PT904357E

PT904357E - Proteína com actividade de fosfolipase

Info

Publication number: PT904357E
Application number: PT98904046T
Authority: PT
Inventors: Fridolin Loeffler; Gerald Jungschaffer; Quoc Nguyen Khanh; Erwin Schuster; Bruno Sproessler; Sabine Wolf
Original assignee: Ab Enzymes Gmbh
Priority date: 1997-01-16
Filing date: 1998-01-08
Publication date: 2007-03-30
Also published as: ATE348151T1; AR010099A1; HU224831B1; CA2243476C; ES2275299T3; DK0904357T3; HUP9901640A3; EP0904357B1; TW565610B; DE59813840D1; HK1019074A1; CN1152954C; DE19701348A1; MY117580A; WO1998031790A1; EP0904357A1; BR9805893A; CA2243476A1; HUP9901640A2; AU6208098A

Description

ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Proteína com actividade de fosfolipase" O invento refere-se a uma proteína com actividade de fosfolipase, obtenível através de clivagem da sequência madura da lisofosfolipase de Aspergillus com a SEQ ID NO:2 em dois produtos de clivagem, em que estes produtos de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação clivável sob condições redutoras ou em que pelo menos um dos produtos de clivagem não ligados possui uma actividade de fosfolipase. Além disso, o invento refere-se a um processo para a produção desta proteína, assim como à utilização desta proteína para a desmucilaginação de óleos vegetais e como agente auxiliar de panificação.

Na desmucilaginação de óleos vegetais, os fosfolípidos não hidratáveis são tornados hidrossolúveis por meio da fosfolipase e, desta maneira, são removidos do óleo alimentar de maneira suave, não nociva para o meio ambiente e com baixos custos. No pedido de patente europeia 0 513 709 (Rõhm/Lurgi) é apresentado pela primeira vez um processo enzimático eficaz para a desmucilaginação. Neste processo, um óleo alimentar pré-desmucilaginado com água é emulsionado com uma solução aquosa de uma fosfolipase, originando partículas com um tamanho inferior a 10 pm. A seguir à hidrólise (pH 3 a 6, temperatura 50 a 70°C), a fase aquosa é separada. O processo de desmucilaginação enzimática foi introduzido na indústria de óleos alimentares pela empresa Lurgi, sob o nome de "processo EnzyMax". Em DE 43 39 556 é descrita como outra variante deste processo, a reutilização da enzima, separando-se a enzima de uma fase aquosa já usada contendo a mucilagem, através da adição de agentes tensioactivos ou solubilizantes, e reutilizando-a sob a forma de solução amplamente isenta de mucilagem e contendo a enzima. A disponibilização das quantidades de enzima necessárias para a realização de um processo à escala industrial pode apenas ser satisfeita por meio de microorganismos. Existe portanto uma procura de uma fonte microbiana que permita produzir a enzima fosfolipase em quantidades ilimitadas. Em DE-OS 195 27 274.9 de 26-07-1995 (Rõhm/Lurgi) é descrito que 2 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ em Aspergillus niger foi encontrada uma fosfolipase apropriada. Cliva a lecitina, dando lisolecitina, mas é também capaz de continuar a clivar a lisolecitina, proporcionando a fosfatidilcolina. As lisofosfolipases puras provenientes de Aspergillus capazes de clivar apenas lisolecitina, são ineficazes no processo de desmucilaginação. Isto também é válido para as fosfolipases C e D que não clivam acilo.

Além disso, as fosfolipases podem também ser utilizadas como agente auxiliar de panificação, para aperfeiçoar o processamento da massa. EP-A-0 808 903 refere-se a um ácido desoxirribonucleico recombinante que pode ser isolado de Aspergillus e que codifica uma lisofosfolipase e apresenta uma sequência nucleotidica definida. WO 97/05219 refere-se a um processo enzimático para a desmucilaginação de óleos vegetais com fosfolipase de

Aspergillus.

Em EP-A-0 575 133 descreve-se uma nova fosfolipase capaz de hidrolisar um fosfolípido com formação de um 2-acilfosfolípido. WO 95/22615 refere-se a um processo para a produção de uma enzima lipolitica, assim como suas variantes possuindo uma menor dependência do cálcio e/ou uma melhor tolerância em relação a detergentes.

Na base do presente invento está o problema de produzir uma fosfolipase não dispendiosa com elevada pureza. Pretende-se que a fosfolipase possa ser produzida em grandes quantidades num organismo hospedeiro transformado. Pretende-se que com a enzima seja possível produzir preparações particularmente adequadas para a hidrólise de fosfolípidos e, por conseguinte, para a depuração de hidrolisados de amido e para a produção de agentes auxiliares de panificação.

De acordo com o invento, este problema é resolvido através de uma proteína com actividade de fosfolipase, obtenível por clivagem da sequência madura da lisofosfolipase 3 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ de Aspergillus com a SEQ ID NO:2, em dois produtos de clivagem, sendo que estes produtos de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação clivável sob condições redutoras ou então, pelo menos, um dos produtos de clivagem não ligados possui uma actividade de fosfolipase. Além disso, este problema é resolvido através de uma proteína com actividade de fosfolipase, caracterizada por ser reconhecida por um anticorpo contra fosfolipase purificada proveniente de Aspergillus foetidus RH 3046.

Inesperadamente, verificou-se que um microorganismo transformado de acordo com DE-OS 196 20 649.9 com o ácido desoxirribonucleico (ADN) obtenível de Aspergillus, não só codifica uma lisofosfolipase, como também, sob determinadas condições de cultura, é transformado numa fosfolipase. Por conseguinte, a fosfolipase possui a mesma estrutura primária que a lisofosfolipase, mas diferentes estruturas secundária e terciária e, por isso, diferentes caracteristicas fisiológicas. A sequência correspondente é representada em SEQ ID NO:l de DE-OS 196 20 649.9. Uma outra sequência codificadora de fosfolipase foi isolada a partir de Aspergillus niger e distingue-se em apenas 6% dos aminoácidos da sequência homóloga de Aspergillus foetidus. Não apenas a fosfolipase proveniente de Aspergillus niger como também a lisofosfolipase proveniente de Aspergillus foetidus consistem em 270 aminoácidos e possuem um peso molecular de 36000 Da (veja SEQ ID NO:l+2). No que se refere à obtenção dos microorganismos transformados, referimo-nos à descrição de DE-OS 196 20 649.9. Uma fosfolipase proveniente de Aspergillus ainda não foi descrita até à data no estado da técnica. A publicação de Nakaya et al., Eur. J. Biochem. 1990, 193 (1) 31-38, descreve uma proteína cuja sequência é semelhante à da fosfolipase A2.

