PT618808E

PT618808E - Composicoes farmaceuticas contendo gonadotrofina com estabilizador de sacarose

Info

Publication number: PT618808E
Application number: PT93901557T
Authority: PT
Inventors: Fabrizio Samaritani; Patrizia Natale
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 1991-12-18
Filing date: 1992-12-17
Publication date: 2000-07-31
Also published as: ATE189608T1; CA2124801C; DE69230672T2; GR3033276T3; JPH07507047A; CA2124801A1; WO1993011788A1; EP0618808B1; DK0618808T3; US5650390A; EP0618808A1; ES2142860T3; AU677773B2; ITRM910952A0; AU3266293A; JP3702313B2; DE69230672D1; ITRM910952A1; IT1250075B

Description

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DESCRIÇÃO "Composições farmacêuticas contendo gonadotrofina com estabilizador de sacarose" A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas contendo gonadotrofina. Mais precisamente, refere-se a composições de gonadotrofinas estabilizadas com sacarose. As gonadotrofinas da presente invenção compreendem FSH (Hormona Folículo Estimulante), LH (Hormona Luteinizante) e hCG (Gonadotrofina Coriónica Humana). É sabido que as proteínas altamente purificadas são instáveis no tempo e são estabilizadas, por exemplo, por mistura com sacáridos, tais como lactose e manitol ou então com proteínas e aminoácidos tais como a albumina e a glicina. Outros compostos de elevado peso molecular, possuindo uma origem biológica tais como, por exemplo, os colóides marinhos, dextrano e outros polissacáridos e os fosfolípidos actuam frequentemente igulamente bem. De qualquer modo, uma vez que as gonadotrofinas da presente invenção são administradas parentericamente, estes excipientes não são adequados para uma composição injectável devido à sua alergenicidade ou à sua insuficiente solubilidade, nalguns casos devido à sua potencial toxicidade ou a um concurso destes efeitos. A composição de proteínas liofilizadas é descrita em M. J. Pikal, BioPharm, Outubro 1990, 25-30. Existem exemplos relatados de proteínas tais como a hormona do crescimento e a ribonuclease A, formuladas usando excipientes estabilizadores tais como manitol, glicina, arginina e lactose.

Em particular, é descrita a liofilização de proteínas na presença de várias substâncias no seu estado amorfo, como açucares, que aumentam a temperatura de colapso e permitem obter tempos de liofilização mais curtos. No entanto, não é praticável, de acordo com o autor, proporcionar uma formulação padrão para todas as proteínas e a escolha da melhor formulação requer um trabalho apreciável de selecção. A patente alemã DE 3520228 descreve proteínas bioactivas tais como linfoquinas, interferões, TNF (Factor de Necrose de Tumores), insulina, hormona do crescimento, em formulações que são estabilizadas por meio de polissacáridos compreendendo unidades repetitivas de maltotriose. A utilização de sacarose como

83 793 ΕΡ Ο 618 808/ΡΤ 2 agente estabilizador é conhecida, por exemplo, numa formulação de orgoteina liofilizada, como descrito na patente U.S. 3,637,640. O pedido de patente internacional WO 89/10407 descreve a formulação com sacarose de M-CSF (Factor Estimulante de Colónias de Macrófagos); o pedido de patente WO 89/09610 descreve, por sua vez, formulações de TNF que foram estabilizadas com albumina, dextrano, polietilenoglicol, 80 polissorbato PVP™, lactose, trialose ou mesmo sacarose.

As formulações injectáveis de gonadotrofinas são obtidas por um processo que inclui a sua liofilização de forma a obter um pó seco. As gonadotrofinas são altamente conduzíveis a desnaturação durante o processo de liofilização e é desejável obter formulações estáveis capazes de manter um ciclo de vida mais longo quando são armazenadas à temperatura ambiente. A Patente U.S. 3,816,617 sugere a preparação de aplicações vaginais de gonadotrofinas usando lactose, amido ou sacarose como veículo. No entanto, não é contemplado o problema de estabilização de gonadotrofinas purificadas. A Patente Japonesa 2-121933 menciona composições de hormonas oleosas para animais, amido e sacarose, em que o amido é o agente estabilizador. A Patente Europeia EP 448146 descreve preparações contendo gonadotrofina liofilizada, que são estabilizadas por meio de um sal de ácido bicarboxílico, tal como, por exemplo ácido cítrico, ácido tartárico e ácido aspártico. A Patente Europeia número EP 388223 descreve preparações de FSH recombinante e sugere que estabilizadores adequados, por exemplo sacarose, maltose e semelhantes, poderão ser necessários para melhorar o tempo de vida em prateleira.

