TW565610B

TW565610B - Protein having phospholipase activity

Info

Publication number: TW565610B
Application number: TW087111741A
Authority: TW
Inventors: Fridolin Loffler; Gerald Jungschaffer; Quoc Khanh Nguyen; Erwin Schuster; Bruno Sprobler
Original assignee: Ab Enzymes Gmbh
Priority date: 1997-01-16
Filing date: 1998-07-18
Publication date: 2003-12-11
Also published as: US6140094A; HUP9901640A3; DE19701348A1; ATE348151T1; AR010099A1; EP0904357B1; WO1998031790A1; DE59813840D1; EP0904357A1; HUP9901640A2; CA2243476A1; MY117580A; BR9805893A; CN1152954C; CN1216061A; HU224831B1; HK1019074A1; ES2275299T3; DK0904357T3; CA2243476C

Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565610 A7 B7 五、發明説明彳) 本發明敘述一種具磷脂酶活性之蛋白質，其特徵爲具有麹菌屬的脫脂酸磷脂酶的成熟序列或由其衍生的序列，並可至少有一位置被切割；於切割時，切割片段可以至少一個在還原態可切斷的鍵結相連結或至少一個未連結的切割片段具有磷脂酶活性。本發明亦敘述此蛋白質的製法以及利用此蛋白質將蔬菜油脫膠及當作烘培輔助品的用法。將食用油脫膠的時候，磷脂酶會使無法水合的磷脂質變成水溶性並藉此使之溫和地脫離食用油，這種方法省錢又環保。歐洲專利案號0 5 1 3 709 (R0hm/Lurgi)首次展現一種以酵素有效脫膠的方法。此方法中，先以水脫膠的食用油被磷脂酶水溶液乳化成小於1 0微米的小滴。水解後（酸鹼値3至6，溫度爲攝氏50至70度）水層被分離出來。

Lurgi將此種酵素脫膠的方法引進食用油工業，稱之爲〜 EnzyMax法〃。專利DE 43 39 556描述此一方法進一步的變化，利用表面張力劑或溶解劑將使用過、含有膠質之水層中的酵素溶解出來重複使用，將之視爲實質上不含膠質的含酵素水溶液再利用。要製造足以供應使用此方法的大型工業規模的酵素用量可能只有依賴微生物。因此需要能夠無限制地製造磷脂酶酵素的微生物。西元1 995年7月26日的專利DE-OS 195 27 274.9 (R6hm/Lurgi)敘述在 Aspergillus niger中發現一* 個合適的磷脂酶。此磷脂酶會將卵磷脂分解爲脫脂酸卵磷脂並能進一步將脫脂酸卵磷脂分解爲磷脂酸膽鹽（ phosphatidylcholine)。源自麹菌屬的純脫脂酸磷脂酶僅能將本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 4 -- -I- I - - - - -.....— I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

565610 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明？) 脫脂酸卵磷脂分解，在脫膠程序上則無效果。此點和非切割醯基的磷脂酶C及D相同。磷脂酶可進一步的被用作烘培輔助品以改進麵團處理〇本發明的目的是提供一個低成本且純度提高的磷脂酶。利用轉型的宿主微生物應能大量製造磷脂酶。利用此等酵素應能製造適於水解磷脂質的調劑並淸除澱粉水解產物以及製造烘培輔助品。由本發明所述之具有磷脂酶活性的蛋白質來看，此目的已達成。其特徵爲具有麴菌屬的脫磷脂的成熟序列或由其衍生的序列，並可至少有一位置被切割，於切割時，切割片段可以至少一個在還原態可切斷的鍵結相連結或至少一個未連結的切割片段具有磷脂酶活性。本發明的目的因具有磷脂酶活性的蛋白質可以被一株源自Aspergillus foetidus RH 3046的純磷脂酶抗體辨識而被進一步達成。令人驚訝的是，依專利DE-0S 1 96 20 649.9所記載之方式以麴菌屬DNA轉型的微生物並非僅編碼脫脂酸磷脂酶，而是在特定的培養狀態下亦能持續的產生磷脂酶。此磷脂酶具有和脫脂酸磷脂酶相同的一級結構，但二級與三級結構則不相同，導致其生理特性亦不同。上述的序列已載於專利DE-0S 1 96 20 649.9的序列編號一號序列裏。另一源自A s p e r g i 11 u s n i g e r的憐脂酶編碼序列亦被分離出來，其中僅有6%的胺基酸與Aspergillus foetidus的對應序列不同。 Aspergillus foetidus的憐脂酶與 Aspergillus niger的脫脂酸碟本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐）-5 - (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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565610 A7 B7 五、發明説明？) 脂酶均由270個胺基酸組成，分子量均爲36,000道爾頓（參照序列編號一號與二號序列）。若要索取轉型微生物，其參考資料已公佈於專利DE-OS 1 96 20 649.9。迄今尙無麴菌屬的磷脂酶曾經在以往專利中被發表過。僅有Nakay a氏等人於西元 1990 年在 Eur. J· Biochem. 193 (1): 31-38頁的報告中描述一個與磷脂酶A2相似的序列。磷脂酶與脫脂酸磷脂酶可以用蛋白質化學的方法加以分離並提高純度。將純化後的磷脂酶與脫脂酸磷脂酶加以比較可得知其有以下差異： --以SDS膠體電泳測量源自Aspergillus foetidus之磷脂酶與脫脂酸磷脂酶在還原態時的分子量，磷脂酶約爲 30,000道爾頓，脫脂酸磷脂酶則約爲36,000道爾頓；而這兩種酵素在非還原態則均約爲36，000道爾頓。在還原態時磷脂酶會分解爲兩條胜肽鏈，其中較大者（30,000道爾頓）會停留在電泳膠體上。由於試驗操作上的原因，約爲6,000道爾頓的片段無法在同一片電泳膠體上出現，但由此可推測磷 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·