Através de métodos da química das proteínas foi possível separar a fosfolipase da lisofosfolipase e obtê-la sob a forma de elevada pureza. Na comparação entre a lisofosfolipase e a fosfolipase purificada, foram verificadas as seguintes diferenças: - Os pesos moleculares da fosfolipase e da lisofosfolipase de Aspergillus foetidus, medidos por meio da electroforese em gel 4 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ de SDS, são cerca de 30 000 Da para a fosfolipase e de cerca de 36 000 Da para a lisofosfolipase sob condições redutoras, sendo no entanto de cerca de 36 000 Da para ambas as enzimas sob condições não redutoras. Sob condições redutoras, a fosfolipase desintegra-se em duas cadeias, a maior das quais (30 000 Da) é detectada no gel de electroforese. Devido a limitações do método, o pedaço parcial com um tamanho de cerca de 6000 Da não pode ser detectado no mesmo gel de electroforese, podendo no entanto deduzir-se deste diagnóstico que a fosfolipase consiste em duas cadeias peptidicas. Esta ideia é confirmada pelo resultado da sequenciação proteica.

Da sequenciação proteica da fosfolipase proveniente de Aspergillus foetidus resultou uma elevada conformidade com a sequência da lisofosfolipase, mas também diferenças. Na fosfolipase foram encontrados dois terminais NH2 com uma proporção de 1:1, na lisofosfolipase pelo contrário, apenas um. Um dos dois terminais NH2 da fosfolipase pertence a um péptido de 6000 Da, enquanto que o outro é o terminal NH2 da proteína de 30 000 Da. Enquanto o péptido mais pequeno está em conformidade com os aminoácidos 1 a 44 da proteína madura de lisofosfolipase (compare-se SEQ ID NO:l em DE- OS 196 20 649.9), a sequência da proteína de 30 000 Da corresponde aos aminoácidos 45 a 270 da lisofosfolipase (compare-se SEQ ID NO:l em DE-OS 196 20 649.9).

Este diagnóstico faz supor que a fosfolipase proveniente de Aspergillus foetidus pode ser originada através de processamento da proteína de lisofosfolipase, não tendo sido no entanto, ainda esclarecido se o processamento decorre no interior ou fora da célula, assim como também não se sabe de que maneira decorre este processamento. As relações que existem entre a fosfolipase e a lisofosfolipase são representadas na figura 1.

Além disso, a fosfolipase e a lisofosfolipase diferem nos seus pontos isoeléctricos, nos seus valores óptimos de pH e de temperatura, assim como muito nitidamente nas suas estabilidades térmicas. A tabela que se segue apresenta uma comparação destes valores. ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ

Tabela 1: Comparação das propriedades de fosfolipase e lisofosfolipase provenientes de Aspergillus foetidus

Lisofosfolipase 36000 Da 36000 Da pH 4, 2 55°C pH 4,5 pH 4,5 10% Restakt.

Fosfolipase 30000 Da 36000 Da pH 4,3 50°C pH 3 - 4 pH 3,5 >75% Restakt.

Peso molec. (gel de SDS, redut.)

Peso molec. (gel de SDS, não redut.) Ponto isoeléctrico Óptimo de temperatura Óptimo de pH

Estabilidade ao pH (lha 60°C)

Para obter a fosfolipase, em vez da lisofosfolipase, a partir dos respectivos microorganismos, as condições de fermentação são essenciais. É essencial para a formação da fosfolipase a realização da cultura num meio ácido ou ligeiramente alcalino. O valor de pH encontra-se neste caso adequadamente num intervalo de 2 a 9, de preferência 3 a 8. Sob estas condições forma-se de preferência fosfolipase. Procede-se de maneira seguinte:

Em primeiro lugar é escolhido um hospedeiro adequado com a finalidade de uma produção da fosfolipase de um modo tão simples quanto possível. Embora possam ser utilizadas muitas espécies de fungos como hospedeiros potenciais, como por exemplo representantes dos géneros termófilos de Humicola, Thermomyces e Mucor, dos géneros Rhizopus, Absidia, Chaetomium, Trichoderma, Thielavia, Penicilium e

Cephalosporium, foram utilizadas de preferência espécies do género Aspergillus. Após transformação com os plasmídeos de acordo com o invento, podem ser isolados transformantes que produzem grandes quantidades de fosfolipase em comparação com os hospedeiros. De preferência, o organismo hospedeiro transformado é uma estirpe de Aspergillus das espécies Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus ellipticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus carbonarius ou Aspergillus phoenicis ou uma estirpe de Trichoderma das espécies Trichoderma viride, Trichoderma longibrachiatum ou Trichoderma reesei. 6 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ

Um transformante produzido através de co-transformação de uma estirpe hospedeira com um plasmideo de selecção, de preferência com pAN7-l, p3SR2 ou pSTAlO, e um plasmideo de expressão, de preferência com pKC3, pKC9, pKC12 ou pKCN2, é cultivado numa solução nutriente usual para a estirpe hospedeira, solução essa contendo pelo menos uma fonte assimilável de C, como por exemplo milho triturado, amido, dextrina proveniente de amido, e pelo menos uma fonte orgânica assimilável de N, como por exemplo licor de maceração de milho, autolisado de levedura, farinha de soja, proteína ou peptona de soja, por si só ou em combinação com fontes de N inorgânicas como, por exemplo, sais de amónio ou nitratos, e que a seguir a uma esterilização é ajustada a um valor de pH ácido ou ligeiramente alcalino. A solução nutriente pode ser suplementada através da adição de substâncias que fazem crescer substancialmente a formação de fosfolipase. Fosfolípidos provenientes de soja contêm substâncias deste género, mas estas existem também em outras classes de substância, como por exemplo nos poli (éteres de oxietileno). A seguir à inoculação da solução nutriente esterilizada com conídios ou micélio vegetativo do transformante, este cresce sob arejamento, a temperaturas entre os 20°C e 60°C, de preferência entre os 25°C e 45°C, produzindo a fosfolipase de acordo com o invento. Durante a cultura, o valor de pH da cultura é corrigido através de adição de um ácido ou de uma base, sendo desta maneira mantido numa gama ácida ou ligeiramente alcalina, de preferência entre o pH 3 e 8. Ao fim de 48 a 120 horas de cultura, a fosfolipase pode ser obtida separando os restos de solução nutriente insolúveis e a biomassa, o que é realizado habitualmente através de filtração, e concentrando o filtrado aplicando os métodos usuais, como por exemplo através de ultrafiltração. O concentrado retido pode ser utilizado para a desmucilaginação de óleos vegetais ou para o tratamento de fosfolípidos. Além disso, a fosfolipase pode também ser utilizada para melhorar as propriedades reológicas de produtos alimentares.