As gonadotrofinas disponíveis no mercado são estabilizadas por meio de sacáridos, por exemplo a hCG é estabilizada por meio de manitol (ProfasiR, SERONO) e a FSH é estabilizada por meio deJactose (MetrodinR, SERONO).

Verificou-se agora que a sacarose confere uma melhor estabilidade à formulação de gonadotrofinas e em particular à forma destas glicoproteínas que foram preparadas pela técnica de ADN recombinante. 83 793 ΕΡ Ο 618 808/ΡΤ 3

Ο principal objectivo da presente invenção é proporcionar uma composição farmacêutica compreendendo uma mistura íntima sólida de uma gonadotrofina, tal como FSH, LH ou hCG e uma quantidade estabilizadora de sacarose em combinação com glicina. Preferivelmente, a composição contém 75 ou 150 U.l. de FHS e 30 mg de sacarose ou contém 75 ou 150 U.l. de LH e 47,75 mg de sacarose. Preferivelmente, o pH da solução é de desde 6,5 a 8,5, preferivelmente 7 para uma formulação de FSH e pH 8 para uma formulação de LH.

Um outro objectivo é proporcionar um processo para a preparação da referida composição farmacêutica. O processo compreende a preparação de uma solução aquosa dos componentes, opcionalmente a sua distribuição em recipientes, a secagem ou liofilização dos componentes e opcionalmente a distribuição da mistura sólida obtida em recipientes. Preferivelmente, o pH da solução é de desde 6,5 a 8,5, preferivelmente 7 para uma formulação de FSH e pH 8 para uma formulação de LH. Outro objectivo é proporcionar uma forma de apresentação da referida composição farmacêutica, compreendendo a referida mistura sólida hermeticamente fechada numa condição estéril num recipiente adequado para armazenagem antes da utilização e adequado para reconstituição da mistura para substância injectável.

Outro objectivo é proporcionar uma solução para a referida mistura sólida reconstituída numa solução injectável. De forma a avaliar o efeito do excipiente sobre a estabilidade dos ingredientes activos, foram preparadas várias formulações de FSH recombinante contendo 150 U.l. por frasco com vários excipientes: lactose, sacarose, glicina, sacarose mais glicina, lactose mais albumina e lactose mais glicina. Todas as formulações foram preparadas por dissolução dos excipientes em tampão fosfato a pH 7, excepto a formulação com lactose (10 mg) que foi dissolvida em H2O para injecção e ajustada a pH 6,4.

As amostras foram armazenadas a 45°C e testadas por meio de um ensaio biológico a intervalos de tempo fixos. As tabelas 1 e 2 dão os resultados dos testes efectuados sobre dois lotes diferentes de FSH recombinante na presença de diferentes excipientes, após 2 e 4 semanas para o lote 1 (Tab. 1) e após 1 e 3 semanas para 0 lote 2 (Tab. 2).

Os testes biológicos foram efectuados de acordo com as regulamentações da Farmacopeia Europeia e efectuados em duplicado. Os testes para FSH e LH 4 BB 7Q”í ΕΡ Ο 618 808/ΡΤ são relatados na monografia "Menotropin" enquanto que o teste para hCG é relatado na monografia "Chorionic Gonadotropin".

Tabela 1

Lote 1 de FSH recombinante U.l.

