JPH05252988A - ヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターのαサブユニツトと特異的に結合するモノクローナル抗体 - Google Patents
ヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターのαサブユニツトと特異的に結合するモノクローナル抗体Info
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- JPH05252988A JPH05252988A JP4057508A JP5750892A JPH05252988A JP H05252988 A JPH05252988 A JP H05252988A JP 4057508 A JP4057508 A JP 4057508A JP 5750892 A JP5750892 A JP 5750892A JP H05252988 A JPH05252988 A JP H05252988A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターのαサブ
ユニットの少くとも１つのエピトープに結合することが
できるモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマ細胞。 【効果】 上記モノクローナル抗体は病気、例えばアレ
ルギー疾患の治療、処置、診断等に有用である。
ユニットの少くとも１つのエピトープに結合することが
できるモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマ細胞。 【効果】 上記モノクローナル抗体は病気、例えばアレ
ルギー疾患の治療、処置、診断等に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト高親和性（human hi
gh offinity）ＦｃＩｇＥレセプターのαサブユニット
の少くとも１つのエピトープに特異的に結合することが
できるモノクローナル抗体又はその断片、それらの製造
方法及び使用に関する。
gh offinity）ＦｃＩｇＥレセプターのαサブユニット
の少くとも１つのエピトープに特異的に結合することが
できるモノクローナル抗体又はその断片、それらの製造
方法及び使用に関する。
【０００２】
【従来技術】ＦｃＥＲＩとして知られている、免疫グロ
ブリンＥ（ＩｇＥ）に対する高親和性Ｆｃレセプター
は、肥満細胞及び好塩基球において見出されている。Ｉ
ｇＥと抗原とによるこのレセプターの架橋は細胞性脱顆
粒（degranulation）やヒスタミンやセロトニンの如き
予め形成された伝達物質（mediator）の放出を誘起する
（１）。アレルギー状態に寄与するのはこれら伝達物質
の放出であり、これによりロイコトリエンや血小板活性
化因子合成も刺激される。
ブリンＥ（ＩｇＥ）に対する高親和性Ｆｃレセプター
は、肥満細胞及び好塩基球において見出されている。Ｉ
ｇＥと抗原とによるこのレセプターの架橋は細胞性脱顆
粒（degranulation）やヒスタミンやセロトニンの如き
予め形成された伝達物質（mediator）の放出を誘起する
（１）。アレルギー状態に寄与するのはこれら伝達物質
の放出であり、これによりロイコトリエンや血小板活性
化因子合成も刺激される。
【０００３】それ故ＦｃＥＲＩはアレルギー反応におい
て中心的役割を演じる（１）。ラットにおいてはこのレ
セプターは３つの異なるサブユニット：ＩｇＥ結合性α
鎖、１つのβ鎖及び２つのγ鎖から成る（１−１２）。
過去の研究により、高親和性の細胞表面ＩｇＥ結合性は
これらの３つのサブユニットの共発現によることが証明
された（１２、１３）。人間の系においては少くともα
及びγサブユニットが高親和性の細胞表面結合のために
は存在せねばならない（１５、１６）。β及び／又はγ
サブユニットの機能的寄与については現在知られていな
い。
て中心的役割を演じる（１）。ラットにおいてはこのレ
セプターは３つの異なるサブユニット：ＩｇＥ結合性α
鎖、１つのβ鎖及び２つのγ鎖から成る（１−１２）。
過去の研究により、高親和性の細胞表面ＩｇＥ結合性は
これらの３つのサブユニットの共発現によることが証明
された（１２、１３）。人間の系においては少くともα
及びγサブユニットが高親和性の細胞表面結合のために
は存在せねばならない（１５、１６）。β及び／又はγ
サブユニットの機能的寄与については現在知られていな
い。
【０００４】ラットα（９、１０）、β（１１）、及び
γ（１２）サブユニット、マウスα、β及びγサブユニ
ット（１３）並びにヒトα（１０、１４）及びγ（１
５）サブユニットをコードする相補的ＤＮＡクローンが
単離された。ヒトα及びラツト或いはヒトγサブユニッ
ト（１４、１６）又はキメラ・ヒトαサブユニット単独
（１７）をコードするｃＤＮＡを異種哺乳動物細胞にト
ランスフェクト（transfection）すると、高い親和性で
ヒトＩｇＥに結合することができる細胞株が得られる。
γ（１２）サブユニット、マウスα、β及びγサブユニ
ット（１３）並びにヒトα（１０、１４）及びγ（１
５）サブユニットをコードする相補的ＤＮＡクローンが
単離された。ヒトα及びラツト或いはヒトγサブユニッ
ト（１４、１６）又はキメラ・ヒトαサブユニット単独
（１７）をコードするｃＤＮＡを異種哺乳動物細胞にト
ランスフェクト（transfection）すると、高い親和性で
ヒトＩｇＥに結合することができる細胞株が得られる。
【０００５】ｃＤＮＡから、２３（ラット及びマウス）
又は２５（ヒト）アミノ酸のシグナルペプチド、１８０
−１８１アミノ酸の細胞外（extracellular）ドメイ
ン、２０−２１アミノ酸の膜貫通（transmembrane）ド
メイン並びに２２（ラット）、２５（マウス）又は３３
（ヒト）アミノ酸の細胞質（cytoplastic）ドメインを
もつ蛋白が予測される。３個のαサブユニットは免疫グ
ロブリン・スーパーファミリー（superfamily）の構成
員であり（９、１０、１３、１４）、お互いに並びにマ
ウスＦｃγＲｌｌａレセプターのαサブユニットと最も
相同性（homologous）がある。他の免疫グロブリン・ス
ーパーファミリー構成員との比較から、ヒトαサブユニ
ットについての配列はαサブユニット配列全長のアミノ
酸配列５１−９３と１３２−１７６をとり囲む２個のジ
スルフィド結合ループを予測させる（図３）（１０）。
又は２５（ヒト）アミノ酸のシグナルペプチド、１８０
−１８１アミノ酸の細胞外（extracellular）ドメイ
ン、２０−２１アミノ酸の膜貫通（transmembrane）ド
メイン並びに２２（ラット）、２５（マウス）又は３３
（ヒト）アミノ酸の細胞質（cytoplastic）ドメインを
もつ蛋白が予測される。３個のαサブユニットは免疫グ
ロブリン・スーパーファミリー（superfamily）の構成
員であり（９、１０、１３、１４）、お互いに並びにマ
ウスＦｃγＲｌｌａレセプターのαサブユニットと最も
相同性（homologous）がある。他の免疫グロブリン・ス
ーパーファミリー構成員との比較から、ヒトαサブユニ
ットについての配列はαサブユニット配列全長のアミノ
酸配列５１−９３と１３２−１７６をとり囲む２個のジ
スルフィド結合ループを予測させる（図３）（１０）。
【０００６】過去の報告には、例えばラットＦｃＥＲＩ
レセプター（３５−３７）及びヒトＦｃＧＲＩレセプタ
ー（３９）の如き高親和性免疫グロブリンレセプターに
特異的なモノクローナル抗体の開発及び特性分析が述べ
られている。更に一つの報告にはヒト好塩基球と反応す
るモノクローナル抗体の単離が記載されている（３
８）。このモノクローナル抗体のヒト好塩基球への結合
はヒトＩｇＥによりブロックされるので、この抗体が高
親和性ＦｃＩｇＥレセプターを認識するかも知れないこ
とを排除できない（３８）。しかし、この引例（３８）
はこのモノクローナル抗体がこのレセプターのいずれの
サブユニットに結合することも記載していない。
レセプター（３５−３７）及びヒトＦｃＧＲＩレセプタ
ー（３９）の如き高親和性免疫グロブリンレセプターに
特異的なモノクローナル抗体の開発及び特性分析が述べ
られている。更に一つの報告にはヒト好塩基球と反応す
るモノクローナル抗体の単離が記載されている（３
８）。このモノクローナル抗体のヒト好塩基球への結合
はヒトＩｇＥによりブロックされるので、この抗体が高
親和性ＦｃＩｇＥレセプターを認識するかも知れないこ
とを排除できない（３８）。しかし、この引例（３８）
はこのモノクローナル抗体がこのレセプターのいずれの
サブユニットに結合することも記載していない。
【０００７】今迄、表面発現させるためにはヒトＦｃＥ
ＲＩのαサブユニットにＦｃＥＲＩの付加的サブユニッ
トを複合化させる必要があると信じられていた（１
２）。しかし Hakimi ら ［J.Biol.Chem．２６５，２２
０７９−２２０８１（１９９０）］は、他のレセプター
の細胞質領域又は細胞質と膜貫通の両領域を組み込んだ
ハイブリッド遺伝子を構成し、αサブユニットを細胞表
面発現させるようにαサブユニットを改変する［ＩＬ−
２レセプター、低親和性ＩｇＥレセプター（ＣＤ２
３）、ネズミエリスロポエチンレセプター、ヒトＩｇＧ
ＦｃレセプターＦｃＧＲＩＩ、等］と、αサブユニッ
トの表面発現がもたらされ、それは高親和性でＩｇＥに
結合もするであろうし、かつ永続的に転換された真核細
胞中でこの活性を安定に発現することを可能ならしめる
ことを示した。
ＲＩのαサブユニットにＦｃＥＲＩの付加的サブユニッ
トを複合化させる必要があると信じられていた（１
２）。しかし Hakimi ら ［J.Biol.Chem．２６５，２２
０７９−２２０８１（１９９０）］は、他のレセプター
の細胞質領域又は細胞質と膜貫通の両領域を組み込んだ
ハイブリッド遺伝子を構成し、αサブユニットを細胞表
面発現させるようにαサブユニットを改変する［ＩＬ−
２レセプター、低親和性ＩｇＥレセプター（ＣＤ２
３）、ネズミエリスロポエチンレセプター、ヒトＩｇＧ
ＦｃレセプターＦｃＧＲＩＩ、等］と、αサブユニッ
トの表面発現がもたらされ、それは高親和性でＩｇＥに
結合もするであろうし、かつ永続的に転換された真核細
胞中でこの活性を安定に発現することを可能ならしめる
ことを示した。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明のモノクローナル
抗体はヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプター（ＦｃＥＲ
Ｉ）のαサブユニットの少くとも１つのエピトープに特
異的に結合することができる。それらはヒトＦｃＥＲＩ
の天然及び組換えαサブユニット（“αサブユニッ
ト”）の免疫アフィニティー精製、免疫分析の開発、α
サブユニットの活性部位の同定のための強力な分析用、
診断用及び治療用試剤を提供し、また（ヒト好塩基球及
び肥満細胞上の細胞性ＦｃＥＲＩレセプターにＩｇＥが
結合するのを阻止するＦａｂ断片又は誘導体を利用する
ことによる）アレルギー疾患のための治療処置法を提供
する。ヒトα−サブユニット上の異なるエピトープを認
識するモノクローナル抗体は、生体流動体中の及び細胞
抽出液からのα−サブユニットの水準を測定するため
の、感度のよい２部位（two-site）免疫分析における試
剤として有用である。
抗体はヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプター（ＦｃＥＲ
Ｉ）のαサブユニットの少くとも１つのエピトープに特
異的に結合することができる。それらはヒトＦｃＥＲＩ
の天然及び組換えαサブユニット（“αサブユニッ
ト”）の免疫アフィニティー精製、免疫分析の開発、α
サブユニットの活性部位の同定のための強力な分析用、
診断用及び治療用試剤を提供し、また（ヒト好塩基球及
び肥満細胞上の細胞性ＦｃＥＲＩレセプターにＩｇＥが
結合するのを阻止するＦａｂ断片又は誘導体を利用する
ことによる）アレルギー疾患のための治療処置法を提供
する。ヒトα−サブユニット上の異なるエピトープを認
識するモノクローナル抗体は、生体流動体中の及び細胞
抽出液からのα−サブユニットの水準を測定するため
の、感度のよい２部位（two-site）免疫分析における試
剤として有用である。
【０００９】ヒト高親和性ＩｇＥレセプターのαサブユ
ニットの少くとも１つのエピトープに特異的に結合する
ことができる本発明のモノクローナル抗体は、例えばヒ
ト好塩基球からのヒスタミン放出を誘導し、標識された
αサブユニットを免疫沈降し、及び／又は組換え及び天
然αサブユニットに結合するＩｇＥを阻害することを特
徴とする。
ニットの少くとも１つのエピトープに特異的に結合する
ことができる本発明のモノクローナル抗体は、例えばヒ
ト好塩基球からのヒスタミン放出を誘導し、標識された
αサブユニットを免疫沈降し、及び／又は組換え及び天
然αサブユニットに結合するＩｇＥを阻害することを特
徴とする。
【００１０】これらのモノクローナル抗体は、天然及び
組換えヒトα−サブユニットの精製のためのアフィニィ
ティー試剤として、生体流動体中、ヒト細胞の細胞質膜
上の天然及び組換えα−サブユニットを測定する酵素免
疫分析及び放射線免疫分析のための試剤として、薬剤ス
クリーニング分析のための試剤として、生体流動体及び
ヒト細胞抽出物中のα−サブユニットを測定する感度の
よい２部位免疫分析を構築する試剤として、生体流動体
及び細胞抽出物中のＩｇＥ水準を測定する高感度捕捉免
疫分析（sensitive capture immunoassay）において組
換えα−サブユニットと組み合わせる試剤として、Ｉｇ
Ｅと結合するのに関与するα−サブユニットの部位を同
定するための試剤として、そして（阻止性モノクローナ
ル抗体の）Ｆａｂ断片の状態で、ＩｇＥにより誘起され
たアレルギー疾患を処置するための治療薬として、用い
ることができる。
組換えヒトα−サブユニットの精製のためのアフィニィ
ティー試剤として、生体流動体中、ヒト細胞の細胞質膜
上の天然及び組換えα−サブユニットを測定する酵素免
疫分析及び放射線免疫分析のための試剤として、薬剤ス
クリーニング分析のための試剤として、生体流動体及び
ヒト細胞抽出物中のα−サブユニットを測定する感度の
よい２部位免疫分析を構築する試剤として、生体流動体
及び細胞抽出物中のＩｇＥ水準を測定する高感度捕捉免
疫分析（sensitive capture immunoassay）において組
換えα−サブユニットと組み合わせる試剤として、Ｉｇ
Ｅと結合するのに関与するα−サブユニットの部位を同
定するための試剤として、そして（阻止性モノクローナ
ル抗体の）Ｆａｂ断片の状態で、ＩｇＥにより誘起され
たアレルギー疾患を処置するための治療薬として、用い
ることができる。
【００１１】本発明において用いられる「モノクローナ
ル抗体」は、２価及び１価のＦａｂ断片の如き、同じ特
異性を有する断片を包含する。当業界で周知の如く、か
かる断片は免疫グロブリン分子の蛋白加水分解開裂によ
り生成することができる。例えばパパイン開裂は２個の
１価のＦａｂ断片を生成し、一方ペプシン開裂は１個の
２価のＦａｂ断片を生成する。これらの断片について
は、完全なモノクローナル抗体をスクリーニングするた
めにここに述べた方法の如き在来の方法で、レセプター
結合活性について選択することができる。例えば免疫沈
降、ウェスターンブロッティング、結合阻止及び、例え
ば実施例３に記載された他の分析法である。
ル抗体」は、２価及び１価のＦａｂ断片の如き、同じ特
異性を有する断片を包含する。当業界で周知の如く、か
かる断片は免疫グロブリン分子の蛋白加水分解開裂によ
り生成することができる。例えばパパイン開裂は２個の
１価のＦａｂ断片を生成し、一方ペプシン開裂は１個の
２価のＦａｂ断片を生成する。これらの断片について
は、完全なモノクローナル抗体をスクリーニングするた
めにここに述べた方法の如き在来の方法で、レセプター
結合活性について選択することができる。例えば免疫沈
降、ウェスターンブロッティング、結合阻止及び、例え
ば実施例３に記載された他の分析法である。
【００１２】本発明のモノクローナル抗体はヒト由来又
は例えばラット、マウス及びうさぎの如き非ヒト哺乳類
由来でありうる。これらの抗体はＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩ
ｇＧサブタイプ、特にＩｇＧ1サブタイプであることが
できる。かかる抗体を製造する方法は当業界で周知であ
り、実施例において述べる。
は例えばラット、マウス及びうさぎの如き非ヒト哺乳類
由来でありうる。これらの抗体はＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩ
ｇＧサブタイプ、特にＩｇＧ1サブタイプであることが
できる。かかる抗体を製造する方法は当業界で周知であ
り、実施例において述べる。
【００１３】本発明は、ＦｃＥＲＩの他のサブユニット
とは無関係に宿主細胞表面上に発現したキメラα−サブ
ユニットを利用する。それ故本発明は例えばＣＯＳ細胞
又はＣＨＯ細胞の如き宿主細胞の表面上に発現されたキ
メラα−サブユニットの１又はそれ以上のエピトープ、
並びに単離されたキメラα−サブユニットにも結合する
ことのできるモノクローナル抗体を含有してなる。該キ
メラα−サブユニットは、機能的αサブユニットアミノ
酸配列及びＩＬ−２レセプターの如き異なるレセプター
の膜貫通及び細胞質アミノ酸配列を有してなる融合ポリ
ペプチドである（本明細中の他の箇所にて記述）。
とは無関係に宿主細胞表面上に発現したキメラα−サブ
ユニットを利用する。それ故本発明は例えばＣＯＳ細胞
又はＣＨＯ細胞の如き宿主細胞の表面上に発現されたキ
メラα−サブユニットの１又はそれ以上のエピトープ、
並びに単離されたキメラα−サブユニットにも結合する
ことのできるモノクローナル抗体を含有してなる。該キ
メラα−サブユニットは、機能的αサブユニットアミノ
酸配列及びＩＬ−２レセプターの如き異なるレセプター
の膜貫通及び細胞質アミノ酸配列を有してなる融合ポリ
ペプチドである（本明細中の他の箇所にて記述）。
【００１４】本発明はまた、肥満細胞又は好塩基球、特
にヒト肥満細胞又は好塩基球の表面に発現されたαサブ
ユニットに結合することができるモノクローナル抗体に
関する。２価の免疫グロブリンＩｇＥはそのＦｃ部又は
幹により、その細胞表面レセプター（ＦｃＥＲＩ）に結
合する。そのＦａｂ“腕”(arms）の各々は抗原に結合
し、そして２個のＩｇＥ分子は、それぞれが同一抗原に
１個の“腕”で結合した状態で、抗原を介して架橋する
ことができる。
にヒト肥満細胞又は好塩基球の表面に発現されたαサブ
ユニットに結合することができるモノクローナル抗体に
関する。２価の免疫グロブリンＩｇＥはそのＦｃ部又は
幹により、その細胞表面レセプター（ＦｃＥＲＩ）に結
合する。そのＦａｂ“腕”(arms）の各々は抗原に結合
し、そして２個のＩｇＥ分子は、それぞれが同一抗原に
１個の“腕”で結合した状態で、抗原を介して架橋する
ことができる。
【００１５】これによりＩｇＥ分子に結合したレセプタ
ーが細胞表面上で凝集する。レセプターの凝集が細胞を
刺激して脱顆粒し、ヒスタミンを放出させる。アレルギ
ー反応に寄与するのがこのプロセスである。
ーが細胞表面上で凝集する。レセプターの凝集が細胞を
刺激して脱顆粒し、ヒスタミンを放出させる。アレルギ
ー反応に寄与するのがこのプロセスである。
【００１６】これらの抗体はＩｇＥ結合部位又はその近
傍のエピトープに結合でき、そうしてＩｇＥ結合を阻止
する。かかる抗体の具体例は抗体１５Ａ５である。該抗
体はそれ自身で、各々のＦａｂ“腕”で１個のレセプタ
ーに結合することによりレセプター凝集をおこし、そし
てヒスタミン放出を刺激する。これは完全な（whole）
免疫グロブリン又は２価Ｆａｂ断片を使用する場合に、
その事例になろう。これらの抗体は分析及び精製のため
に特に有用である。
傍のエピトープに結合でき、そうしてＩｇＥ結合を阻止
する。かかる抗体の具体例は抗体１５Ａ５である。該抗
体はそれ自身で、各々のＦａｂ“腕”で１個のレセプタ
ーに結合することによりレセプター凝集をおこし、そし
てヒスタミン放出を刺激する。これは完全な（whole）
免疫グロブリン又は２価Ｆａｂ断片を使用する場合に、
その事例になろう。これらの抗体は分析及び精製のため
に特に有用である。
【００１７】ＩｇＥ結合を阻止するが、それがただ１個
の結合部位しか有さないので１を越えるレセプターに結
合することができず、そのため凝集を引き起すことがで
きない１価抗体、即ち１価のＦａｂ断片は、それ自身で
ヒスタミン放出を誘起することなく、ＩｇＥがヒスタミ
ン放出を誘起するのを防止できるので、治療上有用であ
る。ここではＩｇＥ結合部位又はその近傍でないαサブ
ユニットエピトープに結合するモノクローナル抗体、例
えばモノクローナル抗体１１Ｂ４も開示されている。か
かる抗体はＩｇＥ結合を阻害せず、そしてヒスタミン放
出を誘起する。モノクローナル抗体がＩｇＥ結合を阻害
するかどうかを決めるには、当業者に周知の方法により
標識ＩｇＥをもちいた競合分析を実施し、該抗体がαサ
ブユニットへのＩｇＥ結合を減少させるかどうかを見る
ことができる。キメラαサブユニット又はキメラαサブ
ユニットを発現している宿主細胞（両者ともここに述べ
られている）は、分析のための結合部位を提供するのに
特に有用である。
の結合部位しか有さないので１を越えるレセプターに結
合することができず、そのため凝集を引き起すことがで
きない１価抗体、即ち１価のＦａｂ断片は、それ自身で
ヒスタミン放出を誘起することなく、ＩｇＥがヒスタミ
ン放出を誘起するのを防止できるので、治療上有用であ
る。ここではＩｇＥ結合部位又はその近傍でないαサブ
ユニットエピトープに結合するモノクローナル抗体、例
えばモノクローナル抗体１１Ｂ４も開示されている。か
かる抗体はＩｇＥ結合を阻害せず、そしてヒスタミン放
出を誘起する。モノクローナル抗体がＩｇＥ結合を阻害
するかどうかを決めるには、当業者に周知の方法により
標識ＩｇＥをもちいた競合分析を実施し、該抗体がαサ
ブユニットへのＩｇＥ結合を減少させるかどうかを見る
ことができる。キメラαサブユニット又はキメラαサブ
ユニットを発現している宿主細胞（両者ともここに述べ
られている）は、分析のための結合部位を提供するのに
特に有用である。
【００１８】本発明のモノクローナル抗体は、例えば２
個の主たる分類： １） ＦｃＥＲＩ担持細胞への放射性標識ＩｇＥの結合
を阻害する抗体［阻害群（inhibitory class）］、と、 ２） このリガンド−レセプター相互作用を阻害しない
もの［非阻害群（non-inhibitory class）］に包摂する
ことにより特徴づけることができる。
個の主たる分類： １） ＦｃＥＲＩ担持細胞への放射性標識ＩｇＥの結合
を阻害する抗体［阻害群（inhibitory class）］、と、 ２） このリガンド−レセプター相互作用を阻害しない
もの［非阻害群（non-inhibitory class）］に包摂する
ことにより特徴づけることができる。
【００１９】ヒトαサブユニットの細胞外ドメインは７
個のＮ−結合グリコシル化可能部位を含有する（１０、
１４）。天然のαサブユニット及びＣＨＯ細胞で発現し
た組換えキメラαサブユニットは明らかにそれぞれ約５
０ＫＤ（２、３）及び約４５ＫＤ（１７）の分子量を有
するが、それらのｃＤＮＡから予測される分子量はそれ
ぞれ２６ＫＤ（１０、１４）及び２４ＫＤ（１７）であ
る。このように７個のＮ−結合グリコシル化可能部位の
ほとんどが成熟蛋白においては利用されているようであ
る。Ｎ−グリカナーゼ消化によりキメラαサブユニット
からＮ−結合炭水化物を除去すると、分子量が約４５Ｋ
Ｄから２５ＫＤに移動する。該２５ＫＤ蛋白はαサブユ
ニットのポリペプチド核（core）を認識する本発明のモ
ノクローナル抗体によって認識される。
個のＮ−結合グリコシル化可能部位を含有する（１０、
１４）。天然のαサブユニット及びＣＨＯ細胞で発現し
た組換えキメラαサブユニットは明らかにそれぞれ約５
０ＫＤ（２、３）及び約４５ＫＤ（１７）の分子量を有
するが、それらのｃＤＮＡから予測される分子量はそれ
ぞれ２６ＫＤ（１０、１４）及び２４ＫＤ（１７）であ
る。このように７個のＮ−結合グリコシル化可能部位の
ほとんどが成熟蛋白においては利用されているようであ
る。Ｎ−グリカナーゼ消化によりキメラαサブユニット
からＮ−結合炭水化物を除去すると、分子量が約４５Ｋ
Ｄから２５ＫＤに移動する。該２５ＫＤ蛋白はαサブユ
ニットのポリペプチド核（core）を認識する本発明のモ
ノクローナル抗体によって認識される。
【００２０】両群の抗体は、αサブユニットに対するＩ
ｇＥの親和性と略同等又はそれ以上の親和性で、キメラ
αサブユニットに結合する。これらのデータは、２群の
抗体間の相違は親和性によるのでなく、それぞれの抗体
が結合するエピトープによるものであることを示してい
る。ヒトＦｃＥＲＩレセプターのαサブユニットの細胞
外領域上の５個の別個のエピトープが、本発明のモノク
ローナル抗体を用いて同定された：２個の阻害的及び３
個の非阻害的エピトープである。本発明の抗体により認
識されるエピトープを同定するために、αサブユニット
の配列に対応する合成ペプチドを用いたＥＩＡで各々の
抗体を試験した。１個の阻害的エピトープ（配列１２５
−１４０）は抗体１５Ａ５で同定され、１個の非阻害的
エピトープ（配列４３−５８）は抗体１１Ｂ４及び２２
Ｅ７で同定された。他の阻害的及び非阻害的抗体のエピ
トープは、放射性標識１５Ａ５及び２２Ｅ７を用いて放
射性レセプター競合法により特定された。
ｇＥの親和性と略同等又はそれ以上の親和性で、キメラ
αサブユニットに結合する。これらのデータは、２群の
抗体間の相違は親和性によるのでなく、それぞれの抗体
が結合するエピトープによるものであることを示してい
る。ヒトＦｃＥＲＩレセプターのαサブユニットの細胞
外領域上の５個の別個のエピトープが、本発明のモノク
ローナル抗体を用いて同定された：２個の阻害的及び３
個の非阻害的エピトープである。本発明の抗体により認
識されるエピトープを同定するために、αサブユニット
の配列に対応する合成ペプチドを用いたＥＩＡで各々の
抗体を試験した。１個の阻害的エピトープ（配列１２５
−１４０）は抗体１５Ａ５で同定され、１個の非阻害的
エピトープ（配列４３−５８）は抗体１１Ｂ４及び２２
Ｅ７で同定された。他の阻害的及び非阻害的抗体のエピ
トープは、放射性標識１５Ａ５及び２２Ｅ７を用いて放
射性レセプター競合法により特定された。
【００２１】全部の阻害的抗体はすべてキメラαサブユ
ニットに対する結合に関して125Ｉ−１５Ａ５と競合す
るので、それらは１２５−１４０配列又は少くともその
構造的近傍に結合する。ＩｇＥもまたキメラαサブユニ
ットに対する結合に関し125Ｉ−１５Ａ５と競合し、Ｉ
ｇＥと１５Ａ５は該レセプターの重畳するドメインでは
あるが、おそらく同一ではないドメインに結合すること
が確認された。ただ１個の抗体４Ｂ４が、ヒト及びラツ
トのαサブユニット両者に対する125Ｉ−ＩｇＥ結合を
ブロックし、そしてヒトαサブユニットに対する125Ｉ
−１５Ａ５結合をブロックする。これらのデータは４Ｂ
４エピトープは抗体１５Ａ５の１２５−１４０エピトー
プと同一ではないが重畳することを示している。
ニットに対する結合に関して125Ｉ−１５Ａ５と競合す
るので、それらは１２５−１４０配列又は少くともその
構造的近傍に結合する。ＩｇＥもまたキメラαサブユニ
ットに対する結合に関し125Ｉ−１５Ａ５と競合し、Ｉ
ｇＥと１５Ａ５は該レセプターの重畳するドメインでは
あるが、おそらく同一ではないドメインに結合すること
が確認された。ただ１個の抗体４Ｂ４が、ヒト及びラツ
トのαサブユニット両者に対する125Ｉ−ＩｇＥ結合を
ブロックし、そしてヒトαサブユニットに対する125Ｉ
−１５Ａ５結合をブロックする。これらのデータは４Ｂ
４エピトープは抗体１５Ａ５の１２５−１４０エピトー
プと同一ではないが重畳することを示している。
【００２２】２２個の非阻害型抗体は125Ｉ−標識２２
Ｅ７がキメラαサブユニットに結合するのを完全に阻害
し、ほとんどがキメラαサブユニットの４３−５８配列
又はその構造的近傍に結合することを示している。３個
の非阻害型抗体はキメラαサブユニットに対する放射性
標識２２Ｅ７の結合を阻害せず、これらの抗体が蛋白の
異なるエピトープに結合することを示している。１個の
非阻害型抗体２９Ｃ６は、キメラαサブユニットに対す
る125Ｉ−２２Ｅ７及び125Ｉ−１５Ａ５両者の結合をブ
ロックする。αサブユニットへの125Ｉ−２２Ｅ７及び
125Ｉ−１５Ａ５の結合に対する２９Ｃ６の阻害におけ
るＩＣ50は、それぞれ０.１８μｇ／ｍｌと＞１２０μ
ｇ／ｍｌである。
Ｅ７がキメラαサブユニットに結合するのを完全に阻害
し、ほとんどがキメラαサブユニットの４３−５８配列
又はその構造的近傍に結合することを示している。３個
の非阻害型抗体はキメラαサブユニットに対する放射性
標識２２Ｅ７の結合を阻害せず、これらの抗体が蛋白の
