CS39092A3 - IgE RECEPTOR ANTIBODIES - Google Patents

Description

-1-

Protilátky IgE-receptoru 3W -/1

igblast techniky Předložený vynález je zaměřen na monoklonální proti-látky nebo jejich fragmenty, schopné specifické vazby naalespoň jéden epřtop podjednotky lidského vysoce afinní-ho Pc IgE receptoru, na způsob jejich přípravy a jejich po-užití.

Dosavadní stav techniky

Vysoce afinní Fc receptor pro imunoglohulin Ξ /IgE/,známý jako FcERI, jenacházen na mastocytech a basofilech."křížené obsazení tohoto receptoru IgE antigenem indikujebuněčnou degranulaci a uvolňuje předem vytvořené mediáto-ry jako je histamin a serotonin1/ jLe to uvolnění mediá-torů, co přispívá k alergickému stavu a co také stimuluje;syntézy leukotrienů a faktoru, aktivujícího destičky. rroto FcERI hraje centrální úlohu v alergické odpově-di^. ha kryse se tento receptor- sestává ze tří rozdílnýchpodjednotek: Ig vazebného ζΑ. řetězce, jednoho (h řetězcea dvou Qp řetězců1 “12Λ Předešlé studie: ukáaaly, že vy-soce afinní vazba buněčného povrchu je závislá na expresitěchto tří podjednotek12*1^. V lidském systému musí býtpřítomny pro vysoce afinní vazbu buněčného povrchu alespoň a qyx podjednotky15’,6//. Funkční přispění přítomnostia''nebo. podjednotek je; neznámé.

Komplementární DNA klony, kódující krysí ^,9’10//, p) a /k 12//f podjednotky pro myší cS , f/ a podjednotky a pro lidské ^1O’U/ a 15/poďjednotky, byly izolovány.

Transfekce cDNA, kódující lidskou a krysí nebo lidskou

něžných liniích'ke schopnosti vazby lidského IgE s vysokouafinitou. cDNA určuje proteiny se signálním peptidem. o 23 /kry-sa a myš/, nebo 25 /člověk/ aminokyselinách, extracelu-lární doménu o 180-181 aminokyselinách, transmembránovoudoménu o 20-21. aminokyselinách a cytoplasmatickou doménuo 22 /krysa/, 25 /myš/ nebo 33 /člověk/ aminokyselinách·

s jinými členy velké rodiny imunoglobulinů, sekvence pro lidskou podjednotku určuje dvě disulfidicky vázané smyčky, které obsahují aminokyselinové sekvence 51-93 a

Předešlé zprávy popisovaly rozvoj a charakterizacimonoklonálních protilátek, specifických pro vysoce afinitníimunoglobulinové receptory, například krysí FcERI recep-tor35~37/ a lidský FcERI receptor^/. ^avíc jedna zprávapopisovala izolaci monoklonálních protilátek, které reagu-jí s lidskými basofily^®/. Protože vazba monoklonální pro-tilátky k lidským basofilům byla blokována lidským IgE,nemůže být vyloučeno, že tato protilátka může rozpoznatvysoce afinní FcIgE receptor^ . Nicméně, reference^ ne-popisuje, že se tato monoklonální protilátka váže na něja-kou podjednotku tohoto receptoru. áž do této doby se věřilo, že pro povrchovou expresije nezbytné mít podjednotku lidského FcERI spojenou s -3- dalšími pod jednotkami f'cERI . Nicméně xiakimi a spol./J.Biol.Chem. 265, 22079-22081 /1990// ukázali, že modifiko-vání podjednotky ke konstrukci hybridního genu, inkor-porujícího cytoplasmatickou nebo jak cytoplasmatickou taktransmembránovou oblast jiných receptorů pro umožnění ex-prese podjednotky na buněčném povrchu /jako je IL-2receptor, nízko afinní IgE receptor /CD23/, myší erythro-poetinový receptor, lidský IgG Fc receptor FcGRII atd./vedlo k povrchové expresi <Á podjednotky, která bude takévázat IgE s vysokou afinitou a dovoluje stabilní expresitéto aktivity v permanetne transfektováných eukaryotic-kých buňkách.

Monoklonální protilátka podle předloženého vynálezu v je schopná specifické vazby na alespoň jeden epitop ^pod-jednot y na lidském vysoko afinitním Fc IgE receptoru? /FcERI/Poskytuje účinné analytické, diagnostické a terapeutickéčinidlo pro imunoafinitni čištění přírodní a rekombinant-ní JL -podjednotky lidského FcERI /” -poďjednotka”/ vý-voje imuno zkoušek, identifikaci aktivní Tíh míst X -podjed-notky a poskytuje terapeutické ošetření pro alergické cho-roby /užitím ^ab fragmentu nebo derivátů k blokování vaz-by IgE na buněčné FcERI receptory na lidských basofilech amestocytech/. “kmoklonální protilátky, které rozpoznávajírozdílné epitopy na lidské Λ -podjednotce jsou užitečnéjako reagens v citlivé dvoumístné imunozkoušce? k měřeníhladiny ‘X -podjednotky v biologických roztocích a z buněč-ných extraktů.

Monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu, kteréjsou schopny specifického navázání na alespoň jeden epi-top -podjednotky lidského vysoce afinního IgE receptorumohou být charakterizovány například indukováním uvolněníhistaminu z lidských basofilů, imunoprecipitací radioaktivně -4- značené -podjednotky a/nebo blokováním TgE vazby narekombinantní a přirozenou -podjednotku.

Tyto monoklonální protilátky mohou být použity jakoafinitní reagens pro čištění přirozené nebo rekombinantnílidské ^podjednotky, jako reagens pro enzymatické imuno-zkoušky a rádioimunozkousky k měření přirozené a rekom-binantní -podjednotky v biologických roztocích, na plas-matických membránách lidských buněk jako reagens pro lé-kové screeningové zkoušky, jako reagens k vytvoření cit-livé dvoumístné imunozkousky k měření -podjednotky vbiologických roztocích a lidských buněčných extraktech, ja-ko reagens v konjunkci s rekombinantní -podjednotkou v citlivých záchytných imunozkouškách k měření hladiny IgEv biologických roztocích a buněčných extraktech, jakoreagens k identifikaci míst -podjednotky, která se účastnívazby IdE a ve formě Fab fragmentů /inhibičních monoklo-nálnícn protilátek/ jako terapeutického léčiva pro léčbu

IgE indukovaných alergických chorob. "Monoklonální protilátky/ jak je tento výraz použit v před-kládaném vynálezu, zahrnují fragmenty se stejnou specifi-tou jako jsou bivalentní a monovalentní Fab fragmenty. Jakje v oboru dobře známo, takové fragmenty mohou být genero-vány proteolyticky štěpením imunoglobulinové molekuly. Na-příklad, štěpením papainem se získají dva monovalentní Fabfragmenty, zatímco štěpením pepsinem jeden bivalentní Fabfragment. Ayto' fragmenty mohou být screenovány na recepto-rovou vazebnou aktivitu konvenčními metodami jako jsou me-tody zde popsané pro screening celé monoklonální proti-látky. Příklady jsou imunoprecipitace, Western blo.tting,inhibice vazby a jiné zkoušky popsané například v příkladu 3. -5- iionoklonální protilátky podle předloženého vynálezumohou být lidské nebo nelidské savčí, pocházející z kry-sy, myši a králíka. Tyto protilátky mohou být IgJl, IgMa igG subtypů, zejména IgG subtypů. ^etody pro produkcitakových protilátek jsou v oboru dobře známé a uvedenév příkladech. Předkládaný vynález vytváří použití chimérické -podjednotky, která je exprimována na povrchu hostitelskébuňky nezávisle na dalších podjednotkách ^cERI. -^roto před-kládaný vynález zahrnuje monoklonální protilátky, kteréjsou schopné vázat se na jeden nebo více epitopů chimé-rické -podjednotky exprimované na povrchu hostitelskébuňky, jako je například COS buňka nebo CHO buňka a takéna izolovanou chimérickou -podjednotku. Chimérická -podjednotky je hybridní polypeptid složený z funkční ami-nokyselinové sekvence X -podjednotky a transmembránovéa cytiplasmatické aminokyselinové sekvence jiných recep-torů jako je IL-2 receptor /popsaný zde na jiném místě/. Předkládaný vynález je také zaměřen, na monoklonálníprotilátky, které jsou schopny vazby na -podjednotku, exprimovanou na povrchu mastocytů nebo basofilů, zejménalidských mastocytů nebo basofilů. IgE, bivalentní imuno-globulin, se váže na svůj receptor na buněčném povrchu/FcERI/ svou Fc částí, nebo kmen. Každé z jeho Fab "ramen’*,je navázáno na antigen a dvě IgE molekuly mohou být spo-lečně navázány na antigenu, každá IgE molekula je navázánajedním "raménkem" na stejný antigen. Toto způsobuje vazbureceptorů na IgE molekuly a jejich agregování na buněčnémpovrchu. Agregace receptorů stimuluje buňky k degranulaci auvolnění histaminu. 'To je proces, který přispívá k alergickéodpovědi. -6-

Tyto protilátky se mohou vázat na epitop v nebo blízkomísta IgE vazby a tak blokovat IgE vazbu. xríkladem takovéprotilátky je protilátka 15-A5. Protilátky mohou samy způ-sobovat agregaci· receptorů obsazením jednoho receptorukaždým Fab "raménkem" a stimulovat uvolnění histaminu. Totose stane, jestliže budou použity celé imunoglobuliny nebobivalentní Pab fragmenty. *yto protilátky jsou zejména uži-tečné pro zkoušky a čištěni. Monovalentní protilátka, tj.monovalentní Fab fragment, který blokuje- IgE vazbu a nezpů-sobuje agregaci., protože má pouze jedno vazebné místo a pro-to nemůže vázat více než jeden receptor, je využitelný te-rapeuticky, protože může zabránit IgE indukovanému uvolně-ní histaminu bez vlastní indukce uvolnění histaminu. xakéjsou zde popsány monoklonální protilátky, které se vážouna epitop 0^ -podjednotky, který není na nebo blízkoIgE vazebného místa, například monoklonální protilátka 1134»Takové protilátky neblokují IgE vazbu a indukují uvolněníhistaminu. Ke zjištění, zda monoklonální protilátka blo-kuje? IgE vazbu, může být provedena kompetiční zkouška uži-tím radioaktivně značeného IgE metodami známými v oboru, keznázornění, jestli protilátka redukuje. IgE vazbu na -podjednotku. Chimérická pQ -podjednotka nebo hostitelskoubuňkou exprimovaná chimérická pí. -podjednotka /dfliě zde popsa-né/, jsou zejména využitelné k poskytnutí vazebných místpro zkoušku.

Monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezumohou být charakterizovány například, rozdělením do dvouhlavních kategorií: 1/ protilátky, blokující vazbu radio-aktivně značených IgE na ^cERI nosičové buňky /in- hibiční třída/ a 2/ ty, které neblokují tuto interakci liganďreceptor /neinhibiční třída/♦ -7-

Sxtracelulární doména lidské 3Č -podjednotky obsahuje. 7 potenciálních N-vázaných glykosylačních míst^’^/. Na-tivní (A-podjednotka a rekombinantní chimérická -podjed-notka, exprimované v CHO buňkách, mají zjevnou molekulovouhmotnost přibližně 50 kD /2,3/ a přibližně 45 kD , zatímco předpokládaná molekulová hmotnost z jejich cDN4 je 26 kD ’17/ a 24 kD f 'lak se zdá, že většina ze sedmi N-připojenýchglykosylačních míst je využita ve zrání proteinů. Odstra-nění N-vázaných karbohydrátů chimérické (A -podjednotkyN-glykanázovým štěpením vede k posunu molekulární hmotnos-ti z přibližně 45 kD na 25 kD. 25 kD protein je rozpoznánmonoklonální protilátkou podle předkládaného vynálezu roz-poznáním polypeptidového jádra -podjednotky.

Obě třídy protilátek se váží na chimérickou A -pod-jednotku s afinitou, která je téměř stejná nebo větší nežafinita IgE k <A -podjednotce. lato data ukazují, že rozdílmezi dvěma třídami protilátek není vztažen na afinitu, alena epitop vazby každé protilátky. Pět odlišných epitopů vextracelulární oblasti -podjednotky lidského EcERIreceptoru bylo identifikováno monoklonální protilátkou podlepředkládaného vynálezu, dva inhibiění a tři neinhibičníepitopy k identifikaci epitopů rozpoznaných protilátkamipodle předkládaného vynálezu, byla každá protilátka testo-vána v EIA se syntetickými peotidy, odpovídajícími sekven-ci A-podjednotky. Jeden inhibiění epitop /sekvence 125-140/byl identifikován protilátkou 1545 a jeden, neinhibiční epi-top /sekvence 43-58/ byl identifikován protilátkami 1134 a22E7. Epitopy dalších inhibičních a neinhibiěních protilá-tek byly pak charakterizovány v radioreceptorové kompetič-ní zkoušce: použitím radioznačené 1545 a 22E7.

Všechny inhibiění protilátky se váží s nebo alespoňstéricky blízko 125 až 140 sekvence, protože všechny soutěžíse 12^1-15 45 o vazbu na chimérickou c/,-podjednotku. IgE -8- 1 25 také soutěží se 3 i-15^5 o va,bu ns chimérickou -pod- jednotku, což potvrzuje;, že IgE a 15^5 se váží na překrý-vající doméjy na receptoru, ale ne na identické domény,^ouze jedna inhibiční protilátka, 434, blokuje vazby jak na lidskou tak krysí -do d jednotku a blokuje1 i pc 31-1 5Λ5 vazbu na lidskou -podjednotku. Tato data indi-kují, že 4B4 epitop se překrývá, ale není identický se125-140 epitopem protilátky 1 5-A5.

