PT95451A - Processo para a preparacao de composicoes aquosas estabilizadas de pequenos peptidos - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de inven ção de Immunobiology ' Research. Instituis. Inc. norte-americana, industrial e comercial, com sede em Soube 22 East

P,0. Box 999j Annandale, Ueisr Jersey 08801, Estados Unidos da América, (inventores*. Gideon Goldstein e !apan Audhya, residentes nos Estados Unidos da América), para "PROCESSO PARA A PRE PARAÇÃO DE OOMPOSIçQES AÇ,U03A3 ESTABILIZADAS DE PEGUEM) S PáPPLDQS"

DESCSIÇiO A presente invenção refere-se a um processo para a. preparação de composições estáveis para preparações de pêptidos de pequena dosagem para administração tera-peutica. Haia particularmente, a invenção refere-se a uma composição para estabilizar a timopentina numa baixa concentração .

Antecedentes da Invenção

Muitos pêptidos, particularmente os pêptidos com cerca de três a cerca de 20 arnino ácidos de comprimento , sao instáveis a baixas concentrações em composições aquosas e tendem a perder a sua actividade biológica, embora retenham a estabilidade e estrutura química. Existe também - 1 - um certo número de pêptidos maiores ou poliplptidos que sofrem uma perda semelhante de actividade após a utilização de concen trações aquosas de pequena dose, como por exemplo, encefalina, tuftsina, interleucina 2, e o neuropeptido do cérebro, .Substância P. Actualmente a única maneira de conservar a actividade biológica destes pêptidos em composições aquosas adequadas para dosagens clínicas por injecçao ê armazená-las em elevadas concentrações. Geralmente, as concentrações elevadas para armazenagem superiores a 50 mg/ml necessitam de condições de refrigeração rigorosas, por exemplo, entre 2 e 8°0, ou aproxi-madamente 4°Q. Concentrações menores, por exemplo inferiores a 10 mg/ml são frequentemente instáveis mesmo em condições de re frige raç ão rig o ro s as.

Uai exemplo de um péptido que sofre esta perda de actividade biológica a baixas concentrações em composições aquosas ê a timopentina, que I um pentapéptido de utilização e significado farmacológico elevado. Ver, Patente U.3. 4, 190,646 e Goldstein, G. Uature (London) 247; 11-14 (1974); Bach, R.S. e Goldstein, G., Proc. Hatl. Acad. 3oi. U.3.A., 71; 1474-1478 (1974); Scheid, M.P. e col, JA Exp. líed., 147: 1727-1743 (1973); Scheid, M.P. e col,

Science, 190: 1211-1213 (1975)s Ranges, G.E. e col, J.

Exp. Med,, 156: 1057-1064 (1982); Ϊ. Audhya e col.,

Biochem, 20 : 6195-6200 (1981); Venkatasubramanian, K. e col, Proc. CTatl. Acad, Soi. U.S.A., 83: 3171-3174 (1986); uai ai se M.G. e col. em "Immunor egul at ory UCLÂ Syraposium on Molecular and Oellular Biology", ed. Goldstein, G., e col (Liss, ITew York) (1986); Sunshine, G.H, e col, J.

Immunol., 120: 1594-1599 (1978) e E. Rentz e col, Arch. Gescln/ulstforsch, 54(2): H3-II8 (1948). Ver também Patentes U.S. 4,261,886; 4,361,673; 4,420,424; e 4,629,723. Estas referências e patentes são incorporadas aqui como referência pela sua apresentação da timopentina e processos para a sua preparação. - 2 -

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Has experiências com a timopentina, foi observado que as closes óptimas da timopentina numa composição aquosa injectável para imunoestimulação em animais de laboratório era de cerce, de 1 ^.g/kg de peso corpóreo. Para utilização laboratorial, estas dosagens foram preparadas imediata-mente antes da utilização. A investigação clínica humana posterior indicou que eram necessárias doses muito maiores, apro-ximadamente 1 mg kg de peso corpóreo ou superior, para produzir um resultado farmacológicamente clínico no paciente. As preparações de quantidades clínicas de timopentina para uma dosagem inferior a 10 mg/ml em composições aquosas revelaram ser frequentemente biologicamente inactivas, sendo assim responsáveis por uma falta de eficiência dessas composições de concentração inferior em estudos clínicos.

