ES2625504T3 - Integración de genes en el cromosoma de Saccharopolyspora spinosa - Google Patents

Abstract

Un método para integrar un gen por recombinación homóloga en DNA cromosómico de una célula hospedante de S. spinosa, comprendiendo dicho método las etapas de: a) clonar dos fragmentos de DNA genómico del gen obsA en el locus del gen de la policétido-sintasa de obscurina para generar un plásmido de integración, en donde se clona un fragmento genómico aguas arriba de un polinucleótido que se ha de integrar, y se clona el segundo fragmento genómico aguas abajo de un polinucleótido que se ha de integrar y el fragmento de DNA ligado resultante se convierte en el plásmido de integración, en donde, tras la integración el gen obsA del locus del gen de la policétido sintasa de obscurina está interrumpido por el polinucleótido; b) introducir el plásmido de la etapa (a) en la célula hospedante; c) integrar el polinucleótido en el gen obsA natural del locus del gen de la policétido-sintasa de obscurina en el genoma de la célula hospedante; y d) cribar la célula hospedante para detectar la presencia de dicho polinucleótido.

Description

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DESCRIPCION

Integracion de genes en el cromosoma de Saccharopolyspora spinosa Campo tecnico

La invencion se aplica al campo tecnico de la genetica molecular en donde los genes pueden estar integrados en el cromosoma de Saccharopolyspora spinosa. Un metodo de ingeniena metabolica clave es la integracion y expresion de genes diana en las regiones del DNA cromosomico que da como resultado poco a ningun impacto negativo sobre la produccion o crecimiento de espinosinas.

Antecedentes

Como se describe en la Patente de EE.UU. N° 5.362.634, el producto de fermentacion A83543 es una familia de compuestos relacionados producida por Saccharopolyspora spinosa. Los miembros conocidos de esta familia se han denominado factores o componentes y a cada uno se le ha dado una letra de identificacion. Estos compuestos se denominan en adelante espinosina A, B, etc. Los compuestos espinosinas son utiles para el control de aracnidos, nematodos e insectos, en particular las especies de lepidopteros y dfpteros. Los compuestos se consideran compatibles con el medio ambiente con un perfil toxicologico atractivo.

Los compuestos espinosinas producidos de forma natural son macrolidos que consisten en una lactona tetradclica de 21 carbonos a la que estan unidos dos desoxiazucares: un azucar neutro (ramnosa) y un aminoazucar (forosami- na) (vease Kirst et al., (1991)). Si el aminoazucar no esta presente, los compuestos se han denominado pseudoagli- conas de A, D, etc., y si el azucar neutro no esta presente, entonces los compuestos se han denominado pseu- doagliconas inversas de A, D, etc. Una nomenclatura mas preferida es referirse a las pseudoagliconas como espinosina A 17-Psa, espinosina D 17-Psa, etc., y a las pseudoagliconas inversas como espinosina A 9-Psa, espinosina D 9-Psa, etc.

Los compuestos espinosinas producidos de forma natural se pueden obtener por fermentacion de las cepas de S. spinosa NRRL 18395, 18537, 18538, 18539, 18719, 18720, 18743 y 18823 y sus derivadas. Estos cultivos se han depositado y forman parte de la coleccion de cultivos madre del Midwest Area Northern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, III, 61604.

La Patente de EE.UU. N° 5.362.634 y la Patente Europea correspondiente N° 0375316 B1 se refieren a las espinosinas A, B, C, D, E, F, G, H y J. Se dice que estos compuestos son producidos cultivando una cepa del nuevo micro- organismo Saccharopolyspora spinosa seleccionada de NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 y NRRL 18539.

El documento WO 93/09126 se refiere a las espinosinas L, M, N, Q, R, S y T. En el tambien se describen dos cepas productoras de la espinosina J: NRRL 18719 y NRRL 18720, y una cepa que produce las espinosinas Q, R, S y T: NRRL 18823.

El documento WO 94/20518 y la Patente de EE.UU. N° 5.670.486 se refieren a las espinosinas K, O, P, U, V, W e Y, y sus derivados. En ellos tambien se describe la cepa NRRL 18743 productora de la espinosina K.

Matsushima P. et al., 1994, se refieren a la transferencia conjugada del DNA cosmido desde E. coli hasta S. spinosa y a los efectos de las inserciones cromosomicas sobre la produccion del macrolido A83543.

El documento WO 99/46387 se refiere a la clonacion de la agrupacion de genes de espinosinas y a sus diversas modificaciones.

Zirkle Ross et al., 2004, se refieren al analisis de una region de 108 kb del genoma de S. spinosa que abarca el locus de la policetido-sintasa de obscurina.

Sena deseable mejorar la expresion genica heterologa en S. spinosa.

Descripcion de la invencion

La presente invencion proporciona un metodo para identificar y validar un sitio neutro en el genoma de S. spinosa, en donde en dicho sitio puede integrarse un(unos) polinucleotido(s) y expresarse establemente.

En una realizacion, el(los) polinucleotido(s) puede(n) contener al menos un casete de expresion genica, que puede integrarse en dicho sitio neutro y expresarse establemente.

En una realizacion, el polinucleotido puede expresarse en generaciones posteriores.

En una realizacion, el locus de la policetido-sintasa (abreviadamente PKS por la expresion inglesa Polyketide synthase) de obscurina se puede usar como un sitio neutro para la integracion de un polinucleotido, extrano o natural, dentro del genoma de S. spinosa. Mas espedficamente, el gen obsA del locus de la policetido-sintasa (PKS) de obscurina se puede usar como un sitio neutro, puesto que este gen se puede interrumpir sin impactar negativamente en la produccion, crecimiento u otras caractensticas metabolicas deseadas de las espinosinas.

Portanto, la presente invencion proporciona un metodo para expresar establemente un polinucleotido en S. spinosa que comprende:

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a) identificar y validar un sitio neutro en el genoma de S. spinosa, en donde un sitio neutro es uno que pueda ser interrumpido sin impactar negativamente en la produccion de espinosinas, el crecimiento de S. spinosa o en una caractenstica metabolica deseada, y

b) introducir en dicho sitio neutro un polinucleotido.

En una realizacion, el polinucleotido es heterologo. En una realizacion, el polinucleotido comprende al menos un casete de expresion genica. En una realizacion, el polinucleotido puede expresarse establemente en generaciones posteriores.

Los metodos adicionales de la presente invencion incluyen la integracion de polinucleotidos en el DNA cromosomico de especies de S. spinosa, que son utiles para la produccion de insecticidas, sus integrantes y tambien para el uso de los integrantes.

Portanto, la presente invencion proporciona tambien una celula hospedante de S. spinosa modificada geneticamen- te que comprende un polinucleotido integrado en un sitio neutro en el genoma de S. spinosa. Preferiblemente, la celula hospedante es generada por un metodo de la invencion. Una celula hospedante de la invencion puede ser una descendiente de una celula hospedante generada por un metodo de la invencion, y que es capaz de expresar establemente el polinucleotido. En una realizacion, el sitio neutro es el locus de la policetido-sintasa (PKS) de obscu- rina. En una realizacion, el sitio neutro es el gen obsA. Portanto, una celula hospedante modificada geneticamente de la invencion puede comprender un locus interrumpido de la policetido-sintasa (PKS) de obscurina, preferiblemente un gen obsA interrumpido. En una realizacion, el polinucleotido es heterologo. En una realizacion, el polinucleotido comprende al menos un casete de expresion genica. En una realizacion, el polinucleotido puede expresarse esta- blemente en las generaciones posteriores.

La presente invencion proporciona tambien el uso de una celula hospedante de S. spinosa modificada geneticamen- te, que comprende un polinucleotido integrado en un sitio neutro en el genoma de S. spinosa, para expresion esta- ble. En una realizacion, la celula hospedante es como se define en la presente memoria. En una realizacion, la celula hospedante se usa para la expresion recombinante de un producto genico. En una realizacion, la celula hospedante se utiliza para la expresion mejorada de una espinosina, preferiblemente A/D y/o J/L.

Otras realizaciones de la presente invencion pueden incluir la integracion de un polinucleotido en el genoma de S. spinosa, cuya expresion da como resultado un aumento en la produccion de espinosinas. Los metodos, las celulas hospedantes y los usos de la invencion pueden proporcionar la expresion de un gen potenciador de las espinosinas. Asf, en realizaciones, el polinucleotido integrado en un sitio neutro puede comprender un gen potenciador de las espinosinas. En una realizacion, el gen potenciador de las espinosinas puede codificar una protema de union al oxfgeno. En una realizacion, la protema de union al oxfgeno es una hemoglobina. En una realizacion, la protema de union al oxfgeno es la hemoglobina de Vitreoscilla (VHb) y el gen potenciador de espinosinas es el gen que codifica la hemoglobina de Vitreoscilla.

Otras realizaciones de la presente invencion pueden incluir la integracion de un polinucleotido en el genoma de S. spinosa sin impactar negativamente en la produccion, el crecimiento u otras caractensticas metabolicas deseadas de las espinosinas.

Otras realizaciones de la invencion proporcionan la expresion de genes que codifican enzimas biosinteticas de espinosinas. Dichas realizaciones permiten la produccion de nuevas espinosinas, de derivados de espinosinas naturales o la expresion alterada (preferiblemente mejorada) de las espinosinas naturales. Esto puede mejorar el espectro de la actividad insecticida y/o aumentar los niveles de tftulo de las espinosinas y/o impartir nuevas caractensticas bene- ficiosas a las cepas productoras de espinosinas existentes. Por tanto, las realizaciones de la presente invencion pueden incluir un metodo para mejorar la produccion de espinosinas, que comprende la integracion en un sitio neutro del genoma de S. spinosa, de un polinucleotido, en donde el polinucleotido comprende un gen que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. Se proporciona tambien una celula hospedante modificada geneticamente, que comprende un polinucleotido que comprende un gen que codifica una enzima biosintetica de espinosinas integrada en un sitio neutro del genoma de la celula hospedante. Se proporciona tambien el uso de una celula hospedante como se define en la presente memoria en la produccion mejorada de una espinosina. En una realizacion, el sitio neutro es como el definido en la presente memoria.

En realizaciones, la invencion proporciona la integracion de dos o mas genes potenciadores de las espinosinas y/o genes que codifican las enzimas biosinteticas de espinosinas. En una realizacion, se proporciona al menos un sitio neutro en el genoma de la celula hospedante. Se pueden proporcionar polinucleotidos heterologos adicionales en el mismo sitio neutro, en una localizacion genomica diferente o como una construccion de expresion no integrada.

La presente invencion incluye tambien dentro de su alcance un metodo para producir una nueva espinosina o un compuesto intermedio o derivado de espinosina, en una celula hospedante de S. spinosa, que comprende la integracion de un polinucleotido en el DNA cromosomico de una celula hospedante de S. spinosa, en donde el polinucleotido es capaz de interrumpir la expresion de un gen natural que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. Por tanto, en una realizacion, el metodo para expresar establemente un polinucleotido en S. spinosa comprende: c) la integracion de un polinucleotido en el DNA cromosomico de una celula hospedante de S. spinosa, en donde el polinucleotido es capaz de interrumpir la expresion de un gen natural que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. La presente invencion proporciona tambien una celula hospedante de S. spinosa modificada geneticamente

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que comprende un polinucleotido integrado en ella, en donde el polinucleotido es capaz de interrumpir la expresion de un gen natural que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. En una realizacion, la celula hospedante esta modificada geneticamente, comprendiendo un polinucleotido integrado en un sitio neutro en el genoma de S. spino- sa. La invencion proporciona tambien el uso de una celula hospedante modificada geneticamente que comprende un polinucleotido integrado en ella, en donde el polinucleotido es capaz de interrumpir la expresion de un gen natural que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. En realizaciones, la celula hospedante esta modificada geneticamente para comprender un polinucleotido integrado en un sitio neutro, como se define en la presente memoria.

Tambien se proporciona un metodo para mejorar la produccion de espinosad en una celula hospedante de S. Spino- sa o para mejorar el proceso de fermentacion de una cepa de S. spinosa, comprendiendo dicho metodo integrar en un genoma de S. spinosa, un agrupamiento de genes de policetido-sintasa de obscurina como un sitio neutro para la integracion y expresion de genes diana de interes. En una realizacion, el metodo comprende ademas la integracion de un polinucleotido en el locus heterologo de policetido-sintasa de obscurina, preferiblemente en el que el gen de PKS de obscurina, obsA, es el sitio de integracion. Tambien se proporciona una celula hospedante modificada geneticamente que comprende un locus heterologo de policetido-sintasa de obscurina. Tambien se proporciona el uso de una celula hospedante modificada geneticamente para expresion estable.

Tambien se proporciona una construccion de expresion que comprende un agrupamiento de genes de policetido- sintasa de obscurina, preferiblemente en donde la construccion de expresion es adecuada para la integracion en un genoma de la celula hospedante. Tambien se proporciona una celula hospedante modificada geneticamente que comprende una construccion de expresion que comprende un agrupamiento de genes de policetido-sintasa de obscurina, preferiblemente en donde la construccion de expresion es adecuada para la integracion en un genoma de la celula hospedante.

Tambien se proporciona un metodo para la integracion de un gen en el DNA cromosomico de una celula hospedante de S. spinosa, comprendiendo el metodo las etapas de:

a) crear una fagoteca para identificar un locus genomico;

b) clonar dos fragmentos de DNA genomico a partir del locus genomico, en el que un fragmento genomico se clona aguas arriba de un gen para integrar un polinucleotido y el segundo fragmento genomico se clona aguas abajo de un gen para integrar dicho polinucleotido y el fragmento de DNA ligado resultante se con- vierte en un plasmido de integracion;

c) introducir el plasmido de la etapa (b) en una cepa de S. spinosa por un metodo de transformacion;

d) obtener transconjugantes; y

e) cribar dichos transconjugantes para determinar la presencia de dicho polinucleotido.

En realizaciones, el polinucleotido es como se define en la presente memoria. En una realizacion, un fragmento genomico puede ser un fragmento interno como se define en la presente memoria. En una realizacion, puede ser un fragmento del agrupamiento de policetido-sintasa de obscurina, como se define en la presente memoria.

Tambien se proporciona una celula hospedante de S. spinosa modificada geneticamente, a la que se ha anadido, sustituido o delecionado un gen por integracion de un gen en el DNA cromosomico de acuerdo con el metodo de la invencion, en donde el gen que ha sido sustituido no es identico a un gen natural de S. spinosa. Tambien se proporciona una celula hospedante de S. spinosa modificada geneticamente, a la que se ha anadido, sustituido o delecionado un gen por integracion de un gen en el DNA cromosomico de acuerdo con el metodo definido de la invencion, en donde el gen que se ha anadido es identico a un gen natural de S. spinosa. En una realizacion, el gen se integra en el DNA cromosomico en un sitio neutro, preferiblemente el sitio neutro es el agrupamiento de genes de policetido- sintasa de obscurina, preferiblemente el gen obsA.

Tambien se proporciona un metodo para preparar una cepa de S. spinosa en la que un numero espedfico de copias de un gen elegido o de una molecula de DnA elegida se integran en un genoma de S. spinosa, en donde dicho me- todo comprende:

a) clonar dicho gen elegido o dicha molecula de DNA elegida en un elemento movil, en el que hay al menos

un gen marcador situado dentro del elemento movil;

b) integrar dicho elemento movil que contiene dicho gen elegido o dicha molecula de DNA elegida en el cro-

mosoma o episoma de dicha cepa de S. spinosa;

c) complementar dicho elemento movil con un gen funcional;

d) expresar dicho gen del elemento movil funcional;

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e) seleccionar dicha cepa en un medio que sea seleccionable para dicho gen marcador, de tal manera que se obtenga una cepa que contenga un numero espedfico de copias de dicho gen elegido o dicha molecu- la de DNA elegida; y

f) recuperar la cepa asf seleccionada.

En una realizacion, el cromosoma esta contenido en un plasmido y es introducido por transformacion. En una reali- zacion, el plasmido incluye un locus genomico utilizado para la integracion de un polinucleotido. En una realizacion, el locus genomico utilizado para la integracion de un polinucleotido es un locus de policetido-sintasa de obscurina, preferiblemente en el que el gen de PKS de obscurina, obsA, es el sitio de integracion. En una realizacion, el ele- mento movil es una construccion genetica.

Si bien en la presente solicitud se hace referencia espedfica a S. spinosa, se considera que la presente invencion en todos los aspectos y realizaciones es aplicable a cualquier especie productora de espinosinas.

En realizaciones, puede ser apropiada la transformacion de celulas hospedante por metodos distintos de la integracion genomica de un polinucleotido. Por ejemplo, cuando se proporcionan a la celula polinucleotidos adicionales.

Breve descripcion de los dibujos

Las realizaciones preferidas de la invencion se describen con referencia a los dibujos, en los cuales:

La FIG. 1 representa el mapa de la secuencia de los extremos de los clones de cosmidos en el agrupamiento de genes de obscurina. Se muestran clones de cosmidos solapantes. Las barras rellenas indica el tamano real de las inserciones en el clon de cosmidos 1E3 y el clon de cosmidos 2N14 relativos al agrupamiento de genes de obscurina. Las lmeas de puntos indican que solo un extremo del cosmido esta dentro de la agrupamiento de genes de obscurina.

La FIG.2 representa el plasmido pIJ773, que contiene el casete de expresion de resistencia a apramicina (mar- cado como aac(3) IV).

La FIG. 3 representa el plasmido pDAB109000 que contiene el fragmento de DNAsintetico de 977 pb con pJ201.

La FIG. 4 representa el plasmido pDAB109001 que resulto de la clonacion del casete de expresion del gen de la hemoglobina en pIJ773.