Dvacet dva neinhibičních protilátek úplně inhibuje^^I-značenou 22E7 ve vazbě na chimérickou -podjednotkucož indikuje, že nejmSue se váže? v nebo stéricky blízko43-58 sekvence chimérické -podjednotky. Tři neinhibičníprotilátky, neinhibující radioaktivně značenou 22E7, váza-jící se na chimérickou <£* -podjednotku indikují, žetyto protilátky se váží na odlišný epitop na proteinu. Jednneinhibiční protilátka 29C6 blokuje jak 125I-22E7 a 125I-1545 vazby na chimérickou -podjednotku. IC^q pro 29C6inhibici 12^I-22E7 a 12^I-15Jí5 vazby na -podjednotkuje 0,18 /Ug/ml a >120 ^ug/ml.

Hybridomy, které produkují monoklonální protilátkypředkládaného vynálezu, jsou popsány v tomto vynálezu, zqna hybridomy, které jsou popsány v příkladech. Generováníhybridomů je metodou v oboru dobře známou a také popsanouv příkladech. é-

Stručně, ve standardní metodě je nějaké zvíře jako myš,krysa nebo králík, imunizováno antigenem, zejména pol.ypep-tidem, obsahujícím alespoň jeden epitop -podjednotky,například celou -podjednotku. samotnou nebo ve forměchimérické -podjednotky, jak je zde popsáno. B-buňkyjsou pak izolovány ze zvířat, testovány na specifitu a fu- 9- zovány s nesmrtelnými buňkami m.yelomů k vytvoření hybrido-mů. Kybridomové buňky jsou rozředěny a jednotlivé buňkyjsou rovnoměrně rozděleny do nádržek /jako jsou jamky'vmikrotitrační destičce/. Monoklonální protilátky produko-vané klony jednotlivých hybridomů jsou také screenovány naspecifitu. Kybridomy, produkující protilátky požadovanéspecifity, mohou být také produkovány, rekombinantnímiDNA metodami, Monoklonální protilátky lidského původu mo-hou být produkovány·rekombinantní metodou nebo mohou býtprodukovány exponováním lidských lymfatických buněk vkultuře oC -podjednotce k indukování protilátkové produkce*?o 3-5 dnech jsou protilátky, produkující buňky fúzoványs myelomovými buňkami a selekce anti- podjednotkových pro-tilátek je provedena jak je popsáno výše.

Jakékoliv konvenční screeningové metody mohou být po-užity ke screenování monoklonálních protilátek podle před-loženého vynálezu nebo jejich fragmentů, např. ty, kteréjsou uvedeny v příkladu 3, částech c, e, f, j, k, 1 a m.Jedna taková metoda užívá buňky zde popsané, které exprimu-jí chimérickou -podjednotku na svém povrchu, “apříklaď, monoklonální protilátky mohou být fluorescenčně označeny v _ a pak přidány na sklíčko, obsahující tyto buňky. Jestližeje sklíčko prohlíženo pod fluorescenčním mikroskopem, budou v protilítky mající popsanou specifitu navázány na buňky avizuálně detegovány. Jinou metodou je imunoprecipitace.Izolovaná podjedhotka zde popsaná, je detegovatelně ozna-čena metodami v oboru dobře známými. Protilátky s požadova-nou specifitou se budou vázat na značenou -podjednotku, aby vytviřily komplex. Komplex může být izolován přidáním,protilátek navázaných na pevný nosič, které vážou protilátkynavázané na -podjednotku. 10- ^xprimované celé protilátky, jejich domény, jednot-livé lehké a těžké řetězce nebo jiné formy imunoglobulinůpodle předloženého vynálezu mohou být čištěny v souladuse standardními postupy v oboru, které zahrnují sráženísíranem amonným, afinitní sloupcovou, sloupcovou chroma-tografii, gelovou elektroforé2u a podobně /viz např. Sco-pes R., Protein Purification, Springer-^erlag, Ν.Ϊ. 1982//.V podstatě čisté imunoglobuliny homogenity alespoň 90 až95 % jsou preferovány, zejména 98 - 99% nebo vyšší homoge-nity, pro farmaceutické využití. Jednou čištěné polypep-tidy, částečně nebo do požadované homogenity, mohou býtvyužity terapeuticky /včetně mimotělního užití/ nebo vevývoji a provedení zkouškových procedur, imunofluorescent-ních vybarvení a podobně /viz např. Immunological Methods,sv.l a II, Lefkovits a Pernis vyd·, Academie Press, Newxork, NY /1979 a 1981//.

Metody pro produkci monoklonálních protilátek schop-ných vazby ha jeden nebo více epitopů ^-podjednotky lid- ského vysoce afinního IgE receptoru, nebo chimérické i(-podjednotky, znamenají izolaci takových protilátek z mediavýše posaných hybridomů· Protilátky mohou být také izolo-vány přímo z imunizovaných zvířat použitím sereeningové me-tody výše popsané.

Vynález popisuje metody pro detekci v, nebo čištěníol-podjednotky ze vzorku, jako je vzorek biologického roztoku, obsahujícího volnou -podjednotku, nebo vzorek,obsahující buňky aóiebo na membránu vázanou gC-podjednotkuMonoklonální protilátka, schopná specifické vazby na něja-ký epitop nebo epitopy -podjednotky lidského vysoceafinního IgE receptoru, zejména na epitop nebo epitopy chi-mérické -podjednotky, j* uvedena do kontaktu se vzorkemza podmínek v oboru dobře známých tak, že se monoklonálníprotilátka naváže na ^-podjednotku vzorku. Monoklonální -1 1- protilátkp 'muže být rozpuštěná nebo navázaná na pevný no-siči jako je kolona nebo plotna nebo membrána /jejich pří-klady jsou zde uvedeny/· ue-li navázána na pevný nosiči,může být -podjednotka vymývána a čištěna metodami zná-mými v oboru. V roztoku může být značená monoklonální pro-tilátka detegována prostředky vhodnými pro užité značeník indikaci přítomnosti -podjednotky ve vzorku, ^iná detekční metoda využívá neznačené monoklonální protilátkyk vazbě na -podjednotku ve vzorku, který je pak uve-den. do kontaktu se značenou protilátkou, která se vážena neznačenou protilátku. V oboj£u metodách může být množstvíznačené protilátky, jestliže je známo, použito ke kvanti-fikaci množství -podjednotky ve vzorku. Značení je dob-ře známé v oboru· Vhodná značení mohou být radioaktivníjako je I, fluorescentní, biotonové nebo enzymatické,jako je peroxidázové. Příklady značení jsou známé v oborua uvedené například v příkladech. Předkládaný vynález zahrnuje metody k detekci a kvan-tifikaci IgE přítomného ve vzorku, který je schopný vazbyna (^-podjednotku. Monoklonální protilátka schopná speci-fické vazby na A,-podjednotku, je připojena na pevný nosič;/jako jsou perličky pro použití v afinitních kolonách nebona povrchu mikrotitračních ploten, nebo jiných nosičíchznámých v oboru/ a uvedena do kontaktu se známým množstvím 4, -podjednotky /získání a kvantifikace < -podjednotkyje popsáno jinde/. Monoklonální protilátka se váže na ρζ -podjednotku a vytváří komplex, který je navázán na pevnýnosič. Tento komplex je kontaktován se vzorkem. Ve vzorkuse bude vázat na <i( -podjednotku aktivní. IgE, ale ne dena-turovaný nebo inaktivní IgE. Množství IgE přítomné ve vzorkumůže být pak kvantifikováno kontaktováním komplexu detego-vatelnou značenou protilátkou schopnou vazby IgE a měřenímmnožství značení. Ťechniky pro produkci monoklonálnich -12- protilátek s vybranými specifikami jako. jsou anti-IgEprotilátky, jsou dobře známé v oboru, ^aké jsou anti-IgEprotilátky snadno získatelné z biologických materiálů.•Ačkoliv IgE může být detegován ve zkouše a užitím pouze antiIgE protilátky, není taková zkouška schopna diskriminacemezi aktivním a inaktivním IgE, tj. být schopným neboneschopným vazby na -podjednotku. Zkouška užitím «τ\ -podjednotky může být užita za tímto účelem a je také pro-myšlena v tomto vynálezu. Předkládaný vynález zahrnuje farmaceutické kompozice,obsahující monovalentní Pab fragment, který je schopný vá-zat se specificky na epitop nebo epitopy -podjednotkylidského vysoce afinního IgE receptoru tak, že vazba IgEje inhibována. Protilátka tohoto vynálezu může být při-pojena na toxin jako je difterický nebo pseudomonázovýtoxin a užita k selektivní eliminaci receptor nesoucíchbuněk·

Protilátky a farmaceutické kompozice podle předkláda-ného vynálezu jsou zejména užitečné pro parenterální po-dání, tj. subkutánně, intramuskulárně nebo intravenozně.Kompozice pro parenterální podání budou běžně obsahovatroztok, protilátky nebo jejich směs rozpuštěnou v přijatel-ném nosiči, výhodně ve vodném nosiči, ^arianty vodných no-sičů mohou být použity - jako je např. voda, pufrovanávoda, 0,4% salinický roztok, 0,3% glycin a tak podobně,tyto roztoky jsou sterilní a obvykle prosté dalších látek.Tyto kompozice mohou být sterilizovány konvenčními, dobře známými sterilizačními technikami. xyto kompozice mohou .1. obsahovat farmaceuticky akceptovatelné pomocné substance,jako jsou látky,které jsou žádoucí pro přiblížení se fyzio-logickým podmínkám, jako je pH upravující a pufrovací či-nidlo, Činidlo upravující toxicitu a tak podobně', například — 13- octan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápe-natý, laktát sodný atd.. Koncentra ce protilátky v těchtopřípravcích může být velmi široká, tj. nejméně 0,5 %, obvyklev neoo alespoň. 1 % do nejvíce 15 nebo 20 % hmotnosti a budevolena zejména vzhledem k objemu roztoku, viskozitě atd.,v souladu s jednotlivým vybraným způsobem podání. typická farmaceutická kompozice pro intramuskulárníinjekci se bude sestávat z 1 ml sterilní pufrové vody a50 mg protilátky. Obvyklá kompozice pro intravenozní podá-ní se bude sestávat z 250 ml sterilního Ringerova roztokua 150 mg protilátky. Používané metody pro přípravu parente-rálně podávaných kompozic, budou známé nebo zřejmé odborní-kům: a jsou popsány detailněji např. v Remington*s Pharma-ceutical Science, 15«vyd., Mack Publishing Company, Raston,^ennsylvania /1980/.

Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou býtlyofilizovány pro uskladnění a rekonstituovány před použi-tím na vhodném nosiči, ‘^ato technika se ukázala být efek-tivní s běžnými imunoglobuliny a byly použity lyofilizačnía rekonstituční techniky známé v oboru. Odborníci uznávají,že lyofilizace a rekonstituce může vést k různému stupni,snížení protilátkové aktivity /tj. u konvenčních imunoglo-bulinů, IgM protilátky mají sklon k většímu snížení aktivitynež IgG protilátky/ a že použité hladiny mohou být kvůlikompenzaci upraveny.

Kompozice, obsahující Pab fragmenty předkládané mono-klonální protilátky nebo jejich směs, mohou být podány proprofylaktické a/nebo terapeutické ošetření. V terapeutickéaplikaci jsou kompozice podané pacientovi, který již trpíalergickou odezvou, v množství dostatečném, k vyléčení neboalespoň Částečnému utlumení choroby a jejich komplikací.Množství schopné toto způsobit je definováno jako "terapeu- -14- ticky účinná dávka". Množství účinné pro toto použití bude2áviset na velikosti alergické odpovědi, ale obvykle budev rozmezí od 1 do 200 mg protilátky na dávku. V profylaktické aplikaci, kompozice: obsahující před-kládané protilátky nebo jejici směs, jsou podány pacientovikterý ještě není v chorobném stavu, v množství dostačujícímk blokování IgE z pacientových vlastních basofilů. ^akovémnožství je definováno jako "profylakticky účinná dávka". tomto použití přesné množství znovu závisí na pacientovězfiravotním stavu a celkové hladině cirkulace antigen. spe-cifických IgE, od Oj do 25 mg na dávku.

Produkce jednoho z možných antigenů, které mohou býtpoužity v provedení předloženého vynálezu, zejména chimé-rické -podjednotky, znamená množství kroků, které za-hrnují přípravu genů, kódujících hybridní genové sekvence,inzerci těchto genů do vhodného klonovacího prostředku proprodukci rekombinantního vektoru, obsahujícího hybridnígenovou sekvenci, transfer'rekombinantního klonovacího pro-středku do kompatibilního hostitelského organismu, selek-ci a kultivaci takto modifikovaných hostitelů, kteří mohouexprimovat inzertované genové sekvence a identifikaci apurifikaci genového produktu. Příprava genu, kódujícího chimérickou -podjednotku je provedena nejprve izolací vhodné části FcERI pod- jednotky a cytoplasmatické nebo cytoplasmatické a trans-membránové oblasti IL-2 receptoru.