Esta perda de actividade num póptido para utilização farmacêutica podem afectar o tratamento terapêutico de um paciente que necessite de um pêptido farmacolo-gic amente activo particular. A perda de actividade na unidade de dosagem resultará num pêptido demasiadamente pouco activo proporcionado ao paciente nuraa unidade de dosagem normal * xssim, a dose adequadamente eficaz do pêptido não serê administrada ao paciente, ;3e a perda de actividade for inferior à'completa, essa perda variável tornará ímpossivel uma dosages: farmacêutica prática determinada com precisão. 0 aumento sim ples do nível de dosagem do pêptido para compensar essa perda não ê prático dado que o grau de perda será desconhecido e as dosagens em excesso de muitos produtos farmacêuticos conduzem a um risco aumentado de efeitos lacerais adversos sérios.

Estes processos ineficazes para compensar a perda de actividade do pêptido aumentarão também o c lis to do composto farmacêutico em questão. A refrigeração adicional entre cerca de 2-8°0 é necessária para manter a actividade biológica de certos péptidos e polipéptidos, incluindo a timopentina. Por - 3 -

exemplo, concentrações de timopentina de 50 mg/ml necesitam de refrigeração para reterem a actividade até e depois de dois anos, que é o padrão industrial convencional para composições farmaceuticamente estáveis. Concentrações inferiores dão frequentemente origem a uma não retenção da actividade mesmo com refrigeração. Esta necessidade de uma refrigeração destes plptidos em dosagens farmacêuticas prefudica bastante a produção, armazenagem, transporte e utilização desses pépti-dos. Por exemplo, a falta de refrigeração ou a flutuação na temperatura da refrigeração durante o transporte destes pépti dos para utilizações terapêuticas ou outras ou durante a armazenagem destes péptidos, £>or exemplo, em países em que não existem instalações clínicas e farmacêuticas adequada.s, podem evitar a utilização eficaz desses péptidos, mesmo em concentrações superiores.

Existe a.ssim a necessidade de um proces sos para a preparação de péptidos terapêuticos numa composição aquosa, de forma, a que eles retenham a actividade biológica nas suas quantidades clínicas.

Resumo dg. Invenção

Ifum dos aspectos, a presente invenção proporciona um processo para a preparação de composições aquosas biologicamente activas de péptidos terapeuticamente acti-vos que sao estáveis à temperatura ambiente.

Como outro aspecto cia presente invenção ê proporcionado um processo para a preparação de composições aquosas biologicamente activas com baixas dosagens de péptidos terapeuticamente activos, que retem a sua actividade biológica

Hum outro aspecto ainda adicional, a invenção proporciona uma composição aquosa estável de um pépti do produzido pelos processos da invenção. Como realização - 4 - preferida, a invenção proporciona uma composição aquosa estável de timopentina,

Outros aspeotos e vantagens da presente invenção sao ainda descritos na seguinte descrição detalhada da presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos Λ 7ig. 1 é um gráfico da estabilidade de uma composição de timopentina preparada de acordo com esta invenção, comparada com uma composição convencional de timopentina contendo um conservante convencional. h Big. 2 ê um gráfico de barras com os resultados de um ensaio de estabilidade de composições de timopentina com e sem a presença de aminoácidos em várias condições de temperatura de armazenagem. L I?ig. 3 e um gráfico de um estudo de várias concentrações de timopentina em composições desta invenção, comparadas com outras composições, sob temperaturas elo vadas de armazenagem.