Descripcion detallada de la invencion

Las herramientas moleculares utiles para la ingeniena metabolica para la mejora de la cepa de espinosinas incluyen la identificacion y validacion de sitios neutros en el genoma de S. spinosa donde se puedan introducir casetes de expresion genica. Los sitios neutros se definen como regiones de DNA en el genoma, que tienen poco o ningun impacto negativo sobre las actividades metabolicas primarias de S. spinosa, la produccion de espinosinas y opcio- nalmente otras caractensticas deseadas. Los sitios neutros identificados estan destinados a la integracion estable y a la expresion opcional de polinucleotidos diana ya sean naturales o heterologos en S. spinosa que a modo de ejemplo pueden incluir: i) la introduccion de caractensticas beneficiosas en las cepas productoras de espinosinas existentes, preferiblemente una caractenstica que no haya mostrado el mismo tipo celular que no habfa sido modifi- cado geneticamente de acuerdo con la invencion, tal como la expresion de un gen heterologo de la hemoglobina; ii) la mejora de las caractensticas espedficas de las cepas productoras de espinosinas existentes (por ejemplo, la mejora de la byconversion de pseudoagliconas en espinosinas); iii) la introduccion de multiples copias del mismo (los mismos) polinucleotido(s) en uno o mas sitios neutros, por ejemplo para maximizar el beneficio del (de los) poli- nucleotido(s) diana y asegurar la estabilidad de las cepas recombinantes tratadas geneticamente; o iv) la introduc- cion de multiples polinucleotidos diana para desbloquear simultaneamente (por ejemplo, superar o mejorar) dos o mas etapas limitadoras de velocidad que controlan la biosmtesis y produccion de espinosinas. Los genes responsa- bles de las vfas metabolicas secundarias en S. spinosa, no esenciales para las actividades metabolicas primarias del organismo, representan una fuente atractiva para los sitios neutros. De estos, los agrupamientos de genes de policetido-sintasa no de espinosinas son de particular interes ya que la interrupcion de los agrupamientos de genes puede dar como resultado la eliminacion de potenciales vfas competidoras de los precursores y cofactores comunes de acil-CoA esenciales para la biosmtesis y produccion de espinosinas. Esto puede crear una sinergia entre los benefi- cios de los genes diana y una mayor disponibilidad de los precursores.

Existen muchos usos diferentes para los genes integrados dentro del cromosoma de Saccharopolyspora spinosa. Los genes clonados se pueden usar para mejorar los rendimientos de espinosinas y para producir nuevas espinosinas. Se pueden obtener mejores rendimientos integrando en el genoma de una cepa particular una copia duplicada del gen para superar una enzima que es limitante de la velocidad en dicha cepa. En algunos casos, cuando en una cepa mutante particular la via biosintetica esta bloqueada debido a la falta de una enzima requerida, la produccion de las espinosinas deseadas se puede restaurar integrando una copia del gen requerido. En otros casos en los que esta interrumpida una via biosintetica, se puede crear una cepa precursora diferente.

Las siguientes definiciones se utilizan en la presente memoria y deben ser remitidas a la interpretacion de las reivin- dicaciones y la parte descriptiva de la memoria.

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Como se usa en la presente memoria, se entiende que los artfculos indefinidos "un" y "una" precediendo a un ele- mento o componente de la invencion no son restrictivos respecto al numero de casos (es dedr, incidencias) del elemento o componente. Por tanto, "un" o "una" se debe leer como que incluye uno o al menos uno, y la forma en singular del elemento o componente incluye tambien el plural salvo que el numero se entienda claramente que es el singular.

Como se usan en la presente memoria, los terminos "que comprende" y "que incluye" significan la presencia de las caractensticas, numeros enteros, etapas o componentes establecidos como se citan en las reivindicaciones, pero que no excluyen la presencia o adicion de una o mas de otras de sus caractensticas, numeros enteros, etapas, componentes o grupos. Esto significa que una composicion, una mezcla, un proceso, un metodo, un artfculo o un aparato que "comprende" o "incluye" una lista de elementos no esta limitado solo a los elementos sino que puede incluir otros no expresamente incluidos en la lista o inherentes a ella. Como se usa en la presente memoria, "o" se refiere a un "o" inclusivo y exclusivo. Por ejemplo, una condicion A o B es satisfecha por una cualquiera de las si- guientes: A es verdadera (o esta presente) y B es falsa (o no esta presente), A es falsa (o no esta presente) y B es verdadera (o esta presente) y tanto A como B son verdaderas (o estan presentes).

Como se usa en la presente memoria, el termino "aproximadamente" se refiere a la modificacion de la cantidad de un ingrediente o reaccionante de la invencion o cuando se emplea se refiere a la variacion en la cantidad numerica que puede ocurrir, por ejemplo, en los procedimientos tfpicos de medicion y manipulacion de lfquidos utilizados para la preparacion de concentrados o el uso de soluciones en la practica; en un error involuntario en estos procedimientos; en diferencias en la fabricacion, fuente o pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o llevar a cabo los metodos; y similares. El termino "aproximadamente" abarca tambien cantidades que difieren de- bido a las diferentes condiciones de equilibrio para una composicion que resulta de una mezcla inicial particular. Sean o no modificadas por el termino "aproximadamente", las reivindicaciones incluyen equivalentes a las cantida- des.

Como se usa en la presente memoria, el termino “invencion” o “presente invencion” es un termino no limitativo y esta destinado a abarcartodas las posibles variaciones que se describen en la memoria descriptiva y se describen en las reivindicaciones

Como se utiliza en la presente memoria, los terminos "polipeptido" y "peptido" se usaran indistintamente para referir- se a un polfmero de dos o mas aminoacidos unidos entre sf por un enlace peptidico. En un aspecto, este termino tambien incluye modificaciones del polipeptido posteriores a la expresion, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Incluidos en la definicion estan, por ejemplo, peptidos que contienen uno o mas analogos de un aminoacido o aminoacidos marcados y peptidomimeticos. Los peptidos pueden comprender L-aminoacidos. La referencia en la presente memoria a "polipeptido", "peptido" y "protema" incluye sus fragmentos, derivados y variantes.

Como se usa en la presente memoria, los terminos "peptido de interes", "POI" (abreviatura de la expresion inglesa product of interest), "producto genico", "producto genico diana" y "producto genico con la region codificadora diana" se refieren al producto peptidico/protemico deseado codificado por el gen expresado. El peptido de interes puede incluir cualquier producto peptidico/protemico, incluyendo, aunque sin limitacion, protemas, protemas de fusion, enzimas, peptidos, polipeptidos y oligopeptidos. El peptido de interes tiene una longitud que vana desde 2 a 398 aminoacidos. El producto peptidico/protemico deseado puede ser un peptido/protema heterologo, expresado por un gen extrano (es decir, no natural).

Como se utiliza en la presente memoria, el termino "construccion genetica" se refiere a una serie de acidos nucleicos contiguos utiles para modular el genotipo o fenotipo de un organismo. Ejemplos no limitantes de construcciones geneticas incluyen, aunque sin limitacion, una molecula de acido nucleico y un marco de lectura abierto, un gen, un casete de expresion, un vector, un plasmido y similares.

Como se utiliza en la presente memoria, el termino "gen endogeno" se refiere a un gen natural en su localizacion natural en el genoma de un organismo.

Como se utiliza en la presente memoria, un "gen extrano" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo hospedante, pero que es introducido en el organismo hospedante por transferencia de genes. Los genes extranos pueden comprender genes naturales insertados en un organismo no natural o genes quimericos. Un gen extrano tambien puede ser denominado un gen no natural. Un gen extrano esta preferiblemente optimizado en sus codones para su expresion en una celula hospedante, preferiblemente cuando la celula hospedante es S. spino- sa. La optimizacion adecuada para la expresion en S. spinosa se incluye en la Tabla 2.

La referencia en la presente memoria a un "gen" incluye, para los fines de la invencion, cualquier secuencia codificadora o secuencia de control, o sus fragmentos. Un gen puede incluir cualquier combinacion de secuencia codificadora y secuencia de control, o sus fragmentos. Por lo tanto, un "gen" como se cita en la presente memoria puede ser todo o parte de un gen natural. Una secuencia de polinucleotido como se cita en la presente memoria se puede usar indistintamente con el termino "gen", o puede incluir cualquier secuencia codificadora, secuencia no codificadora o secuencia de control, sus fragmentos y sus combinaciones.

Como se usa en la presente memoria, el termino "heterologo" con respecto a una secuencia dentro de un organis- mo/genoma particular indica que la secuencia se origina a partir de una especie extrana, o, si procede de la misma

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especie, esta sustancialmente modificada a partir de su forma natural en composicion y/o locus genomico y/o nume- ro de copias por intervencion humana deliberada. Portanto, cuando el gen es un gen natural, puede ser heterologo si ha sido mutado, replicado (es decir, aumentado el numero de copias) o movido (es decir, su localizacion dentro de la celula). As^ por ejemplo, la expresion genica heterologa se refiere al proceso de expresar un gen a partir de un organismo/genoma colocandolo en el genoma de un organismo/genoma diferente.

Como se usa en la presente memoria, el termino "recombinante" se refiere a una combinacion artificial de dos seg- mentos de secuencia que estanan de otro modo separados, por ejemplo, por smtesis qmmica o por la manipulacion de segmentos aislados de acidos nucleicos portecnicas de ingeniena genetica. "Recombinante" incluye tambien la referencia a una celula o vector, que ha sido modificado por la introduccion de un acido nucleico heterologo o una celula procedente de una celula asf modificada, pero no abarca la alteracion de la celula o vector por episodios que ocurren de forma natural (por ejemplo, mutacion espontanea, transformacion natural, transduccion natural, transpo- sicion natural), tales como los que se producen sin intervencion humana deliberada. Una celula hospedante recombinante de la presente invencion sera distinguible de una celula de origen natural de la misma especie en virtud de la presencia en ella de DNA extrano (por ejemplo, marcadores de seleccion, vectores, genes no naturales), o en virtud de una estructura genetica alterada (por ejemplo, eliminacion o interrupcion de secuencias naturales, cambios en la orientacion de las secuencias naturales, promotores alterados u otras secuencias de control, numeros de copia alte- rados, localizacion alterada de secuencias naturales). Ademas de lo anterior, una celula hospedante recombinante de la invencion mostrara preferiblemente mejores caractensticas metabolicas, tales como mejor produccion de espi- nosinas en comparacion con una celula no modificada del mismo tipo. Con referencia a la celula, recombinante puede ser utilizado indistintamente con el termino "modificada geneticamente".

Una "cepa" como se denomina en la presente memoria es una poblacion de celulas que desciende de un solo orga- nismo o que es un material aislado de un cultivo sustancialmente puro. En una realizacion, una cepa puede com- prender al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de celulas hospedantes modificadas geneticamente, tal como se define en la presente memoria.

El termino "modificado geneticamente" o "alterado geneticamente" significa la alteracion cientffica de la estructura del material genetico de un organismo vivo. Implica la produccion y uso del DNA recombinante. Mas en particular, se usa para definir el organismo geneticamente disenado o modificado a partir del organismo de origen natural. La modificacion por ingeniena genetica se puede realizar por varios metodos conocidos en la tecnica, tales como por ejemplo, sustitucion de genes, amplificacion de genes, interrupcion de genes, transfeccion, transformacion utilizando plasmidos, virus u otros vectores. Un organismo modificado geneticamente, por ejemplo, un microorganismo modificado geneticamente, se denomina tambien a menudo un organismo recombinante, por ejemplo, un microorganismo recombinante.

Como se utiliza en la presente memoria, el termino "interrumpido" o "interrupcion" se refiere a un gen que ha sido manipulado o modificado por ingeniena genetica o por causas naturales que cambian la actividad de un gen. Dicha actividad genica se puede aumentar o disminuir, en comparacion con la actividad genica no interrumpida. Ademas, dicha interrupcion puede alterar o suprimir la expresion y/o funcion de las protemas. La interrupcion que causa una disminucion en la actividad de los genes puede ser una reduccion del numero de copias de un gen, provocando asf la subexpresion del gen. Se dice que un gen esta "subexpresado" si esta reducido el nivel de transcripcion de dicho gen en comparacion con un gen no interrumpido (por ejemplo, el gen de tipo natural). Esto se puede medir, por ejemplo, por analisis de transferencia de Northern cuantificando la cantidad de mRNA como indicacion de la expresion genica. Como se usa en la presente memoria, un gen se subexpresa si disminuye la cantidad de mRNA gene- rado en al menos 1%, 2%, 5% 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% o incluso mas de 500%, en comparacion con la cantidad de mRNA generado a partir de un gen no interrumpido (por ejemplo, gen de tipo natural). Alternativamente, la interrupcion puede incluir la expresion del gen a partir de una secuencia de control debil, tal como un promotor, en comparacion con el promotor natural. En otra realizacion, se pueden alterar el promotor, la region reguladora y/o el sitio de union al ribosoma aguas arriba del gen para lograr la expresion reducida. En otra realizacion, tambien se puede reducir la expresion disminuyendo la semivida relativa del RNA mensajero. En otra realizacion, se puede disminuir la actividad de un polipeptido propiamente dicho, por ejemplo empleando una o mas mutaciones en la secuencia de aminoacidos del polipeptido, que disminuyen la actividad. Por ejemplo, la alteracion de la afinidad del polipeptido para su sustrato correspondiente puede dar lugar a una actividad reducida. Igualmente, se puede disminuir la semivida relativa del polipeptido. En cualquier caso, sea la expresion del gen reducida o la actividad reducida, la reduccion se puede conseguir alterando la composicion de los medios de cultivos celulares y/o los metodos utili- zados para el cultivo. "Expresion reducida" como se utiliza en la presente memoria significa una disminucion de al menos 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% o incluso mas de 500%, en comparacion con la cantidad de mRNA o protema generados en comparacion con el gen no interrumpido (por ejemplo, un gen de tipo natural). "Actividad reducida" como se usa en la presente memoria, significa una disminucion de al menos 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% o incluso mas de 500%, en comparacion con la actividad o concentracion de la protema, polinucleotido o gen antes de la interrupcion. La actividad de una protema tambien se puede reducir poniendo en contacto la protema con un inhibidor espedfico o general de su actividad. Los terminos "actividad reducida", "actividad disminuida o suprimida" se usan indistintamente en la presente memoria.

En otra realizacion, la interrupcion puede aumentar la actividad o expresion de un gen. Una secuencia de control, tal como el promotor, la region reguladora y/o el sitio de union al ribosoma aguas arriba del gen se puede alterar para lograr el aumento de la expresion. En otra realizacion, el aumento de la expresion se puede lograr aumentando el

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numero de copias del gen. En una realizacion, la sobreexpresion tambien se puede lograr aumentando la semivida relativa del RNA mensajero. En otra realizacion, la actividad del polipeptido propiamente dicho se puede aumentar realizando una o mas mutaciones en la secuencia de aminoacidos del polipeptido, lo que aumentana la actividad. Por ejemplo, la alteracion de la afinidad del polipeptido para su sustrato correspondiente puede dar como resultado mayor actividad. Igualmente, se puede aumentar la semivida relativa del polipeptido. En cualquiera caso, sea la sobreexpresion del gen o la actividad aumentada, el aumento puede conseguirse alterando la composicion de los medios de cultivos celulares y/o los metodos utilizados para el cultivo. "Sobreexpresion" o "actividad aumentada" como se usa en la presente memoria significa un aumento de al menos 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% o incluso mas de 500%, en comparacion con una protema, polinucleotido o gen de tipo natural; o la actividad y/o la concentracion de la protema presente antes de la interrupcion para aumentar la expresion y/o la actividad. La actividad de una protema tambien se puede aumentar poniendo en contacto la protema con un inhibidor espedfico o general de su actividad. Los terminos "sobreexpresion" y "actividad aumentada" se pueden utilizar indistintamente.

"Alterar" con referencia a los cambios en la expresion o actividad puede incluir mutacion, sustitucion, delecion o adicion de una secuencia genica de control o secuencia de polinucleotido o sus fragmentos.

En la presente memoria, mejora o aumento de la produccion de espinosinas significa un aumento en la cantidad de una o mas espinosinas naturales o la produccion de una o mas nuevas espinosinas, en comparacion con la produccion de espinosinas por una celula hospedante del mismo tipo cuando se desarrolla en las mismas condiciones (por ejemplo, fermentacion en un matraz con agitacion) durante el mismo penodo de tiempo. Preferiblemente, los metodos y las celulas hospedantes de la presente invencion proporcionan un aumento en el tftulo de las espinosinas naturales de al menos 4%, 4,6%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o al menos 100%.

La expresion "secuencias de control" se refiere colectivamente a secuencias promotoras, sitios de union al ribosoma, secuencias de terminacion de la transcripcion, dominios reguladores aguas arriba, potenciadores y similares, que proporcionan colectivamente la transcripcion y traduccion de una secuencia codificadora en una celula hospedante. Una cualquiera o mas de las "secuencias de control" antes mencionadas seleccionadas del grupo antes mencionado se puede proporcionar en un casete de expresion. No todas estas secuencias de control necesitan siempre estar presentes en un vector recombinante, siempre que el gen deseado sea capaz de sertranscrito y traducido.

En la presente memoria, la referencia a DNA cromosomico o al genoma de la celula hospedante se puede usar indistintamente.

"Recombinacion" se refiere a la redistribucion de secciones de secuencias de DNA o RNA entre dos moleculas de DNA o RNA. La "recombinacion homologa" se produce entre dos moleculas de DNA que se hibridan en virtud de las secuencias de nucleotidos homologas o complementarias presentes en cada molecula de DNA.

La referencia en la presente memoria a un "gen potenciador de espinosinas" incluye cualquier secuencia de polinucleotido que, cuando se proporciona en una celula hospedante de S. spinosa, tiene el efecto de aumentar la expresion o actividad de una espinosina natural, o permitir la expresion de una nueva espinosina o un derivado de una espinosina natural. Un gen potenciador de espinosinas puede ser una secuencia de control o una secuencia codificadora, o ambas, o sus fragmentos. Tambien estan incluidos sus derivados y variantes de genes potenciadores de espinosinas naturales. En una realizacion, un gen potenciador de espinosinas puede codificar una protema que se une al oxfgeno. Ademas, la protema que se une al oxfgeno puede ser cualquier protema que se una al oxfgeno, en particular las que se unen al oxfgeno de forma reversible, tales como las globinas. Un gen potenciador de espinosinas puede ser un gen que codifica una enzima biosintetica de espinosinas.

