PT89050B

PT89050B - Meios e metodo para intensificar a hibridacao de acidos nucleicos

Info

Publication number: PT89050B
Application number: PT89050A
Authority: PT
Inventors: James John Hogan; Curt Lawrence Milliman
Original assignee: Ml Tecnology Ventures Lp
Priority date: 1987-11-24
Filing date: 1988-11-22
Publication date: 1993-03-31
Also published as: DE3850055D1; EP0318245B1; KR960015893B1; ATE106947T1; JPH02502250A; CA1319336C; EP0318245A3; FI893526A0; JP2820749B2; DE3850055T2; ES2056115T3; US5030557A; WO1989004876A1; FI893526A; KR890701768A; EP0318245A2; PT89050A

Description

A Iigaçêo ds uma sonda ds ácido nuclaico co® a sua sspuenc xs complementar nuas ácido nucleico alvo de cadeia simples s electuioa pala estrutura sscundãria e terciária do ácido alva, a velocidade e a extensão da hibridação oa sorda ··-.-. o ·'.·.·;· nucleico alvo pooe ser aumsntaoa lediante a utilização 01iponucIsoçioeos auxiliares. Os oiigonucleotídeos auxilis- „·.· nslaccionaoos para ligar o ácido nucleico alvo e impor uen sscrutura sscunosri?. e terciária diferenc-e sobre o alvo, a ·· iscilitar a ligação oa sonda ao alvo. 0 niovido resultante o?. oonoa e oo acido nucleico alvo revela tamoèm um f superior ao ndanoo pus resulta oa adição oa sonda sõzinna.

ύ presente invento refere-se a métodos para intensificar o nioridação entre um polinucleotideo © us mui ti mero ds ι;u<1eotídeos complementar de uma sequência de nucleotideos no oe um polinucleotídso. Um outro aspecto do presente invento ?síers-3e a ensaios de diagnóstico e a processos terapêuticos ·.· pue se usam sondas de ácido nucleico.

A hiõrid-açâo do ácido nucleico, a formação de uma tscsiu dupla de ácxoos nucleicos através da formação de ligações ou miorogênío entre as cadeias complementares de ácidos nucleicos a um fanc-KiSno oem conhecido que está a ter uma aplicação cada ves •caior. ro? exemplo, a hiori cia ção & o fenómeno base dos chamados ensaios de sonda genética. Assim, um ensaio destinado a confirmar a presença numa amostra adequadamente preparada de um . .o oo nucleico com significado de diagnóstico poderá ser construído em redor de um ácido nucleico, geralmente um oligonucleovídeo ioligõmero) os sequência conhecida <a sonda), que seja complementar de uma sequência de nucleotideos no interior do <;: nuc .;.·;·.· co a .. vo .

ver, por exemplo, a patente americana

A formação de um híbrido entre a sonda e o acido nucleico alvo, geraúmente detectada através os um rótulo adequado iis^Gv a sonda, após a separação da sonos nao ligada, é tomada co® confirmação de que a sequência complementar se encontra pruse-íts no ácioo nucleico da amostra. A presença desta sequência, se devioament© seleccxonada, permite que se façam inferências com significado oe diagnóstico. Por exemplo, se a sequência ompiementar έ·. sonda % unics para um género ou espécie os bscfce'../ - - provoca o-·;·„;

V^V : :';· CSi'fÍrí;3GS £& a -- :-. .--.:--1 ·.·.· CiUSOííC 1 £ ds:

doença, a presença do género oo espécie na formação do híbrido é detectada. Por formação do híbrido permite inferir

n.iÇAiivaoente, isto è, que a amostra nao contém o organismo (ou ori^ni ^mos) supeitoísl, pelo menos dentro dos limites de detecção oo ensaio. Este ensaio pode ser usado com outra sintomatologia -o-r o oiagnosticar a doença é causada pelo organismo detecta·.··.. -/-7: ensaio semelnance poderá revelar

- presença nos alimentos destinados a consumo humano. usando vécnicas similares, as sonoas ds ácido nucleico podem ser sbippsgcuas para detectar nao apenas bactérias, mas também fungos, virus, oncogenss ou protooncogenes, genes associados a uma v--iledaoe rir. doenças genéticas, e outros, causadores de doenças.

roi tsmoém proposto gue se usassem as sondas de ácido co terapeuf-i camente. Por exemplo, se uma célula está ’paragem cs nibr idaçáo’'. A sonda um derivado de iníectaoa por um virus, a sonda é introouzida na célula que e corpo emeovar oe pelo menos uma porção ds RNA mensageiro ímRhA) cocoficaoo paio virus ou do seu ácido nucleico genómico, a o- sonda ao ácioo nucleico virai alvo irá impedir a sua <-.·ou .... rj.sçoo poios riec/ssomas cs ceiuxa, evi canoo -co a replicação oo virus. Este fenómeno ds hibridsçâo da . · · . : ,07::: 0:70:-: O ,..:OS X g ::-00.0 pvP •^; · '.· .· C S::; gUS Sfe USO C O:::O .--o-·-:-..:· c-; meti.-.o oo õuA e descrita na patente americana ·:.-.-·.· o. . A util.íxação de técnicas os paragem ds hibrioaçao : o-a,. , a çransiaçáo gs mRuA da di.....niorofolato reductase num

............ ç-_;_.....vitro coice ol igonuc leotí dsos anií-sensí veis, inciuino : .·:....·.ο os ssqusncias curtas os oíigonucleotidsos, e descrita por ?i5.r_:*r e outros nos Ar chi ves.....of Biochsm.and Siophys.,...... £53,

No caso as ss usarem sondas genéticas para detectar erg particular? organismos inf=c c iosos , tem constituíaté agora prática geral marcar o DNA a fim de ss identifiçarem os organismos gue interessam. Dado que o DMA já é de cadeia dupla, isto tornou necessário não só que se lisasse a célula para so lioertar o DNA, como também que se desnaturasse <fundisse) o DNA de cadeia dupla para se obter uma estrutura de caosua simples. Isto é executado tipicamente aquecendo o DNA de caooia dupla a uma temperatura a que a estrutura duplex se separa completamente. A temperatura a que este fenómeno ocorre na solução pooe variar. A Τ,_Λ de um duplex C a temperatura a que SOM das cadeias de DNA se separaram) é aumentada, aumentando a força iõmcs oa solução e diminuindo a presença de reagentes tais como a formamida que desestaoi1ixa as ligações de hidrogénio.

Após a desnaturação, o DNA é fixado tipicamente a uma superfície sõlioa tal como a nitroceluioss, a fim de se impedir a ref o; marao ds estrutura binaria do OnA (rsnaturaçao) por hibrida™ çao oas rudeias separaoas. ver patente americana nS4.358.S3&.

_: fixação oo Dnâ a uma estrutura sólida evite s renatura··. -·η ela impde ss cinética heterogénea, com as desvantagens a ela inerentes, inclusivé uma taxa de hibridação muito mais lenta, nu sâeterna ot ensaio, A fixação do DNA a. uma superfície sólida voee tamoem fixar o DNA numa orientação que impeça a hibridação rcra ~ e .-· mbridaçáo estas limitações foi proposto que se numa solução, uma vez que a cinética da se/urão é h-víí-ci mais favorável do que a cinética heterogénea. Domo resutreoo disto», a bioridaçso completa-se numa solução muito mais aepressa oo que o faria caso o DNA dirigido ao alvo f ,.xaoo a uma superfície sólida.

