PT88992B - Processo para a preparacao de compostos contendo fosforo uteis como inibidores de colagenase - Google Patents

Description

A Patente Europeia 0054852 reve la uma classe de dipeptídeos substituídos que tem uma útil ac^ tividade inibidora da encefalinase.

Foram agora descobertos novos compostos estruturalmente ralacionados, que são inibidores de colagenase e, por conseguinte, de potencial utilidade no trata, mento de doenças nas quais a actividade colagenolítica e a remodelação de tecido estão implicadas.

De acordo com o presente invento é preparado um composto de fórmula geral (I), ou um seu sal, solvato ou hidrato:

R, (I) (I) em que

R^ representa hidrogénio ou hidróxido;

Rg representa hidrogénio ou alquilo;

Rg representa alquilo Cg gj

R^ representa hidrogénio, alquilo, -CHg-Z onde Z representa fe nilo ou hetero-arilo facultativamente substituído, ou

R^ representa um grupo

7.,.

-6-CH-O-Rg onde Rg representa hidrogénio, alquilo ou -CK^-Ph onde Ph representa fenil facultativamente substituído e Rg representa hj. drogénio ou alquilo; e

R₅ representa hidrogénio ou alquilo.

A menos que especificado de outra maneira, cada grupo alquilo é de preferência um grupo θ, mais preferivelmente podendo ser uma cadeia linear ou ramificada.

Os substituintes opcionais para os grupos fenilo e hetero-arilo podem ser seleccionados de entre OH, alquilo θ, alcóxido e halogénio.

Z, quando hetero-arilo, inclui anéis monocíclicos de 5 ou 6 membros e hetero-arilos bicíclicos de 9 ou 10 membros, dos quais são preferidos os hetero-arilos bicíclicos de 9 ou 10 membros.

Além disso, os anéis monocíclicos de 5 ou 6 membros e os hetero-arilos bicíclicos de 9 ou 10 membros contém preferivelmente um ou dois hetero-átomos escolhidos de entre azoto, oxigénio e enxofre, os quais, no caso de ser mais do que um heteró-átomo, podem ser iguais ou diferen tes. Quando Z é um hetero-arilo, bicíclico de 9 ou 10 membros os dois anéis estão, de preferência, condensados de modo a um deles ser um anel de 5 ou 6 membros contendo um único hetero-átomo.

Rg é preferivelmente hidróxido.

-ΊOs exemplos de R₂ incluem hidro génio, metilo, etilo e isopropilo.

R₂ é, preferivelmente, metilo ou etilo.

R^ é, de preferência, um grupo alquilo com 4 átomos de carbono, tal como n-butilo, iso-butilo ou sec-butilo, especialmente iso-butilo.

R^ é, de preferência, benzilo,

4-hidrobenzilo, C₁_₆ alcoxiberizilo tal como 4-metoxibenzilo ou hetero-arilmetilo bicíclico condensado de 9 ou 10 membros como por exemplo 3-indolilmetilo.

Os valores preferidos para R^ são metilo e etilo, especiálmente metilo.

Os compostos de fórmula (I) po dem formar sais com bases como o hidróxido de sódio. Os compoÊi tos de fórmula (I) têm um átomo de azoto básico e podem formar sais por adição de ácido por exemplo ácido clorídrico. Tais compostos fazem parte do presente invento.

Em todas as situações em que os compostos de fórmula (I), ou os seus sais, formam solvatos ou hidratos, estes também constituem um aspecto do invento.

Os compostos de fórmula (I) podem ter um, dois ou três centros assimétricos e por esta razão existem em mais do que uma forma estereoisomérica. O invento abrange todas estas formas e as suas misturas, incluindo racematos, e misturas diastereoméricas.

Os isómeros preferidos são os que têm a configuração S_ no centro quiral marcado com um astje risco na fórmula (I).

Os compostos de fórmula (I) ou os seus sais, solvatos ou hidratos estão preferivelmente em

-8forma farmaceuticamente aceitável ou substanciaimente pura. Por forma farmaceuticamente aceitável quer-se dizer, entre outras coisas, com um nível de pureza farmaceuticamente aceitável excluindo aditivos farmacêuticos normais tais como diluentes e veículos,e não incluindo material considerado tóxico em níveis de dosagem normal.

Uma forma substanciaimente pura conterá geralmente pelo menos 50% em peso, preferivelmente 75%, mais preferivelmente 90% e ainda mais preferivelmente 95% ou 99% ou mais do composto de fórmula I ou um seu sal ou solvato.

Os compostos de fórmula (I) ou os seus sais, solvatos ou hidratos podem ser isolados como sólidos cristalinos ou na forma de espumas ou gomas.

