PT91554A - Processo de clonacao e expressao de sequencias de adn derivadas de candida em saccharomyces e de producao de vacinas - Google Patents

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA

Este invento refere-se geralmente à clonação e expressão de sequências de ADN de Candida em Saccharomyces. Ma is par ticularmente, o invento refere-se à expressão de sequências de gene de Candida em células de Saccharomyces de modo a complementar a função da célula hospedeira de Saccharomyces e a ecpres são e secrecção de genes heterólogos sob o controlo de sequências promotor/sinal de Candida em células de Saccharomyces. Este invento também se refere a vacinas contra a tosse convulsa que compreendem uma subunidade proteica SI truncada de B« per-tussis expressa e segregada numa célula de Saccharomyces sob o controlo de sequências promotor/sina1 de Candida.

Sumário do Invento

Um aspecto deste invento é um microorganismo hospedeiro transformado do género saccharomyces- que compreende uma sequên cia de ADN funcional derivada de uma variedade da espécie Cândida»

Outro aspecto deste invento é um plasmídeo recombinante compreendendo uma região replicadora e uma sequência de ADN funcional derivada de Candida.

Este invento também proporciona uma sequência de promotor e uma sequência de sinais/^ll^flPvedura derivada do gene da glueomilase da albicans para utilização em sistemas de ecpres são em leveduras.

Ainda outro aspecto deste invento proporciona um plasmídeo recombinante compreendendo um promotor de levedura, a sequência de sinais- do gene da glucoamilase da albicansr e um gene estrutural heterólogo, capaz- de produzir, por transformação e expressão em Saccharomyces. um produto de gene fundido hí brido.

Este invento também se refere a um processo de expressão de uma sequência de ADN funcional derivada de Candida que compreende a transformação de um microorganismo hospedeiro do géne ro Saccharomyc es com a sequência de ADN funcional, © a cultura 69 721 SKB CASE 14222-3

-3- <3.0 hospedeiro transformado sob condições adequadas tais que a sequência de ADN funcional seja expressa.

Ainda outro aspecto deste invento é um processo de ca -racterização de uma sequência de ADN derivada da Candida pela sua função, o qual compreende (a) a transformação de um micro organismo hospedeiro do gênero Saccharomyces com a sequência de ADN, microorganismo hospedeiro a que falta uma função conhecida, de modo a que o ADN de Candida possa complementar o microorganismo hospedeiro; e (b) a determinação da presença da função no microorganismo hospedeiro transformado.

Este invento também se refere a um processo de produção de ura polipéptido heterólogo em Saccharomyces o qual compreende a cultura de um microorganismo hospedeiro transformado do género Saccharomyces em meios de cultura adequados, em que o referido microorganismo hospedeiro compreende um promotor e/ /ou uma sequência de sinais derivada de candida fundida, direc ta ou indirectamente, em fase e com a orientação apropriada, a um gene estrutural heterólogo que codifica para o polipéptido. Quando a sequência de sinais é usada no método, o polipéptido é expresso e segregado a partir do hospedeiro celular de levedura .

Como tal, um aspecto adicional deste invento inclui po-lipéptidos heterólogos ou seus fragmentos segregados a partir de célula© hospedeiras de Saccharomyces de acordo com este invento. Entre estes polipéptido© segregados esté uma glicopro-teína gpl60 reeombinante de HIV-1 não processada nos seus componentes gpl20 e gp4l. 0 presente invento também ©e refere a uma vacina para estimular a protecção contra a tosse convulsa, compreendendo tal vacina uma quantidade imunoprotectora e não tóxica de proteína Sl-GA. Tal vacina pode compreender a referida proteína sózinha ou em conjunção com outros antigénios e/ou adjuvantes. Adicionalmente, o presente invento também proporciona um método para inocular um ser humano contra a tosse convulsa, o qual compreende a administração da vacina deste invento ao referido ser humano.

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Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 apresenta a sequência de nucleótidos da sequên cia de promotor e de sinais1 do gene da glucoamilase da c_, a 1-bicans, A Fig. 2 apresenta o vector de expressão empregue no Exemplo 10. A Fig. 3 apresenta a sequência de nucleótidos e de ami-noácidos da sequência de sinais do gene da glucoamilase da C, albicans. A Fig* 4 apresenta a sequência de nucléotidos e de a mi noácidos do ligante sintético utilizado no Exemplo 11, A Fig. 5 apresenta a sequência de ADN e de aminoácidos do TGF-o(.

Descrição Detalhada do Invento O mieroorganismo hospedeiro transformado do presente invento é qualquer membro do género Saccharomyces, no qual foi introduzido uma sequência de ADN funcional derivada de Candida. Prefere-se a Saccharomyces Cerevislae por ser o membro do gene ro ma is bem estudado e porque tem sido a espécie ma is frequentemente empregue para efeitos de ADN recombinante. 0 plasmideo recombinante do presente invento compreende uma sequência de ADN funcional derivada de qualquer espécie do género Candida incluindo as espécies, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida stellatoidea, Candida pse udotropica 1is. Candida parapsilosis. Candida guillieromondi, Candida utilus, e Candida kruisi. Prefere-se especialmente o ADN derivado da Candida albicans por ter sido o primeiro ADN utilizado no presente invento uma vez que é derivado do membro do género que ma is provavelmente provoca a candidíase.

Pelo termo "Sequência de ADN funcional" entende-se qua], quer região discreta de ADN derivada directa ou indirectamente de Candida que funcione em Candida como uma unidade completa de expressão genética, um gene estrutural, um promotor, uma sequência de sinais ou uma região reguladora. Por "unidade com pleta de expressão genética" entende-se um gene estrutural e 69 721 SKB CASE 14222-1

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5 as regiões promotoras e reguladoras necessárias para a sua transcripção e tradução. Por "'promotor" entende-se qualquer região a montante do gene estrutural que permite a ligação de ARN polimerase e a ocorrência da tradução, Por "região re guiadora" entende-se qualquer região que regula a transcrip-çSo do gene. Por *fcfene estrutural* entende-se uma sequência de codificação de um polipéptido que sirva de modelo (template) para a síntese do ARNm. Por "sequência de sinais"1 entende-se uma região a montante de um gene estrutural que baliza a estruturação do gene para a via de secrecção do hospedeiro. O plasmídeo recombinante do presente invento também compreende uma região replicadora, de preferência uma região replicadora de Saccharomyces ou Candida , Por "região replica-dora": entende-se qualquer fragmento de ADN, de preferência de^ rivado directa ou indirectamente de levedura, tal como Saccha-romyees ou Candida , o qual pode ser usado para manter extra -c r om os somic a me nte, uma sequência de ADN funcional derivada da Candida no mier©organismo Saccharomyces hospedeiro. São particular me nte preferidos os plasmídeo®. compreendendo um vector vaivém Saccharomyces-Escherichia. tal como o descrito por Bro-ach et al„. Gene. 8^:121-133' (1979). São exemplos de vectores que podem ser usados neste invento# por clonação neles; de uma sequência de ADN funcional derivada de Candida os seguintes plasmídeos que estão publicamente disponíveis, por ex. a partir da American Type Culture Collection. Rockville. Maryland, USA (número ATCC entre parêntesis): pBIT-1 (37087). pBTI-7 (37088). pBTI-9 (37089), pBTI-10 (37090), pbC544 (37013), pRB3 (37059), pRB4 (37058), pRB5 (37051), pRB8 (37109), pRB9 (37057), pRBlO (37056), pRB18 (37092), pRB20 (37054), pRB21 (37055), pRB22 (37053), pRB12 (37061), pRBl4 (37063), pRB!5 (37062), pRB16 (37060), pRB19 (37064), YEp2 (37076), YRpl7 (37078), YEpl3 (37115). A sequência de ADN de Candida pode ser preparada por té cnicas conhecidas tais como a descrita por Rigsbay et al. Mole c , Ce11. Biol., 2:853-862 (1982). O ADN de Candida isolado pode ainda ser fragmentado por tratamento com uma ou ma is- enzi

69 721 SKB CASE 14222-3 -6- mas de restrição.

Um plasmídeo recombinante contendo uma sequência de ADN de Candida funcional e contendo uma região replicadora de Escherichia coli pode ser usada para transformar Escherichia col^· P9ra amplificar o plasmídeo. Tal transformação e amplif^ cação podem ser levadas a cabo, por técnicas conhecidas. O plasmídeo recombinante é então recuperado da E. coli por técnicas conhecidas. O plasmídeo recombinante recuperado pode então ser usa do para transformar o microorganismo hospedeiro pertencente ao genero Saccharomyces. Tal transformação pode ser levada a cabo por inserção aleatória de fragmentos de plasmídeo de ADN recombinante em plasmídeos de levedura circulares fechados co valente mente e (a) transformando com eles esferoplastos, tal como com o método descrito por Hinnem et ai», Proe» Natl. Acad. Sci« USA, 75^1929—1933 (1978); ou (b) utilizando o método de transformação de levedura com acetato de lítio ou cloreto de lítio, tal como descrito por Ito et al„, J. Bacteriol., 153 : :163 (1983). O ADN de Candida pode também ser transformado num microorganismo Saceharomyces por fusão dos protoplastos de Cândida e Saccharomyces. 0 ADN de Candida introduzido pode ser integrado no ADN cromossómico do microorganismo Saccharomyces hos pedeiro, tal como por reeombinação, ou pode manter-se extracro-mossómico. Como tal, ainda outro exemplo de processo é a transformação de um organismo hospedeiro Saccharomyces directamente com ADN de Candida o qual opcionalmente, possui sequências flan queadoras homologas a uma sequência contígua no ADN cromossómico do hospedeiro, permitindo assim a recombinação com o ADN cro mossómico do hospedeiro.

As regiões promotoras e sequências de sinais derivadas de Candida, pelo processo do presente invento podem ser usadas para expressar as sequências de codificação de Candida, Saccha-romyces ou outros organismos, vírus ou células no hospedeiro Saccharomyces transformado. Tais promotores e/ou sequências de sinais podem ser fundidos a um gene estrutural heterólogo, tal

> ff £-· ά& ^ 69 721 SKB CASE 14222-3 -7- cotno as sequências de codificação da insulina, interferon, proteínas virai e pacteriana da hormona de crescimento, etc.,, directamente por fusão de toda ou parte da sequência de nu-cleótidos naturais do promotor e/ou da sequência de sinais com a sequência de codificação do polipêptido desejado, produzindo assim um gene híbrido. Por exemplo, uma destas re~ giSes promotoras e de sinais e derivada do gene da glucoami-lase de C« albicans. Esta sequência de ADN funcional quando inserida num plasmídeo e fundida a um gene estrutural heteró-logo permite a expressão e secrecção de uma proteína de fusão híbrida. Um sistema de expressão alternativo utiliza outro promotor de levedura e a sequência de sinais do gene da gluco amilase de C. albicans· para expressão e secrecção do gene de fusão desejado. Quando os microorganismos hospedeiros Saccha-romyces que foram transformados por um plasmídeo contendo um tal gene híbrido, são cultivados em meios de cultura adequados, eles produzem o polipêptido. Sob controlo do promotor e sequência de sinais apropriados, o polipêptido pode ser segre gado para o meio de cultura.

Para lá destes promotores de Candida revelados aqui, podem descobrir-se promotores adicionais por clonação de fragmentos aleatórios de ADN de Candida em plasmídeos de Saccha-romyces destinados á selecção de promotores. Tais, plasmídeos podem ser concebidos por técnicas conhecidas tais como a descrita por Casadaban et al„, Methods in Enzymology. 100:293--308 (1983).

Os genes estruturais derivados d® Candida podem ser expressos em Saccharomyces a partir dos seus promotores naturais de Candida. a partir de promotores heterólogos derivados de Candida ou Saccharomyces. ou a partir de outros promotores heterólogos funcionais que sejam derivados de outros organismos ou produzidos a partir de oligonucleótidos· sintéticos e que funcionem em Saccharomyces. Analogamente, os genes estruturais que não têm origem em Candida podem ser expressos a partir de uma variedade de promotores, incluindo o promotor do gene da glucoamila-se com a sua sequência de sinais.

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Muitos mutantes de Saccharomyces conhecidos são deficientes em funções definidas tais como um passo específico na bi os síntese da leucina ou histidina. Esta função poderia ser fornecida se tais- mutantes fossem transformados com sequências de ADN derivadas de Candida que contém genes que codificam para tais funções. Nos casos em que a função a caracterizar não é já deficiente numa estirpe de Saccharomyces disponível, tais mutações podem ser induzidas por técnicas conhecidas, tais como por radiação ultravioleta, mutagénese química ou manipulação genética. Nalguns casos, a função revelada pelo microorga-nismo hospedeiro transformado será uma função que não está na-turalmente presente na Saccharomyces» Por exemplo, um microor-ganismo hospedeiro Saccharomyces cerevisiae pode ser transformado por uma sequência de ADN funcional de acordo com o proces so deste invento de modo a revelar funções que não possui natu ralmente tal como a utilização de sorbitol. utilização de mal-tose por clivagem catalisada por isomaltase das ligações Oó-l--6-glucosídicas (tais como a hidrólise do ^-metil-D-glucopira-nosido), utilização de amido solúvel por clivagem catalisada por glucoamilase das ligações &/-1-4 glucosídicas ou resistência a um agente anti-fúngico. 0 desenvolvimento de uma biblioteca genómica cobrindo a totalidade do genoma de Candida permite a caracterização das funções do ADN derivado de Candida. Isto permitirá que a genética deste patogénio assexual seja analisada mais de perto do que o que tem eido possível no passado e facilitar o desenvolvimento de agentes anti-candidíase. 0 processo preferido de ca racterização das funções de ADN deiva de Candida albicans en Saccharomyces cerevisiae de modo a que o® genes de Candida, podem ser estudados no âmbito de um organismo eucariota bem cara-cterizado. Como tal. a genética de Candida albicans pode ser es tudada por isolamento de genes através da complementação de funções reveladas pela Saccharomyces cerevisiae transformada. A abun dáncla de estirpes mutantes de Saccharomyces cerevisiae disponíveis juntamente com a possibilidade de selecção de mutantes adicionais. torna possível a realização de tal complementação. Como

69 721 SKB CASE 14222-3 tal é possível seleccionar genes de Candida albicans associa dos· com qualquer função de uma série de funções, tais como as associadas a reacções bioquímicas definidas, ou as envolvidas na divisão celular ou estrutura celular. A disponibilidade da biblioteca genómica e de um sistema para a identificação dos genes seleccionados oferece uma nova abordagem para a resolução de algumas diferenças básicas que tornam um organismo eco nomicamente útil e outro organismo um patogénio grave.