Nukleotidová sekvence lidské < podjednotky je pub-likována v Nucleic A:id Research, svý 16/8/: 3584 /1988/.Nukleotidová sekvence lidského p55 IL-2 receptoru je pub-likována v Nátuře, 311: 631 /1984/ a cytoplasmatické a trans -15- membránové oblasti IL-2 receptoru zahrnují přibližně nukleo-tidy 890 až 1030. Nukleotidová sekvence podjednotky můžebýt získána z různých zdrojů jako jsou lidské basifily,mastocyty nebo Ku812 buněčná linie /Kishi, Leukemia Research,9, 381 /1985//. Nukleotidová sekvence IL-2 receptoru můžebýt také získána z různých zdrojů jako jsou lidské T buňky,T-buněčné linie nebo lymfocyty periferní krve. Výhodně pro použití podle předloženého vynálezu obsahujehybridní gen nukleotidové sekvence 121-710 lidské -pod-jednotky, ke kterým byly fúzovány nukleotidy 876-1016 IL-2receptoru·. Toto vede k hybridnímu genu následující nukleo-tidové sekvence.:

TACTAAGAGTCTCCAGCATCCTCCACCTGTCTACCACCGAGCATGGGCCTATATTTGAAGCCTTAGATCTCTCCAGCACAGTAAGCACCAGGAGTCCAT GAAGAAG ATG GCT CCT GCC AGG

ATC CTC CCT ACT CTA CTG TGT GTA GCC TTA CTG TTC TTC GCT CCA GAT GGC GTG TTA GCA GTC CCT CAG AAA CCT AAG GTC TCC TTG AAC CCT CCA TGG AAT AGA ΑΤΑ TTT AAA GGA GAG AAT GTG ACT CTT ACA TGT AAT GGG AAC AAT TTC TTT GAA GTC AGT TCC ACC AAA TGG TTC CAC AAT GGC AGC CTT TCA GAA GAG ACA AAT TCA AGT TTG AAT ATT GTG AAT GCC AAA TTT GAA GAC AGT GGA GAA TAC AAA TGT CAG CAC CAA CAA GTT AAT GAG AGT GAA CCT GTG TAC CTG GAA GTC TTC AGT GAC TGG CTG CTC CTT CAG GCC TCT GCT GAG GTG GTG ATG GAG GGC CAG CCC CTC TTC CTC AGG TGC CAT GGT TGG AGG AAC TGG GAT GTG TAC AAG GTG ATC TAT TAT AAG GAT GGT GAA GCT CTC AAG TAC TGG TAT GAG AAC CAC AAC ATC TCC ATT ACA AAT GCC ACA GTT GAA GAC AGT GGA ACC TAC TAC TGT ACG GGC AAA GTG TGG CAG CTG GAC TAT GAG TCT GAG CCC CTC AAC ATT ACT GTA ATA AAA GCT CCG CGT GAG AAG T ACC AGG TAG CAG TGG CCG GCT GUG TTT TCC TGC TGA TCA GCG TCC TCC TCC TGA GTG GGC TCA CCT GGC AGC GGA GAC AGA GTA AGA GTA GAA CAA TAT TCT AGA AAA CCA AAA GAA CAA GAA TTT CTT GGT AAG AAG CCG -16-

Nicméně při konstrukci hybridního genu bylo zjištěno,že různé restrikční endonukleázy budou štěpit každounukleotidovou sekvenci v různém místě, což může dále véstk hybridním genům, které nemají výše popsanou exaktnísekvenci, ^ak dlouho, pokud hybridní gen obsahuje alespoňnnkleotidovou sekvenci, která kóduje funkční polypeptido-vou subsekvenci -podjednotky /která je jakoukoliv sub-sekvencí, která bude vázat IgE/ jakož i jakoukoliv funkčnísubsekvenci odpovídající cytoplasmatické nebo cytoplasma-tické a transmembránové oblasti IL-2 receptoru, může býtpoužit pro účely předloženého vynálezu. Navíc cytoplas-matické nebo transmembránové oblasti jakéhokoliv jinéhoreceptoru nebo transmembránového proteinu jejichž sekvencemohou být přidány k funkční polypeptidové podsekvenci -podjednotky s následující funkční expresí na buněčném po-vrchu, jsou vhodné. Příklady takových sekvencí jsou uvedenydále.. V každém případě by měla být možná fúze IgE vazeb-ných domén X lidské -podjednotkjr k transmembránovým. a cytoplasmátickým doménám následujících, proteinů /pozn.v každém příkladu jednotlivá podjednotka obohacuje buněč-ný povrch za nepřítomnosti jakékoliv jiné podjednotky/:nízkoafinitní IgE receptor nebo CD23 /Kikutani a spol.,Cell, 47, 657 /1986//, myší erythropoietinový receptor/D*Aidrea a spol., Cell, 57, 277 /1989//, lidský IgG Pcreceptor, Pc GRII /Stuart a spol. ,· J.Expt.Med., 1968 /1987/receptor lidského polyiviru Aendelsohn a spol., Cell, 56,855 /1989/, Lidský CD4 receptor /Madden a spol., Cell, 42,93 /1985//, lidský PDBP receptor /Yarden a spol., Nátuře,323, 226 /1986//, lidský vysoce afinní IgG Pc receptor/Science, 243, 378//, receptor lidského interferonu /4gueta spol., Cell, 55, 273//, rceptor lidského interleukinu-1/Sims: a spol., Science, 241, 585// nebo CD19 diferenciačníantigen /Stamenkovic a Seed, J.Expt.Med., 168, 120.5//* -17-

Menší oblasti -podjednotky, které vážou IgE a ještěobsahují epiton, který je rozpoznáván protilátkami podle-předloženého vynálezu mohou být systematicky determinoványpostupným odštěpováním 3 nukleotidů najednou bučí z 5* nebo3* konce. Nejkratší nukleotidová sekvence, která je schopnakodovat IgE vázající podjednotku polypeptidu, bude defino-vána jako miminální jednotka pro funkční protein. V hyb-ridním genu může být část přírodní nukleotidové sekvence rý\-podjednotky substituována pro umožnění restrikčníendonukleáze zvolit "střih" nukleotidové sekvence v požado-vaném místě. BamHI místo může být vytvořeno v polohách 119—126 substitucí přírodní#^ lidské o( -podjednotky následu-jícím způsobeqt:

107 110 113 113 1 19 122 125 128 131 134přírodní AEG GCT GCT GCC ATG GAA TCC CCT A2T CTA

modifikovaný G AEC CT 8am HI místo vytvořeno

Lidská 4 -podjednotka může být modifikována pro vytvoření EcoRV místa restrikční endonukleázy v polohách 878-890následovně:

866 869 872 875 878. 881; . 884 887 890 893 896přírodní CCC AAA AA3 AAC TC-A TAE AAE TA3 TCA A3A ΑΑΓmodifikovaný CGGr AT C

EcoRV místo vytvořeno -18- ^akékoliv malé substituce v sekvenci přírodní pod-jednotky nebo IL-2-receptoru pro usnadnění požadovanéhoštěpení restrikční endonukleázou mohou být připraveny me-todami známými v oboru* Po izolaci vhodných nukleotido-vých sekvencí obou podjednotek mohou být tyto spojeny vhod-nou ligázou. 1 když pro syntézu hybridního genu byla po-užita technologie rekombinantní DNA, je také možné jejsyntetizovat chemickou metodou} takové syntetické metodyjsou v oboru známé.

Když byl hybridní gen zkonstruován, může být zavedendo jakéhokoliv- běžného expresního vektoru, fágu nebo plas-midu jakýmkoliv způsobem v oboru známým /viz například,v Daboratory ^anual, Sambrook a spol., “Molecular Cloning”,Cold Spring Harbor Daboratory, /1989//.

Obecné metody pro přípravu takových molekul rekombi-nantní DNA jsou také v oboru známé /viz např. US patentč. 4237224 a US patent č. 4304863/. “"etody pro expresi DNA sekvencí, které kódují hybrid-ní proteiny, použité pro účel tohoto vynálezu zahrnujítransformaci vhodného hostitele rekombinantním vektorem,majícím uvedenou DNA sekvenci operativně připojenou k ex-presi řídící sekvenci vektoru, kultivaci hostitele za vhod-ných podmínek růstu a extrakci a izolaci požadovaného hyb-ridního proteinu z kultury. udborník může zvolit z těch-to známých metod ty, které jsou nejúčinnější pro expresijednotlivého genu a výběr jednotlivého hostitele pro po-užití v tomto vynálezu je závislý na množství faktorů, kte-ré odborník zná. '^yto například zahrnují, kompatibilituse zvoleným expresním vektorem, toxicitu proteinů kódu-jících hybridní plasmiď, získávání požadovaného proteinu, -1 α- charaktéřištiky exprese, biologickou bezpečnost a nákla-dy . COS buňkv jsou výhodnými hostiteli oro účely předlo-ženého vynálezu. COS buňky jsou buňky buněčné linie ledvinafrické opice /Afričan green monke.y/ transformované ori-ginálním minus SV40 virálním genomem a jsou dostupné odATCC pod ukládacím číslem č. CHL 1651. Tato buněčná liniebvla popsána Gluzmanen a spol., /Cell 2j, 175 /1981//. CHO buňky jsou také vhodné a dostupné. Alternativní meto-dy pro amplifikaci genu použitelné pro jakoukoliv buněč-nou linii zahrnují použití amplifikačního selekčního sys-tému adenosin-deamináza nebo dihydrofolát reduktáza nega-tivního /dhfr/ genového amplifikačního systému, ^nohéz prokaryotických a eukarydJtick.ých systémů jsou vhodnýmihostiteli pro expresi připravované extracytoplasmatickéoblasti pod jednotky /zbytky 26-201/.

Hybridní oolvoeptid oraktickv použitý podle předlo-ženého vynálezu může mít aminokyselinovou sekvenci: MET Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val

Ala Leu Leu Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Val Pro Gin Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gin His Gin Gin Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gin Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gin Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gin Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Gin Val Ala Val Ala Gly Lys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr Trp Gin Arg Arg Gin Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile -20-

Hybridní protein pro účely předloženého vynálezu mů- že být syntetizován za použití metod v pevné fázi Merri- fielda, Journal of American Chemical Society, 85, 2149 /196 3/

Hybridní proteiny mohou být produkovány rekombinant-ními metodami inzercí sekvence hybridního genu do vhod-ného rekombinantního vektoru a transformací hostitele jakpopisuje Juller, Methods in Enzymology 152, 684-704 /1987/.Transformant pak roste za vhodných kultivačních podmíneka poskytne odpovídající hybridní polypeptidy. Dále je detailněji popsána příprava chimérické <s<podjednotky, která může být použita např. jako antigen propřípravu protilátek podle předloženého vynálezu.

Nukleotidová sekvence podjednotky FcERI může býtmodifikována v polohách 119-126 a 884-890 následovně s vy-užitím místaě řízené mutageneze /Morinaga a spol., Bio Tech2, 636/1984//. pLJ663, obsahující lidskou podjednotku cDN/I197bp podjednotka cDNA ligovaná do EcoHI místa pGem-4/^romega/: Kochan a spol./ 10 /ug může být štěpena při 37 0|restrikčními enzymy BglII /30 jednotek/ a Sty I /30 jedno-tek/ v konečném objemu 100 mikrolitrů v pufru, obsahujícím150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 8,0, 6 mM MgCl^ a 6 mM 2-mer-kaptoethanolu. Tyto štěpí fragmenty pLJ663 do 2 fragmentů,odpovídajícím délkám asi 437bp a 3760 bp. 3760 fragmentje izolován elektroforézou na agarozovém gelu a je označovánjako "gappeď* molekula. pLJ663, 10 /Ug je štěpen separátně restrikčním enzymemPvul /30 jednotek/ při 37 °C v konečném objemu 180 mikro-litrů v pufru, obsahujícím. 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH*6,0, 6 mM MgCl^ a 6 mM 2-merkaptoethanolu. Toto štěpení ome· -21- zuje pLJ663 a generuje lineární fragment přibližně 4197 bp.Tento lineární fragment je izolován elektrofořežou naagarozovém gelu a je označen jako lineární molekula.