Os seguintes microorganismos foram depositados na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) Mascheroder Weg 1B, 38124 Braunschweig, Alemanha, em conformidade com os termos do tratado de Budapeste: 7 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ A. oryzae RH 3745: número de depósito DSM 11283 (Data de depósito: 11-11-1996) A. ellipticus RH 3886: número de depósito DSM 11284 (Data de depósito: 11-11-1996) A. foetídus RH 3046: número de depósito DSM 10652 (Data de depósito: 24-04-1996) E. coli DH5a pKC3: número de depósito DSM 10653 (Data de depósito: 24-04-1996) E. coli DH50C pKC9: número de depósito DSM 10654 (Data de depósito: 24-04-1996) E. coli DH5oc pKC12: número de depósito DSM 10655 (Data de depósito: 24-04-1996) E. coli pKCN2: número de depósito DSM 11352 (Data de depósito: 23-12-1996) A. niger RH 3909: número de depósito DSM 11353 (Data de depósito: 23-12-1996) O invento é mais pormenorizado através dos exemplos e figuras que se seguem. A figura 1 mostra o processamento do gene da lisofosfolipase proveniente de Aspergillus e a obtenção da fosfolipase. A figura 2 mostra a construção do plasmideo pKCN2.

Exemplos

Exemplo 1

Construção do vector de expressão pKCN2

Isolamento do gene da lisofosfolipase a partir de A. niger NRRL3 O ADN cromossómico de A. niger NRRL3 foi isolado de acordo com instruções de Hynes, M.J et al. (1983), Mol. Cell. Biol. 3, 1430-1439. 8 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ Ο ADN macromolecular obtido foi hidrolisado parcialmente com Sau3AI e fraccionado segundo o seu tamanho através de centrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Moléculas de ADN com um tamanho de 9 a 20 kb foram inseridas em EMBL3-DNA hidrolisado com BamHI/EcoRI e empacotadas in vitro.

Para a identificação do gene cromossómico da lisofosfolipase numa biblioteca de genes Lambda EMBL3, o fragmento fííndm/Sali-cDNA do plasmideo pKCl/36 foi utilizado como sonda de hibridação. O plasmideo pKCl/36 continha o ADNc da lisofosfolipase isolado de A. foetidus RH 3046. A seguir à hibridação e individualização repetida, puderam ser identificados dois clones positivos. O ADN do fago do clone n.° 1 foi preparado e hidrolisado com BamHI. A seguir à hibridação de Southern, apresentou um sinal positivo a cerca de 9 kb. O fragmento BamHl foi clonado em pUCl8 e o plasmideo resultante contendo o gene cromossómico completo de lisofosfolipase, foi denominado pKCN.

Construção do vector de expressão pKCN2 O gene da lisofosfolipase foi inserido no plasmideo pKCN2, sob controlo do promotor da alfa-amilase de A. oryzae e do terminador trpC de A. nidulans. O isolamento do gene da lisofosfolipase a partir do plasmideo pKCN foi realizado pelo método da PCR. Foram utilizados dois iniciadores oligonucleotídicos com as sequências seguintes: KC29: 5' -GGA ATT CAC CTG CTA ACC ATG TTC TCT GGA CGG TTT GGA GTG-3' BspMI Met (SEQ ID NO:3) KC43: 5'-CG GGATCC AAG CTA TAG CAG ACA CTC TGA AAT TG-3'

AMB

BaMHI (SEQ ID NO:4) 9 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ

Para a reacção em cadeia com polimerase foram misturados num volume reaccional de 0,1 ml, Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,2 mM (dATP, dCTP, dGTP e dTTP, cada um 0,2 mM), KC29 e KC43, cada um 50 pmol, 1 ng de pKCN como matriz e 2,5 U de polimerase Tag. A preparação foi realizada para 20 ciclos (94°C, 40 s; 40°C, 1 min; 72°C 1 min). Terminada a reacção, o fragmento amplificado foi purificado, hidrolisado com BspMI e Bamhl e inserido no plasmideo pKE2 clivado com Ncol/BamHl. O plasmídeo pKE2 contém o promotor da alfa-amilase de A. oryzae e o terminador trpC de A. nidulans. A construção do plasmideo pKCN2 foi confirmada através de uma análise de restrição e subsequente sequenciação.

Exemplo 2 Método de transformação para as estirpes de Aspergillus e Trichoderma reeseí A partir de uma cultura com cerca de duas semanas numa caixa de Petri, da estirpe do fungo a transformar, foi produzida uma suspensão de esporos em cerca de 10 ml de NaCl a 0,85%, através de arrastamento com o liquido, com a ajuda de uma espátula. Em cada um dos casos, quatro balões de agitação de 1 1 com 100 ml de meio mínimo Czapek-Dox (Oxoid) com extracto de levedura a 0,1%, foram inoculados com 1 ml de suspensão de esporos e incubados durante cerca de 16 horas a 28°C num agitador rotativo, a 120 rotações por minuto. Em cada um dos casos foi recolhido o micélio proveniente de quatro agitadores rotativos através de um filtro de papel e lavou-se com cerca de 50 ml de tampão MP (MgS04 1,2 M em tampão fosfato 10 mM, pH 5,8). Depois de remoção do tampão, pesou-se o micélio húmido. Em geral, foram obtidos cerca de 3 a 5 g de micélio húmido.

Por g de micélio húmido foram adicionados 5 ml de tampão MP, 120 μΐ de solução de Novozym (1 g de Novozym 234 (Novo Nordisk) em 6 ml de tampão MP) e 25 μΐ de β-glucuronidase (Sigma). A suspensão do micélio foi colocada durante 5 min em água gelada. A seguir foram adicionados 60 μΐ de solução de albumina sérica bovina (0,2 g de albumina sérica bovina em 10 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ 4 ml de tampão ΜΡ, filtrados sob condições estéreis), e a preparação foi incubada a 30°C, agitando-se ligeiramente. A formação de protoplastos foi observada visualmente no microscópio. Quando já não se verificava nenhum aumento substancial de formação de protoplastos, a preparação foi interrompida para se recolher os protoplastos. Isto acontecia geralmente ao cabo de cerca de 3 a 5 horas.