.....se adicionando a sonda fosse

A hibridação na solução pode ao DNA desnaturado e

reestaoslecendo as condiçoes em que s formação duplex pode ocorrep. No caso de ss usar um excesso suficiente de sonda, eia pode competir eficazmente para sequência de nucleotídeos particular no ácido nucleico alvo a «?ue a sonda está dirigida, e s r ar· o o o

OdA presente na amostra que é complementar oesta

Punem evitar-se pelo menos alguns dos problemas asso-·· ciaQo-5 com a direcção ao alvo do DNA, usando o RnA como alvo. 0 PnA já é oe cadeia simples e, por esse motivo, a necessidade ds ovsnaturar a fixar ο DNA a uma fase sólida ou efectuar a hibridacão :.:o conca ções em que a sonda tenha de competir com o DNA do próprio organismo e eliminada. uo csso dos vírus, o mRNA pode r .· um alvo Dtil. No entanto, no caso dos pró- e dos eucariotss, prsYsre-àe dirigir ao alvo o RNA ribossómico CrRNA) uma vsz que caca caíUáa concem cerca as lu'~iv vezes os sitios aivo cs rRNA oo qy_S o DhA genómico. Assim, a marcação do rRNA, caso esteja oiaponívei como aivo, permite ensaios com uma muito maior sensi— ·· ·. ;· · C .

os métodos de ensaio em que se dirige ao alvo o DNA ratd .5.0?’ á -i''.

'· ;· a Λ -’í- i ?·--* í ;.'.ã

IS / . X :

; *-·.·.·.^; : i í í« .

hibridação em solução estão 1.215.S04 e no pedido de a divulgação cas quais e aqui des cri tos na pa ten te patente europeia n* incluída a título cs embora seja muito mais conveniente para o utente, a pranca oe ensaios com RNA ribossómico alvo apresenta proolemas. ãui coo vca.es, uma. sonoa candidata, que soo outros aspectos parecia loooi, faina, porque revela uma taxa os reacção muito lenta ou uma frses extensão da reacção, mesmo quando a hibridaçâo que

Por consequência, pode em certos casos necessário seleccionar para um ensaio uma sonda

comprometa a especxficidade a f irn de fornecer a cinética pretenoxoa. 7® outros casos, pode ser necessário sacrificar a sensifaixo-oo para se conss«?ui r um ensaio comerc ia imente viável devido â

I&iiUiitíO da cinética ou A reduzida extensão _: - ί o r x .:·:·.

da formação do

Têm sido feitas tentativas tendentes a acelerar a taxa de hitriosçào dos multimeros de nucÍeotídeos complementares. Entre slas conta-s© a adição à solução de hibridação de reagentes ,·,.· precipitam o acido nucleico, tal como foi descrito no pedido ue patente americano com o número 57.981, feito em 4 de Junho de .•.xo··' e escudo ao cessionário deste pedido cuja divulgação é aqui incluíoa a titulo de referência como se tivesse sido completaroen·ce osroonstrada no presente texto.

A utilização ds técnicas ds aceleração da taxa tal como fen oescrxto no pedido acima referido, não oferece, em cada um aos casos um aumento de taxa de hibridação que permita um desenvoivcmonvo optemo dos ensaios. Como consequência de tal, peraas-··. ·' ·.· iíocepóioooe o? se utilizar outros meios para intensificar a cxnetίca ds nibrxdação entre a sonoa e a sua sequência alvo que possam ser usaoos com, ou mesmo em lugar de, outras técnicas de aceleração da taxa os Hibridação entre muitímeros de nucíeotídeos

C O ·?;··.·. C;; ; Ç~ t S : ^:.-í S .

Depara-se, por vezes, com em outro problema na realização us ensaios be especifxcidade limitada, em particular quando o ensaio é dirigido a uma só espécie de um organismo num gene concendo especxes estreitamente relacionadas. A homologia oa sequência do DbA genómico © do ftNA ribossômico da espécie alvo © os seus parentes proximos é muito similar nestes casos e estes ácidos nucleicos contêm írequsnteroente combinações erradas de

aperías sus ou duas bases de nuc leotideos em sequências relativafj.vD;'; i\í;D X .

fom o advento dos sintstizadores do ácido nucleico, um forncf-.i—es possível conceber e sintetizar sondas que são complemúnfo perfeito, ou quáse perfeito, para uma sequência de a;.. oo ·;·.··„ p·.; v a 1 vo .

i; ·· nucleico alvo é função do número de nucleotídeos complemen·™

A Τ._Λ de um híbrido e do seu complemento no !!i faros gue estão envolvidos na formação do híbrido, isto s, â meoíof que o comprimento da sonda aumenta o mesmo sucede, ea regra. com a T ror esse motivo, a sonda tem de ser suficientemente longa para que se forme um híbrido estável á temperatura a n··:; se realiza o ensaio.

Hui tas possui a cst-a temperatura é seieccionada de forma a que a sxosnsào da nibrxoaçâo num espaço de tempo razoável seja suficiente para fornecer ao ensaio uma sensióiiidade adequada. vazas ussa sonoa suficientemente longa para tal permitir complementar i oaoo suficiente para com a sequência numa ou siais c/ápèciss estreitamente relacionadas permintindo que, durante o anzara, ocorra uma hibridação significativa com o ácido nucleico aa espécie estreitamente relacionada. £sta reactividade cruzada é geralmenfs devioa ao facto dos seus p&rfis de fusão se sobreporem. Isto pode reouzir a especlficidade do ensaio dando origem a

sr ia	ser
se a	f
	m
uma	vez
seu	par

•sxçmr, icstxvamente rsouzioa ou mesmo evitòaa, contuoo oas sonoas relativamente curtas pudesse ser aumentada, uma vez

...

cuferença oas T. entre um híbrido de uma sonda s o seu par perfeito e de um híbrido de uma sonda com um ácido nucleico tendo ume ou mais comoinações de nucleotídeos erradas é geralmente maior para uma sonoa curta em comparação com uma sonda mais longa pus tenha o mesmo número de combinações erradas. A sonda mais curta tom uma percentagem mais elevada de combinações erradas,

reiativamenta ao soo vizinho mais ppóxíso, do que a sonda mais ? ·-····.·. que pode resultar do facto dos seus perfis de fusão já não -ís sobreporem. Esta maior diferença nas T siqnifica que o m híbrido mal comomaoo pode ser compietamente dissociado enquanto a percentagem do hibrídacâo da sonda para o alvo se mantiver reactividade cruzada teria, como é

A rooucOo numa tal e . ..·.· / .

evjcsnto, como consequência reduzir ou eliminar resultados posivivos falsos com o consequente aumento da especificidade ao

Um ácido nucleico de cadeia simples , tal como o rftmA ou ο ueê oesnaiurado, provocou o aparecisento de uma estrutura cecuraâris ordenada a partir da formação intramolecular de iigsçàss os nidrogènio entre sequências de nucleotídeos complementares dentro oo próprio ácido nucleico de cadeia simples. ::-s-,aa sequências podes ser trazidas para uma situação de suficiente proximidade que permita a hibridação molecular por dobraisa ca caceia. 0 resultado será uma estrutura como a que ê epi-esentac-i na rig. í que é a ilustração oa estrutura secundária •o rd t 1SS eudactsrlano sm que os pontos” representam nucleotíasos ificávjiíuais e os traços representa® ligações de hidrogénio intramoieculares. dmoora a Fig. 1 o nao mostre, o rRhíA possui tomoem ume estrutura terciária que deriva do mesmo tipo de forças aá ac-racção que ordenam que o DNA duplex se confiqure na sua já iuem connecioe estrutura helicoidal.