Descrição Detalhada da Presente Invenção A presente invenção proporciona um pro cesso para a estabilização de composições aquosas de péptidos farmacologicamente úteis. 0 processo confere estabilidade a concentrações de dosagens interiores a 10 mg/ml de péptidos que normalmente demonstram uma perda de activids.de biológica em condições de refrigeração rigorosas. Állm disso o processo provou ser útil no aumento da estabilidade com o tempo d© grandes concentrações superiores a 10 mg/ml de péptidos em composições aquosas, sem necessidade da sua refrigeração. - 5 -

Quer os pequenos péptidos com 3 a 20 aminoáci&os de comprimento quer os péptidos maiores que também apresentam perda de actividade por armazenagem ou que necessitam de refrigeração para reter a actividade biológica podem ser preparados de a.cordo com este processo. Um exemplo de um pequeno pêptido desses que sofre perda de actividade biológica é a timopentina. Um exemplo de um pêptido maior que sofre essa perda de actividade biológica ê a IL-2.

De acordo com o processo de presente invenção, e preparado um pêptido escolhido num tampão convencional famaceuticamente aceitável. Dado que o tempão é para ser utilizado na preparação de um produto terapêutico, desejavelmente para utilização em seres humanos, ele deve ser não tóxico e susceptível de utilização segura em seres humanos. Embora possam ser escolhidos pelos especialistas, vários tampões que cumprem estas qualificações, um tampão preferido de acordo com esta invenção é o tampão de citrato. Outros tempões que podem ser utilizados neste processo incluem o tampão de Hepes, tampão de succinato, tampão de histidina, ou tampão de maleato.

Adicionalmente, de acordo com a presente invenção, o pêptido tamponado é desejavelmente preparado a um valor de pE adequadamente controlado. Para péptidos como a timopentina para administração humana, o valor do pH encontra· -se desejavelmente na gama de cerca de 6,8 a cerca de 7/!-. Õontudo, podem ser utilizáveis outras condições de pE e elas podem variar dependendo do pêptido escolhido, tendo em consideração a cerca média da molécula de pêptido. A escolha adequada de pl-í para a solução aquosa pertence ao especialista. Q valor do pli pode ser ajustado com ácidos e bases adequados, que são fisiologicamente seguros para utilização no homem.

Por exemplo, uma base adequada para estes ajustamentos de pH ê o hidróxido de sódio. Pode também ser utilizado para o ajustamento do pH neste processo um ácido como por exemplo o ácido c1orídr ic o. - 6 -

De acordo com a invenção, prepara-se uma solução do pop ti cio escolhido, por exemplo, timopsntina, no tampão escolhido. 1 solução inclui desejavelmente uma con eentração entre 1 jig e 100 mg de péptido por cada mililitro cie um tampão adequado. Para a timopentina, a concentração desejada tem entre 1 a 100 mg. Deve também entender-se pelo especialista que a escolha da concentração do péptido na solução depende do péptido escolhido, e que as gamas de concentração acima referidas não são críticas para todos os péptidos pretendidos que sejam estáveis pelo processo desta invenção. a escolha de outras concentrações para péptidos seleccionados da timopentina está dentro dos conhecimentos dos especialistas. a.apresentação aqui feita não se limita a gamas de concentração específicas.

Jt solução de péptido adequada é adicionada uma quantidade suficiente de uma molécula de aminoácido para estabilizar a solução. Entre os aminoácidos preferidos para utilização neste processo encontra-se a glicina, lisina, arginina, glutamina, ácido aspártido, e histidina. 0 aminoáci do actualnente aais preferido para utilização neste processo é a glicina. Embora esta invenção não se comprometa com a teoria, pensa-se actualmente que as cargas na molécula de ami-noácido aumentam a estabilidade das composições aquosas dos péptidos. 0 aminoácido escolhido é adicionado à solução diluída do péptido numa concentração compreendida entre 0,1 e 5% em peso. Uma gama preferida é de 1 a 3% em peso. hctualmente a concentração mais preferida do aminoácido na solução de timopentina é de 2% em peso. i. composição aquosa resultante do péptido escolhido é estável durante a armazenagem à temperatura ambiente, aproximadamente a 23°0. Hão é necessária refrigeração para manter a actividade biológica de uma composição aquosa - η -