Para a separação de componentes grosseiros do micélio ainda presentes, a suspensão de protoplastos foi vertida sobre um filtro de lã de vidro embebido em tampão MP e transferida para tubos de centrifugação. Por cima da metade superior dos tubos foi colocada uma camada de sorbitol 600 mM e Tris/HCl 100 mM, pH 7,0. Os tubos foram centrifugados durante 10 min a 2500 g. Os protoplastos foram separados da camada intermédia e retomados em sorbitol 1 M e Tris/HCl 10 mM, pH 7,5. A seguir, os protoplastos foram lavados duas vezes com tampão STC (sorbitol 1 M, Tris/HCl 10 mM do pH 7,5 e CaCl2 10 mM) por meio de centrifugação a 1500 g e, finalmente, retomados em 1 ml de tampão STC.

Para a transformação de A. oryzae juntaram-se 300 μΐ de suspensão de protoplastos, cerca de 10 pg de p3SR2 como plasmideo de selecção e 10 pg do respectivo plasmideo para a expressão da LPL em 25 pl de Tris/HCl 10 mM, pH 8,0 e incubou-se durante 10 min a 0°C. A seguir juntaram-se mais uma vez 25 pl da mesma mistura de plasmideo e 400 pl de solução de PEG (polietilenoglicol 6000 a 60% (Fluka) em Tris/HCl 10 mM, pH 7,5 e CaCl2 50 mM), misturou-se muito cuidadosamente e incubou-se durante 5 min à temperatura ambiente. Foram adicionados novamente 600 pl de solução PEG, misturou-se e incubou-se a preparação durante mais 20 min à temperatura ambiente. A preparação foi misturada com cerca de 9 ml de acetamida-ágar semi-sólido (meio minimo com acetamida 10 M, como única fonte de N, sacarose 1 M e 0,6% em peso de ágar) a 45°C, e distribuída por quatro caixas de Petri com o mesmo meio, no entanto com 1,5% em peso de ágar (Oxoid) e, além disso, CsCl 15 mM. As placas foram incubadas a 28°C. Passados 6 a 10 dias, as colónias de crescimento rápido (transformantes) foram inoculadas em meio de acetamida sem sacarose, purificadas duas vezes através de colónias de 11 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ esporos individuais e transferidas para um meio completo, por exemplo dextrose de batata-ágar.

A transformação de estirpes das espécies A. niger, A. awamori, A. japonicus ou A. foetidus pode também ser realizada com o plasmideo p3SR2. De preferência, no entanto, a transformação foi efectuada com o plasmideo pAN7-l. A preparação de protoplastos e a adição de ADN plasmidico são realizadas neste caso de maneira análoga, como descrito anteriormente para o plasmideo p3SR2. No entanto, em vez da adição de acetamida-ágar semi-sólido, toda a preparação de transformação é adicionada a 100 ml de meio minimo Czapek-Dox (Oxoid) com 100 pg de higromicina B/ml, 1,5% em peso de ágar (Oxoid) e sacarose 1 M, arrefecidos a cerca de 45°c, e mistura-se cuidadosamente. A seguir, a preparação é vertida em caixas de Petri, em porções de 10 ml, respectivamente, nas quais tinham sido colocados previamente em cada uma 10 ml de meio minimo Czapek-Dox (Oxoid) com 1,5% em peso de ágar (Oxoid), no entanto sem higromicina e sem sacarose, como camada inferior sólida. Após a solidificação da camada de ágar superior, as caixas de Petri são incubadas a uma temperatura de 30 a 37°C. Os transformantes resistentes à higromicina B podem ser separados ao fim de cerca de 3 a 10 dias e, para verificação da resistência, podem ser transferidos para meio minimo Czapek-Dox (Oxoid) com 50 pg de higromicina B/ml e 1,5% em peso de ágar (Oxoid).

Para a transformação de A. sojae ou A. phoenicis é utilizado um terceiro princípio de selecção, uma vez que as estirpes utilizadas destas espécies não só assimilam acetamida como também são resistentes a higromicina B. Através de selecção em meio de cultura contendo clorato são isolados os mutantes cujo gene da nitrato-redutase (niaD) é defeituoso e que por esta razão já não crescem com nitrato como única fonte de azoto (Cove, D.J. (1976) Heredity 36, 191-203). Através de transformação com o plasmideo pSTAlO (Unkles, S.E. et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 218, 99-104), o qual contém a informação intacta para o gene da nitrato-redutase, este defeito é compensado, pelo que os transformantes crescem com nitrato como única fonte de azoto, enquanto que o crescimento das células não transformadas se atrasa. 12 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ

Além de ser adequado para A. sojae, este método de selecção é-o igualmente para outras espécies de Aspergillus; no entanto, a produção dos mutantes de niaD implica um investimento de trabalho adicional em comparação com a utilização da resistência à higromicina B ou à assimilação de acetamida.

Exemplo 3

Produção de transformantes que segregam PL

Transformantes de A. niger, A. awamori A. foetidus, A. carbonarius e A. ellipticus

Protoplastos destas espécies de Aspergillus foram produzidos através do método descrito no exemplo 1, e co-transformados utilizando o plasmideo pAN7-l e um dos plasmídeos pKC3, pKC9 pKC12 ou pKCN2, respectivamente. Para a regeneração dos protoplastos, a preparação de transformação é espalhada em cima de higromicina como descrito anteriormente, os transformantes são separados das placas de regeneração, purificados e testados em ensaios de agitação, utilizando a solução nutriente seguinte

Maltodextrina 3,75% Pó de milho para maceração 3,0% KH2P04 1,0% K2HPO4 0,7%

Triton X-100 0,10% em água da torneira, esterilizada durante 30 min a 121°C, com vista na produção de PL. Para este efeito, a biomassa das culturas de agitação é separada por filtração e mede-se a actividade da fosfolipase (PLU) no filtrado da cultura. Os transformantes distinguem-se por uma actividade de fosfolipase nitidamente mais elevada em comparação com a estirpe hospedeira.