Uma

·.·.- ' :í a neo m ί · ' íc açáo oo porção suosc-sncial desta estrutura secundaria ou se perde nas condicôes normalmente empresadas na ácido nucleico, por exemplo, temperatura elevada, os sai, presença tíe aceleradores e outras. Descobriu-se mu:·? esia estrutura residual pode inibir ester icamente, ou mesmo (ή****?, a for?ís-;Sv »ao híbrido entrs um muitímero de nucleotíp.··- um oligómero ONA ou -RNA que seja usado como sonda, e a sus sequência complementar no RhA ribossómico ou em ovtro ácido nucleico de cadeia simples tal como o mftNA ou o uNA

-η; -'· sonos considera alvo. Descobriu.....ss ainda que esta inibição pode ser redunda e mesmo eliminada, utilização de um oiigonucieotídeo auxiliar que se liga a uma porção do RNA ou ·.··':·’; d :·. feren te da sus esta sendo alvo da sonda e qus impõe uma nova estrutura secundária ou terciária na região alvo do ácido ·.· · le.í.co ·.··/: cadeia simples o que faz acelerar a taxa de ligaçao cs sonea. Assim, usando um oligonucleotídso auxiliar devidamente seleccionado, a taxa de hibridação entre a sonda e a sua sequência complementar no ácido nuclsico alvo pode ser substancialmente oumenuaoa e permitir mesmo que a hioridação ocorra a uma taxa e em conocçdas oe cario modo adequadas para um ensaio em que, sem ^:...n· o auxiliar, nenhuma hib^ídsçâo poderia ocorrer.

dsscooríu—se tsmosm que o uso do auxiliar pode elevar a do hirmibo bs uma sonos relativaments curta e do seu alvo :í’ p;‘dfencaoo no que se refere á T do híbrido da sonda e de uma m suqooncia os ácioos nucleicos em relação ã qual a sonda e menos complementar. Consequentemente, podem efectuar-se ensaios uma especíí 1 cídade melhorada para organismos que ocorrem em amolentes povoados por organismos estreitamente relacionados

Cons co uu-; assim, um oojectivo do invento facilitar a ligação entre um ácido nucieico bs cadeia simples dirigido a um alvo, que tem uma estrutura de ordem sufi cientemente superior r-e.a inioir a ligação da um multímero de nucleotídeos complemen™ uor ne uma sequência de nucleotídeos dentro do ácido nucieico -. · ·. x no ao a .·. vo .

Um outro odjectivo do presente invento é criar ensaios aperfçoados ws têm por alvo o RNA rioossômico ou outros ácidos nuc X-~icos, peio facto de proporcionares usa maior selecção de sonous tíe mui támeros de nucleotídeos com propriedades que sao

,.·...^, os ensaios.

Um outro odJec t ivo ioade dos ensaios que do invento é o ds intensificar a utilizam sondas de multímeros de nucieotá.dicos complementares ds sequências dentro do RNA dirigido ao alvo ou me outros ácidos nucieicos, acelerando a taxa ds η.··.ηνίdação entre a sonda e o alvo.

A realização deste e ds outros odjectivos será descrita na memória Descritiva detalhada do invento que a seguir se apresenta e em que se faz referência aos desenhos.

A rig

ã.·.—. r;. dossóm ico A rig fi/·>«-/ P .c L’C^r::d'::;.^:<Jí?? .*, »“ O da estrutura secundária do da estrutura secundária ê uma ilustração i6S eudacteriano.

s uma ilustração ioS eudacteriano mostrando as ligações de eonoe para a Salmonelia enteritidis e para dois oligonucleotlueou auxiliares de acordo com o invento.

A Fig. 3 ê uma ilustração oa estrurura secundária do uma oo

FnA rí.nassómico 16S eudacteriano mostrando os locais de ligação .· mu e oos oligonucleotídeos auxiliares . . . -·’οο com o invento.

para a Nelsserxa

-íê.......realj_^clo..£,r^eôtr„ioos sai como foram usados nesta memória, os termos a seguir unriGos foram definidos ou seguinte forma;

nk/£Â.32.LÁ-SÊ2J sudunidaoe de uís ácido nucleico constituída por .p grupo fosfato, um açúcar com S átomos de carbono e uma uu -e contendo azoto. No RNA o açúcar com S átomos ds carbono s a riboss. uo ÚNA e a 2-desoxi r ibose.

..... ......•.-ue leotideos; uma cadeia ds nucleotídeos ligaoa por ligações de diéster ds fósforo.

. ou ol igómero; um multímero ds nucleotídeos, ssralmente ds cerca de iiõ a cerca de xUU nucleotideos, mas que poosm ter 200 ou mais nucleotideos. Sao em psgra sintetizados a parcír os monómeros de nucleotideos por meios enzímáticos.

ds nuc 1 soí- í dsos, geral mente

..... po 1 ntic Isotídso; um multímero cerca oo 100 ou mais nucleotideos.

- - uma propriedaoe conferida pela sequência de os uma cadeia simples de ONA ou RNA que, com outra cadeia eu -.:: ou Rum, pode iorssar um híbrido de DNAíCmmA , RNA-RNA ou õ^AjRhA os cadeia dupla através da ligaçao ds hidrogénio entre parus ou oaues vlatson-Crick nas respectivas cadeias. A adenina U) cosvlssisnia geralmente a timina CT) ou o uraciio CU), enquanto, a goaíuna <S) complementa geralmente a citosina CC). Os pares os usoau nSo canónicos, por exemplo A;G ou G;U, podem também corne rir estaoilíoade s uma cadeia dupla.

, um multímero de nucleotideos com um,a os nucleotideos complementar ds uma sequência num ácido riuclsico dirigido a um alvo, em gerai um polinucleotídeo com um orunificaoo de diagnóstico ou terapêutico. £m regra, a sonda e su-.scc iunac-a para ser perfeitamente complementar da sequência aivo. Contuoo, em alguns casos, pode ser adequado ou mesmo osssjavel que um ou mais nucleotídeos na sonda nao sejam compíe.....

meneares da base correspondente na sequencia alvo. Uma sonda ds nucleotídeos é também geraímente um multímero menor do que o mui aímero que contém a sequência alvo. Ela será tipicamente um olígonucieotídeo, mas pode ser um polinucleotídeo,e, para fins do ensaio, ê qeralmente rotulada com um substituinte químico que psrsiiis a sus detecção, pop exeaplo, por técnicas radiométricas, cou,?rimétri css, f I uoromé tricas, quimio1uminascentes ou outras isenica-s adequadas. £m casos apropriados, a sonda pode ser um análogo da estrutura do éster ds fosfato do DNA ou RNA típico. Por sxe?spio, pode ter a estrutura principal de um alquilo ou fosfato, de um t io-Ξι to de fósforo ou de qualquer outra estrutura r nc í pa 1 mod í f i c ada .

ο ·. ϊ gonuc 2eotí deo________auxi 1 lar; usí muit£mero de nucleotideos, fr~r-?i?!2nte não superior e -50 nucleotideos, que liga o ácido nucleico oirígido ao alvo sem se soorspor suóstancialmente a ····..···> H saoa por um sonos de nucleotideos s que intensifica a < 3. ae c a à* hibrioação entre a sonda e a sequência no interior do acudo nucleico alvo ds que é complementar e/ou que aumenta a T m

o;· tibndo entre a sonda e a sequência complementar. Como já foi auolindado no Sumário do Invento, descobriu-se que a ligação encre a sonoa os nucleotideos e a sequência de que é complementar encontrada nua ácido nucleico alvo pode ser intensifiçada pelo ds -η; oligonucleotídeo auxiliar no sentido os que a taxa e a extensão da hibrioação podem ser aumentadas. Em determinados casos em -a; a sonos nao assistida pode não revelar uma híbrida···· cáo sic-nsurável com o alvo, o uso de um oligonucleotídeo auxiliar permite que a sonda se ligue eficszmsnte com a sua sequência compAsmontar no interior do acido nucleico. Descobriu-se também

•.••o o uso de um oiigonucleotídeo auxiliar pode aumenta a T de um m híbrido formado pela sonda e peio ácido nucleico alvo. Consequer.temerite, quando aqui se faz referência à intensif icação da