Uma forma farmaceuticamente aceitável preferida é a forma cristalina.

O presente invento prepara os compostos de fórmula (I) ou os seus sais, solvatos ou hidratos farmaceuticamente aceitáveis para uso como agentes terapêuticos activos, particularmente como agentes para o tratamento de desordens músculo-esqueléticas resultantes de actividades colagenolíticas, particularmente doenças artríticas, e substitui ção de tecido, e para uso na quimioterapia sistémica do cancro.

O presente invento também proporciona um processo para a preparação de um composto de fórmu la (I) o qual compreende a separação de um grupo R-^θ de um com posto de fórmula (II):

-N

H (II)

O

II

-9em que R-^θ representa alquilo ou benziio facultativamente subs tituído e R^ ' representa R^ ou um grupo ou átomo nele converti, vel, e Rg, R₉, R^, e R^ são definidos do mesmo modo que para a fórmula (I),e onde necessário, convertendo R^' para R^.

A separação de R-^θ pode ser levada a cabo em ácido ou álcali aquoso ou usando um haleto de trimetilsililo, preferivelmente bromotrimetilsilano, num solvente inerte, por exemplo diclorometano. Os ésteres de benziio podem ser removidos alternativamente por hidrogenólise ou por outro processo de desbenzilação estandardizado.

Onde o composto de fórmula (i) por um derivado do ácido fosfónico (R^=OH), R^' no composto de fórmula (II) representa como convém alcóxido por exemplo metóxi do ou etóxido, ou benzilóxido, tal que a separação não só de R^' mas também de R-^θ é, convenientemente efectuada numá única reacção.

Os compostos de fórmula (II) podem ser preparados por tratamento de um composto de fórmula (III):

(III)

-10em que R^', R£, a fórmula (II),

R3, e R_1q são definidos do mesmo modo que para com um composto de fórmula (IV):

NHR₅ (IV) em que R^ e Rg são definidos do mesmo modo que para a fórmula (I).

A reacção é de preferência leva da a cabo na presença de um agente de acoplamento, tal como diciclo-hexilcarbodiimida ou hidrovloreto de l-etil-3-/ 3-(dimetilamino )propil /carbodiimida na presença de 1-hidroxibenzotriazole, ou usando 1,1'-carbonildiimidazole, num solvente iner te tal como o diclorometano ou o acetonitrilo.

Os compostos intermediários de fórmula (III) podem ser preparados pelo tratamento de um composto de fórmula (V) ou um seu sal:

R

NH, // \

0^z OR (V)

-liem que R^ ¹ R2, e R-^θ são definidos do mesmo modo que para a fórmula (II), com um composto de fórmula (VIA) ou (VI B) ou um seu sal:

R.

(VI A)

R.

(VI B) ^CO2^R12 ^C°2^R12 em que R^ é definido do mesmo modo que para a fórmula (I), Rrepresenta um grupo separável tal como halogénio, metanosul fonilóxi ou trifluorometanosulfonilóxi e R^ representa hidrogénio ou um grupo protector do carboxilo, e, conforme o caso, removendo um grupo R^ protector do carboxilo.

Quando é usado um composto de fórmula (VI B), a aminação redutora pode ser levada a cabo por hidrogenação sobre um catalisador de metal nobre tal como palá dio sobre carbono ou por reacção com cianoboro-hidreto de sódio a pH 6 a 7. Os alcoóis alguílicos inferiores usados como solventes, tal como o metanol e o etanol, são adequadas para ambas as reacções. Estas reacçoes podem ser levadas a cabo na presença de crivos moleculares.

É preferida a reacção de hidrogenação mas este processo exclui o uso de um composto de fórmu la (VIB)no qual R-^ seja benzilo. 0 grupo protector do carboxilo é preferivelmente um éster de metilo ou de etilo. Os grupos protectores ésteres podem ser removidos sob condições de

-12hidrólise básica estandardizadas usando uma base diluída tal como hidróxido de sódio 1 Normal em metanol.

Quando o composto de fórmula (V) está na forma de base livre, o composto de fórmula (VIB) é apropriadamente um ot-cetoéster (^rj2^ ^H)·

Quando o composto de fórmula (V) for um sal, tal como o sal hidrocloreto, o composto de fór mula (VI B) é apropriadamente um sal de um (Z-cetoácido (Rl2=H), por exemplo um sal de sódio.

A preparação de compostos de fórmula (III) usando um composto de fórmula (VI A) pode ser levada a cabo sob condições de alquilação estandardizadas. Um grupo separável de halogénio é de preferência o bromo e um gru po separável de base oxigénio é de preferência o trifluorometanosulfonilóxi.