Oligonukleotid uvedený výše /50 pmol/ je fosforylo-ván na svém 5*konci za použití polynukleotidové kinázy /5jednotek/ v prvním objemu 20 mikrolitrů ve směsi, obsa-hující 1 mM ΑΓΡ, 50 mM Tris-HCl p76, 10 mM MgCl^, 5 mMDTT, 0,1 mM spermidinu, 0,1 mM EDTA po re akční dobu 30minut, při 37 °0 a dále 5 minut při 70 °C a potom se vložína led. Místně specifické mutanty mohou být generovány násle-dujícím způsobem: směs se připraví tak, že obsahuje 100 mgkaždé z mezerovítých /gapp.ed/ a lineárních molekul a 12,5pmol 5 *f o sf o rylo váného oligonukleotidu, v konečném objemu 12,5 mikrolitrů v pufru, obsahujícím θ,16Μ KC1, 10,4 mMTris-HCl pH 7,4, 7,2 mM MgClg. Tato směs/ve zkumavce/ seinkubuje ve vroucé vodní lázni /objem 500 ml/ 3 minuty, pakse nádržka z vroucí vodou odstraní z horké plotny a nechávychladnout, při teplotě místnosti /obsahuje směs/. Kdyžsměs vychladla, upraví se konečný objem na 20 mikrolitrůpřídavkem následujících činidel: 4 mikrolitry 2,5 mM dGAEC/dGTA, dATP, dTTP, dCTP/, 1 mikrolitrů 10 x ligázového puf-ru /45 mM NaCl, 45 mM Tris-HCl pH 8,0, 45 mM MgCl2, 40 mMDTT, 12 mM ACP, 0,4 mg/ml hovězího sérového albuminu /frak-ce V//, 1 mikrolitr 10 x NT pufru /0,5 M Tris-HCl pH 7,2,O,1M MgSO^, 1 mM DTT, 500 /Ug/ml hovězí sérový albumin /frakce V/, 1- mikrolitr T4 DNA ligázy /400 jednotek/ a 0,5 mik-rolitrů E.coli DNA polymerázy, velký fragment /Klenow frag-ment/ /2,5 jednotky/. Aato směs se inkubuje při 15 °C nej-méně 2 hodiny a výhodně 18 hodin. 1 až 10 mikrolitrů této reakční směsi se pak použije -22- pro transformaci E.coli MC1061, které jsou identifikoványjejich schopností růst na LB plotnách, obsahujících 50 yug/mlampicilinu. Mutované plasmidy jsou identifikovány jejichschopností hybridizovat k J P- značenému oligonukleotiduza použití standardních podmínek. Pozitivně hybridizujícíkolonie jsou potvrzeny přítomností nového BamHI restrikč-ního místa v plasmidavé DNA izolované z těchto kolonií. Tatokonstrukce je označena jako pLJ663B.

Toto vede k následující modifikaci přírodní sekvence:

přírodní ATG GCT CCT GCC ATG GAA TCC CCT JCT CTA

modifikovaný G AUC CT

Tato modifikace vytvořila nukleotidovou sekvenci ště-pitelnou BamHI restrikční endonukleázou. Další modifikace:v polohách 884-890 vytváří nukleotidovou sekvenci štěpi-telnou EcoRV restrikční endonukleázou. Zavedení EcoRV jeprovedeno jednoduchým způsobem jako výše. Mezerovitá mole-kula je v tomto příkladě vytvořena štěpením pLJ663 /10 /Ug/restrikčním enzymem Pvu II /30 jednotek/ při 37 °c v koneč-ném objemu 100 mikrolitrů v pufru, obsahujícím 150 mM NaCl,6 mM Tris-HCl pH 8,8, 6 mM MgCl^ a 6. mM 2-merkapto-ethanoihuTento štěpí fragment pLJ663 do dvou fragmentů, odpovídají-cích délkám přibližně 600 bp a 3600 bp. 3600 bp fragmentje izolován elektroforézou na agarozovém gelu a je označo-ván jako mezerovitá molekula. iineámí molekula je stejnájak byla uvedena výše. Oligonukleotid použitý v tomto pří-kladu je popsán dále a postup izolace je stejný jako výš©a pozivně hybridizované kolonie jsou potvrzeny přítomnos-tí nového EcoRV restrikčního místa v plasmidové DNA izolo-vané z těchto kolonií. Tato konstrukce je označena jakopLJ663E: -23- 866 869 872 875 878 881 884 887 890 893 896 pří- rodní CCC AAA AAC AAC TG A ΤΑΓ ΑΑΓ TAC TCA .AGA ΑΑΓ

modifikovaný CGG AT C

Tyto modifikace: dovolují, aby ^amHI-EcóRV fragmentbyl izolován, a inzertován do klonovacího vektoru. p3C12BI/viz Cullen, Methods in Enzymology, 152:684 /1987//, při-čemž je deletován QamHI-Smal fragment. BamHI-EcoBV modifi-kovaný fragment, lidské cDNA fragmentu je inzertován doBamHI-Smal míst pBC123I následujícím způsobem: BamHI-Bsmlfragment, 264 bp z pLJ663B;/10 /Ug pU663B je štěpen, při37 °C restrikčními enzymy ^amHI /30 jednotek/ a Bsml /30jednotek/ ve finálním objemu 100 mikrolitrů pufru, obsa-hujícího 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 8,0, 6 ¢1 MgCl2 a6 mM 2-merkaptoethanolu. 264 bp fragment je izolován, elek-troforézou na agarozovém gelu. 496 bp Bsml-EcoBV fragmentz pLJ663E /10 /ug pLJ66'3E/ je štěpen při 37 °C restrikční-mi enzymy Bsml /30 jednotek/ a EcoRV /30 jednotek/ v ko-nečném objemu. 200 mikrolitrů v pufru, obsahujícím 150 mMNaCl, 6 mM Tris-HCl pH 8,0, 6 mM MgClg a 6 mM 2-merkapto-ethanolu. 496 bp fragment je izolován elektroforézou naagarozovém gelu. Plasmiď pBC12BI /10 ^uX/ je1 štěpen restrikcním enzymem Smál /30 jednotek/ při 37 °C v konečném obje-mu 100 mikrolitrů v pufru, obsahujícího 10 mM KC1, 10 mMxris-HCl pH 8,0, 10 mM MgClg a 6 mM 2-merkaptoethanolu. Jepotom štěpen. BamHl /30 jednotek/ při 37 °C v konečném ob-jemu 100 mikrolitrů v pufru, který obsahuje 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 8,0, 6 mM MgCl2 a 6 mM 2-merkaptoethano-lu. Toto štěpení vede k získání 2 fragmentů a větší, přibliž-ně 3500 bp fragment je izolován elektroforézou na agaro-zovém gelu. ^yto tři fragmenty jsou přidány v ekvimolár- -24- ních poměrech do směsi o konečném objemu 10 mikroiitrů vpufru, obsahujícím 4,5 mZ NaCl, 4,5 mm Tris-HCl pH 8,0, 4,5 αώί áigCl,,, 4 misí DTT, 1,2 mil ATP, 40 /Ug/ml hovězíhosérového albuminu a T4 DNA ligázy /400 jednotek/, fragmen-ty se ponechají ligovat přes noc při 4 °C. S.coli MC1061je transformován ligační směsí a pozitivní kolonie jsouidentifikovány hybridizací k sondě s posunem jeonořetěz-cového zlomu lidské Γ/χ pod jedno tkové cDNA. DNA je izolo-vána z pozitivních kolonií a přítomnost 760 bp SamKI-ScoRVfragmentu je potvrzena. Některé pozi ivní jsou izoloványa jeden z nich je označen jako pUllOI. Tento vektor,ρ1ΖΓ11Ο1 exprimuje velmi vysoké hladiny Ά podjednotky,ale velmi málo molekul dosahuje buněčného povrchu nebováže IgE, Z pUllOI je izolován 3amHI-3ca 1 fragment, obsahu-jící následující nukleotidovou sekvenci 121-710:

Plasmid pLJ1l01 /10 /Ug/ je štěpen restrikčním enzy-mem 3amHJ /30 jednotek/ v konečném objemu 100 mikroiitrův pufru, obsahujícím 100 ma. NaCl, 6 miu Tris-HCl pH 8,0, 6 mli MgCl2 a 6 ml 2-merkaptoethanolu celově. ťotom sepřidá restrikční enzym Seal /3 jednotky/ takže dochází kparciálnímu štěpení. 589 bp BamKI-Scal fragment /nukleo-tidy 121-710 lidské podjednotky/ je pak izolován elek- troforézou na agarozovém gelu.

TTA CTG TTCAAG GTC TCCGTG ACT CTTAAA TGG TTCAAT ATT GTGCAC CAA CAAGAC TGG CTGCCC CTC TTCGTG ATC TATCAC AAC ATCTAC TGT ACG

..... GAA

TTC GCT CCA GAT GGCTTG AAC CCT CCA TGGACA TGT AAT GGG AACCAC AAT GGC AGC CTTAAT GCC AAA TTT GAAGTT AAT GAG AGT GAACTC CTT CAG GCC TCTCTC AGG TGC CAT GGTTAT AAG GAT GGT GAATCC ATT ACA AAT GCCGGC AAA GTG TGG CAG

TCC CCT ACT CTA CTGGTG TTA GCA GTC CCTAAT AGA ATA TTT AAAAAT TTC TTT GAA GTCTCA GAA GAG ACA AATGAC AGT GGA GAA TACCCT GTG TAC CTG GAAGCT GAG GTG GTG ATGTGG AGG AAC TGG GATGCT CTC AAG TAC TGGACA GTT GAA GAC AGTCTG GAC TAT GAG TCT

TGT

CAG

GGA

AGT

TCA

AAA

GTC

GAG

GTG

TAT

GGA

GAG

GTA

AAA

GAG

TCC

AGT

TGT

TTC

GGC

TAC

GAG

ACC

CCC

GCC čct

ÁAT

ACC

tTG

CAG

AGT

CAG

ÁAG

AAC

TAC

CTC 25-

ATT XT GTA ΑΓ Λ 4«'ίΛ '-j GA3 í Λ'"’

•flxtU

Tato sekvence se liguje k RsaI-3snEI fragmentu z IL-2receptoru, který obsahuje nukleotidy 376-1016. Plasmid plL-2R/20 /Ug/ /Hakimi a spol., Journal of 3iol.Chem., 262 17336-1 7341 /1937// je štěpen restrikčními enzymy JarnHI /30 jed-notek/ a Ksal /30 jednotek/ v konečném objemu 200 mikro-litrů v pufru, obsahujícím 100 mM NaCl, 6 mJ Tris-HCl pHS,0, 6 mki LgClg a 6 mm 2-merkaptcethanolu celkově. 141 bpx<sal-3amhrl fragment /nukleotidy 376-1016 z p55 11-1 re-ceptorové cDNA/ je izolován elektroforézou na agarozovémgelu*

A CCAGGTAGCA

GTGGCCGGCT GTGTTTTCCT GCTGATCAGC GTCCTCCTCC TGAGTGGGCT CACCTGGCAGCGGAGACAGA GGAAGAGTAG AAGAACAATC TAGAAAACCA AAAGAACAAG AATTTCTTGGTAAGAAGCCG 3amHI-3caI podjednotkový fragment /589 bp/, RsaT-BamHI p55 fragment /141 bp/ a p3C123I štěpený uamHT, jsouspolu ligovány v reakční směsi, obsahující ekvimolárnípoměry všech 3 DNA fragmentů. Správně ligované plasmidovévektory jsou ověřeny analýzou restrikčními enzymy. Jedenz těchto plasmidů, PLJ1275, exprimuje vysoké hladiny < pod-jednotky, která dosahuje buněčného povrchu a váže IgE, je-litransfektována do COS buněk jak je popsáno- Cullenem Axethodsin Enzymology 152, 684-704 /1987//. 14/ cDNA lidské \ podjednotky může být modifikovánamístně řízenou mutagenezí z tak,že je 3amHI místo zavedenou nukleotidů 120 125 a EcoRV místo je zavedeno u nukleoti-dů 879-884. Výsledný 3amHI-EcoRV fragment modifikované cDNAje izolován a klonován do ^amKI.EcoRV fragmentu modifiko-vané cDNA, je izolován a klonován do 3amHI-3maI míst p3C1 231^/.Tyto výsledky v -26-

Toto vede k fúzi v rámečku, kde iniciační kodony a prvníchpět aminokyselin preproinzulinového genu je fúzováno k ami-nokyselinám 6-257 lidské podjednotky. £ato jedinečnákonstrukce pLď1101 vede k vysoké hladině exprese, jestli-že se transfektuje do COS buněk jak je potvrzeno imuno-fluorescenčním vybarvením permeabilizováných buněk za použití antipeptidového antiséra 81-103 a 160-197.

Vektor, obsahující chimérní formu oC podjednotky jekonstruován ligací BamHl^Scal fragmentu modifikované pod-jednotky /nukleotidy 121-710/ k Rsal-BamHI fragmentu IL-2receptoru /nukleotidy 876-101 β/^θΛ Ligovaný fragment jepak inzertovánx do BamHI štěpeného p3C12SI. Výsledný vek-tor, pLJl275, řídí syntézu chimérní podjednotky kódu-jící aminokyseliny 6.201 lidské podjednotky /odpoví- dající signálnímu peptidu a extracelulární doméně/ a amino-kyselin. 240-271 /odpovídající transmembránovým a cytoplas-matickým doménám/ p55 IL-2 receptoru*

Anpliflkace exprese chimérické podjednotky je. do-saženo postupným zvyšováním koncentrací 0,1 a 1,0 mikro-molákních amethropterinu. Obohacení buněk exprimujících.vysoký počet receptářů je dosaženo dvěma běhy třídění fluo-rescenčně aktivovaných buněk za použití IgE-biotinu a střeptavidin-FITC. Stabilní klony, exprimující vysoké hladinypodjednotky vázající buněčný povrchový IgE jsou pak získá-ny klonováním: v limitním ředění. Pět nezávislých klonálníchizolátů se nejprve? charakterizuje rozdíly vzhledem k expresi receptoru ale ne vzhledem, k vazebné afinitě. 31310 klonje adaptován k rotačním kulturám v Iscoveově modifikovanémDulbecco mediu doplněném 1056 fetálního telecího séra a 80/ug/yul gentamycin-sulfátu. -27-

Pro imunofluorescenční analýzu se buňky mohou inku-bovat s biotinylováným-IgE /1-3 mg/ml/ po '30 minut v Iscoveověmodifikovaném Eulbecco mediu doplněném 10 % fetálního tele-cího séra /kompletní medium/ při 37 °C. Buňky se promyjí4x kompletním mediem a inkubují se se streptavidin-PITCnebo oslím anti-králičím IgE-FITC /Jakcson Immunoresear__ch/po 30 minut při 37 °C v kompletním mediu. Buňky se pakpromyjí a buď třídí ma zařízení Ortho Oytoflúorograph 50Hnebo se překryjí 50% glycerolem, obsahujícím 0,25M N-pro- pylgallátu a ponechány prostoupit povlakem. Buňky jsou po-zorovány na Leitz Liaplan fluorescenčním mikroskopu /25 xsuchý objektiv/ a fotografovány na film Kodak Tri-X.

