ES2553079T3

ES2553079T3 - Mejora de la producción de espinosinas con proteínas que se unen al oxígeno

Info

Publication number: ES2553079T3
Application number: ES12166535.0T
Authority: ES
Inventors: Lei Han; Nigel Mouncey
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2011-05-03
Filing date: 2012-05-03
Publication date: 2015-12-04
Anticipated expiration: 2032-05-03
Also published as: EP2520658A2; ES2625504T3; HUE034838T2; EP2520658A3; EP2998399A1; EP2520653A1; EP2520653B1; DK2520653T3; EP2520658B1

Abstract

Un método para aumentar los títulos de espinosinas de una célula hospedante de S. spinosa, comprendiendo dicho método transformar la célula hospedante de S. spinosa con un gen heterólogo que codifica una proteína que se une al oxígeno.

Description

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gen implicado en una vía metabólica secundaria, por ejemplo el locus de la policétido-sintasa (PKS) de obscurina, dando como resultado preferiblemente la inactivación de un gen natural, obsA. La secuencia de un fragmento del gen obsA se denomina en la presente memoria SEQ ID NO 8. Cuando el sitio neutro es un gen, la interrupción puede ser en un elemento de control del gen o en la secuencia codificadora del gen, o en ambos. Alternativamente, un sitio neutro puede ser un sitio que no es un gen.

Una vía metabólica primaria incluye las vías esenciales para la supervivencia celular, por ejemplo la glicolisis, la vía de la pentosa-fosfato, el ciclo de TCA y la biosíntesis de aminoácidos. Una vía metabólica secundaria es una que está implicada en la producción de un metabolito secundario, es decir, que no es necesaria para la supervivencia de la célulaindividual.

Los términos "condiciones restrictivas" o "hibridación en condiciones restrictivas" se refieren a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará preferiblemente con su subsecuencia diana, y en menor grado, o nada en absoluto, a otras secuencias. La "hibridación restrictiva" y las "condiciones de lavado en la hibridación restrictiva" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como hibridaciones de Southern y de Northern, son dependientes de las secuencias y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Una amplia guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, Elsevier, New York. En general, se seleccionan condiciones de hibridación y de lavado altamente restrictivas para que sean aproximadamente 5ºC inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. El Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Se seleccionan condiciones muy restrictivas para que sean iguales al Tm para una sonda particular.

Un ejemplo de condiciones de hibridación restrictivas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en una transferencia de Southern o Northern es 50% de formamida con 1 mg de heparina a 42ºC, realizándose la hibridación durante una noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente restrictivas es con NaCl 0,15 M a 72ºC durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado restrictivas es un lavado con 0,2xSSC a 65ºC durante 15 minutos (véase, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning -A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, para la descripción del tampón SSC). Frecuentemente, un lavado muy restrictivo está precedido de un lavado poco restrictivo para eliminar la señal de la sonda de fondo. Un ejemplo de lavado restrictivo medio para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1xSSC a 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado poco restrictivo para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6xSSC a 40ºC durante 15 minutos. En general, una relación señal a ruido de 2x (o superior) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones restrictivas son todavía sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético.

La descripción se refiere también a un polinucleótido aislado hibridable en condiciones restrictivas, preferiblemente en condiciones muy restrictivas, con un polinucleótido como el de la presente descripción.

Como se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "hibridación" describa condiciones para hibridación y lavado bajo las cuales secuencias de nucleótidos homólogas entre sí, en al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 85% a 90%, lo más preferiblemente al menos 95%, semantienen típicamente hibridadas entre sí.

En una realización, un ácido nucleico de la descripción es al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más homólogo de una secuencia de ácido nucleicomostrada en esta solicitud o de sus complementos.

Otro ejemplo no limitativo de condiciones de hibridación restrictivas es la hibridación en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más lavados en 1xSSC, 0,1% de SDS a 50ºC, preferiblemente a 55ºC, más preferiblemente a 60ºC einclusomás preferiblemente a 65ºC.

Las condiciones altamente restrictivas pueden incluir incubaciones a 42ºC durante un período de varios días, tal como 2-4 días, utilizando una sonda de DNA marcada, tal como una sonda de DNA marcada con digoxigenina (DIG), seguidas de uno o más lavados con 2xSSC, 0,1% de SDS a temperatura ambiente y uno o más lavados con 0,5xSSC, 0,1% de SDS o con 0,1xSSC, 0,1% de SDS a 65-68ºC. En particular, las condiciones altamente restrictivas incluyen, por ejemplo, una incubación de 2 horas a 4 días a 42ºC utilizando una sonda de DNA marcada con DIG (preparada, por ejemplo, usando un sistema de marcaje con DIG; Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Alemania) en una solución, tal como solución DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH) con o sin 100 µg/mL de DNA de esperma de salmón, o una solución que comprende 50% de formamida, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), 0,02% de dodecilsulfato de sodio, 0,1% de N-lauroilsarcosina y 2% de reactivo de bloqueo (Roche Diagnostics GmbH), seguido de lavado de los filtros dos veces durante 5 a 15 minutos en 2xSSC y 0,1% de SDS a tempera