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認確以加序定質白蛋由經並成組所鏈肽胜條兩由是酶匕曰 nfl 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ---A s p e r g i 11 u s f 〇 e t i d u s的磷脂酶蛋白質序列和脫脂酸磷脂酶序列具有極高的相似性，但亦有其差異存在。就磷脂酶而言，它有兩個含氨基端序列以1:1比例存在；而脫脂酸磷脂酶僅有一個。兩個含氨基端序列中，一個屬於6,000 道爾頓的胜肽，另一個屬於30，000道爾頓的蛋白質。較小的胜肽與成熟脫脂酸磷脂酶的第1至44殘基相吻合（參照專利本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）-6 - 565610 A7 _B7___ 五、發明説明f ) DE-OS 1 96 20 649.9序列編號一號序列），30,000道爾頓的蛋白質序列與成熟脫脂酸磷脂酶的第45至270殘基相對應（參照專利DE-0S 1 96 20 649.9序列編號一號序列）。這個發現使我們了解到Aspergillus foetidus的磷脂酶可能是由脫脂酸磷脂酶加工而成，但加工過程是發生在細胞內或細胞外及其如何進行則不得而知。磷脂酶與脫脂酸隣脂酶的相互關係如圖說一所示。磷脂酶與脫脂酸磷脂酶間的差異還包括了等電點、酸鹼値、最適作用溫度以及其最大差異，即對熱的穩定性。上述各項的比較如下表所示。 (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} .dw

-、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）-7 - 565610 A7 B7 五、發明説明彳) 表一：也/Μ/ώΛ鑛脂酶與脫脂酸磷脂酶特質的比較分子量 (SDS膠體，還原態）磷脂酶脫脂酸磷脂酶 30,000道爾頓 36,000道爾頓分子量 (SDS膠體，非還原態）；36,000道爾頓；36,000道爾頓等電點 pH 4.3 pH 4.2 最適作用溫度 50°C 55〇C 最適作用酸鹼値 pH 3-4 pH 4.5 酸鹼値穩定性 (60°C，一小時） pH 3.5 殘餘75%以上活性 pH 4.5 殘餘10%活性 ΙΓ --r — — — — — Awl, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂要以本發明所述之微生物生產磷脂酶而非脫脂酸磷脂酶必須靠發酵條件來控制。必須要在酸到弱鹼性的培養基中培養以生成磷脂酶，適當的酸鹼値爲2至9，而較佳的酸鹼値爲3到8。在上述條件下磷脂酶會優先生成。方法如下首先以能採取最簡便方式來生產磷脂酶爲條件挑選適當宿主。雖然很多黴菌都被認爲是適當的宿主，如好熱的 Humicola、Thermomyces及 Mucoid ’ 以及 Rhizopus、Absidia 、Chaetomium、Trichoderma、Thielavia、Penicillium與本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-8 -

經濟部中央標率局員工消費合作社印製 565610 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明p ) Cephalosporium屬，但較佳的是本發明所用的麴菌屬。經以本發明所述以質體轉型後，轉型株可以藉其能產生大量磷脂酶來與宿主細胞分離。較適合用來轉型的宿主生物爲麴菌屬的 Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae、Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus foetidus、 Aspergillus elliptic us、Aspergillus aculeatus、Aspergillus carbonarius 或 Aspergillus phoenici s，或是木黴屬的 Trichoderma viride、Trichoderma longibrachiatum或 Trichoderma reesei o 以質體PAN7-1、p3SR2或pSTAlO其中之一加上一個表現質體，較佳爲pKC3、pKC9、pKC12或pKCN2轉型得到的轉型株被培養在培養宿主所用的營養液中，此營養液至少含有一種可代謝之碳源，例如育米粉、澱粉或澱粉糊精；以及一種可代謝的含氮有機質來源，例如玉米浸泡液、酵母菌自溶產物、大豆粉、大豆蛋白或蛋白腺；或加上無機氮源如銨鹽或硝酸鹽，並於滅菌後將酸鹼値調爲酸至弱鹼性。營養液中可添加促進磷脂酶生成的物質，這些物質出現於大豆磷脂質或其他物質如聚環氧乙烷乙醚。依據本發明，當滅過菌的營養液接種轉型株的分生子或滋養性菌絲後便將之置於20至60 °C，較佳爲25至45 °C下進行通氣培養，以產生磷脂酶。培養過程中以加酸或鹼來調整培養液的酸鹼値，使之維持在酸性至弱鹼性範圍間，而以酸鹼値3至8 爲佳。經過48至120小時的培養，磷脂酶通常可以用過濾法與不可溶的殘存養分及生物群分開，再以傳統的方法如超 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .dw 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ 297公釐）-9 - 565610 A7 _ B7 五、發明説明（7 ) 微過濾法濃縮濾液。濃縮液可被用來將蔬菜油脫膠或處理磷脂質。磷脂酶可進一步的被用於改良食物的流變性質。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 下列微生物已依據佈達佩斯條約規定送存至德國 Samm 1 ung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) 5 所在地爲Masc he rode r Weg IB, 38124 Braunschweig,