Las "protemas que se unen al oxfgeno" que se pueden utilizar en la invencion incluyen, aunque sin limitacion, hemo- globina de Vitreoscilla (VHb), flavohemoprotema de Alcaligenes eutrophus, mioglobina de corazon de caballo, he- moprotema de E. coli, hemoprotema de B. subtilis, flavohemoglobina de levadura, leghemoglobina de soja, leghe- moglobina de altramuz y mioglobina de esperma de ballena. Como se ha indicado antes, la protema que se une al oxfgeno tambien puede ser una protema que sea endogena del organismo productor de espinosinas. Alternativa- mente, la protema que se une al oxfgeno puede ser heterologa del organismo productor de espinosinas.

Un "sitio neutro" para la integracion de un casete de expresion genica es aquel que codifica un producto genico que no esta implicado en una via metabolica primaria y no se requiere preferiblemente para la produccion de espinosinas. Un sitio neutro puede ser uno que codifica un gen que no es necesario para el desarrollo y/o division de la celula. Portanto, si se interrumpe el gen en el sitio neutro, una celula hospedante modificada geneticamente presentara un metabolismo primario y un desarrollo comparable al de una celula hospedante del mismo tipo que no ha sido modificada geneticamente, cuando se mantiene en las mismas condiciones. Un sitio neutro puede ser un sitio de un gen implicado en una via metabolica secundaria, por ejemplo el locus de la policetido-sintasa (PKS) de obscurina, dando como resultado preferiblemente la inactivacion de un gen natural, obsA. La secuencia de un fragmento del gen obsA se proporciona en la presente memoria como SEQ ID NO 8. Cuando el sitio neutro es un gen, la interrupcion puede ser en un elemento de control del gen o en la secuencia codificadora del gen, o en ambos. Alternativa- mente, un sitio neutro puede ser un sitio que no es un gen.

Una via metabolica primaria incluye las vfas esenciales para la supervivencia celular, por ejemplo la glicolisis, la via de la pentosa-fosfato, el ciclo de TCA y la biosmtesis de aminoacidos. Una via metabolica secundaria es una que esta implicada en la produccion de un metabolito secundario, es decir, que no es necesaria para la supervivencia de

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Los terminos "condiciones restrictivas" o "hibridacion en condiciones restrictivas" se refieren a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridara preferiblemente con su subsecuencia diana, y en menor grado, o nada en absoluto, a otras secuencias. La "hibridacion restrictiva" y las "condiciones de lavado en la hibridacion restrictiva" en el contexto de los experimentos de hibridacion de acidos nucleicos, tales como hibridaciones de Southern y de Northern, son dependientes de las secuencias y son diferentes bajo diferentes parametros ambientales. Una amplia gma para la hibridacion de acidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, Elsevier, New York. En general, se seleccionan condiciones de hibridacion y de lavado altamente restrictivas para que sean aproximadamente 5°C inferiores al punto de fusion termico (Tm) para la secuencia espedfica a una fuerza ionica y un pH definidos. El Tm es la temperatura (bajo una fuerza ionica y un pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Se seleccionan condiciones muy restrictivas para que sean iguales al Tm para una sonda particular.

Un ejemplo de condiciones de hibridacion restrictivas para la hibridacion de acidos nucleicos complementarios que tienen mas de 100 residuos complementarios en un filtro en una transferencia de Southern o Northern es 50% de formamida con 1 mg de heparina a 42°C, realizandose la hibridacion durante una noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente restrictivas es con NaCl 0,15 M a 72°C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado restrictivas es un lavado con 0,2xSSC a 65°C durante 15 minutos (vease, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, para la descripcion del tampon SSC). Frecuentemente, un lavado muy restrictivo esta precedido de un lavado poco restrictivo para eliminar la senal de la sonda de fondo. Un ejemplo de lavado restrictivo medio para un duplex de, por ejemplo, mas de 100 nucleotidos, es 1xSSC a 45°C durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado poco restrictivo para un duplex de, por ejemplo, mas de 100 nucleotidos, es 4-6xSSC a 40°C durante 15 minutos. En general, una relacion senal a ruido de 2x (o superior) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridacion particular indica la deteccion de una hibridacion espedfica. Los acidos nucleicos que no se hibridan entre sf en condiciones restrictivas son todavfa sustancialmente identicos si los polipeptidos que codifican son sus- tancialmente identicos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un acido nucleico usando la maxima degeneracion de codones permitida por el codigo genetico.

La invencion se refiere tambien a un polinucleotido aislado hibridable en condiciones restrictivas, preferiblemente en condiciones muy restrictivas, con un polinucleotido como el de la presente invencion.

Como se utiliza en la presente memoria, se pretende que el termino "hibridacion" describa condiciones para hibrida- cion y lavado bajo las cuales secuencias de nucleotidos homologas entre sf, en al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, mas preferiblemente al menos aproximadamente 80%, incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente 85% a 90%, lo mas preferiblemente al menos 95%, se mantienen tfpicamente hibridadas entre sf.

En una realizacion, un acido nucleico de la invencion es al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mas homologo de una secuencia de acido nucleico mostrada en esta solicitud o de sus complementos.

Otro ejemplo no limitativo de condiciones de hibridacion restrictivas es la hibridacion en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por uno o mas lavados en 1xSSC, 0,1% de SDS a 50°C, preferiblemente a 55°C, mas preferiblemente a 60°C e incluso mas preferiblemente a 65°C.

Las condiciones altamente restrictivas pueden incluir incubaciones a 42°C durante un penodo de varios dfas, tal como 2-4 dfas, utilizando una sonda de DNA marcada, tal como una sonda de DNA marcada con digoxigenina (DIG), seguidas de uno o mas lavados con 2xSSC, 0,1% de SDS a temperatura ambiente y uno o mas lavados con 0,5xSsC, 0,1% de SDS o con 0,1xSSC, 0,1% de SDS a 65-68°C. En particular, las condiciones altamente restrictivas incluyen, por ejemplo, una incubacion de 2 horas a 4 dfas a 42°C utilizando una sonda de DNA marcada con DIG (preparada, por ejemplo, usando un sistema de marcaje con DIG; Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Alemania) en una solucion, tal como solucion DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH) con o sin 100 pg/mL de DNA de esperma de salmon, o una solucion que comprende 50% de formamida, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato trisodico 15 mM), 0,02% de dodecilsulfato de sodio, 0,1% de N-lauroilsarcosina y 2% de reactivo de bloqueo (Roche Diagnostics GmbH), seguido de lavado de los filtros dos veces durante 5 a 15 minutos con 2xSSC y 0,1% de SDS a temperatura ambiente y despues lavado dos veces durante 15-30 minutos con 0,5xSSC y 0,1% de SDS o 0,1xSSC y 0,1% de SDS a 65-68°C.

En algunas realizaciones, una molecula de acido nucleico aislada de la invencion que se hibrida en condiciones altamente restrictivas con una secuencia de nucleotidos de la invencion puede corresponder a una molecula de acido nucleico de origen natural. Como se usa en la presente memoria, una molecula de acido nucleico "de origen natural" se refiere a una molecula de RNA o DNA que tiene una secuencia de nucleotidos que existe en la naturale- za (por ejemplo, codifica una protema natural).

Un experto en la tecnica sabra que condiciones aplicar para condiciones de hibridacion restrictivas y altamente restrictivas. Las directrices adicionales con respecto a estas condiciones estan facilmente disponible en la tecnica, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Au-

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subel et al., (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, N.Y.).

La presente invencion incluye dentro de su alcance un metodo para mejorar la produccion de espinosinas en una celula hospedante de S. spinosa, que comprende integrar un polinucleotido en un sitio neutro del DNA cromosomico de una celula de S. spinosa, en el que el polinucleotido comprende un gen que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. La presente invencion tambien proporciona una celula hospedante de S. spinosa modificada genetica- mente que comprende un polinucleotido integrado en un sitio neutro del genoma, en el que el polinucleotido comprende un gen potenciador de espinosinas y/o un gen que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. La presente invencion se refiere tambien al uso de una celula hospedante de S. spinosa que comprende un polinucleotido integrado en un sitio neutro del genoma en la produccion de una espinosina, en donde el polinucleotido comprende un gen potenciador de espinosinas y/o un gen que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. En una realizacion, una celula hospedante de la invencion muestra mejor produccion de espinosinas, preferiblemente produccion de las espinosinas A/D o produccion de las espinosinas j/l en la fermentacion en un matraz con agitacion.

Un polinucleotido que contiene un gen para una enzima biosintetica de espinosinas permitina el suministro o la du- plicacion de genes que codifican enzimas limitantes de la velocidad en la produccion de espinosinas. Este podna ser utilizado para aumentar el rendimiento en cualquier circunstancia cuando una de las actividades codificadas limita la smtesis de la espinosina deseada. Se observo un aumento en el rendimiento de las espinosinas A/D cuando se duplicaron genes unidos a la policetido-sintasa de espinosinas integrando un cosmido que los contienen en S. spinosa (Madduri et al., 2001). En otro ejemplo, se logro un aumento del rendimiento de estetipo en fermentaciones de Streptomyces fradiae duplicando el gen que codifica una metiltransferasa limitante de la velocidad que convierte macrocina en tilosina (Baltz et al., 1997).

En una realizacion, la presente invencion proporciona el suministro en una celula hospedante de un gen que codifica una enzima biosintetica de espinosina, en combinacion con el suministro de un gen potenciador de espinosinas, que en una realizacion puede codificar una protema que se une al oxfgeno. Por tanto, la invencion proporciona mayor produccion de espinosinas por la expresion heterologa de un gen potenciador de espinosinas y la co-expresion de una enzima biosintetica de espinosinas heterologa. Se proporcionan metodos, celulas hospedantes y usos de la invencion relacionados con esta realizacion.

La presente invencion incluye tambien dentro de su alcance un metodo para producir una nueva espinosina o un compuesto intermedio o derivado de espinosina, en una celula hospedante de S. spinosa, que comprende la inte- gracion de un polinucleotido en el DNA cromosomico de una celula hospedante de S. spinosa, en donde el polinucleotido es capaz de interrumpir la expresion de un gen natural que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. En una realizacion, el polinucleotido comprende un fragmento interno de un gen natural que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. La presente invencion proporciona tambien una celula hospedante de S. spinosa modificada geneticamente que comprende un polinucleotido integrado en ella, en donde el polinucleotido es capaz de interrumpir la expresion de un gen natural que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. En una realizacion, el polinucleotido comprende un fragmento interno de un gen natural que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. La presente invencion se refiere tambien al uso de una celula hospedante de S. spinosa que comprende un polinucleotido integrado en ella en la produccion de una espinosina, en donde el polinucleotido es capaz de interrumpir la expresion de un gen natural que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. En una realizacion, el polinucleotido comprende un fragmento interno de un gen natural que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. En una realizacion, una celula hospedante de S. spinosa de la invencion muestra mejor produccion de espinosinas, preferiblemente produccion de las espinosinas A/D o produccion de las espinosinas J/L en la fermentacion en un matraz con agitacion. En una realizacion, se puede proporcionar un gen heterologo que codifica una enzima biosintetica de espinosinas en la celula hospedante modificada geneticamente. El gen heterologo puede codificar la misma enzima biosintetica de espinosinas o una enzima biosintetica de espinosinas diferente. El gen heterologo puede codificar una enzima biosintetica de espinosinas natural o uno de sus mutantes, derivados, fragmentos o variantes. De este modo, la invencion en una realizacion proporciona un metodo para producir una nueva espinosina o un compuesto intermedio o derivado de espinosinas, en una celula hospedante de S. spinosa, que comprende: a) integrar un polinucleotido en el DNA cromosomico de una celula hospedante de S. spinosa, en donde el polinucleotido es capaz de interrumpir la expresion de un gen natural que codifica una enzima biosintetica de espinosinas; y b) integrar en un sitio neutro en el genoma de la celula hospedante un gen heterologo que codifica una enzima biosintetica de espinosinas y/o un gen potenciador de espinosinas heterologo. Tambien se proporciona una celula hospedante modificada geneticamente que comprende un polinucleotido integrado en ella, en el que el polinucleotido es capaz de interrumpir la expresion de un gen natural que codifica una enzima biosintetica de espinosinas y que comprende ademas un gen heterologo que codifica una enzima biosintetica de espinosinas y/u opcionalmente un gen potenciador de espinosinas heterologo. Tambien se proporciona el uso de dicha celula hospedante para la mejor produccion de una espinosina.

Asf, los compuestos intermedios espedficos (o sus derivados naturales) podnan ser sintetizados por cepas mutantes de S. spinosa en las que se han interrumpido ciertos genes que codifican enzimas para la biosmtesis de espinosinas. Dichas cepas se pueden generar integrando, por ejemplo por recombinacion homologa, una secuencia mu- tagenica que contiene un fragmento interno del gen diana. Tras la integracion, se forman dos copias incompletas del gen biosintetico, eliminando de este modo la funcion enzimatica codificada. El sustrato para esta enzima, o alguno de sus derivados naturales, debena acumularse tras la fermentacion de la cepa mutante. Dicha estrategia se utilizo

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eficazmente para generar una cepa de Saccharopolyspora erythraea produciendo nuevos derivados de 6- desoxieritromicina (Weber & McAlpine, 1992).

Dichas cepas podnan ser generadas intercambiando la region diana, por recombinacion homologa cruzada doble, con un plasmido mutagenico que contiene el nuevo fragmento entre secuencias no mutadas, que flanquean la region diana. El gen tnbrido producina una protema con funciones alteradas, que carece de una actividad o que realiza una nueva transformacion enzimatica. Tras la fermentacion de la cepa mutante se acumulana un nuevo derivado. Dicha estrategia se utilizo para generar una cepa de Saccharopolyspora erythraea produciendo un nuevo derivado de anhidroeritromicina (Donadio et al., 1993).

Se clonaron los genes que codifican enzimas biosinteticas de espinosinas y marcos de lectura abiertos “ORF” rela- cionados para uso en la presente invencion y se determino la secuencia de DNA de cada uno. Los genes clonados y los ORF se denominan de aqu en adelante spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnl, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, ORFL15, OrFl16, ORFR1, ORFR2, S. spinosa gtt, S. spinosa gdh, S. spinosa epi y S. spinosa kre. Las secuencias de los genes biosinteticos de espinosinas son conocidas en la tecnica y estan definidas en US2004/002343 (solicitud N° 10/329148) por las bases 21111-28898, 28916-35374, 35419-44931, 44966-59752, 59803-76569, 20168-20995, 18541-19713, 17749-18501, 16556-17743, 14799-16418, 13592-14785, 12696-13547, 11530-12492, 10436-11434, 8967-10427, 7083-8450, 5363-6751, 4168-5325, 34164165, 2024-2791, 1135-1971, 76932-77528 y 77729-79984 de la SEQ ID NO: 1, las bases 334-1119 de la SEQ ID NO: 27, las bases 88-1077 de la SEQ ID NO 24, las bases 226-834 de la SEQ ID NO 31 y las bases 1165-1992 de la SEQ ID NO: 24, respectivamente. La referencia en la presente memoria a un gen que codifica una enzima biosin- tetica de espinosinas incluye cualquiera de los genes y de los ORF antes mencionados, asf como cualesquiera genes y ORF adicionales conocidos por un experto en la tecnica. Portanto, la presente invencion comprende el uso de uno o mas genes seleccionados del grupo antes mencionado, o sus fragmentos, derivados o variantes.

La Saccharopolyspora spinosa produce una mezcla de nueve compuestos muy relacionados denominados colecti- vamente "espinosinas". Dentro de la mezcla, las espinosinas A y D, conocidas como espinosad, son los componen- tes principales y tienen actividad contra insectos diana claves. Las espinosinas J y L, dos de los componentes mino- ritarios dentro de la mezcla de espinosinas, son los precursores de espinotoram, otro insecticida de espinosina.

Espinosad es un insecticida producido por Dow AgroSciences (Indianapolis, Ind.) que esta constituido principalmente por aproximadamente 85% de espinosina A y aproximadamente 15% de espinosina D. Las espinosinas A y D son productos naturales producidos por fermentacion de Saccharopolyspora spinosa, como se ha descrito en la Patente de EE.UU. N° 5.362.634. El espinosad es un ingrediente activo de varias formulaciones insecticidas disponible co-

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mercialmente de Dow AgroSciences, que incluye los productos para el control de insectos TRACER , SUCCES ,

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SPINTOR y CONSERVE . Por ejemplo, el producto TRACER esta constituido por aproximadamente 44% a aproximadamente 48% de espinosad (p/v) o aproximadamente 479 gramos de espinosad por litro (4 libras por galon). Se ha establecido la utilidad de los compuestos de espinosinas en formulaciones granulares y lfquidas para el control de aracnidos, nematodos e insectos, en particular, las especies de lepidopteros, tisanopteros y dfpteros. Las espinosinas A y D tambien se denominan en la presente memoria espinosinas A/D.

Espinotoram es una mezcla de 5,6-dihidro-3'-etoxi-espinosina J (componente principal) y 3'-etoxi-espinosina L pro- ducidas por Dow AgroSciences. La mezcla se puede preparar por etoxilacion de una mezcla de espinosina J y espinosina L, seguida por hidrogenacion. El doble enlace en 5,6 de la espinosina J y su derivado 3'-etoxi se hidrogenan mucho mas facilmente que el de la espinosina L y su derivado 3'-etoxi, debido al impedimento esterico por el grupo metilo en C-5 en la espinosina L y su derivado 3'-etoxi. Vease, la Patente de EE.UU. N° 6.001.981. Las espinosinas J y L tambien se denominan en la presente memoria espinosinas J/L.