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Espinosad es uninsecticida producido por Dow AgroSciences (Indianapolis, Ind.) que está constituido principalmente por aproximadamente 85% de espinosina A y aproximadamente 15% de espinosina D. Las espinosinas A y D son productos naturales producidos por fermentación de Saccharopolyspora spinosa, como se ha descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.362.634. El espinosad es un ingrediente activo de varias formulaciones insecticidas disponible comercialmente de Dow AgroSciences, que incluye los productos para el control de insectos TRACER™, SUCCES™, SPINTOR™y CONSERVE™. Por ejemplo, el producto TRACER está constituido por aproximadamente 44% a aproximadamente 48% de espinosad (p/v) o aproximadamente 479 gramos de espinosad por litro (4 libras por galón). Se ha establecido la utilidad de los compuestos de espinosina en formulaciones granulares y líquidas para el control de arácnidos, nemátodos e insectos, en particular, las especies de lepidópteros, tisánopteros y dípteros. Las espinosinas A y D también se denominan en la presentememoria espinosinas A/D.

Espinotoram es una mezcla de 5,6-dihidro-3'-etoxi-espinosina J (componente principal) y 3'-etoxi-espinosina L producidas por Dow AgroSciences. La mezcla se puede preparar por etoxilación de una mezcla de espinosina J y espinosina L, seguido por hidrogenación. El doble enlace en 5,6 de la espinosina J y su derivado 3'-etoxi se hidrogenan mucho más fácilmente que el de la espinosina L y su derivado 3'-etoxi, debido al impedimento estérico por el grupo metilo en C-5 en la espinosina L y su derivado 3'-etoxi. Véase, la Patente de EE.UU. Nº 6.001.981. Las espinosinas J y L también se denominan en la presente memoria espinosinas J/L.

En esta solicitud se ha demostrado que la expresión de VHb en S. spinosa da como resultado un aumento en la producción de espinosinas. La expresión de la proteína portadora de oxígeno, VHb, produce niveles elevados de la hemoglobina homodimérica bajo condiciones de crecimiento hipóxicas (Zhang et al., 2007). Entre las hemoglobinas, la VHb tiene un valor medio de la constante de la velocidad de asociación al oxígeno y una constante bastante alta de la velocidad de disociación del oxígeno (cientos de veces mayor que las de otras hemoglobinas). Esto sugiere que VHb es capaz deliberar el oxígeno unidomás fácilmente que las demás hemoglobinas (Zhang et al., 2007).

La expresión de VHb en varias cepas de Actinomyces condujo a un aumento en la producción de antibióticos incluyendo clortetraciclina, monensina, eritromicina y actinorrodina (Zhang et al., 2007; Magnolo et al., 1991). La cepa de Streptomyces coelicolor recombinante que expresa VHb produjo diez veces más actinorrodina que la cepa de tipo natural a bajos niveles de oxígeno disuelto (OD) (OD inferior al 5% de saturación en aire) (Magnolo et al., 1991). Además, la producción de actinorrodina por la cepa recombinante que expresa VHb era menos sensible a las condiciones de aireación. Aunque la producción de eritromicina no se considera en general sensible a los niveles de OD, siempre que los niveles de OD estén por encima de los niveles mínimos requeridos para el crecimiento, la expresión de VHb en una cepa productora de eritromicina industrial aumentó significativamente los títulos de eritromicina hasta 7,25 g/L desde 4,25 g/L, mientras que redujo la acumulación de biomasa en condiciones de fermentación en un biorreactor alimentado por lotes a escalas entre 10-15 litros (Brunker et al., 1997; 1998; Minas et al., 1998).

Las realizaciones de la presente descripción proporcionan una célula hospedante genéticamente modificada que alberga un gen mejorador de espinosinas integrado en el genoma de S. spinosa.