Os compostos de fórmula (III) nos quais R^' é alcóxido podem ser alternativamente preparados por condensação de um composto de fórmula (VII) ou um seu sal:

^CO2^R12 (VII) em que R^ é definido do mesmo modo que para a fórmula (I) e R^2 representa um grupo protector de carboxilo com um aldeído R₂-CHO em que R₂ é definido do mesmo modo que para a fórmula

-13(I) e tratando o produto da condensação com um fosfito de dialquilo apropriado, por exemplo fosfito de dimetilo, e depois dis; so removendo o grupo protector do carbonilo. 0 grupo carboxilo é convenientemente protegido como um éster de alquilo ou de ben zilo o qual pode ser removido usando condições de hidrólise ou de hidrogenação estandardizadas.

Os compostos intermediários de fójr mula (V) são ou compostos conhecidos ou podem ser preparados a partir de conhecidos derivados do ácido aminometil-fosfínico, usando processos estandardizados para introduzir como for reque rido os grupos variáveis e R₁₀ ·

Pode ser necessária a protecção.da função amina durante estas reacções.

A introdução de um grupo metilo pode ser efectuada pela reacção com diazometano num solvente inerte adequado.

Os compostos de fórmulas (IV) e (VII) são ou conhecidos derivados de aminoácidos ou podem ser feitos a partir destes derivados por métodos conhecidos. Os com postos de fórmulas (VI A) e (VIB) são ou compostos conhecidos ou podem ser preparados a partir de compostos conhecidos por métodos conhecidos.

Os intermediários de fórmula (II), (III), e alguns intermediários de fórmula (V) aqui revelados são compostos novos e constituem um aspecto do presente invento como é o caso dos processos descritos para a sua preparação.

Onde obteníveis, os sais dos compostos de fórmula (I) farmaceuticamente aceitáveis podem ser convencionalmente formados pela reacção com o ácido ou base apropriada. Os solvatos podem ser formados por cristalização a partir do solvente apropriado.

-14Como foi previamente mencionado, os compostos de fórmula (I) existem em mais do gue uma forma diastereomérica. Sempre gue os processos do invento produzem misturas destas formas, os isómeros individuais podem ser sepa. rados um do outro por cromatografia por exemplo HPLC.

Alternativamente, os compostos diastereoméricos separados de fórmula (I) podem ser obtidos pe lo uso de materiais à partida estereomericamente puros ou pela separação dos isómeros desejados dos intermediários em qualquer passo do processo de síntese na sua globalidade, e convertendo estes intermediários para compostos de fórmula (I).

Além disso, o presente invento prc> porciona uma composição farmacêutica, que inclui um composto de fórmula (I), ou um seu sal ou solvato farmaeeuticamente aceita, vel, e um veículo farmaeeuticamente aceitável.

Uma composição deste invento é van. tajosa no tratamento de reumatismo e artrite e no tratamento de outras condições colagenolíticas.

Uma composição do invento, que po de ser preparada por mistura, pode conter um diluente, ligante, agente de enchimento, disintegrante, agente aromatizante, agen te corante, lubrificante, conservante da maneira convencional. Estes excipientes podem ser empregados de maneira convencional, por exemplo como na preparação de composições de relatados ini. bidores de enzima peptídica, tal como enalapril inibidor de ACE.

Uma composição do invento, pode ser adaptada para administração oral, tópica, percutânea, rectal ou parenteral-intravenosa, intramuscular, sub-cutânea, intradérmica ou intra-articular, mas é preferida a administração oral.

Preferivelmente, uma composição farmacêutica do invento é em forma de dosagem unitária e numa forma adaptada para uso nos campos médico, e veterinário. Por exemplo, tais preparações podem existir numa forma de embalagem

15acompanhada por instruções escritas ou impressas para uso como um agente no tratamento ou profilaxia de qualquer das desordens antes já mencionadas.

A gama de dosagens adequadas para os compostos do invento pode variar de composto para composto e pode depender da condição a ser tratada. Ela também dependerá entre outras coisas, da relação da capacidade de absorção e do modo de administração escolhida.

composto ou composição do inven to pode ser formulada para administração por qualquer via, dependendo a via preferido da desordem para a qual o tratamento por requerido, e é preferivelmente em forma de dosagem unitária ou numa forma que um paciente humano possa administrar a si próprio numa dosagem única.

As composições podem, por exemplo , ser em forma de comprimidos, cápsulas, carteiras, saquetas, frascos pequenos, ampolas, pós, grânulos, pastilhas, pós recons tituíveis, ou preparações líquidas, por exemplo soluções ou sus pensões, ou supositórios.