Transformantes de A. oryzae e A. aculeatus A produção de protoplastos e a transformação são realizadas também com estas espécies, como descrito no exemplo 2. Os protoplastos são co-transformados utilizando o plasmideo p3SR2 e um dos plasmídeos pKC3, pKC9 pKC12 ou pKCN2, respectivamente. Para a regeneração dos protoplastos, a 13 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ preparação de transformação é espalhada em cima de um substrato de cultura com acetamida como única fonte de azoto, como descrito anteriormente, os transformantes são separados das placas de regeneração, purificados e testados em ensaios ! agitação, utilizando a solução nutriente seguinte Maltodextrina 3, 75% Pó de milho para maceração 3,0% (NH4)2HP04 0,5% Triton X-100 0,10% em água da torneira, esterilizada durante 30 min a 121°C, com vista na produção de PL.

Transformantes de A. sojae e A. phoenicis A estirpes A. sojae RH 3782 niaO22 e A. phoenicis RH 3828 niaO, ambas mutantes de A. sojae RH 3782 e A. phoenicis RH 3828 produzidos de acordo com Cove (1976), são cultivadas na solução nutriente seguinte, que consiste em

Glucose (MERCK) 2%

Extracto de malte (OXOID) 0,5%

Bacto-Peptona (DIFCO) 0,025% Água desionizada

ajustar o valor de pH a 5,0; esterilização: 30 min aos 121°C A partir do micélio, são obtidos protoplastos de acordo com o método descrito no exemplo 1 e estes são co-transformados com pSTAlO como plasmideo de selecção e um dos plasmídeos pKC3, pKC9 ou pKC12, respectivamente. Para a regeneração dos protoplastos, a preparação de transformação é misturada com 9 ml de ágar semi-sólido (estabilizador osmótico), consistindo em 15 ml 10,28 g 29,1 ml 0,18 g (= 0,6%) seguir adição estéril de: 0,6 ml 0,3 ml

Tampão fosfato de Na 0,1 M do pH 6,0 Sacarose 1 M (MERCK) Água Millipore em Ágar (OXOID)

Esterilização de 30 min aos 121°C, a Solução salina (7.14.2)

Solução de NaN03 1 M 14 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ e distribuída por quatro placas de ágar com a mesma composição, contendo no entanto 1% de ágar. Após cerca de 6 a 10 dias de incubação a 37°C, os transformantes são separados das placas de ágar e purificados através de plaqueamento em nitrato-sacarose-ágar. Foi obtida uma multiplicidade de transformantes através de selecção e purificação subsequente num substrato de cultura com nitrato como única fonte de N, que foi verificada em balões de agitação utilizando solução nutriente seguinte

Maltodextrina 3, 75% Pó de milho para maceração 3,0% KH2P04 1, 0% K2HPO4 0, 7% Triton X-100 0,10% em água da torneira, esterilizada durante com vista na produção de PL. 30 min a 121°C,

Além de transformantes que não produzem PL, ou que produzem apenas quantidades reduzidas, assim como das estirpes hospedeiras não transformadas, são também encontrados transformantes que apresentam uma actividade de PL nitidamente aumentada no filtrado de cultura. Estas estirpes denominadas "co-transformantes" são adequadas para a produção da enzima. Na tabela 2 apresenta-se uma comparação entre os resultados típicos da formação de PL através de transformantes e através dos hospedeiros não transformados. 15 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ estirpes

Tabela 2: Comparação da formação de PL por hospedeiras e por transformantes

Estirpe ou transformante

Actividade de relativa

PL A. oryzae RH 3745 100 A. oryzae RH 3745 p3SIZ2 pKC9 3000-4000 A. oryzae RH 3745 p3SR2 pKCN2 2000-2500 A. sojae RH 3782 niaD22 100 A. sojae RH 3782 niaD22 pSTAlO pKC9 500-700 A. foetidus RH 3046 100 A. foetidus RH 3046 pAN7-l pKC9 1000-1500 A. phoenicis RH 3828 niaD 100 A. phoenicis RH 3828 níaD pSTAlO pKC9 400-600 A. ellipticus 100 A. ellipticus pAN7-l pKC12 800-900 A. heteromorphus niaD 100 A. heteromorphus niaD pSTAlO pKC9 900-1000 100 400-600 A. carbonarius A. carbonarius pAN7-l pKC9 A. aculeatus 100 A. aculeatus p3SR2 pKC9 900-1200 A. niger 100 A. niger pAN7-l pKC12 700-1000 A. awamori 100 A. awamori pAN7-l pKC12 600-800 16 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ

Exemplo 4

Purificação da PL proveniente de A. foetidus

Para diminuir a condutividade eléctrica, 2080 ml do concentrado de cultura retido de A. foetidus RH 3788 foram diluídos com 3520 ml de água destilada e ajustados a pH 7,0 com 160 ml de NaOH 1 Μ. A amostra tinha um volume de 5760 ml e uma condutividade de 7,8 mS/cm.

Numa outra etapa foi realizada uma cromatografia de permuta iónica em DEAE-Fractogel (MERCK). Para este efeito foram colocados 5760 ml da solução enzimática, em quatro preparações (1440 ml, cada), numa coluna de DEAE-Fractogel (altura 278 mm, diâmetro 100 mm) . A coluna foi lavada com tampão A (tampão fosfato 20 mM consistindo em Na2HP04/KH2PC>4 pH 7,0 + NaCl 15 mM) . A eluição foi realizada num gradiente contínuo de tampão A para tampão B (tampão A + NaCl 1 M) . A eluição foi realizada com um caudal de 70 ml/min e foram recolhidas em cada um dos casos fracções de 350 ml.

As fracções foram testadas quanto à presença de PL. Isto foi feito medindo a actividade de PL. De acordo com isto, uma unidade de PL é definida como sendo a quantidade de enzima que numa solução aquosa de lecitina a pH 3,5 e a 40°C, provoca uma taxa de hidrólise de 1 μΜ/min. A medição da actividade de PL foi realizada de maneira seguinte:

Substrato: 1 g de Epikuron 200 (fosfatidilcolina da empresa

Lucas Meyer) + 100 g de água destilada + 5 ml de solução de CaCl2 0,32 M foram homogeneizados no Ultra Turrax.

Análise: A 10 ml de substrato foram adicionados 10 ml de solução de Triton X-100 a 1% (empresa Fluka) e 5 ml de solução de ácido cítrico mono-hidratado 0,0033 M e a mistura foi temperada durante 10 min a 40°C; o pH fica entre 3,4 e 3,5. Foram adicionados 0,1 ml de solução enzimática e a mistura foi incubada durante 10 min a 40°C. Convém que a concentração de enzima na preparação em análise não seja superior a 2,5 U/g. Terminado o tempo reaccional, foi feita uma retro-titulação 17 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ com ΚΟΗ 0,01 Μ, ajustando um ρΗ 10,0, sendo que os primeiros 5 ml foram adicionados rapidamente, reduzindo-se a seguir a velocidade da titulação para evitar uma titulação excessiva.

