca antigen pentru prepararea anticorpilor, conform prezentei invenții.

Secvența de nucleotide a subunității a a FcERI poate fi modificată la pozițiile 119-126 și 884-890 după cum urmează folosind mutageneza directă (Morinaga și al., Bio Tech., 2, 636, 1984). pLJ663 conținând subunitatea a umană cDNA (1197 bp subunitatea a cDNA ligată într-o stare EcoRI a pGem-4 (Promega): Kochan și al.) 10 /zg pot fi digerate la

37C cu enzimele reslrictivc Bglll (30 unități) și Sty I (30 unități) într-un volum final de 100iii într-un vas conținând I50 mM NaCI. 6 mM /r/s-HCI /?H=8,0, 6 mM MgCl2 și 6 mM 2-mercaptoetanol. 5 Digestia fragmentelor pl J663 se face în 2 fragmente corespunzătoare în lungime de aproximaiiv 437 bp și 3760 bp. l ragmenlul 37(>0 bp s-a izolai prin elecIrotorcza cu gel de agaro/.a si s a rcicrii Ι· ·^; la o molecula cu goluri.

pl Joo3. Iii (/peste digerat separat cn cn/.ima restrictiva Pvul (30 uiiiiați) ia v”(. ’ inii ·ΐίΐι volum îih.ii de bSDpi îutr-un vas lonținând 150 mM NaCI, 6 mM 15 ins-1K '1 pl I =8.0. 6 înM MgClg și 6 mM

2- mei ca ploe La noi. Această digerare produce restricția pl 3063 odală și generează un fragment linear de aproximativ i97 bp. Acest fragment linear este izolai 20 prin electroforeză cu gel de agaroză și se referă la o moleculă lineară.

Oligonucleotidele menționate mai sus (50 pmoli) sunt fosforilate la capătul lor 5’, folosind polinucleotidkinaza (5 25 unități) înlr- un prim volum de 20 μ\ într-un amestec conținând 1 mM ATP. 50 mM /râ-IICl pH=7,6, 10 mM MgClz, mM DTT, 0.1 mM spermidină, 0,1 mM EDTA la un timp de reacție de 30 min, .30 la 37°C și încă 5 min la 70°C- și apoi puse în gheață.

Mutanții de stare specifică pot fi generați în următorul mod: S-a format un amestec conținând câte 100 mg de ? molecule cu goluri și lineare și 12,5 pmoli de oligonucleotidă fosforilată 5’, într-un volum final de 12,5 pl într-un vas conținând 0.16 M KC1. 10,4 mM trw-HClpH=7,4, 7,2 mM MgCE. Acest 4 amestec (într-un tub de probă) este incubat într-o baie de apă clocotită (volum de 500 ml), timp de 3 min, apoi conteinerul cu apă clocotită este îndepărtat de pe placa fierbinte și lăsat 4 să se răcească la temperatura camerei (conținând amestecul). Odată amestecul răcit, volumul final este ajustat la 20 pl, prin adăugarea următorilor reactivi: 4 pl de 2,5 mM dGATC (dGTP, dATP, dTTP, ί dCT P). 1 ι/l de lOxJigază lamponată (45 mM NaCI, 45 mM tris-l ICI pil =8,0. 45 mM MgCE, 40 mM DTT. 12 mM ATT, 0.4 mg/ml albuminăserică bovină (Fracția V), 1 pl de 10 x 100 NT’ tamponat (0,5 m.M /rw-HCl pH=7.2, 0,1 M MgSO i. 1 mM DTT’, 500 mg/ml albumină serică bovină (Fracția V». 1 pl deT'4 DNA ligază (400 unități) și 0,5 pl de E.coli DNA ]» limcrază. tragmentemari (Fragmente Klenow) (2.5 unități ). Acest amestec este incubat la 1SC. timp dc cel puțin 2 h și >i .ί. idila! 1 imp de 18 h.

I ia i0/^ I dinav'est ameslei'de reacție este apoi idilizai penlru a iranslorma \>l! M( ’ 1’j6 I. care esle identificai prin abilitatea sa dc creștere pe plăci LB. conținând 50 pg/ml ampicilina. Plasmidele mutante sunt idenliticate prin abilitatea lor dea hibridiza la oligonucleotidă marcată cu 32p, folosind condiții standard. Coloniile hibridizate pozitiv sunt confirmate prin prezenta unui nou situs de restricție BamlII în plasmida DNA izolată din aceste colonii. Această construcție se referă la pLJ663B.

Aceasta rezultă din modificările secvenței naturale, după cum urmează: natural:

ATG GCT CCT GOG ATG GAATCCCCI’ ACT CTA modificat: G ATC CT

Această modificare crează o secvență de nucleotidă clivabilă cu o endonuclează de restricție BamHi. O modificare ulterioară la pozițiile 884 890 crează o secvență denucleotidăclivabilă cu o endonuclează de restricție EcoRV. Introducerea de EcoRV este realizată într-un mod similar cu cei descris mai sus. Molecula cu goluri în acest caz este formată prin digestia pl J663 (lOpg) cu enzima restrictivă Pvu II (30 unități) la 37°C, într-un volum final de 100 pl, într-o soluție tampon conținând 150 mM NaCI, 6 mM trw-HCl pH=8,0, 6 mM MgC12 și mM 2-mercaptoetanol. Aceasta digeră fragmentul pLJ663 în două fragmente, corespunzătoare în lungime de aproximativ 600 kpsi 5>0i) kp. Frasmentul de Λ<>00 kp este izolai prin electroforeză cu gel dc agaroză și este denumii ca molecula cu poluri. Molecula lineara este aceeași ca cea descrisa mai sus. Oligonucleotidă utilizata 5 în acest caz este cea descrisă mai jos. iar procedura pentru izolarea acestui mulanl este ca mai sus. iar coloniile hibridizate sunt conliimatede prezența unui nou situs de restricție IkoRV. în plasmida DNA izolată din aceste colonii. Această construcție se referă la plJ633E:

866 869 872 875	878 .881	884	88	S<>0 8' 89ί>
rviiuml CCC AAA A AC AAG	H i A TAI	AAT	ί Ai'	IC A AGA AA1
m i		CGG	Al'	G

Aceste modificări permit ca fragmentul B.1111IΠ 1 coRV O fie izolat și in 10 trodus într-un vector donat ρΒ(Ί2Β1 (Cullcn, Melhacl· f/t Euzviiiokigy. 152-684. 10.87) în care un fragment BamflI-Simil este anulat. Fragmentul BamllI-EcoRV mod ifica t d in fragmentul u man u c DN A 15 este introdus în silusuriie Bamlli-Smal alo pBC12BI în următorul mod: Fragmentul Barul 11-Bsml, 264 bp, din pLJ 663B (10 μ o din pi „T663B) este digerat la 37°Ccu enzima restrictivă BamHI (30 20 unități) și Bsml (30 unități) într-un volum final de 100 μl într-o soluție tam pon conținând 150 mM NaCl, 6 mM Zm-HCl /711=8,0, 6 mM MgCl? și 6 mM 2-mercaptoetanol. Fragmentul de 264 bp este 25 izolat prin electroforeză cu gel de agaroză. Un fragment 496 kp Bsml-EcoRV din pi J663N (10 ț/gde pIJ663E) este digerat la 37°C cu enzima restrictivă Bsml (30 unități) și EcoRV (30 unități) într-un 30 volum final de 200//1 într-o soluție tampon conținând 150 mM NaCl, 6 mM tris-HCl /?H=8,0, 6 mM MgC12 și 6 mM 2-mercaptoetanol. Fragmentul 496 kp este izolat prin electroforeză cu gel de agaroză. 35 Plasmida pBC12BI (10 μλ) este digerată cu enzima de restricție Smal (30 unități) la 37°C, într-un volum final de 100 /il într-o soluție tampon conținând 100 mM