German: A. oryzae RH 3745·•編號 DSM 1 1 283 (送存日期： 1 996年1 1月11曰） A. ellipticus RH 3 8 86:編號 DSM 1 1 284 (送存日期： B. 1 996 年 11 月 11 日） A. foetidus RH 3046:編號 DSM 1 0652 (送存日期： 1996年4月24日） E. coli DH5a pKC3:編號 DSM 1 0653 (送存日期： 1 996年4月24日） E. coli DH5a pKC9:編號 DSM 10654 (送存曰期： 1 996年4月24日） E. coli DH5a pKC12:編號 DSM 10655(送存日期： 1 996年4月24日） E. coli DH5a pKCN2_·編號 DSM 1 1 352(送存日期·· 1 996年12月23曰） A. niger RH 3909:編號 DSM 1 1 35 3 (送存曰期·· 1 996年12月23曰）另外，下述微生物已於1998年3月3日寄存於國內專利微生物寄存機關-食品工業發展硏究所：米曲霉（A.oryzae)RH 3 745 p3SR2 pKCN2，寄存編號 CCRC 930019 ，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製醬油曲霉（A.sojae)RH 3 782 pSTAlO pKC9，寄存編號 CCRC 93 0020，臭曲霉（A.foetidus)RH 3046 pAN7-l pKC9，寄存編號 CCRC 93 002 1，及黑曲霉（A.niger)RH 3 909 pAN7-l pKC12，寄存編號 CCRC 930022 〇下述實施例及圖說將進一步闡明本發明。圖式簡要說明如下：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -10- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565610 A7 B7 五、發明説明¥ ) 第一圖顯示源自麴菌屬的脫脂酸磷脂酶基因的處理方式及磷脂酶的分離。第二圖顯示質體PKCN2的結構。實施例實施例一表現載體DKCN2的結構源自A. niger NRRL3的脫脂酸磷脂酶基因的分離 A. niger NRRL3的染色體DNA依據Hynes, M. J.等人於 1 983 年發表於 Mol. Cell. Biol. 3，1 430- 1439 的方法分離。所得之高分子量DNA以限制酶Sau3AI部分水解並以蔗糖密度梯度離心法將之依大小分離。其中大小在9至20千鹼基對的DNA分子被嵌入到以BamHI/EcoRI水解過的噬菌體 EMBL3的DNA中並在活體外封包。質體pKCl/3 6的Hindlll/Sall重組DNA片段被用來作爲雜合反應的探針以便偵測噬菌體λ EMBL3基因庫中的染色體脫脂酸磷脂酶基因。質體pKC 1/36所含的脫脂酸磷脂酶重組 DNA乃源自 A. foetidus RH 3046。經過雜合反應及重複篩選後得到兩個陽性反應分離株。第一株的噬菌體DNA製備後以BamHI消化。經過南方氏雜合反應在接近9千鹼基對的位置出現了陽性訊號。此一 BamHI片段被植入pUC18，所得的質體含有完整的染色體脫脂酸磷脂酶基因，命名爲pKCN。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-11 - (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565610 A7 B7 五、發明説明？) 表現載體DKCN2的結構質體PKCN2上的脫脂酸磷脂酶基因被置於A. oryzae alpha-澱粉酶啓動子與A. nidulans trpC結束子的控制之下。此脫脂酸磷脂酶基因是自質體pKCN上以聚合酶連鎖反應分離的。使用的寡核苷酸引子序列如下： KC2 9 : 5 7 -GGA ATT CAC CTG CTA ACC ATG TTC TCT GGA CGG TTT GGA GTG-3, BspMI Met (序列編號三號序列） KC4 3 ： 5A -CG GGATCC AAG CTA TAG CAG ACA CTC TGA AAT TG-3,

BairiHI AMB (序列編號四號序列）

聚合酶連鎖反應以氯化鉀50 mM、去氧核苷三磷酸0.2 mM (去氧腺苷三磷酸、去氧胞苷三磷酸、去氧鳥糞苷三磷酸及去氧胸腺苷三磷酸各0.2 mM) 、KC29與KC43各50微微莫爾及pKCN2 1毫克爲基質與2.5單位的Tag聚合酶混合在酸鹼値爲8.4，體積0.1毫升的20 mM三羥甲胺基甲烷/氯化氫 (tns/HCl)中進行。反應進行20個循環（94°C 40秒，40°C 1分鐘，72°C 1分鐘）。反應完成後增幅的片段經純化、

BspMI與BamHI水解後嵌入經NocI/BamHI切割的質體PKE2 ° 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-12 - (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 565610 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明彳0 ) 質體pKE2具有A.oryzae alpha-激粉酶啓動子與A. nidulanstrpC結束子。質體PKCN2的結構經限制酶分析及隨後的定序加以確定。實施例二麴菌屬及各株Trichoderma reesei轉型方法以刮勺及大約1 0毫升0.85 %氯化鈉收取培養在平淺培養皿約二週的待轉型黴菌孢子製成孢子懸浮液。將1毫升的孢子懸浮液接種到四個裝有100毫升Czapek-Dox低養分培養基 (oid)的1公升震盪用三角燒瓶中，以軌道震盪器每分鐘旋轉震盪120次在2培養約16小時。用濾紙收集菌絲並以MP緩衝液（含有1.2 Μ硫酸鎂的10 mM磷酸鹽緩衝液，酸鹼値爲5.8 )沖洗。當緩衝液流掉後將潮濕菌絲秤重，總共約可得到3至5公克的潮濕菌絲。每公克潮濕菌絲加入5毫升MP緩衝液、120微升 Novazym溶液（溶於6毫升MP緩衝液的1公克Novazym® 234 ( Novo Nordisk)溶液）及25微升β-葡萄糖醛酸酶（Sigma)。此菌絲懸浮液至於冰水中5分鐘，隨著加入60微升牛血淸白蛋白溶液（溶於4毫升ΜP緩衝液的0.2公克牛血淸白蛋白溶液，經過濾滅菌）在30°C溫和震盪培養。以顯微鏡觀察原漿形成，一旦可辨識的原漿停止形成便停止培養，通常需培養3至5小時。將此原漿懸浮液用飽含MP緩衝液的玻璃棉過濾以除去 ΙΓΙ —-1 ΙΓ —^----— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）-13 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565610 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 較粗的菌絲成分並裝入微量離心管中，並於其上覆上一層酸鹼値爲7.0，含600 mM山梨醇的1〇〇 mM三羥甲胺基甲烷 /氯化氫溶液。將微量離心管以2,500倍重力離心10分鐘。自中央界面收取原漿，以酸鹼値爲7.5，含1 Μ山梨醇的10 mM三羥甲胺基甲烷/氯化氫溶液懸浮之。再以STC緩衝液 (酸鹼値爲7.5，含1 Μ山梨醇、1〇 mM三羥甲胺基甲烷/ 氯化氫與10 mM氯化鈣）以1，500倍重力離心淸洗原漿兩次，最後以1毫升STC緩衝液懸浮之。 A. oryzae的轉型是結合了 300微升的原漿懸浮液、約 10微克的P3SR2及1 0微克的脫脂酸磷脂酶表現質體於酸鹼値爲8.0的25微升10 mM三羥甲胺基甲烷/氯化氫溶液中，在〇 t作用10分鐘；隨即再加入25微升的上述質體混合液及400 微升的PEG溶液（酸鹼値爲7.5，含60%聚乙烯甘油6000 ( Fluka)、10 mM三羥甲胺基甲烷/氯化氫與50 mM氯化鈣）小心混合，在室溫作用5分鐘。接著加入額外的600微升PEG 溶液接著加入，混合液繼續在室溫作用20分鐘。將作用溫度提高至45 °C，混入約9毫升的乙醯胺軟洋菜（含10 mM乙醯胺爲唯一氮源、1 Μ蔗糖及重量百分比0.6洋菜的低養分培養基）。將之分裝到四個裝有上述培養基，但洋菜（ Oxoid)的重量百分比爲1.5並含有15 mM氯化絶的平淺培養皿，以28°C培養。經過6至10天，將長的較快的菌落（轉型株）再接種到不含蔗糖的乙醯胺培養基上，經過兩次挑選單一孢子菌落後接種到完全培養基，例如馬鈴薯葡萄糖洋菜。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-14 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 丁 -口 - 565610 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明彳2 ) A. niger、A· Awamori、A. Japonicus 及 A. foetidus 亦可用質體P3SR2轉型；然而以質體PAN7-1則較佳。製備原漿及加入質體D N A的程序均如前所述；然而所混入的培養基則非乙醯胺培養基，而是將全部的轉型混合液小心混入1 〇〇毫升，溫度約爲45。(：的Czapek-Dox低養分培養基（〇x.〇id )，此培養基每毫升含有100微克的潮黴素BChygromycm B) 、1 Μ蔗糖及重量百分比1.5的洋菜（〇x〇id )。然後將之每 1〇毫升分裝到裝有10毫升不含潮黴素及蔗糖的上述培養基爲固態底層的平淺培養皿中，待上層洋菜凝固後以3 0至3 7 °C培養之。在培養3至10天後將抗潮黴素B的轉型株分離繼代到每毫升含有50微克的潮黴素B及重量百分比1.5的洋菜 (Oxoid)之Czapek-Dox低養分培養基（Oxoid)以檢查其抗藥性。第三種篩選方式適用在A. sojae或A. Phoenicis，因爲這些菌株既可代謝乙醯胺又有抗潮黴素B抗藥性。缺損硝酸鹽還原酶（niaD )基因的變異株，即無法在以硝酸爲唯一氮源情況下生長的變異株，可以含有氯酸鹽的營養培養基篩選分離出來（Cove，D· J. (1 976) Heredity 36，1 9 1 -203 ) 。上述缺損可因用質體PSTA10轉型而抵銷（Unkles，S. E. 等（ 1 989) Mol· Gen. Genet. 218，99- 104 )，此質體攜有完整的硝酸鹽還原酶基因，故轉型株可在以硝酸爲唯一氮源的情況下生長而未轉型株則無法生長。一如用在A. sojae，此一篩選方式亦適用於其它麹菌屬黴菌；然而因爲使用此方式需要製造niaD變異株，這與已本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-15 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