IippcáO; isso significa que a taxa de hibridação e/ou a extensão oa ítioradução é aumentada e/ou que a 7' do híbrido resultante é m aumentada. Gomo se torna evidente através da discussão que se ísçve, estas oossrvaçôes têm uma aplicação prática significativa.

fai como também foi sublinhado no Sumário do Invento, o efeito oos oiigonuc1eotideos auxiliares soore a cinética da

- 13 -,. orζζίζ,-ζζό ϋ resultado da reordenação da estrutura secundária e —- ; .··.· ècrdo nucleico alvo de cadeia simples. Assim, o ,nve.éo a útil para melhorar a cinética da hibridação entre a

...·.·.·,. e um acioo nucleico seleccionado a partir do DMA ou do RNA.

si'·® pooe ser oe qualquer origsi», inciuinds, mas não se ϊ s-aaanoo a, DMA genómico oe células tais como microrganismos unicelulares ou organismos de formas superiores ds vida ou o nucleico de vírus. Do mesmo modo, o RNA alvo pode ser de q«siqw-s? orxgem incluindo, mas não se limitando ao que se .encontra e»?! células tais como o mRMA, rRNA ou tfiNA. Por consequência, em circunstancias apropríaoas, o ácido nucleico alvo pode ser associado com um vírus, uma célula de um tumor, uma célula que evcoencxé uma doença genética, ou um organismo causador de doença .

A sonda e tipicamente um muitímero de nucleótidos relativamente curto, quer de RNA, quer de DMA, preferindo-se o último devido à dificuldads de proteger as sondas de RNA da degradação através de ensimas altamente estáveis e eficientes que uecompõem o RuA. As sondas podem também ser análogos da estrutura os diéster de fosfato do DMA ou do RMA nas suas formas usuais, dor exemplo, em certas aplicações tais como processos de paragem os O3.brcoação, a sonda pode ser um análogo de fosfonato ds metilo como foi descrito na patente americana nS4.511.713, ou de fosfonafos ds alquilo ou de arilo descritos na patente americana nii 4.507.433 e na patente americana n24.459.353, ou um análogo -..o, coosio oe fósforo tal como foi descrito por natsakura e outros, Phosphorotnioate Anaiogs of 01 igodeoxynucleotidesi Innioí cors of Repl ícacion and Cytopathíc Effects of Human

Ãmmunousficieney vírus <R1V>, ^;!PHAN, Cs ggp imprimido).

r«:O presente invento, prefere-se correntemente o uso de áoncíá oe oligonucleoideos que têm geralmente um comprimento de cerca es iO a cs?cs de SO nucleotideos e, de preferência, cerca a· lò a cerca de 40 nucleotideos. Estas sondas são convenientemanca oo^-ioas usando us sintetizador de DNA e são, em regra, criadas psra serem perfei temente complementeres de uma sequência ·'.··. η·'· iaofídeos dentro do ãcido nucleico alvo. No entanto, uma comoinação perfeita de nucleotideos nem sempre é necessária e, em cercos casos, podem obter-se vantagens por se introduzir deliberâúSKi&ate pares de bases não canónicas ou combinações erradas.

Geralmente a sonda ê seleccionada para ligar uma região dençro do ácido nucleico alvo de forma a minimizar a reacção cruxaoa com um ácido nucleico cuja hibridação com a sonda seria indesejável. Por outras palavras, a sonda é seleccionada para ligar o ácido nucleico alvo numa região em qus um ácido nucleico estreitemente relacionado tenha a menor homologia. Por exemplo, no caso cs uma sonda a ser usada num ensaio de diagnóstico para u«s eepecie ou para um grupo de organismos, a sonda é s&leccionaoa para ligar o DdA ao SNA associado com o organismo ou com os organismos escolhidos, numa região que revela a maior divergência awiuiiva do parente filogenético «ais próximo susceptível de ·'··-:· coneaminar uma amostra contendo o organismo ou organismos i^;ã i. d'-O .

oligonucleotxdeo auxiliar é seleccionado para ligar o acido nucleico alvo numa região que afscta a cinética da hibrida··• ··.· entre a sonda ou o ácido nucleico alvo, aumentando a taxa de hi ·.. r u:r·· ··;: áo s a extensão da ligação e/ou aumentando a T do m

híbrido resultante. Em certos casos, o oligonucleotídeo auxiliar pooe ser seleccionado para ligar uma região no ácido nucleico alvo qus s imsdiatsments adjacente á que ê ligada pela sonda. Nem caso destes pode tolerar-se uma sobreposição limitada entre a região reconhecida pelo auxiliar s a reconhecida pela sonda, mas tal não e desejável. Noutros casos, o auxiliar pode revelar o sisi to desejado isuiw embora ligue uma região afastada da que é i í. P5í5s pí.?.;. a a w ::·.:··.< .

Tal como ss sondas, os oligonucleotideos auxiliares pooem sor ca DiMA ou de RNA , sendo preferido o DNA pelas razões ύ \ :.?···· codas. Os oligonucleotideos auxiliares podem também ser s.ráiegcã dos d i ésteres de fosfato tais como os f os fonatos de alquilo ou de arilo e dos tioatos de fósforo previamente meneioOs oligonucleotideos auxiliares sao também convenientemente obtidos por meios sintéticos e situam-se geralmente dentro ·...·.· gama ·.·? cerca de 10 a cerca de 100 nucleotideos. Os auxiliares preferidos tém cerca de 20 a cerca de SO nucleotídeos visto os auxiliares mais longos serem difíceis de sintetizar e menos efcozes na obtenção oos efeitos desejados. A sonda auxiliar nao precisa de ser concebida de forma a ter uma sequência ds nucleotídeos oue nao seja complementar de um ácido nucleico não alvo, vez que a capacidade ds discriminar entre ácido nucleico alvo e não alvo é função da sonda. Contudo, se a região a que se liga ο oligonucleotídeo auxiliar também revela uma homologia não pçrfsita de sequencia com o ãcido nucleico não alvo estreitamente relacionado, o auxiliar pode intensificar a discriminação entre alvo s nao alvo.

A hibridação da sonda com o ácido nucleico pode efectuar.....ss sm condiçoes em que a concentração da sonda e a do alvo

*.··..·.> mesmas, ou num excesso as sonda ou de alvo. Quando a sonoa è usada em excesso, ela ê tipicamente usada numa concentraçao mo λ ar que é pelo menos cerca de 5 a cerca de 20 vezes mais a dn·· gerai: o oligonucleotídeo auxiliar ê usado em uxcesuo guar-uo comparado com a sonda. Quando a sonda e usada em íxc-iso ^-eiati vamente ao ãcido nucleico alvo, o oligonucleotídeo síAxidâr ê usaoo tipicamente numa concentração molar de pelo menon cerca de 5 vexes a da sonda , até a uma concentração molar ••;ue é cft-rcs oe 100 ou mais vezes a da sonda. Quando o alvo esta em excesso relativamente â sonda, o oligonucleotídeo é usado ii?i camente numa concentração molar cie pelo menos cerca de 10 ve£ôá a oo alvo atê uma concentração que è cerca de 100 ou mais ··.·. oo a i vo .

através da utilização de um oligonucleotídeo auxiliar i-oraxí.....se possível aumentar a taxa de hibridação de uma sonda co» um scido nucleico cerca de 100 vexes, ou mesmo mais. Foi também f-^;Λ V ··“· uÍÍ.ííí ^:: í P <v.

i,<o· PcdiÇPf;

·.· ^: nu·. i s λ c o a i vo .