KC1, 10 mM irsi-HCI pH=8,0, 10 mM 40

MgC12 și 6 mM 2-mercaptoetanol. Rezultatul acestor digestii este producerea a două fragmente, iar cel mai mare de aproximativ 3500 bp este izolat prin electroforeză cu gel de agaroză. Aceste trei 45 fragmente.sunt adăugate iu părți echimo leculare intr un amestec cu volum final de JO/d. într-o sol ut ie tampon conținând 4,5 mM NaCl. 45 mM/ra HCI/rif-R.ik 4.5mM MgCh.4mM 1)1)1. 1.2 mM ATP. 40 mg/ml albumimi serică bovină și 14 DNA ligază (400 mutați). Fragmentele sunt lăsate peste noapte la 4C. E.coli MC 1061 este transformată cu amestecul deligare. iar coloniile pozitive sunt identificate prin hibridizare la o probă de subunitate a cDNA umană deplasată cu o crestătură. DNA este izolat din colonia pozitivă și confirmată prezența fragmentului BamFII-EcoRVde760bp. Mai multe pozitive sunt izolate și unul dintre acestea se referă la pUllOl. Acest vector, pLJllOl exprimă nivele foarte ridicate a subunității a, dar foarte puține dintre molecule ating suprafața celulei sau vor lega IgE.

Fragmentul BamHl-Sca 1 cuprinzând următoarea secvență de nucleotide 121 710 a fost izolată din pUllOl:

Plasmida pI.J 1101 (10/zg) este digerată de enzima de restricție BamlII (30 unități) într-un volum final de 100 /<1, într-o soluție tampon conținând 100 mM NaCl, 6 mM Zrâ-HCl /?Îl=8,0, 6 mM MgC12 și 6 mM 2-mercaptoetanol până la completare. Enzima restrictivă Scai (3 unități) care urmează se adaugă astfel, încât să aibă loc digestia parțială. Fragmentul 589 bp BamHl-Scal (nucleotida 121- 710 a subunității a umane) este izolat prin electroforeză cu gel de agaroză.

				GAA	TGC CCT	AGT	(TA	CTG	TGT	GTA GCC
’l'FA	(TG	TFC	TFC GCT CCA	GAT GGG	G'FG ΊΤΑ	o. Λ	GTC	CCT	('AG	AAA CCT
AAl i	GTG	rcc	TFG AAC CCT	CCA TGG	AAT AGA	ΑΤΑ	ΊΤΤ	AAA	GGA	GAG AAT
G'FG	ACT	crr	AGA TGT AAT	GGG AAC	A A l TFC	TTF	(iAA	GTl'	AGT'	TCC ACC
AAA	TGG	TFC	CAC AAT GGC	AGC CIT	TCA GAA	< :.\< i	A( iA.	ΛΑΤ	TCA	AGT TFG
AAT	ΑΠ'	GTG	AAT GCC AAA	ΊΤΓ GAA	CAC AGT	GGA	·. · \A	TAC	AAA	TGT GAG
('AC	CAA	CAA	G'IT AAT GAG	AGT GAA	CC! GTG	TAC	CTG	(iAA	GTC'	TC AGT
(JAC	< i < i	CTG	CTC Ι.'ΤΓ CAG	GC( TCi	GCT GAG	GTG	(îT(.î	ATC	GAG	CGC gag
CCC	TF('	Γ! ( '	CTC AGG tgc	CAT GGT	FGG AGG	AA('	TGG	ga ;	G T< i	FAC AAG
( i’l'G	TAT	TAT	IAT AAG GAT	GG’F GAA	G( i <TC	.AAG	TAC	TGG	țaț	GAG AAC
< A<'	AA('	AT('	TCC' ATF ACA	MT GCC	ACA GTF	(iAA	G.A('	AGT	< ;g.a	ACC TAG
FAC	1 < .1	AGG	GGC AAA GTG	’IGG ('AG	CTG li.Xi	i Ai	(>A( >	1(1	( iAl i	((( CTC
/\A<	ΛΓΓ	A* i	G'lA A iAAA	< <<' 1 CCG	<'(îl (iA( t	AA<;

Aceasta secvență esle ligaiă la un fragment Rsal BamHI din receptorul !! .-2 care eoni ine nucieotidele 876-1016. Plasmida pil.- 2R (20 zzg) (Hakimi și al., Jounial of Eiol.('hem.. 262 1733617341. 1987) esle digerata de enzinia restrictivă BamHI (30 unități) într-un vo lum final de 200 wl inir-<> solinie tampon conținând 100 niM \'a( Ί rnM iris ’ K 9 pH=8.0. 6 mM MgCh și 6 mM 2- mor capîoetanol până la completare. Un fragment Rsal-BamHI de 14 1 bp (nucleotidcle876-1016din receptorul p55 TI-2cDNA) a fost izolat prin elcctroforeză cu gel de agaroză:

(IC AG ((' FAG (?A (GrGGCCGGCl'GTGTlTCCT( iCTGATGACC GTCCT'CCTCCTGAGTGGGCTCACCTGGCAG CGGAGACAGAGGAAGAGTAG AAGAACAATC TAGAAAACCA AAAGAACAAG AA'JTTCTGG TAAGAAGCCG

Fragmentul subunității a BamHIScal (589 bp), fragmentul Rsal-BamHI p55 (141 bp) și pEC12BI digerat de BamHI sunt ligate împreună într-o reacție conținând rapoarte ale celor trei fragmente DNA. Vectorii de plasmidă corect ligați sunt verificați prin analize cu enzime de restricție. Una dintre aceste plasmide, pLJ275, exprimă nivele ridicate ale subunității a care atinge suprafața celulei și leagă IgE, când este transfectată în celule CCS (Cullen-Methods in Enzymology, 152, 684-704, 1987).

Subunitatea umană a cDNA (Kochan, J., Pettine, L.F., Hakimi, J., Kishi, K. și Kinet, J.-P. (1988), Nucleic Acids Res., 16, 3584) poate fi modificată prin mutageneză direcționată structural (Marinaga, Y., T.Franceschiri, S.Inouye și M.Inouye. (1984), Improvement of oglionucleotide-directed site-specific mutagenesis using double-strand plasmid, DNA Biotechnol. 2:636), cum este structura BamHI introdusă la nucieotidele 879884. Fragmentul BamHI-EcoRV rezultat 10 al lui cDNA modificat este izolat și clonat în structurile BamPIl-Smal ale pBC12BI (Cullen, B.(1987), Use of eukaryotic expression technology in the funcțional analysis of cloned genes. Methods 15 in Enzymology, 152:684). Aceasta rezultă într-o fuziune în cadru unde codonii de inițiere și primii cinci aminoacizi ai genei de preproinsulină fuzionează la aminoacizii 6-257 ai subunității a umane. 20 Această construcție particulară pLKl 101 rezultă într-o expresie de înalt nivel când se transafectează în celule COS, așa cum se judecă prin pătarea imunofluorescentă a celulelor permeabilizate, uti25 lizând antipeptide antisera 81-103 și 160-197.

Vectorul conținând forma himerică a subunității a este construit prin ligarea fragmentului BamHI-Scal a subunității 30 a modificate (nucieotidele 121-170) în fragmentul Rsal-BamHI a receptorului 1L-2 (nucieotidele 876-1016) (Nikaido.

T., A.Shimizu. N.Ishida, H. Sabe, K.

eshigawara. M. Maeda. 1 .Uchivama, J. Yodoi și T.Ilonjo (1984), Molecula)· cloning o f eDNA encoding human interleukin-2 receptor. Nalure. 311:631). .Acest fragmenl ligal este apoi introdus în BaniiII digerat pBC12BI. Vectorul rezullal pl,J 1275 dircctionează sinteza subunității himerice ce codifică aminoacizii 6-201 a subunității umane o (corespunzător semnalului peptide și domeniului exiraccluiar) și aminoacizii 240271 (corespunzător domeniilor transmembranar .și citoplasmă. ) a receptorului p55 11.-2.