異なるエピトープに結合することを示している。１個の
非阻害型抗体２９Ｃ６は、キメラαサブユニットに対す
る125Ｉ−２２Ｅ７及び125Ｉ−１５Ａ５両者の結合をブ
ロックする。αサブユニットへの125Ｉ−２２Ｅ７及び
125Ｉ−１５Ａ５の結合に対する２９Ｃ６の阻害におけ
るＩＣ50は、それぞれ０.１８μｇ／ｍｌと＞１２０μ
ｇ／ｍｌである。
【００２３】本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマは本発明において開示されており、特に実
施例で記載したハイブリドーマはそうである。ハイブリ
ドーマの製造法は当技術分野で周知の方法であり、また
実施例においても説明されている。
イブリドーマは本発明において開示されており、特に実
施例で記載したハイブリドーマはそうである。ハイブリ
ドーマの製造法は当技術分野で周知の方法であり、また
実施例においても説明されている。
【００２４】簡単に言えば、標識的方法においてマウ
ス、ラット又はウサギの如き動物を抗原即ちαサブユニ
ットの少くとも１個のエピトープを有するポリペプチド
例えばここで述べる如き完全なαサブユニットそれ自身
又はキメラαサブユニットで免疫する。そしてＢ細胞を
該動物から取り出し、特異性について分析し、不死化ミ
エローマ細胞と融合し、ハイブリドーマを作出する。該
ハイブリドーマ細胞を希釈し、個々の細胞を（マイクロ
タイタープレート中のウエルの如き）容器に分割する。
個々のハイブリドーマのクローンにより産生されたモノ
クローナル抗体についても特異性について選別する。所
望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマは組
換えＤＮＡ法によっても製造できる。ヒト由来のモノク
ローナル抗体は組換え法によって製造することができ、
或いは培養中のヒトリンパ球をαサブユニットにさらし
抗体産生を誘導することによって製造することができ
る。３−５日後、抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合
させ、上記した如き方法で抗αサブユニット抗体の選別
が実施される。
ス、ラット又はウサギの如き動物を抗原即ちαサブユニ
ットの少くとも１個のエピトープを有するポリペプチド
例えばここで述べる如き完全なαサブユニットそれ自身
又はキメラαサブユニットで免疫する。そしてＢ細胞を
該動物から取り出し、特異性について分析し、不死化ミ
エローマ細胞と融合し、ハイブリドーマを作出する。該
ハイブリドーマ細胞を希釈し、個々の細胞を（マイクロ
タイタープレート中のウエルの如き）容器に分割する。
個々のハイブリドーマのクローンにより産生されたモノ
クローナル抗体についても特異性について選別する。所
望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマは組
換えＤＮＡ法によっても製造できる。ヒト由来のモノク
ローナル抗体は組換え法によって製造することができ、
或いは培養中のヒトリンパ球をαサブユニットにさらし
抗体産生を誘導することによって製造することができ
る。３−５日後、抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合
させ、上記した如き方法で抗αサブユニット抗体の選別
が実施される。
【００２５】本発明のモノクローナル抗体又はその断片
を選別するためにはどのような在来の選別法をも使用す
ることができ、例えば実施例３の項ｃ、ｅ、ｆ、ｊ、
ｋ、ｌ及びｍが例示される。これらの方法の１つはここ
で述べられた表面にキメラαサブユニットを発現する細
胞を用いる。例えばモノクローナル抗体を蛍光標識し、
そしてこれらの細胞を含有するスライドに添加すること
ができる。該スライドを蛍光顕微鏡下で見たとき、上記
の特異性を有する抗体は細胞に結合し、視覚で検知可能
であろう。他の方法は免疫沈降法である。ここで記載さ
れた如き単離されたαサブユニットには当技術分野で周
知の方法で検出可能な標識ができる。所望の特異性を持
つ抗体は標識されたαサブユニットに結合し、複合体を
形成するであろう。該複合体は、該αサブユニットに結
合した抗体に結合する、固体担体に結合された抗体を添
加することにより単離することができる。
を選別するためにはどのような在来の選別法をも使用す
ることができ、例えば実施例３の項ｃ、ｅ、ｆ、ｊ、
ｋ、ｌ及びｍが例示される。これらの方法の１つはここ
で述べられた表面にキメラαサブユニットを発現する細
胞を用いる。例えばモノクローナル抗体を蛍光標識し、
そしてこれらの細胞を含有するスライドに添加すること
ができる。該スライドを蛍光顕微鏡下で見たとき、上記
の特異性を有する抗体は細胞に結合し、視覚で検知可能
であろう。他の方法は免疫沈降法である。ここで記載さ
れた如き単離されたαサブユニットには当技術分野で周
知の方法で検出可能な標識ができる。所望の特異性を持
つ抗体は標識されたαサブユニットに結合し、複合体を
形成するであろう。該複合体は、該αサブユニットに結
合した抗体に結合する、固体担体に結合された抗体を添
加することにより単離することができる。
【００２６】１度発現されると、本発明の完全な抗体、
それらの二量体、各々の軽鎖及び重鎖、又は他の免疫グ
ロブリン形態のものは、硫酸アンモニウム沈降法、アフ
ィニィティーカラム法、カラムクロマトグラフィー法、
ゲル電気泳動法などを含む標準的手法で精製することが
できる［例えば Scopes，R.，蛋白精製法（Protein Pur
ification）、Springer−Verlag，N.Y.（１９８２）参
照］。薬学的用途には少くとも約９０〜９５％の均一性
のある実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８
〜９９％或いはそれ以上が最も好ましい。ひとたび部分
的に、或いは所望の均一性迄精製されると、該ポリペプ
チドは治療的に（体外的を含む）用いられ、又は免疫蛍
光染色法、などの分析手法の開発及び実施において用い
られうる［例えば免疫学的方法（Immunological Method
s）、Vols.Ｉ及びＩＩ、Lefkovits及び Pernis，eds.，
Academic Press，New York，NY（１９７９及び１９８
１）参照］。
それらの二量体、各々の軽鎖及び重鎖、又は他の免疫グ
ロブリン形態のものは、硫酸アンモニウム沈降法、アフ
ィニィティーカラム法、カラムクロマトグラフィー法、
ゲル電気泳動法などを含む標準的手法で精製することが
できる［例えば Scopes，R.，蛋白精製法（Protein Pur
ification）、Springer−Verlag，N.Y.（１９８２）参
照］。薬学的用途には少くとも約９０〜９５％の均一性
のある実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８
〜９９％或いはそれ以上が最も好ましい。ひとたび部分
的に、或いは所望の均一性迄精製されると、該ポリペプ
チドは治療的に（体外的を含む）用いられ、又は免疫蛍
光染色法、などの分析手法の開発及び実施において用い
られうる［例えば免疫学的方法（Immunological Method
s）、Vols.Ｉ及びＩＩ、Lefkovits及び Pernis，eds.，
Academic Press，New York，NY（１９７９及び１９８
１）参照］。
【００２７】ヒト高親和性ＩｇＥレセプターのαサブユ
ニット又はキメラαサブユニットの１又はそれ以上のエ
ピトープに結合することができるモノクローナル抗体の
製造方法は、上記ハイブリドーマの培地からこのような
抗体を単離することを要する。該抗体は上記スクリーニ
ング法を用いて免疫動物から直接単離することもでき
る。
ニット又はキメラαサブユニットの１又はそれ以上のエ
ピトープに結合することができるモノクローナル抗体の
製造方法は、上記ハイブリドーマの培地からこのような
抗体を単離することを要する。該抗体は上記スクリーニ
ング法を用いて免疫動物から直接単離することもでき
る。
【００２８】本発明は、遊離αサブユニットを含有する
生物学的流体の如き試料又は細胞及び／又は膜結合αサ
ブユニットを含有する試料中の検出法、或いは該試料か
らのαサブユニットの精製法を記載している。ヒト高親
和性ＩｇＥレセプターのαサブユニットの１つの又は複
数のエピトープ、特にキメラαサブユニットの１つの又
は複数のエピトープに特異的に結合することができるモ
ノクローナル抗体を、該試料中のαサブユニットにモノ
クローナル抗体が結合するような、当該技術分野で周知
の条件下、該試料と接触させる。該モノクローナル抗体
は溶液状態でも、カラム、プレート又は膜の如き固体担
体に結合された状態でもよい（その例はここで提示され
る）。固体担体に結合しているときは、αサブユニット
を溶出し、そして当技術分野で公知の方法で精製する。
溶液状態のとき、該標識されたモノクローナル抗体を用
いられた標識に適した手段で検出し、該試料中のαサブ
ユニットの存在を示すことができる。他の検出方法では
非標識モノクローナル抗体を用いて該試料中のαサブユ
ニットに結合させ、そしてそれを非標識抗体に結合する
標識抗体と接触させる。他の方法では、標識抗体の量が
知られているなら、該試料中のαサブユニットの量を定
量するために用いることができる。標識は当技術分野で
周知である。好適な標識は125Ｉの如き放射性物質、蛍
光物質、ビオチン又はパーオキシダーゼの如き酵素であ
る。標識法の例は当技術分野で公知であり、例えば実施
例に挙げられている。
生物学的流体の如き試料又は細胞及び／又は膜結合αサ
ブユニットを含有する試料中の検出法、或いは該試料か
らのαサブユニットの精製法を記載している。ヒト高親
和性ＩｇＥレセプターのαサブユニットの１つの又は複
数のエピトープ、特にキメラαサブユニットの１つの又
は複数のエピトープに特異的に結合することができるモ
ノクローナル抗体を、該試料中のαサブユニットにモノ
クローナル抗体が結合するような、当該技術分野で周知
の条件下、該試料と接触させる。該モノクローナル抗体
は溶液状態でも、カラム、プレート又は膜の如き固体担
体に結合された状態でもよい（その例はここで提示され
る）。固体担体に結合しているときは、αサブユニット
を溶出し、そして当技術分野で公知の方法で精製する。
溶液状態のとき、該標識されたモノクローナル抗体を用
いられた標識に適した手段で検出し、該試料中のαサブ
ユニットの存在を示すことができる。他の検出方法では
非標識モノクローナル抗体を用いて該試料中のαサブユ
ニットに結合させ、そしてそれを非標識抗体に結合する
標識抗体と接触させる。他の方法では、標識抗体の量が
知られているなら、該試料中のαサブユニットの量を定
量するために用いることができる。標識は当技術分野で
周知である。好適な標識は125Ｉの如き放射性物質、蛍
光物質、ビオチン又はパーオキシダーゼの如き酵素であ
る。標識法の例は当技術分野で公知であり、例えば実施
例に挙げられている。
【００２９】本発明は、αサブユニットに結合すること
ができる、試料中に存在するＩｇＥを検出し、定量する
方法を含む。αサブユニットに結合することができるモ
ノクローナル抗体を固体担体（例えばアフィニィティー
カラムにおいて用いるためのビーズ、又はマイクロタイ
タープレートの表面、又は当技術分野で周知の他の担
体）に結合させ、そして既知量のαサブユニットと接触
させる（αサブユニットの取得及び定量は、ここの他の
所で述べる）。該モノクローナル抗体はαサブユニット
に結合して複合体を形成し、一方それは固体担体に結合
している。この複合体を試料と接触させる。試料中で変
性や不活性ＩｇＥではない活性ＩｇＥがαサブユニット
に結合するであろう。そしてＩｇＥに結合することがで
きる検出可能に標識された抗体と該複合体とを接触さ
せ、標識の量を測定することにより、試料中に存在する
ＩｇＥの量を定量することができる。抗ＩｇＥ抗体の如
き選定された特異性を有するモノクローナル抗体を製造
する方法は、当技術分野で周知である。また抗ＩｇＥ抗
体は生物材料供給者から容易に入手できる。抗ＩｇＥ抗
体のみを用いる分析にてＩｇＥは検出することができる
が、このような分析は活性と不活性のＩｇＥ、即ちαサ
ブユニットに結合可能及び不可能なＩｇＥを区別するこ
とができないであろう。αサブユニットを用いる分析は
この目的のために用いることができ、そして本発明にお
いて期待されるものである。
ができる、試料中に存在するＩｇＥを検出し、定量する
方法を含む。αサブユニットに結合することができるモ
ノクローナル抗体を固体担体（例えばアフィニィティー
カラムにおいて用いるためのビーズ、又はマイクロタイ
タープレートの表面、又は当技術分野で周知の他の担
体）に結合させ、そして既知量のαサブユニットと接触
させる（αサブユニットの取得及び定量は、ここの他の
所で述べる）。該モノクローナル抗体はαサブユニット
に結合して複合体を形成し、一方それは固体担体に結合
している。この複合体を試料と接触させる。試料中で変
性や不活性ＩｇＥではない活性ＩｇＥがαサブユニット
に結合するであろう。そしてＩｇＥに結合することがで
きる検出可能に標識された抗体と該複合体とを接触さ
せ、標識の量を測定することにより、試料中に存在する
ＩｇＥの量を定量することができる。抗ＩｇＥ抗体の如
き選定された特異性を有するモノクローナル抗体を製造
する方法は、当技術分野で周知である。また抗ＩｇＥ抗
体は生物材料供給者から容易に入手できる。抗ＩｇＥ抗
体のみを用いる分析にてＩｇＥは検出することができる
が、このような分析は活性と不活性のＩｇＥ、即ちαサ
ブユニットに結合可能及び不可能なＩｇＥを区別するこ
とができないであろう。αサブユニットを用いる分析は
この目的のために用いることができ、そして本発明にお
いて期待されるものである。
【００３０】本発明にはＩｇＥ結合を阻害するような、
ヒト高親和性ＩｇＥレセプターのαサブユニットの１つ
のエピトープ又は複数のエピトープに特異的に結合する
ことができる１価のＦａｂ断片を有してなる、薬学的組
成物も含まれる。本発明の抗体はジフテリヤやシュード
モーナス毒素の如き毒素に架橋することができ、そして
レセプター所持細胞を選択的に除去するために用いるこ
とができる。
ヒト高親和性ＩｇＥレセプターのαサブユニットの１つ
のエピトープ又は複数のエピトープに特異的に結合する
ことができる１価のＦａｂ断片を有してなる、薬学的組
成物も含まれる。本発明の抗体はジフテリヤやシュード
モーナス毒素の如き毒素に架橋することができ、そして
レセプター所持細胞を選択的に除去するために用いるこ
とができる。
【００３１】本発明の抗体及び薬学的組成物は、非経口
的投与即ち皮下、筋肉内又は静脈投与のために特に有用
である。非経口的投与のための組成物は、一般的に許容
される担持、好ましくは水性担体に溶解された抗体又は
その調合物（カクテル）の溶液からなるであろう。例え
ば水、緩衝水、０.４％食塩水、０.３％グリシン及び同
等物などの種々の水性担体が用いられる。これらの溶液
は無菌であり、一般的に粒状物質を含まない。これらの
組成物は在来の周知の無菌化技術で無菌化することがで
きる。該組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤及
び同等物例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、等の薬学
的に許容される補助物質を生理学的条件を近似するため
に必要なら含有することができる。これらの調合剤中の
抗体の濃度は、広範囲に即ち約０.５％以下、通常少く
とも約１％から、１５又は２０％（重量基準）迄変化し
え、そして選定される特定の投与方式に対応して、流体
容積、粘度、等に基づいて基本的に選定される。
的投与即ち皮下、筋肉内又は静脈投与のために特に有用
である。非経口的投与のための組成物は、一般的に許容
される担持、好ましくは水性担体に溶解された抗体又は
その調合物（カクテル）の溶液からなるであろう。例え
ば水、緩衝水、０.４％食塩水、０.３％グリシン及び同
等物などの種々の水性担体が用いられる。これらの溶液
は無菌であり、一般的に粒状物質を含まない。これらの
組成物は在来の周知の無菌化技術で無菌化することがで
きる。該組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤及
び同等物例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、等の薬学
的に許容される補助物質を生理学的条件を近似するため
に必要なら含有することができる。これらの調合剤中の
抗体の濃度は、広範囲に即ち約０.５％以下、通常少く
とも約１％から、１５又は２０％（重量基準）迄変化し
え、そして選定される特定の投与方式に対応して、流体
容積、粘度、等に基づいて基本的に選定される。
【００３２】このように、筋肉注射用の典型的薬学組成
物は１ｍｌの無菌緩衝水と５０ｍｇの抗体を含有するよ
うに仕上げることができよう。静脈注入用の典型的組成
物は２５０ｍｌの無菌リンゲル溶液及び１５０ｍｇの抗
体を含有するように仕上げることができよう。非経口的
に投与可能な組成物の具体的製造方法は公知又は当業者
には明白であり、例えばレミントンズ・ファーマシュー
ティカル・サイエンス（Remington′s Pharmaceutical
Science）、１５版、Mack Publishing Company，Easto
n，Pennsylvania（１９８０）に更に詳細に記載されて
いる。
物は１ｍｌの無菌緩衝水と５０ｍｇの抗体を含有するよ
うに仕上げることができよう。静脈注入用の典型的組成
物は２５０ｍｌの無菌リンゲル溶液及び１５０ｍｇの抗
体を含有するように仕上げることができよう。非経口的
に投与可能な組成物の具体的製造方法は公知又は当業者
には明白であり、例えばレミントンズ・ファーマシュー
ティカル・サイエンス（Remington′s Pharmaceutical
Science）、１５版、Mack Publishing Company，Easto
n，Pennsylvania（１９８０）に更に詳細に記載されて
いる。
【００３３】本発明の抗体は貯蔵のために冷凍乾燥し、
使用前に適当な担体で再生することができる。この技術
は在来の免疫グロブリンで有効なことが既に示されてお
り、当技術分野で公知の凍結乾燥・再生技術を採用する
ことができる。凍結乾燥と再生により抗体の活性低下が
種々の程度でおこる可能性があり（例えば在来の免疫グ
ロブリンにおいては、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも大
きな活性低下がある傾向にある）、そしてそれを補償す
るため使用量を調整する必要がありうることを、当業者
は認識することであろう。本モノクローナル抗体のＦａ
ｂ断片又はその調合物を含有する組成物は、予防的及び
／又は治療的処置のために投与することができる。治療
的適用においては、組成物は既にアレルギー反応になや
まされている患者に対し、治癒するに十分な量又は少く
とも部分的に病気及びその併発症を阻止するに十分な量
で投与される。これを達成するに十分な量は“治療上効
果的な薬量（therapeutically effective dose）”とし
て定義される。この用途に効果的な量はアレルギー反応
の重篤さに依存するであろうが、一般的には１投薬当り
約１〜約２００ｍｇの範囲である。
使用前に適当な担体で再生することができる。この技術
は在来の免疫グロブリンで有効なことが既に示されてお
り、当技術分野で公知の凍結乾燥・再生技術を採用する
ことができる。凍結乾燥と再生により抗体の活性低下が
種々の程度でおこる可能性があり（例えば在来の免疫グ
ロブリンにおいては、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも大
きな活性低下がある傾向にある）、そしてそれを補償す
るため使用量を調整する必要がありうることを、当業者
は認識することであろう。本モノクローナル抗体のＦａ
ｂ断片又はその調合物を含有する組成物は、予防的及び
／又は治療的処置のために投与することができる。治療
的適用においては、組成物は既にアレルギー反応になや
まされている患者に対し、治癒するに十分な量又は少く
とも部分的に病気及びその併発症を阻止するに十分な量
で投与される。これを達成するに十分な量は“治療上効
果的な薬量（therapeutically effective dose）”とし
て定義される。この用途に効果的な量はアレルギー反応
の重篤さに依存するであろうが、一般的には１投薬当り
約１〜約２００ｍｇの範囲である。
【００３４】予防的適用においては、本抗体又はその調
合物を含有する組成物は未だ病気ではない患者に対し、
患者自身の好塩基球からのＩｇＥを阻止するに十分な量
投与される。かかる量は“予防上効果的な薬量（prophy
lactically effective does）”と定義される。この用
途においてもまた、正確な量は患者の健康状態及びＩｇ
Ｅに特異的な循環抗原の一般的水準に影響され、投薬当
り０.１〜２５ｍｇである。
合物を含有する組成物は未だ病気ではない患者に対し、
患者自身の好塩基球からのＩｇＥを阻止するに十分な量
投与される。かかる量は“予防上効果的な薬量（prophy
lactically effective does）”と定義される。この用
途においてもまた、正確な量は患者の健康状態及びＩｇ
Ｅに特異的な循環抗原の一般的水準に影響され、投薬当
り０.１〜２５ｍｇである。
【００３５】本発明の実施において使用することができ
る、可能な抗原の１つ即ちキメラαサブユニットの製造
には、ハイブリツド遺伝子配列をコードする遺伝子の調
製、該ハイブリッド遺伝子配列を含有する組換えベクタ
ーを製造するための適当なクローニング・ビヒクルへの
この遺伝子の挿入、適合性のある宿主有機体への該組換
えクローニング・ビヒクルの転移、挿入された遺伝子配
列を発現することがでるかかる変性宿主の選別と生育、
及び遺伝子産物の同定と精製、を含む多数のステツプを
必要とする。
る、可能な抗原の１つ即ちキメラαサブユニットの製造
には、ハイブリツド遺伝子配列をコードする遺伝子の調
製、該ハイブリッド遺伝子配列を含有する組換えベクタ
ーを製造するための適当なクローニング・ビヒクルへの
この遺伝子の挿入、適合性のある宿主有機体への該組換
えクローニング・ビヒクルの転移、挿入された遺伝子配
列を発現することがでるかかる変性宿主の選別と生育、
及び遺伝子産物の同定と精製、を含む多数のステツプを
必要とする。
【００３６】キメラαサブユニットをコードする遺伝子
の調製は、ＦｃＥＲＩαサブユニットの適当な部分及び
ＩＬ−２レセプターの細胞質領域又は細胞質及び膜貫通
領域を先づ単離することにより達成される。
の調製は、ＦｃＥＲＩαサブユニットの適当な部分及び
ＩＬ−２レセプターの細胞質領域又は細胞質及び膜貫通
領域を先づ単離することにより達成される。
【００３７】ヒトαサブユニットの塩基配列は、ニュー
クレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid Resea
rch）、Ｖｏｌ.１６（８）：３５８４（１９８８）に公
開されている。ヒトｐ５５ ＩＬ−２レセプターの塩基
配列はネーチャー（Nature）、３１１：６３１（１９８
４）に公開されており、そしてＩＬ−２レセプターの細
胞質及び膜貫通領域はほぼ塩基８９０−１０３０にわた
つている。αサブユニットの塩基配列は、ヒト好塩基
球、肥満細胞又はＫｕ８１２細胞株の如き多種の源泉か
ら得ることができる［Kishi，Leukemia，Research，
９，３８１（１９８５）］。ＩＬ−２レセプターの塩基
配列はヒトＴ細胞、Ｔ細胞株又は末梢血リンパ球の如き
種々の源泉からも得ることができる。
クレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid Resea
rch）、Ｖｏｌ.１６（８）：３５８４（１９８８）に公
開されている。ヒトｐ５５ ＩＬ−２レセプターの塩基
配列はネーチャー（Nature）、３１１：６３１（１９８
４）に公開されており、そしてＩＬ−２レセプターの細
胞質及び膜貫通領域はほぼ塩基８９０−１０３０にわた
つている。αサブユニットの塩基配列は、ヒト好塩基
球、肥満細胞又はＫｕ８１２細胞株の如き多種の源泉か
ら得ることができる［Kishi，Leukemia，Research，
９，３８１（１９８５）］。ＩＬ−２レセプターの塩基
配列はヒトＴ細胞、Ｔ細胞株又は末梢血リンパ球の如き
種々の源泉からも得ることができる。
【００３８】本発明の利用のために好適には、該ハイブ
リッド遺伝子はＩＬ−２レセプターの８７６−１０１６
塩基が融合されたヒトαサブユニットの塩基配列１２１
−７１０を含有する。これは下記塩基配列：
リッド遺伝子はＩＬ−２レセプターの８７６−１０１６
塩基が融合されたヒトαサブユニットの塩基配列１２１
−７１０を含有する。これは下記塩基配列：
【００３９】
【化１】
【００４０】のハイブリッド遺伝子をもたらす。
【００４１】しかしハイブリッド遺伝子の構築において
種々の制限酵素（restriction endonuclease）が各々の
塩基配列を異なつた場所で切断し、それにより上記と正
確に同一な配列を有さないハイブリッド遺伝子をもたら
しうる。少くともαサブユニットの機能的ポリペプチド
副配列（ＩｇＥに結合するいずれかの副配列（subseque
nce））並びにＩＬ−２レセプターの細胞質又は細胞質
と膜貫通との領域に対応するいずれかの機能的副配列を
コードする塩基配列を該ハイブリッド遺伝子が含有する
かぎり、それは本発明の目的のために用いることができ
る。更にその配列をαサブユニットの機能的ポリペプチ
ド配列に付加することができ、かつ機能的細胞表面発現
を許容する。他のレセプターの細胞質又は膜貫通の領域
或いは膜貫通蛋白も適切である。このような配列の具体
例は以下に示す如く多数ある。それぞれの例において、
下記蛋白の膜貫通及び細胞質ドメインにヒトαサブユニ
ットのＩｇＥ結合ドメインを融合することが可能であろ
う（それぞれの例において単一のサブユニットは他のサ
ブユニットが不在でも細胞表面に到達することに注
意）：低親和性ＩｇＥレセプター又はＣＤ２３［Kikuta
ni et al.，Cell，４７，６５７（１９８６）］；ねず
みエリスロポエチンレセプター［D′Andrea et al.，Ce
ll，５７，２７７（１９８９）］；ヒトＩｇＧ Ｆｃレ
セプター、Ｆｃ ＧＲＩＩ［Stuart et al.，J.Expt.Me
d.，１６６８（１９８７）］；ヒトポリオウイルスレセ
プター［Mendelsohn et al.，Cell，５６，８５５（１
９８９）］；ヒトＣＤ４レセプター［Madden et al.，C
ell，４２，９３（１９８５）］；ヒトＰＤＧＦレセプ
ター［Yarden et al.，Nature，３２３，２２６（１９
８６）］；ヒト高親和性ＩｇＧ Ｆｃレセプター［Scien
ce，２４３，３７８）］；ヒトインターフェロンレセプ
ター［Aguet et al.，Cell，５５，２７３）］；ヒトイ
ンターロイキン−１レセプター［Sims et al.，Scienc
e，２４１，５８５）］；又はＣＤ１９分化抗原［Stame
nkovic and Seed，J.Expt.Med.，１６８，１２０
５）］。
種々の制限酵素（restriction endonuclease）が各々の
塩基配列を異なつた場所で切断し、それにより上記と正
確に同一な配列を有さないハイブリッド遺伝子をもたら
しうる。少くともαサブユニットの機能的ポリペプチド
副配列（ＩｇＥに結合するいずれかの副配列（subseque
nce））並びにＩＬ−２レセプターの細胞質又は細胞質
と膜貫通との領域に対応するいずれかの機能的副配列を
コードする塩基配列を該ハイブリッド遺伝子が含有する
かぎり、それは本発明の目的のために用いることができ
る。更にその配列をαサブユニットの機能的ポリペプチ
ド配列に付加することができ、かつ機能的細胞表面発現
を許容する。他のレセプターの細胞質又は膜貫通の領域
或いは膜貫通蛋白も適切である。このような配列の具体
例は以下に示す如く多数ある。それぞれの例において、
下記蛋白の膜貫通及び細胞質ドメインにヒトαサブユニ
ットのＩｇＥ結合ドメインを融合することが可能であろ
う（それぞれの例において単一のサブユニットは他のサ
ブユニットが不在でも細胞表面に到達することに注
意）：低親和性ＩｇＥレセプター又はＣＤ２３［Kikuta
ni et al.，Cell，４７，６５７（１９８６）］；ねず
みエリスロポエチンレセプター［D′Andrea et al.，Ce
ll，５７，２７７（１９８９）］；ヒトＩｇＧ Ｆｃレ
セプター、Ｆｃ ＧＲＩＩ［Stuart et al.，J.Expt.Me
d.，１６６８（１９８７）］；ヒトポリオウイルスレセ
プター［Mendelsohn et al.，Cell，５６，８５５（１
９８９）］；ヒトＣＤ４レセプター［Madden et al.，C
ell，４２，９３（１９８５）］；ヒトＰＤＧＦレセプ
ター［Yarden et al.，Nature，３２３，２２６（１９