Por do péptido preparado de acordo com o presente processo, exemplo , estuaos ae esóabilxzaçao em composiçoes de timoOen— tina a concentrações de 50 mg/ml preparadas de acordo com este intenção mos oraram que esras composiçoes permanecem estáveis durante períodos superiores a 90 dias a 37°C ou à temperatura ambiente. Qom base em padrões de ensaio farmacêutica— mente aceitáveis, pensa-se que se a preparação for estável a 37 0 durante p meses, essas composiçoes serão estáveis durante dois anos à temperatura ambiente, 23°C. 0 processo de estabilização da presente invenção é adequado para utilização na preparação de formas de dosagem de vários péptidos terapêuticos, incluindo, mas -não se limitando a, timopentina, timoralina, esplenoralina, bormon^. de crescimento, enceíalina e factor de necrose de temores. JL esoollia e o tipo de péptido sujeito a este processo de prepara ção e de estabilização não é crítica para esta invenção. Lssiu. este processo não se limita ao péptido particular, mas I geral mente útil em vencer a instabilidade biológica de qualquer péptido ou proteína numa composição aquosa adequada para dosagens injectáveis.

Os seguintes exemplos ilustram o proces so para a preparação de uma composição aquosa estável de péptidos de um péptido exemplar, por exemplo timopentina. Estes exemplos são apenas ilustrativos e não limitam o âmbito da presente invenção. j?LQ 1

Para preparar uma composição de timopen tina de acordo com a presente invenção, são combinados os seguintes ingredientes num lote de 20 litros; 1000,0 g (50,0 mg/ /ml) de timopentina ajustada para o teor do péptidos 400.0 g (20.0 mg/ml, 2%) glicina (USP)5 176.0 g (8.8 mg/ml) citrato ie sódio (0E20, USP); (Farmacopeia Korte americana); e aproxi-madamente 15 litros de água para injecções (Farmacopeia Sorte Americana ou Farmacopeia Europeia). 0 processo para a preparação da composição utilizando coel os ingredientes acima referidos ê o seguinte . São introduzidos aproxima&amente 15 litros de água para injecções num recipiente de aço inoxidável ou de vidro adequados. .3ão adicionados 400 g de glioina e agita-se até dissolução. 3ão era seguida adicionadas 176,0 g de citrato de sódio (Zi^O) e a mistura resultante é agitada até a solução ficar transparente. & adicionada a quantidade adequada de ti-raopentina, aproximadamente 1,163 gramas, ajustada ao teor de péptidos, enquanto se continua agitando lenta para evitar a formação de espuma até toda a timopentina se encontrar dissolvida e a solução ser transparente. 0 valor do pH da solução resultante ê verificado e ajustado para pE 7,0 - 7,2 utilizando laOE II. 3e necessário, o valor de pH pode ser ainda ajustado com HGl II. Ê adicionada água para injecções para perfazer ao volume de 20 litros. L mistura é agitada até estar corapletamente misturada. L solução é pré-filtrada utilizando um peneiro molecular de Hillpore iP 15 (ou um filtro equivalen te que tenha, sido enxaguado cora água para injecções) para remover quaisquer contaminantes baterianos, pó ou outros materiais insolúveis da solução. Era seguida a mistura pré-filtra da I de novo filtrada através do filtro esterilizado Durapore de 0,22 micrometros. ção de timopentina de mento descrito, acima

Gomo conorolo, prepara-se uma composi-forma idêntica de acordo com o procedi-com a excepção de não ser adicionada glioina a solução. 1L0 2

Para demonstrai"1 a estabilidade das composições desta invenção as composições de timopentina do Exem- - 9 - •pio 1 e outras composições são guardadas em ampolas contendo 1,3 ml/ampola a aproximalamente 24°C e/ou 37°C durante aproxi-nadamente 3 meses, As Siguras 1 a 3 demonstram os resultados destes tempos de armazenagem e condições de armazenagem nas composições de timopentina.