As composições, por exemplo as ade guadas para administração oral, podem conter excipientes conven cionais tais como agentes ligantés, por exemplo xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto ou polivinilpirrolidona; agentes de enchimento, por exemplo lactose, açúcar, amido de milho, fos fato de cálcio, sorbitol ou glicina; lubrificantes para comprimidos, por exemplo estearato de magnésio; desintegrantes, por exemplo amido, polivinilpirrolidona, glicolato de amido e sódio ou celulose microcristalina; ou agentes de fixação farmaceuticamente aceitáveis tais como sulfato de laurilo e sódio.

-16As composições sólidas podem ser obtidas por métodos convencionais de mistura, de enchimento, de fazer comprimidos ou semelhantes. Pdem ser usadas repetidas operações de mistura para distribuir o agente activo completamente por aquelas composições que empregam grandes quantidades de agentes de enchimento. Quando a composição existe na forma de um comprimido, pó ou pastilha, qualquer veículo adequado po de ser usado para as composições farmacêuticas sólidas, sendo exemplos estearato de magnésio, amido, glicose, lactose, sacarose, farinha de arroz e giz. Os comprimidos podem ser revesti, dos de acordo com métodos bem conhecidos na prática farmacêutji ca normal, em particular com um revestimento eutérico. A composição pode também ser na forma de uma cápsula ingerível, por exemplo de gelatina contendo o composto, se desejado com um veículo ou outros excipientes. Por exemplo, numa cápsula de g_e latina dura contendo a quantidade requerida de um composto do invento na forma de um pó ou granulado em íntima mistura com um lubrificante, tal como estearato de magnésio, um agente.de enchimento, tal como celulose microeristalina, e um desintegrante, tal como amido glicolato de sódio.

As composições para administração oral na forma de líquidos podem ser na forma de, por exemplo, emulsões, xaropes, ou elixires, ou podem ser apresentados co mo um produto seco para reconstituição, antes de ser usado, com água ou outro veículo adequado. Tais composições líquidas podem conter aditivos convencionais tais como agentes de suspen são, por exemplo sorbitol, xarope, metil celulose, gelatina, hidroximetilcelulose, carboximetilcelulose, gel de estearato de alumínio, gorduras hidrogenadas alimentares; agentes emulsionantes , por exemplo lecitina, mono-oleato de sorbitano, ou acácia; veículos aquosos e não aquosos, os quais incluem óleos alimentares, por exemplo óleo de amêndoa, óleo de coco fraccio^ nado, ésteres oleosos, por exemplo ésteres de glicerina, ou propileno-glicol, ou álcool etílico, glicerina, água ou solução salina normal; conservantes, por exemplo p-hidroxibenzoato

de metilo ou de propilo ou ácido sórbico;e, se desejado, agen tes aromatizantes e corantes, convencionais.

Os compostos deste invento podem também ser administrados por uma via não oral. De acordo com processos farmacêuticos de rotina, as composições podem ser for muladas, por e xemplo para administração rectal como um supositó rio ou por administração parenteral (ou parentérica) numa forma injectável. Para injecção, por exemplo por injecção intra-articular como depósito acumulado fracamente disperso, os compostos do invento podem ser apresentados numa solução aquosa ou não aquosa, suspensão ou emulsão num líquido farmaceuticamente ad£ quado, por exemplo água livre de pirogénios e estéril ou um óleo parentéricamente aceitável ou uma mistura de líquidos, que podem conter agentes bacteriostáticos, anti-oxidantes e outros conservantes, tampões ou solutos para tornar a solução isotóni. ca com o sangue, agente espessante, agentes de suspensão ou outros aditivos farmaceuticamente aceitáveis. Tais formas serão apresentadas esn dose unitária estéril tal como ampolas ou dispositivos para injecção disponíveis ou em formas multi-dose tais como um frasco do qual a dose apropriada pode ser retira, da ou uma forma sólida ou concentrada que pode ser usada para preparar uma formulação injectável.

Para administração tópica e percu tânea, as preparações podem também ser apresentadas como porna da, creme, loção, gel, spray, aerosol, lavagem, tintura para a pele ou emplastro.

A dose unitária para doenças infla matérias conterá geralmente de 10 a 1000 mg e conterá preferivelmente de 10 a 5 oo mg, em particular 10 , 50 , 100 , 150 , 200 , 250 , 300 , 350 , 400 , 450 ou 500 mg. A composição pode ser administrada uma ou mais vezes por dia, por exemplo 2,3 ou 4 vezes por dia, de tal modo que a dose diária total para um adulto de 70 kg se situará normalmente no intervalo de 10 a 3000 mg. Alternativamente, em particular para injecção, a dose unitária

-18conterá de 2 a 200 mg de um composto do invento e será admini^ trada em múltiplos, se desejado, para dar a dose diária desejada.