Se han clonado genes que codifican un gran número de proteínas que se unen al oxígeno y se han determinado sus secuencias. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótido conocidas de proteínas de globina útiles en la presente invención incluyen, aunque sin limitación, las que codifican una mioglobina de cianobacterias (Potts et al., 1992, Science 256:1690-1692), hemoglobina de Scapharca inaequivalvis (Gambacurta et al., 1993, FEBS Lett. 330:90-94), mioglobina de Aplysia limacina (Cutruzzola et al., 1996, Biochem. J. 314:83-90), hemoglobina de Ascaris (Sherman et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11696-11700), hemoglobina del nemátodo Pseudoterranova decipiens (Dixon et al., 1991, Natl. Acad. Sci. USA 88:5655-5659 y Dixon et al., 1992, J. Mol. Evol. 35:131-136), hemoglobina de Paramecium caudatum (Yamauchi et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 182:195-200), hemoproteína de Rhizobium meliloti (David et al., 1988, Cell 54:671-683) y Saccharomyces cerevisiae (Shimada et al., 1989, J. Biochem. 105:417-422). Particularmente adecuadas para su uso en la presente invención son las proteínas que se unen al oxígeno que tienen velocidades koffrelativamente altas tal como VHb (koff5600 s-1; Orii andWebster, 1986, J. Biol. Chem. 261:3544-3547) o afinidad al oxígeno relativamente baja, tal como la mioglobina de corazón de caballo (KD 0,79 µM; Wittenberg et al., 1985, en Nitrogen Fixation Research Progress. H. J. Evand et al., Eds. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, p. 354). Por tanto, las proteínas que se unen al oxígeno preferidas pueden ser las proteínas con una velocidad koffpara el oxígeno mayor que 10 s-1, más preferiblemente mayor que 100 s-1, o una KD para el oxígeno mayor que 0,5 µM, aunque se entenderá que también serán útiles las proteínas que se unen al oxígeno con constantes de velocidad fuera de estos parámetros. Como se indicó anteriormente, las proteínas que se unen al oxígeno preferidas incluyen globinas, tales como hemoglobina, mioglobina y legemoglobinas. Las propiedades de muchas proteínas que se unen al oxígeno, incluyendo globinas, están descritas en la bibliografía. Adicionalmente, las técnicas para determinar las propiedades de unión al oxígeno de una proteína, tal como una globina, son muy conocidas por los expertos en la técnica y se pueden realizar sin excesiva experimentación.

Como se indicó anteriormente dicha proteína que se une al oxígeno para uso en la presente invención, como se ha descrito en la presente memoria a modo de ejemplo de trabajo, es VHb. La secuencia completa del gen de VHb está descrita en la Patente de EE.UU. Nº 5.049.493. Los fragmentos, mutantes, variantes y derivados de VHb que se unen al oxígeno también están dentro del alcance de la presente descripción.

También están incluidos fragmentos, mutantes, variantes y derivados de la secuencia de polinucleótido que codifica

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VHb, que codifican una proteína que se une al oxígeno. Preferiblemente, la presente descripción proporciona el uso de la secuencia codificadora de VHb del vector de expresión descrito en la SEQ ID NO 1, o sus fragmentos, variantes o derivados.

Los mutantes incluyen, aunque sin limitación, "polimorfismo(s) funcional(es)", que como se utiliza en la presente memoria se refiere a un cambio en la secuencia de pares de bases de un gen que produce un cambio cualitativo o cuantitativo en la actividad de la proteína codificada por dicho gen (por ejemplo, un cambio en la especificidad de la actividad; un cambio en el nivel de actividad). El término "polimorfismo funcional" incluye mutaciones, deleciones e inserciones.

En general, la etapa de detección del polimorfismo de interés se puede realizar recogiendo una muestra biológica que contenga DNA de la fuente y determinando a continuación en la muestra biológica la presencia o ausencia de DNA que contiene el polimorfismo de interés.

La determinación de la presencia o ausencia de DNA que codifica una mutación particular se puede llevar a cabo con una sonda de oligonucleótidos marcada con un grupo detectable adecuado y/o por una reacción de amplificación, tal como una reacción en cadena de polimerasa o una reacción en cadena de ligasa (el producto de la cual se puede detectar entonces con una sonda de oligonucleótidos marcada u otras técnicas). Se sabe que para realizar la presente invención se pueden emplear numerosos formatos de ensayo con diferentes sondas de oligonucleótidos. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.302.204 de Wahl et al.; la Patente de EE.UU. Nº 4.358.535 de Falkow et al.; la Patente de EE.UU. Nº 4.563.419 de Ranki et al.; y la Patente de EE.UU. Nº 4.994.373 de Stavrianopoulos et al.

La amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada, o diana, se puede realizar por cualquier medio adecuado. Véase, en general, Kwoh et al., Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25 (1990). Ejemplos de técnicas de amplificación adecuadas incluyen, aunque sin limitación, reacción en cadena de polimerasa, reacción en cadena de ligasa, amplificación por desplazamiento de cadena (véase en general G. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392396 (1992); G. Walker et al., Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992)), amplificación basada en la transcripción (véase D. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)), replicación de secuencias autosostenida (o "3SR") (véase J. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)), el sistema de Qß replicasa (véase

P. Lizardi et al., BioTechnology 6, 1197-1202 (1988)), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (o "NASBA") (véase R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), 1 (1992)), la reacción en cadena de reparación (o "RCR") (véase R. Lewis, supra) y amplificación de DNA bumerán (o "BDA") (véase R. Lewis, supra). Generalmente se prefiere la reacción en cadena de polimerasa.