８６）］；ヒト高親和性ＩｇＧ Ｆｃレセプター［Scien
ce，２４３，３７８）］；ヒトインターフェロンレセプ
ター［Aguet et al.，Cell，５５，２７３）］；ヒトイ
ンターロイキン−１レセプター［Sims et al.，Scienc
e，２４１，５８５）］；又はＣＤ１９分化抗原［Stame
nkovic and Seed，J.Expt.Med.，１６８，１２０
５）］。
【００４２】ＩｇＥに結合し、かつ尚本発明の抗体によ
って認識されるべきエピトープが含まれるαサブユニッ
トのより小さな領域は、５′又は３′末端のいずれかか
ら連続的に１回毎に３塩基づつ削除することにより、系
統的に決定することができる。ＩｇＥ結合性サブユニッ
トポリペプチドをコードすることができる最小の塩基配
列は、機能的蛋白の最小単位を定義するであろう。ハイ
ブリッド遺伝子において、所望の位置で塩基配列を切断
するように制限酵素を選ぶことができるように、αサブ
ユニットの天然塩基配列の部分を置換することができ
る。下記 のように天然ヒトαサブユニットを置換することによ
り、位置１１９−１２６にＢａｍＨＩ部位を作ることが
できる。
って認識されるべきエピトープが含まれるαサブユニッ
トのより小さな領域は、５′又は３′末端のいずれかか
ら連続的に１回毎に３塩基づつ削除することにより、系
統的に決定することができる。ＩｇＥ結合性サブユニッ
トポリペプチドをコードすることができる最小の塩基配
列は、機能的蛋白の最小単位を定義するであろう。ハイ
ブリッド遺伝子において、所望の位置で塩基配列を切断
するように制限酵素を選ぶことができるように、αサブ
ユニットの天然塩基配列の部分を置換することができ
る。下記 のように天然ヒトαサブユニットを置換することによ
り、位置１１９−１２６にＢａｍＨＩ部位を作ることが
できる。
【００４３】該ヒトαサブユニットは、更に下記 のように改変して、位置８７８−８９０にＥｃｏＲＶ制
限酵素部位を作ることができる。
限酵素部位を作ることができる。
【００４４】所望の制限酵素切断をやりやすくするため
に天然αサブユニット又はＩＬ−２レセプターの微小な
置換を、当該技術分野で公知の方法で調製することがで
きる。両サブユニットの適当な塩基配列を単離した後、
それらを適当なリガーゼで合体させることができる。ハ
イブリッド遺伝子を合成するのに組換えＤＮＡ技術が用
いられるが、当該技術分野で公知の化学合成法で合成す
ることも可能である。ひとたびハイブリッド遺伝子が構
築されると、それを在来の発現ベクター、ファージ、又
はプラスミド中に当該技術分野で公知の手法で導入する
ことができる［例えば Laboratory Manual，Sambrook e
t al.，中の“Molecular Cloning"，Cold Spring Harbo
r Laboratory（１９８９）参照］。
に天然αサブユニット又はＩＬ−２レセプターの微小な
置換を、当該技術分野で公知の方法で調製することがで
きる。両サブユニットの適当な塩基配列を単離した後、
それらを適当なリガーゼで合体させることができる。ハ
イブリッド遺伝子を合成するのに組換えＤＮＡ技術が用
いられるが、当該技術分野で公知の化学合成法で合成す
ることも可能である。ひとたびハイブリッド遺伝子が構
築されると、それを在来の発現ベクター、ファージ、又
はプラスミド中に当該技術分野で公知の手法で導入する
ことができる［例えば Laboratory Manual，Sambrook e
t al.，中の“Molecular Cloning"，Cold Spring Harbo
r Laboratory（１９８９）参照］。
【００４５】かかる組換えＤＮＡ分子を製造する一般的
方法も当該技術分野で公知である［例えばＵＳＰ４,２
３７,２２４及びＵＳＰ４,３０４,８６３を参照］。
方法も当該技術分野で公知である［例えばＵＳＰ４,２
３７,２２４及びＵＳＰ４,３０４,８６３を参照］。
【００４６】本発明の目的のために用いられるハイブリ
ツド蛋白をコードするＤＮＡ配列を発現する方法は、ベ
クターの発現制御配列に実行可能なように結合された上
記ＤＮＡ配列を有する組換えベクターで適当な宿主を転
換し、適当な生育条件下で該宿主を培養し、そして培養
物から所望のハイブリッド蛋白を押出・単離することを
含んでいる。熟練した技術者は特定の遺伝子の発現に最
も効果的な方法を、公知方法から選定することができよ
うし、また本発明において用いる特定の宿主の選定は当
該技術分野で認められた多数の要因に影響される。これ
らには例えば、選ばれた発現ベクターとの適合性、ハイ
ブリツップラスミドにコードされた蛋白の毒性、所望の
蛋白の回収のケース、発現特性、生物安全性及びコスト
が含まれる。
ツド蛋白をコードするＤＮＡ配列を発現する方法は、ベ
クターの発現制御配列に実行可能なように結合された上
記ＤＮＡ配列を有する組換えベクターで適当な宿主を転
換し、適当な生育条件下で該宿主を培養し、そして培養
物から所望のハイブリッド蛋白を押出・単離することを
含んでいる。熟練した技術者は特定の遺伝子の発現に最
も効果的な方法を、公知方法から選定することができよ
うし、また本発明において用いる特定の宿主の選定は当
該技術分野で認められた多数の要因に影響される。これ
らには例えば、選ばれた発現ベクターとの適合性、ハイ
ブリツップラスミドにコードされた蛋白の毒性、所望の
蛋白の回収のケース、発現特性、生物安全性及びコスト
が含まれる。
【００４７】ＣＯＳ細胞は本発明の目的のために好適な
宿主である。ＣＯＳ細胞は originminus ＳＶ４０ウイ
ルスゲノムで形質転換されたアフリカミドリ猿の腎細胞
株であり、寄記番号ＣＲＬ１６５１でＡＴＣＣから入手
可能である。この細胞株は Gluzman et al.，［Cell ２
３，１７５（１９８１）］により記載された。ＣＨＯ細
胞も好適であり、広く入手可能である。いかなる真核細
胞株にも適用可能な遺伝子増幅の代替方法としては、ア
デノシン−デアミナーゼ増幅選別系又はジヒドロ葉酸還
元酵素欠失（dhfr）遺伝子増幅系の利用がある。αサブ
ユニットの加工された細胞質外（extracytoplasmic）領
域（残渣２６−２０１）の発現のためには、種々の原核
及び真核系が適している。
宿主である。ＣＯＳ細胞は originminus ＳＶ４０ウイ
ルスゲノムで形質転換されたアフリカミドリ猿の腎細胞
株であり、寄記番号ＣＲＬ１６５１でＡＴＣＣから入手
可能である。この細胞株は Gluzman et al.，［Cell ２
３，１７５（１９８１）］により記載された。ＣＨＯ細
胞も好適であり、広く入手可能である。いかなる真核細
胞株にも適用可能な遺伝子増幅の代替方法としては、ア
デノシン−デアミナーゼ増幅選別系又はジヒドロ葉酸還
元酵素欠失（dhfr）遺伝子増幅系の利用がある。αサブ
ユニットの加工された細胞質外（extracytoplasmic）領
域（残渣２６−２０１）の発現のためには、種々の原核
及び真核系が適している。
【００４８】本発明の実施において用いられるハイブリ
ッドポリペプチドは下記アミノ酸配列を有することがで
きる：
ッドポリペプチドは下記アミノ酸配列を有することがで
きる：
【００４９】
【化２】
【００５０】本発明の目的のためにハイブリッド蛋白
は、Merrifield，Journal of American Chemical Socie
ty，８５，２１４９（１９６３）の一般的固相法を利用
して合成することができる。
は、Merrifield，Journal of American Chemical Socie
ty，８５，２１４９（１９６３）の一般的固相法を利用
して合成することができる。
【００５１】該ハイブリッドポリペプチドは、ハイブリ
ッド遺伝子配列を適当な組換えベクターに挿入し、Cull
er，Methods in Enzymology １５２，６８４−７０４
（１９８７）に述べられた如く宿主を形質転換すること
による、組換え法により製造することができる。該形質
転換体を適当な培養条件下で生育させ、対応するハイブ
リッドポリペプチドを生成させる。
ッド遺伝子配列を適当な組換えベクターに挿入し、Cull
er，Methods in Enzymology １５２，６８４−７０４
（１９８７）に述べられた如く宿主を形質転換すること
による、組換え法により製造することができる。該形質
転換体を適当な培養条件下で生育させ、対応するハイブ
リッドポリペプチドを生成させる。
【００５２】以下に、例えば本発明の抗体を製造するた
めの抗原として用いることができる、キメラαサブユニ
ットの製造方法をより詳細に述べる。
めの抗原として用いることができる、キメラαサブユニ
ットの製造方法をより詳細に述べる。
【００５３】ＦｃＥＲＩのαサブユニットの塩基配列を
位置特異的変位（site directed mutagenesis）を用い
て以下のようにして位置１１９−１２６及び８８４−８
９０において改変することができる［Morinaga et a
l.，Bio Tech ２，６３６（１９８４）］。ヒトサブユ
ニットαｃＤＮＡを含有するｐＬＪ６６３［ｐＧｅｍ−
４（Promega）のＥｃｏＲＩ部位にライゲートされた１
１９７ｂｐサブユニットαｃＤＮＡ：Kochan et al.］
１０μｇを、３７℃で制限酵素ＢｇｌＩＩ（３０単位）
及びＳｔｙ Ｉ（３０単位）を用いて、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2及び６ｍＭ ２−メルカプト−エタノールを含有
するバッファー中、最終容積１００μｌ中で消化するこ
とができる。この消化によりｐＬＪ６６３は長さ約４３
７ｂｐと３７６０ｂｐに対応する２断片に断片化され
る。３７６０ｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動で単離
し、切れ目分子（gapped molecule）と呼ぶ。
位置特異的変位（site directed mutagenesis）を用い
て以下のようにして位置１１９−１２６及び８８４−８
９０において改変することができる［Morinaga et a
l.，Bio Tech ２，６３６（１９８４）］。ヒトサブユ
ニットαｃＤＮＡを含有するｐＬＪ６６３［ｐＧｅｍ−
４（Promega）のＥｃｏＲＩ部位にライゲートされた１
１９７ｂｐサブユニットαｃＤＮＡ：Kochan et al.］
１０μｇを、３７℃で制限酵素ＢｇｌＩＩ（３０単位）
及びＳｔｙ Ｉ（３０単位）を用いて、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2及び６ｍＭ ２−メルカプト−エタノールを含有
するバッファー中、最終容積１００μｌ中で消化するこ
とができる。この消化によりｐＬＪ６６３は長さ約４３
７ｂｐと３７６０ｂｐに対応する２断片に断片化され
る。３７６０ｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動で単離
し、切れ目分子（gapped molecule）と呼ぶ。
【００５４】別途ｐＬＪ６６３、１０μｇを、３７℃で
制限酵素ＰｖｕＩ（３０単位）を用いて、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、６ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2及び６ｍＭ ２−メルカプト−エタノール
を含有するバッファー中、最終容積１８０μｌ中で消化
する。この消化はｐＬＪ６６３を一度制限し、そして約
４１９７ｂｐの線状断片を生成する。この線状断片をア
ガロースゲル電気泳動で単離し、線状分子（linear mol
ecule）と呼ぶ。 上記のオリゴヌクレオチド（５０ pmoles）を、１ｍＭ
ＡＴＰ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、０.１ｍＭスペルミジン、
０.１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する混合物中、最終容積２０
μｌ中で、３７℃で３０分間、そして更に７０℃で５分
間の反応時間でポリヌクレオチドキナーゼ（５単位）を
用いて、５′末端でリン酸化し、そして氷上にあける。
制限酵素ＰｖｕＩ（３０単位）を用いて、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、６ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2及び６ｍＭ ２−メルカプト−エタノール
を含有するバッファー中、最終容積１８０μｌ中で消化
する。この消化はｐＬＪ６６３を一度制限し、そして約
４１９７ｂｐの線状断片を生成する。この線状断片をア
ガロースゲル電気泳動で単離し、線状分子（linear mol
ecule）と呼ぶ。 上記のオリゴヌクレオチド（５０ pmoles）を、１ｍＭ
ＡＴＰ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、０.１ｍＭスペルミジン、
０.１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する混合物中、最終容積２０
μｌ中で、３７℃で３０分間、そして更に７０℃で５分
間の反応時間でポリヌクレオチドキナーゼ（５単位）を
用いて、５′末端でリン酸化し、そして氷上にあける。
【００５５】位置特異的変異体は以下の手法で作成でき
る：０.１６Ｍ ＫＣｌ、１０.４ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ７.４、７.２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有するバツフア
ー中、最終容積１２.５μｌ中で切れ目分子、線状分子
各々１００ｍｇと５′リン酸化オリゴヌクレオチド１
２.５ pmole を含有する混合物を形成した。この混合物
（試験管内）を沸騰水浴（容積５００ｍｌ）中で３分間
インキュベートし、そして容器を沸騰水とともに熱板か
らはずし、室温まで冷えるままにした（混合物を含有し
たまま）。該混合物が冷えたら、下記試薬：２.５ｍＭ
ｄＧＡＴＣ（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ）４μｌ、１０×リガーゼバッファー（４５ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、４５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８.０、４５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、４０ｍＭ ＤＴＴ、１２ｍＭ ＡＴＰ、
０.４ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（分画Ｖ））１μ
ｌ、１０×ＮＴバッファー（０.５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ７.２、０.１Ｍ ＭｇＳＯ4、１ｍＭ ＤＴＴ、５０
０μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（分画Ｖ））の１μｌ、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（４００単位）１μｌ及びＥ.ｃｏ
ｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（クレ
ノウフラグメント）（２.５単位）０.５μｌ：を添加し
て２０μｌに調整する。この混合物を１５℃で少くとも
２時間、場合によっては１８時間インキユベートする。
る：０.１６Ｍ ＫＣｌ、１０.４ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ７.４、７.２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有するバツフア
ー中、最終容積１２.５μｌ中で切れ目分子、線状分子
各々１００ｍｇと５′リン酸化オリゴヌクレオチド１
２.５ pmole を含有する混合物を形成した。この混合物
（試験管内）を沸騰水浴（容積５００ｍｌ）中で３分間
インキュベートし、そして容器を沸騰水とともに熱板か
らはずし、室温まで冷えるままにした（混合物を含有し
たまま）。該混合物が冷えたら、下記試薬：２.５ｍＭ
ｄＧＡＴＣ（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ）４μｌ、１０×リガーゼバッファー（４５ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、４５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８.０、４５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、４０ｍＭ ＤＴＴ、１２ｍＭ ＡＴＰ、
０.４ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（分画Ｖ））１μ
ｌ、１０×ＮＴバッファー（０.５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ７.２、０.１Ｍ ＭｇＳＯ4、１ｍＭ ＤＴＴ、５０
０μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（分画Ｖ））の１μｌ、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（４００単位）１μｌ及びＥ.ｃｏ
ｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（クレ
ノウフラグメント）（２.５単位）０.５μｌ：を添加し
て２０μｌに調整する。この混合物を１５℃で少くとも
２時間、場合によっては１８時間インキユベートする。
【００５６】この反応混合物１〜１０μｌをＥ.ｃｏｌ
ｉ ＭＣ １０６１を形質転換するために用い、それは５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢプレート上
でのそれらの生育能で同定する。変異プラスミドは標準
条件を用いて32Ｐ−標識オリゴヌクレオチドへのハイブ
リダイズ能で同定される。ハイブリダイゼーションがポ
ジティブなコロニーは、そのコロニーから単離されたプ
ラスミドＤＮＡ中の新規ＢａｍＨＩ制限部位の存在で確
認する。この構成をｐＬＪ６６３Ｂと称する。これによ
り天然配列に下記： 天然 ATG GCT CCT GCC ATG GAA TCC CCT ACT CTA 改変 G ATC CT の改変がもたらされる。
ｉ ＭＣ １０６１を形質転換するために用い、それは５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢプレート上
でのそれらの生育能で同定する。変異プラスミドは標準
条件を用いて32Ｐ−標識オリゴヌクレオチドへのハイブ
リダイズ能で同定される。ハイブリダイゼーションがポ
ジティブなコロニーは、そのコロニーから単離されたプ
ラスミドＤＮＡ中の新規ＢａｍＨＩ制限部位の存在で確
認する。この構成をｐＬＪ６６３Ｂと称する。これによ
り天然配列に下記： 天然 ATG GCT CCT GCC ATG GAA TCC CCT ACT CTA 改変 G ATC CT の改変がもたらされる。
【００５７】この改変によりＢａｍＨＩ制限酵素で切断
可能な塩基配列が創製される。位置８８４−８９０の更
なる改変によりＥｃｏＲＶ制限酵素で切断可能な塩基配
列が創製される。ＥｃｏＲＶの導入は上記に概説された
のと類似の方法で達成される。本具体例における切れ目
分子は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ８.０、６ｍＭ ＭｇＣｌ2及び６ｍＭ ２−メル
カプト−エタノールを含有するバッファー中、最終容積
１００μｌ中で、制限酵素ＰｖｕＩＩ（３０単位）を用
いて、ｐＬＪ６６３（１０μｇ）を３７℃で消化するこ
とにより形成される。この消化によりｐＬＪ６６３を長
さ約６００ｂｐと３６００ｂｐに対応する２個の断片に
分断する。３６００ｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動
で単離し、これを切れ目分子と称する。線状分子は上記
概説と同じである。この具体例において用いられるオリ
ゴヌークレオチドは下に説明されるようなものであり、
この変異体の単離手順は上記したものと同様であり、ハ
イブリダイゼーション陽性のコロニーはこれらのコロニ
ーから単離されるプラスミドＤＮＡ中に新規ＥｃｏＲＶ
制限部位が存在することにより確認する。この構成をｐ
ＬＪ６６３Ｅと称す この改変体は、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片を単離し、
そしてＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片が除去されたクローニ
ングベクターｐＢＣ１２ＢＩ（Cullen，Methods in Enz
ymology，１５２：６８４（１９８７）参照）中に挿入
することを可能とする。ヒトαｃＤＮＡ断片のＢａｍＨ
Ｉ−ＥｃｏＲＶ改変断片は下記の手法でＰＢＣ１２ＢＩ
のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位に挿入される：ｐＬＪ６３
３Ｂ（ｐＬＪ６３３Ｂの１０μｇ）からのＢａｍＨＩ−
ＢｓｍＩ断片、２６４ｂｐ、を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、６ｍＭ ＭｇＣｌ
2及び６ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含有するバッ
ファー中、最終容積１００μｌ中で制限酵素ＢａｍＨＩ
（３０単位）及びＢｓｍＩ（３０単位）を用いて３７℃
で消化する。２６４ｂｐ断片はアガロース・ゲル電気泳
動により単離される。ｐＬＪ６６３Ｅ（ｐＬＪ６６３Ｅ
の１０μｇ）からの４９６ｂｐ ＢｓｍＩ−ＥｃｏＲＶ
断片を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ８.０、６ｍＭ ＭｇＣｌ2及び６ｍＭ ２−メル
カプトエタノールを含有するバッファー中、最終容積２
００μｌ中で、制限酵素ＢＳｍＩ（３０単位）及びＥｃ
ｏＲＶ（３０単位）を用いて、３７℃で消化する。４９
６ｂｐ断片はアガロース・ゲル電気泳動で単離する。プ
ラスミドｐＢＣ１２ＢＩ（１０μｇ）を、１０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2及び６ｍＭ２−メルカプトエタノールを含
有するバッファー中、最終容積１００μｌ中で制限酵素
ＳｍａＩ（３０単位）を用いて３７℃で消化する。ひき
つづき、それを１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ８.０、６ｍＭ ＭｇＣｌ2及び６ｍＭ ２
−メルカプトエタノールを含有するバッファー中、最終
容積１００μｌ中でＢａｍＨＩ（３０単位）を用いて３
７℃で消化する。これらの消化により２個の断片が生成
し、大きい方の約３,５００ｂｐ断片をアガロース・ゲ
ル電気泳動で単離する。これら３個の断片を、４.５ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、４.５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.
０、４.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、４ｍＭ ＤＴＴ、１.２ｍＭ
ＡＴＰ、４０μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン及びＴ4 ＤＮ
Ａリガーゼ（４００単位）を含有するバッファー中、最
終容積１０μｌの混合物中に、等モル比で添加する。該
断片を４℃で一晩かけて連結（ligation）する。該連結
化混合物でＥ.ｃｏｌｉ．ＭＣ１０６１を形質転換し、
陽性コロニーをニックトランスレーションしたヒトαサ
ブユニットｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーショ
ンで同定する。ＤＮＡを陽性コロニーから単離し、７６
０ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片の存在を確認す
る。いくつかの陽性のものを単離し、これらの１つをｐ
ＬＪ１１０１と称す。このベクタ−ｐＬＪ１１０１はα
サブユニットを非常に高水準で発現するが、該分子の非
常に少数しか細胞表面に到達又はＩｇＥに結合しない。
可能な塩基配列が創製される。位置８８４−８９０の更
なる改変によりＥｃｏＲＶ制限酵素で切断可能な塩基配
列が創製される。ＥｃｏＲＶの導入は上記に概説された
のと類似の方法で達成される。本具体例における切れ目
分子は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ８.０、６ｍＭ ＭｇＣｌ2及び６ｍＭ ２−メル
カプト−エタノールを含有するバッファー中、最終容積
１００μｌ中で、制限酵素ＰｖｕＩＩ（３０単位）を用
いて、ｐＬＪ６６３（１０μｇ）を３７℃で消化するこ
とにより形成される。この消化によりｐＬＪ６６３を長
さ約６００ｂｐと３６００ｂｐに対応する２個の断片に
分断する。３６００ｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動
で単離し、これを切れ目分子と称する。線状分子は上記
概説と同じである。この具体例において用いられるオリ
ゴヌークレオチドは下に説明されるようなものであり、
この変異体の単離手順は上記したものと同様であり、ハ
イブリダイゼーション陽性のコロニーはこれらのコロニ
ーから単離されるプラスミドＤＮＡ中に新規ＥｃｏＲＶ
制限部位が存在することにより確認する。この構成をｐ
ＬＪ６６３Ｅと称す この改変体は、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片を単離し、
そしてＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片が除去されたクローニ
ングベクターｐＢＣ１２ＢＩ（Cullen，Methods in Enz
ymology，１５２：６８４（１９８７）参照）中に挿入
することを可能とする。ヒトαｃＤＮＡ断片のＢａｍＨ
Ｉ−ＥｃｏＲＶ改変断片は下記の手法でＰＢＣ１２ＢＩ
のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位に挿入される：ｐＬＪ６３
３Ｂ（ｐＬＪ６３３Ｂの１０μｇ）からのＢａｍＨＩ−
ＢｓｍＩ断片、２６４ｂｐ、を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、６ｍＭ ＭｇＣｌ
2及び６ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含有するバッ
ファー中、最終容積１００μｌ中で制限酵素ＢａｍＨＩ
（３０単位）及びＢｓｍＩ（３０単位）を用いて３７℃
で消化する。２６４ｂｐ断片はアガロース・ゲル電気泳
動により単離される。ｐＬＪ６６３Ｅ（ｐＬＪ６６３Ｅ
の１０μｇ）からの４９６ｂｐ ＢｓｍＩ−ＥｃｏＲＶ
断片を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ８.０、６ｍＭ ＭｇＣｌ2及び６ｍＭ ２−メル
カプトエタノールを含有するバッファー中、最終容積２
００μｌ中で、制限酵素ＢＳｍＩ（３０単位）及びＥｃ
ｏＲＶ（３０単位）を用いて、３７℃で消化する。４９
６ｂｐ断片はアガロース・ゲル電気泳動で単離する。プ
ラスミドｐＢＣ１２ＢＩ（１０μｇ）を、１０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2及び６ｍＭ２−メルカプトエタノールを含
有するバッファー中、最終容積１００μｌ中で制限酵素
ＳｍａＩ（３０単位）を用いて３７℃で消化する。ひき
つづき、それを１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ８.０、６ｍＭ ＭｇＣｌ2及び６ｍＭ ２
−メルカプトエタノールを含有するバッファー中、最終
容積１００μｌ中でＢａｍＨＩ（３０単位）を用いて３
７℃で消化する。これらの消化により２個の断片が生成
し、大きい方の約３,５００ｂｐ断片をアガロース・ゲ
ル電気泳動で単離する。これら３個の断片を、４.５ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、４.５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.