Usando o processo deste invento podem isolar-se e cara cterizar-se plasmídeos com um ou ma is genes funcionais de c. albicans que complementem uma mutação de Saccharomyces ou con ferem uma nova caracteristica à estirpe de Saccharomyces trans formada com eles. Estes genes funcionais de C. albicans podem incluir um gene complementando a mutação trpl de S. cerevisiae, um gene complementando a mutação his3 de S. cerevisiae, um gene conferindo um alto nível de resistência ao agente anti-fún-gico benomilo, um gene que permite o crescimento em sorbitol, um gene que permite o crescimento em isomaltase,. um gene que permite o crescimento em amido solúvel (i.e. um gene de gluco-amilase) e um gene codificando a enzima galactoquinaíse que com plementa uma mutação gall de S. cerevisiae. Estes genes são úteis como marcadores para o isolamento de hospedeiros- Saccharomyces transformados com sucesso com plasmídeos contendo tais genes. Cada um dos promotores dos genes da utilização do sorbi tol, isomaltase e amido solúvel de C. albicans é também útil como promotor regulável para um microorganismo Saccharomyces transformado com um plasmídeo contendo o referido promotor. Os plasmídeos contendo sequências de ADN funcional de C. albicans são úteis para a produção em Saccharomyces de produtos de gene heterólogos, tais como produtos farmacêuticos, antigénios vaci na is © hormonas.

Também de acordo com um processo deste invento,, um gene heterólogo codificando, por ex. uma glicoproteína de superfície de HIV-1 (gpl60), uma subunidade de toxina de B. pertussis (Sl), factor-alfa transformador do crescimento (TGF-Q<0 e Interleucina 1(¾ (lLl-ft)) pode ser expresso e segregado em Saccharomyces- sob o 69 721 SKB CASE 14222-3

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-10- controlo de um promotor de levedura e da sequência de sinais do gene da glucoamilase da C. a lbicans. os plasmídeos conten do um promotor de levedura seleccionado, a sequência de sinais da glucoamilase e o gene estrutural heterólogo podem ser transformados numa célula de levedura Saccharoroyces seleceio-nada. Um produto de gene é assim ex-presso como uma proteína ou polipéptido híbrido ou de fusão e é processado e segregado para o meio de cultura. A secrecçãjc da proteína de fusão permite que a purificação da proteína seja muito simplificada e permite efectuar modificações pós-tradução da proteína, por ex.. glicosilação.

Este invento também se refere a uma vacina contra a tosse convulsa (pertussis). A toxina pertussis é uma exotoxi. na de proteína de B. pertussis que joga um papel importante na patogénese da tosse convulsa e que se crê ser o antigénio protector ma is importante da B. pertussis ZlVêr, A.A. Weiss et al. Ann. Rev» Microbiol», 40:661 (1986).2/. A toxina de pertussis é uma proteína hexamérica composta por cinco subunidades dissimilares denominadas S^, a de acordo com os seus? pesos

moleculares decrescentes. /~7êr, M. Tamura et al. 21:5516 (1982)jy, A toxina de pertussis é estruturada num modelo A-B

ligação da toxina ao seu receptor nas membranas da célula alvo, e o promotor A (subunidade si) contém actividade enzimáti ca. A sequência de nucleótidos de codificação completa do operão de toxina pertussis foi determinada. Ver, por ex., Keith, et al., Pedido da patente Americana No (U^S.S.N.) 843727 apresentada a 26 de Março de 1986, cuja revelação é* aqui incorporada na sua totalidade para referência* Mais ainda, o adn contendo a sequência de codificação de toxina pertussis pode ser isolado de qualquer estirpe de B. pertussis disponível publicamente. Por exemplo, várias estirpes de B« pertussis estão disponíveis publicamente a partir de fontes comerciais, por ex. American Type Culture Collection, Rockvil^ le# Maryland, U.S.A, Tal isolamento pode ser levado a cabo pelo método de Keith, et al». U.S,S,N„ 843727, acima, ou por 69 721 SKB CASE 14222-3 Θ.. y//'~~

-11- outro método convencional. 0 presente invento é baseado na descoberta de que a proteína SI-GA tem a capacidade de produzir uma resposta imu nogénica protectora. Como tal o presente invento refere-se a uma proteína Sl-GÀ, a sequência de codificação da proteína SI-GA, a uma vacina para estimular a protecção contra a tosse convulsa, em que essa vacina compreende uma quantidade imuno-protectora e não tóxica de proteína SI-GA. Tal vacina pode compreender essa proteína isoladamente ou conjuntamente com outros antigénios e/ou adjuvantes. Adicionalmente, o presente invento tambémr fornece um método para inocular um ser humano contra a tosse convulsa, o qual compreende a administra ção da vacina deste invento a esse ser humano.

Pelo termo "quantidade imunoprotectora” tal como usado aqui entende-se uma quantidade de proteína Sl-GA que produza uma resposta imune protectora suficiente contra pertus-sis após essa quantidade dessa proteína ter sido administrada a um hospedeiro humano»

Pelo termo "proteína Sl-GA"' entende-se uma forma solúvel da proteína de subunidade SI da toxina pertussis (PT) que tenha sido expressa por uma célula Saccharomyces hospedei ra, transformada por um fragmento de ADN recombinante, compre^ endendo 186 aminoácidos da sequência de codificação de subunidade SI (aminoácidos 2 a 187 do N-terminal da proteína SI madura) fundida, em fase (a) à sequência de sinais peptídica codificadora da glucoamilase de Candida albicans, ou (b) algu res no gene da glucoamilase de Candida albicans desde que tal gene inclua a sua região de sinais peptídica codificadora e qualquer seu mutante ou derivado funcional. A criação do gene RlS e a sua expressão sob o controlo transcripciona 1 e de tra dução do lacz- no plasmídeo pTXSll @ descrito completamente em Locht al, Infect. Immun, 55, 963-967 (1987), cuja revelação completa é aqui incorporada para referência.

Pelo termo "mutante e derivado funcional" entende-se qualquer proteína codificada por qualquer mutação ou deriva- 69 721

SKB CASE 14222-3 -12- çâto da sequência de codificação da proteína Sl-GA a qual, por expressão numa célula hospedeira, por ex. uma célula hospedei ra da Saccharomyces, resulta numa proteína que retém a activi dade biológica da proteína Sl-GA, por ex., solubilidade e uma resposta imunogénica protectora contra pertussis, A produção de tais mutantes e derivados está dentro dos procedimentos de rotina da arte.

Estes mutantes e derivados funcionais da sequência $e codificação de Sl-GA incluem as suas formas quimicamente modi ficadas, por ex. formas glicosiladas e alquiladas que tenham substancialmente· a mesma actividade, biológica que a proteína Sl-GA. Eles também incluem mutantes e derivados em que um ou mais aminoácidos foram rearranjados, adicionados, delecciona-dos ou substituídos, ou em que um polipéptido heterólogo tenha sido fundido ou conjugado. Como tal, pelo termo "mutantes e derivados funcionais da sequência de codificação da proteína Sl-GA" entende-se. qua Iquer sequência de codificação, tal como uma fusão da sequência de codificação da proteína Sl-GA com outra sequência de codificação da proteína, bem como uma sequência de codificação de proteína Sl-GA compreendendo substjL tuiçÕes, delecçSes ou adições de aminoácidos, que codifique uma proteína que tenha substancialmente a mesma actividade biológica da proteína Sl-GA nativa. Tais mutantes e derivados funcionais: são conveniente mente preparados por um especialista na arte empregando, por ex, mutagenese dirigida ao local, muta génese aleatória, síntese química de sequências nucleotídicasou peptidicas truncagem ou delecção de parte da sequência de codificação para proteína Sl-GA nativa, modificação química do que se referiu acima ou concatenação de mais de um segmento da sequência de codificação da proteína Sl-GA, Estes mutantes e derivados funcionais da sequência de codificação da proteína Sl-GA também incluem as suas formas quimicamente modificadas, por ex. formas· glicosiladas e alquiladas que tenham substancia lmente a mesma actividade biológica da proteína Sl-GA nativa.

Este invento também se refere a uma molécula de ADN re 69 721 SKB CASE 14222-3 (íli. C;>-

13- combinante, tal como um ADNc, que contenha a sequência de co dificação da proteína Sl-GA. Este ADNc pode ser preparado por técnicas convencionais tais como a transcripção inversa do ARNm isolado por técnicas convencionais a partir de uma célula ou cultura produzindo a proteína Sl-GA, tal como atra vés do método de Han et al,, Biochemistry. 26, 1617-1625 (1987), Como outra concretização da molécula de ADN recombi-nante do invento, proporciona-se um vector de ADN recombinan tei compreende a sequência de codificação deste invento. Este vector contém preferencialmente a sequência de codificação anterior em associação operativa com sequências de controlo de expressão adequadas·. Por "sequências de controlo de expre£ são adequadas" entende-se as sequências que regulam a trans-cripção & tradução de um gene estrutural. Tais expressões de controlo de expressão são bem conhecidas na arte. Ainda outro aspecto deste invento é uma célula hospedeira transformada com o vector deste invento. Tal célula hospedeira é capaz de crescer num meio de cultura e é capaz de expressar a sequência de codificação do invento, A referida célula hospedei ra é preparada pelo método deste invento, por ex.,, transformando uma célula hospedeira desejada com o vector do invento. Esta transformação é levada a cabo por utilização de técnicas de transformação convencionais. As células· hospedeiras que podem ser adequadas incluem, não limitativamente, as células de mamíferos, de insectos, bacterianas, de plantas e fúngicas. Como tal este invento não se limita a quaisquer células hospedeiras específicas, embora se prefira uma célula hospedeira de Saccharomyces. 0 presente invento também se refere a um método de pro dução da proteína codificada pela sequência de codificação de Sl-GA deste invento que compreende a cultura do hospedeiro transformado do invento em meios de cultura apropriados e o isolamento de tal proteína. Por "meios de cultura apropriados" entendem-se meios· que permitem que o hospedeiro transformado sobreviva e que permitem também que o hospedeiro expresse a sequência de codificação do invento numa quantidade que se pos 69 721 SKB CASE 14222-3

v - '.yyr- -14- sa recolher» os especialistas entenderão que os meios de cul tura apropriados dependem da célula hospedeira empregue, o isolamento da proteína assim produzida, será levado a cabo a partir de um lisado da cultura do hospedeiro ou, se apropriado, directamente a partir do meio de cultura do hospedei ro, e é levado a cabo por técnicas convencionais de isolamen to de proteínas tais como as que se discutiram acima.

Este invento também se refere a uma molécula de aDN sintético contendo a sequência de codificação da proteína S3. -GA.. Pelo termo "sintético" entende-se uma molécula de ADN preparada por meios sintéticos em vez de técnicas· de recombi nação. Tais técnicas são bem conhecidas na arte usando sinte tizadores de ADN disponíveis comercialmente. A vacina deste invento compreende uma quantidade imu-noprotectora e não tóxica de proteína Sl-GA. Esta vacina con téra de preferência 2-25/Ag desta proteína Sl-GA, mas não se limita a estas quantidades.

Outros antigénios que se sabe seremr desejávelmente administrados em conjunção com a toxina pertussis podem também ser incluídos na vacina deste invento. Estes componentes adicionais são conhecidos dos peritos na arte. Os componentes adicionais preferidos incluem o toxoide do tétano e/ou toxoi-de da difteria bem como a hemaglutinina filamentosa (FHA) e/ /ou qualquer outro antigénio protector da B. pertussis. O fornecimento de uma tal vacina permite assim outro aspecto do presente invento, isto é, um método para imunizar um ser humano contra pertussis que compreende a administração da vacine do invento ao dito ser humano. O modo de administração da vacina do invento pode ser qualquer via adequada que forneça uma quantidade imunoprotec-tora da proteína do presente invento ao hospedeiro» Contudo, a vacina é de preferência administrada parentéricamente, pelas vias intramuscular ou subcutânea profunda. Outros modos de administração podem também ser empregues, quando desejável, tais como administração oral ou por intermédio de outras vias 69 721 SKB CASE 14222-3 //

C&£ 7/ -15- parentéricas, i.e., intradermricamente, intranasalmente ou, intravenosamente. A vacina do invento pode ser preparada como uma compo sição farmacêutica contendo uma quantidade imunoprotectora e não-tóxica de proteína SI-GA num veículo não tóxico e estéril farmacêutica mente aceitável* Nos casos· em que a administração de vacina é parentérica, a proteína incluída na vacina po de ser opcionalmente misturada ou absOrvida com qualquer adju vante convenciona 1, para uso como um irritante não específico de modio a atrair ou aumentar a resposta imune. Tais adjuvantes incluem, entre outros,. hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, o dipeptido muramilo e saponinas, tais como Qull A. Como exemplo alternativo da preparação da vacina do invento, a proteína que.a vacina compreende pode ser capsulada em mi-cropartículas, tais como lipossomas·. Ainda noutro exemplo áL-ternativo da preparação da vacina do invento, a proteína que a vacina compreende pode ser administrada com uma macromolécu la imunoestimuladora, ou um taxoide de tetêno. Em alternativa, uma suspensão aquosa ou solução contendo a proteína da vacina do invento, de preferência tamponada a pH fisiológico, pode ser concebida para ingestão oral.

Prefere-se que a vacina do invento, quando numa preparação farmacêutica, esteja presente em formas de dosagem unitárias. a dose eficaz terapêuticamente apropriada pode ser ime diatamente determinada pelos especialistas na arte. A quanti-daae eficaz de proteína Sl—GA contida na vacina deste invento pode estar na gama das quantidades eficazes de antigénio em vacinas de B. pertussis acelulares ou de componentes convencionais i.e», 5-25/Àg de proteína. Esta dose pode opcionalmen te ser fornecida com várias quantidades de hemaglutinina fila mentosa (PHA) (cerca de lO>Ug-25jUg) e/ou aglutinogánios ou outros antigénios. Compreender-se-á, contudo que o nível espe cífico da dose para qualquer doente particular dependerá de uma variedade de factores incluindo a idade, estado de saêde geral, sexo e dieta do paciente; do tempo de administração; da via de administração; de efeitos sinérgicos com quaisquer 69 721 SKB CASE 14222-3 fj/^. /jt-jsaatgvl

-16- outras drogas a serem administradas; e do grau de protecção a obter. Evidente mente,, a administração pode ser repetida em intervalos adequados se necessário. Serão administradas de preferência três doses, com 3 a 12 meses d© intervalo entre cada dos©, com uma dos© de reforço, opcional, mais tarde.

Nos exemplos que se seguem, revelam-se mais completa-mente concretizações específicas do invento. Os exemplos 1-7 ilustram a expressão de genes de Candida em Saccharomyces para complementar as funções da célula hospedeira Saccharomyces nativa, os exemplos 8 e 9 ilustram p isolamento e uso de regiões replicadoras de Candida para controlo da expressão do gene de Candida em Sacchar omyces» Os exemplos 10-13 ilus-tram o uso de uma sequência de sinais de Candida como parte do sis tema de expressão e secreção para outros genes não heterólo-gos de levedura em Saccharomyces. Os exemplos 13 © 14 referem -se à vacina do invento. Estes exemplos destinam-se a ilustrar o invento e não devem constituir limitações ao seu alcance,

EXEMPLO 1 - ISOLAMENTO DE ADN DE C. ALBICANS A. Construção da biblioteca genómica de C. albicans O ADN de estirpe 792-1 de C« albicans (cortesia de J. Kwon-Chung, Natl. Inst. Health, U.S.A.) foi isolado pelo procedimento descrito por Rigsby et al,, acima citado. O ADN purificado por este procedimento tinha em média 100 pares de Ká. lobases (Kbp) de comprimento.