La reacción en cadena de polimerasa (PCR) se puede llevar a cabo de acuerdo con técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nos. 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; y 4.965.188. En general, la PCR implica, en primer lugar, tratar una muestra de ácido nucleico (por ejemplo, en presencia de una DNA-polimerasa estable al calor) con un cebador oligonucleotídico para cada cadena de la secuencia específica que se ha de detectar en condiciones de hibridación, demodo que se sintetice un producto de extensión de cada cebador que sea complementario con cada cadena de ácidos nucleicos, siendo los cebadores suficientemente complementarios con cada cadena de la secuencia específica para hibridarse con ella de modo que el producto de extensión sintetizado a partir de cada cebador, cuando se separa de su complemento, pueda servir como un molde para la síntesis del producto de extensión del otro cebador, y luego tratar la muestra en condiciones de desnaturalización para separar los productos de extensión del cebador de sus moldes, si están presentes la secuencia o secuencias que se han de detectar. Estas etapas se repiten cíclicamente hasta que se obtiene el grado deseado de amplificación. La detección de la secuencia amplificada se puede realizar añadiendo al producto de reacción una sonda de oligonucleótidos capaz de hibridarse con el producto de reacción (por ejemplo, una sonda de oligonucleótidos de la presente descripción), llevando la sonda un marcador detectable y detectando luego el marcador de acuerdo con técnicas conocidas, o por visualización directa sobre un gel. Dichas sondas pueden tener una longitud de 5 a 500 nucleótidos, preferiblemente de 5 a 250, más preferiblemente de 5 a 100 o de 5 a 50 ácidos nucleicos. Cuando las condiciones de la PCR permiten la amplificación de todos los tipos alélicos, dichos tipos se pueden distinguir por hibridación con una sonda específica alélica, por digestión con endonucleasas de restricción, por electroforesis en geles con gradientes de desnaturalización u otras técnicas.

La reacción en cadena de ligasa (LCR) también se realiza de acuerdo con técnicas conocidas. Véase, por ejemplo,

R. Weiss, Science 254, 1292 (1991). En general, la reacción se lleva a cabo con dos pares de sondas de oligonucleótidos: un par se une a una cadena de la secuencia que se ha de detectar; el otro par se une a la otra cadena de la secuencia que se ha de detectar. Cada par juntos solapancompletamente la cadena correspondiente. La reacción se realiza, en primer lugar, desnaturalizando (por ejemplo, separando) las cadenas de la secuencia que se ha de detectar, haciendo reaccionar a continuación las cadenas con los dos pares de sondas de oligonucleótidos en presencia de una ligasa estable al calor, de modo que se liguen entre sí cada par de sondas de oligonucleótidos, separando luego el producto de reacción y repitiendo luego cíclicamente el proceso hasta que la secuencia ha sido amplificada en el grado deseado. A continuación se puede realizar la detección de la misma manera que se ha descrito anteriormente respecto a la PCR.

Las técnicas de amplificación del DNA, tales como las anteriores, pueden implicar el uso de una sonda, un par de

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sondas o dos pares de sondas que se unen específicamente al DNA que contiene el polimorfismo funcional, pero no se unen al DNA que no contiene el polimorfismo funcional. Alternativamente, la sonda o el par de sondas podría unirse al DNA que tanto contiene como no contiene el polimorfismo funcional, pero produce o amplifica un producto (por ejemplo, un producto de alargamiento) en el que se puede determinar una diferencia detectable (por ejemplo, un producto más corto, donde el polimorfismo funcional es una mutación por deleción). Dichas sondas se pueden generar de acuerdo con técnicas estándares a partir de las secuencias de DNA conocidas en o asociadas a un gen unido a VHb o a partir de secuencias que se pueden generar a partir de dichos genes de acuerdo con técnicas estándares.

Se apreciará que las etapas de detección descritas en la presente memoria se pueden realizar directa o indirectamente. Otros medios de determinar indirectamente el tipo alélico incluyen la medición de marcadores polimórficos que están unidos al polimorfismo funcional particular, como se ha demostrado para las VNTR (repeticiones en tándem de número variable).