０、４.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、４ｍＭ ＤＴＴ、１.２ｍＭ
ＡＴＰ、４０μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン及びＴ4 ＤＮ
Ａリガーゼ（４００単位）を含有するバッファー中、最
終容積１０μｌの混合物中に、等モル比で添加する。該
断片を４℃で一晩かけて連結（ligation）する。該連結
化混合物でＥ.ｃｏｌｉ．ＭＣ１０６１を形質転換し、
陽性コロニーをニックトランスレーションしたヒトαサ
ブユニットｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーショ
ンで同定する。ＤＮＡを陽性コロニーから単離し、７６
０ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片の存在を確認す
る。いくつかの陽性のものを単離し、これらの１つをｐ
ＬＪ１１０１と称す。このベクタ−ｐＬＪ１１０１はα
サブユニットを非常に高水準で発現するが、該分子の非
常に少数しか細胞表面に到達又はＩｇＥに結合しない。
【００５８】以下の塩基配列１２１−７１０を有してな
るＢａｍＨＩ−ＳｃａＩ断片をｐＬＪ１１０１から単離
する：１００ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８.０、６ｍＭ ＭｇＣｌ2及び６ｍＭ ２−メルカ
プトエタノールを含有するバッファー中、最終容積１０
０μｌ中で制限酵素ＢａｍＨＩ（３０単位）を用いて、
プラスミドｐＬＪ１１０１（１０μｇ）を完全に消化す
る。引きつづき制限酵素ＳｃａＩ（３単位）を部分的消
化がおこるように添加する。そして５８９ｂｐ Ｂａｍ
ＨＩ−ＳｃａＩ断片（ヒトαサブユニットの塩基１２１
−７１０）をアガロース・ゲル電気泳動で単離する。
るＢａｍＨＩ−ＳｃａＩ断片をｐＬＪ１１０１から単離
する：１００ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８.０、６ｍＭ ＭｇＣｌ2及び６ｍＭ ２−メルカ
プトエタノールを含有するバッファー中、最終容積１０
０μｌ中で制限酵素ＢａｍＨＩ（３０単位）を用いて、
プラスミドｐＬＪ１１０１（１０μｇ）を完全に消化す
る。引きつづき制限酵素ＳｃａＩ（３単位）を部分的消
化がおこるように添加する。そして５８９ｂｐ Ｂａｍ
ＨＩ−ＳｃａＩ断片（ヒトαサブユニットの塩基１２１
−７１０）をアガロース・ゲル電気泳動で単離する。
【００５９】
【化３】
【００６０】この配列を塩基８７６−１０１６を有して
なるＩＬ−２レセプターからのＲｓａＩ−ＢａｍＨＩ断
片と連結する。プラスミドｐＩＬ−２Ｒ（２０μｇ）
［Hakimi et al.，Journal of Biol.Chem.，２６２ １
７３３６−１７３４１（１９８７）］を、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、６ｍ
ＭＭｇＣｌ2及び６ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含
有するバッファー中、最終容積２００μｌ中で制限酵素
ＢａｍＨＩ（３０単位）を用いて完全に消化する。１４
１ｂｐ ＲｓａＩ−ＢａｍＨＩ断片（ｐ５５ ＩＩ−２
レセプターｃＤＮＡの塩基８７６−１０１６）をアガロ
ース・ゲル電気泳動で単離する：
なるＩＬ−２レセプターからのＲｓａＩ−ＢａｍＨＩ断
片と連結する。プラスミドｐＩＬ−２Ｒ（２０μｇ）
［Hakimi et al.，Journal of Biol.Chem.，２６２ １
７３３６−１７３４１（１９８７）］を、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、６ｍ
ＭＭｇＣｌ2及び６ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含
有するバッファー中、最終容積２００μｌ中で制限酵素
ＢａｍＨＩ（３０単位）を用いて完全に消化する。１４
１ｂｐ ＲｓａＩ−ＢａｍＨＩ断片（ｐ５５ ＩＩ−２
レセプターｃＤＮＡの塩基８７６−１０１６）をアガロ
ース・ゲル電気泳動で単離する：
【００６１】
【化４】
【００６２】該ＢａｍＨＩ−ＳｃａＩαサブユニット断
片（５８９ｂｐ）、ＲｓａＩ−ＢａｍＨＩ ｐ５５断片
（１４１ｂｐ）及びＢａｍＨＩで消化されたｐＢＣ１２
ＢＩを、３ＤＮＡ断片全てを等モル比で含有する反応に
より、一緒に連結した。正確に連結されたプラスミドベ
クターは制限酵素分析により証明される。これらのプラ
スミドの１つ、ｐＬＪ１２７５は、Cullen［Methods in
Enzymology １５２、６８４−７０４（１９８７）］に
記載されたようにしてＣＯＳ細胞中に転移した際、細胞
表面に到達し且つＩｇＥに結合するαサブユニットを高
水準で発現する。
片（５８９ｂｐ）、ＲｓａＩ−ＢａｍＨＩ ｐ５５断片
（１４１ｂｐ）及びＢａｍＨＩで消化されたｐＢＣ１２
ＢＩを、３ＤＮＡ断片全てを等モル比で含有する反応に
より、一緒に連結した。正確に連結されたプラスミドベ
クターは制限酵素分析により証明される。これらのプラ
スミドの１つ、ｐＬＪ１２７５は、Cullen［Methods in
Enzymology １５２、６８４−７０４（１９８７）］に
記載されたようにしてＣＯＳ細胞中に転移した際、細胞
表面に到達し且つＩｇＥに結合するαサブユニットを高
水準で発現する。
【００６３】ヒトαサブユニットｃＤＮＡ（１４）は部
位特異的変異（site directed mutagenesis）（４６）
により、ＢａｍＨＩ部位を塩基１２０−１２５にて導入
し、ＥｃｏＲＶ部位を塩基８７９−８８４にて導入する
というように改変することができる。得られた改変ｃＤ
ＮＡのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片は単離され、そして
ｐＢＣ１２ＢＩ（４７）のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位中
にクローン化される。これにより、プレプロインシュリ
ン遺伝子の開始コドンと初めの５アミノ酸とがヒトαサ
ブユニットのアミノ酸６−２５７に融合した枠内（in-f
rame）融合がもたらされる。ここに特定した構成ｐＬＪ
１１０１は、抗ペプチド抗血清８１−１０３及び１６０
−１９７を用いた透過化細胞（permeabilized cell）の
免疫蛍光染色法により判定して、ＣＯＳ細胞中に転移し
たとき高水準の発現をもたらした。
位特異的変異（site directed mutagenesis）（４６）
により、ＢａｍＨＩ部位を塩基１２０−１２５にて導入
し、ＥｃｏＲＶ部位を塩基８７９−８８４にて導入する
というように改変することができる。得られた改変ｃＤ
ＮＡのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片は単離され、そして
ｐＢＣ１２ＢＩ（４７）のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位中
にクローン化される。これにより、プレプロインシュリ
ン遺伝子の開始コドンと初めの５アミノ酸とがヒトαサ
ブユニットのアミノ酸６−２５７に融合した枠内（in-f
rame）融合がもたらされる。ここに特定した構成ｐＬＪ
１１０１は、抗ペプチド抗血清８１−１０３及び１６０
−１９７を用いた透過化細胞（permeabilized cell）の
免疫蛍光染色法により判定して、ＣＯＳ細胞中に転移し
たとき高水準の発現をもたらした。
【００６４】αサブユニットのキメラ型を含有するベク
ターは、改変αサブユニットのＢａｍＨＩ−ＳｃａＩ断
変（塩基１２１−１７１０）をＩＬ−２レセプターのＲ
ｓａＩ−ＢａｍＨＩ断変（塩基８７６−１０１６）に連
結することにより構築する（４８）。そしてこの連結さ
れた断片をＢａｍＨＩ消化ｐＢＣ１２ＢＩに挿入する。
得られたベクターｐＬＪ１２７５は、ヒトαサブユニッ
トのアミノ酸６−２０１（シグナルペプチドと細胞外ド
メインに対応）とｐ５５ ＩＬ−２レセプターのアミノ
酸２４０−２７１（膜貫通及び細胞質ドメインに対応）
をコードするキメラαサブユニットの合成を指令する。
ターは、改変αサブユニットのＢａｍＨＩ−ＳｃａＩ断
変（塩基１２１−１７１０）をＩＬ−２レセプターのＲ
ｓａＩ−ＢａｍＨＩ断変（塩基８７６−１０１６）に連
結することにより構築する（４８）。そしてこの連結さ
れた断片をＢａｍＨＩ消化ｐＢＣ１２ＢＩに挿入する。
得られたベクターｐＬＪ１２７５は、ヒトαサブユニッ
トのアミノ酸６−２０１（シグナルペプチドと細胞外ド
メインに対応）とｐ５５ ＩＬ−２レセプターのアミノ
酸２４０−２７１（膜貫通及び細胞質ドメインに対応）
をコードするキメラαサブユニットの合成を指令する。
【００６５】キメラαサブユニット発現の増幅は、０.
１及び１.０マイクロモルのアメトロプテリン（amethro
pterin）の段階的濃度上昇により達成される。高い数の
レセプターを発現する細胞を豊富にするのは、ＩｇＥ−
ビオチン及びストレプトアビジン−ＦＩＴＣを用いる蛍
光活性化セルソーティングを２回行うことにより達成さ
れる。そして、細胞表面のＩｇＥ結合性サブユニットを
高レベルで発現する安定なクローンを、限界稀釈クロー
ニングにより得る。５個の独立なクローン性単離体を、
初め結合親和性ではなくてレセプター発現についての相
違で特性づけする。３Ｄ１０クローンは１０％牛胎児血
清と８０μｇ／μｌゲンタマイシン硫酸塩とを補充した
イスコベ（Iscove′s）改変ダルベツコ（Dulbecco′s）
媒地中でスピナー培養に適応させる。
１及び１.０マイクロモルのアメトロプテリン（amethro
pterin）の段階的濃度上昇により達成される。高い数の
レセプターを発現する細胞を豊富にするのは、ＩｇＥ−
ビオチン及びストレプトアビジン−ＦＩＴＣを用いる蛍
光活性化セルソーティングを２回行うことにより達成さ
れる。そして、細胞表面のＩｇＥ結合性サブユニットを
高レベルで発現する安定なクローンを、限界稀釈クロー
ニングにより得る。５個の独立なクローン性単離体を、
初め結合親和性ではなくてレセプター発現についての相
違で特性づけする。３Ｄ１０クローンは１０％牛胎児血
清と８０μｇ／μｌゲンタマイシン硫酸塩とを補充した
イスコベ（Iscove′s）改変ダルベツコ（Dulbecco′s）
媒地中でスピナー培養に適応させる。
【００６６】免疫蛍光分析のために、１０％牛胎児血清
を補充したイスコベ改変ダルベッコ媒地（完全媒地）中
で３７℃３０分間、細胞をビオチニル化ＩｇＥ（１−３
ｍｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートすることができ
る。該細胞を完全媒地で４回洗浄し、ストレプトアビジ
ン−ＦＩＴＣ又はロバ抗−ウサギＩｇＥ−ＦＩＴＣ（Ja
ckson Immunoresearch）と一緒に完全媒地中で３７℃３
０分間インキュベートする。そして該細胞を洗浄し、オ
ルソサイトフルオログラフ５０Ｈで選別するか、或いは
０.２５Ｍ没食子酸Ｎ−プロピルを含有する５０％グリ
セロールでおおいカバースリップをつける。該細胞は L
eitz Diaplan 蛍光顕微鏡（２５×乾燥対物レンズ）で
観察し、Kodak Tri-X フィルムで撮影する。
を補充したイスコベ改変ダルベッコ媒地（完全媒地）中
で３７℃３０分間、細胞をビオチニル化ＩｇＥ（１−３
ｍｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートすることができ
る。該細胞を完全媒地で４回洗浄し、ストレプトアビジ
ン−ＦＩＴＣ又はロバ抗−ウサギＩｇＥ−ＦＩＴＣ（Ja
ckson Immunoresearch）と一緒に完全媒地中で３７℃３
０分間インキュベートする。そして該細胞を洗浄し、オ
ルソサイトフルオログラフ５０Ｈで選別するか、或いは
０.２５Ｍ没食子酸Ｎ−プロピルを含有する５０％グリ
セロールでおおいカバースリップをつける。該細胞は L
eitz Diaplan 蛍光顕微鏡（２５×乾燥対物レンズ）で
観察し、Kodak Tri-X フィルムで撮影する。
【００６７】結合性分析のためには、クロラミン−Ｔを
用いて１−２×１０6ｃｐｍ／μｇ蛋白の比活性まで125
ＩでＩｇＥを放射性標識することができる（１９）。
125Ｉ−ＩｇＥの結合性は（４９）で既述された如く算
定され、６５−７５％の範囲である。結合性分析は既述
された（２２）ように達成され、競合分析のためには、
２５０ｎｇ／ｍｌの125Ｉ−ＩｇＥの添加に先だち、種
々の稀釈率の試料を３０分間細胞懸濁液（４×１０6ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌ）とプレインキュベートする。非特異結
合性は５０−１００倍過剰の非標識ＩｇＥを分析用チュ
ーブに添加することにより求められ、これらの値を実験
値から引き算して特異的結合性を得る。ＩｇＥと組換え
レセプターとの間の結合及び解離の機構は、既述（５
０、５１、１６）の方法で測定される。進行方向の速度
定数（ｋ1）は式 ｋ1＝Ｖ0／ＩｇＥ0Ｒ0 から計算さ
れ、ここでＶ0は初期速度を表わし、ＩｇＥ0とＲ0はそ
れぞれＩｇＥ及びレセプターの初期モル濃度を表わす。
解離速度定数（ｋ-1）は、レセプターからのリガンドの
解離は単純な１次の崩壊過程であると仮定して計算され
る。平衡定数（ＫA）は式 ＫA＝ｋ1／ｋ-1 で計算され
る。
用いて１−２×１０6ｃｐｍ／μｇ蛋白の比活性まで125
ＩでＩｇＥを放射性標識することができる（１９）。
125Ｉ−ＩｇＥの結合性は（４９）で既述された如く算
定され、６５−７５％の範囲である。結合性分析は既述
された（２２）ように達成され、競合分析のためには、
２５０ｎｇ／ｍｌの125Ｉ−ＩｇＥの添加に先だち、種
々の稀釈率の試料を３０分間細胞懸濁液（４×１０6ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌ）とプレインキュベートする。非特異結
合性は５０−１００倍過剰の非標識ＩｇＥを分析用チュ
ーブに添加することにより求められ、これらの値を実験
値から引き算して特異的結合性を得る。ＩｇＥと組換え
レセプターとの間の結合及び解離の機構は、既述（５
０、５１、１６）の方法で測定される。進行方向の速度
定数（ｋ1）は式 ｋ1＝Ｖ0／ＩｇＥ0Ｒ0 から計算さ
れ、ここでＶ0は初期速度を表わし、ＩｇＥ0とＲ0はそ
れぞれＩｇＥ及びレセプターの初期モル濃度を表わす。
解離速度定数（ｋ-1）は、レセプターからのリガンドの
解離は単純な１次の崩壊過程であると仮定して計算され
る。平衡定数（ＫA）は式 ＫA＝ｋ1／ｋ-1 で計算され
る。
【００６８】結合性分析のために、キメラレセプターを
発現する永続的細胞株を、遺伝子結合共増幅法（gene-l
inked co-amplification technology）を用いてＣＨＯ
細胞で確立することができる。αサブユニットの細胞外
ドメインが高親和性のＩｇＥ結合に対して十分であるこ
とを明確に証明するためには、ヒト及びげつ歯類レセプ
ターについて既に述べられている如く、結合及び解離速
度定数を独立に測定することにより平衡結合定数を確定
する。ＣＨＯ細胞上のレセプター数は細胞を１０μｇ／
ｍｌの125Ｉ−ＩｇＥと一緒に２時間インキュベートす
ることにより測定する。レセプター密度は４−１０×１
０5分子／細胞の範囲であつた。
発現する永続的細胞株を、遺伝子結合共増幅法（gene-l
inked co-amplification technology）を用いてＣＨＯ
細胞で確立することができる。αサブユニットの細胞外
ドメインが高親和性のＩｇＥ結合に対して十分であるこ
とを明確に証明するためには、ヒト及びげつ歯類レセプ
ターについて既に述べられている如く、結合及び解離速
度定数を独立に測定することにより平衡結合定数を確定
する。ＣＨＯ細胞上のレセプター数は細胞を１０μｇ／
ｍｌの125Ｉ−ＩｇＥと一緒に２時間インキュベートす
ることにより測定する。レセプター密度は４−１０×１
０5分子／細胞の範囲であつた。
【００６９】以上、本発明を一般的に記述したが、以下
の図面と実施例は本発明を詳細に説明する目的のもので
あり、それによりいかなる意味においても発明が限定さ
れるものではない。
の図面と実施例は本発明を詳細に説明する目的のもので
あり、それによりいかなる意味においても発明が限定さ
れるものではない。
【００７０】図１：ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブ
ユニット）細胞に対する125Ｉ−ＩｇＥ（当技術分野で
公知のクロラミン−Ｔ法で調製）結合性の、モノクロー
ナル抗体による阻害。データは、抗体不在下での全特異
的結合に比較したときの、所定濃度の抗体存在下での
125Ｉ−ＩｇＥ結合の“阻害％”として表わされてい
る。阻害％は実施例に述べられたようにして、非標識Ｉ
ｇＥ（□）に対してと、種々の抗体１５Ａ５（■）、１
２Ｅ７（△）、２２Ｅ７（●）、５Ｄ５（○）、２９Ｃ
６（×）及び８Ｃ８（▲）について測定した。
ユニット）細胞に対する125Ｉ−ＩｇＥ（当技術分野で
公知のクロラミン−Ｔ法で調製）結合性の、モノクロー
ナル抗体による阻害。データは、抗体不在下での全特異
的結合に比較したときの、所定濃度の抗体存在下での
125Ｉ−ＩｇＥ結合の“阻害％”として表わされてい
る。阻害％は実施例に述べられたようにして、非標識Ｉ
ｇＥ（□）に対してと、種々の抗体１５Ａ５（■）、１
２Ｅ７（△）、２２Ｅ７（●）、５Ｄ５（○）、２９Ｃ
６（×）及び８Ｃ８（▲）について測定した。
【００７１】図２：ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブ
ユニット）細胞に対する125Ｉ−１５Ａ５（Ａ）及び125
Ｉ−２２Ｅ７（Ｂ）の結合性の、ＩｇＥ及びモノクロー
ナル抗体による阻害。データは抗体不在下での全特異的
結合に比較したときの、所定濃度の抗体存在下での125
Ｉ−１５Ａ５又は125Ｉ−２２Ｅ７結合の“阻害％”と
して表わされている。阻害％はＡ図においては、非標識
ＩｇＥ（●）についてと、種々の抗体１５Ａ５（□）、
１２Ｅ７（■）、２２Ｅ７（○）、５Ｄ５（×）、２９
Ｃ６（□）及び８Ｃ８（■）について、Ｂ図においては
種々の抗体１５Ａ５（□）、１２Ｅ７（■）、２２Ｅ７
（○）、５Ｄ５（●）、２９Ｃ６（△）及び８Ｃ８
（▲）について測定した。無関係の蛋白に特定的な対照
抗体は、どの分析においても特異的結合を減少させなか
った。
ユニット）細胞に対する125Ｉ−１５Ａ５（Ａ）及び125
Ｉ−２２Ｅ７（Ｂ）の結合性の、ＩｇＥ及びモノクロー
ナル抗体による阻害。データは抗体不在下での全特異的
結合に比較したときの、所定濃度の抗体存在下での125
Ｉ−１５Ａ５又は125Ｉ−２２Ｅ７結合の“阻害％”と
して表わされている。阻害％はＡ図においては、非標識
ＩｇＥ（●）についてと、種々の抗体１５Ａ５（□）、
１２Ｅ７（■）、２２Ｅ７（○）、５Ｄ５（×）、２９
Ｃ６（□）及び８Ｃ８（■）について、Ｂ図においては
種々の抗体１５Ａ５（□）、１２Ｅ７（■）、２２Ｅ７
（○）、５Ｄ５（●）、２９Ｃ６（△）及び８Ｃ８
（▲）について測定した。無関係の蛋白に特定的な対照
抗体は、どの分析においても特異的結合を減少させなか
った。
【００７２】図３：抗ＩｇＥ抗体又は本発明の抗体で処
理した、ヒト好塩基球からのヒスタミン放出の刺激。ヒ
ト末梢血好塩基球を調製し、実施例に記載されたように
所定濃度の抗ＩｇＥ抗体又は本発明の抗体で処理した。
ヒスタミン放出は（３３）に記載されたようにして測定
した。
理した、ヒト好塩基球からのヒスタミン放出の刺激。ヒ
ト末梢血好塩基球を調製し、実施例に記載されたように
所定濃度の抗ＩｇＥ抗体又は本発明の抗体で処理した。
ヒスタミン放出は（３３）に記載されたようにして測定
した。
【００７３】図４：非標識ＩｇＥ及び本発明のモノクロ
ーナル抗体による、ラット好塩基球白血病（ＲＢＬ）細
胞及びＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細
胞に対する125Ｉ−ＩｇＥ結合の阻害の比較。データ
は、非標識ラットＩｇＥ及び抗ヒトαサブユニット抗体
による、ＲＢＬ細胞例えばＲＢＬ−１［ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ１３７８］に対する125Ｉ−ラットＩｇＥの結合及び
ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞に対
する125Ｉ−ヒトＩｇＥの結合の阻害％として表現され
ている。該阻害％は各々の抗体の所定濃度について実施
例に記載されたように測定された。ＲＢＬ細胞において
非標識ラットＩｇＥ（×）及びモノクローナル抗体４Ｂ
４（□）、６Ｆ７（○）及び対照抗体（△）。ＣＨＯ−
ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞において非標
識抗体４Ｂ４（■）、６Ｆ７（●）及び対照抗体
（▲）。
ーナル抗体による、ラット好塩基球白血病（ＲＢＬ）細
胞及びＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細
胞に対する125Ｉ−ＩｇＥ結合の阻害の比較。データ
は、非標識ラットＩｇＥ及び抗ヒトαサブユニット抗体
による、ＲＢＬ細胞例えばＲＢＬ−１［ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ１３７８］に対する125Ｉ−ラットＩｇＥの結合及び
ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞に対
する125Ｉ−ヒトＩｇＥの結合の阻害％として表現され
ている。該阻害％は各々の抗体の所定濃度について実施
例に記載されたように測定された。ＲＢＬ細胞において
非標識ラットＩｇＥ（×）及びモノクローナル抗体４Ｂ
４（□）、６Ｆ７（○）及び対照抗体（△）。ＣＨＯ−
ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞において非標
識抗体４Ｂ４（■）、６Ｆ７（●）及び対照抗体
（▲）。
【００７４】
【実施例】実施例１ αサブユニットに対するモノクローナル抗体 ａ．精製及び125Ｉ及びビオチンを用いてのヒト並びに
ラットＩｇＥの標識 ヒト骨髄腫ＩｇＥ（ＰＳ）を（１７、１８）記載のよう
に精製し、ラットモノクローナルＩｇＥを（１９）記載
のようにして免疫細胞腫ＩＲ １６２をもつｎｕ／ｎｕ
マウスの腹水から精製した。ＩｇＥは（２０）記載のよ
うにしてビオチニル−イプシロン−アミノカプロン酸Ｎ
−ヒドロキシサクシンイミドエステル（Ｂ−Ｘ−ＮＨ
Ｓ、CalBiochem）でビオチニル化した。ヒト及びラット
ＩｇＥをクロラミン−Ｔを用いて比活性１−２×１０6
ｃｐｍ／ｍｇ蛋白まで125Ｉで放射性標識した。
ラットＩｇＥの標識 ヒト骨髄腫ＩｇＥ（ＰＳ）を（１７、１８）記載のよう
に精製し、ラットモノクローナルＩｇＥを（１９）記載
のようにして免疫細胞腫ＩＲ １６２をもつｎｕ／ｎｕ
マウスの腹水から精製した。ＩｇＥは（２０）記載のよ
うにしてビオチニル−イプシロン−アミノカプロン酸Ｎ
−ヒドロキシサクシンイミドエステル（Ｂ−Ｘ−ＮＨ
Ｓ、CalBiochem）でビオチニル化した。ヒト及びラット
ＩｇＥをクロラミン−Ｔを用いて比活性１−２×１０6
ｃｐｍ／ｍｇ蛋白まで125Ｉで放射性標識した。
【００７５】ｂ．可溶性キメラαサブユニットの精製 ４−１０×１０5キメラαサブユニット／細胞で発現し
ているＣＨＯ細胞を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、１
ｍＭグルタミン、５０μｇゲンタマイシン及び３×１０
-6Ｍメトトレキセート（選択剤として）を含有するイソ
コブ改変ダルベツコ培地（ＩＭＤＭ）中で維持した。細
胞を収穫し、冷いリン酸緩衝化サリーン（ＰＢＳ、ｐＨ
７.４）で洗浄し、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、４０μｇ ＰＭＳＦ及び０.０２％ＮａＮ3を含有
する冷却したＰＢＳ（１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳ緩
衝液）中で可溶化した（１０8ｃｅｌｌ／ｍｌ）。細胞
抽出液を１００,０００ｘｇで７０分遠心分離して細胞
屑を除き、可溶化キメラαサブユニットをＩｇＥアフィ
ニティーカラムでクロマトグラフにかけた。
ているＣＨＯ細胞を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、１
ｍＭグルタミン、５０μｇゲンタマイシン及び３×１０
-6Ｍメトトレキセート（選択剤として）を含有するイソ
コブ改変ダルベツコ培地（ＩＭＤＭ）中で維持した。細
胞を収穫し、冷いリン酸緩衝化サリーン（ＰＢＳ、ｐＨ
７.４）で洗浄し、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、４０μｇ ＰＭＳＦ及び０.０２％ＮａＮ3を含有
する冷却したＰＢＳ（１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳ緩
衝液）中で可溶化した（１０8ｃｅｌｌ／ｍｌ）。細胞
抽出液を１００,０００ｘｇで７０分遠心分離して細胞
屑を除き、可溶化キメラαサブユニットをＩｇＥアフィ
ニティーカラムでクロマトグラフにかけた。
【００７６】ヒト又はラットＩｇＥ（５ｍｇ）を製造業
者（BioRad Labs，Richmond，CA）のプロトコールに従
い１ｍｌの Affigel−１０に結合した。該ＩｇＥアフィ
ニティー樹脂をカラムの５倍容量の０.２Ｍ ＨＡｃ、
０.２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ２.８（酢
酸−ＣＨＡＰＳバッファー）で洗浄し、１０ｍＭ ＣＨ
ＡＰＳ／ＰＢＳバッファーで再平衡化した。キメラαサ
ブユニットの可溶化調製液（１−６×１０9細胞当量）
を該カラムに適用し、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳバ
ッファーと２ｍＭ ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳバッファー（Ｐ
ＢＳ ｐＨ７.４中に２ｍＭ ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、４０μｇ ＰＭＳＦ、０.０２％ ＮａＮ3）で洗浄
し、酢酸−ＣＨＡＰＳバッファーで溶出した。各画分を
３Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９でただちに中和した。蛋白を含
有する画分を一緒にし、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳ
バッファーに対し透析し、活性なキメラαサブユニット
についてスロットブロット分析で分析した。
者（BioRad Labs，Richmond，CA）のプロトコールに従
い１ｍｌの Affigel−１０に結合した。該ＩｇＥアフィ
ニティー樹脂をカラムの５倍容量の０.２Ｍ ＨＡｃ、
０.２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ２.８（酢
酸−ＣＨＡＰＳバッファー）で洗浄し、１０ｍＭ ＣＨ
ＡＰＳ／ＰＢＳバッファーで再平衡化した。キメラαサ
ブユニットの可溶化調製液（１−６×１０9細胞当量）
を該カラムに適用し、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳバ
ッファーと２ｍＭ ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳバッファー（Ｐ
ＢＳ ｐＨ７.４中に２ｍＭ ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、４０μｇ ＰＭＳＦ、０.０２％ ＮａＮ3）で洗浄