565610 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明彳3 ) #展完成的潮黴素抗藥性或乙醯胺代謝篩選法相較則需更多的功夫。脂酶轉型株的製造 --Δ. niger、A. awamori、A. foetidus、A· carbonarius與 A-i-__gilipticus的轉型株依實施例一所述製造麴菌屬原漿並以質體PAN7-1加上質體PKC3、pKC9、pKC12或pKCN2之中的一個質體一起轉 Μ °如前所述，將轉型反應混合物塗佈在潮黴素選擇培養基i：使原漿再生以分離、純化轉型株，並以含下列成分之營養液震盪培養來檢測其是否能產生磷脂酶麥芽糖糊精 3.75% 玉米浸泡液 3.0% 磷酸鉀 1.0% 磷酸二鉀 0.7% Triton X-100 0.10% 溶於水中，以121 °C滅菌30分鐘。震盪培養後過濾除去生物群並測量濾液的磷脂酶活性（ PLU)，轉型株可以以磷脂酶活性明顯升高而與原宿主株區分開來。 A. oryzae與 A. aculeatus的轉型株依實施例二所述製造及轉型此二種麴菌的原漿，用質 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .1%.

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）_ _ 565610 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明丨4 ) 體P3SR2力口上質體pKC3、pKC9、pKC12或pKCN2之中的一個質體一起轉型。如前所述，將轉型反應混合物塗佈在以乙醯胺爲唯一碳源的選擇培養基上使原漿再生以分離、純化轉型株，並以含下列成分之營養液震盪培養來檢測其是否能產生磷脂酶麥芽糖糊精 3.75% 玉米浸泡液 3.0% 磷酸二胺 0.5% Triton X- 100 0.10 % 溶於水中，以121 °C滅菌30分鐘。 A. soiae與 A. phoenicis的轉型株根據 Cove ( 1 976)所述方法由 A. sojae RH 3782 與 A. phoenicis RH 3828 所產生的變異株 A. so」ae RH 3782 nia D22與A· phoenicis RH 3 828 niaD培養於下列成分之營養液中葡萄糖（Merck) 2% 麥芽抽出物（Oxoid) 0.5% Bacto-蛋白腺（Difco) 0.025% 去離子水調整酸鹼値爲5.0 ;以121 °C滅菌30分鐘。依實施例一所述以菌絲製造原漿，選用質體PSTA 10加上質體pKC3、pKC9或pKC12之中的一個質體一起轉型。將轉型反應混合物混入9毫升成分如下之軟洋菜（穩定滲透壓 —丨·----— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁j 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）-17 - 565610 A7 B7 五、發明説明！5 ) )使原漿再生〇 · 1 Μ磷酸鈉緩衝液酸鹼値6 · 0 1 5毫升 1 Μ蔗糖（Merck) 1〇·28公克加入Millipore處理水至 29.1毫升洋菜（Oxoid) 〇·18公克（= 0.6% ) 以121°C滅菌30分鐘，然後在無菌狀態下加入鹽溶液（7.14.2) 0.6毫升 1 Μ硝酸鈉溶液 0.3毫升並將混合液分裝到4個裝有相同成分，但洋菜濃度爲} % 的洋菜培養皿上。在3 7 °C經過6至1 0天的培養，將轉型株吊至硝酸鹽/蔗糖洋菜膠純化。篩選到的大量轉型株經由以硝酸鹽爲唯一氮源的營養培養基進一步純化並以含下列成分之營養液震盪培養來檢測其是否能產生磷脂酶 L.J-I「----II (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製麥芽糖糊精 3.75% 玉米浸泡液 3.0% 磷酸鉀 1.0% 憐酸二鉀 0.7% Triton X-100 0.10% 溶於水中，以12 PC滅菌30分鐘。除了和未轉型宿主一起出現的無磷脂酶或低產量的轉型株之外’濾液中磷脂酶活性顯著升高的增強轉型株亦被發現。這些菌株適合用來製造此酵素，被命名爲同步轉型株。表二比較了轉型株及未轉型宿主特有的磷脂酶生成狀本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）-化-