La biología molecular comprende una amplia variedad de técnicas para el análisis de secuencias de ácidos nucleicos y proteínas. Muchas de estas técnicas y procedimientos constituyen la base de pruebas y ensayos de diagnóstico clínico. Estas técnicas incluyen análisis por hibridación de ácidos nucleicos, análisis con enzimas de restricción, análisis de secuencias genéticas y la separación y purificación de ácidos nucleicos y proteínas (véase, por ejemplo,

J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

La mayoría de estas técnicas implican realizar numerosas operaciones (por ejemplo, pipeteado, centrifugación y electroforesis) en un gran número de muestras. Dichas operaciones son a menudo complejas y consumen tiempo, y requieren generalmente un alto grado de precisión. Muchas técnicas están limitadas en su aplicación por una falta de sensibilidad, especificidad o reproducibilidad.

El análisis por hibridación de ácidos nucleicos implica generalmente la detección de un número muy pequeño de ácidos nucleicos diana específicos (DNA o RNA) con un exceso de DNA sonda, entre una cantidad relativamente grande de ácidos nucleicos no diana complejos. Una reducción en la complejidad del ácido nucleico en una muestra es útil para la detección de bajo número de copias (es decir, 10.000 a 100.000) de ácidos nucleicos diana. La reducción de la complejidad del DNA se logra en cierto grado por la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos diana. (Véase, M.A. Innis et al., PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990, Spargo et al., 1996, Molecular & Cellular Probes, respecto a la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA)). Esto es debido a que la amplificación de ácidos nucleicos diana da como resultado un enorme número de secuencias de ácidos nucleicos diana con relación a las secuencias no diana, mejorando así la etapa de hibridación de dianas subsiguiente.

La etapa de hibridación implica colocar la muestra de DNA preparada en contacto con una sonda indicadora específica en las condiciones óptimas ajustadas para que tenga lugar la hibridación entre la secuencia de DNA diana y la sonda. La hibridación se puede realizar en uno cualquiera entre varios formatos. Por ejemplo, el análisis por hibridación de ácidos nucleicos en múltiples muestras se ha realizado en una variedad de formatos de filtros y de soportes sólidos, (véase Beltz et al., Methods in Enzymology, Vol. 100, Part et al., Eds., Academic Press, New York, Chapter 19, pp. 266-308, 1985). Un formato, la llamada hibridación por "transferencia de mancha", implica la unión no covalente de los DNA diana a un filtro seguido por la posterior hibridación con una o varias sondas marcadas con radioisótopos. La hibridación por "transferencia de mancha" alcanzó un uso generalizado en las dos últimas décadas durante las cuales se desarrollaron muchas versiones (véase Anderson and Young, en Nucleic Acid Hybridization – A Practical Approach, Hames and Higgins, Eds, IRL Press, Washington, D.C., Chapter 4, pp.73-111, 1985). Por ejemplo, el método de transferencia de mancha se ha desarrollado para múltiples análisis demutaciones genómicas (EP-A 0228075 de Nanibhushan et al.) y para la detección de clones solapantes y la construcción de mapas genómicos (Patente de EE.UU. Nº 5.219.726 de Evans).

Técnicas adicionales para realizar análisis de hibridación deácidos nucleicos demúltiples muestras incluyen dispositivos múltiplex micro-formateados o de matriz (por ejemplo, chips de DNA) (véase M. Barinaga, 253 Science, pp.1489, 1991; W. Bains, 10 Bio/Technology, pp. 757-758, 1992). Estos métodos unen generalmente secuencias de DNA específicas a áreas específicas muy pequeñas de un soporte sólido, tales como micro-pocillos de un chip de DNA. Estos formatos de hibridación son versiones a microescala de los sistemas de hibridación convencionales por "transferencia demancha" y en "sándwich".

La hibridación micro-formateada se puede utilizar para realizar "secuenciación por hibridación" (SBH) (véase M. Barinaga, 253 Science, pp. 1489, 1991; W. Bains, 10 Bio/Technology, pp. 757-758, 1992). La SBH hace uso de todos los oligómeros de n-nucleótidos (n-meros) posibles para identificar n-meros en una muestra de DNA desconocida, que se alinean subsiguientemente por análisis de algoritmos produciendo la secuencia de DNA (véase, Drmanac, Patente de EE.UU. Nº 5.202.231).

Existen dos formatos para la realización de la SBH. El primer formato implica crear una matriz de todos los n-meros posibles sobre un soporte, que se hibrida luego con la secuencia diana. El segundo formato implica unir la secuencia diana a un soporte, que se sonda secuencialmente con todos los n-meros posibles. Southern (Solicitud de Patente

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físicas, estructura cristalina o similares.