し、酢酸−ＣＨＡＰＳバッファーで溶出した。各画分を
３Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９でただちに中和した。蛋白を含
有する画分を一緒にし、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳ
バッファーに対し透析し、活性なキメラαサブユニット
についてスロットブロット分析で分析した。
【００７７】ｃ．活性なキメラαサブユニットを検出す
るためのスロットブロット分析 ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞の可
溶性抽出物とアフィニティ精製したキメラαサブユニッ
トを、等体積の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−グリシンバッファ
ー、２０％メタノール、ｐＨ８.３で稀釈し、市販のス
ロットブロッテイング・ユニット（Schleicher and Sch
uell，Keene，NH）を用いてニトロセルロース・ストリ
ップ（０.４５μｍ）上に真空濾過した。該ニトロセル
ロース・ストリップを２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
を含有するリン酸緩衝化サリーン（ＰＢＳ）中室温で１
時間かけてブロックし、ＣＨＡＰＳ／ＦＢＳバッファー
（１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、５％牛胎児血清、ＰＢＳ ｐＨ
７.４）中で１時間ＩｇＥ−ビオチン（０.５μｇ）とイ
ンキュベートし、０.０５％ Tween−２０を含有するＰ
ＢＳで洗浄し、そしてＣＨＡＰＳ／ＦＢＳバッファー
（Amersham Corp.）中で３０分間ストレプトアビジン−
パーオキシダーゼと反応させた。該ストリップを洗浄
し、キメラαサブユニット／ビオチニル化ＩｇＥ複合体
を４−クロロ−１−ナプトール（４−chloro−１−napt
hol）（０.５ｍｇ／ｍｌ、０.１５％Ｈ2Ｏ2、０.５Ｍ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５中）
で３０分かけて可視化した。
るためのスロットブロット分析 ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞の可
溶性抽出物とアフィニティ精製したキメラαサブユニッ
トを、等体積の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−グリシンバッファ
ー、２０％メタノール、ｐＨ８.３で稀釈し、市販のス
ロットブロッテイング・ユニット（Schleicher and Sch
uell，Keene，NH）を用いてニトロセルロース・ストリ
ップ（０.４５μｍ）上に真空濾過した。該ニトロセル
ロース・ストリップを２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
を含有するリン酸緩衝化サリーン（ＰＢＳ）中室温で１
時間かけてブロックし、ＣＨＡＰＳ／ＦＢＳバッファー
（１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、５％牛胎児血清、ＰＢＳ ｐＨ
７.４）中で１時間ＩｇＥ−ビオチン（０.５μｇ）とイ
ンキュベートし、０.０５％ Tween−２０を含有するＰ
ＢＳで洗浄し、そしてＣＨＡＰＳ／ＦＢＳバッファー
（Amersham Corp.）中で３０分間ストレプトアビジン−
パーオキシダーゼと反応させた。該ストリップを洗浄
し、キメラαサブユニット／ビオチニル化ＩｇＥ複合体
を４−クロロ−１−ナプトール（４−chloro−１−napt
hol）（０.５ｍｇ／ｍｌ、０.１５％Ｈ2Ｏ2、０.５Ｍ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５中）
で３０分かけて可視化した。
【００７８】ｄ． 125Ｉでのアフィニティー精製したキ
メラαサブユニット蛋白の標識及び125Ｉ−キメラαサ
ブユニットのＮ−グリカナーゼ処理 アフィニティー精製したキメラαサブユニットを、エン
ザイモビード薬剤（Enzymobead reagent）（BioRad Lab
oratories）を用いて、製造業者のプロトコールに従い
０.２ｍＣｉのＮａ125Ｉで３０分かけて標識した。標識
した蛋白は BioGel Ｐ６ＤＧカラム(BioRad Laboratori
es）で遊離のヨウ素から分離し、２ｍＭＣＨＡＰＳ／Ｐ
ＢＳで平衡化し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを有する２ｍＭ
ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳの等容量で稀釈し、４℃で保存し
た。
メラαサブユニット蛋白の標識及び125Ｉ−キメラαサ
ブユニットのＮ−グリカナーゼ処理 アフィニティー精製したキメラαサブユニットを、エン
ザイモビード薬剤（Enzymobead reagent）（BioRad Lab
oratories）を用いて、製造業者のプロトコールに従い
０.２ｍＣｉのＮａ125Ｉで３０分かけて標識した。標識
した蛋白は BioGel Ｐ６ＤＧカラム(BioRad Laboratori
es）で遊離のヨウ素から分離し、２ｍＭＣＨＡＰＳ／Ｐ
ＢＳで平衡化し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを有する２ｍＭ
ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳの等容量で稀釈し、４℃で保存し
た。
【００７９】放射性標識したキメラαサブユニットは真
空乾燥し、そして０.２Ｍリン酸ナトリウム、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ７.０中に再分散した。Ｎ−グリカナー
ゼ（３単位）（Genzyme，Boston，MA，USA）での消化を
振とう機上で３７℃２日間進行させ、その反応を０.１
Ｍクエン酸塩バッファー、ｐＨ４.５で停止した。
空乾燥し、そして０.２Ｍリン酸ナトリウム、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ７.０中に再分散した。Ｎ−グリカナー
ゼ（３単位）（Genzyme，Boston，MA，USA）での消化を
振とう機上で３７℃２日間進行させ、その反応を０.１
Ｍクエン酸塩バッファー、ｐＨ４.５で停止した。
【００８０】ｅ．レセプター結合分析及びアフィニティ
ー架橋 結合分析は基本的には（１７；２２）記載のようにして
達成される。簡単に言えば、ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメ
ラαサブユニット）又はＲＢＬ細胞をＲＰＭＩ１６４
０、５％牛胎児血清、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４
（結合性バッファー）中に４×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
に再分散し、125Ｉ標識ＩｇＥ（１０ｎｇ／ｍｌから１
ｍｇ／ｍｌ）とインキュベートした。非特異結合は、非
特異結合分析チユーブに５０−１００倍過剰の非標識Ｉ
ｇＥを添加することにより決定した。細胞に結合した放
射活性はシリコンオイルを介しての遠心分離（２３）に
より非結合標識から分離した。競合分析のために種々の
濃度の抗体試料を、125Ｉ標識ヒトＩｇＥ（１９ｎｇ）
又はラットＩｇＥ（２５０ｎｇ）の添加にさきだち、室
温で１時間細胞懸濁液とプレインキュベートした。試料
を室温で更に１時間インキュベートし、上記の如く処理
した。ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）又
はＲＢＬ細胞への125Ｉ−ＩｇＥの阻害は、抗体存在下
での全特異的結合を抗体不在下での全特異的結合と比較
することにより決定した。
ー架橋 結合分析は基本的には（１７；２２）記載のようにして
達成される。簡単に言えば、ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメ
ラαサブユニット）又はＲＢＬ細胞をＲＰＭＩ１６４
０、５％牛胎児血清、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４
（結合性バッファー）中に４×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
に再分散し、125Ｉ標識ＩｇＥ（１０ｎｇ／ｍｌから１
ｍｇ／ｍｌ）とインキュベートした。非特異結合は、非
特異結合分析チユーブに５０−１００倍過剰の非標識Ｉ
ｇＥを添加することにより決定した。細胞に結合した放
射活性はシリコンオイルを介しての遠心分離（２３）に
より非結合標識から分離した。競合分析のために種々の
濃度の抗体試料を、125Ｉ標識ヒトＩｇＥ（１９ｎｇ）
又はラットＩｇＥ（２５０ｎｇ）の添加にさきだち、室
温で１時間細胞懸濁液とプレインキュベートした。試料
を室温で更に１時間インキュベートし、上記の如く処理
した。ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）又
はＲＢＬ細胞への125Ｉ−ＩｇＥの阻害は、抗体存在下
での全特異的結合を抗体不在下での全特異的結合と比較
することにより決定した。
【００８１】キメラαサブユニットに架橋した125Ｉ−
ＩｇＥの可溶性複合体を調製するため、細胞を125Ｉ−
ＩｇＥとインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、冷却ＰＢ
Ｓ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ８.３中で１０7ｃｅｌｌｓ
／ｍｌの濃度で再分散した。ジメチルスルホキシド（Ｍ
ｅＳＯ4）中のスベリン酸ジサクシニミジル（ＤＳＳ）
（Pierce Chemical Co.）を最終濃度０.４ｍＭ迄添加
し、反応を一定撹拌下４℃で３０分進行させた。反応を
停止し、細胞を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.
５、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄し
た。該細胞は氷冷した１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳバ
ッファー中（１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）で上記の如くし
て可溶化した。細胞抽出物は直接ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分
析する（２４）か、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによる分析の前に
抗体で免疫沈降した。
ＩｇＥの可溶性複合体を調製するため、細胞を125Ｉ−
ＩｇＥとインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、冷却ＰＢ
Ｓ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ８.３中で１０7ｃｅｌｌｓ
／ｍｌの濃度で再分散した。ジメチルスルホキシド（Ｍ
ｅＳＯ4）中のスベリン酸ジサクシニミジル（ＤＳＳ）
（Pierce Chemical Co.）を最終濃度０.４ｍＭ迄添加
し、反応を一定撹拌下４℃で３０分進行させた。反応を
停止し、細胞を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.
５、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄し
た。該細胞は氷冷した１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳバ
ッファー中（１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）で上記の如くし
て可溶化した。細胞抽出物は直接ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分
析する（２４）か、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによる分析の前に
抗体で免疫沈降した。
【００８２】ｆ．ハイブリドーマ抗体の製造、特性分析
及び精製 ＢＡＬＢ／Ｃマウス（Charles River Laboratories，Wi
lmington，MA）を同容積のフロインド完全アジュバント
と混合した部分精製キメラαサブユニット（７×１０8
細胞当量から）で、腹膜内ルート（ｉ.ｐ.）により免疫
した。２週間後、そのマウスにフロインド不完全アジユ
バントと混合した精製キメラαサブユニットの同量を
ｉ.ｐ.で注射した。７週間後、細胞融合の４日前から始
まる連続２日に、１匹のマウスに更にキメラαサブユニ
ット（５.５×１０9細胞当量から）をｉ.ｐ.及びｉ.ｖ.
で注射した。このマウスから脾臓細胞をとり出し、３５
％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、E.Merc
k）を用いて１：１の比率（脾臓細胞：ＮＳＯ細胞）で
ＮＳＯ細胞（２５）と融合した（２６）。該融合細胞
を、１５％ＦＢＳ、グルタミン（２ｍＭ）、１−メルカ
プトエタノール（０.１ｍＭ）、ゲンタマイシン（５０
μｇ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）及び１５％Ｐ３８８Ｄ
１上清（２７）を補充したＩＭＤＭ中で、４８ウェルプ
レート中に５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／ｍｌの密
度で配置した。ハイブリッド上清は下記３分析法で特異
的αサブユニット抗体について選別した： １）125Ｉ標識キメラαサブユニットの免疫沈降 ２）キメラαサブユニットに架橋した125Ｉ−ＩｇＥの
可溶性複合体の免疫沈降、及び ３）ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）に結
合する125Ｉ−ＩｇＥの阻害。
及び精製 ＢＡＬＢ／Ｃマウス（Charles River Laboratories，Wi
lmington，MA）を同容積のフロインド完全アジュバント
と混合した部分精製キメラαサブユニット（７×１０8
細胞当量から）で、腹膜内ルート（ｉ.ｐ.）により免疫
した。２週間後、そのマウスにフロインド不完全アジユ
バントと混合した精製キメラαサブユニットの同量を
ｉ.ｐ.で注射した。７週間後、細胞融合の４日前から始
まる連続２日に、１匹のマウスに更にキメラαサブユニ
ット（５.５×１０9細胞当量から）をｉ.ｐ.及びｉ.ｖ.
で注射した。このマウスから脾臓細胞をとり出し、３５
％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、E.Merc
k）を用いて１：１の比率（脾臓細胞：ＮＳＯ細胞）で
ＮＳＯ細胞（２５）と融合した（２６）。該融合細胞
を、１５％ＦＢＳ、グルタミン（２ｍＭ）、１−メルカ
プトエタノール（０.１ｍＭ）、ゲンタマイシン（５０
μｇ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）及び１５％Ｐ３８８Ｄ
１上清（２７）を補充したＩＭＤＭ中で、４８ウェルプ
レート中に５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／ｍｌの密
度で配置した。ハイブリッド上清は下記３分析法で特異
的αサブユニット抗体について選別した： １）125Ｉ標識キメラαサブユニットの免疫沈降 ２）キメラαサブユニットに架橋した125Ｉ−ＩｇＥの
可溶性複合体の免疫沈降、及び ３）ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）に結
合する125Ｉ−ＩｇＥの阻害。
【００８３】ハイブリドーマ細胞株は限界稀釈法により
クローン化した。
クローン化した。
【００８４】免疫沈降分析（ＩＰ assay）のためには、
ハイブリドーマ上清又は精製した抗体試料（２０μ
ｇ）、ＩＰバッファー（４ｍＭ ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳ ｐ
Ｈ７.４、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）及び125Ｉ標識キメラ
αサブユニット又はキメラαサブユニットに架橋した
125Ｉ−ＩｇＥの可溶性複合体のいずれかを一緒に混合
し、３０分間静置した。アガロースビーズに結合したヤ
ギ抗マウス抗体（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）
を試験管に添加し、室温で２時間回転した。該ビーズを
ＩＰバッファーで３回洗浄し、カウントした。結合した
リガンドを、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ試料バッファーを添加
し、９５℃で３分間加熱することにより、解離した。該
解離蛋白はＳＤＳ／ＰＡＧＥ及び放射能写真撮影により
分析した。
ハイブリドーマ上清又は精製した抗体試料（２０μ
ｇ）、ＩＰバッファー（４ｍＭ ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳ ｐ
Ｈ７.４、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）及び125Ｉ標識キメラ
αサブユニット又はキメラαサブユニットに架橋した
125Ｉ−ＩｇＥの可溶性複合体のいずれかを一緒に混合
し、３０分間静置した。アガロースビーズに結合したヤ
ギ抗マウス抗体（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）
を試験管に添加し、室温で２時間回転した。該ビーズを
ＩＰバッファーで３回洗浄し、カウントした。結合した
リガンドを、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ試料バッファーを添加
し、９５℃で３分間加熱することにより、解離した。該
解離蛋白はＳＤＳ／ＰＡＧＥ及び放射能写真撮影により
分析した。
【００８５】抗体はまた変性可溶化キメラαサブユニッ
トへの結合性についてウエスターンブロツト分析法によ
り試験した（２８）。簡単にいえば、可溶化蛋白を非還
元又は還元条件下でＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、電
気泳動でニトロセルロース膜に移行させる。該膜を１％
ＢＳＡ、ＰＢＳ ｐＨ７.４で３７℃１時間処理し、次い
で抗体バッファー（１％ＢＳＡ、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウムｐＨ６.５、０.５Ｍ ＮａＣｌ、０.０５％ Tween−
２０）中で稀釈された抗体試料を用いて、室温で２時間
プローブ処理した。該膜を洗浄し、パーオキシダーゼに
結合したヤギ抗マウスＩｇＧと反応させ、結合した抗体
を４−クロロ−１−ナプトール（napthol）で室温下３
０分かけて可視化した。
トへの結合性についてウエスターンブロツト分析法によ
り試験した（２８）。簡単にいえば、可溶化蛋白を非還
元又は還元条件下でＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、電
気泳動でニトロセルロース膜に移行させる。該膜を１％
ＢＳＡ、ＰＢＳ ｐＨ７.４で３７℃１時間処理し、次い
で抗体バッファー（１％ＢＳＡ、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウムｐＨ６.５、０.５Ｍ ＮａＣｌ、０.０５％ Tween−
２０）中で稀釈された抗体試料を用いて、室温で２時間
プローブ処理した。該膜を洗浄し、パーオキシダーゼに
結合したヤギ抗マウスＩｇＧと反応させ、結合した抗体
を４−クロロ−１−ナプトール（napthol）で室温下３
０分かけて可視化した。
【００８６】抗体は、製造業者（Genex，Gaithersbur
g，MD，USA）のプロトコールに従い、架橋化アガロース
ゲルに結合した蛋白Ｇでのアフィニティクロマトグラフ
ィーにより、大規模のハイブリドーマ培養液から精製し
た。
g，MD，USA）のプロトコールに従い、架橋化アガロース
ゲルに結合した蛋白Ｇでのアフィニティクロマトグラフ
ィーにより、大規模のハイブリドーマ培養液から精製し
た。
【００８７】ｇ．合成ペプチドに対する抗体の結合性 αサブユニットの細胞外配列全体にわたる、１６個の重
畳するペプチドを標準的固相合成法で製造した（２
９）。精製したペプチドは蒸留水又はＭｅＳＯ4にとか
した（１ｍｇ／ｍｌ）。ＥＩＡプレートを５０ｍＭ重炭
酸塩−炭酸塩バッファー、ｐＨ９.６中にとかした２０
０ｎｇの各ペプチドで被覆し、そして３７℃で一晩乾燥
した。該プレートを水洗し、１％ＢＳＡ、ＰＢＳ ｐＨ
７.４でブロックし、抗体と一緒に室温で２時間インキ
ュベートした。該プレートを０.０５％Tween−２０、Ｐ
ＢＳ ｐＨ７.４で洗浄し、パーオキシダーゼに結合した
ヤギ抗マウスＩｇＧ（Boehringer Mannheim Immunochem
icals）を室温で２時間で添加した。該抗体−ペプチド
複合体を、０.０１２％Ｈ2Ｏ2を含有する０.１Ｍクエン
酸塩バッファー、ｐＨ４.５に溶かしたｏ−フェニレン
ジアミン（０.４ｍｇ／ｍｌ）で４９２ｎｍで可視化し
た。
畳するペプチドを標準的固相合成法で製造した（２
９）。精製したペプチドは蒸留水又はＭｅＳＯ4にとか
した（１ｍｇ／ｍｌ）。ＥＩＡプレートを５０ｍＭ重炭
酸塩−炭酸塩バッファー、ｐＨ９.６中にとかした２０
０ｎｇの各ペプチドで被覆し、そして３７℃で一晩乾燥
した。該プレートを水洗し、１％ＢＳＡ、ＰＢＳ ｐＨ
７.４でブロックし、抗体と一緒に室温で２時間インキ
ュベートした。該プレートを０.０５％Tween−２０、Ｐ
ＢＳ ｐＨ７.４で洗浄し、パーオキシダーゼに結合した
ヤギ抗マウスＩｇＧ（Boehringer Mannheim Immunochem
icals）を室温で２時間で添加した。該抗体−ペプチド
複合体を、０.０１２％Ｈ2Ｏ2を含有する０.１Ｍクエン
酸塩バッファー、ｐＨ４.５に溶かしたｏ−フェニレン
ジアミン（０.４ｍｇ／ｍｌ）で４９２ｎｍで可視化し
た。
【００８８】ｈ． 125Ｉ標識抗体を用いた結合性分析 抗体１５Ａ５、１２Ｅ７及び２２Ｅ７をイオドゲン法
（Iodogen method）の改良法により125Ｉで標識した（P
ierce Chemical Co.）。簡単に言えば、１ｍＣｉの125
Ｉ−Ｎａ（Amersham Co.）と５０μｌの０.５Ｍリン酸
ナトリウム・バッファー、ｐＨ７.５を、５０μｇのイ
オドゲン（Iodogen）で被覆されたホウケイ酸塩ガラス
管に添加した。４分後、ＰＢＳ、ｐＨ７.４中の抗体
（５０μｇ）を添加し、反応を室温で８分間続けた。標
識抗体を BioGel Ｐ６ＤＧカラム（BioRadLaboratorie
s）でのクロマトグラフィーにより遊離の125Ｉから分離
した。ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細
胞に対する標識抗体の結合性を、125Ｉ−ＩｇＥについ
て述べられたようにして測定した。非特異結合は１００
倍モル過剰の非標識抗体又はＩｇＥの存在下に測定され
た。平衡結合データを、標識抗体の解離定数（ＫD）及
び細胞当りの結合部位の数を推定するため、Scatchard
（３０）に従つて分析した。非標識精製抗体とハイブリ
ドーマ上清を用いた競合分析を、125Ｉ標識抗体を１時
間プレインキュベーション工程の最後に添加する以外は
125Ｉ−ＩｇＥについて記載されたようにして、実施し
た。標識抗体の結合の５０％を阻害する抗体濃度をＩＣ
50と命名した。
（Iodogen method）の改良法により125Ｉで標識した（P
ierce Chemical Co.）。簡単に言えば、１ｍＣｉの125
Ｉ−Ｎａ（Amersham Co.）と５０μｌの０.５Ｍリン酸
ナトリウム・バッファー、ｐＨ７.５を、５０μｇのイ
オドゲン（Iodogen）で被覆されたホウケイ酸塩ガラス
管に添加した。４分後、ＰＢＳ、ｐＨ７.４中の抗体
（５０μｇ）を添加し、反応を室温で８分間続けた。標
識抗体を BioGel Ｐ６ＤＧカラム（BioRadLaboratorie
s）でのクロマトグラフィーにより遊離の125Ｉから分離
した。ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細
胞に対する標識抗体の結合性を、125Ｉ−ＩｇＥについ
て述べられたようにして測定した。非特異結合は１００
倍モル過剰の非標識抗体又はＩｇＥの存在下に測定され
た。平衡結合データを、標識抗体の解離定数（ＫD）及
び細胞当りの結合部位の数を推定するため、Scatchard
（３０）に従つて分析した。非標識精製抗体とハイブリ
ドーマ上清を用いた競合分析を、125Ｉ標識抗体を１時
間プレインキュベーション工程の最後に添加する以外は
125Ｉ−ＩｇＥについて記載されたようにして、実施し
た。標識抗体の結合の５０％を阻害する抗体濃度をＩＣ
50と命名した。
【００８９】ｉ．ヒト好塩基球上の天然ＦｃＥＲＩに対
する抗体の結合性 既に記述（３１）されているようにして、Ficoll-Paque
（Pharmacia）中での沈澱により、ヘパリン化末梢血か
らヒト好塩基球を高濃度化した。洗浄した好塩基球
（１.５×１０5細胞）を、１％ＦＢＳ及び０.０２％ア
ジドナトリウムを含有するＰＢＳ中で、２.５−４０ｍ
ｇ／ｍｌの精製した抗体と一緒に室温で２０分間インキ
ュベートした。該細胞を洗浄し、そしてフルオレセイン
で標識したヤギ抗ヒトＩｇＥ及びローダミンで標識した
（Fab)2−ヤギ抗マウスＩｇＧと一緒にインキュベート
した（Tago Labs，Burlingame，CA.）。細胞を洗浄し、
サイトスピン器（Cytospin apparatus）（４００ｒｐｍ
で５分間）を用いてスライド上に分散した。該スライド
を（３２）で既述されているように、０.２２Ｍ １.４
−ジアゾビシクロ（２,２,２）オクタン（Sigma Chemic
al Co.）を含有する９０％グリセロールで覆つた。該細
胞を Leitz Diaplan 蛍光顕微鏡で観察し、KodakEktach
rome ４００フィルムで写真撮影した。
する抗体の結合性 既に記述（３１）されているようにして、Ficoll-Paque
（Pharmacia）中での沈澱により、ヘパリン化末梢血か
らヒト好塩基球を高濃度化した。洗浄した好塩基球
（１.５×１０5細胞）を、１％ＦＢＳ及び０.０２％ア
ジドナトリウムを含有するＰＢＳ中で、２.５−４０ｍ
ｇ／ｍｌの精製した抗体と一緒に室温で２０分間インキ
ュベートした。該細胞を洗浄し、そしてフルオレセイン
で標識したヤギ抗ヒトＩｇＥ及びローダミンで標識した
（Fab)2−ヤギ抗マウスＩｇＧと一緒にインキュベート
した（Tago Labs，Burlingame，CA.）。細胞を洗浄し、
サイトスピン器（Cytospin apparatus）（４００ｒｐｍ
で５分間）を用いてスライド上に分散した。該スライド
を（３２）で既述されているように、０.２２Ｍ １.４
−ジアゾビシクロ（２,２,２）オクタン（Sigma Chemic
al Co.）を含有する９０％グリセロールで覆つた。該細
胞を Leitz Diaplan 蛍光顕微鏡で観察し、KodakEktach