:::: : λ· ~ .i. t-G'S GOS ;

extensão da hibridação qualquer que seja a e ds elevar a T do híbrido da sonda e do

Os Exemplos que se seguem demonstram os rúhm 1SS da SalmonelIa revela uma estrutura heiicoi~ dal, dé cadesa interna fechada típica, na região 430-500 do rftiMA ido. -.··. uonoa para esta região foi construída usando um sinteti2sty? ue dem com a seguinte sequência de nucleotídeos:

5’ - fGCGST IAT ΪAACCACAACACC F i-3 * ús testes para a Sa1moneIIa enteritidis foram feitos usaneio este sonda e sem ol igonuc leotídeos auxiliares selscc iona™· dos a partir da seguinte sequência:

:·υ,'χ ί 1 i a r fu

5¹-CCTCCCCSCTSAAAQ1ACTTTAC-3'

rr,-;xχ χ xa? S · 3' -GG FGCTTC FTCTGCGQG FAACGTCAATGAG—3^!

G syxilisr- A e o auxiliar &: foram ssisccionsdos para liga? so rRWA da Sa 1 aons 11a nas regiões xmediatamente adjacentes •à aoncs tal como se mostra na Fig. 2, ligando o auxiliar A aproximadamente na região 430--4S0 e o auxiliar B aproximadamente ?· . ragião 4SO—S1O.

nas

Ga ensaios foram executados nas A sonda marcada na extremidade seguintes condições;

combinada foi com = 1 microgramas de rRívA alvo num excesso de alvo. A hibridação efectuou-se a 5o^sC em 100 microlitros de um tampao de fosfato d® uudio 0,4Gri contendo sulfato dodeeil© de sódio a 0,S%, ImM BOTA e .mo Fúfé. uuando ss usou o auxiliar, a concentração molar do à«xiíiâi· foi 100 vexes a da sonda. Guando se usara® dois auxiliares, cana um tinha uma concentração molar que era 100 vezes a da sonoa. A sonas. de hxorxdação foi separada da sonda não ruorionua usanoo nioroxxspstite, tal como se encontra descrito na Pâíank ranadianã n2i.2iô.S04 © os híbridos medidos quantitativamnnce por contagem por cintilação.

Λυχϋνο 1 aoaixo apresentado mostra a percentagem de h^orxnação da sonda com o rRhA da Salmonella entaritidis ©©tida nas conoxçdss do ensaio, usando a sonda sozinha ou, quer com o auxiliar A, gusr com o auxiliar B, ou com ambos em conjunto.

Ο .....

% Híbridos	encontrados
• > -z:.noa	Kibridação durante„6 sún.. 1,23	Hibridação noite 1,83
•-'•o ;ce. · :.··;·· í .· e. · ;U	26,33	88,83
Bonoa/Auxi 13.ar 8	81,83	88,03
bonuozf-u;;· ι xarss m e 8	Z '<-· j íz> X·	83,13

Gs resultados apresentados no Quadro Σ demonstram o efeito dramático na hibridação da sonda com um ácido nucieico alvo mus pooe ss? ootida usando um oligonucieotídeo auxiliar. £m cuoa oo doo cavos foi obtida uma hibridação quãss significstiva qtsfiQo os suxiiis?s3 foram usados em condições em que ss observou -··:-./·· ;· 3 do hiorioação tía sonda na ausência d® um auxiliar.

As T dos níbridos que resultaram da hibridação da m cos; í la. enteritidis com e sem um oligonucIeotídeo auxiliar iorom aambôm determinadas num tampão de fosfato 0,12M, . n, <· .^;,ui:3 ds sulfato dodecílo de sódio e ImM EuTA e imrí E6TA

A T ou sonda sozinha foi de S9^eC. Comparativamente, a T m m com o Auxiliar A foi de 63_;8^&C e com o Auxiliar B de 83°C.

A Meisseria revela íguala-snie estruturas helicoidais de caseia inièrns fecnada no ribossoma 168. Encontraram-se exemplos nus regxdss 130 ISO, u30 430 s 880-1010. A sonda para a regi«ao

130 130 foj sintetizada usando um sintetizador de DNA com a ssíãántó sequência ce nucleotídeosί ô¹ 'CCGC rACCCGGTACG f TC—3 ‘ i··· itsrâíírrc ⁵ · O. CO·;: O 3i“Í!!;

oas seguintes testes para a Neisseria gonorrhea usando oligonucleotideos auxiliares ss 1 ec c. i onados; a seguências;

. A :· ι Π a r C: AU -CCATATSTTACTCACCC3TTCeCCACTCSCC-3¹Auxiiisr 0; 5’-CCCC7GCTTTCCCTCTCTA3ACQTAF6CG6TATTA6CTSATCTTTCe-3 ·'

Auxi1i ar Ê; 5’-6GCC7 TTACCCCSCCAACCAGCTAATCAGATATceeccscTC-su auxiliar C foi seleccionado para ligar ao γχ·μΑ da r·., r ·7· i a na região :Lmed ia temente ad jacente s sonda, tal como foi mostraoo na rig. Iii, n« regi Mo centrada a cerca de 110. ús auxiliares ú e £ fora!;· seleccionados para ligar em regiões do afasc-aoas cas iigaoas peia sonda, tal como tamoêm se pode n... --19. I Π . 0 auxiliar D está cen-srado a cerca de ISO e o auxi is.sr d ά cerca oe 250.

Os ensaios foram efectuados nas eessas condições das do dxemplo i, inciuinoo as mesmas rasões molares do auxiliar (ou «uxilisresi para a sonda, exceptuando o facto de gue a hibridação se erectuou a õO^cC. As T dos híbridos foram também obtidas tal m •,·.·-· no cxcíRPiο I.

úuaoco llft s seguir sprsssntstieo mostra a percentagem oe monoação os sonos com o rRNA os heisseris gonorrhea nas condicdas do ensaio, usando a sonda sozinns e com cada um dos .···-..1íares ou com combinações tios auxiliares.

.......:_;.dd.

	% Híbridos...	encontrados
Hibridação durante	Hibridação durante
		12..min.	a noite Tm
‘Z. Π:*»·.«		17	87	82,4^SC
Sonca/Auxi 1 iar C		1 tS Ά	757	SS,3^SC
·..·· s-.s.·· ftux.;. liar 0		77	857	S3,4^CC
O / íSUX ' ã		77	227	83,0^sC
ι·- .·;/ρ/'llu?:; i I lares	CZO/F	22%	857	88,0^0
-ri/ í-i^.ϊ i, 7,Ciií‘Z		227	777	S5,5°C
·.:··· ·.·'·.·' Auxi 1 iares	C/D	217	857	65,7°C
oenoa/Auxi I xares	Dz E	87	827	S3,3°C

As sondas s os oligonucleotídaos auxiliares foram também sintetizados para a região 480-480 e para a região 55ό-··· 1010. Os ensaios foram efectuados a SO^C e as temperaturas usvs?minadas tal como no Exemplo i. As localizações das ligações ···..· sono-as e dos auxiliares são apresentados na Fig. ΙΠ. Os repulsados são apresent ados, r espec ti vamente, nas Fig. 118 e HC.