Periodicamente durante e após a armazenagem, as composições são ensaiadas para a determinação da actividade "biológica de acordo com o ensaio cícli G-AP. Este ensaio e conhecido dos especialistas e e referido nas paten-tes Sorte Americanas e outras referencias so"bre a timopentina acima referidas. As composições resultantes preparadas de acordo com esta invenção contêm timopentina estável, o que demonstra a actividade biológica total neste ensaio convencional da timopentina. 0 ensaio cie cGiíP mede a capacidade de uma composição de peptido desta invenção para se ligar ao receptor da membrana celular OEM e estimular selectivamente a produção do SAP cíclico. Duma maneira breve, a linha de células OEM foi obtido da American T;ype Oulture Collection of Pockville, Mcl, As células CEM foram mcleadas frescas e cultivadas durante 4 dias com recolha da forma descrita em I.

Audhya e col, Arch. Biochem Biophys., 234: 167-177 (1984).

As células foram lavadas 3 vezes em PB3 e ressuspenss.s em iíPml 16¾) 3. "LLÍiXoL G Oilo Ô3Q. ϋ x o.Ç clO Xô 1 ^0 Pi. 107 0©l*Ul3vS\ 1 - O XOx*cUíL cieixacla.s equilibrar a 37 0 durante 30 minutos antes da adição de composições de ensaio de peptido (25juL) e composições de controlo de peptido. A incubação foi deixada prosseguir num oarmo de água com agitação durante 4-p minutos e foi em seguida terminada por adição de 1 ml de ácido tricloroacético a 10% (PCA) refrigerado com gelo.

As células em TOA foram homogeneizadas bratadas com som para libertar nucleótido cíclioo. A suspen-^ são foi csntrifugada a 3000 x g durante 20 minutos a 4°C. 0 10 - precipitado resultante foi dissolvido em H'aOH 0,1 Έ para deter minar o teor de proteína. Foi removido o ICA da fracçao sobre nadante por extracção por 4 vezes com 5 4L de éter dietílico saturado com água. Após a extracção final, foram removidos os traços remanescentes de éter por aquecimento durante 10 minutos num bando de água a 50°0, Após a liofilização a amostra foi reconstituída em tampão de acetato 50 mil (pH 6,2) para um radioimunoensaio de GAP cíclico.

Foi determinado o limiar de actividade da composição de pêptido ensaiada. Este valor e definido como a concentração mínima da composição de ensaio induzida a ou nível intracelular de Gífi? cíclico superior a dois desvios padrão acima, do controlo. Os controlos tiniiam valores de G-MP intracelulares cíclicos inferiores a 0,5 picomoles/ml (media + desvio padrão). Os resultados dos ensaios foram considerados positivos se o teor de GAP cíclico for superior a 2 vezes (2 desvios padrões) ao 'determinado para o controlo negativo paralelo.

As Figuras 1-3 demonstram a eficiência do processo da presente invenção na timopentina. Ha Figura 1, foi comparada a estabilidade relativa da solução de controlo de timopentina contendo metil e propil parabéns e sem aminoá-cidos com a glicina, composição isenta de conservantes descrita no Exemplo 1 em armazenagem a 37°G com o tempo. Foi comparada uma concentração inicial de 52 mg/ml de timopentina preparada de acordo com a presente invenção com um padrão de 50,17 mg/ml de composição de timopentina. Eo estudo de 90 dias, a composição da presente invenção apresentava uma. diminuição na actividade biológica de 52 mg/ml para aproximadamen te 50 mg/ml. Pelo contrário as composições padrão diminuíam de actividade biológica de uma dosagem eficaz de 50,7 mg/ml para uma dosagem eficaz de 42 mg/ml. - 11 A Figura 2 revela outro tipo comparativo de actividade biológica da solução de timopentina, nuas. concentração de 1 mg/ml, feita de acordo com o Exemplo 1 possuindo 2/ de glicina presente na solução e comparada com uma solução de controlo de timopentina, não possuindo aminoácido. Qs estudos de estabilidade foram conduzidos durante três meses à temperatura ambiente, por exemplo, a 23°G e a uma temparatura elevada de 3^°G· A solução de timopentina da presente invenção revelou estabilidade até três mesos e mais à temperatura de armazenagem. 0 controlo sem aminoácido era inactivo sempre a estas temperaturas. A Figura 3 é um gráfico de um bioen-saio efectuado numa solução de timopentina preparada de acordo com a presente invenção. Prepararam-se três soluções cie timopentina a concentrações de 1 mg/ml com (a) 2% de glicina,