rome ４００フィルムで写真撮影した。
【００９０】ヒスタミン放出は（３３）で既述されたよ
うに実施した。
うに実施した。
【００９１】ｊ．αサブユニットに対するモノクローナ
ル抗体の特性分析 ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞の粗
製抽出物及び精製された可溶性キメラαサブユニット
を、スロットブロット分析で特異的ＩｇＥ結合活性につ
いて評価した。スロットブロット分析結果の定性的評価
により、第１次及び第２次免疫において存在する部分精
製キメラαサブユニットの量は約７から２８μｇである
ことが証明された。最終免疫については、該マウスはス
ロットブロツト分析での測定では約１００μｇの部分精
製キメラαサブユニットを受けていた。精製されたキメ
ラαサブユニットを注射されたマウスは、ＣＨＯ−Ｆｃ
ＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞に結合する125Ｉ
−ＩｇＥを効果的にブロックし、125Ｉ標識キメラαサ
ブユニット及びキメラαサブユニットに架橋した125Ｉ
−ＩｇＥの可溶性複合体の両者を免疫沈降させる、血清
抗体を産生した。一匹のマウスからとり出された脾臓細
胞を用いた融合により、本発明のモノクローナル抗体
（ｍＡｂ）を分泌する４７のハイブリドーマが得られた
（表１）。全ての抗体が125Ｉ標識キメラαサブユニッ
ト調製物からの約４７ＫＤの放射性標識蛋白を免疫沈降
させた。125Ｉ−キメラαサブユニット調製物中に存在
する約４７ＫＤと約６５ＫＤの２個の主要な放射性免疫
蛋白は、標識されたキメラαサブユニットと牛血清アル
ブミンをそれぞれ表わしている。データとしては表１を
参照：但し数１）〜７）が以下の意味を有する。
ル抗体の特性分析 ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞の粗
製抽出物及び精製された可溶性キメラαサブユニット
を、スロットブロット分析で特異的ＩｇＥ結合活性につ
いて評価した。スロットブロット分析結果の定性的評価
により、第１次及び第２次免疫において存在する部分精
製キメラαサブユニットの量は約７から２８μｇである
ことが証明された。最終免疫については、該マウスはス
ロットブロツト分析での測定では約１００μｇの部分精
製キメラαサブユニットを受けていた。精製されたキメ
ラαサブユニットを注射されたマウスは、ＣＨＯ−Ｆｃ
ＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞に結合する125Ｉ
−ＩｇＥを効果的にブロックし、125Ｉ標識キメラαサ
ブユニット及びキメラαサブユニットに架橋した125Ｉ
−ＩｇＥの可溶性複合体の両者を免疫沈降させる、血清
抗体を産生した。一匹のマウスからとり出された脾臓細
胞を用いた融合により、本発明のモノクローナル抗体
（ｍＡｂ）を分泌する４７のハイブリドーマが得られた
（表１）。全ての抗体が125Ｉ標識キメラαサブユニッ
ト調製物からの約４７ＫＤの放射性標識蛋白を免疫沈降
させた。125Ｉ−キメラαサブユニット調製物中に存在
する約４７ＫＤと約６５ＫＤの２個の主要な放射性免疫
蛋白は、標識されたキメラαサブユニットと牛血清アル
ブミンをそれぞれ表わしている。データとしては表１を
参照：但し数１）〜７）が以下の意味を有する。
【００９２】
【表１】
【００９３】１） 125Ｉ標識した精製キメラαサブユニ
ット（125Ｉ−アルフアー）、125Ｉ標識した脱グリコシ
ル化精製キメラαサブユニット（125Ｉ−ｄｅ−アルフ
ァー）及びキメラαサブユニットに架橋した125Ｉ−Ｉ
ｇＥの可溶性複合体（125Ｉ−ＩｇＥアルファー）を用
いて、上記の如くに実施された免疫沈降分析（ＩＰ分
析）。
ット（125Ｉ−アルフアー）、125Ｉ標識した脱グリコシ
ル化精製キメラαサブユニット（125Ｉ−ｄｅ−アルフ
ァー）及びキメラαサブユニットに架橋した125Ｉ−Ｉ
ｇＥの可溶性複合体（125Ｉ−ＩｇＥアルファー）を用
いて、上記の如くに実施された免疫沈降分析（ＩＰ分
析）。
【００９４】２） 組換えキメラαサブユニットを発現
しているＣＨＯ細胞［ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサ
ブユニット）］及びＲＢＬ細胞を用いて、上記の如くに
実施されたレセプター結合分析。分析に含まれる放射性
標識リガンドは125Ｉ−ＩｇＥ、125Ｉ−１５Ａ５及び
125Ｉ−２２Ｅ７であつた。
しているＣＨＯ細胞［ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサ
ブユニット）］及びＲＢＬ細胞を用いて、上記の如くに
実施されたレセプター結合分析。分析に含まれる放射性
標識リガンドは125Ｉ−ＩｇＥ、125Ｉ−１５Ａ５及び
125Ｉ−２２Ｅ７であつた。
【００９５】３） αサブユニットの細胞外ドメインの
アミノ酸配列（ａａ配列）に対応する１６個の合成ペプ
チドを用いて、上記の如くに実施されたペプチドＥＩ
Ａ。
アミノ酸配列（ａａ配列）に対応する１６個の合成ペプ
チドを用いて、上記の如くに実施されたペプチドＥＩ
Ａ。
【００９６】４） （ ）の中の数字はそれぞれの“ク
ラス”及び“タイプ”に入る抗体の数を表わす。標識的
抗体をそれぞれの抗体のタイプの下の（ ）内に示し
た。
ラス”及び“タイプ”に入る抗体の数を表わす。標識的
抗体をそれぞれの抗体のタイプの下の（ ）内に示し
た。
【００９７】５） タイプ２ａ及び２ｂ抗体間の相違
は、該タイプ２ｂ抗体は E.coli 内で発現されたαサブ
ユニットの組換え細胞外ドメインに、ウエスターンブロ
ットにおいて結合するということである。
は、該タイプ２ｂ抗体は E.coli 内で発現されたαサブ
ユニットの組換え細胞外ドメインに、ウエスターンブロ
ットにおいて結合するということである。
【００９８】６） ＩＣ50は＞１２０ｍｇ／ｍｌであ
る。
る。
【００９９】７） ＩＣ50は０.１８ｍｇ／ｍｌである。
【０１００】４７抗体を、それぞれキメラαサブユニッ
トに架橋した125Ｉ−ＩｇＥの可溶性複合体を免疫沈降
する、或いはＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニッ
ト）細胞に結合する125Ｉ−ＩｇＥを阻害する能力に従
つて、非阻害型及び阻害型クラスに分割した。ＳＤＳ／
ＰＡＧＥ及び放射線写真分析により、６個の非阻害型抗
体（２２Ｅ７、２９Ｃ６、１１Ｂ４、８Ｃ８、２４Ｂ４
及び５Ｄ５）がＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニ
ット）細胞に親和性架橋した125Ｉ−ＩｇＥの可溶性抽
出物からの分子量約１９０ＫＤと２５０ＫＤの２個の蛋
白を免疫沈降させた。阻害型抗体１５Ａ５、１２Ｅ７、
６Ｆ７、４Ｂ４、２３Ｂ８及び３９Ｄ７はこれらの放射
性標識複合体を免疫沈降させなかつた。キメラαサブユ
ニットは高度にグリコシル化されているため、架橋アガ
ロースに結合した小麦胚種レクチンもまた１９０ＫＤ及
び２５０ＫＤ複合体を沈降させた。
トに架橋した125Ｉ−ＩｇＥの可溶性複合体を免疫沈降
する、或いはＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニッ
ト）細胞に結合する125Ｉ−ＩｇＥを阻害する能力に従
つて、非阻害型及び阻害型クラスに分割した。ＳＤＳ／
ＰＡＧＥ及び放射線写真分析により、６個の非阻害型抗
体（２２Ｅ７、２９Ｃ６、１１Ｂ４、８Ｃ８、２４Ｂ４
及び５Ｄ５）がＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニ
ット）細胞に親和性架橋した125Ｉ−ＩｇＥの可溶性抽
出物からの分子量約１９０ＫＤと２５０ＫＤの２個の蛋
白を免疫沈降させた。阻害型抗体１５Ａ５、１２Ｅ７、
６Ｆ７、４Ｂ４、２３Ｂ８及び３９Ｄ７はこれらの放射
性標識複合体を免疫沈降させなかつた。キメラαサブユ
ニットは高度にグリコシル化されているため、架橋アガ
ロースに結合した小麦胚種レクチンもまた１９０ＫＤ及
び２５０ＫＤ複合体を沈降させた。
【０１０１】阻害型抗体１５Ａ５及び１２Ｅ７はＣＨＯ
−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞に結合する
125Ｉ−ＩｇＥをブロックする（図１）。125Ｉ−ＩｇＥ
の結合をブロツクするＩＣ50（最大阻害の半分）はそれ
ぞれ１５Ａ５、ＩｇＥ及び１２Ｅ７について０.３３、
０.８９及び２.４３μｇ／ｍｌである。これらのデータ
は、１５Ａ５及び１２Ｅ７はＩｇＥよりもαサブユニッ
トについてそれぞれ約２.５倍高い及び低い親和性を有
することを示唆している。４個の非阻害型抗体（２２Ｅ
７、５Ｄ５、８Ｃ８及び２９Ｃ６）はキメラαサブユニ
ット担持細胞への放射性標識ＩｇＥの結合をブロツクし
ない（図１）。
−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞に結合する
125Ｉ−ＩｇＥをブロックする（図１）。125Ｉ−ＩｇＥ
の結合をブロツクするＩＣ50（最大阻害の半分）はそれ
ぞれ１５Ａ５、ＩｇＥ及び１２Ｅ７について０.３３、
０.８９及び２.４３μｇ／ｍｌである。これらのデータ
は、１５Ａ５及び１２Ｅ７はＩｇＥよりもαサブユニッ
トについてそれぞれ約２.５倍高い及び低い親和性を有
することを示唆している。４個の非阻害型抗体（２２Ｅ
７、５Ｄ５、８Ｃ８及び２９Ｃ６）はキメラαサブユニ
ット担持細胞への放射性標識ＩｇＥの結合をブロツクし
ない（図１）。
【０１０２】ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニッ
ト）細胞への125Ｉ−１５Ａ５、125Ｉ−ＩｇＥ及び125
Ｉ−２２Ｅ７の結合は飽和性（saturable）であり、か
つ特異的である。ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユ
ニット）細胞への125Ｉ−１５Ａ５、125Ｉ−ＩｇＥ及び
125Ｉ−２２Ｅ７の平衡結合性のスャッチャードプロッ
ト分析は、それぞれのリガンドの見掛けの解離定数（Ｋ
D s）がそれぞれ１.５７ｎＭ、２.９９ｎＭ及び０.８１
ｎＭであることを示している。
ト）細胞への125Ｉ−１５Ａ５、125Ｉ−ＩｇＥ及び125
Ｉ−２２Ｅ７の結合は飽和性（saturable）であり、か
つ特異的である。ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユ
ニット）細胞への125Ｉ−１５Ａ５、125Ｉ−ＩｇＥ及び
125Ｉ−２２Ｅ７の平衡結合性のスャッチャードプロッ
ト分析は、それぞれのリガンドの見掛けの解離定数（Ｋ
D s）がそれぞれ１.５７ｎＭ、２.９９ｎＭ及び０.８１
ｎＭであることを示している。
【０１０３】多くの抗体がウェスターンブロットで変性
キメラαサブユニットに結合するが、非阻害型抗体のサ
ブグループのみ（即ち２２Ｅ７）がウェスターンブロッ
トで還元された及び変性されたキメラαサブユニットの
両方に結合する。ＣＨＯ細胞で発現されたキメラαサブ
ユニットの見掛けの分子量は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥでの
125Ｉ標識キメラαサブユニットのウェスターンブロッ
ト分析及び放射性写真撮影での測定によれば、約４７Ｋ
Ｄである。キメラαサブユニットのｃＤＮＡからは約２
４ＫＤの分子量が予測されることから、この見掛けの分
子量は、細胞表面のキメラαサブユニットが高度に翻訳
後修飾されていることを示している（１７）。該抗体が
炭水化物残渣及びαサブユニットのペプチド配列のうち
どちらを認識しているかを決めるため、それぞれの抗体
をＮ−グリカナーゼ消化した125Ｉ標識キメラαサブユ
ニットを用いた免疫沈降分析で試験した。Ｎ−グリカナ
ーゼ消化したレセプターは約２５ＫＤの見掛けの分子量
で移動する。非阻害型（１１Ｂ４及び３９Ｄ５）及び阻
害型（１５Ａ５）抗体の両者が、約２５ＫＤの脱グリコ
シル化された125Ｉ標識キメラαサブユニットを免疫沈
降させる。モノクローナル抗体のほとんど（４７のうち
４３）が、脱グリコシル化された125Ｉ標識キメラαサ
ブユニットを免疫沈降した。
キメラαサブユニットに結合するが、非阻害型抗体のサ
ブグループのみ（即ち２２Ｅ７）がウェスターンブロッ
トで還元された及び変性されたキメラαサブユニットの
両方に結合する。ＣＨＯ細胞で発現されたキメラαサブ
ユニットの見掛けの分子量は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥでの
125Ｉ標識キメラαサブユニットのウェスターンブロッ
ト分析及び放射性写真撮影での測定によれば、約４７Ｋ
Ｄである。キメラαサブユニットのｃＤＮＡからは約２
４ＫＤの分子量が予測されることから、この見掛けの分
子量は、細胞表面のキメラαサブユニットが高度に翻訳
後修飾されていることを示している（１７）。該抗体が
炭水化物残渣及びαサブユニットのペプチド配列のうち
どちらを認識しているかを決めるため、それぞれの抗体
をＮ−グリカナーゼ消化した125Ｉ標識キメラαサブユ
ニットを用いた免疫沈降分析で試験した。Ｎ−グリカナ
ーゼ消化したレセプターは約２５ＫＤの見掛けの分子量
で移動する。非阻害型（１１Ｂ４及び３９Ｄ５）及び阻
害型（１５Ａ５）抗体の両者が、約２５ＫＤの脱グリコ
シル化された125Ｉ標識キメラαサブユニットを免疫沈
降させる。モノクローナル抗体のほとんど（４７のうち
４３）が、脱グリコシル化された125Ｉ標識キメラαサ
ブユニットを免疫沈降した。
【０１０４】ｋ．抗体エピトープの同定 αサブユニットのシグナルペプチド（アミノ酸２６−２
０４）を除いて完全な細胞外配列に亘り、且つ重畳する
１６個の合成ペプチドに対する各抗体の結合性を、ＥＩ
Ａで決定した。該ペプチドは成熟αサブユニットのアミ
ノ酸配列２６−５１、４３−５８、５１−６５、５９−
７４、７３−８８、６６−８０、８１−１０３、９３−
１１０、１０４−１１７、１１１−１２４、１１８−１
３２、１２５−１４０、１３４−１５８、１５１−１６
７、１６０−１９７及び１８５−２０４に対応した。試
験された４３の抗体のうち、ただの２個のみが該ペプチ
ドに特異的に結合した。阻害型抗体１５Ａ５はアミノ酸
１２５−１４０に亘るペプチドを認識し、一方非阻害型
抗体１１Ｂ４は配列４３−５８を表わすペプチドに結合
した。どの抗体も他のどのペプチド例えば配列８１−１
０３に対応するペプチドとも反応しなかった。どの抗体
も部分的に重畳するペプチド（１５Ａ５については１１
８−１３２及び１３２−１５８；１１Ｂ４については２
６−５１及び５１−６５）に結合しなかったので、１５
Ａ５及び１１Ｂ４のエピトープはそれぞれおそらくアミ
ノ酸１３０及び５０の周囲の領域を含む。
０４）を除いて完全な細胞外配列に亘り、且つ重畳する
１６個の合成ペプチドに対する各抗体の結合性を、ＥＩ
Ａで決定した。該ペプチドは成熟αサブユニットのアミ
ノ酸配列２６−５１、４３−５８、５１−６５、５９−
７４、７３−８８、６６−８０、８１−１０３、９３−
１１０、１０４−１１７、１１１−１２４、１１８−１
３２、１２５−１４０、１３４−１５８、１５１−１６
７、１６０−１９７及び１８５−２０４に対応した。試
験された４３の抗体のうち、ただの２個のみが該ペプチ
ドに特異的に結合した。阻害型抗体１５Ａ５はアミノ酸
１２５−１４０に亘るペプチドを認識し、一方非阻害型
抗体１１Ｂ４は配列４３−５８を表わすペプチドに結合
した。どの抗体も他のどのペプチド例えば配列８１−１
０３に対応するペプチドとも反応しなかった。どの抗体
も部分的に重畳するペプチド（１５Ａ５については１１
８−１３２及び１３２−１５８；１１Ｂ４については２
６−５１及び５１−６５）に結合しなかったので、１５
Ａ５及び１１Ｂ４のエピトープはそれぞれおそらくアミ
ノ酸１３０及び５０の周囲の領域を含む。
【０１０５】合成ペプチドに結合しなかった抗体のエピ
トープを同定するため、ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラα
サブユニット）細胞に結合する125Ｉ−１５Ａ５及び125
Ｉ−２２Ｅ７（抗体１１Ｂ４と同種）を各々の抗体が阻
止する能力を測定する、競合研究が実施された。細胞性
レセプターに対する125Ｉ−１５Ａ５及び125Ｉ−２２Ｅ
７の結合性は飽和し得、且つ特異的であった。非標識１
５Ａ５、ＩｇＥ及び１２Ｅ７による125Ｉ−１５Ａ５結
合性の阻害についてのＩＣ50は、それぞれ１.０９、２.
４１及び１３.７４ｍｇ／ｍｌであつた（図２）。中和
型抗体のすべてがＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユ
ニット）細胞への125Ｉ−１５Ａ５の結合を阻止し、中
和型抗体は共通のエピトープ又は近く隣接したエピトー
プを認識することを示唆した。１つの非阻害型抗体２９
Ｃ６は125Ｉ−１５Ａ５の結合を１２０μｇ／ｍｌで部
分的に阻害でき、一方他の非阻害型抗体はこの濃度では
125Ｉ−１５Ａ５の結合を阻止しなかった（図２）。
トープを同定するため、ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラα
サブユニット）細胞に結合する125Ｉ−１５Ａ５及び125
Ｉ−２２Ｅ７（抗体１１Ｂ４と同種）を各々の抗体が阻
止する能力を測定する、競合研究が実施された。細胞性
レセプターに対する125Ｉ−１５Ａ５及び125Ｉ−２２Ｅ
７の結合性は飽和し得、且つ特異的であった。非標識１
５Ａ５、ＩｇＥ及び１２Ｅ７による125Ｉ−１５Ａ５結
合性の阻害についてのＩＣ50は、それぞれ１.０９、２.
４１及び１３.７４ｍｇ／ｍｌであつた（図２）。中和
型抗体のすべてがＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユ
ニット）細胞への125Ｉ−１５Ａ５の結合を阻止し、中
和型抗体は共通のエピトープ又は近く隣接したエピトー
プを認識することを示唆した。１つの非阻害型抗体２９
Ｃ６は125Ｉ−１５Ａ５の結合を１２０μｇ／ｍｌで部
分的に阻害でき、一方他の非阻害型抗体はこの濃度では
125Ｉ−１５Ａ５の結合を阻止しなかった（図２）。
【０１０６】非標識２２Ｅ７、２９Ｃ６、８Ｃ８及び５
Ｄ５による125Ｉ−２２Ｅ７の結合の阻害についてのＩ
Ｃ50は、それぞれ０.２６、０.１８、０.２９及び０.７
９μｇ／ｍｌであつた。２５の非中和型抗体のうち２２
のものを含有するハイブリドーマ上清は、ＣＨＯ−Ｆｃ
ＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞に対する125Ｉ−
２２Ｅ７の結合を阻止した。残る３つの非中和型抗体
（即ち３９Ｄ５）により認識されるエピトープは、エピ
トープが２２Ｅ７エピトープ（アミノ酸配列４３−５
８）と重畳しないことを示す細胞への、放射性標識２２
Ｅ７の結合を阻止しなかつた。阻害型抗体１５Ａ５は、
ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞への
放射性標識２２Ｅ７の結合を約２５％阻止した。この阻
害水準は一定であり、結合反応に更に多くの１５Ａ５を
添加しても増大しなかつた。非標識ＩｇＥ及び他の阻害
型抗体（即ち１２Ｅ７）は、これらの細胞への放射性標
識２２Ｅ７の結合を阻害しなかつた。
Ｄ５による125Ｉ−２２Ｅ７の結合の阻害についてのＩ
Ｃ50は、それぞれ０.２６、０.１８、０.２９及び０.７
９μｇ／ｍｌであつた。２５の非中和型抗体のうち２２
のものを含有するハイブリドーマ上清は、ＣＨＯ−Ｆｃ
ＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞に対する125Ｉ−
２２Ｅ７の結合を阻止した。残る３つの非中和型抗体
（即ち３９Ｄ５）により認識されるエピトープは、エピ
トープが２２Ｅ７エピトープ（アミノ酸配列４３−５
８）と重畳しないことを示す細胞への、放射性標識２２
Ｅ７の結合を阻止しなかつた。阻害型抗体１５Ａ５は、
ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞への
放射性標識２２Ｅ７の結合を約２５％阻止した。この阻
害水準は一定であり、結合反応に更に多くの１５Ａ５を
添加しても増大しなかつた。非標識ＩｇＥ及び他の阻害
型抗体（即ち１２Ｅ７）は、これらの細胞への放射性標
識２２Ｅ７の結合を阻害しなかつた。
【０１０７】ｌ．ヒト好塩基球上の天然ＦｃＥレセプタ
ー（ＦｃＥＲＩ）に対する抗体の結合 本発明のモノクローナル抗体が、ヒト好塩基球上のＦｃ
ＥＲＩ複合体の部分としての天然αサブユニットを認識
する能力を評価するため、２種のカラー免疫蛍光分析を
実施した。正常なヒト好塩基球は通常それらのＦｃＥレ
セプターの多数に結合したＩｇＥを有しているため、Ｆ
ＩＴＣ標識抗ＩｇＥは抗塩基球を染色し、ＩｇＥで占拠
されたＦｃＥＲＩレセプターを有する細胞が存在するこ
とを示すであろう。好塩基球は阻害型抗体１５Ａ５で非
常にかすかに染色される。この抗体はＣＨＯ−ＦｃＥＲ
Ｉ（キメラαサブユニット）細胞を鮮明に染色し、Ｉｇ
Ｅで予め処理した後のこれら同一細胞にはかすかに染色
するだけである。これらのデータは、好塩基球上の大多
数のＦｃＥＲＩレセプター上で１５Ａ５エピトープがブ
ロツクされることを示している。しかしながら、非阻害
型抗体５Ｄ５は、ＩｇＥが結合した同じ細胞を鮮明に染
色し、ＩｇＥと５Ｄ５は同時に天然ＦｃＥＲＩレセプタ
ーに結合しうることを示している。両抗体は抗ＩｇＥ染
色細胞を染色するだけであり、該抗体が好塩基球に対し
高い特異性を有することを証明した。
ー（ＦｃＥＲＩ）に対する抗体の結合 本発明のモノクローナル抗体が、ヒト好塩基球上のＦｃ
ＥＲＩ複合体の部分としての天然αサブユニットを認識
する能力を評価するため、２種のカラー免疫蛍光分析を
実施した。正常なヒト好塩基球は通常それらのＦｃＥレ
セプターの多数に結合したＩｇＥを有しているため、Ｆ
ＩＴＣ標識抗ＩｇＥは抗塩基球を染色し、ＩｇＥで占拠
されたＦｃＥＲＩレセプターを有する細胞が存在するこ
とを示すであろう。好塩基球は阻害型抗体１５Ａ５で非
常にかすかに染色される。この抗体はＣＨＯ−ＦｃＥＲ
Ｉ（キメラαサブユニット）細胞を鮮明に染色し、Ｉｇ
Ｅで予め処理した後のこれら同一細胞にはかすかに染色
するだけである。これらのデータは、好塩基球上の大多
数のＦｃＥＲＩレセプター上で１５Ａ５エピトープがブ
ロツクされることを示している。しかしながら、非阻害
型抗体５Ｄ５は、ＩｇＥが結合した同じ細胞を鮮明に染
色し、ＩｇＥと５Ｄ５は同時に天然ＦｃＥＲＩレセプタ
ーに結合しうることを示している。両抗体は抗ＩｇＥ染
色細胞を染色するだけであり、該抗体が好塩基球に対し
高い特異性を有することを証明した。
【０１０８】該ＦｃＥＲＩレセプターは、ＩｇＥと抗原
とが２又はそれ以上のレセプターを架橋するとき、好塩
基球の脱顆粒を促進する。２価の抗体分子も天然ＦｃＥ
ＲＩレセプターを架橋することにより、好塩基球の脱顆
粒を促進する。各抗体の脱顆粒を誘起する能力は、それ
ぞれの抗体が異なる濃度で存在するとき好塩基球から放
出されるヒスタミンの量で測定できる（図３）。抗Ｉｇ
Ｅ抗体は投与量依存的様式で好塩基球からのヒスタミン
放出を誘起する（図３、内部図）。非阻害型抗体５Ｄ５
及び２２Ｅ７は、最少の抗体濃度で最大のヒスタミン放
出を誘起することができる（図３）。しかし、阻害型抗
体１５Ａ５及び１２Ｅ７は、ほとんどのＦｃＥＲＩレセ
プターがＩｇＥで占拠されるため最少の抗体濃度ではヒ
スタミン放出を誘起できない（図３）。高濃度のこれら
２つの中和型抗体は、おそらくＩｇＥで占拠されていな
いレセプターの架橋によりヒスタミン放出を誘起する
（図３）。
とが２又はそれ以上のレセプターを架橋するとき、好塩
基球の脱顆粒を促進する。２価の抗体分子も天然ＦｃＥ
ＲＩレセプターを架橋することにより、好塩基球の脱顆
粒を促進する。各抗体の脱顆粒を誘起する能力は、それ
ぞれの抗体が異なる濃度で存在するとき好塩基球から放
出されるヒスタミンの量で測定できる（図３）。抗Ｉｇ
Ｅ抗体は投与量依存的様式で好塩基球からのヒスタミン
放出を誘起する（図３、内部図）。非阻害型抗体５Ｄ５
及び２２Ｅ７は、最少の抗体濃度で最大のヒスタミン放
出を誘起することができる（図３）。しかし、阻害型抗
体１５Ａ５及び１２Ｅ７は、ほとんどのＦｃＥＲＩレセ
プターがＩｇＥで占拠されるため最少の抗体濃度ではヒ
スタミン放出を誘起できない（図３）。高濃度のこれら
２つの中和型抗体は、おそらくＩｇＥで占拠されていな
いレセプターの架橋によりヒスタミン放出を誘起する
（図３）。
【０１０９】ｍ．ＲＢＬ細胞上の天然ＦｃＥＲＩレセプ
ターへの抗体の結合 ６種の阻害型（１５Ａ５、４Ｂ４、３９Ｄ７、１２Ｅ
７、６Ｆ７及び２３Ｂ８）及び６種の非阻害型（２２Ｅ
７、５Ｄ５、８Ｃ８、２４Ｂ４、２９Ｃ６及び１１Ｂ
４）の抗体につき、ＲＢＬ細胞上のＦｃＥＲＩレセプタ
ーへの125Ｉ−ＩｇＥの結合を阻害し、又はラットαサ
ブユニットに架橋した125Ｉ−ＩｇＥの可溶性複合体を
免疫する能力を試験した。ただ１種の阻害型抗体４Ｂ４
がＲＢＬ細胞への125Ｉ−ラットＩｇＥの結合を阻止す
る。ＣＨＯ−ＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞及び
ＲＢＬ細胞に結合する125Ｉ−ＩｇＥを阻止する４Ｂ４
のＩＣ50は、それぞれ０.６及び３３０ｍｇ／ｍｌであ
る。非標識ラットＩｇＥはＲＢＬ細胞に結合する125Ｉ
−ラットＩｇＥの阻止において、４Ｂ４より約１１００
倍効果的であつた。他の抗体はＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キ
メラαサブユニット）細胞に結合する125Ｉ−ヒトＩｇ
Ｅを阻止するのは非常に効力があったが、どれもＲＢＬ
細胞に結合する125Ｉ−ラットＩｇＥを阻止できなかつ
た。非阻害型抗体のどれもラットαサブユニットに架橋
した125Ｉ−ＩｇＥの可溶性複合体を免疫沈降できなか
った。
ターへの抗体の結合 ６種の阻害型（１５Ａ５、４Ｂ４、３９Ｄ７、１２Ｅ
７、６Ｆ７及び２３Ｂ８）及び６種の非阻害型（２２Ｅ
７、５Ｄ５、８Ｃ８、２４Ｂ４、２９Ｃ６及び１１Ｂ
４）の抗体につき、ＲＢＬ細胞上のＦｃＥＲＩレセプタ
ーへの125Ｉ−ＩｇＥの結合を阻害し、又はラットαサ
ブユニットに架橋した125Ｉ−ＩｇＥの可溶性複合体を
免疫する能力を試験した。ただ１種の阻害型抗体４Ｂ４
がＲＢＬ細胞への125Ｉ−ラットＩｇＥの結合を阻止す
る。ＣＨＯ−ＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞及び
ＲＢＬ細胞に結合する125Ｉ−ＩｇＥを阻止する４Ｂ４
のＩＣ50は、それぞれ０.６及び３３０ｍｇ／ｍｌであ
る。非標識ラットＩｇＥはＲＢＬ細胞に結合する125Ｉ
−ラットＩｇＥの阻止において、４Ｂ４より約１１００
倍効果的であつた。他の抗体はＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キ
メラαサブユニット）細胞に結合する125Ｉ−ヒトＩｇ
Ｅを阻止するのは非常に効力があったが、どれもＲＢＬ
細胞に結合する125Ｉ−ラットＩｇＥを阻止できなかつ
た。非阻害型抗体のどれもラットαサブユニットに架橋
した125Ｉ−ＩｇＥの可溶性複合体を免疫沈降できなか
った。
【０１１０】ｎ．モノクローナル抗体のＦａｂ断片の調
製と利用 本発明の精製モノクローナル抗体のＦａｂ断片は、“An
tibodies：A Laboratory Manual"，E.Harlow and D.Lan
e，eds.，Cold Spring Harbor Press，１９８９：pp.６
２５−６３１及び“Monoclonal antibodies：Principle
and Practice"，J. Goding，Academic Press，Inc.，N
ew York，N.Y.，１１９−１２４（１９８３）に記載さ