Uma biblioteca genómica foi construída no vector vaivém de Sacchar omyces1 - Eecherichia coli, YEpl3 ZTATCC 3 7115_Ι7, des crito por Broach et al», acima citado. O calculo do tamanho do genoma de C^ albicans baseado nos dados fornecidos por Rigsby et al., citados acima, sugere que o tamanho do genoma de C± albicans é de cerca de 2 x IO4 Kbp» Como tal, são necessários perto de 8000 transformantes; independentes transportando uma inserção de 10 Kbp para se obter uma biblioteca genómica com uma probabilidade de 99% de cada uma das sequências de C. albicans ser representada pelo menos uma vez, nesta biblioteca. Isto foi calculado pelo método revelado por Maniatis et al,. -17- 69 721 SKB CASE 14222-3 "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Har-bor Laboratory (1982). 0 ADN foi parcialmente digerido com a endonucleose de restrição S~au3A e fraccionada por centrífugação nunr gradiente de sacarose de 5-20%.

As fracções contendo fragmentos de ADN na gama de 10 Kbp foram reunidas e usadas para ligação. O plasmldeo de ADN YEpl3 foi clivado no local único BamHl, e depois tratado com fosfatase alcalina de modo a evitar a auto-ligação, Ligaram--se concentrações iguais (200 mg numa mistura reaceional de lOyUl de C. a lbicans e ADN de ΥΕ·ρ13 *

As estirpes de E. coli MC1061 (Casadaban et al., J.

Mol. Biol., 138:179-207 (1980)) e HB101 (Bolivar et al. Gene. £:95-113 (1979) foram transformadas com a mistura ligada de acordo com Lederberg e Cohem, J. Bacteriol.. 119:1072-1074 (1974), com a modificação de que se permitiu um tempo de expressão de 45 min. a 37SC em caldo de Luria, (Luria Broth) (LB) , Uma estimativa do número de transformantes independentes foi obtido por sementeira de uma pequena amostra em placas de LB contendo 50>ig/ml de ampicilina. Simultâneamente, a amos tra restante foi inoculada em caldo LB contendo 50;Ug/mi de ampicilina e incubadas de um dia para o outro para uso no isolamento de ADN. Os resultados das placas indicaram que foram obtidos cerca de 16 000 clones independentes. Para estimar a percentagem de transf ormantes que continham inserçõès, testaram -se 100 transf ormantes no que diz· respeito à sua resistência à ampicilina e à tetraciclina. Uma vez que o local BamHI está no gene de resistência à tetraciclina (tetR), os transformantes que contêm plasmídeos com o ADN inserido deverão ser sensíveis à tetraciclina e resistentes à ampicilina, enquanto que os transformantes contendo plasmídeos sem inserções deverão ser resistentes a ambos os antibióticos. Os resultados obtidos indicam que todos os transformantes são sensíveis à tetraciclina e resistentes à ampicilina, sugerindo que pelo menos 99% dos transf ormantes possuíam plasmídeos contendo ADN de C. albicans inserido. 69 721 SKB CASE 14222-3

-18—

Preparou-se ADN a partir da cultura de B. colj em LB--amplicilina, em pequena escala ou grande escala pelo método de Maniatis· et al., acima citado, usando uma alíquota desta cultura original como inoculo. B. Expressão dos genes- de C. albicans em S« cerevi-siae (1) Metodologia geral

Para isolar as sequências de ADN clonadas de C» albicans por expressão em S« cerevisiae, empregaram-se estirpes haplóides- de S. cerevisiae geneticamente definidas como hospedeiros para transformação mediada por Adn, A transformação foi levada a cabo a) pelo procedimento de esf er oplastos·, como descreveu Sherman et al,, "Methods in Yeast Genetics Laborato ry Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1982), ou pelo método do cloreto de lítio ou acetato de lítio descrito por Ito et al,, acima citado. A levedura foi semeada num meio mínimo (Yeast nitrogen base-Difco YNB) contendo todos· os suplementos necessários menos um. A transformação de um mutante· de S. cerevisiae definido com um plasmídeo contendo um a leio do tipo selvagem da mutação específica permite o crescimento do hospedeiro transfor mado em condições restritivas em relação ao mutante não trans^ formado. Nos exemplos· seguintes, o gene LEU2 foi usado como o primeiro marcador seleccionável. A levedura transformada foi então subeultivada em tipos de meio adicionais de modo a se— leccionar transformantes que expressem outras funções que faltavam originalmente na estirpe hospedeira de S. cerevisiae.

Os plasmídeos foram recuperados da S. cerevisiae. fazen do uma preparação de ADN do transformante desejado, usando o procedimento de Sherman et al., acima citado, e utilizando este ADN para transformar E. coli, por técnicas conhecidas, e usados para análises subsequentes. Este estudo subsequente inclui: a) a transformação da levedura para confirmar a presença de um gene conferindo o mesmo fenotipo encontrado na célula de levedura transformada original; b) análise de hibridação para -19- 69 721 UIL·. SKB CASE 14222-3' confirmar a presença de ADN de C. albicans no plasmídeo híbrido; e c) análise posterior do fragmento de ADN de C, a 1-bicans, tanto estruturalmente1 como funcional mente. (2) Isolamento de um gene de Candida albicans que complementa a mutação trpl de S. eerevisiae

Transformaram-se esferoplastos da estirpe DBY746 de s, cerevisdae· (0L, his3-l, Ieu2-3d leu2-112. ura3-52, trpl-289) com ADN isolado a partir da biblioteca de C. albicans. A estirpe DBY+46 de S. cerevisiae foi obtida no Yeast Genetic Sto ck Center, Department of Biophysies and Medicai Physics, Uni-versity of Califórnia, Berkeley, Califórnia, U.S.A. As células foram semeadas em meio mínimo (Difco YNB) contendo todos os suplementos necessários excepto leucina. As células de levedura transformadas expressaram o plasmídeo codificado pelo gene LEU2. as células de Leu+ foram recolhidas a partir destas placas e semeadas em meio mínimo privado de leucina e tri ptofano. Dos 500 transformantes examinados, dois cresceram nestas placas.

Para testar se o crescimento destes dois transformantes em meio privado de leucina e triptofano foi devido a presença de uma inserção de ADN de C. albicans. em vez de uma in serção da mutação trpl, fizeram-se crescer os transformantes em meio de extract© de levedura com peptona e dextrose CYEPD) durante lo gerações, e depois cultivados em meio mínimo contendo todos os suplementos. As colónias· foram então semeadas em replica em meio mínimo privado apenas de triptofano ou ape nas de leucina.

Em todos os casos, as colónias provenientes de células que perderam o plasmídeo, i.e. foram Leu, também necessitaram de triptofano indicando co-segregação dos ale los LEU2 e TRPI.

Os plasmídeos foram recuperados dos dois isolados trans formados, por transformaçao de E. coli HB101 com pequenas preparações de ADN de levedura, preparados pelo método de Sherman et al., citado acima, seleccionancfo os transf ormantes resistentes à ampicilina. As células de E. coli transformadas eram sensíveis è tetraciclina, indicando que o plasmídeo continha jV\

69 721 SKB CASE 14222-3

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R uma inserção no gene tet , os dois plasmídeos foram designados por pAR84-l & pAR 84 -2 ,

Preparou-se ADN de cada plasmídeo pelo método de Mania tis et al., citado acima, e usaram-se para transformar a estirpe DBY746 de S, cerevisiae. A selecção das células transformadas foi levada a cabo num meio desprovido de leucina mas contendo os suplementos histidina, triptofano e uracilo. Nas células Leu+ transformadas pesquisou-se a prototrofia pelo tri ptofano. Entre 88 e 100% dos transformantes expressaram o marcador não seleccionado TRP+ confirmando que o pAR84-l e o pAr82-2 continham ambos um gene complementando uma mutação trpl de s, cerevisiae e indicando que uma sequência de ADN fun cional derivada de Candida pode ser expressa em Saccharomyces. C. Caracterização Adicional dos Plasmídeos

Para testar a hibridação especifica da inserção de ADN nos plasmídeos recombinantes com ADN genómico de C, albicans, isolou-se ADN de estirpes DBY746 de S, cerevisiae não transfor madas e transformadas, de acordo com o procedimento descrito por Sherman et al., citado acima, para preparações em pequena escala, 0 ADN de E, coli com ou sem plasmídeo, foi também pre^ parado pelo método de Maniatis et al., citado acima.

As amostras de ADN foram digeridas com enzimas de restri ção HindiII e BglII. 0 ADN digerido de uma estirpe 792-1 de C, albicans, da estirpe DBY746 da S., cerevisiae, de plasmídeo YEpl3, e do plasmídeo pAR84-2 foi submetido a electrof orese em geles de agarose, © transferidos para um filtro de nitrocelulo se pelo procedimento de Southern, J, Mol, Biol,, 98:503-517 (1975), 0 filtro foi então hibridado sequencialmente, primeiro 32 com ADN de YEpl3 marcado com P para testar se o vector usado se hibrida com o ADN genómico de C, albicansr, e, segundo com 32 ADN de pAR84-2 marcado com P para determinar se o novo plas-mideo se hibridou com o ADN genómico de C, albicane.

Os filtros de nitrocelulose foram préhibridados durante 3 horas a 65sc com uma solução contendo 6 x SSC e 3 x Denhardt (1 x Denhardt é 0,02% Picol 400, 0,02% polivinilpirrolidona 360 e 0,02% albumina de soro bovino) de acordo com o método de 69 721 SKB CASE 14222-3

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Maniatis et al., citado acima, a solução de hibridação foi a mesma com excepção de se ter adicionado a sonda de ADN marca 3 2 *“ da com P, preparado por tradução por corte ("nickH) de acor do com o método de Maniatis et al., citado acima. A hibrida- ção foi levada a cabo durante 18 horas a 65sc. Após· hibrida- ção os filtros foram lavados com 2 x SSC a 65ec. Os filtros foram então expostos a um filme de raios X, 0 ADN de YET13 hibridou-se apenas com o ADN genómico de S, cerevisiae, enquanto o ADN de pAR84-2 também se hibri-dou com o ADN genómico de C. albicans. A hibridação de pAR84--2 com o ADN genómico de S, cerevisiae é devida ao gene LEU2 der S. cerevisiae que faz parte do plasmídeo. A hibridação com C. albicans é devida à homologia da inserção de Candida com sequências genómicas de Candida . 0 tamanho das inserções de cada plasmídeo foi estimado por electroforese dos· digeridos de restricçã© em geles de aga rose. 0 pAR84-l contém um fragmento de IS Kbp de ADN de c. albicans. enquanto que o pAR84-2 contém um fragmento de 10,4 Kbp.

Usando a mesma metodologia que se usou para o isolamen to do fragmento de ADN de C. albicans que complementa a mutação trpl de S, cerevisiae, isolaram-se plasmídeos coptendo outros genes funcionais de C. albicans e caracterizam-se como se descreve nos Exemplos 2-7 que se seguem.

EXEMPLO 2 - COMPLEMENTAÇÃO DO GENE his3 DE S. CEREVISIAE COM ADN DE C, ALBICANS 0 his3 de S. cerevisiae codifica a imidazolglicerolf os-fatodesidrogenase. o isolamento de um gene de C. albicans que complementa a mutação his3 da S. cerevisiae foi levado a cabo de acordo com o procedimento do Exemplo 1. Os· transformantes 4. de levedura Leu foram cultivados em meio privado de leucina e histidina. As colónias que surgiram foram seleccionadas.

Os plasmídeos contendo um gene de C, albicans· que complementa a mutação his3' de S, cerevisiae, foram recuperados das colónias seleccionadas, descritas acima, por transformação 69 721 SKB CASE 14222-3 _ /fy f~J! A „ .ψ

-22 de E. coli HBlOl de acordo com o método do Exemplo 1. o plas-mídeo de ADN foi isolado dos transformantes de E, coli de acor do com o método do Exemplo 1, e foi designado por pAR84-3. 0 plasmídeo pAR84-3, contendo o çjene de C* albicans que complementa a mutação his3 de S. cerevisiae foi transformado na estirpe DBY746 de S, cerevisiae de acordo com o proce dimento do Exemplo 1,

Os microorganismos hospedeiros de S* cerevisiae foram transformados com o plasmideo pAR84 —3 e seleccionados de acor do com os métodos descritos acima * Estes microorganismos foram então testados no que diz respeito a expressão do gene his3'.

EXEMPLO 3 - EXPRESSÃO DO GENE DE C, ALBICANS DE RESISTÊNCIA AO BENOMILO EM S* CEREVISIAE O gene de resistência ao benomilo confere uma resistên cia de alto nível ao agente anti-fúngico benomilo l-(butilcar bamoil)-2-benzimidazol-carbamato de metilo) * As estirpes de C. albicans são ma is resistentes ao benomilo que as de S, cere-visiae. Este gene confere assim uma nova característica a uma estirpe de S. cerevisiae transformada como se segue* O isolamento do gene de C, albicans* de resistência ao benomilo, foi levado a cabo de acordo com o procedimento do Exemplo 1, com excepção de se ter usado, como hospedeiro, a es tirpe JWG2-2C de S* cerevisiae (0L, leu2-3, leu2-112) . a estirpe1 JWG2-2C de S* cerevisiae foi derivada de um cruzamento da estirpe de S* cerevisiae DCS (leu2-3, leu2-112, his3, gaI2, canl-11), com a estirpe YM146 de S, cerevisiae (Oé , gallA!52, trpl-289, ura3—52, rho)· A estirpe DC5 de S, cerevisiae foi obtida de James R* Broach, S.U.N.Y., Stonybrook, New York, U.S.A. A estirpe' YM146 de S, cerevisiae foi obtida a partir de Mark Johnson, Washington State University, Pullman, Washin-gton, USA. As células Leu transformadas foram semeadas em meio mínimo (Difco YNB), contendo todos os suplementos necessários excepto leucina, e contendo também benomilo (50JtAg/rii) * 23- 69 721 SKB CASE 14222-3 (η! // /

Obtiveram-se várias colónias resistentes- ao benomilo.

Os- plasmídeos contendo p gene- de C. albicans que codi fica uma enzima que confere a resistência ao benomilo foram recuperados de acordo conr o procedimento do Exemplo 1. O ADN de plasmídeo foi isolado dos transformantes de E, coli individuais de acordo com o método a escala reduzida de Sherman et al., citado acima, o tamanho da inserção de C. albicans nos plasmídeos recuperados foi estimada por electroforese em gel de agarose, 0 ADN de plasmídeo contendo o gene da resistência ao benomilo do C. albicans foi isolado dos transformantes de E. coli* e usado para transformar a estirpe de S. cerevisiae, JWG2-1IDj , his3, trpl—289* leu2-3, leu2-112, gallAL52) de acordo com o procedimento do Exemplo 1. A estirpe JWG2-13D de S, cerevisiae foi derivada pelo mesmo método que a estirpe JWG2-2C de S. cerevisiae.