Excipiente Quantidade (mg) Título teórico T=0 45°C 2 semanas 45°C 4 semanas Lactose 10 167,31 129,0 139,0 104,0 Lactose 30 167,31 132,0 118,0 116,0 Sacarose 30 167,31 158,0 163,0 136,0 Sacarose 50 167,31 140,0 135,0 150,0* Sacarose + Glicina 20 + 10 167,31 144,0 143,0 186,0 Lactose + Albumina 20 + 3 167,31 127,0* 134,0 128,0 Glicina 20 167,31 132,0 107,0 - Lactose + Glicina 20 + 10 167,31 153,0 132,0 104,0 * válido apenas um ensaio

Tabela 2

Lote 2 de FSH recombinante 150 U.l.

Excipiente Quantidade (mg) Título teórico T=0 45°C 1 semana 45°C 3 semanas Lactose 10 155,08 163,0 121,0 103,0 Lactose 30 155,08 164,0 166,0 108,0 Sacarose 30 155,08 165,0 128,0 151,0 Sacarose 50 155,08 150,0 143,0 157,0* Sacarose + Glicina 20 + 10 155,08 160,0 152,0 185,0 Lactose + Glicina 20 + 3 155,08 172,0 136,0 101,0 Glicina 20 155,08 136,0 115,0* 97,0* Lactose + Albumina 20 + 10 155,08 171,0* 137,0 157,0 * válido apenas um ensaio

Os resultados mostram que as formulações mais estáveis de entre as testadas são as que contêm sacarose, i.e. formulações com sacarose sozinha ou

83 793 ΕΡ Ο 618 808/ΡΤ 5 com sacarose mais glicina. A sacarose revela, surpreendentemente, ser um agente estabilizador eficiente contra a desnaturação das gonadotrofinas.

Os agentes estabilizadores que são empregues nas composições da presente invenção incluem portanto, sacarose sozinha ou em combinação com outros excipientes, preferivelmente aminoácidos tais como glicina. Em particular, foi estudada a estabilidade da FSH recombinante e da LH recombinante.

As gonadotrofinas produzidas de acordo com a técnica do ADN recombinante devem ser submetidas a um processo de elevada purificação de forma a evitar agentes de contaminação de origem não humana e esta elevada pureza torna-as menos estáveis do que as gonadotrofinas urinárias correspondentes.

As gonadotrofinas recombinantes da presente invenção foram preparadas por expressão em células CHO (Ovário de Hamster Chinês), transformadas com o ADN recombinante correspondente, de acordo com a técnica descrita nas Patentes Europeias EP 160699 e EP 211394. O estudo aprofundado das formulações contendo ADN recombinante foi efectuado usando diferentes composições, de acordo com o esquema da Tab.3, compreendendo respectivamente: a) lactose, b) sacarose, c) sacarose mais glicina.

Tabela 3

Formulação de FSH recombinante

Composição Dosimetria U.l. Lactose mg Sacarose mg Glicina mg Na?HP04.2H90 mg NaH?P04.H?O mg a 150 10 - - - b 150 - 30 - 1,11 0,45 c 150 - 20 10 1,11 0,45 A preparação do liofilizado foi efectuada diluindo a totalidade da gonadotrofina com uma solução do excipiente em água para injecção (formulação "a") ou tampão fosfato 0,01 M (formulações "b" e "c") de forma a obter a concentração de 200 U.l./ml, ajustando o pH a 6,4 para as formulações contendo lactose e a 7 para as formulações contendo sacarose ou formulações contendo

7Q^

EP 0 618 808/PT 6 sacarose mais glicina. A solução foi filtrada, levada ao volume final com a solução de excipiente remanescente de forma a alcançar a concentração de 150 U.l./ml e liofilizada. A estabilidade acelerada destas formulações foi estudada de forma a que a estabilidade das mesmas possa ser prevista quando são armazenadas em recipientes à temperatura ambiente, por extrapolação dos resultados obtidos a temperaturas mais elevadas (+37°C; +45°C; +50°C). A estabilidade acelerada das formulações de FSH foi determinada por meio do teste de actividade biológica, efectuado aos intervalos de tempo que são apresentados nas Tabelas respectivas.