れている如き、周知の標準的方法によりパパイン消化で
製造された。
製と利用 本発明の精製モノクローナル抗体のＦａｂ断片は、“An
tibodies：A Laboratory Manual"，E.Harlow and D.Lan
e，eds.，Cold Spring Harbor Press，１９８９：pp.６
２５−６３１及び“Monoclonal antibodies：Principle
and Practice"，J. Goding，Academic Press，Inc.，N
ew York，N.Y.，１１９−１２４（１９８３）に記載さ
れている如き、周知の標準的方法によりパパイン消化で
製造された。
【０１１１】精製したモノクローナル抗体のＦａｂ断片
は、もとの抗体分子について記述した方法により、ヒト
好塩基球及び肥満細胞に結合するＩｇＥを阻止するのに
利用することができる。脱顆粒とヒスタミン放出を刺激
することなく、Ｆａｂ断片によって好塩基球や肥満細胞
に結合するＩｇＥを阻害する証明は、Progress in Alle
rgy，Vol.３４，pp.１８８−２５３“ＩｇＥレセプター
を介してのメディエーター放出についての肥満細胞の活
性化”、T.I.Ishizaka and K.Ishizaka に記載された標
準的技術で実施された。
は、もとの抗体分子について記述した方法により、ヒト
好塩基球及び肥満細胞に結合するＩｇＥを阻止するのに
利用することができる。脱顆粒とヒスタミン放出を刺激
することなく、Ｆａｂ断片によって好塩基球や肥満細胞
に結合するＩｇＥを阻害する証明は、Progress in Alle
rgy，Vol.３４，pp.１８８−２５３“ＩｇＥレセプター
を介してのメディエーター放出についての肥満細胞の活
性化”、T.I.Ishizaka and K.Ishizaka に記載された標
準的技術で実施された。
【０１１２】なお、本発明の主たる特徴及び実施態様を
示せば以下のとおりである。
示せば以下のとおりである。
【０１１３】１．ヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターの
αサブユニットの少くとも１つのエピトープに特異的に
結合することのできるモノクローナル抗体又はその断
片。 ２．１価又は２価のＦａｂ断片である第１項の断片。
αサブユニットの少くとも１つのエピトープに特異的に
結合することのできるモノクローナル抗体又はその断
片。 ２．１価又は２価のＦａｂ断片である第１項の断片。
【０１１４】３．ヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターの
αサブユニットのアミノ酸配列が下記のとおり
αサブユニットのアミノ酸配列が下記のとおり
【０１１５】
【化５】
【０１１６】である第１項又は２項のモノクローナル抗
体又はその断片。
体又はその断片。
【０１１７】４．ヒト好塩基球又はヒト肥満細胞の高親
和性ＦｃＩｇＥレセプターに結合するＩｇＥをブロック
する第１〜３項のいずれかのモノクローナル抗体又はそ
の断片。
和性ＦｃＩｇＥレセプターに結合するＩｇＥをブロック
する第１〜３項のいずれかのモノクローナル抗体又はそ
の断片。
【０１１８】５．ヒト好塩基球又は肥満細胞の高親和性
ＦｃＩｇＥレセプターのαサブユニットに結合したとき
ヒスタミン放出を刺激しない第１〜３項のいずれかのモ
ノクローナル抗体又はその断片。
ＦｃＩｇＥレセプターのαサブユニットに結合したとき
ヒスタミン放出を刺激しない第１〜３項のいずれかのモ
ノクローナル抗体又はその断片。
【０１１９】６．哺乳動物由来の第１〜５項のいずれか
のモノクローナル抗体又はその断片。
のモノクローナル抗体又はその断片。
【０１２０】７．第１〜６項のいずれかのモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞。
ル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞。
【０１２１】８．治療活性物質（therapeutically acti
ve substance）としての第１〜６項のいずれかのモノク
ローナル抗体又はその断片。
ve substance）としての第１〜６項のいずれかのモノク
ローナル抗体又はその断片。
【０１２２】９．診断道具としての第１〜６項のいずれ
かのモノクローナル抗体又はその断片。
かのモノクローナル抗体又はその断片。
【０１２３】１０．ヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプター
のαサブユニットを精製するための第１〜６項のいずれ
かのモノクローナル抗体又はその断片。
のαサブユニットを精製するための第１〜６項のいずれ
かのモノクローナル抗体又はその断片。
【０１２４】１１．（ａ） ヒト高親和性ＦｃＩｇＥレ
セプターのαサブユニットに対応する第１のアミノ酸配
列又はその機能的サブ配列、及び上記αサブユニットの
細胞表面発現を可能とするレセプターの膜貫通及び細胞
質領域に対応する第２のアミノ酸配列とを含有してなる
ポリペプチドをアジユバントと混合して哺乳動物に注射
し、そして免疫応答を生起するように少くとも１回注射
を繰返し； （ｂ） 該哺乳動物から抗体産生細胞を単離し； （ｃ） 該細胞をミエローマ細胞と融合し；そして （ｄ） 得られるハイブリドーマ細胞から所望のモノク
ローナル抗体を産生する細胞を選択することからなる第
１〜６項のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ細胞の製造方法。
セプターのαサブユニットに対応する第１のアミノ酸配
列又はその機能的サブ配列、及び上記αサブユニットの
細胞表面発現を可能とするレセプターの膜貫通及び細胞
質領域に対応する第２のアミノ酸配列とを含有してなる
ポリペプチドをアジユバントと混合して哺乳動物に注射
し、そして免疫応答を生起するように少くとも１回注射
を繰返し； （ｂ） 該哺乳動物から抗体産生細胞を単離し； （ｃ） 該細胞をミエローマ細胞と融合し；そして （ｄ） 得られるハイブリドーマ細胞から所望のモノク
ローナル抗体を産生する細胞を選択することからなる第
１〜６項のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ細胞の製造方法。
【０１２５】１２．第１１項の工程（ａ）から（ｄ）
と、対応するハイブリドーマ細胞の上清から所望のモノ
クローナル抗体を単離し、そして所望により、既知方法
によりそれらの断片を製造することからなる工程（ｅ）
とを特徴とする第１〜６項のいずれかに記載のモノクロ
ーナル抗体又はその断片を製造する方法。
と、対応するハイブリドーマ細胞の上清から所望のモノ
クローナル抗体を単離し、そして所望により、既知方法
によりそれらの断片を製造することからなる工程（ｅ）
とを特徴とする第１〜６項のいずれかに記載のモノクロ
ーナル抗体又はその断片を製造する方法。
【０１２６】１３．（ａ） 上記モノクローナル抗体又
は断片と試料中に存在する該αサブユニットとの間で複
合体が形成される条件下で、固相担体に結合されていて
もよい該モノクローナル抗体又は断片と試料とを接触せ
しめ； （ｂ） 該試料から形成される複合体を分離し；そして （ｃ） 該複合体から上記αサブユニットを純粋な形態
で単離することからなるヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプ
ターのαサブユニットの精製方法。
は断片と試料中に存在する該αサブユニットとの間で複
合体が形成される条件下で、固相担体に結合されていて
もよい該モノクローナル抗体又は断片と試料とを接触せ
しめ； （ｂ） 該試料から形成される複合体を分離し；そして （ｃ） 該複合体から上記αサブユニットを純粋な形態
で単離することからなるヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプ
ターのαサブユニットの精製方法。
【０１２７】１４．（ａ） 生物学的流体であつてもよ
い試料を、酵素又は放射性或いは蛍光性物質であつても
よい検出可能なマーカーで標識された第１−６項のいず
れかで定義されるモノクローナル抗体又はその断片と接
触させて、該モノクローナル抗体又は断片と該試料中に
存在するαサブユニットとの間で複合体を形成させ；そ
して （ｂ） 標識された複合体を検出し、それにより試料中
の該αサブユニットの存在を検出することからなる試料
中のヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターのαサブユニッ
トの存在を検出する方法。
い試料を、酵素又は放射性或いは蛍光性物質であつても
よい検出可能なマーカーで標識された第１−６項のいず
れかで定義されるモノクローナル抗体又はその断片と接
触させて、該モノクローナル抗体又は断片と該試料中に
存在するαサブユニットとの間で複合体を形成させ；そ
して （ｂ） 標識された複合体を検出し、それにより試料中
の該αサブユニットの存在を検出することからなる試料
中のヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターのαサブユニッ
トの存在を検出する方法。
【０１２８】１５．（ａ） 試料を、第１〜６項のいず
れかに定義されたモノクローナル抗体又はその断片と接
触させ、該モノクローナル抗体又は断片と該試料中に存
在する上記αサブユニットとの間で複合体を形成させ； （ｂ） 得られる試料を、上記モノクローナル抗体又は
断片と結合することのできる検出可能な標識抗体と接触
させ、該検出可能な標識抗体と工程（ａ）の複合体との
間で複合体を形成させ；そして （ｃ） 工程（ｂ）の標識複合体を検出し、それにより
試料中の上記αサブユニットの存在を検出することから
なる試料中のヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターのαサ
ブユニットの存在を検出する方法。
れかに定義されたモノクローナル抗体又はその断片と接
触させ、該モノクローナル抗体又は断片と該試料中に存
在する上記αサブユニットとの間で複合体を形成させ； （ｂ） 得られる試料を、上記モノクローナル抗体又は
断片と結合することのできる検出可能な標識抗体と接触
させ、該検出可能な標識抗体と工程（ａ）の複合体との
間で複合体を形成させ；そして （ｃ） 工程（ｂ）の標識複合体を検出し、それにより
試料中の上記αサブユニットの存在を検出することから
なる試料中のヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターのαサ
ブユニットの存在を検出する方法。
【０１２９】１６．（ａ） 固相担体に結合した第１〜
６項のいずれかに定義されたモノクローナル抗体又はそ
の断片を、単離されたヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプタ
ーのαサブユニットの既知量と接触させ、該モノクロー
ナル抗体又は断片と上記αサブユニットとの間で複合体
を形成させ； （ｂ） 工程（ａ）の複合体を試料と接触させ、試料中
のＩｇＥを上記複合体のαサブユニットと結合させて新
複合体を形成させ； （ｃ） 工程（ｂ）の新たに形成された複合体を、Ｉｇ
Ｅに結合することができる検出可能な標識抗体の既知量
と接触させ；そして （ｄ） 工程（ｃ）の検出可能な標識抗体の量を測定す
ることにより、該試料中に存在するＩｇＥの量を決定す
ることからなる、ヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターの
αサブユニットに結合可能な試料中に存在するＩｇＥの
量を決定する方法。
６項のいずれかに定義されたモノクローナル抗体又はそ
の断片を、単離されたヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプタ
ーのαサブユニットの既知量と接触させ、該モノクロー
ナル抗体又は断片と上記αサブユニットとの間で複合体
を形成させ； （ｂ） 工程（ａ）の複合体を試料と接触させ、試料中
のＩｇＥを上記複合体のαサブユニットと結合させて新
複合体を形成させ； （ｃ） 工程（ｂ）の新たに形成された複合体を、Ｉｇ
Ｅに結合することができる検出可能な標識抗体の既知量
と接触させ；そして （ｄ） 工程（ｃ）の検出可能な標識抗体の量を測定す
ることにより、該試料中に存在するＩｇＥの量を決定す
ることからなる、ヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターの
αサブユニットに結合可能な試料中に存在するＩｇＥの
量を決定する方法。
【０１３０】１７．第１〜６項のいずれかのモノクロー
ナル抗体又はその断片及び所望により非毒性、不活性の
治療上許容される担体材料を含有する薬学的組成物。
ナル抗体又はその断片及び所望により非毒性、不活性の
治療上許容される担体材料を含有する薬学的組成物。
【０１３１】１８．第１〜６項のいずれかのモノクロー
ナル抗体又はその断片の治療剤としての使用。
ナル抗体又はその断片の治療剤としての使用。
【０１３２】１９．第１〜６項のいずれかのモノクロー
ナル抗体又はその断片のアレルギー疾患の処置のための
治療剤としての使用。
ナル抗体又はその断片のアレルギー疾患の処置のための
治療剤としての使用。
【０１３３】２０．第１〜６項のいずれかのモノクロー
ナル抗体又はその断片の診断薬としての使用。
ナル抗体又はその断片の診断薬としての使用。
【０１３４】２１．第１〜６項のいずれかのモノクロー
ナル抗体又はその断片のヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプ
ターのαサブユニットの精製のための使用。
ナル抗体又はその断片のヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプ
ターのαサブユニットの精製のための使用。
【０１３５】２２．第１１項に記載された方法により製
造されたハイブリドーマ細胞。
造されたハイブリドーマ細胞。
【０１３６】２３．第１２項に記載された方法により製
造されたモノクローナル抗体又はその断片。
造されたモノクローナル抗体又はその断片。
【０１３７】参 考 文 献 １．Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｈ.，Ａｌｃａｒａｚ，Ｇ.，Ｈａ
ｈｍａｎ，Ｒ.，Ｊ.Ｐ. Ｋｉｎｅｔ，Ｐｕｂｌｕｄａ
Ｖ.，ａｎｄ Ｑｕａｒｔｏ，Ｒ.（１９８６）Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，４１９‐４７０ ２．Ｃｏｎｒａｄ，Ｄ．Ｈ.，Ｂｅｒｃｚｉ，Ｉ.，ａｎ
ｄ Ｆｒｏｅｓｅ，Ａ．（１９７６）Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ １３，３２９‐３３２ ３．Ｋｕｌｃｚｙｃｋｉ，Ａ.，Ｊｒ.，ＭｃＮｅａｒｎ
ｅｙ，Ｔ．Ａ.，ａｎｄ Ｐａｒｋｅｒ，Ｃ．Ｗ.（１９
７６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７，６６１‐６６５ ４．Ｈｏｌｏｗｋａ，Ｄ.，Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｈ.，Ｋ
ａｎｎｅｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｊ.，ａｎｄ Ｍｅｔｚｅ
ｇｅｒ，Ｈ.（１９８０）Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｒｅｓ．
１，４１‐６８ ５．Ｈｏｌｏｗｋａ．Ｄ.，ａｎｄ Ｍｅｔｚｇｅｒ，
Ｈ.（１９８２）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９，２１
９‐２２７６．Ｐｅｒｅｚ‐Ｍｏｎｔｆｏｒｔ，Ｒ.，
Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐Ｐ.，ａｎｄ Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｈ.
（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２，５７２
２‐５７２８ ７．Ｐｅｒｅｘ‐Ｍｏｎｔｆｏｒｔ，Ｒ.，Ｆｅｗｔｒ
ｅｌｌ，Ｃ.，ａｎｄＭｅｔｚｇｅｒ，Ｈ.（１９８３）
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２，５７３３‐５７３７ ８．Ａｌｃａｒａｚ，Ｇ.，Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐Ｐ.，Ｋ
ｕｍａｒ，Ｎ.，Ｗａｎｋ，Ｓ．Ａ.，ａｎｄ Ｍｅｔｚ
ｇｅｒ，Ｈ.（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５９，１４９２２‐１４９２７ ９．Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐Ｐ.，Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｈ.，Ｈ
ａｋｉｍｉ，Ｊ.，ａｎｄ Ｋｏｃｈａｎ，Ｊ.（１９８
７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６，４６０５‐４６
１０ １０．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ａ.，Ｔｅｐｌｅｒ，Ｉ.，Ｂｅ
ｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ.，Ｂｅｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅ.，Ｓｉ
ｒａｇａｎｉａｎ，Ｒ．Ｐ.，ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ，
Ｐ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８５，１９０７‐１９１１ １１．Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐ｐ.，Ｂｌａｎ，Ｕ.，Ｒａ，
Ｃ.，Ｗｈｉｔｅ，Ｋ.，Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｈ.，ａｎｄ
Ｋｏｃｈａｎ，Ｊ.（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，６４８３‐６４
８７ １２．Ｂｌａｎｋ，Ｕ.，Ｒａ，Ｃ.，Ｍｉｌｌｅｒ，
Ｌ，Ｗｈｉｔｅ，Ｋ.，Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｈ.，ａｎｄ
Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐Ｐ.（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３
７，１８７‐１８９ １３．Ｒａ，Ｃ.，Ｊｏｕｖｉｎ，Ｍ.‐Ｈ．Ｅ.，ａｎ
ｄ Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐Ｐ.（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｄｈｅｍ．２６４，１５３２３‐１５３２７ １４．Ｋｏｃｈａｎ，Ｊ.，Ｐｅｔｔｉｎｅ，Ｌ．Ｆ.，
Ｈａｋｉｍｉ，Ｊ.，Ｋｉｓｈｉ，Ｋ．ａｎｄ Ｋｉｎ
ｅｔ，Ｊ.‐ｐ.（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１６，３５８４ １５．ｋｕｓｔｅｒ，Ｈ.，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｈ.，ａ
ｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.Ｐ.（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ ２６５：６４４８ １６．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ.，Ｂｌａｎｋ，Ｕ．Ｍｅｔｚ
ｇｅｒ，Ｈ.，ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐Ｐ.（１９８
９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，３３４‐３３７ １７．Ｈａｋｉｍｉ，Ｊ.，Ｓｅａｌｓ，Ｃ.，Ｐｅｔｔ
ｉｎｅ，Ｌ．Ｆ．ａｎｄＫｏｃｈａｎ，Ｊ.（１９９
０）Ｓｃｉｅｎｃｅ（ｉｎｐｒｅｓｓ） １８．Ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｋ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎ
ｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ（ＩｇＥ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１６，７６ １９．Ｂａｚｉｎ，Ｈ.，Ｑｕｅｒｉｎｊｅａｎ，Ｐ.，
Ｂｅｃｋｅｒｓ，Ａ.，Ｈｅｒｅｍａｎｓ，Ｊ．Ｆ.，ａ
ｎｄ Ｄｅｓｓｙ，Ｆ．（１９７４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ ２６，７１３ ２０．Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ.，Ｓｋｕｔｅｌｓｋｙ，
Ｅ.，ａｎｄ Ｗｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．（１９７９）Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６２，３０
８ ２１．ＭｃＣｏｎａｈｅｙ，Ｐ.，ａｎｄ Ｄｉｘｏ
ｎ，Ｆ．Ｊ.（１９８６）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅ
ｇｙ ２９，１８５ ２２．Ｋｕｌｃｚｙｃｋｉ，Ａ.，Ｊｒ.，Ｉｓｅｒｓｋ
ｙ，Ｃ.，ａｎｄ Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｈ.（１９７４）
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３９，６００ ２３．Ｋｉｌｉａｎ，Ｐ．Ｌ.，Ｋａｆｆｋａ，Ｋ．
Ｌ，Ｓｔｅｒｎ.，Ａ．Ｓ.，Ｗｏｅｈｌｅ，Ｄ.，Ｂｅ
ｎｊａｍｉｎ，Ｗ．Ｒ.，Ｄｅｃｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ.，
Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ.，Ｆａｒｒａｒ，Ｊ.，Ｍｉｚｅｌ，
Ｓ．Ｂ.，ａｎｄ Ｌｏｍｅｄｉｃｏ，Ｐ．Ｔ.（１９８
６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６，１‐６ ２４．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｊ．Ｋ.（１９７０）Ｎａｔｕ
ｒｅ ２２７，６８０‐６８５ ２５．Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ.，ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ，Ｃ.（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ ７３，３‐４６６ ２６．Ｆａｚｅｋａｓ Ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ，
ａｎｄ Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｄ.（１９８０）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５，１‐２１ ２７．Ｎｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｐ.，Ｐｕｍｐｈｒｅｙ，
Ｊ．Ｇ.，ａｎｄ Ｒｕｄｉｋｏｆｆ， Ｓ.（１９８
７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，８１３‐８１７ ２８．Ｂｕｒｎｅｔｔｅ，Ｗ．Ｈ.（１９８１）Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２，１９５‐２００ ２９．Ｂａｒａｎｙ，Ｇ.，ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅ
ｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９８０）Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ.，ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆ
ｅｒ，Ｊ.，ｅｄｓ）Ｖｏｌ．２，ｐｐ．１‐２５５，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ３０．Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ｇ.（１９４９）Ａｎｎ．
Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１，６６０‐６７２ ３１．Ｌｅｏｎａｒｄ Ｅ．Ｊ.，Ｒｏｂｅｒｔｓ，
Ｒ．Ｌ.，ａｎｄ Ｓｋｅｅｌ，Ａ.（１９８４）Ｊ．Ｌ
ｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．３５，１６９‐ ３２．Ｋｒｅｎｉｋ，Ｋ．Ｄ.，Ｋｅｐｈａｒｔ，Ｇ．
Ｍ.，Ｏｆｆｏｒｄ，Ｋ．Ｐ.，Ｄｕｎｎｅｔｔｅ，Ｓ．
Ｌ.，ａｎｄ Ｇｌｅｉｃｈ，Ｇ．Ｊ.（１９８９）Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１７，９１‐９７ ３３．Ｈｅｌｍ，Ｂ.，Ｋｅｂｏ，Ｄ.，Ｖｅｒｃｈｅｌ
ｌｉ，Ｄ.，Ｇｌｏｒｓｋｙ，Ｍ.，Ｇｏｕｌｄ，Ｈ.，
Ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｋ.，Ｇｅｈｅ，Ｒ.，ａｎｄ Ｉｓ
ｈｉｚａｋａ，Ｔ.（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，９４６５‐９４６９ ３４．Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ.，，Ｌｕｓｔｅｒ，
Ａ．Ｄ.，Ｗｅｉｎｓｈａｎｋ，Ｒ.，Ｋｏｃｈａｎ，
Ｊ.，Ｐａｖｌｏｖｅｃ，Ａ.，Ｐｏｒｔｎｏｙ，Ｄ．
Ａ.，Ｈｕｌｍｅｓ，Ｊ.，Ｐａｎ.Ｙ.‐Ｃ．Ｅ.，ａｎ
ｄ Ｕｎｋｅｌｅｓ，Ｊ．Ｃ．（１９８６） ３５．Ｂａｓｃｉａｎｏ，Ｌ．Ｋ.，Ｂｅｒｅｎｓｔｅ
ｉｎ，Ｅ．Ｈ.，Ｋｍａｋ，Ｌ.，ａｎｄ Ｓｉｒａｇａ
ｎｉａｎ，Ｒ．Ｐ.（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６１，１１８２３‐１１８３１ ３６．Ｂａｎｉｙａｓｈ，Ｍ.，Ａｌｋａｌａｙ，Ｉ.，
ａｎｄ Ｅｓｈｈａｒ，Ｚ.（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１３８，２９９９‐３００４ ３７．Ｓｔｒａｃｋｅ，Ｍ．Ｌ.，Ｂａｓｃｉａｎｏ，
Ｌ．Ｋ.，Ｆｉｓｃｈｌｅｒ，Ｃ.，Ｂｅｒｅｎｓｔｅｉ
ｎ，Ｅ．Ｈ.，ａｎｄ Ｓｉｒａｇａｎｉａｎ，Ｒ．Ｐ.