Os microorganismos hospedeiros de S. cerevisiae. trans formados’ eo® um plasmídeo contendo o gene da C. albicans de resistência ao benomilo de acordo com o método descrito acima, foram seleccionados eomo se descreveu acima, A presença de plasmídeo nos hospedeiros transformados foi confirmada de acor do com o método do Exemplo 1. por sementeira em meio contendo benomilo» Analisaram-se ainda três isolados independentes, designa d os por pCAbe n 17 pCAbe n3 e pCAbe n 15 p or ma pe a me nt o ("ma p-ping") de restrição e todos· revelaram conter 5,8 pares de Kilo base (Kbp) de fragmentos de ADN de C, albicans.

EXEMPLO 4 - EXPRESSÃO DO GENE DE C. ALBICANS DE UTILIZAÇÃO DO SORBITOL, EM Si CEREVISIAE 0 gene de C. albicans, de utilização do sorbitol, permite o crescimento numa fonte de carbono de sorbitol. As estir pe® de C. albicans podem crescer em sorbitol mas a S. cerevi-5Í9® ® outras espécies de Saccharomyces não podem utilizar este açúcar. Este gene confere então uma nova característica à estirpe de S. cerevisiae transformada, como se segue. O isolamento do gene de utilização de sorbitol de C. al 69 721 SKB CASE 14222-3

-24- bicans· foi levado a cabo de acordo com o procedimento do Exem pio 1, com excepção de se> ter usado a estirpe JWG2-2C de S . cerevisiae como hospedeiro. Os transformantes Leu+ semeados e-m meio mínimo (DIFCO YNB) contendo todos os suplementos necessários excepto a leucina e a glucose* e contendo tambám 2% de sorbitol.

Os plasmídeos contendo um gene de C. albicans que codifica para um enzima que confere a capacidade de utilização do sorbitol foram recuperados de acordo com o procedimento do Exemplo 1. O ADN de plasmídeo foi isolado dos transformantes de B* coli de acordo com o mátodo em pequena escala de Sher- man et al», citado acima e o tamanho da inserção de C. albi cans dos plasmídeos recuperados foi estimado por electrofore-se em gel de agarose. 0 ADN do plasrnídeo contendo o gene de utilização do sor bitol da C «a lbicans, foi isolado dos transf ormantes de E« coli acima descritos e usados para transformar a estirpe JWG2-11D de S, cerevisiae de acordo com o mátodo do Exemplo 1.

As células hospedeiras de S. cerevisiae transformadas com um plasmídeo contendo o gene de utilização de C. albicans foram seleccionadas como se descreveu acima. A presença do plasmídeo nos hospedeiros transformados foi confirmada de acor do com o mátodo do Exemplo 1. 0 ADN de dois isolados independentes, designados por pCAsor2 e pCAsor9,. foi ainda analisado por mapeamento de restrição . 0 pCAsor 2 revelou conter uma in serção de ADN 4,,5 Kbp de C. albicans·, enquanto que o pCAsor9 revelou conter uma inserção de ADN de 4,8 Kbp de C, albicans que mostrou pouca homologia com a inserção de ADN de C. albicans no pCAsor2 . EXEMPLO 5 - EXPRESSÃO DO GENE DA GaLACTOQUINaSE DE C. ALBICANS1.

EM S. CEREVISIAE O isolamento do gene da ga lactoquinase de C» a lbicans. que complementa a mutação gall de S. cerevisiae, foi levado a cabo de acordo com o procedimento do Exemplo 1, excepto que /·· /' /·· /'

<ϊ 69 721 SKB CASE 14222-3 -25- se usou a estirpe JWG2-11D de S. cerevisiae como hospedeiro.

Os transformantes Leu+ foram semeados em meio mínimo (Difco YNB) contendo todos os suplementos necessários excepto a leu cina e glucose, e contendo ainda 2% de galactose*

Os plasmídeos contendo o gene de C. albicans que codi fica para a galactoquinase foram recuperados em E, coli de acordo com o procedimento do Exemplo 1. O ADN de plasmídeo foi isolado dos transformantes individuais de E. coli de acor do com o método do Exemplo 1. O ADN do plasmídeo contendo o gene da ga lactoquinase de C. albicans, foi isolado dos trans-formantes de E« coli como se descreveu acima e usado para trans formar a estirpe JWG2-11D de S. cerevisiae de acordo com omito do do Exemplo 1.

Os microorganismos hospedeiros, de S. cerevisiae, tranis formados com um plasmídeo contendo o gene da ga lactoquinase de c. albicans foram seleccionados como se descreveu acima, e a presença do plasmídeo no hospedeiro transformado foi confirmada de acordo com o método do Exemplo 1« Analisaram—se ainda dois isolados independentes, designados por pCAgall-1 & pCAgall-4 por mapeamento de restrição o que revelou que a inser ção de ADN de 7 Kbp de C. albicans em pCAgall-1 é idêntica à porção interna da inserção de 13 Kpb no pCAgaIl-4. A presença de uma sequência· de ADN de C. albicans codificando para a ga lactoquinase nos· transforma ntes de S. cerevi-sisa foi ainda demonstrada por medição do nível de galactoquinase na estirpe JWG2-1ID com ou sem o plasmídeo pCAgall-4, A actividade enzimática, medida pelo método de Butt et al.„ FNAS--USA, 81, 3332—3336 (1984) foi apenas detectada nas culturas induzidas pela galactose contendo pCAga11-4 . 0 promotor do gene de galactoquinase de C. albicans re velou ser activado positivamente pelo regulador positivo de S. cerevisiae.. o produto de gene GAL-4, como se segue. A estirpe JWG2-11D contendo pCAga11-4 foi cruzada (mated) com outra estirpe de S., cerevisiae (genotipo: c/.-trpl-2 89, leu2-3, leu2-12, ga 11-152.. ura3-52) contendo um vector vaivém de 2jUm Leu2 contendo o gene GAL-4 de S, cerevisiae. 0 diplóide resultante foi 69 721 SKB CASE 14222-3

-26- mantido em meio privado de leueina e triptofano. o nível de galactoquinase induzido foi significativa mente mais alto na presença do plasmídeo expressando o gene GAL-4. Este resultado- indica que a sequência de C> albicans em pCAgall-4 con têm um promotor regulado pela galactose que responde a proteínas reguladoras de S. cerevisiae .

EXEMPLO 6 - EXPRESSÃO DO GENE DA ISOMALTASE DE C. ALBICANS EM S, CEREVISIAE A enzima isomaltase cliva as ligaç3es 0^-1-6 glucosí-dicas, e permite aos microorganismos que a expressam o cres cimento na fonte de carbono conhecida por ^-metil-D-glucopi ranosido (por ex. isomaltase). Algumas estirpes de C. albicans podem crescer neste substracto mas a maior parte das es tirpes de S. cerevisiae nâfo podem utilizar naturalmente este açúcar. Esta encima tem sido encontrada noutras espécies de Saccharomyces. Como tal, o gene de C. albicans que codifica para a isomaltase confere uma nova característica ao hospedeiro de S, cerevisiae transformado. O isolamento do gene isomaltase de C« albicans. foi le vado a cabo de acordo com o procedimento do Exemplo 1. Os transformantes Leu foram semeados num meio mínimo (Difco YNB) contendo todos· os suplementos necessários excepto a leueina e contendo também 2% deO£ -metil-ET-glucopiranosldo.

Os plasmídeos contendo o gene de C« albicans que codifica para a isomaltase foram recuperados de acordo com o procedimento do Exemplo 1. o ADN de plasmídeo foi isolado dos transf ormantes individuais de E. coli de acordo com o método do Exemplo 1. O ADN de plasmídeo contendo o gene da isomaltase de C . albicans foi isolado dos transformantes de E. coli descritos acima e usados para transformar a estirpe JWG2-11B de S. cere-visiae de acordo com o método do Exemplo 1.

Os microorganismos hospedeiros de S. cerevisiae, trans formados com um plasmídeo contendo o gene da isomaltase de c» a lbicans foram seleccionados como se descreveu acima, e> a pre 69 721 SKB CASE 14222-3

-27- sença do plasmídeo no hospedeiro transformado foi confirmada de acordo com o método do Exemplo 1,

EXEMPLO 7 - EXPRESSÃO DO GENE1 DA GLUCOAMILASE DE C, ALBICANS, SM S, CEREVISIAE 0 gene· da glucoamilase de C, albicans codifica uma enzima que permite o crescimento em amido solúvel. Algumas estirpes de C. albicans. podem utilizar este amido solúvel como substracto, mas a s. cerevisiae não pode utilizar naturalmente esta fonte de carbono. Esta enzima, glucoamilase, tem sido encontrada noutras espécies de Saccharomyces. Como tal, o gene de C. albicans, que codifica para a glucoamilase (que cliva as ligações-1-4-glucosídicas) confere uma nova caracteríss tica ao hospedeiro de S. cerevisiae transformado. O isolamento do gene da glucoamilase de C. albicans foi levado a cabo substancialmente de acordo com o procedimen to do Exemplo 1, com excepção de se ter utilizado uma estirpe JWG2-2C de S. cerevisiae como hospedeiro. Os transformantes Leu+ foram semeados em meio mínimo (Difco YNB) contendo todos os suplementos- necessários excepto a leucina e glucose, e con tendo também 2% de amido solúvel. Os transf ormantes de E. coli segregaram provavelmente o gene· da glucoamilase, uma vez que começaram a crescer colónias satélite adjacentes às colónias gra nde s or ig ina is .

Os plasmídeo® contendo o gene da glucoamilase da C. a 1-bicans foram recuperados em Ξ. coíi e o plasmídeo de ADN foi isolado dos transf ormantes individuais- E. coli de acordo com os métodos- do Exemplo 1. 0 ADN de plasmídeo contendo o gene da glucoamilase de C. albicans isolado dos transformantes de E. coli, como descrito acima, foram usados para transformar a estirpe JWG2-11D de S. cerevisiae de acordo com o método do Exemplo 1*

Os mieroorganismoe hospedeiros de S» cerevisiae, trans formados com um plasmídeo de acordo com o método acima descri to, foram seleccionados como se descreveu acima. A presença do plasmídeo no hospedeiro transformado foi confirmada de acordo 69 721 SKB CASE 14222-3 c.

;/

-2 8- com o método do Exemplo 1#

Três isoladosr independentes, designados por pSTA27-l, pSTAl-3: e pSTAl5—1, foram ainda analisados por mapeamento de restrição, o que revelou que pSTA27-l e pSTAl-3 contém uma inserção de ADN de C, albicans, idêntica enquanto que pSTA15--1 contém uma inserção de ADN de C, albicans possivelmente di ferente. O plasmídeo pSTA27-l foi introduzido por transformação (Ito et al., acima citado) em três estirpes de S, cerevis jae diferentes, uma estirpe (genotipo: oZ, leu2~, hisl), uma segun da estirpe (genotipo:^, leu2, hisl) e uma terceira estirpe fgenotipo: , leu2, hisl) . As mesmas três estirpes foram tam bém transformadas com o plasmídeo vector progenitor YEpl3 pri vado de todas as sequências de C, albicans, O crescimento de todas as seis estirpes transformadas foi testado em meio completo (YEP) contendo 0,5% de maIto-oligossacarídeos (Mos) (Pfanstiel - Laboratories Ine,) como única fonte de carbono#

Este composto, Mos,, consiste numa mistura de polímeros de glucose ligados por ligações alfa-l,4-glucosídicas, É desprovido de glucose, maltose e maltotriose, e consiste portanto de oligómeros· de alto peso molecular que não podem ser usados como fontes de carbono por estirpes de· Saccharomyces cerevi-siae. Isto devesse ao facto de: 1) estes polissacarídeos néfo entrarem nas células de S. cerevisiae e 2) as estirpes de S» cerevisiae não segregarem uma actividade enzimática (amilase ou glucoamilase) capaz de degradar extracelularment© o Mos·,

Enquanto todas as três estirpe® transformadas· com o plasmídeo YE^IS não cresceram em meio contendo Mos, as mesmas três· estirpes portadoras do plasmídeo pSTA27-l, bem como a estirpe 792-1 de G# albicans (cortesia de J., Kwon-Chung, NatL Inst. Health, U.S,A.) crescem bem neste meio. Este resultado, indica que o fragmento de ADN de C, albicans clonado em pSTA27 -I possui um gene que codifica uma enzima capaz de degradar Mos numa fonte de carbono que se pode usar.

Este gene· é expresso em S, cerevisiae, e o seu produto

69 721 SKB CASE 14222-3 -2 9- é segregado para o meio de cultura.

De forma a confirmar a expressão e secrecção de gluco amilase de C. albicans porum hospedeiro de S. cerevisiae transformadp com ela, os- meios de cultura de todos as seis es tirpes de S. cerevisiae transformadas, bem como o da estirpe 792-1 de C, albicans, foram testados no que diz respeito à pre sença da aetividade da glucoamilase de acordo com o método descrito por Searle· et al, FEMS Microbiology Letterslll, 211--212 (1981). Verificou-se que enquanto os meios de cultura das estirpes de S. cerevisiae transformadas com YEplJ estavam isen tos de qualquer aetividade de glucoamilase detectável, os meios de cultura da estirpe 729-1 de C, albicans e o da S. cerevi- contendo pSTA27-l continham quantidades apreciáveis de glu coamilase. De facto verificou-se que as estirpes de S_, cerevisiae com o plasmídeo pSTA27-l segregam? 15 a 3Ό vezes? mais acti-vidade de glucoamilase no meio de eultura do que a estirpe 792--1 de C. albicans. A aetividade da glucoamilase segregada por estirpes de S » cerevisiae transformada com pSTA27-l foi ainda caracteriza-da & comparada à que foi segregada pela estirpe 792-1 de albicans da seguinte maneira: a» Determinou-se que o pH óptimo da enzima segregada por estirpes de S_^ cerevisiae está entre 4,5 e 6,0 e ê idêntico ao da enzima segregada por C_. a lbicans. b* Verificou-s© que o óptimo de temperatura da enzima segregada por cerevisiae era de δο^ϋ e ê idêntico ao da en-z?ima segregada pela Ç_^ a lb icans.

Cf Analisaram-se alíquotas do meio de cultura derivado de uma estirpe de S. cerevisiae (genotipo; , leu2, hisl), aci ma descrita, transformada com YEpl3’ ou pSTA27-l e da estirpe 792-1 de Çj^ albicans, por electroforese em gel de poliacrilami^ da> SDS. Uma banda difusa de proteína de um peso molecular maior que 94 K dalton está presente na estirpe de cerevisiae acima descrita, transformada com meio pSTA27-l mas ausente do meio derivado da estirpe transformada com YEpl3. Detecta-se /// ///

69 721 SKB CASE 14222-3' -30- uma banda proteica semelhante#. se não idêntica# embora em quantidades muito ma is baixas# em meio derivado da estirpe 792-1 de Calbicans.

Tomados em conjunto# estes resultados indicam que o fragmento de ADN de c_j_ albicans clonado em pSTA27-l transpor ta um gene de a lbicans codif icancEo a glucoamilase #, que e£ te gene é expresso na levedura cerevisiae# e que o produto deste gene é segregado para o meio de cultura pelas células de cerevisiae.

Os Exemplos 8 e 9 revelam: o isolamento e utilização de várias regiSes replicadoraq de C, albicans que suportam a re-plicação autonoma de plasmídeoe recombinantes em microorganis mos heterólogos de cerevisiae hospedeira*.