Adicionalmente, o presente invento proporciona um método de tratamento de uma condição colagenolítica tal como reumatismo e/ou condições artríticas, ou cancro, ou outras doenças nas quais o colapso de componentes do tecido conjuntivo mediado por enzimas tem nos mamíferos um papel, nomeadamente nos humanos, o que inclui a administração de uma quantidade efectiva de um composto de fórmula (I) ou um seu sal solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável, ao mamífero.

presente invento também proporciona o uso de um composto de fórmula (i) ou um seu sal, solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável, para o fabrico de um medicamento para ser usado como uma substância terapêutica activa, partieularmente no tratamento de condições colagenioljí ticas, tais como reumatismo, cancro, desordens ósseas, doenças de pele, doenças periodontal ou ulceração corneai, nos mamíferos .

As seguintes Descrições e Exemplos ilustram a preparação de compostos do invento e os subsequentes dados biológicos ilustram a sua actividade farmacológica. Todas as temperaturas são expressas em °C.

-19Descrição 1

N-(l-fosfonoetil)-leucina éster de trietilo (Dl)

(Dl)

O ácido / 1-Λ (ienilmetil)amino / /etil/fosfónico, éster de dietilo (2,76 g) J preparado pelo pro cesso de F.R. Atherton et al. J. Med. Chem. 29 , 29, 1986 / foi dissolvido em etanol (100 ml) e hidrogenado sobre paládio e 102 em carvão à pressão atmosférica. Foram adicionados (4-metil-2-οχο) pentanoato de etilo (1,58 g) e crivos moleculares e a hidrogenação continuou por 48 h. 0 catalizador foi removido por filtração e o filtrado foi evaporado no vácuo obtendo-se um óleo incolor, que foi cromatografado sobre gel de sílica, eluindo com acetato de etilo, para dar o composto indicado no título como uma mistura de isómeros (0,83 g).

Descrição 2

N-(1-Dietoxifosfiniletil)-leucina (D2 )

Método A

N-(l-fosfonoetil)-leucina éster de trietilo (Dl) (0,81 g) foi dissolvido em metanol (30 ml) e tratado com hidróxido de sódio (0,2 g) em água (15 ml). Após 24 h, a solução foi acidificada com HCl 5N e extractado com diclorometano. Os extractos orgâni. cos foram secos sobre sulfato de sódio anidro e o solvente foi removido no vácuo para se obter o composto indicado no .título (0 ,66 g) .

λ

Método B

Uma solução do sal hidrocloreto de ácido /*l-(fenilmetil)amino7etil /fosfónico éster de dietilo (15 g) dissolvido em etanol (400 ml) foi hidrogenados sobre pa. ládio a 102 em carvão à pressão atmosférica até que a conversão para amina primária estivesse completa. O sal de sódio do ácido 4-metil-2-oxo pentanóico num volume mínimo de água foi então adicionado e a hidrogenação continuou durante 3 dias. O catalizador foi removido por filtração e o filtrado foi evaporado no vácuo para se obter um óleo incolor gue foi então rece

bido em clorofórmio e lavado com água (30 ml) seguida por ácido cítrico diluído (2x30 ml) e por mais uma lavagem aquosa. Depois de uma secagem (Na₂SO^) a camada de clorofórmio foi evapo rada até à secura para dar o composto indicado no título como um sólido branco e viscoso tendo as mesmas propriedades espectroscópicas que o material obtido no método A.

Descrição 3

I N- /N-(l-Fosfonoetil)-leucil7-N,0-dimetil-L-tirosinamida, éster de dietilo (D3)

O composto N-(1-fosfonoetil)leuci. na, éster de dietilo (D2) (0,66 g) foi arrefecido até O°C em di. clorometano (25 ml). Foram adicionados 1-hidroxibenzotriazole (0,37 g) e diciclo-hexilcarbodiimida (0,57 g) e a solução foi agitada a O°C durante l/² h. Após /² à temperatura ambiente, a solução foi arrefecida até 0°C e foi-lhe adicionada gota a gota O-metil-L-tirosina N-metilamida (0,52 g) em diclorometa no (25 ml). A solução foi agitada à temperatura ambiente duran te 6 h, filtrada, lavada com solução saturada de bicarbonato de sódio, seca com sulfato de sódio anidro e evaporada no vácuo para se obter um óleo incolor. Uma purificação por cromatogra

-22fia em coluna sobre gel de sílica, eluindo com metanol a 2%/cl£ rofórmio, deu o composto mencionado no título como um óleo incolor (0,8 g) .

M⁺ observado 485,2654 ; ^C23^H40^N3°6^P exige M 485,2650 .