Pro vazebnou studiii IgE může být radioaktivně zna-čen pomocí na specifickou aktivitu 1-2 X 10^ cpm/,ug 19/ 125 ' proteinu za použití chloraminu-T ' . Vazebnost I-IgEje hodnocena jak bylo popsáno a je v rozmezí 65-75 %. z 22/ vazebné studie jsou prováděny jak je popsáno dříve a prokompetiční studie byly vzorky o různém ředění preinkubo-vány se suspenzí buněk /4 x 10^ buněk/ml/ po 30 minut předpřídavkem 250 ng/ml 1^^I-IgE. Nespecifická vazebnost jedeterminována přídavkem 50-100 násobného přebytku nezna-čeného IgE ke zkušebním zkumavkám, a tyto hodnoty jsouodečteny od experimentálních hodnot, získá se specifickávazebnost. Kinetika asociace a disociace mezi IgE a rekom-binantním receptorem jsou stanoveny metodami dříve popsa-nýrni^0t Postupná rychlostní konstanta /K^/ je vypočtena z rovnice k1=VQ/IgE0R0, kde VQ představuje po-čáteční rychlost vazby a IgEQ a RQ představují počátečnímolární. koncentrace IgE a receptoru. Disociační rychlostníkonstanta /k.·,/ je vypočtena za předpokladu, že disociaceligandu z receptorů je; jednoduchý proces rozpadu prvníhořádu. Rovnovážná konstanta /K^/ je vypočtena z rovnice: KA= k,/k_, · -28-

Pro vazebnou analýzu mohou být permanentní buněčnélinie, exprimující chimérický receptor zavedeny do CHO bu-něk za použití genové-spojovací ko-amplifikační technolo-gie. Pro zřetelný doklad, že extracelulární doména pod-jednotky je dostačující pro vysoce afininitní IgE navá-zání, je rovnovážná asociační konstanta určena nezávislýmistanoveními asociačních a disociačních rychlostních konstsnjak bylo popsáno dříve pro receptory lidské a hlodavců.Počet receptorů na CHO buňkách je stanoven inkubaci buněk s 10 /Ug/ml 12^I-lgE po 2 hodiny. gustota receptorů je vrozmezí mezi 4-10 x 10^ molekul/bunku. Předložený vynález byl popsán obecně, následujícíobrázky a příklady jej detailněji ilustrují, aniž by jejjakkoliv omezovaly.

Popis obrázků

Obr.1. Inhibice· 12^I-IgE /připravená chloramin-T metodou známou v oboru/ vazby k CHO-PcERI /chimérická c\ pod-jednotky/ buňkám, monoklonálními protilátkami, tfdajejsou vyjádřeny jako "% inhibice” 125l-IgE navázáníza přítomnosti uvedených koncentrací protilátky ve isrovnání s celkovým specifickým navázáním za nepří-tomnosti protilátky. % inhibice byla stanovena jakje popsáno v příkladech pro neznačený IgE /0 / apro protilátky 15^5 / Bř /, 12E7 / Δ /, 22E7 / &amp; /,5D5 /O /, 29C6 /X/ a 808 / A/.

Obr.2. Inhibice 125I-15-A5 /A/ a 12^I-22E7 /3/ navázání k CHO-PcERI /chimérická c< podjednotka/ buňkám IgE a imonoklonálními protilátkami, ^daje jsou vyjádřenyjako % inhibice 12^I-15A5 nebo 12^I-22E7 navázaníza přítomnosti uvedených koncentrací protilátky resrovnání s celkovým specifickým navázáním za nepří-tomnosti protilátky. % inhibice jsou stanovena na ; -29- grafu A pro neznačený IgE / $ / a pro protilátky15A5 /□ /, 12Ξ7 /0 /, 22E7 /0 /, 5D5 /X/, 29C6/ q / a 8C8 /U / a grafu B pro protilátky 15A5 /0/,1 2E7 / 1« /, 22E7 / O /, 5D5 / ©/, 29C6 / A / a8C8 / A /. kontrolní protilátková specifita pro ne-při buzný protein nesnižuje specifitu navázání vobou zkouškách.

Qbr«3. Stimulace: uvolnění histaminu z lidských basofilůošetřením anti-IgE protilátkami nebo protilátkamipodle předloženého vynálezu. Lidské basofily peri-ferní krve; byly připraveny a ošetřeny v uvedenýchkoncentracích anti-IgE protilátkou nebo protilát-kami podle předloženého vynálezu jak je popsánov příkladech. Uvolnění histaminu bylo měřeno jakje popsánoJJ/.

Obr.4. porovnání inhibice *3I-IgE navázání k buňkám krysíbasofilní leukemie /RHL/ a CHO-FcERI /chimérní 0Qpodjednotka/ buňkám neznačeného IgE a monoklonál-ních protilátek/podle předloženého vynálezu $dajejsou vyjádřeny jako % inhibice- 3I-krysí IgE navá-zání k RHL buňkám, např. RBL-1 /ATCC CRL 1378/ a lidský IgE navázání k CHO-FcERI /chimérnípodjednotka/ buňkám neznačených krysích IgE a anti-lidským podjednotkovým protilátkám. % inhibicebyla stanovena jak je popsáno v příkladech pro uve-dené koncentrace?každé protilátky. Neznačený krysíIgE /X/ a monoklonální protilátky 4B4 /□ /, 6F7 /O /a kontrolní protilátka /A/ na R3L buňkách. Nezna-čené protilátky 4B4 /W/, 6F7 /$ / a kontrolní pro-tilátka /A/ na CHO-FcERI /chimérní podjednotka/buňkách. -30- Příklady provedení vynálezu Příklad 1

Monoklonální protilátky k (XI podjednotce x 125 a. Čištění a značení lidského a krysího IgE pomocí '1 abiotinu 17 18/

Lidský myelomový IgE/PS/ byl čištěn jak je popsáno 1 ' a krysí monoklonální IgE byl čištěn z ascitické kapaliny nu/nu myši nesoucí imunocytom IR 162 jak je popsáno1

IgE byl biotinylován. pomocí N-hydroxysukcinimid esteru bio- tinyl-epsilon-aminokaproové kyseliny /B-X-NHS, Calsiochem/ jak bylo popsáno ' . Lidský a krysí IgE byl radioaktivně značen pomocí na specifickou aktivitu 1-2 x 10^ cpm/mg 21/ proteinu za použití chloraminu-T . b. Čištění rozpustné chimérické c( podjednotky CHO buňky exprimující 4-10 x 10' chimérní podjednot- ky/buňku byly udržovány v Iscoveově modifikovaném Dulbeccomediu '/DUB/, obsahujícím 10 % fetálního telecího séra /F3S/,

1 mM glutaminu, 50 /Ug gentamycinu a 3 x 10“^ methotrexátujako selektivního činidla. Šunky byly odebrány, promytychladným salinickým roztokem pufrovaným fosfátem /PBS, pH

Q 7,4/ a solubilizovány /10 buněk/ml/ ve studeném PBS, obsa-hujícím 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, 40 /Ug PMFS a 0,02 % NaNj/10 mM CHAPS/PBS pufr/. Buněčný extrakt byl odstřelován z při 100000 x g po 70 min pro odstranění buněčných zlomkůa solubilizovaná chimérní d, podjednotka byla chromatogra-fována na IgE afinitní koloně.

Lidský nebo krysí IdE /5 mg/ byl připojen k 1 ml Affigelu· 10 podle návodu výrobce /BioRad Labs, Richmond CA'1'· IgE afi- nitní pryskyřice.- byla promyta pěti objemy kolony 0,2 M HAc, -31- 0,2M NaCl, 2 mM CH^PS, pH 2,8 /kyselina oetová-CHJSPS pufr/s následující reekvilibrací s 10 aM CHJSPS/P3S pufrem. So-lubilizované přípravky chimérické podjednotky /2 až 6

Q x 10' buněčných ekvivalentů/ byly aplikovány na sloupec,promyty s 10 mM CHáPS/PBS pufru a 2 mM CHJ5PS/P3S pufru /2 mMCH.4PS, 1 mM EDTA, 40 /Ug PMSF, 0,02 % NaN^ v PBS pH 7,4/ aeluovány octovou kyselinou-CHAPS pufrem. Každá frakce seihned neutralizuje 3 M Tris, pH 9. Frakce, obsahující pro-tein se spojí, dialyzují proti 10 mM CH^PS/PBS pufru azkoumá se v dráhovou blot zkouškou na aktivní chimérní CK podjednotku. c. Dráhová blot zkouška pro detekci aktivní chiméricképodjednotky

Rozpustné extrakty CHO-FcERI /chimérická podjednotka/buněk a afinitně čištěná chimérní ¢( podjednotka byly zře-děny stejnými objemy 10 mM Tris-glycínového pufru, 20%methanolu, pK 8,3 a vakuově filtrovány na nitrocelulozo-vých proužcích /0,45 /um/ za použití obchodně dostupné drá-hové biotting jednotky /Schleicher and Schuell, Keene, NH/.Kitrocelulozové proužky byly blokovány 1 h při teplotě míst-nosti vr salinickém roztoku pufrovaném fosfátem /PBS/, ob»sáhujícím 2% hovězí sérový albumin /BSA/, inkubovány s IgE-biotinem /0,5 /Ug/ v CHJSPS/FBS pufru /10 mM CfUPS, 5 % fe-tálního hovězího séra, PBS pH 7,4/ po 1 h, promyty pomovíPBS, obsahujícího 0,05 % Tweenu-20 a ponechány reagovat sestreptavidin-peroxidázou v CHjSPS/FBS pufru /Anersham Corp./po 30 minut. Proužky byly promyty a komplexy chimérní pod-jednotky/biotinylovaného-IgE byly vizualizovány 4-chlor-1-naftolem /0,5 mg/ml v 0,15% H^Og, M NaCl, 50 mM Tris-HC1, pH 7,5/ po 30 minut. -32- d. Značení afimtnš čištěného chimérního c\ pod^ednotko- i 25 vého proteinu se I a N-glykanázovým zpracováními 25 I-chimérní podjednotky

Afinitně čištěná chimérní Λ podjednotka byla zna-Čena 30 min pomocí 0,2 mCi Nal y za použití činidla Enzy-mobead /BioKad Laboratories/ podle návodu výrobce. Zna-čený protein byl oddělen od volného jodu na koloně BioGelP6DG /BioEad Laboratories/, ekvilibrované 2 mM CHAPS/PBS,zředěn stejným objemem 2 mM CHAPS/PBS pomocí 1 mg/ml BSAa uchováván při 4 °C.

Hadioaktivně značená chimérní podjednotka bylasušena pod vakuem a resuspendována v 0,2M fosforečnanu sod-ném, 10 mM EDTA, pH 7,0. štěpení N-glykanázou /3 jednotky//Genzyme, Boston, MA, USA/ se provádělo 2 dny při 37 °C natřepačce a reakce byla ukončena 0,1 M citrátovým pufrem,pH 4,5. e. Studie? navázání receptoru. a afinitní zesítění

Vazebné studie byly provedeny v podstatě tak, jak již bylo popsáno^’2^/. stručně, CHO-FcERI /chimérní <<podjednotky/ nebo HBL buňky byly resuspendovány na 4 x 10^buněk/ml v HPMI 1640, 5 % fatálního hovězího séra, 5 mMHEPES pH 7,4 /vazebný pifr/ a inkubovány se 25i_značenýmIgE /10 mg/ml až 1 mg/ml/. Nespecifické navázání bylo sta-noveno přídavkem 50-10'0 násobného přebytku neznačeného IgEke zkumavkám s nespecifickou studií. Buňky s navázanou ra-dioaktivitou byly odděleny od nenávazaného značení odstře-děním přes silikonový olej:2^» Pro kompetiční studie, bylyvzorky protilátek v různých koncentracích preinkubovány sbuněčnou suspenzí 1 h při teplotě místnosti před přídavkem -33- ^5i«2nageného lidského IgE /19 ng/ nebo krysího IgE /250 ng/.