EXEMPLO 8 - TRANSFORMAÇÃO DE S, CEREVISIAE COM UM PLASMÍDEO RECOMBIMANTE CONTENDO UMA REGIÃO REPLICADORA DE C. ALBICANS A* Materiais e métodos

Utiliz:ou-se a estirpe SF8 de Echerichia coli (C600# leuB# thr# pro* Bl# rk“# mk“# recBC~# lopll* liq+) ZTcameron et aL# PNAS#. USA* 72# 3416-3420 (I975)J7# para a transforma ção bacteriana e propagação de plasmídeos. As bactérias cresceram em LB (meios ricos) ou M9 (meios mínimos) suplementado como necessário Z7(Miller# "Experiments In Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, New York#. 431-433 (1972)J7. Usou -se a estirpe 483 de Saccharomyces cerevisiae (genotipo: a# leu2-3# leu2-112* his4-5l9# canla) como hospedeiro para a trans formação da levedura. Esta estirpe foi obtida a partir de Mi-chael Culbertson, University of Wisconsin# Madison# Wisconsin. As culturas de levedura cresceram em YPG (meios ricos,* 1% de ex tracto de levedura, 1% peptona# 2% glucose) ou YNB (meio mínimo? Difco YNB) suplementado com histidina (2jUg/ml) e leucina (2jug/ml) como se pretender.

Utilizou-se o plasmídeo M85I /"Gorman ©t al.# Mol, Gen. Genet*# 183# 306-313 (I981)_7* Utilizou-se a estirpe 792-I de C. albicans como fonte de ADN genómico# 69 721 <r.; SKB CASE 14222-3 -3 ΙΟ ADN de plasmídeo cireular cova lentemente fechado foi preparado a partir de culturas de E\. coli cultivadas em gluco se-M9 amplificada com cloroanfenicol. 0 ADN foi extraído epurificado por uma técnica de lisados clarificados essencialmen te como descreveu Clewell, J« Bacteriol., 110, 667-676 (1972).

Produziram-se preparações de plasmídeos de E_. coli em bruto, usadas para transformação de leveduras & análise preli minar por gel, usando o procedimento de Birnboim e Doly, Nuc. Acids·. Res., 1513-1523 (1979). Dez ml de cultura bacteria- na (2 x 1010 células) deram l-2jlig de ADN de plasmídeo em bru to. Para detecção rápida de transformantes bacterianos no que diz- respeito à presença de plasmídeo, usaram-se mini-lisados de colónia única, preparados pelo mesmo método.

Para recuperação do ADN total de S_. cerevisiae, utilizou-se o método de pequena escala de Sherman et al», acima ci. tado»

Preparou-se ADN de albicans pelo método de Rigby et al., J. Mol» Biol.. 113. 237-251 (1977).

Todos os procedimentos de análise por gel e hibridação empregues estavam de acordo com o método de Maniatis et al., acima citado. A E. coli foi transformada usando o método do cálcio - choque térmico, como modificado por Dagert e Erlich,

Gene. 6, 23-28 (1979). O procedimento usado para transformação de leveduras foi essencialmente como descrito por Beggs Nature, 275, 104-109 (1978), usando (b-glucuronidase-sulfatase (Sigma) por formação de esferoplastos, com a excepção de se ter usado uma concentração mais baixa de ADN de plasmídeo (0,5-I,0/ig por 9 10 esferoplastos) . B. Resultados 1. Construção do plasmídeo

Misturou-se o ADN total de Candida, digerido completa-mente com a endonuclease de restrição Pstl, com o ADN de plasmídeo M851 clivado por Pst-I em concentrações estimadas, para dar uma recuperação máxima de plasmídeos contendo inserções de Candida pelo método de Dugaiczyk et al», J. Mol. Biol., 96, 69 721 SKB CASE 14222-3

V '

c~' -32- 171-184 (1975)r e ligou-se com T4 polinucleotido ligase. Este, procedimento inseriu o ADN por ligação no local pstl único do M851. a mistura ligada foi usada para transformar a estirpe SF8 de B. coli a prototrofia à leucina. Os transformantes Leu+ foram então testados quanto à sua sensibilidade a ampicilina. A interrupção do gene ampr por um fragmento inserido resulta na perda de resistência à droga. Como tal as colónias amps (5„8% de transformantes bacterianos Leu+) foram seleccionadas como plasmídeos presumivelmente contendo sequências de Candida. Estes plasmídeos híbridos foram designados por pCA seguidos por um número de isolado. 2. Transformação de levedura

Os plasmídeos contendo uma sequência replicadora de levedura transformam a levedura a alta frequência, reflectindo a replicação autonóma do plasmídeo na célula eucariota. Se o pias mídeo estiver privado de um replicador funcional, ele também a transformará, mas a uma frequência baixa * Presumivelmente, esta transformação estável a baixa frequência reflecte a integração do gene plasmídeo Leu2+ no ADN cromossótrrico por recombinação homóloga. Se os replicadores cromossómicos· da Candida foram fun

ΙΜΜΒΜΜΜΜΜΒΜΜ·· MM cionais em levedura, os plasmídeos híbridos que os contêm podem ser caracterizados pela capacidade de transformar a levedura a alta frequência.

Testaram-se quarenta e um (41) plasmídeos pCA individu-almente- no que diz respeito à sua capacidade de transformar a S.. cerevisiae Leu2 em Leu+. Cinco dos quarenta e um plasmídeos pCA testados mostraram transformação de alta frequência. Estes resultados indicaram que tais plasmídeos se podem replicar autonomamente em S_* cerevisiae. 3 · Detecção do ADN de plasmídeo em S. cerevisiae

Se a transformação a alta frequência indicar a presença de uma sequência de Candida que permita a replicação autónoma do plasmídeo, deverá ser possível recuperar as moléculas circu lares fechadas cova lentemente da levedura Leu+ instável transformada com ADN dos plasmídeos pCA, y x ‘ ' "jzjzsbuCZ’

69 721 SKB CASE 14222-3 -33- 0 ADN de levedura na srua totalidade foi extraído das estirpes de leveduras progenitoras· e transformadas, submetido a eleetrof orese num gel de agarose a \„Q%r e transferido para um papel de nitrocelulose. 0 ADN foi então hibridado com 32 uma sonda pBR322 marcada com P . Esta sonda não tem nenhuma homologia com o ADN cromossómico de levedura. 0 ADN das cultu ras transformadas foi transferido para filtros de nitrocelulo 3; 2 se e hibridada com pBR322 marcado cota P . As sequências de ADN hibridadas a esta sonda podiiam ser detectadas em extractos de S_. cerevisiae transformados com um dos cinco plasmídeos pCA dando transformação de alta frequência, bem como com o plasmídeo de controlo pYP42 (Gorman et al», acima citado)· 4„ Transformação de E, coli com ADN de Plasmídeo de levedura

As preparações de plasmídeo de levedura analisadas por técnicas de hibridação foram também examinadas no que diz respeito à sua capacidade de transformar E. coli leuB em Leu+. As colónias bacterianas seleccionadas num meio deficiente em leu-cina foram examinadas quanto a presença de plasmídeos por ele-ctroforese em gel de agarose de mini lisados. Os cinco extractos de levedura que mostraram conter plasmídeos· por hibridação deram lugar a coli Leu+ que continham ADN de plasmídeo. O ADN de plasmídeo de um dos cinco plasmídeos pCA de transformação de alta frequência foi comparado com o plasmídeo isolado de S. coli a seguir à transferência através do hospedeiro S_. cerevisiae . Os plasmídeos contendo uma inserção de albicans de 4,0 pares de kilobases (Kbp), revelaram ser idênticas.

Outras regiões replicadoras de Candida úteis na manuten ção autónoma de plasmídeos usados para transformar Saccharomv-ces podem ser isoladas de acordo com o método de Kawamura et al., acima citado; Hsu et al., acima citado; ou Tikhomirora et al.,, acima citado* Os plasmídeos contendo tais regiões repli cadoras podem ser preparados de acordo com o método descrito neste Exemplo.

69 721 SKB CASE 14222-3

EXEMPLO 9 - TRANSFORMAÇÃO DE S. CERBVISIAE COM UM PLASMÍDBO CONTENDO UMA REGIÃO REPLICADORA DE C, ALBICANS E UMA SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DE C, ALBICANS

Um plasmídeo contendo uma regido replicadora de a 1-bicans e uma sequência de codificação de C_. albicans pode ser preparado combinando os métodos dos Exemplos 1 e 8. Este pias mídeo pode ser usado para transformar S_. cerevisiae de acordo com o método do Exemplo 1, e a expressão da sequência de codi ficação de C^ albicans pelo hospedeiro cerevisiae transfor mado pode ser detectada de acordo com o método do Exemplo 1,

Os genes para glucoamilases de ratinho (Thomsen, 1983, Carlsberg Res, Commun, 48:545), trigo, Asperiqillus (Innis et al#, 1985, Science, 228:21) e S, diastaticus (Yamashita and Fukui, 1983, Agrie» Biol. Chem., £7:2689) revelaram ser segre gados para o meio quando expressos em 5, cerevisiae. Quando produzida por C_. a lbicans ou por um hospedeiro cerevisiae transformado, a enzima glucoamilase de Ç_. a lbicans é excretada para o meio. Verificou-se agora que o gene da glucoamilase de C_j_ a lbicans, também chamado gene STA, isolado como se descreveu no Exemplo 7 proporciona sequências de ADN para um novo promotor e um péptido sinal que funciona na secrecçâo da proteína. 0 uso de um péptido sinal na secrecçâo de uma proteína citoplasmdca é revelado, por exemplo, em Silhavy et al., Paten te dos E.U.A, 4 3 35 336, concedida em 22 Junho de 1982. Este péptido sinal do gene da glucoamilase pode ser usado num siste ma para secrecçâo de proteínas nativas ou heterólogas expressas por Candida, Saccharomyces ou outras células de levedura transformadas com ele. Este sistema de expressão orienta a pro tsínaheteróloga para a via de secrecçâo, conduzindo a modifica^ çSes pós- ou co-produccionais da. proteína sintetizada. O promotor e as sequências de sinais do gene da glucoamilase da C. a lbicans estão identificados na Fig. 1. A Fig. 3 ilustra o péptido sinal sozinho. A sequência de sinais permite a orientação da proteína heteróloga para a via de secrecçâo. Co mo tal, ela pode ser usada num sistema de expressão para permitir a secrecçâo de uma proteína recombinante no meio de cultu- -35- -35- - // (fí!... / /:--_=5BSE3í 69 721 SKB CASE 14222-3 ra sob o controlo do seu próprio promotor ou sob o controlo de promotores de levedura heterólogos.

Os seguintes Exemplos 10-13 demonstram uma variedade de usos destas sequências de ADN funcional de C. albicans, por ex», o uso de sequências de sinais e promotores de C. albjcans para expressar e segregar uma proteína heteróloga em cerevisiae e o uso da sequência de sinais de C_. albicans com outros promotores de levedura para tal expressão e secrecção.

Em geral nestes exemplos, são construídos veetores de E1» coli que permitem a fusão estrutural de tradução de péptido© ou proteínas heterólogas à região promotor/péptido de sinais deste gene de glucoamilase. Estas eonstrucções de genes· híbridos, (por ex», regiSes de péptido sinal e promotor da glucoamilase ou péptido sinal sob controlo de outro promotor de levedura) fundidas a um gene heterólogo são então transferidas preferivelmente para veetores vaivém de plasmídeo de E^ coli/Saccha-romyces para transformação em células de levedura,

EXEMPLO 10 - EXPRESSÃO E SECRECÇÃO DE HIV-I GP160 SOB CONTROLO DA REGIÃO PEPTIDO DE SINAL/PROMOTOR PA GLUCOAMILA-SB DE C, ALBICANS EM S, CEREVISIAE

Um sistema de expressão que emprega o péptido sinal e promotor da glucoamilase da a lbicans foi empregue para produzir a glicoproteína gpl60 do envólucro virai do vírus HIV-I, o gplôo é um dos antigénios de interesse para uso em potenciais vacinas contra a SIDA e sua terapêutica e pode ser usada como agente de diagnóstico na detecção da infecção por HIV. A. Construcção de veetores plasmídeos de E, coli 0 plasmídeo de E. coli pUC13 /TJ. Viera et al„. Gene 19; :259-68 (1982)_I7 foi linearizado por co-digestão com as enzimas de restrição Accl e HindiII, 0 plasmídeo linearizado foi ligado a um fragmento de ADN Tagl a HindIIl construído como se segue, um fragmento de ADN de Tagl a Fnu4Hl compreendendo a região e de péptido de sinal e promotora do gene STA de levedura de Candida albicans (codificando para a enzima segregada, glucoamilase) foi purificado a partir do gene clonado, A sequência // f: /·%!-===£*»

69 721 SKB CASE 14222-3 -36- de nucleótidos- deste fragmento de ADN é mostrada na Fig. 1.

Um oligonucleótido sintético de duas cadeias com a seguinte sequência:

Fnu4Hl BglII HindIII

CGCTCCAGATCTA

CGAGGTCTAGATTCGA foi ligado ao fragmento de Tagl a Fnu4 descrito acima. 0 produto desta ligação , (um fragmento de ADN de Tagl a HindIII) após purificação em gel# foi ele próprio ligado ao ADN de PUC13 digerido por Acc1/Hindiii. As misturas de ligação foram usadas para transformar à estirpe MM2 94 de K_. coli (disponível na American Type' Culture Collection, como ATCC 33625 ou ATCC 39607).

Seleceionaram-se transformantes em placas de ampicili-na ma is LB e analisaram-se por híbridação por filtros de coió nias usando uma sonda radiomarcada contendo sequências homólo gas ao fragmento Tagl a Fnu4Hl. O ADN de plasmídeo de trans-formantes apropriados foi sujeito a análises de enzimas de restrição e de sequenciação de nucleótidos. 0 plasmídeo selec cionado resultante destas análises pTI-18 (pRIT13046) contém toda a região promotora do gene STA de levedura,, bem como a sequência de ADN codificando para os primeiros 22 aminoácidos NH2 terminais da proteína glucoamilase, que representam o pé-ptido sinal desta proteína segregada. Imediatamente a seguir ao local de clivagem do peptido sinal, introduziu-se um local de clivagem de restrição único BglII como parte do oligonucleó tido sintético· descrito acima. A clonação da sequência de codificação (ou parte dela) dos genes estranhos no local BglII, de tal forma que se respei te a estrutura de leitura do péptido sinal bem como a da proteína estranha, permite,· uma vez transferida a construção para um plasmídeo de levedura e introduzida nas células de levedura, a expressão do gene híbrido através do promotor do gene STA da glucoamilase e o direccionamento da proteína estranha para a via de secrecção através da sequência sinal da glucoamilase. 69 721 SKB CASE 14222-3

(L -37- B. Clonação da sequência de codificação da glico-proteína do envólucro do HIV (gp!60) num veetor de levedura

Um clone genómico da variante BH10 do HIV Rattner et alM, Nature,, 313 :277-284 (1985)J7 foi digerido comas enzi mas de restrição Asp7I8 e Xbai. Um fragmento de ADN de Asp718 e Xbai de a próxima da mente 2550 pares de 4 bases foi purificado em gel. Este fragmenta contém a sequência codificadora da glicoproteína do envolucro gp!60 (o gene env)começando no ami noácido Val42 e estende-se1 várias centenas de nucleótidos pa ra lá do codão de paragem de tradução (TAA) do gene env. Este fragmento foi tratado com nuclease de "Mung bean,r (feijão tipo soja) de acordo eom Maniatis et ai*, acima citado de modo a tomar-lhe a extremidade romba. O plasmídeo pIT-18 (pRIT13046) descrito acima foi linea rizado por digestão com a enzima de restrição Bglll tratado com Klenoxl polimerase na presença de trifosfatos de desoxinu-cleótidos (dNTP's) de modo a encher extremidades protuberantes 5'. O fragmento e plasmídeo foram ligados usando a T4 ADN liga se. As células de E_. coli foram transformadas com a mistura de ligação. Os transformantes foram analisados por hibridação por filtros de colónias. A análise das enzimas de restrição e sequência de ADN foi levada a cabo em ADN de plasmídeo extraído de transformantes seleccionados.