Co) glicina, (c) albumina de soro liumano, e (d) sem adi tivo. Esta soluções foram armazenadas a duas temperaturas, 24° 0 e 3?°0 até três meses. As soluções foram ensaiadas num ensaio de cGLP periodicamente durante o tempo de armazenagem. Todas estas soluções excepto o controlo demonstraram estabilidade até três meses em ambas as temperaturas de armazenagem. li solução de timopentina sem ami no ácidos ou albumina, de soro humano não retinbam actividade biológica no ensaio cG-mP em qualquer altura às temperaturas deste ensaio. A albumina do soro liumano também aumentou a estabilidade da solução de timopentina., mas não é um estabilizante preferido num composto terapêutico devido aos perigos de transmissão virai do soro . 0 gráfico inferior da Figura 3 demons tra a armazenagem de soluções de timopentina preparadas de acordo com a presente invenção a várias concentrações de timopentina e glicina, mas em condições de armazenagem de três meses e 37°C. (a) 0,05 mg/ml de timopentina com 3/ de glicina; (b) 0,5 mg/ml de timopentina com 3% de glicina, (c) 5 mg/ml - 12 -

Claims (1)

1. '3-e timopentina com 3% de glicina, e (d) 50 mg/ml de timopentina com 2/ de glioina, Iodas estas composições preparadas de acordo com a presente invenção permanecem estáveis, como evidenciado pela actividade no bioensaio de oGráB, ao longo de 3 meses de armazenagem. .3ao incluídas na especificação acima mencionada várias modificações e variações da presente invenção que se pensa serem óbvias para o especialista. Por exemplo , embora a timopentina fosse o péptido ensaiado e referido nos Sxemplos anteriores, e de esperar que outros péptidos possam ser tratados por este processo e também referem actividade en condições severas de armazenagem, por exemplo temperaturas elevadas. 33 st as modificações e alterações às composições e processos da presente invenção devem ser consideradas como dentro do âmbito das reivindicações anexas. I ? I 1? D I ΰ A v Ô E 3 - lâ Processo para a. preparação de uma composição estável de um péptido farmacêutico caracterizado por se estabilizar uma solução do referido péptido mm tampão aquoso fisiológicamente aceitável com 0,1 a 5% em volume de um amino ácido, mantendo a referida composição de péptido a sua actividade biológica a temperaturas superiores à temperatura ambiente. - 2& Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a concentração do referido amino ácido ser de 2% em volume. - 13 - - - - - j caracterizado o^xpo consistindo aoido aspártico, 'Processo de acordo com a reivindicação por o referido amino ácido ser escolhido no em glicina, arginina, lisina, glutamina, e iiistidina. - 4a - de acordo com a reivindicação tampão ser tampão de citrato. de acordo com a reivindicação amino ácido ser a glicina. Processo 1, oara.cteriza.do por o referido - 5S Processo 2, caracterizado por o referido - 6B - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida composição de pêptido possuir um valor de pí-I compreendido entre 6,2 e 7,4. - _ Processo de ac.ordo com a reivindicação 1 caracterizado por o referido pêptido ser a timopentina. Á requerente reivindica a prioridade do pedido norte-americano apresentado em 28 de Setembro de 1989 sob o 12. 07/4-13,841. Lisboa, 27 de Setembro de 1990

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