Vzorky byly inkubovány další 1 h při teplotě místnosti a.i. i oř zpracovány jak je popsáno výše. nhibice ^I-xgE k FcERI/chimérní </ podjednotky/ nebo RSL buňkám byla stanovenaporovnáním celkového specifického navázání za přítomnostiprotilátky s celkovým navázáním za nepřítomnosti protilátky. ro přípravu rozpustných komplexů 'Ι-IgE zesítěnýkřížově navázaný k chimérické / podjednotke, byly buňkyinkubovány se 7I-IgE, promyty PSS a resuspendovány vestudeném PBS, 1 mM MgCl^, pH a,3 v koncentraci 10? buněk/ml.Disukcinyl-suberát /DSS/ /Pierce Chemical Co./ v dimethyl-sulfoxidu /MeSO^/ byl přidán do konečné koncentrace 0,4 mMa reakce probíhala po 30 min při 4 °'C za konstantního mí-chání. Reakce byla přerušena a buňky byly promyty 25 mMTris-HCl pH 7,5, 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA. Buňky se? solub.i-lizují v ledově studeném 10 mM CHJSPS/PBS pufru /10? buněk/ml/jak je popsáno výše?. Buněčné extrakty se přímo analyzujípomocí SDS/PJSGE^/ nebo se imunoprecipitují protilátkamipřed analýzou pomocí SDS/PA3E. f. Příprava, charakterizace a čištění hybridomových pro-tilátek 3J5L3/c myši /Charles River Laboratories, Wilmington, M4/ se imunizují intraperi&amp;oneálním způsobem /i.p./ částeč-ně čištěnou chimérní Ά podjednotkou /7x10 buněčnýchekvivalentů/ smíšenou se stejným objemem Freudova komplet-ního adjuvans. θ dva týdny později se myši injektují i.p.stejným množstvím čištěné chimérní podjednotky smísenés ^reudovým nekompletním adjuvans. 0 sedm týdnů pozdějise jedna myš injektuje i.p. a i.v. další chimérickou i/ pod-jednotkou /od 5,5 X 10^ buněčných ekvivalentů/ dva po sobějdoucí dny , vychází se 4 dny před buněčnou 'fúzí. Slezinné -34- buňky se izolují z této myši a fúzují s NSO buňkami255/ v poměru 1:1 /slezinné buňky: NSO buňky/ se 35% polyethy- lenglykolem /PEG 4000, E.Merck/2^.Fúzované buňky se umístí v hustotě 5 x 104 buňky/jamka/ml na 48 jamkovou plotnu v IMDM doplněném 15% FBS, glutaminem /2 mM/, 1-merkaptoetha- nolem /0,1 mM/, gentamycinem /50 /ug/, HEPES /10 mM/ a27/ ' 15 % P388D1 supernatantem . Hybridní supernatanty seprohledají na specifické protilátky proti podjednotce ve třech zkouškách: 1/ imunoprecipitace ^2^I-značené chimé-rické podjednotky, 2/ imunoprecipitace; rozpustného kom-plexu Ί-IgE křížově navázaného k chimérní podjednotcea 3/ inhibici 12^l-IgE navázání k CHO-EcERI /chimérní podjednotka/ buňkám.Hybridomové buněčné linie byly klonoványlimitujícím ředěním.

Pro imunoprecipitační zkoušky /IP zkoušky/ byly hyb-ridomové supernatanty nebo vzorky čištěných protilátek /20/Ug/, IP pufr /4- mM CHJSPS/PBS pH 7,4 1 mg/ml BSA/ a bud" 2'I-značená chimérní Ji podjednotka nebo rozpustný komplex^2^I-IgE křížově navázaný $ chimérické cXÍ podjednotce:, smí-šeny a ponechány stát 30 minut. Hozí anti-myší protilátkynavázané na agarozových perličkách /Sigma Chemical Co., St.Loů&amp;s, MO/ byly přidány do zkumavek a otáčeny 2 hodiny přiteplotě místnosti. Perličky byly třikrát promyty IP pufrema spočteny. Navázané ligandy byly uvolněny přídavkem SDS/PA3E vzorkového pufru a zahřátý na 95 °C po 3 minuty. Uvol-něné proteiny byly analyzovány pomocí SDS/PJ5GE a autoradio-grafií.

Protilátky byly také testovány western blot analýzouna navázání k denaturované solubilizované chimérní &amp; pod-jednotce28//. Stručně, solubilizoyané proteiny byly separo-vány pomocí SDS/PAJE za buň neredukčních nebo za redukčníchpodmínek a elektroforeticky přeneseny na nitrocelulozovémembrány. Membrány byly ošetřeny 1% BSA, PBS pH 7,4 po 1 h . ' Λ·'< . -35- při 37 °C a následovně sondovány vzorky protilátky zředě-nými v protilátkovém pufru /1% 3SA, 50 mM fosforečnan sodný,pH 6,5, 0,5 M NaCl, 0,05 % Tween-20/ po 2 h při teplotěmístnosti, membrány byly promyty, ponechány reagovat s kozímanti-myším IgG navázanými k peroxidáze a navázaná proti-látka se vizualizuje pomocí 4-chlor-1-naftolu po 30.minpři teplotě místnosti.

Protilátky byly čištěny z hybridomových kultur ve vel-kém měřítku pomocí afinitní chromatografie na Proteinu Gnavázaném na zesítěnou agarozu podle návodu výrobce /Genex,Gaithersburg, MD, USA/· 2° / x dardní syntézou v pevné fázi . Ci

Navázání protilátek k syntetickým peptidům Šestnást překrývajících peptidů, obsahujících celouextracelulární sekvenci podjednotky bylo připraveno stan- ištené peptidy byly roz-

puštěny /1 mg/ml/ v destilované vodě nebo MeSO^. EIA plotnybyly potaženy 200 ng každého peptidu v 50 mM hydrogenuhli-čitan-uhličitanového pufru, pH 9,6 a pak sušeny přes noc při37 °C. Plotny byly promyty vodou, blokovány 1% BSA, PBS pH 7,4 a inkubovány s protilátkou po 2 hodiny při teplotě míst-nosti. Plotny byly promyty pomocí 0,05% Tweenu-20, P3S pH 7,4a byl přidán kozí anti myší IgG navázaný k peroxidáze /Boeh-ringer Mannheim Immunochemicals/ na 2 h při teplotě míst-nosti. Komplexy protilátka-peptid byly vizualizovány o-fe-nylen-diaminem /0,4 mg/ml/ rozpuštěným v O,1M citrátovémpufru, pH 4,5, obsahujícím 0,012% ^2θ2 nm‘ h. Vazebné studie se ^^1-značenými protilátkami

Protilátky 1 5 f£>, 1 2E7 a 22E7 byly radioaktivně značeny pomocí 12^i modifikací lodogen metody /Pierce Chemical Co./.Stručně, 1 mCi /^ensham Co./ a 50 /ul 0,5 M fosfo- rečnanu sodného -pufru, pH 7,5 bylo přidáno do borosiliká-tové skleněné zkumavky potažené 50 yug rodogenu. Po 4 min. -36- byla přidána protilátky /50 /Ug/ v P3S, pH 7,4 a v reakcise pokračovalo 8 minut při teplotě místnosti. Radioaktivněznačená protilátka byla uvolněna od volného 1ťOI chromato-grafií na BioGelavé P6DG koloně /BioRad Laboratories/. Na-vázání radioaktivně značených protilátek k CHO-FcERI /chimérní Ά podjednotka/bunky byly stanoveny jak je popsáno pro 125 ' * * Ι-IgE. Nespecifické navázání bylo stanoveno za přítomnosti 100nésobného molárního přebytku nežnačené protilátky neboIgE. Rovnovážné vazné hodnoty byly analyzovány podle 3cat-rcharda-^/ pro stanovení disociační konstanty /Kp/ pro zna-čenou protilátku a počet vazných míst na buňku. Byly pro-vedeny kompetiční studie s neznačenými čištěnými protilátkami 1 *25 a hybridomovými supernatanty jak je popsáno pro I-IgEs výjimkou, že yI-značená protilátka se přidá na konci1 hodiny pre-inkubačního stupně. Koncentrace protilátky,která inhibuje 50 % navázání značeného ligandu byla ozna-čena jako i. Navázání protilátek k nativnímu FCERI lidských basofilůLidské basifily byly získány z heparinizované peri- ferní krve sedimentací ve Ficoll-Paque /Pharmacia/ jak bylodříve popsáno^/. Promyté basofily /1,5 x 10^ buněk/ bylyinkubovány s 2,5 - 40 ml/ml čištěných protilátek v P3S,obsahujícím 1 % FBS a 0,02 % azidu sodného po 20 minut přiteplotě místnosti. Buňky byly promyty a pak inkubovány skozím aniti-lidským IgE značeným fluoresceinem a /Fab^-kozímanti-myším IgG značeným rhodaminem /Tágo Labs, Burlingame,CA./· 3uňky byly promyty a dispergovány na sklíčku 2a použitizařízení Cytospin /400 ot.min“1 po 5 minut/. Sklíčka bylapřecrstvena 90¾ glycerolem, obsahujícím 0,z2M 1 ,4—diazo bi—cyklo /2,2,2/oktan /Sigma Chemical Co./ jak bylo popsáno vliteratuře^2/. Buňky byly pozorovány na Leitz Lšaplan fluo- -37- rescentním mikroskopu a fotografovány na Kodak Sktachrome400 film.

Uvolnění histaminu bylo orovedeno jak je Doosáno v li-33/ terature . j. Charakterizace monoklonálních protilátek k podjednotce

Surové extrakty CHO-FcERI/chimérní podjednotka/ buněk a čištěná rozpustná chimérní fA podjednotka byly hod-noceny na specifickou IgE vazebnou aktivitu "slot b^l" zkouš-kou. Kvalitativní hodnocení výsledků "slot blot" zkouškyprokazují, že množství částečně čištěné chimérní ,χ podjed-notky představuje v primární a sekundární imunizaci přibližněpřítomných 7 až 28 yug. Pro konečnou imunizaci dostaly myšipřibližně 100 ^/Ug částečně čištěné chimérné podjednotkyjak je stanoveno ve "slot blot" zkoušce, -‘-yši injikovanéčištěnou chimérní A podjednotkou produkují sérové protilátky,které účinně blokují ^2^I-IgE navázání k CHO-FcERI/chi-mérní oodjednotka/ buňkám a imunoprecipitují jak 12^I-značenou chimérní X podjednotku a rozpustný komplex x-IgEkřížově navázanou k chimérní podjednotce. Fúze se sle-zinnými buňkami izolovanými z jedné myši poskytla 47 hybri-domů sekretujících monoklonální protilátky /máb/ podle před-loženého vynálezu /tabulka 1/. Všechny protilátky imunopre-cipitují a radioaktivně značí 47 kP protein, ze yI-značenéchimérní podjednotky. Dva hlavní radiaktivně značenéproteiny přibližně 47 kD a přibližně 65 kD představují vpreparaci 12^I-chimérní podjednotky značenou chimérní podjednotku a hovězí sérový albumin, tfdaje v tabulce!označené čísly 1/-7/ mají následující význam: -38- Φ o β Φ 3 > 44 Φ P m ft Φ CO o- ca ro <í

M

W ►-q g

M t»0

M

I

H

tO

OJ o •«j· 7

LO

Ol (0 β

Tabulka 1 mABtřída IP zkouška1 zkouška vézebnosti

ca 44 P o β Ό Φ •o 3 Ό β O o O, P o. Φ o M Φ β β β 'Φ a •Η x3 υ \ o 1 o 33 O 125 125 I-22E7 c- + 125 I-15A5

I-IgE 125I-IgE/alfa 1 25 1 25 I-de-alfa I-alfa

co OJ OJ *·-* M O Ή IO 'P ·<"· o Tt m rs x-> 'P — m 3 M Ό ' <✓ X) OJ m 3 CO X) •P *· OJ >— X) -ιλοι c— OJ X3 T““ OJ to m •P <ί w r- m β to Q jc ftio o, OJ O. a, 00 •P cx o O, co 04 C >>— >5 r— >5 vo >> Φ >> to >i PO .P P'-' P P P β P P •P (29C6)- -39- 1/ ImunoprecipitaČní zkouška /IP zkouška/ byla provedenar 125 jak je popsáno výše se yI-značenou chimérní podjednotkou125 1 ~ 5 /‘^I-alfa/, líOI -značenou deglykos.ylovanou čištěnou νζ pod- 125 125* jednotkou / I-de-alfa/ a rozpustným komplexem ^I-lgEkřížově navázaného k chimérní podjednotce /12:?I-IgEalf a/. « cep 2/ Re/torová vazebná zkouška byla provedena jak je popsá- v no výše s CHO buňkami exprimujícími rekombinantní chimérní'Á podjednotku /CHO-FcERI /chimérní podjednotka/ a RBL buňkami. Radioaktivně- značené ligandy zahrnuté do zkouš-ky byly 125I-IgE, 125I-15A5 a 125I_22E7. 3/ Peptidová SIA provedena jak je popsáno výše se 16 syn-tetickými peptidy, odpovídajícími aminokyselinové sekvenci/aa sekvence/ extracelulární domény podjednotky. 4/ Čísla v závor ách znamenají počet protilátek každé”tří-da" a "typu” protilátky. Prototypová protilátka je uvede-na v závorkách pod každým typem protilátky. 5/ Rozdíl mezi typem. 2a a 2b protilátek je, že typ 2bprotilátek se při western blot váže k rekombinantníextracelulární doméně ¢/ podjednotky exprimované v E.coli. 6/ IC^q je >120 mg/ml. 7/ IC5Q je 0,18 mg/ml. 47 protilátek bylo rozděleno na neinhibičaí a inhi- biční třídy podle jejich schopnosti buS imunoprecipitovat rozpustný komplex 1 27I-IgE křížově navázaný k chimérické 'iíS'?.'1; ir.· -40- .it. podjednotce nebo inhibovat 12^I-IgE navázání k CHO-

PcERI/chimérní 7\ podjednotka/ buňkám. Pomocí SDS/PAjE a autoradiografické analýzy 6 neinhibičních protilátek /22E7, 2906, 1134, 8C8, 24B4 a 535/ imunoprecipituje dva proteiny s přibližnou molekulovou hmotností 190 k3 a 250 kD z roz-z 1 95 pustneho extraktu Ι-IgE afinity křížově navázané kCHO-FcERI/chimérní c*. podjednotka/buňkám. Inhibiční pro-tilátky 15A5, 12E7, 6F7, 4B4, 23B8 a 3937 neimunopreci-pitují tyto radioaktivně značené komplexy.