Amplificarea expresiei subunității .o himerice este realizată treptat mărind concentrațiile de 0.1 si 1.0 micromolar ametropterin. îmbogățirea celulelor exprimând numere ridicate de receptor este realizată prin două runde de triere a celulelor activate fluorescente folosind IgE-biotin și streplavidin-IITC. Clone stabile exprimând niveluri ridicate a suprafeței celulei IgE subunității de legătură se obțin apoi prin limitarea diluării clonelor. Cinci clone independente izolate sunt caracterizate inițial și diferă în ceea ce privește expresia receptorului, dar nu în ceea ce privește afinitatea legăturii. Clonul 3D10 este adaptat la culturile spin în mediu Dulbecco modificat de lscove, suplimentat cu 10% ser fetal de vițel și 80 /<g/ml gcntamicinsulfat.

Pentru analiza imunofluorescentă celulele pot fi incubate cu IgE- biotinilat (1-3 mg/ml),timp de 30 min în mediu Dulbecco modificat de lscove suplimentat cu 10% ser de vițel fetal (completarea mediului) la 37°C. Celulele sunt spălate de 4 ori cu mediul de completare și incubate cu streptavidin-FITC sau cu IgE-FITC de auxiliar anti-iepure (Jackson Immunoresearch), timp de 30 min, la 37°C, în mediu complet Celulele sunt apoi spălate și fie sortate pe un ortocytofluorograf 50 H, fie acoperite cu 50% glicerol, conținând 0,25 M M-propilgalat și acoperite. Celulele sunt observate pe un microscop fluorescent Leitz Diaphan (25 x obiceiiv uscat) și fotografiate cu film Kodak Tri-X.

Pentru o încercare legare IgE poale fi radiomarcat cu ^J'l până la o activitate specifică de 1...20 x 10 cpin/^g proteină lolosind doramin-T (Bazin. 11.. Querinjean, P.. Bcckers, A., Hcremans, J.F. și Dcssy. F (1974). lmp}unology,2b. 713). Tendința dc legare a ' “ ί -h’i \ a fost stabilită cum s-a descris mai sus (Isersky,

A. Kulozycki. Jr. si II.Metzger. ( 1974 ) Isolation of IgE Iro/n reaginic rai scrum., J.lmmunoL, 112:1909), ,și este în jur de 65-75%. încercările dc legare au fost făculc cum s a descris mai sus (Kulczycki, A.. Jr., isersky, C. și Mctzgcr. 11. (1974),.I.Exp.Med., 139,600), iar peniru încercări competitive probe la diferile diluții au fost preincubate cu suspensii celulare (4 x 10' celule mi) cu 30 min l^ss înainte de adăugarea a 250 ng/m 1 “ I-IgE. Legătura nespecifică este determinată prin adăugarea a 50...100 sau mai mult de IgE nemarcal în tuburile de încercare și aceste valori sunt scăzute din valorile experimentale pentru a da legătura specifică. Cinetica de asociere și disociere dintre IgE și receptorul recombinant s-au determinat prin metode descrise anterior (Kulczycki. A., Jr. și II.Metzger. (1974), The interaction of IgE with rat basophilic leukemia cells. II. Quantitative aspectsofthe binding reaction., J.Exp.Med., 140:167); (Ishizaka, T., B.lllem, J.Hakimi, J.Niebyl, KIshizaka și H. Gould. (1986), Biological properties of a recombinării human immunoglobulin epsilonchain fragment., Proc.NatlAcad.Sci. USA, 83:8323); (Miller, L., Blank, U. Metzger,

H. și Kinet, J.-P. (1989), Science, 244, 334-337). Constanta vitezei de înaintare (ki) este calculată din ecuația Ki= Vo/ IgEoRo unde Vo reprezintă viteza inițială de legare și IgEo și Ro reprezintă concentrațiile molare inițiale ale IgE și receptorului. Constanta vitezei de disociere (k-i) este calculată presupunând că disocierea unui ligand de receptori este un proces simplu de ordinul unu. Constanta de echilibru (Ka) este calculată cu ecuația:

Κι = ki/k-i

Pentru analiza legăturii, liniile de celule permanente exprimând receptorul himeric pot ti stabilite în celule OHO, 5 utilizând tehnologia de co-ampliiicare a genelor de legătură. Pentru a demonslra in mod clar că domeniul extracelular al subunității tr. este suficient pentru o legătură IgE de afinitate ridicată, cens Ji tanta dc echilibru ;·. asocierii și disocierii este stabilită prin determinări independent·' ale constantelor vi tezei de asociere si disociere, așa cum s a descris mai înainte penlru receptorii uman și rodent. Numărul receptorului pe celulele t Ί1Ο este determinat pini incubarea celulelor cu 10 îngâni dc ‘“'Ι-IgE. timp de 2 h. Densitatea receptorului a variat intre 4-10 x 10 moleculă,celulă.

După ce invenția a fost descrisă mai sus în principiu, următoarele exemple și fig.l...4, intenționează să ilustreze în detaliu invenția, fără a o limita.

^s P 5

- fig. 1, inhibarea a I-IgE (preparat prin metoda cunoscută cu cloramin-T) legând la CHO-FcERI (subunitatea a himerică) celulele de anticorpi monoclonali. Datele sunt exprimate ca procente de inhibare a legăturii ^I- IgE în prezență de concentrații indicate de anticorp comparate cu legătura specifică totală în absența anticorpului. Procentul de inhibare a fost determinat așa cum este descris în exemple pentru IgE nemarcat (□) și pentru anticorpi 15A5 (), 12E7 (Δ), 22E7 (·), 5D5 (O), 2906 (X) și 808 (4);

⁴ . 125

- fig.Z inhibarea legăturii I-15A5 (A) și ^1λ5Ι- 22E7 (B) la celule CHOFcER (subunitatea a himerică) prin IgE și anticorpi monoclonali. Datele sunt exprimate ca procente de inhibiție a legăturilor ¹²⁵I-15A5 sau ¹²⁵I-22E7 în prezența unor concentrații indicate de anticorp, în comparație cu legătura specifică totală în absența anticorpului. Procentul de inhibiție s-a determinat. în tabloul A pentru IgE nemarcat (·) și pentru anticorpi 15A5 (□), 12E7 (),

22E7 Γ), 5D5 (x). 29(¾ (a) și SCS («) și tabloul B pentru anticorpi 15A5p), I2E7 (), 22E7 (o). 5D5 (·), 2906 (Δ) și SCS (A). Anticorpul specific de control penlru proteina neînrudită nu reduce legătura specifică în nici o încercare:

- fig-3, stimularea hislaminei eliminate din bazofilele umane prin tratare cu anticorpi anti-lgEsau anlicorpi. conform prezentei invenții. Ba/ofilcsanguine pe riferiale umane s-au preparat și tratat cu concentrații indicate de anticorp anii !gi i sau cu aniicorpi. conform prezentei invenții, așa cum este descris în exemple. Eliminarea histaminei a fost măsurată așa cum s-a descris (l-leim. 13.. Kcbo. D.. Verchelli. D.. Glorskv. M.. Gould, 11.. Ishizaka. K., Gchc. R. si Ishizaka, T. (1989). Proc.NatLAcad.Sci.USA. 86, 9465-9569);

- fig.4, comparația inhibării legăturii “ I-IgEla celulele bazofilice de leucemie (RBL) ale șobolanului și celulele OHO -FcERI (subunitatea a himerică) de anticorpii nemarcați IgE și monoclonali, conform prezentei invenții. Datele sunt exprimate ca procente de inhibare a legăturii șobolan IgE la celulele RBL, de exemplu RBL-1 (ATCC CRL 1378) și legătura umană ²~I IgE la celulele CHO-FcERI (subunitatea a himerică) de către anticorpii nemarcați la șobolan IgE și anti-umani ai subunității

a. Procentele de inhibare au fost determinate așa cum s-a descris în exemplele pentru concentrațiile indicate ale fiecărui anticorp. Anticorpi nemarcați de șobolan IgE (X) și anticorpi monoclonali 4B4 (O), 6F7 (o) si anticorp de control (Δ) pe celulele RBL. Anticorpi nemarcați 4B5 (), 6F7 (·) și anticorp de control (A) pe celulele CHO-FcERI (subunitatea a himerică).