En la presente memoria se utiliza la anotacion convencional para describir secuencias polinucleotidicas: el extremo izquierdo de una secuencia polinucleotfdica monocatenaria es el extremo 5'; la direccion hacia la izquierda de una secuencia polinucleotfdica bicatenaria se denomina direccion 5'. La direccion de la adicion de 5 'a 3' de nucleotidos a los transcritos de RNA nuevos se denomina la direccion de transcripcion. La cadena de DNA que tiene la misma secuencia que un mRNA se denomina "cadena codificadora"; las secuencias en la cadena de DNA que tienen la misma secuencia que un mRNA transcrito a partir de dicho DNA y que estan situadas 5' hasta el extremo 5' del transcrito de RNA se denominan "secuencias aguas arriba"; las secuencias en la cadena de DNA que tienen la misma secuencia que el RNA y que son 3' hasta el extremo 3' del transcrito de RNA codificador se denominan "secuencias aguas abajo".

En ciertas realizaciones para mejorar la cepa de S. spinosa se produjeron transformantes estables de polinucleoti- do(s) por integracion de un casete de expresion genica en el genoma de S. spinosa. Esto se logro integrando el gen por recombinacion homologa usando una parte del DNA cromosomico y un elemento de insercion. Basandose en esta recombinacion y como resultado de su aplicacion, los casetes de expresion de los genes Aac(3) IV y vhb se integraron por separado en el cromosoma de S. spinosa en el locus de policetido-sintasa (PKS) de obscurina dando como resultando la inactivacion de un gen natural, obsA.

Por tanto, la presente invencion proporciona un metodo para expresar establemente un casete de expresion genica en S. spinosa, que comprende:

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a) identificar y validar un sitio neutro en el genoma de S. spinosa, en donde un sitio neutro es uno que puede ser interrumpido sin impactar negativamente en la produccion de espinosinas, el crecimiento de S. spinosa o una caractenstica metabolica deseada; y

b) introducir en dicho sitio neutro un polinucleotido. Preferiblemente, el polinucleotido se expresa establemen- te en las generaciones posteriores. En una realizacion, el polinucleotido comprende un casete de expresion genica.

Preferiblemente, un casete de expresion genica usado en la presente invencion comprende un fragmento de una secuencia del locus de policetido-sintasa (PKS) de obscurina. Preferiblemente, un casete de expresion genica comprende dos o mas fragmentos separados de dicho locus, flanqueando preferiblemente una secuencia polinucleotfdi- ca que ha de ser insertada en un genoma de celula hospedante. Preferiblemente, cualquier fragmento puede re- combinarse con el gen natural, obsA, dando como resultado su inactivacion.

Otras realizaciones de la presente invencion pueden incluir la integracion de un polinucleotido en el genoma de S. spinosa sin impactar negativamente en la produccion de espinosina, el crecimiento de S. spinosa u otras caractens- ticas metabolicas deseadas.

Realizaciones adicionales de la presente invencion pueden incluir la integracion de un polinucleotido que contiene un casete de expresion genica en el genoma de S. spinosa, cuya expresion da como resultado un aumento de la produccion de espinosinas. Se ha demostrado en esta solicitud que la sobreexpresion de la VHb, en S. spinosa da como resultado un aumento de la produccion de espinosinas. La expresion de la protema portadora de oxfgeno, VHb, produce niveles elevados de la hemoglobina homodimerica en condiciones de crecimiento hipoxicas (Zhang et al., 2007). Entre las hemoglobinas, la VHb tiene una constante de velocidad de asociacion al oxfgeno media y una constante de velocidad de disociacion del oxfgeno bastante alta (cientos de veces mayor que otras hemoglobinas). Esto sugiere que la VHb es capaz de liberar el oxfgeno unido mas facilmente que todas las otras hemoglobinas (Zhang et al., 2007).

La expresion de VHb en varias cepas de Actinomyces condujo a un aumento de la produccion de antibioticos, inclu- yendo clortetraciclina, monensina, eritromicina y actinorrodina (Zhang et al., 2007; Magnolo et al., 1991). La cepa de Streptomyces coelicolor recombinante que expresa VHb produjo diez veces mas actinorrodina que la cepa de tipo natural a bajos niveles de oxfgeno disuelto (abreviadamente en lo sucesivo DO por la expresion inglesa dissolved oxygen) (DO por debajo del 5% de saturacion de aire) (Magnolo et al., 1991). Ademas, la produccion de actinorrodina por una cepa recombinante que expresa VHb fue menos susceptible a las condiciones de aireacion. Aunque la produccion de eritromicina en general no se considera sensible a los niveles de DO siempre y cuando los niveles de DO esten por encima de los niveles mmimos requeridos para el crecimiento, la expresion de VHb en una cepa industrial productora de eritromicina aumento significativamente los tttulos de eritromicina hasta 7,25 g/L desde 4,25 g/L, mientras que se redujo la acumulacion de biomasa bajo condiciones de fermentacion en biorreactores de alimenta- cion por lotes a escalas entre 10-15 litros (Brunker et al., 1997; 1998; Minas et al., 1998).

Las protemas que se unen al oxfgeno que se pueden usar en la invencion incluyen, aunque sin limitacion, hemoglobina de Vitreoscilla (VHb), flavohemoprotema de Alcaligenes eutrophus, mioglobina de corazon de caballo, hemoprotema de E coli, hemoprotema de B. subtilis, flavohemoglobina de levadura, leghemoglobina de soja, leghemoglobina de altramuz y mioglobina de esperma de ballena. Como se ha indicado anteriormente, la protema de union al oxf- geno tambien puede ser una que sea endogena del organismo productor de espinosina. Alternativamente, la protef- na de union al oxfgeno puede ser heterologa para el organismo productor de espinosina.

Se han clonado los genes que codifican un gran numero de protemas de union al oxfgeno y se han determinado sus secuencias. Por ejemplo, las secuencias de polinucleotidos conocidas de protemas globinas utiles en la presente invencion incluyen, aunque sin limitacion, las que codifican una mioglobina de cianobacterias (Potts et al., 1992, Science 256: 1690-1692), hemoglobina de Scapharca inaequivalvis (Gambacurta et al., 1993, FEBS Lett. 330: 9094), mioglobina de Aplysia limacina (Cutruzzola et al., 1996, Biochem. J. 314: 83-90), hemoglobina de Ascaris (Sherman et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11696-11700), hemoglobina del nematodo Pseudoterranova decipiens (Dixon et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5655-5659, y Dixon et al., 1992, J. Mol. Evol. 35: 131136), hemoglobina del Paramecium caudatum (Yamauchi et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 182: 195200), hemoprotema del Rhizobium meliloti (David et al., 1988, Cell 54: 671-683) y Saccharomyces cerevisiae (Shi- mada et al., 1989, J. Biochem. 105: 417-422). Son particularmente adecuadas para uso en la presente invencion las protemas que se unen al oxfgeno que tienen constantes de velocidad de disociacion (koff) relativamente altas, tales como VHb (koff 5600 s'1; Orii and Webster, 1986, J. Biol. Chem. 261: 3544-3547) o afinidad relativamente baja para el oxfgeno, tal como la mioglobina de corazon de caballo (Kd 0,79 |jM; Wittenberg et al., 1985, in nitrogen fixation research progress. H.J. Evand et al., Eds. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, p. 354). Portanto, las protemas de union al oxfgeno preferidas pueden ser las protemas con una koff para oxfgeno mayor que 10 s-1, mas preferiblemente mayor que 100 s-1, o una Kd para el oxfgeno mayor que 0,5 |jM, aunque se comprendera que tambien seran utiles las protemas de union al oxfgeno con constantes de velocidad fuera de estos parametros. Como se ha indicado anteriormente, las protemas de union al oxfgeno preferidas incluyen globinas, tales como hemoglobina, mioglobina y leghemoglobinas. Las propiedades de muchas protemas de union al oxfgeno, incluyendo las globinas, estan descri- tas en la bibliograffa. Adicionalmente, las tecnicas para determinar las propiedades de union al oxfgeno de una pro-

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tema, tal como una globina, son muy conocidas por los expertos en la tecnica y pueden realizarse sin excesiva expe- rimentacion.

Como se ha indicado anteriormente, una de dichas protemas de union al oxfgeno para uso en la presente invencion, como se describe en la presente memoria a modo de ejemplo de trabajo, es VHb. La secuencia completa del gen de la VHb esta descrita en la patente de EE.UU. N° 5.049.493. Estan tambien dentro del alcance de la presente invencion los fragmentos, mutantes, variantes y derivados de VHb que se unen al oxfgeno. Tambien estan incluidos los fragmentos, mutantes, variantes y derivados de la secuencia polinucleotfdica que codifica VHb, que codifican una protema que se une al oxfgeno. Preferiblemente, la presente invencion proporciona el uso de la secuencia codifican- te de VHb del vector de expresion descrito en la SEQ ID NO 1, o sus fragmentos, variantes o derivados.

Las realizaciones de la presente invencion tambien pueden incluir la integracion de un polinucleotido en el genoma de S. spinosa en un sitio neutro, y el posterior apilamiento de un segundo polinucleotido en el mismo lugar, en donde el sitio neutro dentro de S. spinosa se utiliza como locus preferido para introducir polinucleotidos adicionales.

Otras realizaciones de la presente invencion pueden incluir integrar un polinucleotido en el genoma de S. spinosa en un sitio neutro y la subsiguiente eliminacion de un marcador seleccionable del polinucleotido integrado. En una reali- zacion, el polinucleotido comprende un casete de expresion genica, que comprende un marcador seleccionable. Se puede usar cualquier metodo adecuado. Un metodo preferido utilizado para eliminar el casete de expresion del marcador seleccionable es un metodo de doble cruzamiento, un metodo de escision que utiliza CRE-LOX, un metodo de escision que utiliza FLP-FRT o un metodo de escision que utiliza el kit RED/ET RECOMBINATION® (Genebridges, Heidelberg, Alemania), ademas de otros metodos de escision conocidos en la tecnica. Por lo tanto, el metodo de la invencion tal como se define en la presente memoria puede comprender opcionalmente la etapa c) consistente en eliminar un casete de expresion del marcador seleccionable del casete de expresion genica integrado.

Realizaciones adicionales de la presente invencion pueden incluir la integracion de un polinucleotido en el genoma de S. spinosa en un sitio neutro como alternativa al uso de plasmidos de replicacion extranos, en donde uno o mas plasmidos de replicacion extranos son incompatibles debido a la presencia de ongenes de replicacion similares, grupos de incompatibilidad, marcadores seleccionables redundantes u otros elementos genicos, en donde uno o mas plasmidos de replicacion extranos no son funcionales en S. spinosa debido a la especificidad del sistema de modificacion por restriccion de S. spinosa, en donde no estan disponibles dentro de S. spinosa uno o mas plasmidos de replicacion extranos, funcionales o facilmente transformables.

Otras realizaciones de la presente invencion pueden incluir metodos para aumentar la eficacia de la recombinacion homologa en una celula procariotica. Los metodos que dependen de la recombinacion homologa mediada por enzi- mas introducidas, tales como "recombioingeniena" roja lambda y enfoques analogos son utiles en un numero limita- do de clases bacterianas, particularmente Escherichia (Datsenko and Wanner (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-5) y Salmonella. Pueden utilizarse tambien metodos que dependen de la recombinacion espedfica de sitios mediada por enzimas introducidas, tales como integrasas de fago, FLP/FRT, o Cre/loxP, pero son dependientes de la presencia de sitios preexistentes dentro del DNA diana (Wirth et al., (2007) Current Opinions in Biotechnology 18, 411-419). Metodos alternativos explotan virus o elementos moviles o sus componentes (por ejemplo, fagos, transpo- sones o intrones moviles).

Sin embargo, los metodos que dependen de la recombinacion homologa mediada por el hospedante son, con mu- cho, el tipo mas comunmente utilizado de modificaciones cromosomicas del DNA. En una aplicacion microbiana tfpica de la recombinacion homologa mediada por el hospedante, un plasmido con una unica region de identidad de secuencia con el cromosoma se integra en el cromosoma por integracion de un solo cruzamiento, a veces denomi- nada integracion de tipo Campbell. Despues de tal episodio, los genes en el plasmido introducido se replican como parte del cromosoma, la cual puede ser mas rapida que la replicacion del plasmido. Por consiguiente, el crecimiento en un medio con seleccion para un gen marcador seleccionable llevado por plasmido puede proporcionar una pre- sion selectiva para la integracion. La integracion de tipo Campbell puede usarse para inactivar un gen cromosomico colocando un fragmento interno de un gen de interes en el plasmido, de manera que despues de la integracion, el cromosoma no contendra una copia completa del gen. El cromosoma de una celula integrante de tipo Campbell no es estable, porque el plasmido integrado esta flanqueado por las secuencias homologas que dirigieron la integracion. Un episodio de recombinacion homologa adicional entre estas secuencias conduce a la escision del plasmido y la reversion del cromosoma al tipo natural. Por esta razon, puede ser necesario mantener la seleccion para el gen marcador seleccionable llevado por el plasmido para mantener el clon integrante.

Una mejora en el metodo basico de integracion de un solo cruzamiento de la modificacion cromosomica puede incluir la recombinacion homologa cruzada doble, tambien denominada intercambio alelico, que implica dos episodios de recombinacion. El alelo modificado deseado se coloca en un plasmido flanqueado por regiones de homologfa con las regiones que flanquean el alelo diana en el cromosoma ("brazos de homologfa"). Un primer episodio de integracion puede ocurrir en cualquier par de brazos de homologfa, lo que conduce a la integracion del plasmido en el cromosoma de la misma manera que la integracion de tipo Campbell. Despues del primer episodio de cruzamiento, el cromosoma contiene dos conjuntos alternativos de secuencias homologas que pueden dirigir un segundo episodio de recombinacion. Si se recombinan las mismas secuencias que dirigieron el primer episodio, el plasmido se escindi- ra y la celula volvera al tipo natural. Si el segundo episodio de recombinacion esta dirigido por el otro brazo de homo- logfa, se escindira un plasmido, pero el alelo cromosomico original se habra intercambiado por el alelo modificado introducido en el plasmido; se habra conseguido la modificacion cromosomica deseada. Al igual que con la integra-

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cion de tipo Campbell, el primer episodio de recombinacion se detecta tipicamente y los integrantes se afslan usan- do una ventaja selectiva conferida por la integracion de un gen marcador seleccionable llevado por un plasmido.

"Polimorfismo funcional" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un cambio en la secuencia de pares de bases de un gen que produce un cambio cualitativo o cuantitativo en la actividad del gen (por ejemplo, expresion del gen) o en la actividad y/o expresion de la protema codificada por ese gen (por ejemplo, un cambio en la especifi- cidad de la actividad, un cambio en el nivel de actividad). El termino "polimorfismo funcional" incluye mutaciones, deleciones e inserciones.

En general, la etapa de detectar el polimorfismo de interes puede llevarse a cabo recogiendo una muestra biologica que contenga DNA de la fuente y, a continuacion, determinar la presencia o ausencia de DNA que contenga el polimorfismo de interes en la muestra biologica.

La determinacion de la presencia o ausencia de DNA que codifica una mutacion particular puede llevarse a cabo con una sonda oligonucleotfdica marcada con un grupo detectable adecuado y/o por medio de una reaccion de amplifi- cacion, tal como una reaccion en cadena de polimerasa o una reaccion en cadena de ligasa (cuyo producto de la reaccion de amplificacion puede detectarse luego con una sonda oligonucleotfdica marcada u otras varias tecnicas). Se conocen numerosos formatos de ensayo con sondas oligonucleotfdicas diferentes que pueden ser empleados para llevar a cabo la presente invencion. Veanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 4.302.204 de Wahl et al.; la patente de EE. UU. N° 4.358.535 de Falkow et al.; la patente de eE.UU. N° 4.563.419 de Ranki et al.; y la patente de EE.UU. N° 4.994.373 de Stavrianopoulos et al.

La amplificacion de una secuencia de acidos nucleicos seleccionada o diana, puede llevarse a cabo por cualquier medio adecuado. Vease, en general, Kwoh et al., Am. Biotechnol. Lab. 8,14-25 (1990). Ejemplos de tecnicas de amplificacion adecuadas incluyen, aunque sin limitacion, reaccion en cadena de polimerasa, reaccion en cadena de ligasa, amplificacion por desplazamiento de cadenas (vease, en general, G. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 (1992); G. Walker et al., Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992)), amplificacion basada en la trans- cripcion (vease, D. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)), replicacion de secuencia auto- mantenida (o "3SR") (vease, J. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)), el sistema de repli- casa Qp (vease, P. Lizardi et al., BioTechnology 6, 1197-1202 (1988)), amplificacion basada en secuencias de acidos nucleicos (o "NASBA") (vease, R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), 1 (1992)), reaccion en cadena de reparacion (o "RCR") (vease, R. Lewis, supra) y la amplificacion de DNA en bumeran (o "BDA") (vease, R. Lewis, supra). Generalmente, se prefiere la reaccion en cadena de polimerasa.