Protože chimérní podjednotka je obtížně glykosylo-vatelná, lektin pšeničných klíčků navázaný k zesítěné aga-roze. také sráží 190 k3 a 250 k3 komplexy.

Inhibiční protilátky 15-A5 a 12E7 blokují ^2^I-lgEnavázání k CHO-FcERI/chimérní J podjednotka/buňkám /Obr.l/.IC^q /polovina maximální inhibice/ pro blokování I-IgEnavázání jsou 0,33, 0,89 a 2,43 /Ug/ml pro 15-A5, IgE a 12E7·Tyto údaje potvrzují, že 15-A5 a 12E7 mají přibližně 2,5krát vyšší a nižší afinitu pro «=< podjednotku než posky-tuje IgE. Čtyři neinhibiční protilátky /22Ξ7, 535, 8C8 a29C6/ neblokují navázání radioaktivně značeného IgE k chi-mérní šA, podjednotku nesoucím buňkám /obr. 1/.

Navázání 125I-15^5, 125I-IgE a 125I-22E7 k CHO-FcERI /chimérní doújednotka/buňkám je nasycené a specifické. * - 125

Scatchard plot analýza rovnovážného navázáni I-15é5,125I_IgE a 125I-22E7 k CHO-FcERI/chimérní << podjednotka/buňkám indikuje, že zjevné disociační konstanty /Kp/ prokaždý ligand jsou 1,57 nM, 2,99 nM a 0,81 nM.

Mnoho protilátek se váže k denaturované chimérní pod- jednotce na western blot, ale pouze podskupina neinhibičních -41- protilátek /tj.-22E7/ se váže jak k redukované tak dena-turované pod jednotce při western blot. Zjevná molekulováhmotnost CHO buněk exprimujících chimérní podjednotku je přibližně 47 kD jak bylo stanoveno analýzou westernblot a autoradiografií I-značené chimérické pod- jednotky podle SDS/PAGE. Tato zjevná molekulová hmotnostindikuje, že buněčný povrch chimérní podjednotky jevysoce posttranslačně modifikován, protože cDNA chimérní podjednotky předpokládá molekulovou hmotnost přibližně24 kD Pro stanovení zda protilátky rozpoznávají kar-bohydrátové zbytky nebo peptidovou sekvenci podfted-notky, byla každá protilátka testována n imunoprecipitačnízkoušce s N-glyksnázou štěpenou ^I-znaČenou chimérní podjednotkou. N-glykanázou štěpený receptor migruje se zjevnou molekulovou hmotností přibližně 25 kD. Jak neinhibiční /11B4 a 39D5/ a inhibiční /15A5/ protilátky1 25 imunoprecipitují přibližně 25 kD deglykosylováné I- značené chimérní podjednotky. Většina /43 ze 47/ mo- noklonálních protilátek imunoprecipituje deglykosylovanou1 25 yI-značenou chimérní podjednotku. k. Identifikace epitopů protilátek.

Navázání každé protilátky k 16 syntetickým; peptidůmzahrnujícím a přesahujícím celou extracelulární sekvenciminus signální peptid /aminokyseliny 26 až 204/ podjed-notky bylo stanoveno pomocí ΕΙΑ» Peptidy odpovídají amino-kyselinovým sekvencím 26-51$ 43-58, 51-65, 59-74, 73-88,66-80, 81-103, 93-110, 104-117, 111-124, 118-132, 125-140,134-158, 151-167, 160-197 a185-204 zralé podjednotky.

Ze 43 testovaných protilátek pouze: 2 specificky navazujík peptidům. Inhibiční protilátka 15 A5 rozpoznává peptidy,zahrnující aminokyseliny 125-140, zatímco neinhibiční pro-tilátka 11B4 se navazuje k peptidu, představujícímu sekven-ci 43-58.Žádná z protilátek nereaguje s jakýmkoliv jiným -42- peptidem jako například peptidem, odpovídajícím sekvenci81-103. Epitopy 15-A5 a 1134 pravděpodobně zahrnují oblastiokolo aminokyselin 130 a 50, protože žádná protilátka seneváže k částečně přesahujícím peptidům /118-132 a 132-158pro 1 5 45, 26-51 a 51-65 pro 1 1 B4/. ^ro identifikaci epitopů protilátek, které se nevá-žou k syntetickým peptidům byly provedeny kompetiční stu-die, které měří schopnost každé protilátky blokovata 12^I-22E7 /homologní protilátce 1134/ vazbu k CHO-FcERI/chimérní pod jedno tka/buňkám. Navázání l2^I-15ú5 a 1 25 j_ 22E7 k buněčnému receptoru bylo úplné a pecifické. ΙΟ^θ pro 1 25 inhibici I-15-A5 navázání neznačeným 1 5A5, IgE a 12E7byly 1,09, 2,41 a 13,74 mg/ml /obr.2/J Všechny neutrali-zující protilátky by mohly blokovat 1-15^5 navázání kCHO-FcERI/chimérní j( podjednotka/bunkám, což potvrzuje,že neutralizující protilátky rozeznávaní běžný epitop nebopřipojeným epitopům. ďedna neinhibující protilátka, 29C6,může částečně inhibovat 12^1-15^5 navázání při 120 ^ug/ml,zatímco jiné neinhibující protilátky neblokují navázání12^I-15A5 v těchto koncentracích /obr.2/. IC5Q pro inhibici 12^I-22E7 navázání neznačeným 22E7,29C6,8C8 a 5D5 byly 0,26, 0,18, 0,29 a 0,79 /Ug/ml. Hyb-ridomové supernatanty, obsahující 22 ze 25 neneutralizu-jících protilátek blokující/K ^2^-22E7 navázání k CHO-FcERI/chimérní podjednotka/bunkám. Epitopy rozpoznávané zbýva-jícími třemi neneutralizujícími protilátkami /tj. 39D5/neblokují navázání radioaktivně značeného 22Ξ7 k těmtobuňkám což indikuje, že jejich epitopy nepřesahují 22E7 epitop/aminokyselinová sekvence 43-58/· Inhibiční protilátka15A5 blokuje přibližně 25 % navázání radioaktivně znače-ného 22Ξ7 k CH04FcERI/chimérní podječnotka/buňkám. Tato -43- hladina inhibice byla konstantní a nezvyšovala se přídav-kem další 15*45 k vazebné reakci. Neznačený IgE a jiné in-hibiční protilátky /tj. 1 2E7/ neinhibují navázání radioak-tivně značené 22E7k těmto buňkám. 1. Navázání protilátky k nativnímu EcE receptoru /FcERI/lidských basofilů

Byly provedeny dvě barevné imunofluorescenční zkouš-ky pro hodnocení schopnosti monoklonálních protilátekpodle předloženého vynálezu rozpoznávat nativní podjed-notku jako část FcERI komplexu lidských basofilů. Protoženormální lidské basofily obvykle mají IgE navázán k větši-ně svých EcE receptorů FITC značený anti-IgE bude vybarvo-vat basofily označením přítomnosti buněk s IgE obsazenýmiFcERI receptory. Basofily jsou velmi slabě vybarvoványinhibiční protilátkou 15-45. Tato protilátka zářivě vabar-vuje CHO-FcERI/chimérní podjednotka^buňky a vykazuje jen velmi slabé vybarvení těchto stejných buněk po před-cházejícím ošetření s IgE. Tyto údaje indikují, že 15.A5epitop je blokován na většině svých EcERI receptorů nabasofilech. Nicméně, neinhibiční protilátka 5D5 zářivě bar-ví tyto buňky, ke kterým je IgE navázán což znamená, žeIgE a 5E5 mohou současně být navázány k nativnímu EcERIreceptorů. Obě protilátky pouze vybarvují anti-IgE barve-né buňky což demonstruje, že protilátky jsou vysoce speci-fické pro basofily.

FcERI receptor promotuje degranulaci basofilů, jestližeIgE a antigen křížově spojují dva nebo více receptorů. Bi-valentní protilátkové molekuly také promotují degranulacibasofilů křížovým navázáním k nativnímu EcERI receptoru.Schopnost každé protilátky indukovat degranulaci může býtměřena množstvím histaminu uvolněného z basofilů, za pří-tomnosti různých koncentrací každé protilátky /obr.3/. Aiti-IgE -44- protilátky indukují uvolnění histaminu z basofilů v dávcezávisle na způsobu /obr.3, vložený obr./. Neinhibující pro·tilátky, 5L5 a 22E7, mohou indukovat maximální uvolněníhistaminu při nejnižší koncentraci protilátky /obe.3/. Nicmé-ně, inhibiční protilátky, 15Λ5 a 12E7, neindukují uvolně-ní histaminu při nejnižší koncentraci protilátky /obe»3/,protože nejvíce PcERI receptorů je obsazeno IgE. Vyššíkoncentrace těchto dvou neutralizačních protilátek indu-kují uvolnění histaminu /obr.3/ nejpravděpodobněji křížovýmnavázáním: k receptorům neobsazeným IgE. m. Navázání protilátky k nativnímu FcERI receptorů RBLbuněk Šest inhibičních /15^5, 4B4, 3987, 12E7, 6F7 a 2388/ ašest neinhibičních /22E7, 585, 8C8, 2484, 29C6 a 1134/protilátek bylo testováno na jejich schopnost inhibovat12^I-IgE navázání k FeERI receptorů RBL buněk nebo k imuno-

i OK precipitaci rozpustného komplexu 'I-IgE křížově naváza-ného ke krysí podjednotce. Pouze jedna inhibiční proti-látka, 484, blokuje navázání 7I-krysí IgE k RBL buňkám.IC,-n pro 4B4 blokující navázání 12^I-IgE cHO-ERI/chimé- ✓ v v _ - rická c\ podjednotka/bunkám a RBL buňkám jsou 0,&amp; a 330mg/ml. Neznačený krysí IgE byl přibližně 1100 krát účinnějš:než 4B4 při blokování ^^I-krysí Igg navázání k RBL buňkám.Žádná jiná protilátka neblokuje· navázání yI-krysí IgE kRBL buňkám, ačkoliv tyto protilátky jsou velmi účinné přiblokování navázání 125I-lidský IgE k CHO-PcERI/chimérní rÁ podjednotka/bunkám, Žádná z neinhibičních protilátekneimunoprecipituje rozpustný komplex 3I-IgE křížově na-vázaný ke krysí podjednotce. n. Příprava a použití P'ab fragmentů monoklonálních proti-látek

Pab fragmenty čištěných monoklonálních protilátek poule předloženého vynálezu byly připraveny štěpením papainem podle -45- známých a standa dních technik, popsaných v ”Antibodies: A Laboratory Manual”, E.Harlow a D.Lane, eds., Cold SpringHarbor Press, 1989, str. 625-631 a v "Monoclonal Antibodies:Principles and Practiee", J.Goding, Academie Press, Inc«,

New York, N.Y., 119-124 /1983/. *

Fab fragmenty čištěných monoklonálních protilátekmohou být použity pro blokování IgE navázání k lidskýmbasofilům a mastocytovým buňkám metodami popsanými pro mo-lekuly intsktních protilátek. Demonstrace, inhibice vazbyIgE k basofilům/řr^g&amp;SKÍ^Eab bez stimulace degranulacea uvolnění histaminu bylo provedeno standardními technika-mo jak je popsáno v Progress in Allergy, sv.34, str, 188-253 "Activation of Mast Cells for Mediator Release throughIgE Receptors”, T.I.Ishizaka a K. Ishizaka. -46-

Literatura: 1. Metzger, H., Alcaraz, G., Hahman, R., J.P. Kinet, Publuda V., aQuarto, R. (1986) Annu. Rev. Immunol. 4, 419-470 2. Conrad, D.H., Berczi, I., a . Froese, A. (1976) Immunochemistry'13, 329-332 3. Kulczycki, A.,Jr., McNeamey, T.A., a ! Parker, C.W. (1976) J.Immunol. 117, 661-665 4. Holowka, D., Hartmann, H., Kannelopoulos, J., a; * Metzger, H.(1980) J. Recept. Res. 1, 41-68 5. Holowka, D., and Metzger, H. (1982) Mol. Immunol. 19, 219-2276.£«, Perez-Montfort, R., Kinet, J.-P., a: ’ Metzger, H. (1983)