Para obter o valor do branco (BW), a enzima foi desactivada aquecendo-a durante 15 min a cerca de 95°C. Após o arrefecimento, a mesma foi diluída como também se fez para o valor principal (HW) e continuou a proceder-se da mesma maneira como com o valor principal. Cálculo: = PLU/g, pH 3,5 = HW (ml) - BW (ml) * 0,01 M * 1000 10 min * 0,1 ml * conc. enzima g/ml

No pedido de patente 195 27 274.9 de 26-07-1995, a fosfolipase é indicada em unidades de lecitase, LU/g, sendo 1 unidade de lecitase a quantidade de enzima que a 40°C e a pH 8, liberta de gema de ovo, por minuto, 1 μΜ de ácido gordo. 1 LU/g a pH 8 corresponde a 108 PLU/g a pH 3,5. A eluição da PL iniciou-se com cerca de 0,11 M de NaCl. As fracções contendo PL de quatro passagens foram reunidas (8950 ml) e concentradas através de um CH2A concentrator da empresa Amicon, Hollow-Fiber Patrone MG10.000 com um volume de 2570 ml. A esta amostra foram adicionados, com agitação, 782 ml de solução de sulfato de amónio 3 M (a amostra continha agora sulfato de amónio 0,7 M).

Na etapa seguinte, 3352 ml da amostra foram colocados numa coluna de Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow, Low Substitution (Pharmacia, altura 215 mm, diâmetro 100 mm) . A coluna foi depois lavada com tampão C (tampão fosfato 20 mM do pH 7,0 + sulfato de amónio 0,5 M) e eluída com um gradiente continuamente decrescente de tampão C para tampão D (tampão fosfato 20 mM, pH 7,0). As fracções contendo PL foram reunidas (790 ml), concentradas por meio do concentrador (veja-se acima) e dialisadas contra tampão D; foram obtidos 150 ml de amostra.

Numa outra etapa foram colocados em cada um dos casos 30 ml da amostra, em 5 preparações, numa coluna de cromatografia de permuta aniónica Mono Q (Pharmacia, 6,3 ml). 18 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ A coluna foi lavada com tampão D e a eluição foi realizada num gradiente continuo de tampão D para tampão B, começando a PL a eluir a cerca de NaCl 200 mM.

As fracções contendo PL foram reunidas e dialisadas através de colunas PD-10 (Pharmacia) contra tampão E (tampão fosfato 20 mM, pH 7,1). A amostra tinha um volume de 24 ml.

Purificação final da PL através de Mono P HR5/20 (Cromatofocagem)

Os 24 ml (veja-se acima) foram colocados na coluna MONO P (altura 200 mm, diâmetro 5 mm). A coluna foi depois lavada com tampão E. A amostra foi eluida com tampão F (Polybuffer 74, da Pharmacia diluído 1:10 com água destilada e ajustado a pH 4,0 com HC1 1 M). A PL eluiu depois de 13 vezes o volume de coluna de tampão F ter passado pela coluna. A proteina purificada apresenta na electroforese em gel de SDS uma banda homogénea com um peso molecular de cerca de 31 000 Dalton. O ponto isoeléctrico encontra-se próximo do pH 4,3. A proteina purificada desta maneira foi utilizada para a sequenciação. A fosfolipase isolada desta maneira foi utilizada para a obtenção de anticorpos em coelhos. A imunização foi realizada utilizando o método padrão descrito em Harlowe e Lane (Lit: Ed Hariowe e David Lane, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). O anti-soro obtido pôde ser utilizado directamente para Western blots (como também descrito em Harlowe e Lane), onde marcava a banda de fosfolipase de forma especifica.

Exemplo 5

Desmucilaginação de óleo de soja

Aquecem-se 200 g de óleo de soja desmucilaginado por via húmida, com um teor de fosfato restante de 160 ppm, num balão de fundo redondo, a 40°C. São adicionados 10 g de água contendo 20 mg de ácido citrico e 100 unidades de fosfolipase. A enzima é proveniente da fermentação de um transformante de Aspergillus niger que contém a construção de fosfolipase. A verificação da actividade é realizada a pH 3,5. Para este 19 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ efeito são adicionados a 10 ml de f osf atidilcolina a 1% (Epikuron 200 da Lucas Meyer) contendo 0,5 ml de CaCl2 0,32 M, 10 ml de solução de Triton X-100 e 5 ml de ácido cítrico mono-hidratado 0,0033 M e tempera-se durante 10 minutos a 40°C. São adicionados 0,1 ml de solução de enzima adequadamente diluída e realiza-se uma incubação de 10 minutos a 40°C. Com solução de KOH 0,01 M titula-se até se obter um pH 10. O valor do branco (solução de enzima aquecida durante 15 minutos a 95°C, na preparação) é subtraído, e o cálculo é realizado de acordo com o exemplo 3. O conteúdo do balão de fundo redondo é disperso intensivamente por meio de uma bomba centrífuga externa, circulando o conteúdo do balão aproximadamente uma vez por minuto e sendo o tamanho das partículas na fase aquosa inferior a 1 μ. Em intervalos de duas horas, são tiradas amostras que são analisadas em relação ao teor de fósforo. Nestas análises foram obtidos os valores seguintes:

Tempo em horas 0 2 4 6 8 Teor de fósforo em ppm 160 24 12 7 3 Em ensaios nos quais se procedeu como descrito, adicionando-se no entanto em vez da preparação enzimática uma quantidade correspondente de proteína de soro de leite, portanto uma proteína não enzimática, ou lisofosfolipase comercial (C-Zyme da Enzyme Biosystems, Estados Unidos, 1000 unidades de lisofosfolipase por 200 ml de óleo de soja), o teor de fósforo não conseguiu ser reduzido abaixo dos 80 ppm.