Estas análises permitiram a selecção de transformantes contendo o plasmídeo pri-18/gpl60 (pRIT13047). Este plasmídeo contém o fragmento do gene env de HIV definido acima,, fundido na: estrutura ã sequência de sinais do gene STA e precedido pela região promotora do gene STA. A sequência de ADN e de aminoácidos da junção relevante entre a região de codificação da sequência de sinais e a sequência de codificação do gene env é apresentada abaixo. 69 721 SKB CASE 14222-3

-38-

GCC GCT CCA GTA CCT f

Ala L Ala Pro A Vai Pr o locais de clivagem do péptido de junção de sinais BglII]/ /Asp718 da glucoamilase. A parte· revelante do plasmídeo pTI-18/gp!60 (pRIT13047) foi transferida para um vector de levedura da seguinte maneira, 0 plasmídeo foi digerido com as enzimas de restrição Xbal e EspI. Purificou-se em gel um fragmento de ADN Xbal a Espl de apróximadamente 2950 pares de bases. Este fragmento contém (co meçando no local Xbal e continuando em direcção ao local Ξspi) os seguintes elementos?? alguns pares de bases derivados da sequência poli-ligante do plasmídeo pUC13f 355 pares de bases re presentando o promotor do gene STA? 66 pares de bases codificando para o péptido sinal da proteína glucoamilase; a sequência de codificação do gene env descrito antes (começando em Val42 e terminando no seu codão de tradução de paragem natural TAA), seguida por 70 pares de bases de sequências flanqueado-ras 3' não traduzidas.

Este fragmento de ADN foi tratado com a enzima Klenoxl polimerase na presença de dNTP's de modo a encher extremidades' protuberantes 5'. 0 fragmento foi ligado a um vector de levedu ra contendo os componentes· mostrados na Fig, 2 excepto a casse tte de expressão/secreção para o gene env, anteriormente digerida com Sali e tratada com Rlenox polimerase I e άΝΤΡ'β. A mistura da ligação foi transformada em Ε_. coli. Os transforman tés· resistentes à ampicilina foram seleccionados por híbrida-ção de filtração de colónias. O ADN de plasmídeo extraído de transformantes seleccionados' foi analisado por 11 ma pe a mento" das enzimas de restrição e análise da sequência de ADN. 0 plasmídeo pQUG3/gp!60 (pRIT13049) resultante desta análise contém a cassette de expressão/secreção para o gene env seguida imediatamente por uma sequência de terminação da transeripção de levedura derivada do gene D plasmídeo 2yxm /TA. Sutton et al., MoI,Cell,.Biol,, 5^: 69 721 SKB CASE 14222-3 M- zf -3 9- :2770-2780 (1985)_17, e está esquematizado na Fig. 2.0 plas-mídeo pQUG3'/gpl60 (pRITl3049) foi introduzido numa estirpe de S. cerevisiae (genotipo: Mat ura3 leu2 adel glnl) por transformação, Os transformantes de levedura foram se lec c i ona d os no que diz- respeito à sua capacidade de crescer na ausência de glutamina, C. Expressão do gene env HIV em levedura e localização do produto do gene (gp!60) Células de levedura da estirpe de iS. cerevis iae (genotipo: Mat & ura 3 leu2 adel glnl) transformada com o plasmídeo pQUG3/gpl60 (pRlT1304 9) foram cultivadas em meio selectivo.

As células foram colhidas na fase logarítmica tardia oura fase estacionária inicial, lavadas com um tampão salino tamponado com fosfato (PBS) (NaP04, 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) e resus-pensas em PBS e fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF, Sigma) a 1:10 e 1:20 do volume original de cultura.

As células foram lisadas por sujeição a vortex vigoroso na presença de pérolas· de vidro. A suspensão de células des fruídas- foi centrifugada a baixa velocidade (lOOOxg, 10', 4sc) de modo a eliminar as células não destruídas e os resíduo® celulares, o sobrenadante foi retido e representa o ex-tracto celular bruto (C) . Uma alíquota da fracção C foi centri fugada a 30000xg, durante 1 hora a 4¾ obtendo-se uma pelota de membranas bruta (Pl-30) e um sobrenadante (Sl-30) representando a fracção citoplaemética solúvel. A fracção Pl-30 foi re suspensa em PBS com um tampão PMSF 1 mM e extraída com Triton X—100 com uma concentração final de detergente de 1%, A fracção Pl-30 extraída com detergente foi centrifugada a 30000xg durante 1 hora a 4sc. A fracção sobrenadante (S2-3o) foi retida, Adicionalmente, extraíram-se alíquotas de fracçSes C e Sl--30 com Triton X-100-1%.

As várias amostras resultantes deste esquema de fraccio namento celular foram testadas no que diz respeito à presença de material imunológicamente reactivo com anticorpos dirigidos contra a glicoproteína do envolucro virai. Nesta análise usaram-se vários testes "sandwich" ELISA, utilizando-se- uma varie-

69 721 SKB CASE 14222-3 -40- dade de anticorpos comercialmente adquiríveis poli e monoclo-nais dirigidos contra porções da proteína gpl60, por ex., a proteína externa gpl20 e/ou a sua fracção interna gp41, Nalgumas determinações, os soros humano derivado dos pacientes com SIDA foi também usado. Detectou-se material reactivo com anticorpos anti gp!20 bem como anti gp41 na fracçâo C (extrac to celular em bruto) apenas a seguir à extracção por detergen tes, indicando a expressão do gene enV e síntese de gp!60 pelas estirpes de levedura testadas e sugerindo a associação da proteína sintetizada com lípidos e/ou membranas celulares. Aproximadamente 80% deste material de reacção cruzada foi recu perado na fracção de membrana solubilizada extraída com detergente (52-30) confirmando a associação deste material com lípi dos- e/ou membranas celulares. A reactividade deste material em relação aos anticorpos anti-gpl20 bem como anticorpos anti--gp41 sugere que a maior parte senão todos, estão na forma de proteína precursora gplôO não processada. A análise deste material por "immunoblotting" confirma esta hipótese. D. Detecção de gp!60 de HIV num extracto de membrana bruto A fracção S2-30 foi analisada por ELISA de captura no que diz respeito à presença de locais antigénicos HlV-env. Um anticorpo de carneiro para um péptido sintético gp41 de HIV (Biochrom | B7323) foi absorvido em placas de microtitulação NUNC Imunoplate I a uma concentração de 5 /Ag/ml em PBS; 50/1/ /ml de anticorpos foram incubados de ui dia para o outro a 42C. As placas foram lavadas por substituição do conteúdo de cada cavidade 6 vezes com PBS e 0,1% de Tween 20 e incubados com 100 jj.1 de tampão de saturação (PBS + Tween 20 0,1%; + 1% de albumina de soro bovino + 4$ de soro de vitelo recém-nascido) durante 1 hora a 37^0^ As placas foram então lavadas como acima e os- orifícioe individuais foram incubados com diluições em série de S2-30 em PBS + 1% de Triton. Incubaram-se cin quenta ^λ,Ι de antigénio durante 2 horas è temperatura ambiente. as placas foram lavadas como acima e incubadas com um anticorpo monoclona1 para gpl20 de HIV (Dupont § 9284/7054). Usou-se -41- -41- # 69 721

SfKB CASE 14222-3 uma concentração de 1 p.l/ml de anticorpo no tampei o de saturação» Cavidade de cinquenta /11 foram incubadas durante 1 hora a 3 7eC. as placas foram lavadas como se descreveu e a ligação do anticorpo monoclonal anti-gp!20 de HIV foi revelada usando o reagente de imunoglobina de anti-ratinho marcado com bioti-na (Amersham RPN102I) e o complexo estreptavidina-peroxidase (Amers-ham RPN 1051) de acordo com as instruçSes do fabricante» As curvas de titulação obtidas indicara a presença de locais· antigénicos· do gene env do HIV.

E. Optiraização do rendimento de gpI60 do HIV A proteína gpI60, foi produzida por fermentação em lotes de uma estirpe de S_. cerevisiae (genotipo: Mat f ura3, leu2, adel, glnl) contendo o plasmídeo pQU63/gpl60 (pRIT1304 9) com a duração de 25-30 horas num tanque agitado Standard mantido a 302C. O meio rico (1% de extracto de levedura, 2% de pe ptona, 2% de galactose - YEP) foi mantido a pH 5,0 por adição de uma base. O inoculo (10% v/v) foi feito crescer durante 24 horas em YEP e 2% de glucose a 30^0« O crescimento da levedura foi rápido e medido com referência a sua Densidade óptica (D.0»g50) a 650 mm. O tempo máximo de duplicação durante a fase exponencial foi de aproximada mente 3 horas.

Durante a fase de crescimento exponencial, sintetizou--se rápidamente gp!60 e foi medida após apróximadamente 12 horas de crescimento usando ELISA de captura como se descreveu acima. A síntese atingiu o máximo de 600jUg/ml de caldo de fer mentação era aproximada mente 20 horas, após o que foi detetável um rápido declínio em gp!60» 0 início do declínio da concentração de gpl60 coincidiu com o esgotamento do substrato de galactose. 0 metabolismo da galactose foi seguido indirectamente por medição espectromé trica de massa (cada 20 segundos) da concentração de C02 e oxi génio no gás de saída do fermentador. A exaustão de galactose foi correlacionada cora o rápido declínio da % de C02 no gás de saída do fermentador em apróximadamente 20 horas.

Como tal, recolher a cultura um pouco antes do declínio 69 721 SKB CASE 14222-3

C '.r ·.

-42- da % de CC^ no fermentador pode ser crucial para a obtenção de um bom rendimento de gplôo em S_. cerevisiae. F * Purificação de gp!60 e preparação de micelas

Um volume de cá lulas de levedura transformadas foi moí do num aparelho Dynomil na presença de um volume de tampão consistindo de fosfato 25 mM pH 7,0 contendo NaC'1 150 mM, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 1 mM e PMSF 1 mM (Tam pão A) .. A suspensão é centrif ugada durante 10 min a íoooxg e a pelota consistindo de cálulas não destruídas e resíduos celulares á rejeitada, o sobrenadante á por sua vez centrifuga-da 30 min a 30000xg e a pelota extraída com 1% de Triton X--100 no volume original de tampão a. Após centrifugação a 30000xg (30 min) o sobrenadante contendo a gpI60 foi tratado com 20% de polietilenoglicol-400 de modo a precipitar a gpl60. A pelota PEG foi dissolvida em tampão Tris 50 mM pH 7,2 contendo Nacl 150 mM e 1% de Triton X-lOO e suplementado com CsCl 1,5 M e guanidina HC1 4M. Esta solução foi ultracentrifugada num Rotor 50,2 de Titánio durante 65 horas a 4500 rpm.

As fracçSes contendo gpl60 (detectadas por Elisa de captura como acima) foram reunidas, dialisadas contra PBS e concentradas numa ultramembrana Amicon SM-50* A fracção de gpl60 dialisada foi então separada num gradiente de sacarose 10-40% e centrifugada num rotor SW41 a 40 000 rpm de um dia para o outro. As fracções contendo micelas que ficaram positivas para ELISA após- tratamento com Triton foram reunidas e usadas em e£ tudos de imunização.

Esta glicoproteína do invólucro gp!60 de HIV sintetizada pela levedura obtida atravás do sistema de expressão/secre-ção da glucoamilase do presente invento tem potencial como pos sível candidata a vacina. As modificaçSes post- e co-tradução permitias por este sistema de expressão influenciam a estrutu xerciana t — ra/da proteína, a qual pode, por sua vez-, influenciar a indução de uma resposta imune relevante, uma vez- que uma parte significativa do anticorpo á dirigida a epítopos conformacionais. O elevado conteúdo em cisteína e a frequente ocorrência de locais de glic os ilação N- ligados potenciais·· na gpI60 sugerem a formação de pontes dissulfureto e a posterior modificação de

J 69 721 SKB CASE 14222-3

propriedades antigénicas da molécula por glicosilação. Como tal o direccionamento da gp!60 para a via de secrecção num sistema de expressão usando o péptido sinal da glueoamilase obtém-se uma molécula que parece ser estrutural e antigénicamente ma is relacionados com a glicoproteína nativa. As· características estruturais da glicoproteína env-gp!60 obtida através do sistema de expressão do presente invento não estão presentes na proteína do invólucro expressa por intermédio dos sistemas de não se ereção em leveduras /Tver, por ex., P, J* Barr et al., acima citadoJ7 ou em E_. coli /~~ver. por ex,# S. D* Putney et al.,

Science 234:1392-96 (1986)17.