Descrição 4

Ácido fenilmetilaminometil fosfónico, éster de dietilo (D4)

(D4)

Uma mistura de N-benzil-hexa-hi.

drotriazina (9,2 g; 0,0 25 mol) e fosfito de dietilo (9,8 g;0,07 mol) em tolueno seco foi aquecida com refluxo durante 3 ² h e deixada com agitação à temperatura ambiente durante a noite.

O tolueno foi removido por vácuo e o resíduo oleoso foi acidificado para pH 3-4 com HC1 5N e lavado com acetato de etilo. A fracção aquosa foi então basificada com solução de carbonato de sódio a 10% e extractada com acetato de etilo (3 x 50 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água, seca e evaporada à secura para dar um óleo amarelo, que foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica, eluindo com acetato de etilo, para se obter o composto mencionado no tí tulo (3g).

-23Descrição 5

Ácido C*--aminoetil fosfónico, éster de dietilo (D5)

H C_0. 5 2 //

OC_H. 2 3 (D5)

Foi dissolvido ácido fenilmetil aminometil fosfónico éster de dietilo (D4) (l,lg) em etanol (100 ml) e hidrogenado sobre paládio a 10% em carvão à pressão atmosférica. O catalisador foi removido por filtração e o filtrado evaporado a vácuo para se obter um óleo incolor qu'e foi cromatografado sobre gel de sílica, eluindo com metanol a 10%/ /clorofórmido, para dar o composto mencionado no título (0,60 ç

Descrição 6

N-(Dietoxifosfinilmetil)-leucina (D6)

CH.

AAh.

^H5^C2°\ /(l ^C02^H o oc₂h₅ (D6)

Foi dissolvido ácido ©t-aminometil fosfónico, éster de dietilo (D5) (600 mg) em HC1 etanólico e evaporado a vácuo para dar o sal hidrocloreto. O sal hidrocloreto e o sal sódico do ácido 4-metil-2-oxopentanóico (480 mg; 0,00 3 mol) foram dissolvidos em etanol-água (50%, 80 ml) e hidrogenado sobre paládio a 10% em carvão à pressão atmosférica durante 48 h. O catalisador foi removido por filtração e o filtrado evaporado a vácuo. O óleo resultante foi triturado com clorofórmio, e o cloreto de sódio precipitado foi removido por filtração. O filtrado foi evaporado a vácuo para dar o com posto mencionado no título como uma mistura de isómeros (800 mg 89%) .

Descrição 7

N-/~N-(Fosfonometil) -leucil^-N,O-dimetil-L-tirosinamida, éster de dietilo (D7)

-250 composto mencionado no título foi preparado com rendimento de 30% como um sólido branco a partir de N-(dietoxifosfinilmetil)-leucina e de O-metil-L-tiro sina N-metilamida pelo método da Descrição 3, usando hidrocloreto de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida em vez de diciclo-hexilcarbodiimida.

Descrição 8

N-(1-Dimetoxifosfinilpropil)-leucina (D8)

CH.

^C2^H5

-CH.

(D8)

H-CO * \

OCH

-Ν'

H co₂h

Foi dissolvido o ácido /*l-/*(fe nilmetil) amino.7propil.7f osf ónico , éster dimetílico, sal hidrocloreto (llg) / preparado pelo processo de F.R. Atherton et al.

J. Med. Chem. 29, 29, 1986 / em etanol (200 ml) e hidrogenado sobre paládio a 10% em carvão à Pressão atmosférica. Adicionou -se o sal de sódio do ácido 4-metil-2-oxopentanóico (7,0 g ) e o hidrogenação continuou durante 48 h. O catalizador foi removido por filtração e o filtrado foi evaporado a vácuo para dar um óleo. 0 óleo foi triturado com clorofórmio, e o precipitadc de cloreto de sódio foi removido por filtração. A fase orgânica foi lavada com água seca (MgSO^) e evaporada até à secura para dar o composto mencionado no título como uma mistura de

-26isémeros (5,83 g).

Descrição 9

N-/-N-(1-Fosfonopropil)-leucil_7-N,0-dimetil-L-tirosinamida éster de dimetilo (D9)

H-.CO

(D9)

OCH.

composto mencionado no título foi preparado com rendimento de 30% a partir de N-(l-dimetoxifosfinilpropil)-leucina (D8) pelo método da Descrição 3.