（１９８７）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４，３４７‐
３５６ ３８．Ｍｉｒｏｌｉ，Ａ．Ａ.，ａｎｄ Ｓｐｉｔｚ，
Ｍ.（１９８７）Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
９７，１８５‐１９０ ３９．Ｇｕｙｒｅ，Ｐ．Ｍ.，Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．
Ｒ.，Ｖａｎｃｅ，Ｂ．Ａ.，Ｍｏｒｇａｎｅｌｌｉ，
Ｐ．Ｍ.，ａｎｄ Ｆａｎｇｅｒ，Ｍ．Ｗ.（１９８９）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３，１６５０‐１６５５ ４０．Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．（１９８２）Ｉｎｔｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ
Ｉｎｃ.，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ． ４１．Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ.，ｅ
ｄｓ.（１９８９），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ，６２５‐６３１． ４２．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ.（１９８３）Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ.，１１９‐１２
４． ４３．Ｉｓｈｉｚａｓｋａ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｓｈｅｉｚ
ａｋａ Ｋ.，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ａｌｌｒｅｇ
ｙ，３４，１８８‐２３５． ４４．Ｌａｗｌｏｒ Ｅ.，Ｗ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，ａｎ
ｄ Ｂ．Ｏ′Ｃｏｎｎｏｒ .（１９８６）．Ａ
Ｃａｓｅ ｏｆ ＩｇＥ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｅｍ．３２：６９７． ４５．Ｌｕｉ，Ｆ．Ｔ.，Ｍ．Ｓｉｎｎｅｃｋｅｒ，
Ｊ．Ｈａｍａｏｋａ，ａｎｄ Ｄ．Ｋａｔｚ.（１９７
９）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：６９０． ４６．Ｍａｒｉｎａｇａ，Ｙ.，Ｔ．Ｆｒａｎｃｅｓｃ
ｈｉｒｉ，Ｓ，Ｉｎｏｕｙｅ，ａｎｄ Ｍ．Ｉｎｏｕｙ
ｅ．（１９８４）．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏ
ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ‐ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓ
ｉｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｕｓｉｎｇ ｄｏｕｂｌｅ‐ｓｔｒａｎｄ ｐｌａｓｍ
ｉｄ．ＤＮＡ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：６３６． ４７．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．（１９８７）．Ｕｓｅ ｏｆ
ｅｕｋａｒｏｙｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅ
ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １
５２：６８４． ４８．Ｎｉｋａｉｄｏ，Ｔ.，Ａ．Ｓｈｉｍｉｚｕ，
Ｎ．Ｉｓｈｉｄａ，Ｈ．Ｓａｂｅ，Ｋ．Ｔｅｓｈｉｇａ
ｗａｒａ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｔ．Ｕｃｈｉｙａｍａ，
Ｊ．Ｙｏｄｏｉ，ａｎｄ Ｔ．Ｈｏｎｊｏ．（１９８
４）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃ
ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅ
ｕｋｉｎ‐２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ ３１
１：６３１． ４９．Ｉｓｅｒｓｋｙ，Ｃ.，Ａ．Ｋｕｌｃｚｙｃｋ
ｉ，Ｊｒ.，ａｎｄ Ｈ．Ｍｅｔｚｇｅｒ．（１９７
４）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＥ ｆｒｏｍ
ｒｅａｇｉｎｉｃ ｒａｔ ｓｅｒｕｍ．Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１１２：１９０９． ５０．Ｋｕｌｃｚｙｃｋｉ，Ａ.，Ｊｒ.，ａｎｄ Ｈ．
Ｍｅｔｚｇｅｒ．（１９７４）．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａ
ｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＥ ｗｉｔｈ ｒａｔ ｂａｓ
ｏｐｈｉｌｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．Ｉ
Ｉ．Ｑｕａｎｔｉａｔｉｖｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ，１４０：１６７． ５１．Ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｔ.，Ｂ．Ｈｅｌｍ，Ｊ．Ｈ
ａｋｉｍｉ，Ｊ．Ｎｉｅｂｙｌ，Ｋ．Ｉｓｈｉｚａｋ
ａ，ａｎｄ Ｈ．Ｇｏｕｌｄ．（１９８６）．Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏ
ｂｕｌｉｎ ｅｐｓｉｌｏｎ‐ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８３：８３２３． ５２．Ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｔ.，Ａ．Ｍ．Ｄｖｏｒａ
ｋ，Ｄ．Ｈ．Ｃｏｎｒａｄ，Ｊ．Ｒ．Ｎｉｅｂｙｌ，
Ｊ．Ｐ．Ｍａｒｑｕｅｔｔｅ，ａｎｄ Ｋ．Ｉｓｈｉｚ
ａｋａ．（１９８５）．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ａｎ
ｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂａｓｏｐｈｉｌｓ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ
ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅ
ｌｌｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：５３２． ５３．Ｃｏｎｒａｄ，Ｄ．Ｈ.，Ｊ．Ｒ．Ｗｉｎｇａｒ
ｄ，ａｎｄ Ｔ．Ｉｓｈｉｚａｋａ．（１９８３），Ｔ
ｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａ
ｎｄ ｒｏｄｅｎｔ ＩｇＥ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｕ
ｍａｎ ｂａｓｏｐｈｉｌ ＩｇＥ ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：３２７
ｈｍａｎ，Ｒ.，Ｊ.Ｐ. Ｋｉｎｅｔ，Ｐｕｂｌｕｄａ
Ｖ.，ａｎｄ Ｑｕａｒｔｏ，Ｒ.（１９８６）Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，４１９‐４７０ ２．Ｃｏｎｒａｄ，Ｄ．Ｈ.，Ｂｅｒｃｚｉ，Ｉ.，ａｎ
ｄ Ｆｒｏｅｓｅ，Ａ．（１９７６）Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ １３，３２９‐３３２ ３．Ｋｕｌｃｚｙｃｋｉ，Ａ.，Ｊｒ.，ＭｃＮｅａｒｎ
ｅｙ，Ｔ．Ａ.，ａｎｄ Ｐａｒｋｅｒ，Ｃ．Ｗ.（１９
７６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７，６６１‐６６５ ４．Ｈｏｌｏｗｋａ，Ｄ.，Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｈ.，Ｋ
ａｎｎｅｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｊ.，ａｎｄ Ｍｅｔｚｅ
ｇｅｒ，Ｈ.（１９８０）Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｒｅｓ．
１，４１‐６８ ５．Ｈｏｌｏｗｋａ．Ｄ.，ａｎｄ Ｍｅｔｚｇｅｒ，
Ｈ.（１９８２）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９，２１
９‐２２７６．Ｐｅｒｅｚ‐Ｍｏｎｔｆｏｒｔ，Ｒ.，
Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐Ｐ.，ａｎｄ Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｈ.
（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２，５７２
２‐５７２８ ７．Ｐｅｒｅｘ‐Ｍｏｎｔｆｏｒｔ，Ｒ.，Ｆｅｗｔｒ
ｅｌｌ，Ｃ.，ａｎｄＭｅｔｚｇｅｒ，Ｈ.（１９８３）
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２，５７３３‐５７３７ ８．Ａｌｃａｒａｚ，Ｇ.，Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐Ｐ.，Ｋ
ｕｍａｒ，Ｎ.，Ｗａｎｋ，Ｓ．Ａ.，ａｎｄ Ｍｅｔｚ
ｇｅｒ，Ｈ.（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５９，１４９２２‐１４９２７ ９．Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐Ｐ.，Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｈ.，Ｈ
ａｋｉｍｉ，Ｊ.，ａｎｄ Ｋｏｃｈａｎ，Ｊ.（１９８
７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６，４６０５‐４６
１０ １０．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ａ.，Ｔｅｐｌｅｒ，Ｉ.，Ｂｅ
ｎｆｅｙ，Ｐ．Ｎ.，Ｂｅｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅ.，Ｓｉ
ｒａｇａｎｉａｎ，Ｒ．Ｐ.，ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ，
Ｐ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８５，１９０７‐１９１１ １１．Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐ｐ.，Ｂｌａｎ，Ｕ.，Ｒａ，
Ｃ.，Ｗｈｉｔｅ，Ｋ.，Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｈ.，ａｎｄ
Ｋｏｃｈａｎ，Ｊ.（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，６４８３‐６４
８７ １２．Ｂｌａｎｋ，Ｕ.，Ｒａ，Ｃ.，Ｍｉｌｌｅｒ，
Ｌ，Ｗｈｉｔｅ，Ｋ.，Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｈ.，ａｎｄ
Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐Ｐ.（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３
７，１８７‐１８９ １３．Ｒａ，Ｃ.，Ｊｏｕｖｉｎ，Ｍ.‐Ｈ．Ｅ.，ａｎ
ｄ Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐Ｐ.（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｄｈｅｍ．２６４，１５３２３‐１５３２７ １４．Ｋｏｃｈａｎ，Ｊ.，Ｐｅｔｔｉｎｅ，Ｌ．Ｆ.，
Ｈａｋｉｍｉ，Ｊ.，Ｋｉｓｈｉ，Ｋ．ａｎｄ Ｋｉｎ
ｅｔ，Ｊ.‐ｐ.（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１６，３５８４ １５．ｋｕｓｔｅｒ，Ｈ.，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｈ.，ａ
ｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.Ｐ.（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ ２６５：６４４８ １６．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ.，Ｂｌａｎｋ，Ｕ．Ｍｅｔｚ
ｇｅｒ，Ｈ.，ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ｊ.‐Ｐ.（１９８
９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，３３４‐３３７ １７．Ｈａｋｉｍｉ，Ｊ.，Ｓｅａｌｓ，Ｃ.，Ｐｅｔｔ
ｉｎｅ，Ｌ．Ｆ．ａｎｄＫｏｃｈａｎ，Ｊ.（１９９
０）Ｓｃｉｅｎｃｅ（ｉｎｐｒｅｓｓ） １８．Ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｋ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎ
ｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ（ＩｇＥ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１６，７６ １９．Ｂａｚｉｎ，Ｈ.，Ｑｕｅｒｉｎｊｅａｎ，Ｐ.，
Ｂｅｃｋｅｒｓ，Ａ.，Ｈｅｒｅｍａｎｓ，Ｊ．Ｆ.，ａ
ｎｄ Ｄｅｓｓｙ，Ｆ．（１９７４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ ２６，７１３ ２０．Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ.，Ｓｋｕｔｅｌｓｋｙ，
Ｅ.，ａｎｄ Ｗｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．（１９７９）Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６２，３０
８ ２１．ＭｃＣｏｎａｈｅｙ，Ｐ.，ａｎｄ Ｄｉｘｏ
ｎ，Ｆ．Ｊ.（１９８６）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅ
ｇｙ ２９，１８５ ２２．Ｋｕｌｃｚｙｃｋｉ，Ａ.，Ｊｒ.，Ｉｓｅｒｓｋ
ｙ，Ｃ.，ａｎｄ Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｈ.（１９７４）
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３９，６００ ２３．Ｋｉｌｉａｎ，Ｐ．Ｌ.，Ｋａｆｆｋａ，Ｋ．
Ｌ，Ｓｔｅｒｎ.，Ａ．Ｓ.，Ｗｏｅｈｌｅ，Ｄ.，Ｂｅ
ｎｊａｍｉｎ，Ｗ．Ｒ.，Ｄｅｃｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ.，
Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ.，Ｆａｒｒａｒ，Ｊ.，Ｍｉｚｅｌ，
Ｓ．Ｂ.，ａｎｄ Ｌｏｍｅｄｉｃｏ，Ｐ．Ｔ.（１９８
６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６，１‐６ ２４．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｊ．Ｋ.（１９７０）Ｎａｔｕ
ｒｅ ２２７，６８０‐６８５ ２５．Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ.，ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ，Ｃ.（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ ７３，３‐４６６ ２６．Ｆａｚｅｋａｓ Ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ，
ａｎｄ Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｄ.（１９８０）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５，１‐２１ ２７．Ｎｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｐ.，Ｐｕｍｐｈｒｅｙ，
Ｊ．Ｇ.，ａｎｄ Ｒｕｄｉｋｏｆｆ， Ｓ.（１９８
７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，８１３‐８１７ ２８．Ｂｕｒｎｅｔｔｅ，Ｗ．Ｈ.（１９８１）Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２，１９５‐２００ ２９．Ｂａｒａｎｙ，Ｇ.，ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅ
ｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９８０）Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ.，ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆ
ｅｒ，Ｊ.，ｅｄｓ）Ｖｏｌ．２，ｐｐ．１‐２５５，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ３０．Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ｇ.（１９４９）Ａｎｎ．
Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１，６６０‐６７２ ３１．Ｌｅｏｎａｒｄ Ｅ．Ｊ.，Ｒｏｂｅｒｔｓ，
Ｒ．Ｌ.，ａｎｄ Ｓｋｅｅｌ，Ａ.（１９８４）Ｊ．Ｌ
ｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．３５，１６９‐ ３２．Ｋｒｅｎｉｋ，Ｋ．Ｄ.，Ｋｅｐｈａｒｔ，Ｇ．
Ｍ.，Ｏｆｆｏｒｄ，Ｋ．Ｐ.，Ｄｕｎｎｅｔｔｅ，Ｓ．
Ｌ.，ａｎｄ Ｇｌｅｉｃｈ，Ｇ．Ｊ.（１９８９）Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１７，９１‐９７ ３３．Ｈｅｌｍ，Ｂ.，Ｋｅｂｏ，Ｄ.，Ｖｅｒｃｈｅｌ
ｌｉ，Ｄ.，Ｇｌｏｒｓｋｙ，Ｍ.，Ｇｏｕｌｄ，Ｈ.，
Ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｋ.，Ｇｅｈｅ，Ｒ.，ａｎｄ Ｉｓ
ｈｉｚａｋａ，Ｔ.（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，９４６５‐９４６９ ３４．Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ.，，Ｌｕｓｔｅｒ，
Ａ．Ｄ.，Ｗｅｉｎｓｈａｎｋ，Ｒ.，Ｋｏｃｈａｎ，
Ｊ.，Ｐａｖｌｏｖｅｃ，Ａ.，Ｐｏｒｔｎｏｙ，Ｄ．
Ａ.，Ｈｕｌｍｅｓ，Ｊ.，Ｐａｎ.Ｙ.‐Ｃ．Ｅ.，ａｎ
ｄ Ｕｎｋｅｌｅｓ，Ｊ．Ｃ．（１９８６） ３５．Ｂａｓｃｉａｎｏ，Ｌ．Ｋ.，Ｂｅｒｅｎｓｔｅ
ｉｎ，Ｅ．Ｈ.，Ｋｍａｋ，Ｌ.，ａｎｄ Ｓｉｒａｇａ
ｎｉａｎ，Ｒ．Ｐ.（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６１，１１８２３‐１１８３１ ３６．Ｂａｎｉｙａｓｈ，Ｍ.，Ａｌｋａｌａｙ，Ｉ.，
ａｎｄ Ｅｓｈｈａｒ，Ｚ.（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１３８，２９９９‐３００４ ３７．Ｓｔｒａｃｋｅ，Ｍ．Ｌ.，Ｂａｓｃｉａｎｏ，
Ｌ．Ｋ.，Ｆｉｓｃｈｌｅｒ，Ｃ.，Ｂｅｒｅｎｓｔｅｉ
ｎ，Ｅ．Ｈ.，ａｎｄ Ｓｉｒａｇａｎｉａｎ，Ｒ．Ｐ.
（１９８７）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４，３４７‐
３５６ ３８．Ｍｉｒｏｌｉ，Ａ．Ａ.，ａｎｄ Ｓｐｉｔｚ，
Ｍ.（１９８７）Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
９７，１８５‐１９０ ３９．Ｇｕｙｒｅ，Ｐ．Ｍ.，Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．
Ｒ.，Ｖａｎｃｅ，Ｂ．Ａ.，Ｍｏｒｇａｎｅｌｌｉ，
Ｐ．Ｍ.，ａｎｄ Ｆａｎｇｅｒ，Ｍ．Ｗ.（１９８９）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３，１６５０‐１６５５ ４０．Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．（１９８２）Ｉｎｔｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ
Ｉｎｃ.，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ． ４１．Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ.，ｅ
ｄｓ.（１９８９），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ，６２５‐６３１． ４２．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ.（１９８３）Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ.，１１９‐１２
４． ４３．Ｉｓｈｉｚａｓｋａ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｓｈｅｉｚ
ａｋａ Ｋ.，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ａｌｌｒｅｇ
ｙ，３４，１８８‐２３５． ４４．Ｌａｗｌｏｒ Ｅ.，Ｗ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，ａｎ
ｄ Ｂ．Ｏ′Ｃｏｎｎｏｒ .（１９８６）．Ａ
Ｃａｓｅ ｏｆ ＩｇＥ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｅｍ．３２：６９７． ４５．Ｌｕｉ，Ｆ．Ｔ.，Ｍ．Ｓｉｎｎｅｃｋｅｒ，
Ｊ．Ｈａｍａｏｋａ，ａｎｄ Ｄ．Ｋａｔｚ.（１９７
９）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：６９０． ４６．Ｍａｒｉｎａｇａ，Ｙ.，Ｔ．Ｆｒａｎｃｅｓｃ
ｈｉｒｉ，Ｓ，Ｉｎｏｕｙｅ，ａｎｄ Ｍ．Ｉｎｏｕｙ
ｅ．（１９８４）．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏ
ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ‐ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓ
ｉｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｕｓｉｎｇ ｄｏｕｂｌｅ‐ｓｔｒａｎｄ ｐｌａｓｍ
ｉｄ．ＤＮＡ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：６３６． ４７．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．（１９８７）．Ｕｓｅ ｏｆ
ｅｕｋａｒｏｙｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅ
ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １
５２：６８４． ４８．Ｎｉｋａｉｄｏ，Ｔ.，Ａ．Ｓｈｉｍｉｚｕ，
Ｎ．Ｉｓｈｉｄａ，Ｈ．Ｓａｂｅ，Ｋ．Ｔｅｓｈｉｇａ
ｗａｒａ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｔ．Ｕｃｈｉｙａｍａ，
Ｊ．Ｙｏｄｏｉ，ａｎｄ Ｔ．Ｈｏｎｊｏ．（１９８
４）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃ
ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅ
ｕｋｉｎ‐２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ ３１
１：６３１． ４９．Ｉｓｅｒｓｋｙ，Ｃ.，Ａ．Ｋｕｌｃｚｙｃｋ
ｉ，Ｊｒ.，ａｎｄ Ｈ．Ｍｅｔｚｇｅｒ．（１９７
４）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＥ ｆｒｏｍ
ｒｅａｇｉｎｉｃ ｒａｔ ｓｅｒｕｍ．Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１１２：１９０９． ５０．Ｋｕｌｃｚｙｃｋｉ，Ａ.，Ｊｒ.，ａｎｄ Ｈ．
Ｍｅｔｚｇｅｒ．（１９７４）．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａ
ｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＥ ｗｉｔｈ ｒａｔ ｂａｓ
ｏｐｈｉｌｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．Ｉ
Ｉ．Ｑｕａｎｔｉａｔｉｖｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ，１４０：１６７． ５１．Ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｔ.，Ｂ．Ｈｅｌｍ，Ｊ．Ｈ
ａｋｉｍｉ，Ｊ．Ｎｉｅｂｙｌ，Ｋ．Ｉｓｈｉｚａｋ
ａ，ａｎｄ Ｈ．Ｇｏｕｌｄ．（１９８６）．Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏ
ｂｕｌｉｎ ｅｐｓｉｌｏｎ‐ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８３：８３２３． ５２．Ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｔ.，Ａ．Ｍ．Ｄｖｏｒａ
ｋ，Ｄ．Ｈ．Ｃｏｎｒａｄ，Ｊ．Ｒ．Ｎｉｅｂｙｌ，
Ｊ．Ｐ．Ｍａｒｑｕｅｔｔｅ，ａｎｄ Ｋ．Ｉｓｈｉｚ
ａｋａ．（１９８５）．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ａｎ
ｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂａｓｏｐｈｉｌｓ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ
ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅ
ｌｌｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：５３２． ５３．Ｃｏｎｒａｄ，Ｄ．Ｈ.，Ｊ．Ｒ．Ｗｉｎｇａｒ
ｄ，ａｎｄ Ｔ．Ｉｓｈｉｚａｋａ．（１９８３），Ｔ
ｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａ
ｎｄ ｒｏｄｅｎｔ ＩｇＥ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｕ
ｍａｎ ｂａｓｏｐｈｉｌ ＩｇＥ ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：３２７
【図１】 ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニッ
ト）細胞に対する125Ｉ−ＩｇＥ（当技術分野で公知の
クロラミン−Ｔ法で調製）結合性のモノクローナル抗体
による抑制割合を示すグラフである。
ト）細胞に対する125Ｉ−ＩｇＥ（当技術分野で公知の
クロラミン−Ｔ法で調製）結合性のモノクローナル抗体
による抑制割合を示すグラフである。
【図２】 ＣＨＯ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニッ
ト）細胞に対する125Ｉ−１５Ａ５（Ａ）及び125Ｉ−２
２Ｅ７（Ｂ）の結合性のＩｇＥ及びモノクローナル抗体
による抑制割合を示すグラフである。
ト）細胞に対する125Ｉ−１５Ａ５（Ａ）及び125Ｉ−２
２Ｅ７（Ｂ）の結合性のＩｇＥ及びモノクローナル抗体
による抑制割合を示すグラフである。
【図３】 抗ＩｇＥ抗体又は本発明の抗体で処理したヒ
ト好塩基球からのヒスタミン放出割合を示すグラフであ
る。
ト好塩基球からのヒスタミン放出割合を示すグラフであ
る。
【図４】 非標識ＩｇＥ及び本発明のモノクローナル抗
体によるラット好塩基球白血病（ＲＢＬ）細胞及びＣＨ
Ｏ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞に対する
125Ｉ−ＩｇＥ結合の抑制割合を示すグラフである。
体によるラット好塩基球白血病（ＲＢＬ）細胞及びＣＨ
Ｏ−ＦｃＥＲＩ（キメラαサブユニット）細胞に対する
125Ｉ−ＩｇＥ結合の抑制割合を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジヨン・ハキミ アメリカ合衆国ニユーヨーク州10583スカ ルスデイル・カントリーリツジロード210 (72)発明者 ジヤレマ・ピーター・コーチヤン アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07044 ベローナ・クレストモントロード７
Claims (15)
- 【請求項１】 ヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターのα
サブユニットの少くとも１つのエピトープに特異的に結
合することのできるモノクローナル抗体又はその断片。 - 【請求項２】 請求項１記載のモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマ細胞。 - 【請求項３】 （ａ） ヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプ
ターのαサブユニットに対応する第１のアミノ酸配列又
はその機能的サブ配列、及び上記αサブユニットの細胞
表面発現を可能とするレセプターの膜貫通及び細胞質領
域に対応する第２のアミノ酸配列とを含有してなるポリ
ペプチドをアジュバントと混合して哺乳動物に注射し、
そして免疫応答を生起するように少くとも１回注射を繰
返し； （ｂ） 該哺乳動物から抗体産生細胞を単離し； （ｃ） 該細胞をミエローマ細胞と融合し；そして （ｄ） 得られるハイブリドーマ細胞から所望のモノク
ローナル抗体を産生する細胞を選択することを特徴とす
る、請求項１記載のモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞の製造方法。 - 【請求項４】 請求項３記載の工程（ａ）から（ｄ）
と、対応するハイブリドーマ細胞の上清から所望のモノ
クローナル抗体を単離し、そして所望により、既知方法
によってそれらの断片を製造することからなる工程
（ｅ）とを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗
体又はその断片の製造方法。 - 【請求項５】 （ａ） モノクローナル抗体又は断片と
試料中に存在するαサブユニットとの間で複合体が形成
される条件下で、固相担体に結合されていてもよい該モ
ノクローナル抗体又は断片と試料とを接触せしめ； （ｂ） 該試料から形成された複合体を分離し；そして （ｃ） 該複合体から上記αサブユニットを純粋な形態
で単離することを特徴とするヒト高親和性ＦｃＩｇＥレ
セプターのαサブユニットの精製方法。 - 【請求項６】 （ａ） 生物学的流体であってもよい試
料を、酵素又は放射性或いは蛍光性物質であってもよい
検出可能なマーカーで標識された請求項１記載のモノク
ローナル抗体又はその断片と接触させて、該モノクロー
ナル抗体又は断片と該試料中に存在するαサブユニット
との間で複合体を形成させ；そして （ｂ） 標識された複合体を検出し、それにより試料中
の該αサブユニットの存在を検出することを特徴とする
試料中のヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターのαサブユ
ニットの存在を検出する方法。 - 【請求項７】 （ａ） 試料を、請求項１記載のモノク
ローナル抗体又はその断片と接触させ、該モノクローナ
ル抗体又は断片と該試料中に存在する上記αサブユニッ
トとの間で複合体を形成させ； （ｂ） 得られる試料を、上記モノクローナル抗体又は
断片と結合することのできる検出可能な標識抗体と接触
させ、該検出可能な標識抗体と工程（ａ）の複合体との
間で複合体を形成させ；そして （ｃ） 工程（ｂ）の標識複合体を検出し、それにより
試料中の上記αサブユニットの存在を検出することを特
徴とする試料中のヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターの
αサブユニットの存在を検出する方法。 - 【請求項８】 （ａ） 固相担体に結合した請求項１記
載のモノクローナル抗体又はその断片を、単離されたヒ
ト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターのαサブユニットの既
知量と接触させ、該モノクローナル抗体又は断片と上記
αサブユニットとの間で複合体を形成させ； （ｂ） 工程（ａ）の複合体を試料と接触させ、試料中
のＩｇＥを上記複合体のαサブユニットと結合させて新
しい複合体を形成させ； （ｃ） 工程（ｂ）の新たに形成された複合体を、Ｉｇ
Ｅに結合することができる検出可能な標識抗体の既知量
と接触させ；そして （ｄ） 工程（ｃ）の検出可能な標識抗体の量を測定す
ることにより、該試料中に存在するＩｇＥの量を決定す
ることを特徴とするヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプター
のαサブユニットに結合可能な試料中に存在するＩｇＥ
の量を決定する方法。 - 【請求項９】 請求項１記載のモノクローナル抗体又は
その断片及び所望に応じて非毒性、不活性の治療上許容
される担体材料を含有する薬学的組成物。 - 【請求項１０】 請求項１記載のモノクローナル抗体又
はその断片の治療剤としての使用。 - 【請求項１１】 請求項１記載のモノクローナル抗体又
はその断片のアレルギー疾患の処置のための治療剤とし
ての使用。 - 【請求項１２】 請求項１記載のモノクローナル抗体又
はその断片の診断薬としての使用。 - 【請求項１３】 請求項１記載のモノクローナル抗体又
はその断片のヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターのαサ
ブユニットの精製のための使用。 - 【請求項１４】 請求項３に記載された方法により製造
されたハイブリドーマ細胞。 - 【請求項１５】 請求項４に記載された方法により製造
されたモノクローナル抗体又はその断片。
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| Publication Number | Publication Date |
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|---|---|---|---|
| JP4057508A Pending JPH05252988A (ja) | 1991-02-11 | 1992-02-10 | ヒト高親和性ＦｃＩｇＥレセプターのαサブユニツトと特異的に結合するモノクローナル抗体 |
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| AU (1) | AU652024B2 (ja) |
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| CA (1) | CA2059842A1 (ja) |
| CS (1) | CS39092A3 (ja) |
| FI (1) | FI920565A (ja) |
| HU (1) | HUT63205A (ja) |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003528317A (ja) * | 2000-03-23 | 2003-09-24 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 肥満細胞／好塩基球活性化阻害剤の同定 |
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Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770396A (en) * | 1992-04-16 | 1998-06-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Isolation characterization, and use of the human beta subunit of the high affinity receptor for immunoglobulin E |
| US5714338A (en) * | 1993-12-10 | 1998-02-03 | Genentech, Inc. | Methods for diagnosis of allergy |
| JP2952750B2 (ja) * | 1995-02-23 | 1999-09-27 | 株式会社林原生物化学研究所 | モノクローナル抗体 |
| US7135458B1 (en) | 1995-11-15 | 2006-11-14 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Interferon-γ inducing polypeptide, pharmaceutical composition thereof, monoclonal antibody thereto, and methods of use |
| US6423512B1 (en) | 1996-07-26 | 2002-07-23 | Novartis Ag | Fusion polypeptides |
| AR008077A1 (es) * | 1996-07-26 | 1999-12-09 | Talarico Salinas Laura Beatriz | Un polipeptido de fusion o una sal del mismo, su uso, un proceso para prepararlos, una composicion farmaceutica que los comprende, y un vector. |
| US6299875B1 (en) | 1998-06-04 | 2001-10-09 | Panacea Pharmaceuticals, Llc | Methods to block IGE binding to cell surface receptors of mast cells |
| US7759133B2 (en) | 1998-12-22 | 2010-07-20 | Alk-Abello A/S | Method of detecting and/or quantifying a specific IgE antibody in a liquid sample |
| CA2676843A1 (en) * | 2007-01-29 | 2008-08-07 | Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus | Method for producing novel ige based reagents |
| KR101686395B1 (ko) | 2015-06-22 | 2016-12-15 | 주식회사 선일기연 | Ｐｃｂ용 단자 삽입기의 삽입력 측정장치 |
| CN105352930A (zh) * | 2015-12-01 | 2016-02-24 | 深圳市绿诗源生物技术有限公司 | 基于amf为荧光素标记物的双酚a荧光偏振免疫分析检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0394302A1 (en) * | 1987-12-01 | 1990-10-31 | The President And Fellows Of Harvard College | DNA ENCODING IgE RECEPTOR $g(a)-SUBUNIT OR FRAGMENT THEREOF |
-
1992
- 1992-01-22 CA CA002059842A patent/CA2059842A1/en not_active Abandoned
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- 1992-02-10 IE IE043492A patent/IE920434A1/en unknown
- 1992-02-11 FI FI920565A patent/FI920565A/fi not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0394302A1 (en) * | 1987-12-01 | 1990-10-31 | The President And Fellows Of Harvard College | DNA ENCODING IgE RECEPTOR $g(a)-SUBUNIT OR FRAGMENT THEREOF |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003528317A (ja) * | 2000-03-23 | 2003-09-24 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 肥満細胞／好塩基球活性化阻害剤の同定 |
| US7384633B2 (en) | 2001-07-19 | 2008-06-10 | Judicial Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Res. | Human type antihuman IgE receptor antibody and fragment |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS39092A3 (en) | 1992-09-16 |
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