Exemplul 1. Purificarea și marcarea a IgE uman și de șobolan cu și biotin

Celulele myeloma umane IgE (PS) au fost purificate (Hakimi, J., Seals, C.,

Pettine, L.F. și Kochan, J. (1990), Science (in press); Ishizaka K. (1985), Immuno109707 globulin E iIgE). Methods In Enzwnologv. 116, 76), iar IgE de șobolan a fost purificai de fluidul de ascile al nu/nu Immunocytoma IR 162 purtătoare de șoaicce (Bazin, 11., Querinjean. P., Beckers. ?\., Ileremans, J.E și Dcssy, E (1974), Immunology, 26, 713. IgE a fost biolinilat cu acid biolinil-epsilon-amino capronic X- hidroxisuccinimidă ester (BXXIIS. ('alBiochem) ( Bayer. EA., Skulelskv. E. și Wilchek. .VI. (1979). Methods in EnzMnology. 62. 308). |o|^; umaiț și ci<' a iosl radiomarcat cu I ia o aciiviiale specifica vie 1-2 x 10' cpm/mg proteină folosind cioramin-1 (.McCohahev. P. și IJixon. Ε.Ι. (1986), Int.Arcii.AHergv, 29, 185).

Exemplul 2. Purificarea subunității o himerice solubile (’eluleie CIK) exprimând 4-10 x 1(P subunități a himerice/celulă au fost menținute în mediu Iscove modificat Dulbecco (IMDM), conținând 10% ser fetal de vițel (FBS), 1 mM glutamină, 50 mg gentamicină și 3 x 10’⁶ M metotrexat ca agent selectiv. Celulele au fost recoltate, spălate cu saramură tamponată cu fosfat (PBS, pH=7,4) și solubilizate (10^v celule/ml) în PBS rece, conținând 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA. 40 ț/g PMSF și 0,02% NaN3 (10 mM CHAPS/ PBS ca tampon). Extrasul celular a fost centrifugat la 100000 x g, timp de 70 min pentru a îndepărta resturile celulare, iar subunitatea a himerică solubilizată a fost cromatografiată pe o coloană de afinitate IgE.

IgE uman sau de șobolan (5 mg) a fost cuplat la 1 ml de Affigel- 10 (BioRad Labs, Richmond CA). Rășina de afinitate IgE a fost spălată cu cinci volume ale coloanei de 0,2 M HAc, 0,2 M NaCl, 2 mM CHAPS, pH=2,8 (acid acetic CHAPS ca tampon), urmată de reechilibrare cu 10 mM CHAPS/PBS ca tampon. Preparatele solubilizate ale subunității a himerice (1 la 6 x 10 celule echivalente) au fost aplicate pe coloană, spălate cu 10 mM CHAPS/PBS ca tampon și 2 mM CHA PS/PBS ca tampon (2 mM CHAPS, 1 mM l-DIA. 40 ug PMSE 0.02% NaN; în PBS /?11=7,4) și eluate cu acid acetic-CHAPS ca tampon. Fiecare fracție a Iosl imedial neutralizată cu 3 M tris.

/?H=9. Fracțiile conținând proteină au fost dializate contra tamponului 10 mM CHAPS PBS și testate sloi biol pentru subunitatea activă himerică <r.

Testul sloi blot” pentru a detecta 10 subunitatea himerică c

Extractele solubile de CIIO-FcHRI (subunitatea himerică) celule și subunitatea <t himerică purificată de afinitate au lo.st diluate cu un volum egal de 15 10 mM /m-glicină ca tampon. 20% metanol, ρΐI =8,3 și filtrată in vacuum pe nitroceluloză (0.45 mM), folosind o unitate· industrială (Scheleicher și Schu-ell. Keene. XII). Banda de nitroceluloză a 20 fost blocată timp de o oră. Ia temperatura camerei. în saramură tamponată cu fosfat (PBS), conținând 2% aibumină serică bovină (BSA), incubat cu IgE-biotin (0.5 //.g) în CHAPS/PBS ca tampon (10 mM 25 CHAPS. 5% ser fetal de bovină, PBS /?H=7.4), timp de o oră, spălat cu PBS conținând 0,05% Tween-20 și reacționat cu streptavidinperoxidază în CHAPS/ PBS ca tampon (Amersham Corp.) timp 30 de 30 min. Pânzele au fost spălate și complexul subunitate a himerică/IgEbiotinilat a fost vizualizat cu 4 cloro-lnaftol (0,5 mg/ml în 0,15% II2O2,0,5 M NaCl, 50 mM trâ-HCl, pH=7,5), timp 35 de 30 min.

Marcarea subunității a himeric^urificate de afinitate a proteinei cu ¹”I ₇ji N-glicanaza tratament a subunității a himerice

Subunitatea a himerică purificată de afinitate a fost marotă timp de 30 min cu 0,2 mCi de Na¹ !, folosind reactiv Enzimobead (BioRad Labs.), în conformitate cu protocolul fabricantului.

Proteina marcată a fost separată de iodul liber pe o coloană cu BioGel P6DG (BioRad Labs.), echilibrată cu 2 mM CHAPS/PBS, diluată cu un volum egal de 2 mM CHAPS/PBS cu 1 mg/ml BSA 50 și depozitai la 4(’.

Subunitatea Iiimerică radiomareală a fost uscată sub vacuum și resuspendaiă în 0.2 M fosfat de sodiu. 10 mM EDTA. /,11=7,0. Digestia cu N-glicanază (3 unităli) (Genzime. Boston. Ma. USA) a fost realizată timp de 2 zile, la 37ΎΛ într-un agitator, iar reacția a fost oprită cu 0,1 M cilral ca tampon./?i 1 =4.5.

Exemplul 3. încercări de legare a receptorului și reticulurea de afinitate ( ciulele C!K)-FcPRl (subunitalea <r himerica)sau RBI. au fost resusneudate ia 4 x 10° celule,ml in RPMI 1640, 5% ser teta) dc bovină 5 m Μ 111 il'ES pH -- 7.4 Șampon de legare) și incubal cu IgE “ i marcat (10 ng/ml la 1 mg/ml). Legătura nespccifică a fost determinată prin adăugare a 5()...100 sau mai mult dc IgE nemarcat la tubul de încercare nespecific. Celula cu radioactivitatea legată a fost separată de marca nelegată prin centrifugarea prin ulei de silicon (Kilian, P.L.. Kaffka. K.L., Stern, /X.S., Woehle, ID.. Benjamin. W.R., Dechiara, T.M., Gubler,

U.. Farrar, J„ Mizei, S.B. și Lomedico, P.T. (1986), J.Immunol., 136.1-6). Pentru încercări competitive, probele de anticorp la diferite concentrații au fost preincubate cu suspensii celulare, timp de o oră, la temperatura camerei, înainte de adăugarea de IgE uman ^iiJ>I-marcat (19 ng) sau IgE de șobolan (250 ng). Probele au fost incubate pentru încă o oră la temperatura camerei și tratate cum s-a descris mai înainte. Inhibarea ’^i-IgE la CHO-FcERI (subunitatea a himerică) sau celule RBL s-au determinat prin compararea legăturii specifice totale în prezența anticorpului, cu legătura specifică totală în absența anticorpului.