Biochemistry 22, 5722-5728 7. Perex-Montfort, R., Fewtrell, C., ai . Metzger, H. (1983)Biochemistry 22, 5733-5737 8. Alcaraz, G., Kinet, J.-P., Kumar, N., Wank, S.A., a Metzger, H.(1984) J. Biol. Chem. 259, 14922-14927 9. Kinet, J.-P., Metzger, H., Hakimi, J., a. Kochan, J. (1987)Biochemistry 26, 4605-4610 10. Shimizu, A., Tepler, I., Benfey, P.N., Berenstein, E., Siraganian, R.P.,a Leder, P. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 1907-1911 11. Kinet, J.-P., Blank, U., Ra, C., White, K., Metzger, H., a. Kochan, J.(1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 6483-6487 12. Blank, U., Ra, C., Miller, L, White, K., Metzger, H., a Kinet, J.-P.(1989) Nátuře 337, 187-189 13. Ra, C., Jouvin, M.-H. E., a Kinet, J.-P. (1989) J. Biol. Chem. 264,15323-15327 14. Kochan, J., Pettine, L.F., Hakimi, J., Kishi, K. a: Kinet, J.-P. (1988)Nucleic Acids Res. 16, 3584 15. Kuster, H., Thompson, H., a · Kinet, J.-P. (1990) J. Biol. Chem 265:6448 16. Miller, L., Blank, U. Metzger, H., a Kinet, J.-P. (1989) Science244, 334-337 17. Hakimi, J., Seals, C., Pettine, L.F. a' · Kochan, J. (1990) Science (inpress) 18. Ishizaka, K. (1985) Immunoglobulin E (IgE). Methods InEnzymology 116, 76 -47- 19. Bažin, H., Querinjean, P., Beckers, A., Heremans, J. F., a; Dessy, F.(1974) Immunology 26, 713 20. Bayer, E.A., Skutelsky, E., a Wilchek, M. (1979) Methods inEnzymology 62, 308 21. McConahey, P., a Dixon, F.J. (1986) Int. Arch. Allergy 29, 185 22. Kulczycki, A., Jr., Isersky, C., a? Metzger, H. (1974) J. Exp. Med.139, 600 23. Kilián, P.L., Kaffka, K.L, Stem., A.S., Woehlé, D., Benjamin, W.R.,Dechiara, T.M., Gubler, U., Farrar,J., Mizel, S.B., av·’. Lomedico, P.T.(1986) J. Immnnol. 136, 1-6 24. Laemmli, J.K. (1970) Nátuře 227, 680-685 25. Galfre, G., &amp; Milstein, C. (1981) Methods in Enzymology 73, 3-466. 26. Fazekas De St. Groth, S, a, Scheidegger, D. (1980) J. Immunol.Methods 35, 1-21 27. Nordan, R.P., Pumphrey, J.G., a; < Rudikoff, S. (1987) J. Immunol.139, 813-817 28. Burnette, W.H. (1981) Anal. Biochem. 112, 195-200 29. Barany, G., a Merrifield, R.B. (1980) The Peptides: AnalysisSynthesis, Biology (Gross, E., a Meienhofer, J., eds) Vol. 2, pp. 1255, Academie Press, New York. 30. Scatchard, G. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51, 660-672 31. Leonard E.J., Roberts, R.L., a Skeel, A. (1984) J. Leukocyte Biol.35, 169- 32. Krenik, K.D., Kephart, G.M., Offord, K.P., Dunnette, S.L., a Gleich,G.J. (1989) J. Immunol. Methods 117, 91-97 33. Helm, B., Kebo, D., Verchelli, D., Glorsky, M., Gould, H., Ishizaka, K.,Gehe, R., a. Ishizaka, T. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86,9465-9469 34. Ravetch, J.V., Luster, A.D., Weinshank, R., Kochan, J., Pavlovec, A.,Portnoy, D.A., Hulmes, J., Pan, Y.-C.E., av Unkeles, J.C. (1986)Science 234, 718-725 35. Basciano, L.K., Berenstein, E.H., Kmak, L., a? i. Siraganian, R.P.(1986) J. Biol. Chem. 261, 11823-11831 36. Baniyash, M., Alkalay, I., a- Eshhar, Z. (1987) J. Immunol. 138,2999-3004 37. Stracke, M.L., Basciano, L.K., Fischler, C., Berenstein, E.H., a:.Siraganian, R.P. (1987) Mol. Immunol. 24, 347-356 -48-

Miroli, A.A., a. Spitz, M. (1987) J. Immunol. Methods 97, 185-190 39. Guyre, P.M., Graziano, R.R., Vance, B.A., Morganelli, P.M., ai .

Fanger, M.W. (1989) J. Immunol. 143, 1650-1655 40. Nisonoff, A. (1982) Introduction to Molecular Immunology,

Sinauer Associates lne., Sunderland, Mass. 41. Harlow, E. a Lané, D., eds. (1989), Antibodies, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Press, 625-631. 42. Goding, J. (1983) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,New York, Academie Press, lne., 119-124. 43. Ishizaka, T. a Ishizaka K., Progress in Allergy, 34, 188-235. 44. Lawlor E., W. Collins, a: B. 0'Connor. (1986). A čase of IgEMyeloma. Clin. Chem. 32:697. 45. Lui, F.T., M. Sinnecker, J. Hamaoka, a. D. Katz. (1979).Biochemistry 18:690. 46. Marinaga, Y., T. Franceschiri, S. Inouye, ai M. Inouye. (1984).Improvement of oligonucleotide-directed site-specificmutagenesis using double-strand plasmid. DNA Biotechnol. 2:636 47. Cullen, B. (1987). Use of eukaroytic expression technology in thefunctional analysis of cloned genes. Methods in Enzymology152:684. 48. Nikaido, T., A. Shimizu, N. Ishida, H. Sabe, K. Teshigawara, M.Maeda, T. Uchiyama, J. Yodoi, a . T. Honjo. (1984). Molecularcloning ofcDNÁ eneoding human interleukin-2 receptor. Nátuře311:631. 49. Isersky, C., A. Kulczycki, Jr., a- . H. Metzger. (1974). Isolation ofIgE from reaginic rat sérum. J. Immunol. 112:1909. 50. Kulczycki, A., Jr., a· H. Metzger. (1974). The interaction of IgEwith rat basophilic leukemia cells. II. Quantitative aspects of thebinding reaction. J. Exp. Med. 140:167. 51. Ishizaka, T., B. Helm, J. Hakimi, J. Niebyl, K. Ishizaka, a H. Goul(1986). Biological properties of a recombinant humanimmunoglobulin epsilon-chain fragment. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:8323. 52. Ishizaka, T., A. M. Dvorak, D. H. Conrad, J. R. Niebyl, J. P.

Marquette, a... K. Ishizaka. (1985). Morphologic and immunologiccharacterization of human basophils developed in cultures of cordblood mononuclear cells. J. Immunol. 134:532. -49-

Conrad, D. H., J. R. Wingard, and T. Ishizaka. (1983). Theinteraction of human a. rodent IgE with the human basophil IgEreceptor. J. Immunol. 130:327

Claims (21)

1. -') - - PATENTOVÉ R A/Η 9 '< Υ ιαη 1 . xonoklonólní ρspecifického navázánínotky lidského vysoce
2. 2. Fragment podle·valentní Fab fragment •otilátka nebo .její fragmentk alespoň jednomu enitopueďir.itního Fc IgE receptoru. scr.op.| /pOdjr‘ ΑΛ3Γ'31 ·/( d -Itíjd go vC udp ----------5 nároku 1 , kterým je mono- nebo bi-r ’ ? 6 HZ! 4 1 «·.
3. .· 3. líonokionální protilátka nebo její fragment "podle inároku 1 nebo 2, kde aminokyselinová sekvence podjede q i β 1notky lidského vysoce afinitního Fc IgE receptoru je násle-dující: s rF

   Val Pro Gin Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn^ Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gin His Gin Gin Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gin Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gin Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gin Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys
4. 4· Monoklonální protilátka nebo její fragment podle" kteréhokoliv z nároků 1-3, který blokuje navázání IgEk vysoce afinitnímu Fc IgE receptoru lidských basofilůnebo lidsckých mnstocytů. -51-
5. 5. Monoklonální protilátka nebo její fragment podlekteréhokoliv z nároků 1-3, která nestimuluje uvolnění his-taminu, je-li navázán na podjednotku vysoce afinitníhoíc IgE receptoru lidského basofilu nebo mastocytu.
6. 6. Monoklonální protilátka nebo její fragment podlekteréhokoliv z nároků 1-5, který je savčího původu.
7. 7. Hybridomová buňka sekretující monoklonální proti-látku podle kteréhokoliv z nároků 1-6.
8. 8. Monoklonální protilátka nebo její fragment podlekteréhokoliv· z nároků 1-6 jako terapeuticky účinná substance.
9. 9. Monoklonální protilátka nebo její fragment podlekteréhokoliv z nároků 1-6 jako diagnostický prostředek.
10. 10» Monoklonální protilátka podle kteréhokoliv z nároků1-6 pro čištění Λ podjednotky lidského vysoce afinitníhoEc IgE receptoru.
11. 11 * Způsob přípravy hybridomových buněk, které produ-kují monoklonální protilátky podle kteréhokoliv z nároků1-6,vyznačující se tím, že zahrnujea/ injikování polypeptidu, obsahujícího první aminokyseli- novou sekvenci odpovídající podjednotce lidskéhovysoce afinitního Ec IgE receptoru nebo její jakokolivfunkční sekvenci a druhou aminokyselinovou sekvenci,odpovídající transmembránové a cy toplasthatické oblastireceptoru, který umožňuje buněčnou povrchovou expresiuvedené podjednotky, smíšeného s přísadou savci a opakování injektace alespoň jednou až se objeví imunníodezva, b/ izolaci buněk, produkujících protilátku z uvedenéhos ave e, -52- c/ fúzi uvedených buněk s myelomovými buňkami a d/ výběr takových buněk ze získaných hybridomových buněk,které produkují požadovanou monoklonální protilátku*
12. 12. Způsob přípravy monoklonální protilátky nebo jejíhofragmentu podle kteréhokoliv z nároků 1-6,vyznačujíc í se t í m, že stupně a/ až d/ podle nároku 11 astupeň e/ zahrnující izolaci požadované monoklonální proti-látky ze supernatantu odpovídající hybridomové buňky jsouzde zahrnuty a,je-li to žádoucí, připraví se jejich frag-met metodami v oboru známými.
13. 13. Způsob čištění podjednotky lidského vysoceafinitního Fc IgE receptoru, vyznačující setím, že zahrnuje a/ kontakt vzorku s monoklonální protilátkou nebo jejímfragmentem,popřípadě spojenýu s pevným nosičem za pod-mínek takových, že se vytvoří komplex mezi monoklonálníprotilátkou nebo fragmentem a uvedenou podjednotkoupřítomnou ve vzorku, b/ oddělení vytvořeného komplexu ze vzorku a c/ izolaci komlexu uvedené podjednotky v purifikované formě.
14. 14. Způsob detekce přítomnosti podjednotky lidského vysoce afinitního Fc IgE receptoru ve vzorku, vyznaču-jící se t í m, že zahrnuje θ/ΚΌηtakt, vzorku popřípadě biologické kapaliny s monoklo-nální protilátkou nebo jejím fragmentem, jak je defino-vána v kterémkoliv z nároků 1-6, značenou detegovatelným -53- markerem, popřípadě enzymaticky nebo radioaktivně nebofluorescentně , pro vytvoření komplexu mezi monoklonál-ní protilátkou nebo fragmentem a uvedenou X podjednot-kou přítomnou ve vzorku a b/ detekci značeného komplexu a tím detekci přítomnostiuvedené podjednotky ve vzorku.
15. 15· Způsob detekce přítomnosti podjednotky lids-kého vysoce afinitního Fc IgE receptoru ve vzorku, vyzna-čující se tím, že zahenuje a/ kontakt vzorku s monoklonální protilátkou nebo jejímfragmentem jak je definováno v kterémkoliv z nároků1-6 pro vytvoření komplexu mezi monoklonální protilát-kou nebo fragmentem a uvedenou podjednotkou pří-tomnou ve vzorku, b/ Kontakt výsledného vzorku s detegovatelně značenouprotilátkou schopnou navázání k uvedené monoklonálníprotilátce nebo fragmentu pro vytvoření komplexu mezidetegovatelně značenou monoklonální protilátkou akomplexem ze stupně a/ a c/ detekci značeného komplexu ze stupně b/ a tak detekcipřítomnosti uvedené o\ podjednotky ve vzorku.
16. 16. Způsob stanovení množství IgE přítomného ve vzorku schopného navázání k \\ podjednotce lidského vysoce afi-nitního Fc IgE receptoru, vyznačující se tím,že zahrnuje a/ kontakt monoklonální protilátky nebo jejího fragmentujak je definováno v kterémkoliv z nároků 1-6, navázanouna pevný nosič se známým množstvím izolované X pod-jednotky lidského vysoce afinitního Fc IgE receptoru provytvoření komplexu mezi monoklonální protilátkou nebofragmentem a uvedenou X, podjednotkou, b/ kontakt komplexu ze stupně a/ se vzorkem pro navázaníIgE ve vzorku k uvedené -ý podjednotce tohoto komplexu -54- pro vytvoření nového komplexu,c/ kontakt nově vytvořeného komplexu ze stupně b/ se známým množstvím detegovatelně značené protilátky schopn né navázání k IgE a e/ stanovení množství IgE přítomného ve vzorku měřením množství detegovatelně značené protilátky ze stupně c/»
17. * 17· Farmaceutický přípravek, obsahující monoklonální protilátku nebo její fragment podle kteréhokoliv z náro-ků 1-6 a je-li to žádoucí, netoxický, inertní terapeutickypřijatelný nosičový materiál.
18. 18. Použití monoklonální protilátky nebo jejího frag-mentu podle kteréhokoliv z nároků 1-6 jako terapeutickéhočinidla.
19. 19. Použití monoklonální protilátky nebo jejího frag-mentu podle kteréhokoliv z nároků 1-6 jako terapeutickéhočinidla pro léčení alergických chorob.
20. 20. Použití monoklonální protilátky nebo jejího frag-mentu podle kteréhokoliv z nároků 1-6 jako diagnostickéhočinidla.
21. 21. Použití monoklonální protilátky nebo jejího frag-mentu podle kteréhokoliv z nároků 1-6 pro čištěni 4 pod-jednotky lidského vysoce afinitního Fc IgE receptoru·