: c::' ».ζ .:. Ο áeaqenrg	Xtílbr i desencontrados
Hibridação durante IX min.„	Hibridaçâo durante
âU2Sl.ts	Ϊ&
SOOOO S Π-ΊΟ ·. To A fC-GõCCâCCGA i'A ÍTGGC )	0,8%	10%	52 ; 8 ^s C
So vι ·.., o / õu x i 1 i o r r < AACGGCCTTTTCÍTCCC Γ6Α- .····:! ·: 0 ff OO ? - ! AokAOCoG 1		es,
OO; ·Οθ/όί.ίχ;Π XOr β GGCACG CG í TAGCCGS FGC ΓT™ í ·?* í '0 = ? ..--.-00 ? ACCtá ?	1	·”« </	»“*» f . h ί I
-··--· a- ·./ OOX ί Ϊ . <.·.; rí CGTCT íGCA ÍG CS ÍAAASC T'f- SoOGOOhoCG”í 1 oAATCTGAGCC)		10%
dcOúS / HUX1-2 3 -¹ es P /tí/H	A Λ Λ*	t···	59,5%°C
Sonbo/Auxi l i,aras F/S	Ο ·Λ	Λ'	S9,S%^SC

CA.....CCCCCÃiD.C.ÍS..i

- ·^;·- ··.-·· .' :·. no··;

'. .. · Ã-i í CCCCACA '37CAAAA-; .· já;·?;' o O í ( ·-·· ·; TC ί TCCCQ FTGCATCG· . . . . : ?;· -: ; ν.-:”:C.-;-: : : Ο U ί-: V-L-V5 L· X

Ão:.·s / Aux x Ϊ í a r J ι oC - ; õ í fACGGC fCCCQAAãG~ ÃAC · ãã ί Cotí Ci CCú)

Coroa/Auxx1ísp Z/J oonao/Auxi 1 iar ;<

i. OVí-iCQl STõAÃâCCCTGQTCâTAA'·· ooGCCA · CAQSAC ί í CACC; CA — CooCACCTTCC)

Sonoa/Auxi 1 xares ϊ/J/K

Hibriçtosen^«ntrados
Hibridação	Hibridação
durante	durante
X2.jMru.	s..„.Oihfe	Tm
7%	63%	S9,2⁵C


**7 Ύ		61 .'? ® C:


i ».-»/·*
	_ ...
		ϊ_ ·,^ί j—J V f ·

Oo rssuit-sdos dos Quadros IIA, S s 0 confirmam mais uma vês: o afeito da utilização de ol igonuc leotideos auxiliares na '- ·/ · ·. - oxdridaçso com um ácido nucleico alvo, incluindo o -io:· dos oligonucleotideos auxiliares que ligam numa região assaca da regiáo ligada pela sonda. A capacidade dos oiigonucleox.íneos auxiliares de aumenta a T do híbrido da sonda s do hi do e Lífr-a vsz conf ir-nadêi.

....

Sinete ti sou-se um alvo de muitímero os DNA com 30 vHicáífes usando u» sintetizador de DNA com a seguinte sequência ííU'. iGUViOxuS :'

5^!-TTCSSSjGTAAASYACTTTCAeCSSGÕAfíAuxi1iar Res x ao A

G ίAAGGGAG FAAãG ΓYrAYACCTYTG j CTCAT Região Sonda

TGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCJQSCTA-3’

Auxiliar Região S

A sequência os DNA foi sintetizada de modo a ter uma ssuianciã de base de nucleotideos correspondendo à regiãao 450 do RNA rifoossõmico Í6S da E. região designada como região da c en o·;·.:· cerca do nuc leoti deo coli. A sonda complementar da sonua foi sintetizada ds modo a ter a seguinte sequência:

5'-CAAAGG FATTAACFTTACTCCCTT-3'

Erectuaram se ensaios usando o DNA 30-mer e a sonda com © sem os auxiliares A e S. A titulo comparativo efectuaram-se ensaios similares usando como alvo o rENA da E. Coli. As regiões reconnecxoas por esses auxiliares na Salmonella são conservadas no rionsuoma da £. Coli. õs ensaios foram efectuados tal como no Exemplo x, xx-zsplx que a razão molar de cada auxiliar para a

-u fo:. oe xSu para 1 .

-;onua :

A percentagem os hxoridacão ooservaoa nos ensaios entre o rRnA da G. Coli e o OhA 30.....mer sozinho ou com o cr A e D sao apresentados no õuadro III.

ί

Hibridação durante a noite e

a.a.	«ã*â®nte híèrÍSPS_ençoi^trad»os
Cont ittrço i ..:.···;	Sonda sozinha	0, S%
. dO λ .·. r Udo	Sonda sozinha	1,5%
d. Coli rada	Sonda/auxi1iares A/S	85%
c. do /χ··ο?	•”^r Ο Γ: _.i ‘Xí «Xi “£ X }*» f > «&	2,85%
oô drc?7^?·	Sonda/auxiliares A/8	87%

£stsâ resultados demonstram que os oligonucleotídeos aux-, liares tamoem melhoram a cinética da hibridação çom um alvo òúá. Obtiveram.....se resultados semelhantes a 37 °C, a temperatura uo >xo‘go humano, demonstrando que a hibridação da sonda num ãcioo nutiaico e obtida em condições que permitiriam in vivo aplicações oos ο I igonuc leotíç?eos auxiliares sm, por exemplo, processos de í u vdód;:; '.dd?,· ! : λ ί * X .

A sonorreia é uma das infecçôes mais frequentemente rxçiáasoss nos âs-iso3S Unidos, sendo registados anual men te mais ·· ooas -t ir-des de casos. Esta doença sexualmente transmitida resulta geralmente numa uretrite anterior, nos homens, e implica a infecçao du cervjx , nas mulheress. Enquanto se verificam complicações graves ® mesmo esterilidade nos indivíduos não tratados_s as infec çoes assintomáticas sâ'o comuns e dao origem a portadores qu®, sem o sêoer, disseminam a doença.

^r.„ ··,.·· w

agente causador, a Neisserxa gonorrheae, e um dxplo• rsm negativo, positivo â oxidase com condições de cresciΠ νί*Ο5δ3 .

método usado para o diagnóstico depende do locai da infecção e dos sintomas do paciente. A uretrite gonocôcica nos homens é diagnosticada com uma boa sensividade e especificidade caso ss use marcação gram. Tem de efectuar-se, geralmente, uma cultura, que requere um período de 24-72 horas, para ss confirmar o dxgnóstxco ds gonorrexa sa todos os homens e mulheres sssintomaficos. A seguir a detecção do organismo a partir do seu crescimento na cultura, a Neisseria gonorrheae tem ds ssr identificada através de outros testes tais como degradação pslío hidratos ds carbono, co-aglutinacão, crivo de anticorpos fluorescentes ou ensaios de suostrato enzxmatxcos cromogénicos.

A íMeisseria sonorrfteae é par ti cularaente difícil de sutsctar .,· distinguir usando uma sonca ds acido nucleico visto esia? es»?eii-amence relacionada com a u menxngitidis. Os dados pu-:o. i canos por Kingsoury, O.f., J. Sacterioi. 34:870-374 <1967>

•'ax-eia uma homologia OhAiONA para as ouas espécies de aproximadamenu- SO.....tda. de acordo com as instruções emitidas pela Comissão to i-;o_C acare a harmonização das Propostas à Sistematização

Bocterxana, Int,.............J_._________System. Bacteriol . , 37,= 463-464 (1337), a ueilniçao filogénica das espécies significa, em regra, uma nusoiogui OhA ; õoA oe 707 ou superior. Apesar do facto destes organismos poderem ser considerados como pertencendo à mesma especis ao aorxgo dos princípios estaõelecidos, concebeu-se um ensaio capaz de os distinguir usando olxsonucleotídeos auxilia?.r;:sí .

Tal como se esperava, a homologia do rRNA entre a N.

_ . é ainda maior do que a homologia oo uuh enrre estas espécies devido às regiões conservadas conhecíoãs. Ocoervou-se uma oxferença de 1,07« e de 1,17 entre as sequências ds rkkA 1 S e 233 da hk. Simnmgae e da hl·. DI^JJjSÍMz. -.·:.-. ver hogan e outros, pedido ds patente americana com o n£ C/-uCdêC. apresentado a 24 de Novembro ds 1987 e entitulada v-úiL-lei·: Híid Probss for Detection and/or yuantitation of Non-Virai Organisms, a divulgação oa qual e aqui incluída a título ds ·.·;··'·/·”.: is.

Criar uma sonda para a N. gonorrhsae foi complicado »tílc> fscto ae, em alguns locais em que a N. roeníngi tidis e a N.