Pentm prepararea complecșilor solubili de ^lz>I-IgE reticulat la subunitatea «himerică, celulele au fost incubate cu ι-IgE, spălate cu PBS și resuspendate în PBS rece, 1 mM MgC12, pH=8,3, la o concentrație de 10⁷ celule/ml. Disuccinimidă suberat (DSS) (Pierce Chemical Co.) în dimetilsulfoxid (MeSCM) a fost adăugat la concentrația finală de 0,4 mM și reacția a decurs timp de 30 min, la 4C. cu agitare constantă. Reacția a fost oprită brusc, iar celulele spălate cu 25 mM n/x-IICI /41 = 7.5, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA. Celulele au fost solubilizate în gțieată 10 mM CHAPS/PBS ca tampon (10' celule/ml). așa cum s-a descris mai sus. Extractul de celule a lost analizat cu SDS/PAGE (I.aemmli. J.K. (1670), Nature. 227. 68()-685) sau a fost imunoprecipitat cu anticorpi înainte de analiza cu SDSTA( -l·.

Exemplul 4. Prepararea, caracterizarea și purificarea anticorpilor hvbridoma

BAI.B c de șoarece (Charlcs River Laboralories. Wilmington. MA) au fost imunizate pocale intra peritoneală (i.p.), cu subunitatea « himerică parțial purificată (de la 7 x 10 celule echivalente), amestecatecu unvolumegal deadjuvanf complet i’reund. Două săptămâni mai târziu, șoarecele a fost injectat i.p. cu o cantitate similară de subunitate a himerică purificată amestecată cu adjuvant incomplet Freund. Șapte săptămâni mai târziu, un șoarece a fost injectat

i.p. și i.v. cu subunitate « himerică adițională (de la 5,5 x l(r celule echivalente) două zile succesive, începând cu 4 zile mai înainte de fuziunea celulei. Celule de splină au fost izolate de la acest șoarece și fuzionate cu celule NSO (Galfre. G. și Milstein, C., (1981), Methods in Enzymology, 73. 3- 466) într-un raport de 1:1 (celule de splină:NSO celule) cu 35% polietilenglicol (PEG 4000, E.Merck) (Fazekas De StGroth.

S. și Scheidegger, D. (1980), J.Immunol. Methods. 35, 1-21). Celulele fuzionate aij fost placate la o densitate de 5 x 1(E celule/sursă/ml în 48 plăci, în IMDM suplimentat cu 15% FBS, glutamină (2 mM), I-mercaptoetanol (0,1 mM), gentamicin (50 /zg), HEPES (10 mM) și 15% P388 Dl supematant (Nordan, R.P., Pumphrey, J.G. și Rudikoff, S. (1987), J.Immunol., 139,813-817). Supematanții hibrid au fost selectați pentru anticorpii subunității specifice» în 3 încercări: 1) imunoprecipitarea subunității a himerice

I-marcat: 2) ințunoprecipilarea complexului solubil — 1-IgL· reliculal la suhunijaiea himerică <t; 3) inhibarea legăturii “ 1-Igl' l<t ( I IO- i’cERl (a subunității himerice a). Liniile de celule hvbridoma au iosl donate prin limitarea diluției.

Pentru încercările dc imunoprecipi tare (încercare IPk supernatantul de hvbridoma sau probele de anticorp purificat (20 mg). tamponul IP (4 mM CU^PS/PBSpi 1=7.4. 1 mg/ml BSA) și fio I marcat al subunității himerice </. fie corn plexul <oi ubil al 'J-lgL reliculal ia subunitatea himerica a au Iosl ames tecate Împreună și lasale să sica limp de 30 miîi.

Anlicorpi de capră, anti-șoarece, cuplați cu slraluri de agaroză (Sigma (.’hemical (.’o. Sl.I .outs. MO) s-au adăugat la tuburi care s- au rotit timp de 2 h. la temperatura camerei. Straturile au fost spălate de trei ori cu tampon IP și numărate. Liganzii de legătură au fost eliminați prin adăugarea de SDS/PAGE probă tampon și încălzire la 95°C, timp de 3 min. Proteinele puse în libertate au fost analizate prin SDS/PAGE și autoradiografie.

Anticorpii au fost, de asemenea, testați prin analize western blot, pentru legătură în scopul denaturării subunității himerice a (Burnette, W.H. (1981), Anal.Biochem., 112, 195-200). Pe scurt, proteinele solubilizate au fost separate prin SDS/PAGE în condiții fie nereduse sau în condiții reduse și transformați electroforetic în membrane de nitroceluloză. Membranele au fost tratate cu 1% BSA. PBS />H=7,4, timp de o oră, la 37°C și în continuare probată cu probe de anticorpi diluate în tampon anticorp (1% BSA 50 mM fosfat de sodiu, pH=6,5,0,5 M NaCl, 0,05% Tween-20), timp de 2 h, la temperatura camerei. Membranele au fost spălate, reacționate cu anticorpi anti-șoarece de capră IgG cuplat la peroxidază, iar anticorpul legat vizualizat cu 4-cloro-l-naftol, timp de 30 min, la temperatura camerei.

Anticorpii au fost purificați din cul turile de hvbridoma ia scară mare prin cromatografie de afinitate pe legătura protein-G pentru a relicula agaroza (Genex. Gatthersbug MD. SUA).

Exemplul 5. Legarea anticorpilor la pr< >1 uleie sir ti etice peptide. acoperind întrcasia secvență exlracelulară a subunității rt. au Iosl preparate prin sinteză standard în 10 fază solidă (Baranv. G._ și Merrifield.

R.B. (1980). JhePeptidesAnalvsis Svnthesis, Biology, (Gross. L... și Meienhofer. .1.. eds). voi.2. pp. 1-255. Academic Press. Xew York). I’eptidele purificate au (ost 15 dizolvate (1 mg ml) în apă distilata sau

MeSOi, Plăcile I‘.IA au fost căptușite cu 200 mg din fiecare peptidă. în 50 mM bicarbonat ca tampon.pil =9,6 și apoi uscate, peste noapte, la 37°C. Plăcile au 20 fost spălate cu apă. blocate cu BSA.

PBS />11=7.4 și incubate cu anticorp, timp de 2 h, la temperatura camerei.

Plăcile au fost spălate cu 0,05% Tween-20, PBS />11 = 7,4 și s-a adăugat Ig anti25 șoarece de capră cuplat cu peroxidază (Boehringer Nanheim ImmunochemicaÎ), timp de 2 h, la temperatura camerei. Complexele de anticorp-peptidă au fost vizualizate cu o-fenilendiamină (0,4 30 ing/ml) dizolvată în 0,1 M citrat ca tampon, />H = 4,6, conținând 0,012% H2O2 la 492 nm.

Exeqiplul 6. Legarea probelor cu anticorpi ^T-marca ți

Anticorpii 15Α^_$12Ε7 și 22E7 au fost radiomarcați cu ^I printr-o metodă lodogen modificată (Pj^rce Chemical Co.). Pe scurt, 1 mCi de ¹“I-Na (Amersham Co.) și 50 ml de 0,5 M fosfat de 40 sodiu ca tampon,/>11=7,5 s-au adăugat la un tub de sticlă borosilicat căptușit cu 50 pg de lodogen. După 4 min, anticorpul (50 pg) în PBS, />H=7,4 a fost adăugat, reacția continuând timp de

8 min, la temperatura cameigi. Anticorpul marcat a fost separat de 1-liber, prin cromatografie pe o coloană cu biogel P6DG (BioRad Labs.). Legarea anticorpilor marcați la un CHO-FcERI (subu50 nitatea a himerică) a fost determinată, /

așa cum s-a descris peniiu ” 1-lgL. Legătura nespecifică a fost determinată în prezența a 100 ori exces molar de anticorp nemarcat sau IgE. Dalele de legătură de echilibru au fost analizate (Scatchard. G. (1940). Arin. N.Y. Acad. Sci.. 51. 660-672) pentru a estima constanta dc disociere (Kd) pentru anticorpul marcat și numărul de structuri legale per celulă. încercări competitive cu anticorpi nemarcați purificați și supernatanți de la celule hvbridoma au fost efectuate asa cum s-a descris pentru j ' T ^{1 1} j ' ?>

I-lgE. cu excepția că anticorpul 1marcat s-a adăugal la sfârșitul unei ore de fază pre-incubatoare. Concentrația anticorpului care inhibă 50% din legătura Iigantului marcal a fost stabilită ca fiind IC50.