Por exemplo, neste sistema de expressão, a gp!60 sintetizada pela levedura mantem-se não processada nos seus componentes glicoproteicos gpl20 e gp4I. Como tal ambas as proteínas se mantêm associadas à membrana, isto é diferente da situ£ ção das células de mamíferos /Tver/ por ex., Μ. P* Kieny et al./· B i ot e ch η o 1 ogy, 4:790-795 (1986) ~7 enr que a clivagem entre gp41 e gpl20 resulta na dissociação das duas moléculas e liber tação de grande parte das moléculas de gp!20 para o sobrenadan te da cultura. A associação as membranas celulares através de uma região hidrofóbica transmembranar de gp41 pode servir para a incorporação em estruturas particuladas tais como micelas, em lipossomas por associação a lípidos, ou em complexos imuno-estimuladores (ISCOMS) por associação ao detergente quil A. is to pode aumentar a imunogenicidade das moléculas através das propriedades adjuvantes dos lipossomas e ISCOMS e por permitir uma apresentação orientada na superfície destas estruturas , se melhante â superfície virai. ΕΧΕΜΡΙιΟ II - EXPRESSÃO E SECREÇÃO DE TGF-Q£

Construção de vectores bésicos de expressão de levedura

Os plasmídeos usados na construção de vectores para secreção de TGF-OÍ usando a sequência de sinais de glueoamilase são baseados- no vector vaivém de levedura de muitas cópias PYSK102 ^Rosenberg et al., Genetic Engineering. 8:151 (I986)J7* Todos contêm um fragmento EcoRI-PstI de 82 3 pb do gene trpl de -44 — -44 — β vrrrassrifg^:·· SKB CASE 14222-3 levedura /j^sutnper and Carbon, Gene·, ^0:157 (I980)_I7, que pro porciona um marcador sreleccionável# um fragmento EcoRI-PstI de 2,0 Kb do circulo de 2 micron de levedura, /Tiartley e Dona ldson, Nature, 286:860 (1980)~7 que proporciona uma origem de replicação em leveduras, uma porção de pBR322 /Tem "Cloning Veetors", Pouwels, Enger, valk, Eds. (1985)_Z7 que> efectua a re_ plicação e selecção em E^ coli e um módulo promotor-terminador de levedura inserido entre os locais Hindlll e BarnHI do pBR322 As sequências pB322 entre BarnHI e PvuII foram deleccionadas, O promotor empregue nestas construções é um fragmento BamHi-Rsai de 431 pb de CUP1 ZTKarin et al», PNAS USA, 81:337 (1984)_y, derivado como um fragmento BamHl-EcoRI de pYSKI2 Z~Butt et al., Proe, Natl» Acad, Sei» USA, 81:3332 (1984) ; Rosenberg et al», supra; Gorman et al., Gene,, 48:13 (1986)J7 ou uma sequência promotora TDH^, de 1,1 Kb /Tíolland and Hol-land, J. Biol» Chem»» 255:2596 (1980)_Z7, derivada como um fragmento BamHl-EcoRI do plasmídeo pYSK18 /jRosenberg et al» supra; Gorman et al, supra~7. 0 terminador de transeripção é um Kpnl-HindIII de 361 pb do gene CYC1 /^“Smith et al», Ce 11, 16: : 7 5 3' (197 9)^7.

Um ligante sintético com a sequência 5' GAATTCTCGAGCCATGGCCAGTCGACGTAGTTAaGTaGGTaCC 3' está presente na região entre o promotor e o fragmento de terminação CYC1, Esta, sequência sintética contém os únicos locais de restrição Xhol, Ncol e Sair a montante dos codões de paragem de tradução em todas as três estruturas de leitura, B. Construção de pYSKl40 e pYSKl42 O local de clivagem de sinais do gene da glucoamilase foi determinado pela sequênciação dos aminoácidos do terminal amino da glucoamilase segregada do exemplo 7. A sequência de ADK da extremidade 5” da região de codificação do gene da glucoamilase e a sequência de aminoácidos correspondente, com o local de processamento é mostrada na Fig. 3, Sintetizou-se uma sequência oligonucleotídica sintética correspondente â sequência de sinais· e de nucleótidos flanqueadores contendo locais de endonuclease de restrição. Esta sequência é mostrada na Fig

69 721 SKB CASE 14222 -3 -45- 4 * Os asterisco acima das bases indicam cargas para introdução dos locais de clivagem pela endonuclease de restrição. A sequência de sinais acaba após o último asterisco. Sste fragmento duplo Standard foi inserido nos vectores básicos descri tos· acima que tinham sido clivados com Xhol e Ncoí de modo a dar pYSKMO (promotor CUPl) e pYSKl42 (promotor TDH3). A sequência de sinais- sintéticos da glucoamilase corrente contém os codões para os aminoácidos Asn Ala Ala Pr o na extremidade 3' de modo a proporcionar o local de processamento (ver Fig, 3) * A presença dos dois aminoácidos Ala e Pro no lado 3' do local de clivagem pode ser essencial para uma boa clivagem* Contudo, isto resulta na presença de dois aminoácidos' extra na extremidade 5· de qualquer proteína segregada por utilização desta sequência de sinais,, Estão a ser construídos· plasmídeos que permitirão fusSes directamente após os codSes Asn e Ala, A secreção e processamento na extremidade 5' das proteínas de fusão feitas com estes vectores são supostas ser tão úteis como a presente sequência de sinais. C. Construção de PYSK151 e PYSK152

Sintetizou-se um oligonucleotido correspondente à sequência de ADN^ do factor de transformação do crescimento huma no maduro (TGF-ôQ 0>erynck et ai,, Ce 11. 38 s2 87 (1984).17 ma is bases adicionais nas extremidades- 5* e 3' e efectuaram-se quatro mudanças conservativas de bases para se obterem locais de endonuclease de restrição* Esta sequência é mostrada na Fig. 5. A porção Ncoí e Sali da sequência TGF-0/ foi inserida em PYSK140 e pYSK142 clivados· com Ncoí e Sali de modo a dar pYSK15I e PYSK152 respectivamente· A construção resultante pro porciona um codão ATG no início do sinal da glucoamilase e um codão ATG estrutural (met) no início do péptido TGF-o£. D. Expressão e secreção de TGF-<*em culturas de levedura

Usou-se ADN de plasmídeo (2-lOyug/ml) para transformar a estirpe F762 de cerevisiae (Mata. trpl 1. ura3'-52) usando técnicas Standard /JSherman et al.,, Methods in Yeast Genetics. 69 721 SKB CASE 14222-3

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Cold Spring Harbor, (1986)J37, seleccionando para prototrofia de triptofano. A estirpe F762 foi obtida de Phillip Hunter, Department of Molecular Biology and Genetics, Johns Hopkins Medicai School Baltimore, Maryland. Fizeram-se crescer culturas de transf ormantes· seleccionados· em YNB (difco) contendo 2% de glucose e uracil (20/jig/ml) . Nos plasmídeos utilizando o promotor CTJP1, incluiu-se sulfato de cobre 100 micromolar. Recolheram-se as culturas nas fases logarítmica tardia avança da ou estacionária. As células foram agitadas,, e o meio de eul tura e as células retidas».As pelotas de células foram lavadas, destruídas com esferas de vidro em tampão de acetato 0,05 M, pH 5,0, e a suspensão foi centrifugada a 5000xg de modo a remover as esferas de vidro e resíduos celulares, os^ extractos celulares solúveis e os fluídos da cultura foram então diali-sados contra 2% de ácido acético de um dia para o outro usando membranas com uma retenção (cut-oíf) de 2000 de peso molecular. E. Ensaio biológico de TGF-^

Os lisados de células dialisados e os fluídos da cultura foram analisado© no que diz respeito à actividade TGF-<^ por três métodos.

(1) Ensaio de radioreceptor TGF-a/EGF Células epidermoides de carcinoma humanas A431A (IxlO5) foram colocadas de um dia para o outro em placas para cultura de tecidos de 24 cavidades em DMEM contendo 10% FCS a 3793 numa atmosfera de 10% de Co. As células foram lavadas 3 vezes com um tampão de ligação (solução salina de Hank, 1 mg/ml de albumina de soro bovino (BSa) e Hepes 10 mM, pH 7,4) a 490 . Adicionou-se um tampão de ligação (100/il) contendo 1 nm 125i TGF-o< e várias concerntraçSes da amostra a ser testada ou factor de crescimento epidermal (EGP) Standard simultaneamente e incubou-se a 493 durante 2 horas. Realizou-se uma competição a frio com um excesso de 1000 vezes de EGF. 0 TGF-OÍ. foi iodado usando o processo da cl ora mina T. As células foram lavadas com um tampão de ligação gelado sem BSA* As células foram solubilizadas durante 30 min a 3793 com 0,5 ml de NaOH 0,5 μ. A radioactivida de ligada determinada usando um contador gama. 69 721

SKB CASff 14222-3

-47- (2) Ensaio de crescimento indepervte da ancoraqem

Misturaram-se células indicadoras de fibroplastos de rins· de ratazanas normais (NKR-49F) (5000) em 0/.8 ml de meio essencial mínimo (ΒΜΕΪΜ) contendo 10% de soro de vitelo fetal (FCS) e 0*5% de Bacto-agar (Difco) com alíquotas de amostras experimentais que tinham sido liofilizadas, e depois dissolvi das num tampão contendo HC1 4 mM e 2 mg/ml BSA. As células fo raut adicionadas a uma camada de fundo de 0,8 ml de DMEM contendo 10% de FCS e 0,6% de ágar em placas de cultura de tecidos de 35 mm (costar, Oambridge, Mass·)· As placas foram incu badas durante 8-10 dias numa atmosfera de 10% de Co a· 3 7sc,

As colónias formadas foram coradas com violeta de p-iodonitro tetrazoli© durante a noite· e- contadas num Analisador de imagem Bausch and Lomb. 0 sdstema foi programado para detectar colónias maiores do que 60/JLm em diâmetro. (3) Ensaio de radioímunidade

Realizaram-se ensaios usando um conjunto TGF-«?(RIA (Biotape) comercialmente disponível de acordo com as instru-çSes do fabricante· F. Actividade em TGF-oó produzido em Levedura

De terminou-se a actividade do TGF-Q^ produzido pelos plasmídeos pYSK151 e pYSKl52 em culturas agitadas em frascos, colhidas 12 horas após atingir a fase estacionária. O rendimen to máximo obtido no meio foi de aproximadamente 2 mg/litro a GD54o = 2,0· Ma is do que 95% da actividade total foi encontrada no meio comparativamente ao extracto celular· 69 721 SKB CASE 14222-3

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TABELA I (/Ag/IO8 células) Extrato celular

Actividade TGF-Q£ estimada Plasmídeo Meio

Ensaio de ligação competitiva de EGF 0,143 0,135 PYSK151 2,87 PYSK152 2,70

Ensaio de Agar Macio 0,006 0,005 PYSK151 0,718 PYSK152 0,617

Ensaio de Radioiraunidade PYSK151 2,31 PYSK152 2,24 G, Purificação do TGF-o^ 0 caldo de fermentação foi centrifugado para remover as células e depois filtrado, O pH do filtrado foi ajustado a pH 2,7 usando ácido acético glacial, bombado através de uma coluna whatman Partisil 0DS-3, (dimensSes da coluna: 48x650 mm enchimento 40-60>(jLm) a um caudal de 200ml/min que tinha si do equilibrada com ácido trif luoroacético a 0,1% (TFA) . Após o enchimento, a coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de TFA a 0,1%, e i-propanol 5%/TFA 0,1% cada, O TFA- bruto foi eluído com i-propanol 40%/TFA 0,1%. 0 eluído (4 1) foi concentrado in vácuo de modo a remo ver o isopropanol, e depois- liofilizado, O pó (aproximadamente 600 mg) foi redissolvido em 3’ ml de ácido acético 1,0 M e depois centrifugado. O sobrenadante foi carregado numa coluna Biogel P—10 (2,6x120 cm) e eluído com ácido acético 1,0 M a 400iJ.l/min. As fracçoes foram analisadas por electroforese SDS-PAGE. As fracções contendo TGF-c< foram reunidas e liofili zadas, O pó (14 mg) foi introduzido numa coluna Vydac C^g (10 69 721 SKB CASE 14222-3

-4 9- mm x 250 mm) usando um gradiente de 16% de acetonitrilo/TFA 0,05% a 26% de acetonitrilo/TFA 0,05% em 90 minutos·» As frac ções foram recolhidas e analisadas por HPLC. A recuperação foi apróximadamente de 30% da actividade total. Três grupos contendo proteína foram feitos e foram sujeitos a ensaio de radio-receptor EGF/TGF, composição de aminoécidos· sequencia-ção.

Todas as três; proteínas eram biologicamente· activas, © variavam em comprimento de cadeia no N-terminal. As sequên cias foram as de TGF-©( (50%) , Met-TGF-C^ (18%) e Gly-Ala-Met--TGF-^(22%). As comparações· de composição de aminoácidos e de ensaios de ligação dos- receptores mostraram que cada uma tinha uma actividade específica de 1,0 equivalentes de EGF· EXEMPLO 12 - EXPRESSÃO E SECREÇÃO DE ILI-fte ILl-a O ILl-0 humano é expresso numa variedade de tipos ce lulares como um polipéptido precursor grande (31 Kd) que 4 processado e segregado como um fragmento terminal carboxilo de 17 Kd maduro, não glicosilado e bioactivo. Embora o ILl-β seja normalmente segregado, falta-lhe a sequência sinal.

Com os mesmos métodos do Exemplo 11, a sequencia sinal derivada do gene da glucoamilase clonado da C^ albicans, em combinação com o promotor induzível CUP1 ou constitutivo TDH3 em plasmídeos pYSK14O e pYSKI42, foi usada para dirigir a síntese e secreção do recombinante humano interleucina-l(í? em S» cerevisiae, 0 ADN codificando para a forma madura autênti — ——————— c — ca de ILl-φ (transportando um fragmento Baml cuja extremidade foi tornada romba com a polimerase Klenow) foi fundido como se descreveu no Exemplo 11 ã sequência sinal de glucoamila se no único local Smal (ver Fig. 4) do pYSKl4o e pYSK142, e transformado em levedura.

Cada construção dirige a secreção eficiente do ILl-(3 biologicamente activo. Ma is dó que 95% da proteína expressa é’ extracelular, resultando em níveis acumulados de ma is do que 2 mg/1 como se determinou por "Wester blotting'*. A integração de uma única cópia da cassette de expressão ILl-β da sequên- , y/

69 721 SKB CASE 14222-3 -50- cia de sinais da glucoamilase TDH3 no genoma no local ura3 no cromossoma V da cerevisiae resultou numa estirpe (GL46: ΜΑΤβ leu2-3„ 2-112 trpl-I ade2-l his3-ll, 3-15 canl-100 ura3 ILl-^ ) que segrega apróximadamente 6 mg/1 de produto quando cultivada até a fase estacionária em frascos- com agitação sob condiçSes não selectivas (meios ricos). A quantidade de produ to extracelular obtida pode ser aumentada por construção de estirpes; contendo integraçSes múltiplas e/ou por crescimento de células· em cultura de ‘"fed-batch"'. A forma segregada de lLl-y$ em levedura consiste em aproximada mente quantidades· equimolares de duas espécies de proteínas (17 Kd e 22 Kd) , Experiências de "pulse Chase" na pre sença ou ausência de túnicamicina, seguidas por imunopreeipi-tação revelam que a espécie 22 Kd é uma forma glicosilada da molécula. Um local de glicosilação N-ligada potencial encontra-se perto do terminal amino. A razão para o aparecimento de uma mistura de duas formas extracelulares (glicosilada e não glicosilada) não é clara. Os dados de cinética indicam que o produto agora segregado consis-te principalmente na espé cie glicosilada de 22 Kd que pode depois ser convertida, atra vés de clivagem proteolítica ou através de uma endoglicosidase, na forma de 17 Kd. A fusão directa da sequência IL1(^ ao promotor induzível CUP1 sem uma sequência sinal resulta na expressão da forma intracelular de 17 Kd, ma is uma espécie extracelular de 17 Kb simples que se acumula no meio de cultura de fase baixa, o ILl-(3 extracelular purificado está presentemente a ser sequenciado de modo a determinar o local de clivagem primário do péptido sinal bem como quaisquer locais secundários que possam ser reconhecidos na levedura.