. ¹ .·· outras espécies ds Neisseria eram semelhantes a u_.„ sonorrnsae. As poucas como inações erradas que existem ·:..··.· estas duas espécies são nas regiões mais variáveis , regide-g eue variam nao apenas entre as espécies, mas também ds ·.·,·.-· para estirpe. Apesar do facto de alguns acreditarem que aa espécies nao podiam ser de todo distinguidas, e de outros • andarem que o rENA era demasiado conservado para ser útil nas 5or;c,.3 da diagnóstico, Hogan e outros descreveram sondas capazes • · ddmêndar a k,. sonorrhsae da hk_ mêmnâitidis.

Taram caracterizadas as sequências que se seguem e oemonstrato qua eram especificas para a Neisser,ia gonorrhsas.

x .....se para termo de comparação com a sequência da N-gonorrhe-iè os vizinhos filogeneticamente mais próximos, isto é, Neisse- q .· · _ · . a, hk. cinerea, tk, & iáinaeila êlilSàs.·

1 .	CCS	CCC	CIA	ccc	ser	AC
7^:	CA	•Cd	GCC	scc	GA f	ATT	GGC
3.	CAfci	CAI'	TCC	6CA	CAT	QIC	AAA ACC AGG TA

A sequência 1, complementar do rRNA í&S na região ízo.....ϊά·ϋ, tem 17 oasss e uma T de óô^C.

m .··· segusnc

·.··?-1·-.·; mem 21 bases

A sequência 3,

-em ...2 oaoes í.-sííí-~’. T m

2.: complementar do rRh.A 133 na regiãao e uma T oe 63 * C. m complementar do rRhA na regi Sao 330-1015, de SZ-C.

Slntetizaram-se ol igonuc leotídeos complementares das soquanc !.·?.=> adjacentes ãs regiões da sonoa, misturaram-se eoa as • · · . .... usaram.....se no processo de hibridação.

A reactividade s a especificidade das sondas para a ·......... . foi demonstrada através de um ensaio de

Tri

....idas de ol igonuc: leotídeos foram iodadas com misturaoas com oligonucleotídeos não rotulados com seguinte sequência; S^CCC CTG CTT TCC CTC TCT AGA CGT ATG CSG Thí TAG CTÕ A TC TTT CG™3^J, 5'-GCC TTT TCT TCC CTG ACA AAA CTC CÍT '1 AC AAC CCS-3 ’ , 5' -GGC ACG TAS TTA GCC GGT GCT TAT TCT TCA GGT . ·, ót 2 s^j--âGT íct ice cgt rsc Are gaa τγα aíc cac aíc aíc cac

CoC.....3·', e com RuA purificado (excesso de sonda) em fosfato ds ac-o-.o 0,c3a= pH 6,3, sulfato tiodscilo de sddio (SOS) a O,Sã xncuoedes a 60^síC durante sonoa foi ds 60 para 1.

uma hora. A razão do auxiliar para Apôs incuoação, adieionaram-se 4 ml pieroxispafite, fosfato os sódio 0,12H, pH 6,3, SDS a 2%e e

a de a

mistura foi incuoaoa a SCTC durante 5 minutos, contrifugaoas e os supranadantes removidos.

As amostras foram Adxcionaram-se Sml go uma solução as lavagem (fosfato de sódio 0,12M, pH 6,3, SDS a 2m) e as amostras foram misturadas centrifugadas e os supranadan™· mos r^-movicos. A quantidade de radioactividade ligada à hidroximpmtite foi determinada num contador gama.

ί..?·..'. ·..'.· .

ΰ Quadro IV mostra que a sonda hibrida bem para o RNA oo CL... sonorrheae e náo hibritíixa para as outras espécies testa™

Hibridação da hfeiss&ria Oonorrheae Sondas ϊ-S para or ftNA da ftfeisseria e Kingel la

â.I£C l..ris.Jl.^.io._á_sonda

i ^;···;;../.. eri a cineres	23332 14S3S	0,03 0,04
ganor rneae	19424	43,4
í S C V- Í»; I c -a.	23370	0,07
muningitidís serogrupo A	13077	0,04
seii-gi t io is serosrupo 8	13030	0,04
·: .·'*. np._; fe j;. 5 serogrupo C	13102	0,04
mucoss	13636	0,07
,.·...· . ΐ ·. ... V'·.	14793	0, os

i

-Ρ ν

χ co a.-vo s o efeito oo aumento oa ? dos m dos modos de realização do invento auxiliares pooem ser utilizados em ensaios ,..-0 ou de RNA para dtectar o DNA ou o cJí/Odn ν Γ :í^;’S .

I

Os oligonucleoiídeos auxiliares sxampio, sm ensaios em que o DNA ê o alvo

As experiências atrás menncionadas demonstram a utiliosõe gos o·.igonucleoiídeos auxiliares no aumento da taxa e da extensão da formação dos híbridos entre a sonda e o ácido nucleihíbridos resultantes.

os oligonucleoiídeos que utilizam uma sonda RNA com interesse nas podem ser usados, por tal como se descreve na paronco americana n24,3S8.535. Neste ensaio o DNA é fixado a uma superfície sólida. No entanto, uma porção solúvel que não ê finano a fsss sólida? estende—se para o meio solvente contendo a .η.··ο nessa extensão, pode possuir ume estrutura secundária e terc iár ia isuai à de um écido nucleico de cadeia simples totalUO‘ : SO 1 UO j. Λ 1 ZAOO .

Os olϊgonucleoiídeos auxiliares podem também ser uti 1 :·. zados em ensaios em que o rRNA e o alvo, tal como o descreve a nanum-e canadiana nÊ I.21S.SÕ4 e o mRNA tal como o descreve o pedioo ce patente europeia n2 84300057.1. £stes ensaios baseiam.....· na · oocn.u on sonos nao hioridaoa usando uma fsss sólida que .-emove selectivamente o híbrido. d também possível usar os m xsonucj. eoí ictòos auxiliares em ensaios conduzidos num meio 'noncnénso tal como o descreve Arnold e outros no pedido de parente nh 053.382, apresentado em 22 de Setembro de 1387 e .nnjpuj Homogeneous rrotection Assay, a divulgação do qual é aqui induída a título de referência.

Nestes ensaios a sonda ppode ser rotulada com qualquer ·'·/.:,·.·.· anequado tal como um radionucleotídeo, por exemplo, Í2S_T, 32 . 3... ou outros. 0 rótulo pode sar uma enzima tal como a • ! í

PèPoxsússs do rábano ou a fosfatas© alcalina que catalisa a cor formando reacçao de um substrato adequado. 0 rótulo pode ser também uma fracção fluorométrics. Mas prefere-se sobretudo que o róculo seja um éster de acridinio tal como ss encontra descrito na parente inglesa n2 2.112.773 B e em Arnold © outros, supra.

Nestes ensaios podem usar-ss auxiliares simples ou duplos. 0 auxiliar é tipicamente adicionado num excesso molar substanciai em comparação com a quantidade de ácido nucleico presanre no ensaio, as modo a mais rapidamente se ligar ao ácido Cvtlsiçú alvo e inibir a hibridaçâo das cadeias intramoieculares, que xmpdem a estrutura secundária e terciária que iniba a hibri·.···.·.·o -ι.·. opara o aivo.

us próprios ensaios são efectuados tipicamente a uma iemperacura que ss encontra 4 a S°C abaixo da t do híbrido da m sonos aivo. Isto reduz a extensão da hibridação entre a sonda e o 3úm não aivo, reduzindo positivo falso.

assim a possibí1 idade ds um resultado

Uma vez que os oiigonuc1sot1deos auxiliares podem ser usados em processos para detectar um ácido nucleico aivo, o invento inclui também um estojo para usar nos ensaios deste tipo conrendo uma ou mais sondas e um ou mais oligonucleotídeos auxi ;inres como reagentes. Num estojo deste tipo a sonda poderá ser fornecida com um rótulo adequado tal como aqui se descreve, usfe estojo também pode incluir controlos negativos © positivos e normas para a ootsnçâo de resultados quantitativos.