Descrição 10

N-(l-Dimetoxifosfinil-2-metilpropil)-leucina, éster de benzilo (D10 )

^c°2^CH2^Ph t \ ' H ^ϋ och₃

-27Uma mistura de 2-metilpropionaldeído (1,08 g), sal p-toluenosulfunato éster de benzilo de leucina e trietilamina (2,1 ml) em tolueno (100 ml) foi aquec_i da com refluxo durante 2 h num aparelho de Deam e Stark. Foi adicionado fosfito de dimetilo (1,65 g) e a solução refluxou durante 24 h. A solução foi arrefecida e o solvente evaporado a vácuo para dar um óleo amarelo que foi cromatografado sobre gel de sílica, eluindo com acetato de etilo, para dar o compos^ to mencionado no título como uma mistura de isómeros (3,36 g).

Descrição 11

N-(1-Dimetoxifosfinil-2-metilpropil)-leucina (D11)

N—(1-Dimetoxifosfini1-2-metilpropil)-L-leucina éster de benzilo (D10) (3,3g) foi dissolvido em metanol (100 ml) e hidrogenado sobre paládio a 10% em carvão à pressão atmosférica.0 catalisador foi removido por filtração e o solvente foi removido em vácuo para dar um rendimento acei tável do composto mencionado no título.

-28Descrição 12

N- /N-(l-Fosfono-2-metilpropil) -leucil J-N,O-dimetil-L-tirosinamida, éster de dimetilo (D12)

Foi arrefecido a 0°C N-(l-dimetoxifosfinil-2-metilpropil)-L-leucina (Dll) (2,6 g) em diclo rometano (100 ml).

Foram adicionados 1-hidroxibenzotriazole (1,57 g) e hidrocloreto de l-etil-3-(3-dimetil aminopropil)carbodiimida (2,3 g) e a solução foi agitada a O°C durante /² h. Foi adicionada gota a gota O-metil-L-tirosina N-metilamida (2,1 g) em diclorometano (25 ml). A solução foi agitada a 0°C durante lh e à temperatura ambiente durante 24 h. A solução foi filtrada, lavada com água, solução saturada de bi carbonato de sódio e solução a 10% em ácido cítrico e seca com sulfato de sódio anidro. A solução foi filtrada e o solvente evaporado a vácuo para dar um óleo amarelo. Uma purificação por cromatografia em coluna sobre gel de sílica, eluindo com metanol a 10% / acetato de etilo, deu o composto mencionado em títu lo como uma mistura de 4 diasteroisómeros.

-29Discrição 13

N- /N-d-FosfonoetiD-leuciiy-N-metil-L-triptofanamida, éster de dietilo (Dl3)

N-(1-Dimetoxifosfiniletil)-leu cina (D2) (lg, 0,0039 mol) em acetonitrilo foi arrefecido até 0°C num banho de gelo e foi adicionado 1,1'-carbonildiimidazole (0,55 g, 1 equiv.). A mistura foi agitada a esta temperatura du rante 1 h antes de se lhe adicionar uma solução de triptofano N-metilamida (0,81 g; 1,1 equiv.) em acetonitrilo (10 ml). Depois de ser agitada à temperatura ambiente durante a noite a solução foi evaporada até à secura, recebida em acetato de eti. lo e lavada primeiramente'com ácido cítrico diluído (x2), depois com água seguida por hidróxido de sódio diluído (x2) e finalmente com água. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada até à secura. A goma resul^ tante foi cromatografada sobre gel de sílica (100 g) inicialmen te com clorofórmio como eluente subindo com passos de 10% para metanol a 5% /clorofórmio. As fracções 23 a 28 continham várias proporções dos quatro possíveis diastereómeros do composto men cionado no título (0,78 g no total).

EXEMPLO 1

N-/N- (1-Fosfonoetil)-leuciJ-N,O-dimetil-L-tirosinamida (EI)

Dissolveu-se o éster' de dietjL lo (D3) (0,4 g) em diclorometano. (10 ml) e tratou-se com brom<3 trimetilsilano (5 ml). A solução foi agitada à temperatura ambi ente durante 48 h, foi adicionado metanol (20 ml) e o solvente foi evaporado a vácuo para dar o composto mencionado no título uma espuma amarela, como uma mistura de 4 diastereómeros (0,37 g) (El). Acromatografia em coluna do produto cru (150 mg) usando sílica de fase invertida, eluindo com um gradiente de 5% a 30% de metanol em água, deu como uma mais rápida fracção uma mistura 1:1 de 2 diastereómeros. Isómeros El A/B (30 mg).

£(CDClg):0 ,80 (6H,m), l,16(4H,m), 1,44 (3H.m),

2,58 (3H,m) , 2,78 (lH,m) , 2,98 (lH,m) , 3,52 (0 ,5 H, larjo s) ,

3,71 (3H,s), 3,88 (0 ,5 H, larjo s) , 4,46 (lH,m) , 6,82 (2H,m) ,

7,16 (2H,m), 8,18 (1H, larjo s) , 8,80 (14,m).