Exemplo 6

Melhoramento da qualidade da massa O ensaio de cozedura que se segue foi realizado com a fosfolipase de acordo com o invento. Foi preparada uma massa a partir de 100 partes em peso de farinha, 2 partes em peso de sal, 3 partes em peso de levedura de padeiro, 58 a 60 partes em peso de água e 40 a 50 ppm de ácido ascórbico (em relação ao peso da massa), num amassador de espiral (produto de fabrico Kemper) durante 2 min em posição baixa 1 e 6 min em 20 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ posição superior 2. Antes de se iniciar a operação de amassagem, foram adicionados à água as enzimas e os outros aditivos. A temperatura da massa era de 23° a 25°C. Após 20 min de repouso, a massa para a fabricação de pão branco foi separada em pedaços de 350 g, formada, fermentada durante 70 min ou 90 min a 32°C e 80% de humidade atmosférica relativa e cozida durante 32 min a 230°C. Na tabela 3 é indicado o volume do pão para diferentes adições de enzima. Os resultados de cozedura mostram que através da adição de fosfolipase tanto o volume do pão cozido como a estrutura do miolo do pão são melhorados. O efeito estabilizador exercido na massa manifesta-se nos bons resultados de cozedura no caso do tempo de fermentação mais elevado (90 min)

Tabela 3: Ensaios de cozedura

Aditivos/ 100 kg de farinha Volume de cozedura 70 min de ferment. % 90 min de ferment. % Estrutura de poros Sem aditivos 1000 cc 100 1050 cc 100 irregular Amilase de fungo 10000 SKB 1050 cc 105 1130 cc 107 irregular Amilase de fungo 10000 SKB + fosfolipase 2500 PLU 1100 cc 110 1225 cc 117 irregular Amilase de fungo 50000 SKB 1225 cc 122 1275 cc 121 irregular Amilase de fungo 50000 SKB + fosfolipase 12500 PLU 1275 cc 128 1365 cc 130 irregular Xilanase de fungo 12000 UXYL 1325 cc 133 1375 cc 131 irregular Xilanase de fungo 1200 UXYL + fosfolipase 12500 PLU 1375 cc 138 1475 cc 140 irregular 21 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:

(A) NOME: ROEHM GMBH (B) RUA: Kirschenallee (C) LOCALIDADE: Darmstadt (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: 64293

(A) NOME: Fridolin LOEFFLER (B) RUA: Karl-Henkelmann-Weg 4 (C) LOCALIDADE: Bensheim (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: 64625

(A) NOME: Gerald JUNGSCHAFFER

(B) RUA: Haehnleiner Strasse IA (C) LOCALIDADE: Alsbach-Haehnlein (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: 64665

(A) NOME: Quoc Nguyen KHANH (B) RUA: Am Tannenberg 9 (C) LOCALIDADE: Reichelsheim (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: 64385

(A) NOME: Erwin SCHUSTER (B) RUA: Darmstaedter Str. 237 (C) LOCALIDADE: Bensheim-Auerbach (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: 64625

(A) NOME: Bruno SPROESSLER (B) RUA: Auf der Schmelz 93 (C) LOCALIDADE: Rossdorf (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: 64380 22 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ (Α) ΝΟΜΕ: Sabine WOLF (Β) RUA: Otzbergstrasse 44 (C) LOCALIDADE: Otzberg (Ε) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: 64853 (ii) TÍTULO DO INVENTO: Proteína com actividade de fosfolipase (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 4 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) SUPORTE DE DADOS: Floppy dísk

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (EPA) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1368 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: cadeia dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: intrão (B) POSIÇÃO: 222..275 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: intrão (B) POSIÇÃO: 442..486 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: intrão (B) POSIÇÃO: 824..874 23 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ (ix) CARACTERÍSTICA:

(Α) ΝΟΜΕ/CHAVE: CDS (Β) POSIÇÃO: join(140..221, 276..441, 487..823, 875..1180) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mat_peptide (B) POSIÇÃO: 221..1180 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: sig_peptide (B) POSIÇÃO: 140..220 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1 ATGGGGAATT GGGGTGGGTA ATATGATACA GGTATAAAAG GGGGCTCGGA GGTGCAGTTG 60 GATAGAAGCA TTGTGTGTGC ATTGCAGCAG TCCGTTGGTC TCACGTCTCT GGTTGCCTCG 120 ATTGTATATA TACTGCAGG ATG TTC TCT GGA CGG TTT GGA GTG CTT TTG ACA 172

Met Phe Ser Gly Arq Phe Gly Vai Leu Leu Thr -27 -25 -20 GCG CTT GCT GCG CTG TGT GCT GCG GCA CCG ACA CCA CTT GAT GTG CGG A 221

Ala Leu Ala Ala Leu Cys Ala Ala Ala Pro Thr Pro Leu Asp Vai Arg -15 -10 -5 GTAGGTGTGC CTGATTTGAA GTGGCTGGAT AGCACTGATG AAGGTTTTGA ATAG GT 277

Ser 1 GTC TTG ACT TCC ACG TTG GAT GAG CTG CAA TTG TTC TCG CAA TGG TCT 325

Vai Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gin Leu Phe Ser Gin Trp Ser 5 10 15 GCC GCA GCT TAT TGC TCG AAC AAT ATC GAC TCG GAC GAC TCT AAC GTG 37 3

Ala Ala Ala Tvr Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Aso Asa Ser Asn Vai 20 25 “ 3Ò ACA TGC ACG GCC GAC GCC TGT CCA TCA GTC GAG GAG GCG AGC ACC AAG 421

Thr Cys Thr Ala Asp Ala Cys Pro Ser Vai Glu Glu Ala Ser Thr Lys 35 40 45 ATG CTG CTG GAG TTT GAC CT GTATGTTGCT CCAGTGAAAT GGATAGAACA 471

Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu 50 55 CAGCTGATTG A AT AG G ACA AAT AAC TTT GGA GGC ACA GCC GGT TTC CTG 520

Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala Gly Phe Leu 60 65 GCC GCG GAC AAC ACC AAC AAG CGG CTC GTG GTC GCC TTC CGA GGC AGT 568

Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Vai Vai Ala Phe Arg Gly Ser 70 75 80 AGC ACC ATC AAG AAC TGG ATT GCT GAT CTC GAC TTC ATC CTG CAA GAT Ser Thr Ile Lys Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ile Leu Gin Asp 85 90 95 516 24 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ AAC GAT GAC CTC TGT ACT GGC TGC AAG GTT CAC ACT GGA TTC TGG AAG 564

Asn Asp Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Vai His Thr Gly Phe Trp Lys

100 105 110 11S GCA TGG GAA GCC GCT GCA GAC AAT CTG ACG AGC AAG ATC AAG TCC GCG 712

Ala Trp Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys Ile Lys Ser Ala 120 125 130 ATG AGC ACG TAT TCG GGC TAT ACC CTC TAC TTC ACC GGG CAC AGC TTG 760