Usando métodos semelhantes aos delineados no Exemplo 11, usou-se a sequência de sinais derivada do gene de glucoamilase clonado de ç, albicana·, para dirigir a síntese e secreção do interleucina-l recombinante humana em S. cerevisiae. 69 721 SKB CASE 14222-3

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EXBMPLO 13 - EXPRESSÃO B SBCRBCÃO DÃ SUBUNIDADE' DA TOXINA SI DE B» PERTUSSIS A toxina de pertus-sis, um antigénio proteetor promissor para uso potencial como vacina contra a tosse convulsa/ é uma proteína hexamérica composta de cinco subunidades dife rentes. Uma das subunidades (Sl) expressa uma actividade en-zimática, que é responsável pela toxicidade da proteína, con tudo SI sem as outras subunidades é desprovida de actividades tóxicas. A expressão do gene Sl e a secreção do produto recombinante deverão facilitar a produção e purificação desta subunidade, sem contaminação das outras subunidades da to xina de pertussis* 0 cistrão da subunidade Sl de toxina de pertus-sis foi expresso em S_* cerevisiae como uma proteína da fusão com glu-coamilase segregada ou como uma proteína não fundida mas processada usando o péptido sinal de glucoamilase. A* Construções de plasmídeos e clones· de S. cerevisiae

Um fragmento de ADN que começa no segundo aminoácido, a seguir ao local de clivagem do péptido sinal de Sl e que se estende até ao codão natural de paragem de tradução TAG codificando uma proteína SI quase completamente madura foi fundido, estruturalmente à sequência de codificação de péptido sinal do gene da glucoamilase de Candida albicans. As sequências de codificação fundidas são precedidas pelas sequências 5» não codificadoras do gene da glucoamilase incluindo o promotor e os locais de início de transcripção do gene STA (ver Fig. 1). A "cassette" de expressão foi transferida para um vector vaivém coli/S» cerevisiae contendo os elementos do vector da Fig. 2 menos- a "cassette" de expressão env,, dando o plasmídeo pRiT!3072. O plasmídeo pRITI3072 contém todos os componentes do vector da Fig„ 2, com excepção da cassette de express-ão SI substituir a "cassette" de expressão env, e o lo cal de ligação no lado direito da cassette ser um local Xbal/ /Sai, em vez de um local Espl/Sali. o pRIT 13072 foi transfor- 69 721 SKB CASE 14222-3

% -52- mado numa estirpe de S. cerevisiae (genotipo: Mata/. Ieu2 ura3 adel glnl). Seleccionou-se um clone de levedura transformado/ 745 *1 /TpR IT13 072_7 para trabalhos futuros.

Inseriu-se um fragmento de aDN de restrição Sau3a codificando para 186 aminoácidos da proteína SI (aminoácidos 2 a 187 da proteína madura) na sequência de codificação do gene STA (ver, Pig. I). A inserção foi introduzida num local de restrição BamHl construído localizado perto da extremidade do terminei carboxi da proteína glucoamilase. o gene híbrido resultante deveria expressar uma proteína de fusão glucoamilase. -Sl. A "cassette" de expressão inteira é transportada num ve-ctor plasmídeo vaivém de R, coIi/S. cerevisiae semelhante ao que se descreveu acima, o plasmídeo resultante, pRlT13O73', foi introduzido numa estirpe de S_. cerevisiae (genotipo: Mat Ieu2 ura3 adel glnl) e seleccionou-se um clone transformado, 745.1 /~QRIT13073 ~7, para uso em análises· subsequentes. B. Expressão A subunidade Sl sintetizada no clone 745,1 /plIT13072_27 foi detectável imediatamente em "Western blots" de extractos de células integrais usando o anticorpo monoclonal anti-toxi-na de pertússis B2F8. A mobilidade electrof orética da proteína recombinante em SDS-PAGE' pareceu ser semelhante à mobilida de da subunidade Sl purificada da holotoxina da Bordetella per-tussis. indicando que o péptido sinal da glucoamilase é removido e a subunidade SI processada na célula de levedura, A clivagem· do péptido sinal ocorre normalmente durante ou depois da translocação da proteína sintetizada através da membrana do retículo endoplasmático. A subunidade Sl processada deverá como tal ser associada à fracção msmbranar bruta dos extractos de células de levedura e/ou segregada para o meio de cultura.

Os; extractos de células de levedura foram fraccionados por cen trifugação diferencial e as diferentes fracções analisadas no que diz respeito à presença de Sl. A subunidade Sl foi associa da exclusivamente com o material insolúvel após centrifugação a 30 OOOxg dos extractos. As fracções em pelotas puderam ser solubilizadas com SDS 1% ou ureia 4M. Testaram-se uma série de 69 721 SKB CASE 14222-3

-53- outros detergentes· /7^e&oxiGolat.o de sódio (DOC# Sigma)# Tri-ton X100# sulfonato 3-/7(3“Colamidopropil)-dimetilamónio_I7--l-propano (CHAPS# Sigma) e Zwitergen_7 numa tentativa de extrair a proteína SI da membrana de levedura# Nenhum teve nenhum efeito significativo# na solubilização de Sl.

Extractos de células contendo Sl e controlos negativos# antes e depois- do fraccionamento# foram analisados quanto a presença de actividades NAD-glieo-hidrolase, Nenhuma das frac çóes continha actividades enzimáticae significativas# mas todas elas· inibiram fortemente a actividade NAD-glico-hidrolase da Sl. Não se conseguiu detectar proteína Sl por "western blot" ou por análise da actividade enzimática# no meio de cul tura « 0 clone 745,1 /TpRlT13073J7 foi analisado no que diz respeito ã presença de uma proteína de fusão glucoamilase-Sl (i.e,, proteína Sl-GA) , A actividade enzimática de glucoamilase· foi testada por medição da quantidade de glucose libertada do substracto msOto-triose a 3 7sc, num tampão reaccional contendo NaPO^ 10 mM#, 1% de maltotriose# pH 6#5. A actividade de Sl (NAD-gluco-hidrola-se) foi medida através da quantidade (p moles) de nieotinamida libertada por minuto por ml de meio#. 0 vector progenitor que não contém cassette de expressão não mostrou actividade de glu eoamilase ou Sl em meio de cultura ou extractos. o vector progenitor contendo apenas uma "cassette" de expressão da glucoamilase (i.e.. o gene ST A) mostrou actividade de glucoamilase no meio de cultura e extractos celulares#, mas não mostrou actividade Sl. Por outro lado#, a estirpe de levedura transportando PRIT13073#, o vector contendo a "cassette"’ de expressão da fusão glucoamilase Sl# mostrou actividade de glucoamilase no meio e no extracto e actividade Sl no meio# Como tal#, as células de S_. cerevisiae transformadas com o plasmídeo pRIT13073 sintetizaram e segregaram# para o sobrenadante da cultura#, pro teínas que expressam actividades de glucoamilase e NAD-glico--hidrolase. Este resultado sugere que a porção enzimaticamente activa de Sl foi fundida# com sucesso#, á glucoamilase sinteti- 69 721 SKB CASE 14222-3

zaãa na levedura e segregada para o sobrenadante da cultura.

Estes resultados- mostram que a subunidade SI da toxina de pertussis pode ser sintetizada em levedura sob o con trolo do promotor da glucoamilase ou do gene ST A. segregada para as membranas de levedura através do péptido sinal da glu coamilase ou exportada para o meio de cultura como uma proteí na de fusâfo com a glucoamilase. No último caso (i.e. a proteí na de fusâfo glucoamilase-SI) a subunidade Sl é enzimaticamente activa, C· Actividade imunoprotectora

Injectaram-se dois ratinhos, cada um. com 3-5 JUg de Sl--GA (pRiT13073) (a proteína de fusdo Sl-glucoamilase preparada no Exemplo 13, parte B a partir da transf ormaçâfo da s_. ce-revisiae com pRITl3073) ou glucoamilase (GA) em CFA, no dia 0. e duas vezes em IFA nos dias 30 e 58. A GA e a proteína de fusâfo Sl-GA (pRIT 13073) usadas foram ambas sintetizadas em S. cerevisiae e parcialmente purificadas a partir do sobrenadante· da cultura de uma maneira não desnaturadora. como por cromatografia DEAE-celulose, antes da injecçâfo em ratinhos·. Os ratinhos foram sangrados nos dias 54' e 75, Os soros foram analisados- por ELISA no que diz respeito a presença de anticorpos anti-PT, anti-Sl e anti-rSId. e pelo ensaio da célula de ovário de criceto Chinês (CHC) (Hewlett et al. (1983) Infect. Immun,, 55. 24-38) no que diz respeito à presença de anticorpos neutralizadores de PT. Todos os ratinhos injectados com a proteína de/Sl-GA (pRIT 13073) tinham títulos· de anticorpos anti-PT, anti-Sl e anti-rSId aumentados. Os títulos de anticorpos- contra estes antigénios· nâfo aumentaram significativamen te nos ratinhos imunizados com GA. Todos os ratinhos injectados coro Sl-GA (pRIT13073) tinham também títulos de neutralização de células CHO aumentados, 0 valor da média aritmética era de-920 para Sl-GA (pRITl3073). Estes resultados mostram que a proteína Sl-GA é suficiente para induzir uma resposta neutra li zante e protectora, e que essa proteína é útil numa vacina con tra pertussis, "" 55- 69 721 M- jfr ,w C , . . —-~-ΓΓϋ. SKB CASE 14222-3

De uma maneira semelhante ao método delineado no Exem pio 13 , partes A e B# a fragmento de ADN de restrição Sau3a codificando 186 aminoácidos da proteína SI (aminoácidos 2 a 187 da proteína madura) podia ser fundido, estruturaImente, à sequência de codificação do péptido sinal do gene da gluco amilase de Candida albicans·, a cassette de expressão resultajn te poderia ser transferida para um vector apropriado# o ve-ctor resultante poderia ser transferido para uma estirpe? hospedeira apropriada de cerevisiae, e a proteína resultante poderia ser usada numa vacina contra a pertussis,

EXEMPLO 14 - PREPARAÇÃO DE UMA VACINA PARENTÉTICA

Misturam-se 5-25,Ug de Sl-GA (pRITl3073), preparada de acordo com o método do Exemplo 13, com um adjuvante de alu mínio, tal como hidróxido de alumínio, para produzir uma vaci na numa forma apropriada para incorporação numa forma de dosa_ gem de administração parentérica,

Embora as descrições e exemplos acima apresentados de£ crevam completamente o invento e as suas concretizações prefe ridas, entende-se que o invento não está limitado às conereti zaçõea particulares reveladas,

Est© invento não é limitado aos genes e promotores de Candida dados nos exemplos acima. Este invento proporciona um método geral para localizar as unidades de expressão de genes, promotores, regiões reguladoras e genes estruturais de Candida bem como um método geral de expressão de tais sequências de ADN funcional em Saccharomyces,

Ma is ainda, os genes heterólogos expressos sob o controlo da sequência de sinais da glucoamilase e promotores de levedura de c. albicans não estão limitados aos exemplos de proteínas aqui descritos. Um especialista no ramo compreenderá o uso do sistema de expressão descrito para exprimir e segregar uma variedade de genes heterólogos de interesse.

Como tal, o invento inclui todas as concretizações que estejam dentro do alcance das seguintes reivindicações.

Claims (14)

1. 69 721 SKB CASE 14222-3

   /y, / -.«r á·/

   -56- REIVINDICAÇÕES 1 - Processo de expressão de uma sequência de ADN funcional compreendendo uma sequência igual,, ou essencialmente igual, à sequência de sinal ou do promotor do gene de glucoa-milase de C_. a Ibicans', caracterizado por compreender a transformação de um microorganismo hospedeiro do gênero Saccharo-myces com a sequência de ADN funcional, e* a cultura do hospedeiro transformado sob condiçSes adequadas, de modo que a sequência de ADN funcional seja expressa.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de sinal ser fundida, em fase, e com a orientação conveniente, com um gene heterólogo seleccionado.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido gene heterólogo ser seleccionado do grupo consistindo em TGF-o£ , lnterleucina-ΐφ , interleucina--Io£ , proteína Sl-GA, proteína HIV-1 ou seus fragmentos.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte- pertencer rizado por o microorganismo hospedeiro/a espécie Saccharomy-ces cerevisiae.
5. 5 - Processo de produção de uma glicoproteína gpX60 de HIV-1 numa forma não processada caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira Saccharomyces transformada, em que a referida célula hospedeira compreende uma sequência do gene gpl60 fundida em fase e com uma orientação conveniente a um promotor de levedura e à sequência de sinais do gene da glicoamilase de Candida albicans, num meio de cultura apro priado,
6. 6 - Processo de produção de TGF-&Í , caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira Saccharomyces transformada, em que> a referida célula hospedeira compreende uma seguência de genes TGF-OÓ fundida em fase e com uma orientação conveniente a um promotor de levedura ©· à sequência de sinais do gene' de glucoamilase de Candida albicans. num meio de cultura apropriado. .A,.··'".

   69 721 SKB CASE 14222-3 -57-
7. 7 - Processo de produçâío de proteína Sl-GA caracteri-zado por compreender a cultura de uma célula hospedeira de Saccharomyces· transformada, em que a referida célula hospedei ra compreende uma sequência de codificação da proteína Sl-Ga fundida em fase e na orientação conveniente (a) a um promotor de levedura e (b) no gene da glicoamilase de Candida albicans· desde que tal fusão inclua a sequência de sinais do gene da glucoamilase de Candida albicans,, num meio de cultura apropriado e o isolamento dessa proteína,
8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracte rizado por a proteína ser Sl-GA (pRIT13073) .
9. 9 - Processo de produção de proteína Sl-GA caracteriza do por compreender a cultura de uma célula hospedeira de Saccharomyces transformada, em que a referida célula hospedeira compreende uma sequência de codificação da proteína Sl-GA fun dida em fase & com a orientação conveniente a um promotor de levedura e à sequência de sinais do gene da glucoamilase de Candida a lbicans·, num meio de cultura apropriado & o isolamen to dessa proteína,
10. 10 - Processo de produção de ILl-(3 caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira de Saccharomyces transformada, em que a referida célula hospedeira compreende uma sequência de genes IL1-Ç? fundida em fase & com uma orientação conveniente, a um promotor de levedura e a sequência de sinais de gene da glucoamilase de Candida albicans, num meio de cultura apropriado.
11. 11 - Processo de produção de IL1-0Í caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira de Saccharomyces transformada, em que a referida célula hospedeira compreende uma sequência de genes lLl-(b fundida em fase e com a orientação conveniente a um promotor de levedura e à sequência de sinais do gene da glucoamilase da Candida albicans, num meio de cultura apropriado.
12. 12 - Processo de preparação de uma célula hospedeira transformada, caracterizado por se transformar uma célula hos- 69 721 SKB CASE 14222-3 -58- pedeira desejada com o vector que contém a sequência de codifica çã o de SI-GA.
13. 13 - Processo de· produção de uma vacina para estimular a protecção contra a tosse convulsa, caracterizado por a refe rida vacina compreender uma quantidade não tóxica e imunopro-tectora de proteína Sl-GA,
14. 14 — Processo de acordo com a reivindicação 13,. caracte rizado por compreender a proteína Sl-GA (pRIT13073). Lisboa, 2 5. |939 Por SMITHKLINET BEECHAM CORPORATION - O AGENTE OFICIAL -