Usaram-se duas preparações em ampola de HMG (Menotropina) como soluções padrão, a primeira possuindo uma biopotência de 101,3 U.l. de FSH/ampola e 85,6 de U.l. de LH/ampola, a segunda possuindo uma biopotência de 103,1 U.l. de FSH/ampola e 82,3 U.l. de LH/ampola. As amostras nas concentrações de 0,5; 1,0 e 2,0 U.l./ml bem como as soluções padrão de HMG, foram administradas a três grupos diferentes de cinco ratos cada, por meio de injecção sub-cutânea de 0,5 ml/rato duas vezes por dia durante três dias consecutivos (doses finais; 1,5; 3,0; 6,0 U.l. de FSH/rato). Cada animal recebeu ainda de uma só vez uma dose de 40 U.l. de hCG.

Os resultados apresentados na Tabela 4 referem-se a formulações de 3 lotes diferentes de FSH recombinante, contendo 150 U.l./ml de FSH, na presença de 10 mg de lactose (Composição a), 30 mg de sacarose (Composição b) e 20 mg de sacarose mais glicina (composição c ) em frascos de 5 ml. Os testes foram efectuados à temperatura de 37°C, 45°C e 50°C. (Segue Tabela 4)

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Estudo da estabilidade acelerada de formulação de FSH recombinante (3 lotes diferentes - Lote 1, Lote 2 e Lote 3 contendo 150 U.l./ml FSH) com 10 mg de lactose (Composição a), 30 mg de sacarose (Composição b) e sacarose (20 mg) + glicina (10 mg) (Composição c) em frascos E LDQ) T3 co <ki T- in cn c\i <n

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A degradação é significativa para as formulações que contêm lactose em todas as temperaturas de teste e em todos os três lotes. Pelo contrário, não se observa variação apreciável na formulação contendo sacarose do lote 1 às mesmas temperaturas. Para a formulação contendo sacarose mais glicina, relativa ao primeiro lote, a única degradação apreciável é observada a 50°C. Para as formulações contendo sacarose ou sacarose mais glicina dos restantes lotes, observa-se uma degradação que é de qualquer forma menor do que a da formulação contendo lactose. A Tab. 5 dá mais resultados de estabilidade acelerada, derivados pelos resultados de actividade biológica, para 2 lotes diferentes (lote 1 e lote 2) de formulações de FSH recombinante contendo 150 U.l./ml de FSH e 30 mg de sacarose em frascos de 3 ml. (Segue Tabela 5) 83 793 ΕΡ Ο 618 808/ΡΤ

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EP 0 618 808/PT 0 estudo foi efectuado em frascos armazenados durante 5 semanas à temperatura de 50°C ou durante 10 semanas à temperatura de 45°C ou durante 12 semanas à temperatura de 37°C. Novamente, não se observou variação de actividade em todas as temperaturas de teste para ambos os lotes. A estabilidade forecast à temperatura ambiente, apresentada na Tabela 6 e extrapolada a partir dos resultados de estabilidade acelerada da Tabela 5 de acordo com o método de Garret (Garret E.R., J. Pharm. Sei., 51:811, 1962) revela uma degradação de cerca de 35% e 30% após dois anos de armazenagem, respectivamente para as formulações contendo lactose.

Tabela 6

Estabilidade previsível de formulações de FSH recombinante (150 U.l.) à temperatura ambiente

Composi ção Excipiente Recuperação de Actividade (%) 4°C 1 ano 2 anos 25°C 1 ano 2 anos a Lactose 79,30% 62,89% 41,57% 17,28% b Sacarose 99,61% 99,22% 96,86% 93,82% c Sacarose + Glicina nenhuma nenhuma degradação degradação Não é prevista degradação a 4°C para as formulações com sacarose ou sacarose mais glicina, enquanto que apenas é prevista uma diminuição de 6% para as formulações contendo sacarose após dois anos a 25°C.

Foi estudada a estabilidade das formulações de LH recombinante (75 U.l.) com 50 mg de sacarose (Composição a) e 50 mg de lactose (Composição b). A composição exacta das formulações de LH recombinante é apresentada na Tabela 7.