Met ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly His Ser Leu 135 140 145 GGC GGC GCA TTG GCT ACA CTG GGA GCA ACG GTC TTG CGA AAT GAC GGT 808

Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Vai Leu Arg Asn Asp Gly 150 155 160 TAT AGC GTT GAA CTG GTGAGTGCTT CAGAGGGTGA TCATTAAACA GCCGGTTCTG 863

Tyr Ser Vai Glu Leu 165 ACAGTCAATA G TAC ACC TAT GGA TGT CCT CGA GTC GGA AAC TAT GCG CTG 913

Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Vai Gly Asn Tyr Ala Leu 170 175 180 GCC GAG CAC ATC ACC AGC CAG GGA TCT GGA GCG AAC TTC CCT GTT ACA 961

Ala Glu His Ile Thr Ser Gin Gly Ser Gly Ala Asn Phe Pro Vai Thr 185 190 195 CAC TTG AAC GAC ATC GTC CCC CGG GTG CCA CCC ATG GAC TTT GGA TTC 1009

His Leu Asn Asp Ile Vai Pro Arg Vai Pro Pro Met Asp Phe Gly Phe 200 205 210 AGC CAG CCA AGT CCA GAA TAC TGG ATC ACC AGT GGC ACC GGA GCC AGT 1057

Ser Gin Pro Ser Pro Glu Tyr Trp ile Thr Ser Gly Thr Gly Ala Ser 215 220 225 GTC ACG GCG TCG GAT ATT GAA CTC ATC GAG GGA ATC AAT TCG ACG GCG 1105

Vai Thr Ala Ser Asp Ile Glu Leu Ile Glu Gly Ile Asn Ser Thr Ala 230 235 240 245 GGG AAT GCA GGC GAA GCA ACG GTG GAC GTT TTG GCT CAC TTG TGG TAC 1153

Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Vai Asp Vai Leu Ala His Leu Trp Tyr 250 255 260 TTT TTC GCA ATT TCA GAG TGT CTG CTA TAGCTTGGAC AGTCCGATGA 1200

Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu 255 270 AATAAGTGCG GAGAGAAAGT GTAAATAGTA ATTAAGTATA TATCAGGCAG AGAAGCAGTG 1260 GTGGTCAGAG AAGAAAGAGT GAGTCCCATT ACGTAGCAGA TAACCACGTG TGGAGGCGCT 1320 GTTCCTCCAC TTGCAGTTGC GGCCATCAAT CATATTCTTC TCCTTACT 1368 (2) INFORMAÇÃO REFERENTE AO SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 297 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 25 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: : 2 Met Phe Ser Gly Arg Phe Gly val Leu Leu Thr Ala Leu Ala Ala Leu -27 -25 -20 -15 Cys Ala Ala Ala Pro Thr Pro Leu Asp Val Arg Ser Val Ser Thr ser -10 -5 1 5 Thr Leu Asp Glu Leu Gin Leu Phe Ser Gin Trp Ser Ala Ala Ala Tyr 10 15 20 Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Asp Asp Ser Asn Val Thr Cys Thr Ala 25 30 35 Asp Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala ser Thr Lys Met Leu Leu Glu 40 45 50 Phe Asp Leu Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala Gly Phe Leu Ala Ala 55 60 65 Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Ser Thr 70 75 80 85 IlG Lys Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ile Leu Gin Asp Asn Asp 90 95 100 Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly Phe Trp Lys Ala Trp 105 110 115 Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys Ue Lys Ser Ala Met Ser 120 125 130 Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly 135 140 145 Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg Asn Asp Gly Tyr Ser 150 155 160 165 val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu 170 175 180 Ala Glu Hls Ile Thr Ser Gin Gly Ser Gly Ala Asn Phe Pro Val Thr 185 190 195 His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Val Pro Pro Met Asp Phe Gly Phe 200 205 210 Ser Gin Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Gly Ala Ser 215 220 225 Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Leu Ile Glu Gly Ile . Asn Ser Thr Ala 230 235 240 245 Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val ASp Val Lâu . Ala : His : Leu Trp Tvr 250 255 260 Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu 265 270 (2) INFORMAÇÃO REFERENTE AO SEQ ID NO:3: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) tipo de cadeia: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear 26 ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: GGAATTCACC TGCTAACCAT GTTCTCTGGA CGGTTTGGAG TG 42 (2) INFORMAÇÃO REFERENTE AO SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: CGGGATCCAA GCTATAGCAG ACACTCTGAA ATTG 34

Lisboa

Claims

ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína com actividade de fosfolipase, obtenível através de clivagem da sequência madura da lisofosfolipase de Aspergíllus com a SEQ ID NO:2, em dois produtos de clivagem, em que estes produtos de clivagem estão ligados através de, pelo menos, uma ligação clivável sob condições redutoras ou em que pelo menos um dos produtos de clivagem não ligados possui actividade de fosfolipase.
2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por um dos produtos de clivagem possuir um peso molecular de 30 kDa.
3. Proteína de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por a clivagem da sequência madura da lisofosfolipase de Aspergíllus foetidus ter ocorrido entre as posições 44 e 45 da sequência de aminoácidos.
4. Proteína de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por poder ser isolada a partir de culturas de Aspergíllus.
5. Proteína de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por poder ser isolada a partir de culturas de A. foetidus, A. niger ou A. oryzae.
6. Proteína com actividade de fosfolipase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser reconhecida por um anticorpo contra fosfolipase purificada proveniente de Aspergíllus foetidus RH 3046.
7. Processo para a produção de uma proteína com actividade de fosfolipase de acordo com a reivindicação 1, através de fermentação de um organismo hospedeiro adequadamente transformado e produtor de lisofosfolipase, num meio de cultura adequado, e isolamento da proteína com actividade de fosfolipase a partir do filtrado da cultura isento de células, caracterizado por a fermentação ser realizada numa gama ácida ou ligeiramente alcalina. ΕΡ Ο 904 357 /ΡΤ 2/2
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a fermentação ser realizada a um valor de pH de 2 a 9, de preferência 3 a 8.
9. Processo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado por se utilizar como organismo hospedeiro transformado, uma estirpe de Aspergillus ou uma estirpe de Trichoderma.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se utilizar como organismo hospedeiro transformado, Aspergillus foetidus ou Aspergillus oryzae.
11. Utilização de uma proteína de acordo com uma das reivindicações 1 a 6 para a desmucilaginação de um óleo vegetal.
12. Utilização de uma proteína de acordo com uma das reivindicações 1 a 6 como agente auxiliar de panificação. Lisboa,