La reaccion en cadena de polimerasa (PCR) se puede llevar a cabo de acuerdo con tecnicas conocidas. Veanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nos. 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; y 4.965.188. En general, la PCR implica, en primer lugar, tratar una muestra de acido nucleico (por ejemplo, en presencia de una DNA-polimerasa estable al calor) con un cebador oligonucleotidico para cada cadena de la secuencia espedfica que se ha de detectar en con- diciones de hibridacion, de modo que se sintetice un producto de extension de cada cebador que sea complementary con cada cadena de acidos nucleicos, siendo los cebadores suficientemente complementarios con cada cadena de la secuencia espedfica para hibridarse con ella de modo que el producto de extension sintetizado a partir de cada cebador, cuando se separa de su complemento, pueda servir como un molde para la smtesis del producto de extension del otro cebador, y luego tratar la muestra en condiciones de desnaturalizacion para separar los productos de extension del cebador de sus moldes, si estan presentes la secuencia o secuencias que se han de detectar. Es- tas etapas se repiten dclicamente hasta que se obtiene el grado deseado de amplificacion. La deteccion de la secuencia amplificada se puede realizar anadiendo al producto de reaccion una sonda de oligonucleotidos capaz de hibridarse con el producto de reaccion (por ejemplo, una sonda de oligonucleotidos de la presente invencion), lle- vando la sonda un marcador detectable y detectando luego el marcador de acuerdo con tecnicas conocidas, o por visualizacion directa sobre un gel. Dichas sondas pueden tener una longitud de 5 a 500 nucleotidos, preferiblemente de 5 a 250, mas preferiblemente de 5 a 100 o de 5 a 50 acidos nucleicos. Cuando las condiciones de la PCR permi- ten la amplificacion de todos los tipos alelicos, dichos tipos se pueden distinguir por hibridacion con una sonda espedfica alelica, por digestion con endonucleasas de restriccion, por electroforesis en geles con gradientes de desnatu- ralizacion u otras tecnicas.

La reaccion en cadena de ligasa (LCR) tambien se realiza de acuerdo con tecnicas conocidas. Vease, por ejemplo, R. Weiss, Science 254, 1292 (1991). En general, la reaccion se lleva a cabo con dos pares de sondas de oligonu- cleotidos: un par se une a una cadena de la secuencia que se ha de detectar; el otro par se une a la otra cadena de la secuencia que se ha de detectar. Cada par juntos solapan completamente la cadena correspondiente. La reaccion se realiza, en primer lugar, desnaturalizando (por ejemplo, separando) las cadenas de la secuencia que se ha de detectar, haciendo reaccionar a continuacion las cadenas con los dos pares de sondas de oligonucleotidos en presencia de una ligasa estable al calor, de modo que se liguen entre sf cada par de sondas de oligonucleotidos, separando luego el producto de reaccion y repitiendo luego dclicamente el proceso hasta que la secuencia ha sido amplificada en el grado deseado. A continuacion se puede realizar la deteccion de la misma manera que se ha descrito anteriormente respecto a la PCR.

Las tecnicas de amplificacion del DNA, tales como las anteriores, pueden implicar el uso de una sonda, un par de sondas o dos pares de sondas que se unen espedficamente al DNA que contiene el polimorfismo funcional, pero no se unen al dNa que no contiene el polimorfismo funcional. Alternativamente, la sonda o el par de sondas podna unirse al DNA que tanto contiene como no contiene el polimorfismo funcional, pero produce o amplifica un producto

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(por ejemplo, un producto de alargamiento) en el que se puede determinar una diferencia detectable (por ejemplo, un producto mas corto, donde el polimorfismo funcional es una mutacion por delecion). Dichas sondas se pueden generar de acuerdo con tecnicas estandares a partir de las secuencias conocidas de DNA en o asociadas a un gen unido a obsA o a partir de secuencias que se pueden generar a partir de dichos genes de acuerdo con tecnicas estandares.

Se apreciara que las etapas de deteccion descritas en la presente memoria se pueden realizar directa o indirecta- mente. Otros medios de determinar indirectamente el tipo alelico incluyen la medicion de marcadores polimorficos que estan unidos al polimorfismo funcional particular, como se ha demostrado para las VNTR (repeticiones en tandem de numero variable).

La biologfa molecular comprende una amplia variedad de tecnicas para el analisis de secuencias de acidos nuclei- cos y protemas. Muchas de estas tecnicas y procedimientos constituyen la base de pruebas y ensayos de diagnosti- co clmico. Estas tecnicas incluyen analisis por hibridacion de acidos nucleicos, analisis con enzimas de restriccion, analisis de secuencias geneticas y la separacion y purificacion de acidos nucleicos y protemas (vease, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

La mayona de estas tecnicas implica realizar numerosas operaciones (por ejemplo, pipeteado, centrifugacion y elec- troforesis) en un gran numero de muestras. Dichas operaciones son a menudo complejas y consumen tiempo, y requieren generalmente un alto grado de precision. Muchas tecnicas estan limitadas en su aplicacion por una falta de sensibilidad, especificidad o reproducibilidad.

El analisis por hibridacion de acidos nucleicos implica generalmente la deteccion de un numero muy pequeno de acidos nucleicos diana espedficos (DNA o RNA) con un exceso de DNA sonda, entre una cantidad relativamente grande de acidos nucleicos no diana complejos. Una reduccion en la complejidad del acido nucleico en una muestra es util para la deteccion de bajo numero de copias (es decir, 10.000 a 100.000) de acidos nucleicos diana. La reduccion de la complejidad del DNA se logra en cierto grado por la amplificacion de secuencias de acidos nucleicos diana. (Veanse, M.A. Innis et al., PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990, Spargo et al., 1996, Molecular & Cellular Probes, respecto a la amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA)). Esto es debido a que la amplificacion de acidos nucleicos diana da como resultado un enorme numero de secuencias de acidos nucleicos diana con relacion a las secuencias no diana, mejorando asf la etapa de hibridacion de dianas subsiguiente.

La etapa de hibridacion implica colocar la muestra de DNA preparada en contacto con una sonda indicadora esped- fica en las condiciones optimas ajustadas para que tenga lugar la hibridacion entre la secuencia de DNA diana y la sonda. La hibridacion se puede realizar en uno cualquiera entre varios formatos. Por ejemplo, el analisis por hibrida- cion de acidos nucleicos en multiples muestras se ha realizado en una variedad de formatos de filtros y de soportes solidos, (vease Beltz et al., Methods in Enzymology, Vol. 100, Part et al., Eds., Academic Press, New York, Chapter 19, pp. 266-308, 1985). Un formato, la llamada hibridacion por "transferencia de mancha", implica la union no cova- lente de los DNA diana a un filtro, seguido por la posterior hibridacion con una o varias sondas marcadas con radio- isotopos. La hibridacion por "transferencia de mancha" alcanzo un uso generalizado en las dos ultimas decadas durante las cuales se desarrollaron muchas versiones (vease Anderson and Young, en Nucleic Acid Hybridization - A Practical Approach, Hames and Higgins, Eds., IRL Press, Washington, D.C., Chapter 4, pp.73-111, 1985). Por ejemplo, el metodo de transferencia de mancha se ha desarrollado para multiples analisis de mutaciones genomicas (EP-A 0228075 de Nanibhushan et al.) y para la deteccion de clones solapantes y la construccion de mapas geno- micos (Patente de EE.UU. N° 5.219.726 de Evans).

Tecnicas adicionales para realizar analisis de hibridacion de acidos nucleicos de multiples muestras incluyen disposi- tivos multiplex micro-formateados o de matriz (por ejemplo, chips de DNA) (veanse, M. Barinaga, 253 Science, pp.1489, 1991; W. Bains, 10 Bio/Technology, pp. 757-758, 1992). Estos metodos unen generalmente secuencias de DNA espedficas a areas espedficas muy pequenas de un soporte solido, tales como micropocillos de un chip de DNA. Estos formatos de hibridacion son versiones a microescala de los sistemas de hibridacion convencionales por "transferencia de mancha" y en "sandwich".

La hibridacion microformateada se puede utilizar para realizar "secuenciacion por hibridacion" (SBH) (veanse, M. Barinaga, 253 Science, pp. 1489, 1991; W. Bains, 10 Bio/Technology, pp. 757-758, 1992). La SBH hace uso de todos los oligomeros de n-nucleotidos (n-meros) posibles para identificar n-meros en una muestra de DNA descono- cida, que se alinean subsiguientemente por analisis de algoritmos produciendo la secuencia de DNA (vease, Drma- nac, Patente de EE.UU. N° 5.202.231).

Existen dos formatos para la realizacion de la SBH. El primer formato implica crear una matriz de todos los n-meros posibles sobre un soporte, que se hibrida luego con la secuencia diana. El segundo formato implica unir la secuencia diana a un soporte, que se sonda secuencialmente con todos los n-meros posibles. Southern (Solicitud de Patente del Reino Unido GB 8810400, 1988; E. M. Southern et al., 13 Genomics 1008, 1992), propuso utilizar el primer formato para analizar o secuenciar DNA. Southern identifico una unica mutacion puntual conocida utilizando DNA ge- nomico amplificado por PCR. Southern describio tambien un metodo para sintetizar una matriz de oligonucleotidos sobre un soporte solido para la SBH. Drmanac et al., (260 Science 1649-1652, 1993) utilizaron un segundo formato para secuenciar varias secuencias cortas de DNA (116 pb). Los DNA diana se unieron a soportes de membrana

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(formato de "transferencia de mancha"). Cada filtro se hibrido secuencialmente con 272 oligonucleotidos de 10- meros y 1-mero marcados. Se utilizaron amplios intervalos de condiciones restrictivas para lograr una hibridacion espedfica para cada sonda de n-meros. Los tiempos de lavado variaron desde 5 minutos hasta una noche utilizando temperatures de 0°C a 16°C. La mayona de las sondas requirieron 3 horas de lavado a 16°C. Los filtros tuvieron que ser expuestos de 2 a 18 horas con el fin de detectar las senales de hibridacion.

En general, estan disponibles una variedad de metodos para la deteccion y el analisis de los episodios de hibridacion. Dependiendo del grupo indicador (fluoroforo, enzima, radioisotopo, etc.) utilizado para marcar la sonda de DNA, la deteccion y el analisis se realizan fluorimetricamente, calorimetricamente o por autorradiograffa. Observando y midiendo la radiacion emitida, tal como la radiacion fluorescente o la emision de partfculas, se puede obtener in- formacion acerca de los episodios de hibridacion. Incluso cuando los metodos de deteccion tienen muy alta sensibi- lidad intrmseca, la deteccion de los episodios de hibridacion es diffcil debido a la presencia de fondo de materiales unidos no espedficamente. Portanto, la deteccion de episodios de hibridacion depende de como se pueda realizar la hibridacion espedfica y sensible. En cuanto a los analisis geneticos, se han desarrollado varios metodos que han intentado aumentar la especificidad y sensibilidad.

Una forma de analisis genetico es el analisis centrado en la elucidacion de polimorfismos de un solo acido nucleico o ("SNP"). Factores que favorecen el uso de los SNP son su gran abundancia en el genoma humano (especialmente en comparacion con repeticiones cortas en tandem (STR)), su localizacion frecuente dentro de regiones de genes codificadoras o reguladoras (que pueden afectar a la estructura de las proternas o a los niveles de expresion) y su estabilidad cuando pasan de una generacion a la siguiente (Landegren et al., Genome Research, Vol. 8, pp.769-776, 1998).

Un SNP se define como cualquier posicion en el genoma que existe en dos variantes y la variante mas comun se produce menos del 99% de las veces. Con el fin de utilizar los SNP como marcadores geneticos generalizados, es crucial que puedan ser genotipificados facil, rapida, precisa y rentablemente. Numerosas tecnicas estan actualmente disponibles para tipificar los SNP (para revision, vease Landegren et al., Genome Research, Vol. 8, pp. 769-776, (1998)), las cuales requieren amplificacion de la diana. Dichas tecnicas incluyen secuenciacion directa (Carothers et al., BioTechniques, Vol. 7, pp. 494-499, 1989), polimorfismo de conformacion monocatenaria (Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, pp. 2766-2770, 1989), amplificacion espedfica de alelos (Newton et al., Nucleic Acids Research, Vol. 17, pp. 2503-2516, (1989)), digestion por restriccion (Day and Humphries, Analytical Biochemistry, Vol. 222, pp. 389-395, 1994) y ensayos de hibridacion. En su forma mas basica, los ensayos de hibridacion funcionan discriminando indicadores de oligonucleotidos cortos contra dianas apareadas y desapareadas. Se han desarrollado muchas adaptaciones al protocolo basico. Estas incluyen reaccion en cadena con ligacion (Wu and Wallace, Gene, Vol. 76, pp. 245-254, 1989) y minisecuenciacion (Syvanen et al., Genomics, Vol. 8, pp. 684-692, 1990). Otras mejo- ras incluyen el uso de la actividad 5'-nucleasa de la DNA-polimerasa Taq (Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 7276-7280, 1991), balizas moleculares (Tyagi and Kramer, Nature Biotechnology, vol. 14, pp. 303-308, 1996), curvas de desnaturalizacion por calor (Howell et al., Nature Biotechnology, Vol. 17, pp. 87-88, 1999) y "chips" de DNA (Wang et al., Science, Vol. 280, pp.1077-1082, 1998).

Un fenomeno adicional que se puede utilizar para distinguir los SNP es las energfas de interaccion de los acidos nucleicos o energfas de apilamiento de bases resultantes de la hibridacion de multiples sondas espedficas diana con una sola diana. (Veanse, R. Ornstein et al., "An Optimized Potential Function for the Calculation of Nucleic Acid Interaction Energies", Biopolymers, Vol. 17, 2341-2360 (1978); J. Norberg and L. Nilsson, Biophysical Journal, Vol. 74, pp. 394-402, (1998); y J. Pieters et al., Nucleic Acids Research, Vol. 17, n° 12, pp. 4551-4565 (1989)). Este fe- nomeno de apilamiento de bases se usa en un formato unico en la presente invencion para proporcionar diferencia- les de Tm altamente sensibles que permiten la deteccion directa de los SNP en una muestra de acidos nucleicos.

Se han utilizado metodos adicionales para distinguir secuencias de acidos nucleicos en organismos relacionados o para secuenciar DNA. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 5.030.557 de Hogan et al., describio que la estructura secundaria y terciaria de un acido nucleico diana monocatenario puede verse afectada por la union de oligonucleoti- dos "auxiliares" ademas de los oligonucleotidos "sonda" provocando un mayor Tm entre la sonda y el acido nucleico diana. Sin embargo, dicha patente se limitaba en su procedimiento a la utilizacion de energfas de hibridacion solo para alterar las estructuras secundaria y terciaria de cadenas de RNA de auto-asociacion, que si se dejaban inalte- radas tendenan a evitar que la sonda se hibridara con la diana.

Respecto a la secuenciacion del DNA, K. Khrapko et al., Federation of European Biochemical Societies Letters, Vol. 256, n° 1,2, pp. 118-122 (1989), por ejemplo, describieron que la hibridacion por apilamiento continuo dio como re- sultado una estabilizacion del duplex. Adicionalmente, J. Kieleczawa et al., Science, Vol. 258, pp. 1787-1791 (1992), describieron el uso de tramos contiguos de hexameros para cebar la smtesis de DNA, en donde pareda que los tramos contiguos estabilizaban el cebado. Igualmente, L. Kotler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90, pp. 42414245, (1993) describieron la especificidad de secuencias en el cebado de las reacciones de secuenciacion de DNA por el uso de modulos de oligonucleotidos hexameros y pentameros. Ademas, S. Parinov et al., Nucleic Acids Research, Vol. 24, n° 15, pp. 2998-3004, (1996), describieron el uso de oligomeros de apilamiento de bases para la secuenciacion del DNA en asociacion con microchips pasivos de secuenciacion de DNA. Por otra parte, G. Yershov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp. 4913-4918 (1996), describieron la aplicacion de las energfas del apilamiento de bases en SBH sobre un microchip pasivo. En el ejemplo de Yershov, se anclaron sondas de DNA de 10- meros a la superficie del microchip y se hibridaron con secuencias diana en conjuncion con sondas cortas adiciona-

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les, pareciendo que dicha combinacion estabilizaba la union de las sondas. En dicho formato, podnan ser elucidados segmentos cortos de una secuencia de acidos nucleicos para la secuenciacion de DNA. Yershov senalo ademas que en su sistema se incremento el efecto desestabilizador de los desapareamientos utilizando sondas mas cortas (por ejemplo, 5-meros). El uso de dichas sondas cortas en la secuenciacion de DNA proporciono la capacidad de discernir la presencia de desapareamientos a lo largo de la secuencia que se estaba sondando en lugar de un unico desapareamiento en una localizacion espedfica del complejo de hibridacion sonda/diana. El uso de sondas mas largas (por ejemplo, oligos de 8-meros, 10-meros y 13-meros) fue menos funcional para dichos fines.

Un ejemplo adicional de metodologfas que han utilizado el apilamiento de bases en el analisis de acidos nucleicos incluye la Patente de EE.UU. N° 5.770.365 de Lane et al., en donde se describe un metodo para capturar dianas de acidos nucleicos utilizando una sonda de captura unimolecular que tiene un bucle monocatenario y una region bica- tenaria que actua junto con una diana de union para estabilizar la formacion de duplex por las energfas de apilamiento.

La secuencia de nucleotidos puede ser modificada convenientemente por mutagenesis dirigida al sitio de acuerdo con metodos convencionales. Alternativamente, la secuencia de nucleotidos se puede preparar por smtesis qmmica, incluyendo, aunque sin limitacion, el uso de un sintetizador de oligonucleotidos, en donde los oligonucleotidos se disenan basandose en la secuencia de aminoacidos del polipeptido deseado, y preferiblemente seleccionando los codones que son favorecidos en la celula hospedante en la que se producira el polipeptido recombinante.