Num outro modo de realização do invento os oligonucleotideos auxiHarss podem igualmente ser usados para intensificar a hibridação in______vivo ds uma sonda de um ácido nucleico tal como o meoA _nos processos de paragem de hibridação. Neste caso a rszúo s o auxiliar podem ser administrados a um paciente sob a forma uma mistura ou ssguencialments, sendo o auxiliar admr™ n-.ãfruoo em regra primeiro, a fim de estabelecer a estrutura que vaá permitir uma melhor ligação entre a sonda e o alvo, mais uma vez, paooííí utilizar-se -auxiliares múltiplos. Nestas aplicações in.......vivo prefere-se usar um análogo do DúA, tal como um fosfonato os oado que se saoe que tanto a sonda como o auxiliar sob a rur rr fosfonato de metilo e de outros análogos entram numa cêiidâ sais facilmente do que o ONA com a estrutura usual de diêster de fosfato. Neste caso, a sonda e os auxiliares podem ser aoministrados num veiculo farmacêutico adequado e numa quantidade que seja eficaz para causar a paragem da hibridação ou qualquer outro resultado que se deseje. A administração pode ser quer orai_; quer parentêrica.

que atrás se descreveu não constitui senão exemplos coá modos tís realização actualmente preferidos das utilizações que pooeu ser uadas aos oligonucleotideos auxiliares do presente invento. Oeste modo, o presente invento deve ssr considerado como estanoo limitado apenao pelas reivindicações anexas.

Claims

.lâ. ..... Processo para intensificar a ligação entre uaa ro·'·.:'·; os nucleotídeos s uma sequencia de nucleotídeos complementar num ácido nucieico alvo de cadeia simples, caracterizado por compreender a adição ao ácido nucieico alvo de um oligonucleotídeo suxihar qus nibrid-a com o ácido nucieico alvo numa região d-farente aa da sonda, e se adicionar o oligonucleotídeo auxiliar numa q:.u_Sntioads qus >i&ja para intensificar a ligação da sonda ao ..r.» ;?uc _·.s λ co ai vo .
2â. - Processo de acordo com a rei vindicação 1, caracrsrizaoo por o ácido nucieico alvoser seleccionado entre o grupo constituído por DuA, mRNA, rRhift e tRNA e por outros pequenos • · - j. oos nu c 1 s i c os .

32. - Rroc&sso de acordo com a reivindicação terizado por o ácido nucieico alvo ser separado de um =us o produz ou em que ele se encontra antes da adiçao nucleotídeo auxiliar s da sonda de nucleotídeos.

2, carac-·· organismo do o1i go~ tu. · Processo de acordo com a reivindicacso 2, caractsnxaoo por o nucleotídeo auxiliar e a sonda de nucleotídeos ..cru·· introduzidos numa célula em qus o ácido nucieico alvo se snconcra localizado e por a hibridação entre o ácido nucieico alvo s o oligonucleotideo auxiliar e a sonda de nucleotídeos ocorres íntracelularmente.

caçoes i,

.·. eOtiUeO

52. - Processo de acordo com qualquer uma das 2,
3 ou
4, caracterizado por a sonda ser um de DNA e o oligonucleotídeo auxiliar ser um reivindi-oligonuoligonuC ‘xiQ í< λ cis

DdA.

. -- Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterixado por a -sonda compreender de cerce de 10 a cerca de 50

u.·.. .·.no\.·iem compr.mento e por os cοοη>'ηο·'·οο;®5 oe cerca tís 10 s cerca

u. O'í^:>*·. ?ϊ:3’Π vO .

nucleotídeos auxiliares de 200 nuc1 ©o t- ídeos em η~·>·saçjo por a.

z.... . parc/r

... · _;·η η·η·.

• ·. .. ; . P .. ' !.'.··. to .

Processo de acordo com a reivindicação &, caracsonua © os nucleotídeos auxiliares serem selecciodo OuÂ com uma estrutura de ester de difosfato, oe alquil ou arί1fosfonato ou uma estrutura cs
5a. ..... Processo de acordo com a reivindicação 7, csracterixaoo po? a sono». compreender oe cerca de 15 a cerca de 40 nuc ooróooos © os oligonucleotídeos auxiliares compreenderem ds corca de 2u a cerca da 50 nucleotídeos.

5u. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caraccerixaoo por o oligonucleotídeo auxiliar se ligar com o acido ;o.. ·.... alvo imediatamente adjacente à sonda.

iuã. - Processo de acoroo com a reivindicação 7, sru.c ter i t:ndo por o o 1 igonuc 1 soti teo auxί 1 i a r se ligar com o ncioo nucleico alvo imediatamente adjacente â sonda.

líâ. ..... Processo de acordo com a reivindicação 6, z-z-zzc ter xsado por o oligonucleotídeo auxiliar se ligar com o áci ao nucleico alvo numa região afastada da sonda.

i2s. - Processo de acordo com a reivindicação 7, csrasterixaoo por o oiigonucleotídeo auxiliar se ligar com o uciuo nuci&ico alvo numa região remota em relação ã sonda.

{ *

13â. - Processo de acordo com a reivindicação 5, ..rrr:ao?izado po? a sonda ser marcada ds forma a permitir a om.OCcao oa sonoa.

14ã. ~ Processo de acordo com a reivindicação 13, caraccarizaoo por a sonoa ser detectada apôs formação do híbrido a separaçao sonoa nao hibridada.

iSã. ·” Processo ds acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a marca ser um radionucleotídso, uma enzima, ama tracção fiuorométrica ou uma fracção que participa numa e· c to p r oduz i ndo pu í m 1 ol um i nesc ênc i a carac a.._Sr izaoo por a marca ser sslsccionada entre “·~·'~'χ ou um éster iSS. - Processo de acordo com a reivindicação IS, .ma do ..·. arniin <o .

i/é. processo ds acordo com a reivindicação S, <zc?ac tarizaoo por se usar uma mistura ds oligonucleotideos e.UÍÍI C ? .·.····. .

13b. - Processo ds acorao com a reivindicação &, caracterizado por se usar uma mistura de o1igonucleotideos an.ii ares.

las. - Processo de acordo com a reivindicação 14, carac cer :· zado por ss usar uma miscuira de ol igonuc leotideos

a.··:

20b. - Processo de acordo com a reivindicação 1&, caracaerxzaoo por se usar uma mistura ds o1igonucleotideos

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1. TT

VíHf

21â. - Processo de preparação ds um ácido nucleico duplex caracterizado por compreender um híbrido de uma sonda ds nucleotideos e um ácido nucleíco alvo a que e hibridado ou o ã i. 1 eoχ- í oeo aux lixar .

222. ·· Processo de preparação de um duplex de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o duplex ser constituído por mais do que um oligonucleotídeo auxiliar.

232. · Equipamento kit para detectar um acido nuclaico alvo, caracterizado por compreender uma sonda marcada ds nucIsoí-ídsos complementar ds uma sequência nucleotídica no ácido nucleico alvo & um oligonucleotídeo auxiliar.

24s. Equipamento de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por compreender dois ou mais oligonuc1eotídeos :?.r .·. cares.

23o. - Equipamento de acordo com a reivindicação 24, caracterizaco por o referido equipamento conter duas ou mais 9u«.mc u ®is ou mais ol igonuc 1 eot ídeos auxiliares.

232. ”· Equipamento o® acordo com a reivindícação 2S, caracterizado por cada sonda ter um oi igonuc leotídeo auxiliar.

27â. · Equipamento ds acordo com a reivindicação 26,

·...ar,,u.; ter izstío por uma ou maís sondas terem dois ou mais oligonu.....

c: i so -·: í de os a ux i 1 isrss.

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