Exemplul 7. Legarea anticorpilor la EcERI native pe hazoftle umane

Bazofile umane au fost îmbogățite din sânge periferial heparinizat prin sedimentare în Ficoll-Paque (Pharmacia) (Leonard E.J.. Roberts, R.L. și Skell,

A. (1984), J.Leukocyte Biol., 35, 169). Bazofilele spălate (1,5 x 10' celule) au fost incubate cu 2,5...40 mg/ml anticorpi purificați în PBS, conținând 1% FBS și 0,02% azidă de sodiu, timp de 20 min, la temperatura camerei. Celulele au fost spălate și apoi incubate cu IgE antiuman de capră marcat cu fluoresceină și (Fab)2-capră anti- șoarece IgG marcat cu rodamină {l'ago Labs, Burlingame, GA.). Celulele au fost spălate și dispersate pe un plan înclinat folosind aparatul Cytospin (400 rot/min, timp de 5 min).

Planul înclinat a fost supraîncărcat cu 90% glicerină, conținând 0,22 M

1,4-diazobiciclo (2, 2, 2) octan (Sigma Chemical Co.) (Krenik, K.D., Kephart,

G.M., Offord, K.P., Dunnette, S.L. și Gleich, G.J. (1989),J.Immunol.Methods, 117, 91-97). Celulele au fost observate la un microscop fluorescent Leitz Displan și fotografiate cu Kodak extracrom 400.

Eliminarea histaminei s-a realizat așa cum s-a descris mai înainte (Helm,

B. , Kebo, D., Verchelli, D., Glorsky, M.

Gould. ÎL, Ishizaka, K., Gehe. R. si Ishizaka, T. (Î9S9) Proc.NatlAcacLSci.. USA 86, 9465-9469).

Exemplul 8. Caracterizarea anlicor5 pilor monoclonali la subunitatea a Extractele brute de celule CIlO-FcERI (subunitatea <z himerică) și subunitatea a himerică solubilă purificată au fost evaluate în ceea ce privește acliJ0 vitatea de legare specifică IgE printr-o încercare slot blot. Evaluările calitative ale rezultatelor încercărilor sloi blot'' au demonstrat că. cantitatea de subunitate o, himerică parțial purificată, prezentă în 15 imunizările primară si secundară, a tos!

de aproximativ 7 la 28 ug. Pentru imunizarea finală, șoarecele a primit aproximativ 100 //o de subunitate himerică parțial purificată, așa cum s-a determinat 20 în încercarea sloi blot. Șoarecele injectat cu subunitate a himerică purificată a produs ser cu anticorpi c^rc au blocat în mod eficient legătura ^J~I-IgE la celulele CHO-FcERI (subunitatea himerică) și a imunopjecipitat atât subunitatea a himerică ^I-marcată cât și complexul solubil al ^I-IgE reticulat la subunitatea himerică a. O fuziune cu celulele de splină izolate dintr-un șoa30 rece au condus la 47 hybridomas, secretând anticorpi monoclonali (mAb), conform prezentei invenții (tabelul care urmează). Toți anticorpii au imunoprecipitat o proteină radiomarcată cu apro35 ximativ 47 kD ție la prepararea subunității a himerice ~Ι- marcată. Cele două proteine principale radiomarcate de aproximativ 47 kD și aproximativ 65 kD prezente Ja prepararea subunității a hi40 merice '“ I - reprezintă subunitatea a himerică marcată și albumină serică de bovine. Pentru datele respective vezi tabelul, în care numerele 1...7 au următoarea semnificație:

1. încercare;! de imunoprecipilare (Încercare IP) efectuată așa cum s-a descris mai^its, cu subunitatea a himerică purificată ^I-marcată t¹ î-cilfciV subu nitatea ςξ himerică “ T-marcat deglicozilată ( ' I-de-<///ă) și complexul solubil al ~ I Iul· au reticuiat la subunitatea himerica ( 1-lgF. %/λ).

2. Încercarea de legare a receptorului efectuată așa cum s-a descris mai sus. cu celule ( TIO exprimând subunitatea <.t himerică recombinaioă (CH< )-Fcl il<l subunitatea (î himerică) si celulele KBE.

I.iganzii radiomțucali in^Luși în încercări au fost '''I-Iul·.. ~ I-15A5 si ¹ ^1-2207.

3. Peptidă 1 IA efectuată așa cum s-a descris mai sus. cu 16 peptide sintetice corespunzând secvenței de aminoacizi (secvența aa ) al domeniului extracelular al sub u ni lății a.

4. Numerele din paranteză reprezintă 5 numărul de anticorpi în fiecare clasă și tip de anticorp. Anticorpul prototip este listat în paranteză sub fiecare tip de anticorp.

5. Deosebirea dintre lipul 2a și 2b 10 de anticorpi este aceea că tipul de anticorpi

2b se leagă la porțiunea vestică a domeniului extraceiular recombinau» al subunității te exprimată în E.coli.

6. lUsoeste mai mare de 120 mgnil.

7. λ ,,, este 0.I<8 mg>ml.

mAb Class	încercarea IP1	încercare 2 de levare a receptorului CHO-FcERI		Peptidă
	125I u l-alja	125l-de- alfa	125I- I țfo-Îalfa	H-IgE	1¾ 15A5	125i_ 22E7		E1A3 (Secvența aa)
Inhibitor (18)4 Tip 1(1)4(15A5)	+	+		T	+			125-140
Tip 2a(13)(12E7)	+	-1-	-	4-	+	-	-	fără
Tip 2b(3)~(6F7)	+	+	-	+	4~	-	-	fără
Tip 3(1)(484)	+	+	-	4~	+	-	+	fără
Ne-inhibitor(28) Tipl(24)(505.22E7)	-L	+	+			+		fără
Tip 2(3)(3995)	+	+	+	-	-	-	-	fără
Tip 3(1)(29C6)	4	+	+	-		+ 7	-	fără
|Tip 1(1/(11841	+	4“	+	-	-	T	+	43-58

Cei 47 anticorpi au fost împărțiți în clase de ne-inhibitori și inhibitori în funcție de abilitatea lor fie de a imunoprecipita complexul solubil al ¹²⁵I-IgE reticuiat la subunitatea ct himerică, fie 25 de a inhiba legătura ¹²⁵I-IgE la CHOFcERI (subunitatea « himerică). Cu SDS/PAGE și analiza autoradiografică, 6 anticorpi ne-inhibitori (22E7, 2906, 11B4, 808, 24B4 și 5D5) au imunopre- 30 cipitat două proteine cu greutate moleculară aproximativă de 19 0 kD și 250 kD din extractul solubil al ^1Z5I-IgE reticuiat de afinitate la CHO-FcERI (subunitate a himerică). Anticorpii inhibitori 15A5, 12E7, 6F7, 4B4, 23B8 și 39D7 nu au imunoprecipitat acești complecși radiomarcați. Deoarece subunitatea a himerică este puternic glicozilată, lecitina de germeni de grâu s-a legat la agaroză reticulată, precipitând astfel complecșii

190 kD și 250 kD.

Anticorpii inhibitori 15A5 și 12E7 blochează legătura I- IgE la celulele CHO-FcERI (subunitatea a himerică) (Fig. 1). IC 50 (jumătate din inlțțbarea maximă) pentru a bloca legătura ^L“ I-IgE are valoarea 0.33, 0.89 și 2.43 /zg/ml pentru 15A5. IgE și 12E7 respectiv. /Veste dale sugerează că 15Λ5 și 121(7 au o afinitate de aproximativ 2.5 ori mai mare și respectiv mai mică pentru subunitatea a decât o are IgE. Patru anticorpi ne-inhibitori (22E7, 5D5, 8C8 și 29(26) nu blochează legătura radiomarcată IgE la celulele purtătoare ale subunității himerice a (Fig.R

Legarea a ¹ I-I5A5^: Ί-IgE si ^,2Ί-22Ε7 la celulele CHO-FcERI (subunitatea a himerică) arată că. constantele de disociere aparente (K()s) pentru fiecare ligand sunt 1,57 nM, 2.99 nM și 0,81 nM.