Los genes responsables de las vías metabólicas secundarias en S. spinosa, no esenciales para las actividades metabólicas primarias del organismo, representan una fuente atractiva para los sitios neutros. De estos, son de particular interés las agrupaciones de genes de policétido-sintasa que no son de espinosinas puesto que la interrupción de las agrupaciones de genes pueden dar como resultado la eliminación de las vías competidoras potenciales para los precursores comunes de acil-CoA y los cofactores esenciales para la biosíntesis y producción de espinosinas. Esto puede producir una sinergia entre los beneficios de los genes diana y la mayor disponibilidad de los precursores. En una realización, la presente invención proporciona la integración de un polinucleótido como se define en la presente memoria en un sitio neutro en el genoma de la célula hospedante, por ejemplo en el locus de la policétido-sintasa de la obscurina, por ejemplo el gen obsA.

Los textos y ejemplos encontrados en la presente memoria describen estos procedimientos. Se encuentra información adicional en las siguientes publicaciones y referencias citadas en: Ling et al, Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal. Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. 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También se pueden utilizar fragmentos de péptidos, polipéptidos, proteínas, polinucleótidos y genes descritos en la presente memoria. Los fragmentos pueden comprender al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o al menos 99% de la longitud de la secuencia de referencia (por ejemplo, secuencia de tipo natural o de origen natural). En una realización, los fragmentos pueden ser los que son funcionalmente equivalentes en al menos un aspecto a la secuencia de referencia.

Los términos "homología" o "porcentaje de identidad" se usan indistintamente en la presentememoria. Para los fines de esta invención, se define en la presente memoria que con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para fines de com

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paración óptimos (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos). Se comparan a continuación los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácidos o nucleótidos que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en dicha posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir, posiciones solapantesx100). Preferiblemente, las dos secuencias tienen lamisma longitud. En la presente invención, una variante o derivado de péptido, polipéptido, proteína o polinucleótido o secuencia de genes es uno que comprende una o más deleciones, adiciones o sustituciones, y puede tener al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos 99% de identidad de secuencias con la secuencia de referencia (por ejemplo, de tipo natural o de origen natural). En una variante o derivado, las sustituciones pueden ser sustituciones conservadoras, en las que los aminoácidos o ácidos nucleicos están sustituidos por aminoácidos o ácidos nucleicos que tienen propiedades similares, de tal manera que no se cambie la naturaleza y actividad de la secuencia. Alternativamente, las sustituciones pueden no ser conservadoras, de tal manera que estén sustituidas por unas que tengan propiedades diferentes que a su vez afecten a la naturaleza y propiedades de la secuencia.

Los expertos en la técnica serán conscientes del hecho de que están disponibles varios programas informáticos diferentes para determinar la homología entre dos secuencias. Por ejemplo, se pueden realizar una comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias utilizando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de programas informáticos GCG (disponible en Internet en la página web de Accelrys, más específicamente en http://www.accelrys.com), usando bien una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de huecos de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitudes de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Los expertos en la técnica apreciarán que todos estos parámetros diferentes proporcionarán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente cuando se utilizan diferentes algoritmos.

Incluso en otra realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de programas informáticos GCG (disponible en Internet en la página web de Accelrys, más específicamente en http://www.accelrys.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de huecos de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitudes de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos se determina usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CA-BIOS, 4:11-17 (1989) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) (disponible en Internet en la página web de Vega, más específicamente ALIGN -IGH Montpellier, o más específicamente en http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.

Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas de la presente descripción se pueden usar además como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en las bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden realizar usando los programas BLASTN y BLASTX (versión 2.0) de Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos por BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácidos nucleicos de la presente descripción.

Las búsquedas de proteínas por BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteínas de la presente descripción.

Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST como ha sido descrito por Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). (Disponible en Internet en la página web de NCBI, más específicamente en www.ncbi.nlm.nih.gov).

Un casete de expresión para uso en la presente descripción puede comprender una secuencia de polinucleótido, preferiblemente un gen que codifica un gen mejorador de espinosinas y/o un gen que codifica una enzima biosintética de espinosinas. En una realización, el gen mejorador de espinosinas y un gen que codifica una enzima biosintética de espinosinas son como se han definido en la presente memoria. Un casete de expresión puede comprender opcionalmente un marcador seleccionable. Un casete de expresión puede comprender opcionalmente una o más secuencias de control, incluyendo un origen de replicación. Un casete de expresión puede comprender opcionalmente una o más secuencias para permitir la integración (por ejemplo, por recombinación) en un genoma de una célula hospedante. El término "casete de expresión" se puede usar indistintamente con términos tales como vector de expresión y construcción genética.