Las nuevas espinosinas tambien se pueden producir por mutagenesis de los genes clonados y sustitucion en un organismo productor de espinosinas de los equivalentes no mutados por los genes mutados. Preferiblemente, la sustitucion comprende un metodo de introduccion de polinucleotidos como se describe en la presente memoria. Se puede usar cualquier metodo de mutagenesis adecuado, incluyendo, por ejemplo mutagenesis de cualquier enzima biosintetica de espinosinas bien directamente o por mutagenesis de un gen que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. La invencion proporciona mutagenesis de cualquier espinosina de S. spinosa. Preferiblemente, la mutagenesis puede implicar, por ejemplo: 1) delecion o inactivacion de un dominio de cetorreductasa, deshidratasa o enoil-reductasa (KR, DH o ER) de modo que se bloquee una o mas de estas funciones y la cepa produzca una espinosina que tenga un nucleo de lactona con un doble enlace, un grupo hidroxilo o un grupo ceto que no esta presente en el nucleo de espinosina A (vease Donadio et al., 1993); 2) sustitucion de un dominio de AT de modo que se in- corpore en el nucleo de lactona un acido carboxflico diferente (vease Ruan et al, 1997); 3) adicion de un dominio de KR, DH o ER a un modulo de PKS existente, de modo que la cepa produzca una espinosina que tenga un nucleo de lactona con un enlace saturado, un grupo hidroxilo o un doble enlace que no esta presente en el nucleo de espinosina A; o 4) adicion o sustraccion de un modulo de PKS completo de modo que el nucleo de lactona dclica tenga un numero mayor o menor de atomos de carbono. Se puede crear una PKS tubrida sustituyendo el dominio de carga de la PKS de espinosina con carga de PKS heterologa. Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 7.626.010. Se ha observado ademas que las espinosinas por la modificacion de los azucares que estan unidos a la cadena principal de la lactona de la espinosina pueden incluir modificaciones del resto de ramnosa y/o forosamina o union de diferen- tes desoxiazucares. El grupo de Salas en Espana demostro que se pueden producir nuevos compuestos de policeti- dos sustituyendo la molecula de azucar existente por diferentes moleculas de azucar. Rodriguez et al., J. Mol. Microbiol Biotechnol. 2000 Jul; 2(3): 271-6. Los ejemplos que siguen en la solicitud ayudan a ilustrar el uso de mutagenesis para producir una espinosina con funcionalidad modificada.

Las nuevas espinosinas tambien se pueden producir por mutagenesis de los genes clonados y sustitucion en un organismo productor de espinosinas de los equivalentes no mutados por los genes mutados. Preferiblemente, la sustitucion comprende un metodo de introduccion de polinucleotidos como se describe en la presente memoria. Se puede usar cualquier metodo de mutagenesis adecuado, incluyendo, por ejemplo mutagenesis de cualquier enzima biosintetica de espinosinas bien directamente o por mutagenesis de un gen que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. La invencion proporciona mutagenesis de cualquier espinosina de S. spinosa. Preferiblemente, la mutagenesis puede implicar, por ejemplo: 1) delecion o inactivacion de un dominio de cetorreductasa, deshidratasa o enoil-reductasa (KR, DH o ER) de modo que se bloquee una o mas de estas funciones y la cepa produzca una espinosina que tenga un nucleo de lactona con un doble enlace, un grupo hidroxilo o un grupo ceto que no esta presente en el nucleo de espinosina A (vease Donadio et al., 1993); 2) sustitucion de un dominio de AT de modo que se in- corpore en el nucleo de lactona un acido carboxflico diferente (vease Ruan et al, 1997); 3) adicion de un dominio de KR, DH o ER a un modulo de PKS existente, de modo que la cepa produzca una espinosina que tenga un nucleo de lactona con un enlace saturado, un grupo hidroxilo o un doble enlace que no esta presente en el nucleo de espinosina A; o 4) adicion o sustraccion de un modulo de PKS completo de modo que el nucleo de lactona dclica tenga un numero mayor o menor de atomos de carbono. Se puede crear una PKS tubrida sustituyendo el dominio de carga de la PKS de espinosina con carga de PKS heterologa. Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 7.626.010. Se ha observado ademas que las espinosinas por la modificacion de los azucares que estan unidos a la cadena principal de la lactona de la espinosina pueden incluir modificaciones del resto de ramnosa y/o forosamina o union de diferentes desoxiazucares. El grupo de Salas en Espana demostro que se pueden producir nuevos compuestos de policeti- dos sustituyendo la molecula de azucar existente por diferentes moleculas de azucar. Rodriguez et al., J. Mol. Microbiol Biotechnol. 2000 Jul; 2(3): 271-6. Los ejemplos que siguen en la solicitud ayudan a ilustrar el uso de mutagenesis para producir una espinosina con funcionalidad modificada.

El DNA de la region de agrupacion de genes de espinosinas se puede utilizar como sonda de hibridacion para identi- ficar secuencias homologas. Portanto, el DNA clonado de la presente memoria se podna utilizar para localizar otros

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plasmidos de las genotecas de Saccharopolyspora spinosa que solapen la region descrita en la presente memoria, pero que tambien contuvieran anteriormente el DNA no clonado de las regiones adyacentes en el genoma de Saccharopolyspora spinosa. Ademas, el DNA de la region clonada de la presente memoria se puede utilizar para identi- ficar en otros organismos secuencias no identicas pero similares. Las sondas de hibridacion tienen normalmente una longitud de al menos aproximadamente 20 bases y estan marcadas para permitir su deteccion.

En la invencion se pueden utilizar varios tipos de mutagenesis con una variedad de fines. Incluyen, aunque sin limi- tacion, mutagenesis puntual aleatoria dirigida al sitio, recombinacion homologa, barajadura del DNA u otros metodos de mutagenesis recursivos, construccion quimerica, mutagenesis que usa moldes que contienen uracilo, mutagenesis dirigida por oligonucleotidos, mutagenesis del DNA modificado con fosforotioato, mutagenesis que usa DNA duplex con huecos o similares, o cualquiera de sus combinaciones. Metodos adecuados adicionales incluyen repa- racion de desapareamiento puntual, mutagenesis que usa cepas hospedantes deficientes en reparacion, seleccion por restriccion y purificacion por restriccion, mutagenesis por delecion, mutagenesis por smtesis genica total, reparacion por rotura de la doble cadena y similares. Las mutagenesis, que incluyen, aunque sin limitacion, la participacion de construcciones quimericas, tambien estan incluidas en la presente invencion. En una realizacion, la mutagenesis puede ser guiada por informacion conocida de la molecula de origen natural o de la molecula de origen natural alte- rada o mutada, incluyendo, aunque sin limitacion, informacion de la secuencia, comparaciones de secuencias, pro- piedades ffsicas, estructura cristalina o similares.

Los textos y ejemplos encontrados en la presente memoria describen estos procedimientos. Se encuentra informacion adicional en las siguientes publicaciones y referencias citadas en: Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal. Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothio- ate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13:8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate- modified DNA, Nucl. Acids Res. 13:8765-8787 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14:9679-9698 (1986); Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate- containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16:803-814; Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12:9441-9456 (1984); Kramer & Fritz, Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16:7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16:6987-6999 (1988); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879887 (1984); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13:4431-4443 (1985); Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154:382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14:5115 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtil- isin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317:415-423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223:1299-1301 (1984); Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14:6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13:3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001). W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); y, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995). Detalles adicionales sobre muchos de los metodos anteriores se pueden encontrar en Methods in Enzymology, Volumen 154, que describe tambien controles utiles para la localizacion y resolucion de problemas con varios metodos de mutagenesis.

Tambien se pueden utilizar en la invencion fragmentos de peptidos, polipeptidos, protemas, polinucleotidos y genes descritos en la presente memoria. Los fragmentos pueden comprender al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,

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Los terminos "homologfa" o "porcentaje de identidad" se usan indistintamente en la presente memoria. Para los fines de esta invencion, se define en la presente memoria que con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoacidos o de dos secuencias de acidos nucleicos, las secuencias se alinean para fines de com- paracion optimos (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoacidos o acidos nucleicos para alineacion optima con una segunda secuencia de aminoacidos o acidos nucleicos). Se comparan a continuacion los residuos de aminoacidos o nucleotidos en las posiciones de aminoacidos o posiciones de nucleotidos correspondientes. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo residuo de aminoacidos o nucleotidos que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en dicha posicion. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = numero de posiciones identicas/numero total de posiciones (es decir, posiciones solapantesx100). Preferiblemente, las dos secuencias tienen la misma longitud. En la presente invencion, una variante o derivado de peptido, polipeptido, protema o polinucleotido o secuencia de genes es uno que comprende una o mas deleciones, adiciones o sustituciones, y puede tener al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos 99% de identidad de secuencias con la secuencia de referencia (por ejemplo, de tipo natural o de origen natural). En una variante o derivado, las sustituciones pueden ser sustituciones conservadoras, en las que los aminoacidos o acidos nucleicos estan sustituidos por aminoacidos o acidos nucleicos que tienen propiedades similares, de tal manera que no se cambie la naturaleza y actividad de la secuencia. Alternativamente, las sustituciones pueden ser no conservadoras, de tal manera que esten sustituidas por unas que tengan propiedades diferentes que a su vez afecten a la naturaleza y propiedades de la secuencia.

Los expertos en la tecnica seran conscientes del hecho de que estan disponibles varios programas informaticos diferentes para determinar la homologfa entre dos secuencias. Por ejemplo, se pueden realizar una comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias utilizando un algoritmo matematico. En una realizacion preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de programas informaticos GCG (disponible en Internet en la pagina web de Accelrys, mas espedfi- camente en
http://www.accelrys.com), usando bien una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de hue- cos de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitudes de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Los expertos en la tecnica apreciaran que todos estos parametros diferentes proporcionaran resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente cuando se utilizan diferentes algoritmos.

Incluso en otra realizacion, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos se determina usando el programa GAP en el paquete de programas informaticos GCG (disponible en Internet en la pagina web de Accelrys, mas espedficamente en
http://www.accelrys.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de huecos de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitudes de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realizacion, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos o de nucleotidos se determina usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CA- BIOS, 4:11-17 (1989) que se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0) (disponible en Internet en la pagina web de Vega, mas espedficamente ALIGN - IGH Montpellier, o mas espedficamente en
http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalizacion por longitud de hueco de 12 y una penalizacion por hueco de 4.

Las secuencias de acidos nucleicos y protemas de la presente invencion se pueden usar ademas como una "secuencia de consulta" para realizar una busqueda en las bases de datos publicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas busquedas se pueden realizar usando los programas BLASTN y BLASTX (version 2.0) de Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las busquedas de nucleotidos por BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, puntuacion = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleotidos homologas a las moleculas de acidos nucleicos de la presente invencion. Las busquedas de protemas por BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, puntuacion = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoacidos homologas a las moleculas de protemas de la presente invencion. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST como ha sido descrito por Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). (Disponibles en Internet en la pagina web de NCBI, mas espedficamente en
www.ncbi.nlm.nih.gov).

Un casete de expresion para uso en la presente invencion puede comprender una secuencia de polinucleotido, preferiblemente un gen que codifica un gen potenciador de espinosinas y/o un gen que codifica una enzima biosintetica de espinosinas. En una realizacion, el gen potenciador de espinosinas y un gen que codifica una enzima biosintetica de espinosinas son como se han definido en la presente memoria. Un casete de expresion puede comprender op- cionalmente un marcador seleccionable. Un casete de expresion puede comprender opcionalmente una o mas secuencias de control, incluyendo un origen de replicacion. Un casete de expresion puede comprender opcionalmente una o mas secuencias para permitir la integracion (por ejemplo, por recombinacion) en un genoma de una celula hospedante. El termino "casete de expresion" se puede usar indistintamente con terminos tales como vector de expresion y construccion genetica.

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Vectores de expresion adecuados para su uso en la presente invencion incluyen vectores procariotas y eucariotas (por ejemplo, plasmido, fagemido o bacteriofago), vectores de mairnferos y vectores de plantas. Los vectores procariotas adecuados incluyen plasmidos tales como, aunque sin limitacion, los comunmente utilizados para la manipula- cion del DNA en Actinomyces (por ejemplo pSET152, pOJ260, pIJ101, pJV1, pSG5, pHJL302, pSAM2, pKC1250). Dichos plasmidos han sido descritos por Kieser et al., ("Practical Streptomyces Genetics", 2000). Otros vectores adecuados pueden incluir plasmidos tales como los capaces de replicacion en E. coli (por ejemplo, pBR322, ColEI, pSC101, PACYC 184, itVX, pRSET, pBAD (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y similares). Dichos plasmidos han sido descritos por Sambrook (vease "Molecular Cloning: A Laboratory Manual', segunda edicion, editado por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)) y muchos de dichos vectores estan disponibles comer- cialmente. Los plasmidos de Bacillus incluyen pC194, pC221, pT127 y similares, y han sido descritos por Gryczan (en: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), pp. 307-329). Los plasmidos de Streptomyces adecuados incluyen pli101 (Kendall et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183, 1987) y los bacteriofagos de Streptomyces incluyen, aunque sin limitacion, tales como ^C31 (Chater et al., en: Sixth International Symposium on Actinomyceta- les Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungna (1986), pp. 45-54). Los plasmidos de Pseudomonas han sido revi- sados por John et al., (Rev. Infect. Dis. 8:693-704, 1986) e Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742, 1978). En una reali- zacion, un casete de expresion para uso en la presente invencion puede comprender una secuencia de polinucleoti- do que codifica un gen potenciador de espinosinas, como se define en la presente memoria, un terminador de la transcripcion y un marcador seleccionable. Preferiblemente, el gen potenciador de espinosinas es una secuencia de polinucleotido que codifica VHb o uno de sus fragmentos, derivados o variantes. Independientemente, el terminador de la transcripcion puede ser la secuencia terminadora de la transcripcion aph. Independientemente, el marcador seleccionable puede ser un gen de resistencia a la apramicina. Preferiblemente, el casete de expresion es como se muestra en la SEQ ID NO. 1.

Vectores de expresion adecuados para su uso en la presente invencion incluyen vectores procariotas y eucariotas (por ejemplo, plasmido, fagemido o bacteriofago), vectores de marnfferos y vectores de plantas. Los vectores procariotas adecuados incluyen plasmidos tales como, aunque sin limitacion, los comunmente utilizados para la manipula- cion del DNA en Actinomyces (por ejemplo pSET152, pOJ260, pIJ101, pJV1, pSG5, pHJL302, pSAM2, pKC1250). Dichos plasmidos han sido descritos por Kieser et al., ("Practical Streptomyces Genetics", 2000). Otros vectores adecuados pueden incluir plasmidos tales como los capaces de replicacion en E. coli (por ejemplo, pBR322, ColE1, pSC101, PACYC 184, itVX, pRSET, pBAD (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y similares). Dichos plasmidos han sido descritos por Sambrook (vease "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edicion, editado por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)) y muchos de dichos vectores estan disponibles comer- cialmente. Los plasmidos de Bacillus incluyen pC194, pC221, pT127 y similares, y han sido descritos por Gryczan (en: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), pp. 307-329). Los plasmidos de Streptomyces adecuados incluyen pli101 (Kendall et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183, 1987) y los bacteriofagos de Streptomyces incluyen, aunque sin limitacion, tales como ^C31 (Chater et al., en: Sixth International Symposium on Actinomyceta- les Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungna (1986), pp. 45-54). Los plasmidos de Pseudomonas han sido revi- sados por John et al., (Rev. Infect. Dis. 8:693-704, 1986) e Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742, 1978).

La supresion de la expresion de genes particulares es una herramienta importante tanto para la investigacion como para el desarrollo de organismos modificados geneticamente mas ajustados para un fin particular. El silenciamiento de genes se puede conseguir por la introduccion de un transgen que corresponda al gen de interes en la orientacion antisentido con relacion a su promotor (vease, por ejemplo, Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8805-8808 (1988); Smith et al., Nature 334:724-726 (1988)), o en la orientacion con sentido con relacion a su promotor (Napoli et al., Plant Cell 2:279-289 (1990); van der Krol et al., Plant Cell 2:291-299 (1990); Patente de EE.UU. N° 5.034.323; Patente de EE.UU. N° 5.231.020; y Patente de EE.UU. No. 5.283.184), ambas de las cuales conducen a la expresion reducida del transgen asf como al gen endogeno.

Se ha documentado que el silenciamiento de genes postranscripcional va acompanado por la acumulacion de pe- quenos fragmentos (20 a 25 nucleotidos) de RNA antisentido, que pueden ser sintetizados a partir de un molde de RNA y representan los determinantes de especificidad y movilidad del proceso (Hamilton & Baulcombe, Science 286:950-952 (1999)). Ha quedado claro que en una gama de organismos la introduccion de dsRNA (RNA bicatena- rio) es un componente importante que conduce al silenciamiento de genes (Fire et al., Nature 391:806-811 (1998); Timmons & Fire, Nature 395:854 (1998); el documento WO99/32619; Kennerdell & Carthew, Cell 95:1017-1026 (1998); Ngo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14687-14692 (1998); Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959-13964 (1998); el documento WO99/53050; Cogoni & Macino, Nature 399:166-169 (1999); Lohmann et al., Dev. Biol. 214:211-214 (1999); Sanchez-Alvarado & Newmark, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5049-5054 (1999)). En las bacterias, el gen suprimido no necesita ser un gen bacteriano endogeno, ya que tanto los transgenes informado- res como los genes vmcos son sometidos a silenciamiento de genes postranscripcional por transgenes introducidos (English et al., Plant Cell 8:179-188 (1996); Waterhouse et al., supra). Sin embargo, en todos los casos anteriores, se puede preferir alguna similitud de secuencias entre el transgen introducido y el gen que es suprimido.

En la presente memoria los terminos "celula hospedante" y "celula hospedante recombinante" se usan indistintamen- te. Dichos terminos se refieren no solo a la celula objeto particular, sino tambien a la progenie o progenie potencial de dicha celula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a muta- cion o influencias ambientales, dicha progenie puede en efecto no ser identica a la celula parental, pero aun asf esta incluida dentro del alcance del termino tal como se usa en la presente memoria.

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Los metodos de la invencion pueden incluir las etapas adicionales de:

a) cultivar una celula modificada geneticamente de la invencion, en condiciones apropiadas para la produc- cion de espinosinas; y

b) recoger las espinosinas de un cultivo de la celula.

Se incluyen los ejemplos siguientes para ilustrar la presente invencion y no se deben interpretar como limitativos de la misma.

La presente invencion se explica con mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Identificacion de clones de cosmidos que llevan el gen de PKS de obscurina, obsA.

El cribado de una coleccion de cosmidos se completo usando una sonda de 806 pb del locus genomico obsA de S. spinosa (SEQ ID NO: 8). Se construyo una coleccion de cosmidos a partir de una cepa de S. spinosa por BioS&T (Montreal, Canada) usando el vector cosmidico Supercos I (Stratagene, La Jolla, CA) y el DNA genomico de la cepa de S. spinosa que se preparo de acuerdo con el protocolo de aislamiento del DNA genomico descrito por Kieser et al., (2000).