II 565610 A7 B7五、發明説明！6 )況表二：宿主及轉型株的磷脂酶生成比較菌株或轉型株 A. oryzae RH 3 74 5 A· oryzae RH 3745 p3SR2 pKC9 A. oryzae RH 3745 p3SR2 pKCN2 A· sojae RH 3782 niaD22 A. sojae RH 3782 niaD22 pSTAlO pKC9 Λ. foetidus RH 3046 A· foetidus RH 3046 pAN7-l pKC9 A. phoenicis RH 3828 niaD A. phoenicis RH 3828 niaD pSTAlO pKC9 磷脂酶相對活性 100 3000-4000 2000-2500 100 500-700 100 1000-1500 100 400-600 L·—,--门------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）-19 - 565610 A7 B7 五、發明説明Γ ) 菌株或轉型株 A. ellipticus A. ellipticus pAN7-l pKC12

A. heterornorphus niaD A. heterornorphus niaD pSTAlO A. carbonarius A. carbonarius pAN7-l pKC9 A. aculeatus A. aculeatus p3SR2 pKC9 A. niger A· niger pAN7-l pKC12 A. awamori A. awamori pAN7-l pKC12 磷脂酶相對活性 100 800-900 100 pKC9 900-1000 100 400-600 100 900-1200 100 700-1000 100 600-800 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T

經濟部中央標準局員工消費合作社印^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0X297公釐）-20- 565610 Α7 Β7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製五、發明説明彳8 ) 實施例四 A. foetidus磷脂酶的純化將A. foetidus RH 3788培養液濾液2080毫升加入3520毫升的蒸餾水稀釋以降低電導性並以160毫升的1 Μ氫氧化鈉將酸鹼値調至7.0。最後樣本的體積爲5670毫升，電導性爲 7.8 mS/cm 〇下一個步驟是以DEAE-Fractogel (Merck)進行離子交換樹脂層析分離術。5760毫升的酵素溶液被分成四份（一份 1440毫升）倒入DEAE-Fractogel管柱（高 27 8毫米、直徑100 毫米）中。以緩衝液A (酸鹼値7.0的磷酸二鈉/磷酸鈉溶液加上15 mM的氯化鈉配製成的20 mM磷酸鹽緩衝液）灌洗管柱，再以緩衝液A到緩衝液B (緩衝液A加上1 Μ氯化鈉）的連續梯度溶液洗出酵素。洗出的速率爲70毫升/分鐘，每個分段收集350毫升。測試各分段的磷脂酶活性以了解哪個分段有磷脂酶存在。一單位的磷脂酶（？1^)定義爲能在40艽，酸鹼値3.5 時以每分鐘1 μΜ的速率水解卵磷脂水溶液的酵素量。磷脂酶活性測量方式如下：受質：1公克的Epikuron 200 (Lucas Meyer出品的磷脂酸膽鹽）加100公克蒸餾水及5毫升0.32 Μ的氯化鈣後以Ultra T u η· a X將之均質化。分析：將10毫升受質加上10毫升的1% Triton X-100溶液（ Fluka)及5毫升0.0033 Μ單結晶水檸檬酸溶液後保持40°C 10分鐘；使酸鹼値爲3.4至3.5之間。將〇·1毫升酵素加入上述 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）-21 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565610 A7 __ B7 五、發明説明彳9 ) 混合物中，在40。(：作用1 〇分鐘。試驗時酵素濃度不可超過 2 · 5單位/公克。作用時間結束後以〇. 〇丨μ氫氧化鉀將混合物反滴定至酸鹼値1 〇 · 〇，滴定時前5毫升先很快的加入，然後再減低滴定速率以避免超過滴定終點。將酵素加熱到約95 °C維持15分鐘使之不活化以得到空白値（BV )，降溫後將之和測試値（MV )以一樣的方式稀 η 釋’而下述步驟是測試値操作的方式。計算式： MV (毫升)-BV (毫升)X 0.01 Μ X 1000 =PLU/公克，ΡΗ 3.5 =- 10分鐘X 0.1毫升酵素濃度公克/毫升在1 995年七月26日的專利申請第1 95 27 274.9號中，磷脂酶係以卵磷脂酶單位（LU/公克）計量。一單位卵磷脂酶是能在40°C，酸鹼値8時以每分鐘1 μΜ的速率釋出卵黃中脂肪酸的酵素量。1單位卵磷脂酶（酸鹼値8 )相當於1 08單位的的磷脂酶（酸鹼値3.5)。磷脂酶約在以0.1 1 Μ氯化鈉灌流時被洗出。四次含有磷脂酶的分段收集液被收在一起（8,950毫升），以Amicon 生產的分子量閾値爲1〇,〇〇〇的中空微纖筒CH2A濃縮器濃縮爲2，57 0毫升。接著在樣品中加入782毫升的3 Μ硫酸胺攪拌均勻（此時樣品的硫酸胺濃度爲0.7 Μ)。在下個階段，所有3,352毫升的樣品被倒入Phenyl 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-22 - L·!-.--^----II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂

經濟部中央標率局員工消費合作社印製 565610 A7 ____B7 _ 五、發明説明？0 )

Sepharose 6高流速低替代性管柱（Pharmacia出品，高215毫米’直徑100毫米）。以緩衝液C (酸鹼値7.0的20 mM磷酸鹽緩衝液加上0.5 Μ硫酸胺）沖洗管柱，並以自緩衝液C至緩衝液D (酸鹼値7.0的20 mM磷酸鹽緩衝液）的下降梯度洗出酵素。含酵素的分段收集倒在一起（790毫升）並以前述之濃縮器濃縮再以緩衝液D透析；最後得到1 50毫升的樣品〇接下來將樣品分爲各30毫升的五等份倒入Mono ( Pharmacia，6.3毫升）陰離子交換樹脂層析管柱。以緩衝液D 灌洗管柱，再以緩衝液D到緩衝液B的連續梯度洗出酵素，磷脂酶約在氯化鈉濃度爲200 mM時被洗出。含磷脂酶的分段收集倒在一起後以PD-10管柱（ Pharmacia)在緩衝液E(酸鹼値7.1的20 mM磷酸鹽緩衝液），樣本的終體積爲24毫升。以 Mono P HR5/20 (層析集中法，chromatofocusing)進行憐脂酶的最終純化前述的24毫升樣品倒入Mono P管柱（高200毫米，直徑 5毫米）中，並以緩衝液D沖洗管柱。樣品以緩衝液F ( Pharmacia出品之Polybuffer 74以蒸餾水稀釋十倍後用1 μ鹽酸調整酸鹼値至4.0 )洗出。磷脂酶在13倍管柱容積的緩衝液F通過時被洗出。純化的蛋白質在SDS膠體電泳中只在分子量約31，000道爾頓的位置形成一條帶。等電點約在酸鹼値4 · 3。純化的蛋本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐1 ~- 23 - (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 565610 A7 B7 _ 五、發明説明Ρ ) 白質被用來定序及注射兔子來產生抗體。免疫的方法如