Vectores de expresión adecuados para su uso en la presente invención incluyen vectores procariotas y eucariotas (por ejemplo, plásmido, fagémido o bacteriófago), vectores de mamíferos y vectores de plantas. Los vectores proca

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riotas adecuados incluyen plásmidos tales como, aunque sin limitación, los comúnmente utilizados para la manipulación del DNA en Actinomyces (por ejemplo pSET152, pOJ260, pIJ101, pJV1, pSG5, pHJL302, pSAM2, pKC1250). Dichos plásmidos han sido descritos por Kieser et al., ("Practical Streptomyces Genetics", 2000). Otros vectores adecuados pueden incluir plásmidos tales como los capaces de replicación en E. coli (por ejemplo, pBR322, ColE1, pSC101, PACYC 184, itVX, pRSET, pBAD (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y similares). Dichos plásmidos han sido descritos por Sambrook (véase "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, editado por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)) y muchos de dichos vectores están disponibles comercialmente. Los plásmidos de Bacillus incluyen pC194, pC221, pT127 y similares, y han sido descritos por Gryczan (en: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), pp. 307-329). Los plásmidos de Streptomyces adecuados incluyen pli101 (Kendall et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183, 1987) y los bacteriófagos de Streptomyces incluyen, aunque sin limitación, tales como ψC31 (Chater et al., en: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kiado, Budapest, Hungría (1986), pp. 45-54). Los plásmidos de Pseudomonas han sido revisados por John et al., (Rev. Infect. Dis. 8:693-704, 1986) e Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742, 1978). En una realización, un casete de expresión para uso en la presente descripción puede comprender una secuencia de polinucleótido que codifica un gen mejorador de espinosinas, como se define en la presente memoria, un terminador de la transcripción y un marcador seleccionable. Preferiblemente, el gen mejorador de espinosinas es una secuencia de polinucleótidos que codifica VHb o uno de sus fragmentos, derivados o variantes. Independientemente, el terminador de la transcripción puede ser la secuencia terminadora de la transcripción aph. Independientemente, el marcador seleccionable puede ser un gen de resistencia a la apramicina. Preferiblemente, el casete de expresión es como se muestra en la SEQ ID NO. 1.

La supresión de la expresión de genes particulares es una herramienta importante tanto para la investigación como para el desarrollo de organismos modificados genéticamente más ajustados para un fin particular. El silenciamiento génico se puede conseguir por la introducción de un transgén que corresponde al gen de interés en la orientación antisentido con relación a su promotor (véase, por ejemplo, Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8805-8808 (1988); Smith et al., Nature 334:724-726 (1988)), o en la orientación con sentido con relación a su promotor (Napoli et al., Plant Cell 2:279-289 (1990); van der Krol et al., Plant Cell 2:291-299 (1990); Patente de EE.UU. Nº 5.034.323; Patente de EE.UU. Nº 5.231.020; y Patente de EE.UU. No. 5.283.184), ambas de las cuales conducen a la expresión reducida del transgén así como al gen endógeno.

Se ha documentado que el silenciamiento génico postranscripcional va acompañado por la acumulación de pequeños fragmentos (20 a 25 nucleótidos) de RNA antisentido, que pueden ser sintetizados a partir de un molde de RNA y representan los determinantes de especificidad y movilidad del proceso (Hamilton & Baulcombe, Science 286:950952 (1999)). Ha quedado claro que en una gama de organismos la introducción de dsRNA (RNA bicatenario) es un componente importante que conduce al silenciamiento génico (Fire et al., Nature 391:806-811 (1998); Timmons & Fire, Nature 395:854 (1998); el documento WO99/32619; Kennerdell & Carthew, Cell 95:1017-1026 (1998); Ngo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14687-14692 (1998); Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1395913964 (1998); el documento WO99/53050; Cogoni & Macino, Nature 399:166-169 (1999); Lohmann et al., Dev. Biol. 214:211-214 (1999); Sánchez-Alvarado & Newmark, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5049-5054 (1999)). En las bacterias, el gen suprimido no necesita ser un gen bacteriano endógeno, ya que tanto los transgenes informadores como los genes víricos son sometidos a silenciamiento génico postranscripcional por transgenes introducidos (English et al., Plant Cell 8:179-188 (1996); Waterhouse et al., supra). Sin embargo, en todos los casos anteriores, se puede preferir alguna similitud de secuencias entre el transgén introducido y el gen que es suprimido. En la presente memoria los términos "célula hospedante" y "célula hospedante recombinante" se usan indistintamente. Dichos términos se refieren no sólo a la célula objeto particular, sino también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede en efecto no ser idéntica a la célula parental, pero aún así está incluida dentro del alcance del términotal como se usa en la presente memoria.

Los métodos de la invención pueden incluir las etapas adicionales de:

a) cultivar una célula modificada genéticamente de la invención, en condiciones apropiadas para la producción de espinosinas; y

b) recoger las espinosinas de un cultivo dela célula.

Se incluyen los ejemplos siguientes para ilustrar la presente invención y no se deben interpretar como limitativos de la misma.