Mulți dintre anticorpi se leagă la subunitatea a himerică în porțiunile vestice și numai un subgrup de anticorpi ne-inhibitori (de exemplu 22E7) se leagă la ambele subunități himerice a redusă și denaturată în porțiunile vestice. Greutatea moleculară aparentă a celulelor OHO exprimând subunitatea a himerică, este de aproximativ 47 kD. așa cum s-a determinat prin analiza porțiunii vestice (western blot) și a^țoradiografia subunității a himerice T-marcată pe SDS/ PAGE. Aceaslă greutate moleculară aparentă arată că suprafața celulei subunității himerice a este puternic modificată posttranslațional întrucât cDNA pentru subunitatea a himerică arata o greutate moleculară de aproximativ 24 kD (Hakimi, J., Seals, C., Pettine, L.F. și Kochan, J. (1990), Science (in press). Pentru a determina dacă anticorpii recunosc reziduurile carbohidrat sau secvența de peptide a subunității a, fiecare anticorp a fost testat prin imunoprecipitare cu Nglic^jiază digerată a subunității himerice a ι-marcată. Receptorul digerat de N-glicanază migrează cu o greutate moleculară aparentă de aproximativ 25 kD.

Ambii anticorpi (11B4 și 39D5) neinhibitori și (15A5) inhibitori imyijioprecipită subunitatea a himerică ~'Imarcală de aproximativ 25 kD deglicozilată. Majoritatea (Ishizaka. T. și Ishizaka K.. Progress in Al ier gr. 34. 188-235 și C'ullen, Β. (1987). Usc of eukarvotic expression technology in the funcțional analvsis ofeloned genes. Methods in Enzxu niolt))· 152:684) anticorpilor monoclonali iipunoprecipită subunitatea r: himerică marcată deglicozilată.

Exemplul 9. Identifica)·.a epitopii·.»· anticorpului

Legătura fiecărui anticorp la 16 peptide sintetice acoperă întreaga secvență extracelulară minus semnalul peptide (aminoacizii 26 la 204) al subunității a și a fost determinată cu testul EI A. Peptidele corespund secvențelor de aminoacizi 26-51, 43-58. 51-65. 59-74. 73-88. 66-80,81-103, 93- 110, 104-117, 111-124, 118-132. 125-140. 134-158. 151-167. 160197 și 185-204 a subunității a mature. Dintre cei 43 anticorpi testați, numai 2 se leagă în mod specific de peptide. Anticorpul inhibitor 15A5 recunoaște seria de peptide conținând aminoacizii 125-140. în timp ce anticorpul 11B4 se leagă la o peptidă reprezentând secvența 43-58. Nici un anticorp nu reacționează cu vreo aha peptidă ca de exemplu peptide corespunzând secvenței 81-103.

Epitopii lui 15A5 și 11B4 includ probabil regiunile în jurul aminoacizilor 130 și 50 respectiv, deoarece nici un anticorp nu se leagă la peptidele parțial acoperite (118-132 și 132-158 pentru 11A5; 26-51 și 51-65 pentru 11B4).

Pentru a identifica epitopii anticorpilor care nu se leagă la peptidele sintetice, s-au efectuat studii competitive care au măsurat abilitatea fiecărui anticorp de a bloca legăturile ¹²⁵I-15A5 și ¹²⁵I-22E7 (omologul anticorpului 11B4) la celulele

CHO-FcERI (subunitatea Legătura a ¹²⁵I-15A5 și a himerică).

¹²⁵I-22E7 la receptorul celular a fost saturabilă și specifică. IC50 pentru inhibarea legăturii ¹²⁵I-15A5 de 15A5 nemarcat, IgE și

121:7 au fost 1.()9. 2.41 și respectiv 13.74 mg ml (big.2). Țpji anlicorpii neutrali pot bloca legătura ‘^1-15/35 la celulele CIK) FcERI (subunitatea <: himerică), sugerând că anticorpii neutrali recunosc un 5 epitopcomun sau epitopi strâns adiacent i. Un anlicorp nc-inhibito^c 29( Ό. poae. inhiba parțial legătura 'Ί-Ι5Α5 i.i 129 ag ml. in timp ce aiii aniicorpj ne-inhi bitorț nu au blocat Icehiura ’ IV.'’

ί.ι aceste concentraiιι (1Έ.2ΐ.

b mi pentru inhibarea legăturii ‘1

..'21 ” de 221 7 nemarcat. 29(4-,. ,x( ’x < au tost 9.2<>. ti.,i<\ '!.2d si res|)>.*ciiv

o. /¹·’ zzg/mi. Supernatanlii de hvbridoma B < *'iiiiiinix! ..2din _ _xui!!ii<-orpi neutrali au Lineal legătură ‘ I-22I-.7 la celulele < ΗΟ-Ιτί ΚΙ (suniiiiiialea <: himerică).

i pitopn recunoscuti dintre cei trei anti corpi neutrali rama>i (deexemplu 39IJ5) 20 mi au blocat legătură radiomarcată 22157 ia aceste celule, indicând că epitopii lor nu au iost protejați cu epitopul 22E7 (secvența de aminoacizi 43-58). Anticorpul inhibitor 15A5 a blocat aproximativ 25 25% din legătura 221:7 radiomarcată la celulele CHO-FcERI (subunitatea a himerică). Acest nivel de inhibare a fost constant și nu a putut fi crescut prin adăugarea de 15A5 suplimentar la reacția 30 de legare. IgE nemureai și alți anticorpi inhibitori (de exemplu 12E7) nu au putut inhiba legătura 221:7 radiomarcată la aceste celule.

Exemplul 10. Legarea anticorpului la 35 receptorul activ FcE (FcERI) la bazofile umane

S-au efectuat două teste de fluorescentă color pentru a evalua abilitatea anticorpilor monoclonali din prezenta 40 invenție de a recunoaște subunitatea a nativă ca parte complexului FcERI pe bazofile umane. întrucât bazofilele umane normale au în mod obișnuit IgE legat la majoritatea receptorilor lor FcE. 45 anti-IgE marcați FITC vor păta bazofilele. indicând prezența celulelor cu receptorii IgEocupați FcERI. Bazofilele sunt foarte slab colorate cu anticorp inhibitor 15A5. Acest anticorp colorează puternic celu- 50 lele CiR) bcl'.RI isubunilalea <' hime nea ) .și indii a doar o slabă colorare la aceleași celule, după o prelralarc cu b:l . Aceste date arată ca epitopul I5A5 eslc blocat la majoritatea receptorii·'; I cbRI pe bazofile. lotuși, anticorpul ne inhibitor '4% · 4 orc axă intens ace 'oasi ceiuli.- la care .Mc lcs»al btl·’ Îii<iic;îii4 · ă Igr. si '4)5 se pot leua -.upiili.tii !.s ‘oceploru! nativ FcERI. Num.o ambii anticorpi «.olorați anti-Igl. i niofe.i/.a < cluicio demonstrând ca aiin- • . ·ί?>i snηl toarte speciiici pentru ba/ofilc.