Harlowe 氏及 Lane 氏（參考：Ed Harlowe & David Lane， Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory，1 988 )所述之標準程序進行。所得到的抗血淸可用來進行西方氏墨點吸漬反應（同樣依Harlowe氏及Lane氏所述），將磷脂酶形成的帶標示出來。實施例五大豆油脫膠將殘留有160 ppm磷酸鹽的200公克潮濕去膠大豆油裝在圓底燒瓶中加熱至40 °C，並加入溶於10公克水的20毫克檸檬酸與100單位的磷脂酶。此酵素以A. niger轉型株發酵產生且具有磷脂酶的結構，其活性在酸鹼値3 · 5時測得。含有0.5毫升0.32 Μ氯化鈣之1%磷脂酸膽鹽（Epikuron 200， Lucas Meyer出品）10毫升加上10毫升的Triton X-100溶液及 5毫升0.0033 Μ單結晶水檸檬酸，置於40 °C 10分鐘。將相對稀釋的酵素0.1毫升加入並在40 °C作用10分鐘。以0.01 Μ氫氧化鉀將混合液滴定至酸鹼値爲1 〇。將空白値（酵素溶液加熱到95 °C維持15分鐘）依照實施例三所述扣除並計算其結果。以外接的離心幫浦將圓底燒瓶內容物極度的分散，內容物約每分鐘通過幫浦一次。水溶液相以小於1微米的顆粒存在。每兩小時採樣一次檢查其中的磷含量，測得數値如下·· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐1 -24- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 565610 A7 _ B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明？2 ) 經過時間，以小時計〇 2 4 6 8 磷含量，以百萬分之一計160 24 1 2 7 3 另外以前述相同方法進行試驗，但以無酵素活性的市售乳淸蛋白或脫脂酸憐脂酶（美國Enzyme Biosystems公司出品之G-Zyme，每200毫升大豆油1，〇〇〇單位脫脂酸磷脂酶 .)取代其中的酵素配置液，結果磷含量均無法降至百萬分之80。實施例六改良麵團品晳下述的烘培試驗使用本發明所載的磷脂酸酶。依重量比例將100份的麵粉、2份的食鹽、3份的烘培用酵母粉、58 至60份的水及占麵團總重百萬分之40至50的維生素丙用螺旋軸揉麵機（製造商：Kemper )以低速檔1攪拌2分鐘，再以高速檔2攪拌6分鐘。酵素及其他添加物在攬拌前先加到水中。麵團溫度維持在23至25 °C。靜置20分鐘後將麵團分成重350公克的小塊以製成開放式烘培的白麵包，置於32°C ，相對溼度80%下70或90分鐘使之成形，並以230°C烘培32 分鐘。表三載明了各種各種酵素添加物下所得麵包的體積。烘培結果顯示了添加磷脂酶可增進麵包容積及麵包內部結構。穩定麵團作用可明顯由延長作用時間至90分鐘仍能得到良好的烘培結果來證明。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'乂 297公釐）-25 - 565610 kl B7 五、發明説明〈一）試培烘每100公克麵粉使用的添加物作用70分鐘後烘培所得容積 % 作用90分鐘後烘培所得容積 % 孔洞結構無添加物 1，000立方公分 100 1，050立方公分 100 不規則 10,000 SKB 黴菌澱粉酶 1，050立方公分 105 1，130立方公分 107 不規則 10,000 SKB 黴菌澱粉酶加2,500 PLU磷脂酶 1，1⑻立方公分 110 1，225立方公分 117 不規則 50,000 SKB 黴菌澱粉酶 1，225立方公分 122 1，275立方公分 121 不規則 50,000 SKB 黴菌澱粉酶加12,500 PLU磷脂酶 1，275立方公分 128 1，365立方公分 130 規則 12,000 UXYL黴菌木膠酶 1，325立方公分 133 1，375立方公分 131 規則 12,000 UXYL黴菌木膠酶加12,500 PLU磷脂酶 1，375立方公分 138 1，475立方公分 140 規則 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） J^6l〇五、 A7 B7 發明説明笔4 序列_ (1) (1) (π) (iii) (i v) (2) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (ι) (ii) (ϋι) —般資料：申請者： (A) 姓名：Roehm Gmbh (B) 街名：Kirschenallee (C) 城市：Darmstadt (D) 國家：德國 (E) 郵遞區號：64293 發明名稱：具磷脂酶活性之蛋白質序列數量：4 電腦可讀形式： (A) 資料媒介：軟性磁片 (B) 電腦：與IBM電腦相容 (C) 操作系統：PC-DOS/MS-DOS (D) 軟體：Patent In Release #1.0，第 1·30 版（歐洲專利組織）序列編號一號序列的資料：序列特徵： (Α) 長度：1，368鹼基對 (Β) 形式：核苷酸 (C) 股數（strandness):雙股 (D) 拓樸學：線性分子形式：基因組DNA 假設：無本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）-27 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 565610 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7 五、發明説明？5 ) (IV) 相對序列：無 (IX) 特性： (A) 名稱/索引：內子 (B) 位置：222.........275 (IX) 特性： (A) 名稱/索引：內子 (B) 位置：824 ......... 874 (IX) 特性： (A) 名稱/索引：編碼序列 (B) 位置：連結（ 140.........221、276......... 441、4 8 7 ......... 823、8 7 5 ......... 1180) (IX) 特性： (A) 名稱/索引：成熟胜肽 (B) 位置：221··· ...... 1180 (IX) 特性： (A) 名稱/索引：訊號胜肽 (B) 位置：140.........220 (XI) 序列編號一號序列如後： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-28 - 565610 A7B7 五、發明説明？6 ) 經濟部中央榡隼局員Η消費合作衽印製 atggggaatt ggggtgggta atatgataca ggtataaaag ggggctcgga ggtgcagttg GATAGAAGCA TTGTGTGTGC ATTGCAGCAG TCCGTTGGTC TCACGTCTCT GGTTGCCTCG ATTGTATATA TACTGCAGG ATG TTC TCT GGA CGG TTT GGA GTG CTT TTG ACA Met Phe Ser Gly Arg Phe Gly Val Leu Leu Thr -27 -25 -20 GCG CTT GCT GCG CTG TGT GCT GCG GCA CCG ACA CCA CTT GAT GTG CGG A Ala Leu Ala Ala Leu Cys Ala Ala Ala Pro Thr Pro Leu Asp Val Arg -15 -10 -5 GTAGGTGTGC CTGATTTGAA GTGGCTGGAT AGCACTGATG AAGGTTTTGA.ATAG GT Ser 1 GTC TCG ACT TCC ACG TTG GAT GAG CTG CAA TTG TTC TCG CAA TGG TCT Val Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gin Leu Phe Ser Gin Trp Ser 5 10 15 GCC GCA GCT TAT TGC TCG AAC AAT ATC GAC TCG GAC GAC TCT AAC GTG Ala Ala Ala Tyr Cys Ser Asn Asn lie Asp Ser Asp Asp Ser Asn Val 20 25 30 ACA TGC ACG GCC GAC GCC TGT CCA TCA GTC GAG GAG GCG AGC ACC AAG Thr Cys Thr Ala Asp Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr Lys 35 40 45 ATG CTG CTG GAG TTT GAC CT GTATGTTGCT CCAGTGAAAT GGATAGAACA Met Leu Leu Glu Phe Asp Leu 50 55 CAGCTGATTG AATAG G ACA AAT AAC TTT GGA GGC ACA GCC GGT TTC CTG Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala Gly Phe Leu 60 65 ο 6 ο 2 2 2 5 2 3 (睛t閱漬肾面之注意事項再填寫本頁) 373 421 471 520 GCC GCG GAC AAC ACC AAC AAG CGG CTC GTG GTC GCC TTC CGA GGC AGT 568 Ala Ala Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe Arg Gly Ser 70 75 80 AGC ACC ATC AAG AAC TGG ATT GCT GAT CTC GAC TTC ATC CTG CAA GAT 616 Ser Thr lie Lys Asn Trp lie Ala Asp Leu Asp Phe lie Leu Gin Asp 85 90 95 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-29 - 565610 A7 __B7 五、發明説明Θ ) AAC GAT GAC CTC TGT ACT GGC TC-C AAG GTT CAC ACT GGA TTC TGG AAG 6,6 4