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Tabela 7

Composição de formulações de LH recombinante (75 U.l.) com 50 mg de sacarose (Composição a) e 50 mg de lactose (Composição b) em frascos de 3 ml

Composição Excipiente Quantidade (mg) a Sacarose 47,75 NaH2PC>4. H2O 0,052 Na2HP04.2H20 0,825 b Lactose 50,00 NaH2P04.H2O 0,052 NapHPO*.2H9O 0,825 O estudo da estabilidade acelerada de tais formulações armazenadas a 37°C, 45°C e 50°C, determinada por meio do teste de actividade biológica medida em U.l. (Tabela 8) revela o que já tinha sido observado para as formulações de FSH: a degradação das formulações contendo sacarose é extremamente baixa, enquanto que a degradação das formulações contendo lactose é mais evidente. A previsão da estabilidade à temperatura ambiente, estabilidade extrapolada pelos resultados de estabilidade acelerada da Tabela 8 de acordo com o método de Garret (Garret E. R., J. Pharm. Sei., 51:811, 1962) é apresentada na Tabela 9. (Segue Tabela 8) 12 83 793 ΕΡ Ο 618 808/ΡΤ Ε CO φ α cnο ο <Λ 03

=) ιη φ 4—» c 03 C 1ωΕο ο φ ι_ X cow φ co φ "Ο C/3 φ<ο ο 03

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Tabela 9

Previsão da estabilidade de formulações de LH recombinante (75 U.l.) à temperatura ambiente

Composições Excipiente Recuperação de actividade (%) após 2 anos 4°C 25°C a Sacarose 99,68% 90,65% b Lactose 80,56% 19,86% É calculada uma degradação de cerca de 20% e 8% respectivamente para as formulações de lactose armazenadas durante dois anos a 4°C e 25°C. As formulações contendo sacarose permanecem inalteradas durante dois anos a 4°C e é calculada uma diminuição de apenas 9% para as mesmas formulações após dois anos a 25°C.

Efectuou-se também um estudo sobre formulações de hCG urinária usando sacarose (formulação "a", 30 mg de sacarose), lactose (formulação "b", 10 mg de lactose) ou manitol (formulação "c", 20 mg de manitol) como estabilizadores em frascos de 3 ml contendo 500 U.l./frasco de hCG. A Tab. 10 apresenta os valores estimados derivados pelo ensaio biológico efectuado a diferentes tempos para as referidas formulações de hCG armazenadas a uma temperatura de 55°C.

Tabela 10

Estudo da Estabilidade a 55°C de formulações de hCG (500 U.l.) com sacarose (a), lactose (b) e manitol (c)

Composição T = 0 3S 6S a 511 567 597 (390;i-670,2) (407,0-788,7) (452,2-789,4) b 534 355 428 (396,7-719,6) (293,7-430,2) (330,2-55501) c 449 332 244 (330,2-611,7) (259,0-425,5) (201,8-295,9) (Entre parenteses limites de confiança a 95%) S = Semanas

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Uma vez mais, a sacarose demonstra ser o excipiente mais adequado de forma a preservar a estabilidade da hCG, i.e. um excipiente que é muito melhor do que o manitol e melhor do que a lactose, mesmo se, neste caso, a diferença de estabilidade para as três formulações for menos forte do que relativamente ao caso de FSH e LH.

EXEMPLOS DE PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA

Materiais: sacarose extra pura Ph Eur, BP, PH Nord, NF (Merck); lactose RPE ACS (Cario Erba); glicina de grau analítico (Merck), Na2HP04.H20 de grau analítico (Merck), NaH2P04.H20 RPE (Cario Erba); ácido fosfórico 85% RPE ACS (Cario Erba); NaOH 0,1 M (Merck); água para injectáveis.

Como recipientes, foram utilizados frascos de vidro de 3 ou 5 ml (vidro borossilicato do tipo I) com septo de borracha (Fradagrada Pettenati and Pharmagummi, mistura butílica) e cápsula de alumínio.