SEQ ID NO 8

caagatcgtt gggacctggc cgcacgtttc gacgaggagc tttccgggcg ggggagcctg gggtcgggcc gtggtggttt cctcaccgag gtcgaccagt tcgacgccgc cttcttcggg

atctcccctc gtgaagccgc cgaactcgac ccccggcagc ggctcacgct ggagctgggc

tgggaagcgt tggaagacgc cgggatcgtg ccgggtgcgc tgcgcggtga acgggtcgcc

gtgttcgtgg gcgcgatggg ggacgactac gccacgctga gcttcgccga cggcggctcc

cagatcggtc actacacggc gaccggtgtg cagcggagca tgatcgccaa ccggttgtcg

tacgtgctcg gtgtgcacgg cccgagcttc gtcgtcgact ccggtcagtc atcctccctg

gttgcggttc acctcgccgt ggagagcctg cgccgcggcg agtcttcggc cgccctggtc

ggcggggtca ccctgaacct ggctgcggag agcatggcgg ccacggccag gttcggcgcg

ctttcgcccg acgggctctg cttcactttc gatgcacgcg cgaacggcta cgcacgcggt

gaaggcggcg gtttcgccgt cctcaagccg ctgcacctcg cgctcggcga tggcgacgac

atctactgcg tgatccgcgg gaccgccatg aacaacgacg gtggcggcga tgggctcacc

gtcccgaacg agcgcgccca gcaggcggtg ctcgcggagg cgtaccggcg agcgggagtg

gacccggccg aggtccagta cgtcga

El cribado de la coleccion con la sonda de obsA permitio la identificacion de clones de cosmidos que llevaban el extremo 5' de obsA en condiciones rigurosas. El marcado de la sonda, la hibridacion y la deteccion se llevaron a cabo utilizando el kit de marcado de DNA DIG y el kit de deteccion de acidos nucleicos DIG (Roche, Basilea, Suiza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Espedficamente, el fragmento de PCR de 806 pb derivado del extremo 5' de obsA se marco usando el Random Prime Labeling Kit (Roche). La hibridacion se llevo a cabo durante una noche a 58°C en el horno de hibridacion seguido por lavado de ambos filtros dos veces a 65°C durante un total de 30 minutos utilizando el tampon de lavado que contema 0,1XSSC y SDS al 0,1%. La sonda hibridada se detecto usando el kit de deteccion de acidos nucleicos DIG de Roche basado en el inmunoensayo unido a enzimas con un conjugado de anticuerpo anti-DIG-AP altamente espedfico y los sustratos de color NBT (nitro azul tetrazolio) y BCIP (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo). Se identificaron varios conjuntos de cosmidos con fuertes senales de hibrida- cion. Cuatro de los clones, 1E3, 2N14, 3M23 y 4E16, se seleccionaron para el aislamiento del DNA de cosmido y la confirmacion de la secuenciacion.

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La amplificacion por PCR de los clones de cosmidos usando el cebador directo de obsA (SEQ ID NO: 9, 5'- CAAGATCGTTGGGACCTGGCC-3') y el cebador inverso de obsA (SEQ ID NO: 10, 5'-TCGACGTACTG GAC- CTCGGC-3') dio como resultado un unico fragmento de PCR equivalente al tamano de la sonda de 806 pb. Las reacciones de PCR se completaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando el sistema de PCR FAILSAFE™ (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI).

Las inserciones de DNA llevadas por los cuatro clones de cosmido se secuenciaron tambien en ambos extremos con el fin de cartografiar los clones de cosmidos en el agrupamiento de genes de obscurina y estimar el tamano de la insercion de los clones de cosmidos (Figura 1). Se determino que el clon cosirndico 1E3 tema un tamano de 42.900 pb y contema el extremo 5' de obsA en el centro de la insercion de DNA. Se determino que el clon cosirndico 2N14 tema un tamano de 40.153 pb y no llevaba la totalidad de la region codificadora de obsA. Las inserciones en los clones cosmfdicos 3M23 y 4E16 conteman el extremo 5' de obsA en un extremo y las secuencias de DNA mas alla del agrupamiento de genes de obscurina en el otro extremo. No se estimaron los tamanos reales de los clones cos- mfdicos 3M23 y 4E16. El clon cosmfdico 1E3 se eligio para completar la interrupcion de obsA para determinar el impacto de la abolicion de la funcion genica de las policetido-sintasas sobre las caractensticas de S. spinosa y la produccion de espinosinas.

Ingenieria del clon cosmidico con interrupcion de obsA por reacciones de PCR.

Para interrumpir el obsA dentro del agrupamiento de genes de obscurina, el casete de interrupcion de resistencia a la apramicina (FRT-aac3(IV)-oriT-FRT) del plasmido pIJ773 (proporcionado por John Innes Center Plant Biosciences Limited, Norwich, Inglaterra, Figura 2) se integro en el clon cosirndico 1E3 por reacciones de PCR.

La integracion del casete de interrupcion de obsA (FRT-aac3(IV)-oriT-FRT) en el clon cosirndico 1E3 se realizo de acuerdo con Gust et al., (2002) con las siguientes modificaciones. Se uso la cepa BW25141/pKD78 de E. coli adqui- rida a The Coli Genetic Stock Center (CGSC) de la Universidad de Yale que contiene el plasmido de expresion de recombinasa rojo lambda pKD78, derivado de pKD46 (Datsenko and Wanner, 2000). Se utilizaron los siguientes cebadores largos de PCR, el cebador 5'FRT aac3 de obsA (SEQ ID NO: 11, 5'-GGCAATGCGCAGAGTTCGTA GTGCGGGAGC CATTTGATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3') y el cebador oriT FRT interno de obsA (SEQ ID NO: 12, 5'-GAAGAAGGCGGCGTCGAACTGGTCGACCTCGGTGAGGAAATTCCGGGGATCCGTCGACC-3') para la amplificacion del fragmento de 1322 pb que llevaba FRT-aac3(IV)-oriT-FRT usando como molde pIJ773 (Figura 2). El fragmento amplificado de 1322 pb se purifico e integro en el cosmido 1E3 de acuerdo con Gust et al., (2002).

Los diez clones de E coli recombinantes que se produjeron a partir de reacciones de PCR eran resistentes a la apramicina y teman el mismo patron de digestion por la enzima de restriccion BamHI (este patron de digestion es diferente del que tiene el clon cosirndico 1E3 que no contiene el casete de interrupcion). La confirmacion adicional de los clones recombinantes se llevo a cabo mediante amplificacion utilizando un par de cebadores que se asocian a las regiones de DNA de 95 pb aguas arriba del codon de iniciacion de obsA y 334 pb aguas abajo del codon de iniciacion de obsA, respectivamente. Los cebadores son el cebador directo aguas arriba en 5' de obsA (SEQ ID NO: 12, 5'-CGACCGGTGTGTCGATGTTAGGGT-3') y el cebador inverso interno de obsA (SEQ ID NO: 14, 5'- CTTCCAACGCTTCCCAGCCC-3'). Las reacciones de PCR se completaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando el sistema de PCR FAILSAFE™ (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI).

La amplificacion utilizando el DNA genomico de la cepa de espinosad usada para crear los cosmidos o el DNA del clon cosmidico 1E3 produjo el fragmento esperado de 429 pb. La amplificacion utilizando el DNA de cosmido aislado a partir de nueve (el clon 10 no se prosiguio debido a la redundancia) de los diez clones cosirndicos recombinantes produjo un solo fragmento que correspondfa al tamano esperado de 1538 pb. El fragmento de PCR esperado de 1538 pb se debe a la insercion de 1322 pb del casete de interrupcion (FRT-aac3(IV)-oriT-FRT) en el extremo 5' de obsA con delecion simultanea de 213 pb del gen obsA. Todos los clones cosirndicos recombinantes produjeron un unico fragmento de PCR de 1538 pb y no produjeron el fragmento de 429 pb visto en el clon cosirndico de control 1E3 lo que indica que cada uno de los clones cosirndicos recombinantes contema el casete de interrupcion (FRT- aac3(IV)-oriT-FRT) en el extremo 5' de obsA.

Interrupcion de obsA dentro del agrupamiento de genes de obscurina por integracion del casete de interrupcion (FRT-aac3(IV)-oriT-FRT) en S. spinosa.

Se usaron metodos de conjugacion para introducir el clon cosmidico recombinantes que llevaban el casete de interrupcion de obsA (FRT-aac3(IV)-oriT-FRT) en S. spinosa para obtener transconjugantes de todas las cepas diana para un analisis concluyente del impacto de la interrupcion de obsA sobre el crecimiento y la produccion de espino- sinas.

La conjugacion micelial entre la cepa donante que llevaba el cosmido 1E3 recombinante y una cepa receptora de S. spinosa, NRRL 18538, se llevo a cabo de acuerdo con el metodo descrito por Matsushima et al., (1994).

Se produjeron transconjugantes. Casi todos los transconjugantes primarios confirmaron el fenotipo resistente a la apramicina deseado, lo que indica que los transconjugantes llevaban el gen de resistencia a la apramicina, aac3(IV), integrado en el agrupamiento de genes de policetido-sintasa de obscurina por recombinacion homologa. Se analiza- ron varios transconjugantes selectos para detectar la presencia del fragmento de DNA correspondiente al tamano de un fragmento aac3(IV) de 785 pb por amplificacion por PCR. Los controles negativos que no conteman el casete de interrupcion (FRT-aac3(IV)-oriT-FRT) no produjeron un amplicon de PCR.

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El impacto de la interrupcion de obsA en el crecimiento de S. spinosa y la produccion de espinosinas

Se evaluo el impacto de la interrupcion de obsA en la produccion de espinosinas utilizando un protocolo de matraz con agitacion para espinosinas. La fermentacion de los transconjugantes se realizo en las condiciones descritas por Burns et al., (documento WO 2003/070908). El analisis del caldo de fermentacion para detectar la presencia de factores de espinosinas se llevo a cabo en las condiciones descritas por Baltz et al., (Patente de EE..UU. N°. 6.143.526).

Se obtuvo una comparacion directa del rendimiento de los transconjugantes con respecto a sus cepas parentales respectivas para aislados de S. spinosa. Se evaluaron en frascos con agitacion cuatro de los mutantes desactivados de obsA derivados de la cepa NRRL 18538. El trtulo medio de cada mutante desactivado era mayor que el de la cepa parental. Sin embargo, las diferencias no paredan ser significativas basandose en el analisis estadistico (Tabla 1).

Tabla 1. Produccion de espinosinas el dia 10 por los mutantes desactivados de obsA derivados de NRRL 18538.

Cepa

Factores de espinosinas principales TUulos de espinosinas en relation con el control, en porcentaje el dia 10 de fermentacion

Precursora de NRRL 18538

A/D 100

AobsA-1 de NRRL 18538

A/D 108

AobsA-2 de NRRL 18538

A/D 114

AobsA-3 de NRRL 18538

A/D 108

AobsA-6 de NRRL 18538

A/D 107

La interrupcion del gen obsA en la policetido-sintasa (PKS) de obscurina en la cepa A/D, NRRL 18538, no tuvo un impacto negativo sobre la produccion de espinosinas en comparacion con las cepas de control precursoras respectivas, bajo las condiciones actuales de fermentacion en matraz con agitacion. La falta de impacto negativo en la produccion de espinosinas por la interrupcion de obsA califica el agrupamiento de genes de policetido-sintasa de obscurina como un sitio neutro para la integration y expresion de genes diana de interes para mejores procesos de produccion y fermentacion de espinosinas. Este locus genomico sirve como ejemplo de un sitio de integracion para la integracion de genes dentro del genoma de S. spinosa.

Construction de un casete de expresion del gen de la hemoglobina

Se diseno un casete de expresion del gen de la hemoglobina para que contuviera las siguientes caracteristicas claves: i) el promotor (promotor aac3(IV)) del gen de resistencia a la apramicina (originalmente de Klebsiella pneumoniae bajo el numero de acceso en GenBank X99313; Kieser et al., 2001) que es funcional en S. spinosa; ii) el gen VHb de la hemoglobina de Vitreoscilla con codones optimizados (Tabla 1) disenado utilizando una tabla de preferen- cia de codones de S. spinosa y el programa informatico GeneDesigner (DNA 2.0, Menlo Park, California); y iii) la secuencia terminadora de la transcription aph (Pulido y Jimenez, 1987). La selection y disposition de estos elemen- tos genicos garantiza la transcripcion estable de VHb y la expresion optima de protemas, proporcionando de esta manera una expresion fuerte de la protema hemoglobina. El casete de expresion con el gen de la hemoglobina (SEQ ID NO: 1) se sintetizo por el programa DNA 2.0 (Menlo Park, CA). El fragmento sintetico resultante de 977 pb flan- queado por HindIII se clono en el vector pJ201 (Figura 1) y se secuencio por el programa DNA 2.0 para confirmar la exactitud de secuencia antes del envio. El plasmido resultante se denomino pDAB109000.

SEQ ID NO. 1

aagcttgaat tcgatatcag cccggtacct cgccgccaac ccgtaccacg gcctctgacg gctccggcca agccgcggaa agcgggggcc gggcgccggt ctccaggcgg ccgggtacct

ccgaccgcac ggccgcttcc ggagtggtcc ggaagcggcc tgcggagcgc cctgcggggc

ggctatcgat tcactccacc gcctgcgcgt acaggtccgc ctccacctgg atgaacacgt

ccgcgatcac gccgtacgcc ttgccccacg cgtccaggat gtcgtccgtc gccgcgtcgc

ccagcacctc cttgatcgcg cccagcagct cctggcccac gatcgggtag tgcgccgccg

ccacgcccgc ctggcagtgc ttcaccgcga tcttcttcac cgccggcagg atcgccggca

ggttctcgat gttctgcgcc gccgccagca ccgtcatcgc cagcgccttc ggctgctcca gcgactcctg ccggcccatg tcgaacagcg gccgcacctc cgggtgcttc gcgaacaggt tcttgtagaa cgtggtcgtg atcgtcacgc cgtgctcctt cagcaccggc accgtcgcct tgatgatgtt gatcgtctgc tggtccagca tatgattgca ctccaccgct gatgacatca gtcgatcata gcacgatcaa cggcactgtt gcaaatagtc ggtggtgata aacttatcat ccccttttgc tgatggagct gcacatgaac ccattcaaag gccggcattt tcagcgtgac atcattctgt gggccgtacg ctggtactgc aaatacggca tcagttaccg tgagctgcat tttccgctgc ataaccctgc ttcggggtca ttatagcgat tttttcggta tatccatcct ttttcgcacg atatacagga ttttgccaaa gggttcgtgt agactttcct tggtgtatcc aacggcgtca gaagctt

Tabla 2. Comparacion de los codones del gen de la hemoglobina de Vitreoscilla (VHb) y los codones preferidos del gen sintetico de la hemoglobina para la expresion optima en S. spinosa. Se prefieren los codones de VHb sinteticos 5 en S. spinosa y se seleccionaron para sustituir los codones preferidos del gen de la hemoglobina de Vitreoscilla

usando el programa informatico GeneDesigner.

Aminoacido

Leu Arg Thr Ile Lys Ala Val Pro His

Codon de VHb deVitreoscilla

TTA CGT ACC ATT AAA GCC GTT CCT CAT

TTG

CGC ACT GCT GTA CCA

Aminoacido

Leu Arg Thr Ile Lys Ala Val Pro His

GCA GTC

Codon sintetico de VHb

CTG CGG ACG ATC AAG GCG GTG CCG CAC

Aminoacido

Asp Gly Ser Asn Cys Phe Gln Glu Tyr

Codon de VHb deVitreoscilla

GAT GGT TCT AAT TGT TTT CAA GAA TAT

Aminoacido

Leu Arg Thr Ile Lys Ala Val Pro His

Codon sintetico de VHb

GAC GGC TCG AAC TGC TTC CAG GAG TAC

Introduccion del casete de expresion del gen de la hemoglobina en el clon cosmldico 1E3

Se eligio el agrupamiento de genes de la obscurina como sitio para la integracion del casete de expresion del gen de 10 la hemoglobina debido a que la interrupcion del agrupamiento de genes de la obscurina no reduce la produccion de espinosinas. El casete de expresion del gen de la hemoglobina fue clonado en el cosmido 1E3 (que contiene una agrupacion parcial de genes de la obscurina con DNA genomico). Este cosmido se manipulo geneticamente para facilitar la integracion estable del casete de expresion del gen de la hemoglobina dentro del agrupamiento de genes de la obscurina del genoma de S. spinosa.

15 El casete de expresion del gen de la hemoglobina se clono primeramente en el vector pIJ773 (John Innes Centre, Norwich, Reino Unido) por un metodo de donation convencional. Este casete, ademas del gen de resistencia a la apramicina y oriT flanqueado por secuencias de recombination de FRT fue clonado luego en el cosmido 1E3 por reacciones de PCR (Gust et al., 2002). Brevemente, el casete de expresion del gen de la hemoglobina se amplifico primeramente usando pDAB109000 como molde y los siguientes cebadores, el cebador directo aac3-VHb (sEq ID 20 NO: 2, 5-CGCTGAAAAGCTTCTGACGCCG-3') y el cebador inverso aac3-VHb (SEQ ID NO: 3, 5'-

CAACCCGTACCACGGCCTCT-3'). El fragmento de PCR amplificado se digirio con HindIII/KpnI para generar dos fragmentos; un fragmento HindIII/KpnI de 864 pb y un fragmento HindIII/KpnI de 83 pb. El fragmento HindIII/KpnI de

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864 pb, que lleva el casete de expresion del gen de la hemoglobina incluyendo el terminador de la transcripcion, se purifico en gel y se clono en el vector pIJ773 que ha^a sido digerido con HindIII/KpnI. Se seleccionaron un total de 38 transformantes cultivados en medios de Luria-Bertani (LB) que conteman 50 pg/mL de apramicina para su posterior analisis y confirmacion. Despues de crecimiento durante una noche en LB lfquido que contema apramicina a 50 pg/mL, se recogieron las celulas por centrifugacion a 13000 rpm en una microcentnfuga durante 2 minutos.