..piοι ηi ί < i ,K1 laxorize.i/.a de granularea bazotilelor când Igl și an • igenul ret imleaza doi sau mai mulți itccpioiI. Moleculele dc anlicorp bivalent ia\ orizeaza. de asemenea, degranularea bazotilelor prin reticularea receptorului nativ FcERI. Abilitatea fiecărui anticorp de a induce degranularea poate fi măsurată prin cantitatea de histamină eliberată din bazofile în prezența diferitelor concentrații din fiecare anticorp (fig.3). Anticorpii anti-IgE induc eliberarea histaminei din bazofile într-o mă sură dependentă de doză (fig.3. reprezentarea interioară). Anticorpii ne-inhibitori. 5D5 și 22E7 pot induce eliberarea maximă de histamină la concentrații scăzute de anticorp (fig.3). lotuși, anticorpii inhibitori. 15Λ5 și 12E7. nu induc eliberarea histaminei la concentrația cea mai scăzută de anticorp (fig.3). întrucât majoritatea receptorilor FcERI sunt ocupați de IgE Concentrații mai mari ai acestor doi anticorpi neutrali induc eliberarea histaminei (fig.3) mai mult datorită reticulării receptorilor neocupați de IgE.

Exemplul 11. Legarea anticorpului la receptorul nativ FcERI la celulele RBL anticorpi inhibitori (15A5. 4B4. 39D7, 12E7. 6F7 și 23B8) și 6 neinhibitori (22E7. 5D5. 8C8, 24 B4. 29C6 și 11B4) au l’osl testați pentru abilitatea lor de a inhiba legătura Ι-IgE la receptorul FcERI pe celulele RBL sau de a jmunoprecipita complexul solubil al ^I'~^>I-IgE reticulat la subunitatea a de șobolan.

Niim.ii ηn antnorp jniubilof. 4B4. blochează legătura igl·. l-șobolan la celulele RBL. ICySo pentru 4B4 ce blochează legăi ura ¹ ” 1 -Igi: l<t celulele ('1 Ii )ERI(subunilalea<c himerica) și celulele 5 RBL suni 0.6 și respectiv 330 mg/ml. Igl· nemarcal de șobolan a fost aproxi malivde 1100 ori mai p^țent decât 4ΙΠ la blocarea legai m ii El; ~ I șobolan la . ('lulele RBl,. Nici un alt aquicorp nu a i pulul bloca legălura Igl: 1 -șobolan

i.t celulele RBl.. deși ace.șii anticorpi au toș^toartepoienii la blocarea legăturii Igl: “ l-uman la celulele CI l() 1 cbRi (subunitatea <t himerică). Nici unul dinIre i.’> anticorpii ne inhibitori nu a putql. imunopiecipita complexul solubil al ~ 1-4gF rcticulal la subunilalea <' la șobolan.

Exemplul IZ.Prepararea și utilizarea fragmentelor b'ab ale anticorpilor mono- 20 ·- -Ion aii

Fragmentele băbaleanticorpilor monoclonali. purificați conform prezentei invenții, au fost preparați prin digestie cu papaiană. conform tehnicilor standard 25 bine cunoscute (E. Harlow și D. Lane. Antibodies: A Laborator? Manual ed.. (. A>id Spring Harbor press, 1989; pp.625631 și in J. Godings, MonoclonalAntibodies: Principles ana Practice. Academic 30 Press. inc., New York. N.Y., 119-124, 1983).

Fragmentele babale anticorpilor mono» lonali punticați pot ii utilizate pentru a bloca legal ura igl: la bazofilele umane si maslocile. prin metoda descrisă pentru moleculele anticorp intacte. Demonstrarea inhibării legăturii IgE la bazofile și mastocite de fragmentele Fab fără stimularea degranulării și eliberarea hislaminei a fost efectuat;) cu tehnici standard (iTogress) în Allergy. Voi.34. pp. 188-253. I .l. Ishizaka și K. Ishizaka. Activation oi Mas! ( e!ls for MeiUator Release Hirotigii Igl·.' Receptors, L

Claims (6)

1. Revendicări

   1. Anlicorpi monoclonali. ai receptorului lgl^; uman s;₍u un fragment b’ab mono sau bivalent al acestora, caracterizați prin aceea că. sunt capabili de legare specifică ia ce! puțin un epitop al subunității a a receptorului uman FclgE de înaltă afinitate a celulei umane bazofilesau mastocite. când nu se stimulează eliberarea de histamină ș i este blocată legarea IgE la receptorul FclgE.
2. 2. Anticorpi monoclonali sau un fragment al acestora, conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că, secvența de aminoacizi a subunității a a receptorului uman FclgE de înaltă afinitate este următoarea:

   Val Pro Gin Lvs Pro l ,vs Val Ser i.eu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lvs Glv Glu Asn Val Thr Leu Thr Cvs Asn Glv Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Glv Ser leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Als Lys Phe Glu Asp Ser Glv Glu Tyr Lys Cvs Gin His Gin Gin Val As n Glu Ser Glu Pro Val Tvr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu I OU Gin Ala Ser zVla Glu Val Val Met Glu Glv Gin Pro leu Phe Leu Arg Cys His Glv Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tvr Lys Asp Glv Glu Ala 1 ou Lys Tvr Trp Tyr Glu Asn His Asn TÎe Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Glv Thr Tvr Tyr Cys Thr Glv Lvs Val Trp Gin Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys
3. 3. Procedeu de obținere a anticorpilor monoclonali, definiți în revendicarea 1.

   caracterizat prin aceea că, constă în: 35

   a. injectarea la un mamifer a unei polipeptide. conținând o primă secvență de aminoacizi corespunzătoare subunității a a receptorului uman de înaltă afinitate FclgE sau orice secvență funcțio109707 nală a acesteia si o a două secvență de a niίnoacizi corcspu uzatoare 1 ransmem hranei si a regiunii ciloplasmatice a receptorului, care permite exprimarea pe suprafața celulei a respectivei subunități 5 <r. amestecată cu un adjuvant și repetând injectarea cel puțin o dală, astfel încât să producă un răspuns imun:

   b. izolarea anticorpului monoclonal dorit de supernatantuI celulelor hvbrido- Iii m;i corespunzătoare, obținui din celulele producătoare dc anlicorpi ale respecți culm mamiier si. da· ă se dorește, prepararea tuiiii fragment ..2 acestuia.
4. 4. Metodă pentiti detectarea pre 15 zenței subunității a receptorului uman ' cigl· de afinitate înaltă. într-o probă, caracterizată prin aceea că. cuprinde:

   a. contactarea unei probe, eventual un fluid biologic, cu un anticorp mono- 20 donai sau un fragment al acestuia, definit în revendicarea 1, marcat sau nu. cu un markerdetectabii. eventual o enzimă sau o entitate radioactivă sau fluorescentă, pentru a forma un complex: 25

   b. contactarea complexului rezultat în căzui în care a fost obținut cu un anticorp nemarcat, cu un anticorp monoclonal sau un fragment al acestuia definit în revendicarea 1, marcat cu un 30 marker detectabil când se formează un alt complex;

   c. detectarea complexului marcat, format în etapele anterioare și deter minarea in acest lela prezentei subunității î V.
5. 5. Metodă pentru determinarea cantității de Igb prezenla într-o probă, capabilă de a se lega de subunitatea a a receptorului uman FcIgE de afinitate inalla. caracterizată prin aceea că. · tipii nde:

   a. contactarea unui anlicorp monodonai sau a unui fragment al acestuia, definit în revendicarea 1. cu o cantitale cunoscută a subunității .·; a receptorului uman lclgltde afinitate înaltă pentru a forma un complex:

   b. contactarea complexului leu mat în etapa anterioară cu proba pentru a lega IgE la respectiva subunitate o a complexului, pentru a forma un nou complex:

   c. contactarea complexului format în etapa anterioară, cu o cantitate de anticorp marcat, delectabil, capabil de a lega IgE:

   d. determinarea cantității de IgE prezente în probă, prin măsurarea cantității de anticorp marcat, detectabil din etapa anterioară.
6. 6. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că. conține de la minimum 0.5 la 25% în greutate, anticorp monoclonal al receptorului FcIgE uman, dc înaltă afinitate sau un fragment al acestuia, definit în revendicarea 1 și substanțe auxiliare acceptabile farmaceutic.