Preparação da solução de FSH recombinante contendo sacarose (para 1200 frascos contendo cada um 150 U.l. de FSH)

Dissolve-se sacarose (36 g), Na2HP04.H20 (1,33 g) e NaH2P04.H20 (0,54 g) em água para injectáveis (1200 ml) de forma a se obter a solução de sacarose de partida. A totalidade da FSH recombinante (180000 U.l.) é diluído com a solução de forma a se obter uma solução de FSH a 200 U.l./ml. O pH. da solução de FSH e o da solução residual de sacarose são ajustados a 7 por meio de NaOH 0,1 M ou H3PO4. A solução contendo FSH é filtrada através de um filtro estéril Durapore™ 0,22 μΐη e levada ao volume final com a solução residual de excipientes filtrada através do mesmo filtro Durapore™. Durante o processo a temperatura é mantida entre 4o e 8°C.

Preparação da solução de LH recombinante contendo sacarose (para 1200 frascos contendo cada um 75 U.l. de LH)

Dissolve-se sacarose (57,3 g), Na2HP04-H20 (0,99 g) e NaH2P04.H20 (0,62 g) em água para injectáveis (600 ml) de forma a se obter a suloção de sacarose de partida. A totalidade da LH recombinante (90000 U.l.) é diluída com a solução de sacarose, de forma a se obter uma solução de LH a 300 U.l./ml. 15 oo 7Q^ ΕΡ 0 618 808/ΡΤ Ο ρΗ da solução de LH e ο da solução residual de sacarose são ajustados a 8 por meio de NaOH 0,1 M ou H3PO4. A solução contendo LH é filtrada através de um filtro estéril Durapore™ 0,22 μΐη e levada ao volume final com a solução residual de excipientes filtrada através do mesmo filtro Durapore™. Durante o processo a temperatura é mantida entre 4o e 8°C.

As soluções contendo diferentes excipientes foram preparadas de forma semelhante.

Enchimento e liofilização

Os frascos de 3 ml ou 5 ml são cheios com 1 mi de solução de FSH ou 0,5 ml de solução de LH, transferidos para 0 dispositivo de liofilização e arrefecidos a -45°C durante 6 horas, pelo menos. A liofilização é inicidada à temperatura de -45°C com um vácuo de 0,07. O aquecimento é efectuado de acordo com o seguinte esquema: -20°C durante 20 horas, em seguida -35°C até ao final do ciclo.

Sobre a solução reconstituída foram efectuados os controles de qualidade usuais.

Lisboa, 14. M5R. ííuou

Por APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V. - O AGENTE OFICIAL -

Claims

0¾ 7Cn EP 0 618 808/PT 1/1 Reivindicações 1 - Composição farmacêutica compreendendo uma mistura íntima sólida de gonadotrofina e uma quantidade estabilizadora de sacarose em combinação com glicina.
2 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 em que a mistura íntima sólida é um liofilizado.
3 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que a gonadotrofina é FSH, LH ou hCG.
4 - Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a gonadotrofina é recombinante.
5 - Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que contém 75 ou 150 U.l. de FSH e 30 mg de sacarose ou então contém 75 ou 150 U.l. de LH e 47,75 mg de sacarose.
6 - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, o processo compreendendo a preparação de uma solução aquosa dos componentes, opcionalmente a sua distribuição em recipientes, a secagem ou liofilização dos componentes e opcionalmente a distribuição da mistura sólida obtida em recipientes.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 6 em que o pH da solução é de desde 6,5 a 8,5, preferivelmente 7 para uma formulação de FSH e pH 8 para uma formulação de LH.
8 - Forma de apresentação de uma composição farmacêutica compreendendo uma mistura sólida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, hermeticamente fechada numa condição estéril, num recipiente adequado para armazenagem antes da utilização e posterior reconstituição da mistura num solvente ou numa solução para injecção.
9 - Solução compreendendo uma mistura sólida de acordo com a reivindicação 8, reconstituída num solvente ou numa solução para injecção. Lisboa, · Μ· &Λ· tu.v Por APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V. - O AGENTE OFICIAL - _

aw.iunto ENG.· ÁMTÓNI0 JOÃO S»A CUfcíHA FERREIRA A§. Of. Pr. Ind. Rue des Flores, 74-4.° 1900 LISBOA