Los sedimentos celulares que llevan el plasmido de control pDAB109000 produjeron un color rojizo que indicaba la presencia de la protema hemoglobina. Sin embargo, solo siete de los clones recombinantes produjeron sedimentos celulares rojizos visibles que variaban desde el rojo claro a un color rojo mas intenso. Se seleccionaron estos siete clones y se paso a la siguiente etapa que inclrna el aislamiento de dNa plasmfdico y digestiones con enzimas de restriccion. Dos de los siete clones, el clon 22 y el clon 30, produjeron los patrones de restriccion deseados basados en el analisis de restriccion usando las siguientes enzimas Ndel, HindIII/KpnI y Ndel/KpnI. Se secuenciaron la region del gen de la hemoglobina de ambos clones y el fragmento de PCR que llevaba el casete de expresion del gen de la hemoglobina. Se secuenciaron completamente la region del gen de la hemoglobina del clon 22 y el fragmento de PCR y los datos de las secuencias confirmaron que el gen sintetico de la hemoglobina deseado se amplifico sin ningun error y fue clonado en pIJ773 (Figura 2). El plasmido resultante fue etiquetado como pDAB109001.

La integracion del casete de expresion genica FRT :: aac3(IV) y el casete de expresion del gen sintetico de la hemoglobina :: oriT::FRT :: en el clon cosmfdico 1E3 se llevo a cabo como se describe por un protocolo modificado por reacciones de PCR (Gust et al., 2002). Se incorporaron al protocolo las siguientes modificaciones: i) el E. coli hospe- dante para introducir el clon cosirndico recombinante que llevaba el casete de expresion del gen de la hemoglobina era E. coli BW25141/pKD78 adquirido a The Coli Genetic Stock Center (CGSC) de la Universidad de Yale; ii) el plasmido de expresion de recombinasa rojo lambda, pKD78, derivado de pKD46 (Datsenko and Wanner, 2000); y iii) se disenaron y utilizaron los siguientes cebadores de PCR, el cebador interno de tramo lineal-bucle Strep de obsA (SEQ ID NO: 4, 5'-GAAGAAGGCGGCGTCGAACTGGTCGACCTCGGTGAGGAAGGTACCTCCGACCGCACGGC- 3') y el cebador 5' FRT aac3 de obsA (SEQ ID NO: 5, 5'-GGCAATGCGCAGAGTTCGTAGTGCGGGAGCCATTT GATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'). La amplificacion resultante produjo un fragmento de 2216 pb que consistfa en (FRT ::aac3(IV):: oriT:: FRT :: VHb) dentro del clon cosirndico 1e3.

La integracion dentro del clon cosirndico 1E3 se diseno para que ocurriera en el extremo 5' de obsA, lo que da como resultado la eliminacion de 600 pb de la secuencia codificadora de obsA. Esto asegura la interrupcion completa de la primera enzima policetido-sintasa dentro del agrupamiento de genes de la obscurina. Una vez integrado, el casete de expresion del gen de la hemoglobina fue orientado de tal manera que su secuencia codificadora estuviera en la orientacion opuesta a la secuencia codificadora de obsA. Esta direccionalidad impide la lectura en la transcripcion a partir del supuesto promotor de obsA que potencialmente podna dar como resultado una transcripcion no deseada. Los supuestos clones recombinantes que llevaban el fragmento (FRT :: aac3(IV):: oriT:: FRT :: VHb) se aislaron y se confirmaron por analisis de restriccion. La digestion por restriccion usando BamHI indico que los clones cosirndicos recombinantes que llevaban el casete del gen de la hemoglobina teman diferentes patrones de restriccion, en com- paracion con el clon cosirndico parental, 1E3. Por otra parte, la digestion por restriccion usando NdeI y ClaI, destina- da a regenerar la secuencia codificadora del gen sintetico de la hemoglobina, revelo que solo los tres clones recombinantes produdan un fragmento de 444 pb que llevaba la region codificadora completa del gen sintetico de la he- moglobina.

Conjugacion del casete de expresion genica (FRT :: aac3(IV) :: oriT:: FRT :: VHb) en cepas de S. spinosa

Se completo la conjugacion micelial entre la cepa donante, Escherichia coli S17, que contema el casete de expresion genica FRT :: aac3(IV) y el casete de expresion del gen sintetico de la hemoglobina :: oriT:: FRT :: dentro del cosmido 1E3 y la cepa productora de espinosinas, DAS-2. La conjugacion micelial entre la cepa donante y la cepa receptora de S. spinosa se llevo a cabo de acuerdo con el metodo descrito por Matsushima et al., (1994). Las colo- nias identificadas inicialmente como resistentes a la apramicina y al acido nalidfxico en los medios de conjugacion se parchearon sobre medios de agar-agar con infusion de cerebro-corazon (BHI) que conteman 50 pg/mL de apramicina y 25 pg/mL de acido nalidfxico para confirmar el fenotipo de resistencia a antibioticos de las colonias. Se supuso que las colonias que teman el fenotipo de resistencia a antibioticos deseada conteman el casete FRT :: aac3(IV):: oriT :: FRT:: VHb integrado dentro del locus obsA del agrupamiento de genes de la obscurina. Para confirmar la presencia del gen de resistencia a la apramicina, aac3(IV), se aislo el DNA genomico de los supuestos transconju- gantes utilizando el kit genomico bacteriano PURELUTE™ (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este DNA genomico (gDNA) se utilizo como molde para la confirmacion del tamano por amplificacion por PCR de un fragmento de DNA de aac3(IV) de 785 pb utilizando el sistema de PCR FAILSAFE™ (Epicentre Biotecnologies, Madison, WI).

Confirmacion de la presencia de un gen de la hemoglobina en transconjugantes

Para confirmar que el gen sintetico de la hemoglobina estaba presente en los transconjugantes, se aislo el DNA genomico de un numero seleccionado de transconjugantes (por el kit genomico bacteriano PURELUTE™) y se utili- zo como molde para la amplificacion por PCR del gen de la hemoglobina (por el sistema de PCR FAILSAFE™). Las cepas recombinantes produjeron un producto de PCR de 395 pb, correspondiente al tamano de la region codificadora del gen de la hemoglobina destinada a la amplificacion. Se purificaron los fragmentos de PCR y se completo la secuenciacion del DNA de ambas cadenas para confirmar aun mas la presencia del gen VHb. El alineamiento de la secuencia derivada de los fragmentos de pCr con la secuencia del gen sintetico de la hemoglobina sintetizado por

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el programa DNA 2.0 indico que estas cepas recombinantes llevaban el gen de la hemoglobina con una secuencia identica a la secuencia de DNA disenada.

Expresion del gen de la hemoglobina en condiciones de fermentacion

Se determino en condiciones de fermentacion la expresion del gen sintetico de la hemoglobina en la cepa recombi- nante que llevaba el casete de expresion del gen de la hemoglobina. Las cepas recombinantes que conteman el casete de expresion de VHb se cultivaron en condiciones de fermentacion en matraces con agitacion, y se aislaron las correspondientes muestras de RNA total por el kit bacteriano RIBOPURE™ (Ambion, Austin, TX) y se prepararon para su uso como molde en el ensayo de RT-PCR. La fermentacion del mutante de doble cruzamiento se realizo bajo las condiciones descritas por Burns et al., (documento WO 2003/070908). El analisis del caldo de fermentacion para detectar la presencia de factores de espinosinas se puede llevar a cabo bajo las condiciones descritas por Baltz et al., (Patente de EE.UU. N° 6.143.526). Para confirmar la presencia de los factores de espinosinas en el lfquido sobrenadante, se secaron extractos del caldo de fermentacion en un aparato SpeedVac durante una noche seguido por reparto del residuo entre agua y eter. La capa eterea se seco por evaporacion bajo corriente de N2. La muestra se disolvio luego en acetona-d6y se transfirio a un tubo de RMN para la adquisicion de la RMN protonica 1D. Los perfiles de RMN se compararon con los de los patrones de espinosinas.

La preparacion de RNA total se trato con DNAsa I (Ambion, Austin, TX) inmediatamente despues de la purificacion del RNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La RT-PCR del gen sintetico de la hemoglobina utilizando el RNA total aislado se llevo a cabo usando el kit de RT-PCR OneStep (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores para la amplificacion de la region codificadora del gen sintetico de la hemoglobina fueron el cebador directo SynHemo (SEQ ID NO: 6, 5'-CAGACGATCAACATCATCAAGGCG-3') y el cebador inverso SynHemo (SEQ ID NO: 7, 5'-ACCTGGATGAACACGTCCGC-3'). Las cepas recombinantes que conteman el casete de expresion de VHb produjeron un fragmento espedfico de 395 pb correspondiente a la region codificadora del gen de la hemoglobina destinada a la amplificacion. En el mismo ensayo, el RNA total aislado de cepas de control no recombinantes no produjo un fragmento de PCR correspondiente en tamano al gen sintetico de la hemoglobina. Estos resultados confirmaron que un gen sintetico de la hemoglobina, activado por el promotor del gen de resistencia a la apramicina, se transcribio y expreso en S. spinosa bajo condiciones de fermentacion.

Efecto de la expresion del gen de la hemoglobina sobre la produccion de espinosad

Se evaluo el impacto de la expresion del gen de la hemoglobina sobre la produccion de espinosad (A/D) cultivando las cepas recombinantes bajo condiciones de fermentacion en matraces con agitacion, tal como se ha descrito ante- riormente. Los resultados de la fermentacion se compararon con los niveles de las espinosinas A/D producidos en la respectiva cepa parental, que no llevaba el gen de la hemoglobina. El numero de cepas recombinantes selecciona- das para la evaluacion en matraces con agitacion se baso en el numero de transconjugantes disponibles para el analisis y el deseo de obtener datos que determinanan si la expresion del gen sintetico de la hemoglobina producina mayores niveles de espinosad A/D.

Se analizaron siete cepas recombinantes derivadas de DAS-2. Todas ellas superaron a la cepa parental DAS-2, en la produccion de espinosad. La cepa parental acumulo espinosad dentro del intervalo esperado. El aumento estadfs- ticamente significativo de la produccion de espinosad A/D vario de 4,6% a 12,9% para las cepas que conteman el gen VHb (Tabla 2). La consistencia entre las cepas recombinantes en superar a la cepa de control en la produccion de espinosad en condiciones de fermentacion en matraces con agitacion dio como resultado un aumento significativo porcentual de tftulos de espinosad A/D. Este aumento en los tttulos de espinosad indico que las cepas recombinantes como un todo habfan adquirido una mayor capacidad de produccion de espinosad debido a la presencia en el genoma del gen sintetico de la hemoglobina. La expresion del gen sintetico de la hemoglobina en condiciones de fermentacion en matraces con agitacion indica que la expresion del gen de la hemoglobina aumenta la produccion de espinosad.

Tabla 3: Comparacion de las cepas DAS-2 y las cepas recombinantes DAS-2 VHb que contienen un gen de VHb integrado cromosomicamente en la produccion de espinosad.

Identificacion de la cepa

Factores principales de espinosinas Tftulos de espinosinas en relacion con el control en por- centajes el dfa 10 de la fermentacion

DAS-2

A/D 100,0

DAS-2 VHb1

A/D 107,4

DAS-2 VHb4

A/D 104,6

DAS-2 VHb5

A/D 108,0

DAS-2 VHb6

A/D 110,5

DAS-2 VHb7

A/D 112,9

DAS-2 VHb8

A/D 110,4

DAS-2 VHB9

A/D 105,6

Claims (24)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para integrar un gen por recombinacion homologa en DNA cromosomico de una celula hospedante de S. spinosa, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

   a) clonar dos fragmentos de DNA genomico del gen obsA en el locus del gen de la policetido-sintasa de obscurina para generar un plasmido de integracion, en donde se clona un fragmento genomico aguas arriba de un polinucleotido que se ha de integrar, y se clona el segundo fragmento genomico aguas abajo de un polinucleotido que se ha de integrar y el fragmento de DNA ligado resultante se convierte en el plasmido de integracion, en donde, tras la integracion el gen obsA del locus del gen de la policetido- sintasa de obscurina esta interrumpido por el polinucleotido;

   b) introducir el plasmido de la etapa (a) en la celula hospedante;

   c) integrar el polinucleotido en el gen obsA natural del locus del gen de la policetido-sintasa de obscurina en el genoma de la celula hospedante; y

   d) cribar la celula hospedante para detectar la presencia de dicho polinucleotido.
2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la integracion del polinucleotido no impacta negativamen- te en el crecimiento ni en ninguna caractenstica metabolica deseada de S. spinosa.
3. 3. Un metodo para expresar establemente un polinucleotido en una celula hospedante de S. spinosa, que compren- de un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2.
4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polinucleotido comprende un casete de expresion genica, en donde dicho casete de expresion genica comprende un gen que codifica una enzima biosinteti- ca de espinosinas y/o un gen que codifica una protema de union al oxfgeno.
5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el polinucleotido comprende un marcador seleccionable.
6. 6. Una celula hospedante de S. spinosa modificada geneticamente, que comprende un gen anadido en el DNA cro- mosomico en el gen obsA de PKS del agrupamiento de genes de la policetido-sintasa de obscurina o un gen susti- tuido que no es identico a un gen natural de S. spinosa.
7. 7. Una celula hospedante de S. spinosa modificada geneticamente de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde el gen que se ha anadido es identico a un gen natural de S. spinosa.
8. 8. Un metodo para la produccion de un producto protemico de un gen diana, comprendiendo dicho metodo preparar una celula hospedante de S. spinosa en la que un numero espedfico de copias de dicho gen diana se integran en el genoma de S. spinosa de acuerdo con las etapas a) a d) de la reivindicacion 1, y cultivar dicha celula en un medio de cultivo adecuado durante un tiempo suficiente para que sea expresado dicho gen diana y sea producida dicha protema.
9. 9. Un metodo para la expresion estable de un gen diana, comprendiendo el metodo:

   integrar en un genoma de S. spinosa un agrupamiento de genes de policetido-sintasa de obscurina como un sitio neutro para la integracion y expresion de un gen diana de interes;

   integrar el gen diana de interes en el sitio neutro, con lo cual se interrumpe el agrupamiento de genes de policetido-sintasa de obscurina;

   en donde el gen diana de interes codifica una protema de union al oxfgeno.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, en donde ademas el gen obsA de la PKS de obscurina del agrupamiento inte- grado es el sitio de integracion.
11. 11. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 9 o 10, en donde el gen diana comprende una secuencia codificado- ra funcionalmente unida a un promotor heterologo para la cepa de S. spinosa.
12. 12. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el gen diana comprende un marcador seleccionable.
13. 13. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde la integracion comprende recombinacion homologa.
14. 14. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende ademas:

    cultivar una celula hospedante en condiciones apropiadas para la produccion de espinosinas; y recoger las espinosinas de un cultivo de la celula hospedante.

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15. 15. Una construccion de expresion que comprende el gen obsA de la policetido-sintasa de obscurina, en donde el gen obsA comprende un gen que codifica una protema de union a oxfgeno integrada en el mismo.
16. 16. Una construccion de expresion segun la reivindicacion 15, en donde la construccion de expresion es adecuada para la integracion en un genoma de una celula hospedante.
17. 17. Uso de una construccion de expresion de acuerdo con las reivindicaciones 15 o 16, en un metodo para integrar un gen por recombinacion homologa en el DNA cromosomico de una celula hospedante de S. spinosa, para la ex- presion de genes estables.
18. 18. Un metodo para preparar una cepa de S. spinosa en la que un numero espedfico de copias de un gen elegido o de un polinucleotido se integra en un genoma de S. spinosa, en donde dicho metodo comprende:

    a) clonar un locus del gen de policetido-sintasa de obscurina en un elemento movil, en donde hay al menos un gen marcador situado dentro del elemento movil;

    b) integrar dicho elemento movil en un locus del gen de la policetido-sintasa de obscurina en el cromosoma o episoma de dicho cepa de S. spinosa;

    c) complementar dicho elemento movil con un gen funcional;

    d) expresar dicho gen del elemento movil funcional;

    e) seleccionar dicha cepa en un medio que sea seleccionable para dicho gen marcador, de tal manera que se obtenga una cepa que contenga un numero espedfico de copias del locus del gen de la policetido-sintasa de obscurina;

    f) recuperar la cepa asf seleccionada; y

    g) integrar un polinucleotido en el numero espedfico de copias del locus del gen de la policetido-sintasa de obscurina en el gen obsA de la PKS de obscurina, con lo que se interrumpe el locus del gen de policetido- sintasa de obscurina.
19. 19. El metodo de la reivindicacion 18, en donde el cromosoma o episoma esta contenido en un plasmido y se introduce portransformacion.
20. 20. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 18 o 19, en donde el elemento movil es una construccion genetica.
21. 21. El metodo, la celula o la construccion de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la inte- gracion de un polinucleotido no impacta negativamente en la produccion, el crecimiento u otras caractensticas meta- bolicas deseadas de espinosinas.
22. 22. Uso de una celula hospedante de S. spinosa modificada geneticamente que comprende un gen anadido, susti- tuido o delecionado en el DNA cromosomico en el agrupamiento de genes de la policetido-sintasa de obscurina en un metodo de expresion de genes estables.
23. 23. Uso de acuerdo con la reivindicacion 22, en donde la celula hospedante es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7.
24. 24. Uso de acuerdo con la reivindicacion 22 o 23, en donde el metodo comprende cultivar la celula hospedante en condiciones apropiadas para la produccion de espinosinas; y recoger las espinosinas de un cultivo de la celula hospedante.