Asn Aso Asd Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly Phe Trp Lys 100 · 105 110 115 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 GCA TGG GAA GCC GCT GCA GAC AAT CTG ACG AGC AAG ATC AAG TCC GCG Ala Trp Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys lie Lys Ser Ala 120 125 130 ATG AGC ACG TAT TCG GGC TAT ACC CTC TAC TTC ACC GGG CAC AGC TTG Met Ser Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly His Ser Leu 135 140 145 GGC GGC GCA TTG GCT ACA CTG GGA GCA ACG GTC TTG CGA AAT- GAC GGT Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu Glv Ala Thr Val Leu Arg Asn Asp Gly 150 155 160 TAT AGC GTT GAA CTG GTGAGTGCTT CAGAGGGTGA TCATTAAACA GCCGGTTCTG Tyr Ser Val Glu Leu 165 ACAGTCAATA G TAC ACC TAT GGA TGT CCT CGA GTC GGA AAC TAT GCG CTG Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu 170 175 180 GCC GAG CAC ATC ACC AGC CAG GGA TCT GGA GCG AAC TTC CCT GTT ACA Ala Glu His lie Thr Ser Gin Gly Ser Gly Ala Asn Phe Pro Val Thr 185 190 195 CAC TTG AAC GAC ATC GTC CCC CGG GTG CCA CCC ATG GAC TTT GGA TTC His Leu Asn Asp lie Val Pro Arg Val Pro Pro Met Asp Phe Gly Phe 200 205 210 AGC CAG CCA AGT CCA GAA TAC TGG ATC ACC AGT GGC ACC GGA GCC AGT Ser Gin Pro Ser Pro Glu Tyr Trp lie Thr Ser Gly Thr Gly Ala Ser 215 220 225 GTC ACG GCG TCG GAT ATT GAA CTC ATC GAG GGA ATC AAT TCG ACG GCG Val Thr Ala Ser Asp lie Glu Leu lie Glu Gly lie Asn Ser Thr Ala 230 235 240 245 GGG AAT GCA GGC GAA GCA ACG GTG GAC GTT TTG GCT CAC TTG TGG TAC Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Asp Val Leu Ala His Leu Trp Tyr 250 255 260 TTT TTC GCA ATT TCA GAG TGT CTG CTA TAGCTTGGAC AGTCCGATGA Phe Phe Ala lie Ser Glu Cys Leu Leu 265 270 C 6 8 ο 8 3 6 8 961 1009 1057 1105 1153 1200 AATAAGTGCG GAGAGAAAGT GTAAATAGTA ATTAAGTATA TATCAGGCAG AGAAGCAGTG 1260 GTGGTCAGAG AAGAAAGAGT GAGTCCCATT ACGTAGCAGA TAACCACGTG TGGAGGCGCT 1320 GTTCCTCCAC TTGCAGTTGC GGCCATCAAT CATATTCTTC TCCTTACT 1368 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】0X297公釐）-30 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 565610 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 五、發明説明紅） (2) 序列編號二號序列的資料： (1) 序列特徵： (A) 長度= 297個胺基酸殘基 (B) 形式：胺基酸 (D) 拓樸學 :線性 (11) 分子形式：蛋白質 (xi) 序列編號一* 號序列如後：

Met Phe Ser Gly Arg Phe Gly Val Leu Leu Thr Ala Leu Ala Ala Leu -27 -25 -20 -15 -

Cys Ala Ala Ala Pro Thr Pro Leu Asp Val Arq Ser Val Ser Thr Ser -10 -5 1 5

Thr Leu Asp Glu Leu Gin Leu Phe Ser Gin Trp Ser Ala Ala Ala Tyr 10 15 20

Cys Ser Asn Asn lie Asp Ser Asp Asp Ser Asn Val Thr Cys Thr Ala 25 30 35

Asp Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr Lys Met Leu Leu Glu 40 45 50

Phe Asp Leu Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala Gly Phe Leu Ala Ala 55 60 65

Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Ser Thr 7 0 75 80 85

He Lys Asn Trp lie Ala Asp Leu Asp Phe lie Leu Gin Asp Asn Asp 90 95 100

Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly Phe Trp Lys Ala Trp 105 110 115

Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys lie Lys Ser Ala Met Ser 120 125 130

Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly 135 140 145

Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg Asn Asp Gly Tyr Ser χ5〇 155 160 165

Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu 170 175 180 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公楚）-31 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

565610 A7 B7 五、發明説明辟）

H u 1 G a •—I A

A u e L s i H

e 5 p 18 s II A

Thr Ser Gin Gly Ser Gly Ala Asn Phe Pro Val Thr 190 195 He Val Pro Arg Val Pro Pro Met Asp Phe Gly Phe 205 210

Ser Gin Pro Ser Pro Glu Tyr Trp lie Thr Ser Gly Thr Gly ,Ala Ser 215 220 225 Val Thr Ala Ser Asp lie Glu Leu lie Glu Gly lie Asn Ser Thr Ala 230 235 240 245 Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Asp Val Leu Ala His Leu Trp Tyr 250 255 260

Phe Phe Ala lie Ser Glu Cys Leu Leu 265 270 (2) 序列編號三號序列的資料： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ⑴ 序列特徵： (A) 長度： 42 驗基 (B) 形式：核甘酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學 : 線性 (ii) 分子形式：基因組DNA (ni) 假設：姐 j \ \\ (iv) 相對序列：紐 j\\\ (xi) 序列編號三號序列如後 GGAATTCACC TGCTAACCAT GTTCTCTGGA CGGTTTGGAG TG 42 (2) 序列編號四號序列的資料：(i) 序列特徵：(A) 長度：34鹼基訂

J 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） 565610 A7 B7 五、發明説明N ) (B) 形式：核苷酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學 : 線性 (11) 分子形式·· 基因組DNA (ill) 假設 : Μ j\\\ (IV) 相對序列： Μ j \ \\ (XI) 序列編號四號序列如後 CGGGATCCAA GCTATAGCAG ACACTCTGAA ATTG 34 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-33 -

Claims

公告 Α8 Β8 C8 D8 六、申請專利範圍：Ι?ίίίφ2: 第87 1.1 1 741號專利申請案中文申請專利範圍無劃線替換本民國92年5月1日修正〖.一種用於蔬菜油脫膠或充作烘焙輔助劑之組成物，其包含具有磷脂酶活性和SEQ ID NO : 2所示之胺基酸序列.之曲霉屬（Aspergillus )成熟溶血磷脂酶，其特徴在於該胺基酸序列係於位置 44與45間之部位被切割，且所生成之2個酶切片段係可選擇地以至少一個在還原狀態下可被切斷之鍵結相連接或該2個未連接之酶切片段之至少1個具有磷脂酶活性。請先閲讀背面之注 I 旁經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Met Phe -2 7 Cys. Ala -10 Thr Leu Cys Ser Asp Ala Phe Asp 55 Asp Asn 70 lie Lys As p Leu Ser Gly Arg Phe -25 Ala Ala Pro Thr Asp Glu Leu Gin 10 Asn Asn lie Asp 25 Cys Pro Ser Val 40 Leu Thr Asn Asn Thr Asn Lys Arg 75 Asn Trp lie Ala 90 Cys Thr Gly Cys 105 Gly Val Leu Leu Thr Ala Leu Ala Ala Leu -20 -15 · Pro Leu Asp Val Arg Ser Val Ser Thr Ser -5 1 5 Leu Phe Ser Gin Trp Ser Ala Ala Ala Tyr 15 20 Ser Asp Asp Ser Asn Val Thr Cys Thr Ala 30 35 Glu Glu Ala Ser Thr Lys Met Leu Leu Glu 45 ^ 50 Phe Gly Gly Thr Ala Gly Phe Leu Ala Ala 60 65 Leu Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Ser Thr 80 85 Asp Leu Asp Phe lie Leu' Gin Asp Asn Asd 95 100 ^ Lys Val His Thr Gly Phe Trp Lys Ala Trp 110 115 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4此格（210X297公釐） 565610 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys lie Lys Ser Ala Met Ser ^ 12〇 125 130 Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly 135 140 145 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg Asn Asp Gly Tyr Ser 150 155 160 165 Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu 170 175 180 鬌 Ala Glu His lie Thr Ser Gin Gly Ser Gly Ala Asn Phe Pro Val Thr 185 190 195 His Leu Asn Asp lie Val Pro Arg Val Pro Pro Met Asp Phe Gly Phe 200 205 210 Ser Gin Pro Ser Pro Glu Tyr Trp lie Thr Ser Gly Thr Gly ,Ala Ser 215 220 225 Val Thr Ala Ser Asp lie Glu Leu lie Glu Gly lie Asn Ser Thr Ala 230 235 240 245 Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Asp Val Leu Ala His Leu Trp Tyr 250 255 260 Phe Phe Ala lie Ser Glu Cys Leu Leu 265 270 教 2 ·如申請專利範圍第1項之組成物，其特徵在於該具有磷脂酶活性之序列係與曲霉屬溶血磷脂酶之相似序列具有至少80%之同質性。經濟部智慧財^i局員工消費合作社印製 3 ·如申請專利範圍第1或2項之組成物，其特徵在於該曲霉屬溶血磷脂酶之成熟序列係臭曲霉（Aspergillus foetidus )溶血磷脂酶之成熟序列。· | 4. 如申請專利範圍第1或2項之組成物，其特徵在於該序列可分離自曲霉屬之培養物。 5. 如申請專利範圍第4項之組成物，其特徵在於該序列可分離自臭曲霉（A. foetidus)、黑曲霉（A. niger)或米曲本紙張尺度逋用中國國家橾準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -2- 565610 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍霉（A. oryzae)之培養物。 6. —種產製申請專利範圍第1項所描述之具有磷脂酶活性之曲霉屬成熟溶血磷脂酶的方法，其係藉由於適當培養基中醱酵能產製溶血磷脂酶之曲霉屬轉形株，該轉形株含有編碼SEQ ID NO : 2之胺基酸序列的DNA片段，及自不含有細胞之培養基濾液中分離該溶血磷脂酶，其特徵在於在pH値爲2至9之間進行醱酵。 7. 如申請專利範圍第6項之方法，其特徵在於利用臭曲霉或米曲霉以充作轉型宿主。’ 8·如申請專利範圍第6項之方法，其特徵在於在pH値爲3至8之間進行醱酵。 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） -3 -