Ejemplos

Construcción de un casete de expresión del gen de hemoglobina

Se diseñó un casete de expresión del gen de hemoglobina para que contuviera las siguientes características claves: i) el promotor ( promotor aac3 (IV)) del gen deresistencia a apramicina(originalmentede Klebsiella pneumoniae bajo el número de acceso en GenBank X99313; Kieser et al., 2001) que es funcional en S. spinosa; ii) el gen VHb de la hemoglobina de Vitreoscilla con codones optimizados (Tabla 1) diseñado utilizando una tabla de preferencia de

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moglobina fueron SynHemo directo (SEQ ID NO: 6 5'-CAGACGATCAACATCATCAAGGCG-3') y SynHemo inverso (SEQ ID NO: 7 5'-ACCTGGATGAACACGTCCGC-3'). Las cepas recombinantes que contenían el casete de expresión de VHb produjeron un fragmento específico de 395 pb correspondiente a la región codificadora del gen de hemoglobina destinada a la amplificación. En el mismo ensayo, el RNA total aislado de cepas de control no recombinantes no produjo un fragmento de PCR correspondiente en tamaño al gen sintético de hemoglobina. Estos resultados confirmaron que un gen sintético de hemoglobina, activado por el promotor del gen de resistencia a apramicina, se transcribió y expresó en S. spinosa bajo condiciones defermentación.

Efecto dela expresión del gen dela hemoglobina sobrela producción de espinosad

Se evaluó el impacto de la expresión del gen de hemoglobina sobre la producción de espinosad (A/D) cultivando las cepas recombinantes bajo condiciones de fermentación en matraces con agitación, tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados de la fermentación se compararon con los niveles de la espinosina A/D producidos en la respectiva cepa parental, que no llevaba el gen de la hemoglobina. El número de cepas recombinantes seleccionadas para la evaluación en matraces con agitación se basó en el número de transconjugantes disponibles para el análisis y el deseo de obtener datos que determinarían si la expresión del gen sintético de hemoglobina produciría mayores niveles de espinosad A/D.

Se analizaron siete cepas recombinantes derivadas de DAS-2. Todas ellas superaron a la cepa parental DAS-2, en la producción de espinosad. La cepa parental acumuló espinosad dentro del intervalo esperado. El aumento estadísticamente significativo de la producción de espinosad A/D varió de 4,6% a 12,9% para las cepas que contenían el gem VHb (Tabla 2). La consistencia entre las cepas recombinantes en superar a la cepa de control en la producción de espinosad en condiciones de fermentación en matraces con agitación dio como resultado un aumento significativo porcentual de títulos de espinosad A/D. Este aumento en los títulos de espinosad indicó que las cepas recombinantes como un todo habían adquirido unamayor capacidadde producción de espinosad debido a la presencia en el genoma del gen sintético de hemoglobina. La expresión del gen sintético de hemoglobina en condiciones de fermentación en matraces con agitación indica que la expresión del gen de la hemoglobina aumenta la producción de espinosad.

Tabla 2: Comparación de las cepas DAS-2 y las cepas recombinantes DAS-2 VHb que contienen un gen de VHb integrado cromosómicamente en la producción de espinosad.

Identificación de la cepa: Factores principales de espinosinas Títulos de espinosinas en relación con el control en porcentajes el día 10 de la fermentación

DAS-2: A/D 100,0

DAS-2 VHb1: A/D 107,4

DAS-2 VHb4: A/D 104,6

DAS-2 VHb5: A/D 108,0

DAS-2 VHb6: A/D 110,5

DAS-2 VHb7: A/D 112,9

DAS-2 VHb8: A/D 110,4

DAS-2 VHB9: A/D 105,6

Basándose en los resultados de fermentación descritos anteriormente, las cepas recombinantes siguientes, DAS-2 VHb7 y DAS-2 VHb8, se conservaron criogénicamente en glicerol al 20% usando cultivos vegetativos que crecen activamente. Se llevó a cabo un estudio de la fermentación en matraces con agitación dedicado a: i) evaluar las cepas crioconservadas; ii) asegurar la reproducibilidad de los resultados de fermentación; y iii) proporcionar pruebas del avance de las cepas seleccionadas para un trabajo futuro. En este estudio las cepas de control produjeron espinosad en los niveles esperados, y todo el estudio se llevó a cabo sin ningún tipo de desviaciones inesperadas del protocolo de operación. Cada cepa recombinante superó a las cepas de control tanto durante como al final del ciclo de fermentación lo que confirmó las observaciones iniciales de los estudios de fermentación en matraces con agitación. El aumento en los niveles de espinosad en las cepas recombinantes en relación con las cepas de control fue estadísticamente significativo.

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Claims

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