Observou-se FAB (M+H)⁺ 430 . ^C]_9^H32^N3°6^{P rec}?^uer 429.

Uma eluição adicional deu como uma mais lenta fracção uma misturas de 2 diastereómeros.

Isómero EI C/D (20 mg). Obser vou-se FAB (M + H)⁺ 430 . ^cj_9 ^H32^N3°6^P requer M 429.

Separação de Isómeros EI A/B

O isómero El A/B foi separado em diastereómeros isolados por um preparativo de HPLC num colu na de Hamilton PRP-1, eluindo com 25:75 metanol/acetato de amónio aquoso 0,0 5M, pH5,0 , para dar:

Isómero A : (CD₃OD): 0,87(3H,d), 0,92(3H,d), l,26(3H,dd),

1,45 (34,m), 2,65 (lH,dd), 2,70 (3H, s), 2,84 (lH,dd), 3,10 (lH,dd)

3,63 (1H, largo t) , 3,74 (3H,s), 4,60 (lH,dd), 6 ,82 (2H,d) , 7,16 (2H,d).

Isómero B : <£ (CD₃OD): 0 ,90 (3H,d) , 0 ,94 (3H,d) , 1,25 (3H,dd) ,

1,54 (3H,m) , 2,61 (lH,dd) , 2,69 (3H,s), 2,87 (lH,dd), 3,05 (lH,dd),

3,75 (3H,s) , 4,16 (1H, largo t) , 4,58 (lH,dd) , 6,84 ( 2H ,d) , 7,18 (2H,d).

-32Ν-/~Ν- (Fosfonometil) -leucilJ-N ,0-dime til-L-tiros inamida , sal de dissódio (E2)

EXEMPLO 2

(E2) éster de dietilo (D7) (0,4g) foi dissolvido em diclorometano (10 ml) e tratado com bromotri metilsilano (1 ml). A solução foi agitada à temperatura ambien te durante 48 h, foi adicionado metanol (20 ml) e o solvente foi evaporado a vácuo para se obter um óleo amarelo. Este foi purificado por cromatografia em coluna usando sílica de fase invertida e eluindo com um gradiente de 5% a 10% de metanol em água para dar o diácido como um sólido branco p.f. 260-262°C

Observou-se FAB (M + H)⁺ 416.

^C18^H30^N3°6^{P rec}?^uer M 415. 0 diácido foi agitado com solução de hidróxido de sódio em metanol (20 ml) durante /₂ h. O solven te foi evaporado e vacúo para dar o composto mencionado no tí.

tulo como um sólido branco como uma mistura de isômeros (150 mg

EXEMPLO 3

N-£N- (1-Fosfonopropil)-leucilj-N,0-dimetil-L-tirosinamida (E3 )

O composto mencionado no título foi preparado a partir de (D9) como uma mistura de 4 diastereó meros pelo método do Exemplo 1. A cromatografia em coluna do produto cru usando sílica de fase invertida e eluindo com um gradiente de l%-5% de metanol em água deu como uma mais rápidô fracção uma mistura de 2 diastereómeros. Isómero E3 A/B (100 mg) p.f. 160°-163°C; observou-se FAB (M + H)⁺ 444; ^c2o^H34^N3^P06 requer M 443.

Uma eluição adicional deu como um mais lenta fracção uma mistura de 2 diastereómeros. Isómero E3 C/D (80 mg) p.f. 164-168°C. Observou-se FAB (M + H)⁺ 444; ^C20^H34^N3^PO6 ^re<T^uer M 443. Finalmente foi obtido o isómero iso lado E3 D.

-34Separação de Isómeros E3 A/B método HPLC descrito no Exemplo 1 foi usado para separar o isómero E3 A/B em diastereómeros isolados.

Isómeros A: p.f. 160-163°C

J(CD₃OD) : o,85 (3H,t),0,92 (3H,d),0,96 (3H,d) 1,4-1,72 (4H,m), 1,72-1,95 (lH,m), 2,33 (lH,m), 2,7 (3H,s), 2,84 (lH,dd)

3,03 (lH,dd), 3,75 (3H,s), 4,22 (1H, brt), 4,56 (lH,dd), 6,86 (2H,d), 7,19 (2H,d).

Isómero B : p.f. 148-150°C.

(CD₃OD): 0 ,89 (3H,d), 0 ,93(3H,d), 0 ,99 (3H,t), 1,35-1/95 (5H,m), 2,68 (4H,m), 2,87 (lH,dd), 3,08 (lH,dd), 3,75 (3H,s) 3,82 (1H, brt), 4,58 (lH,dd), 6,84 (2H,d), 7,17 (2H,d).

-35EXEMPLO 4

N-^N-(l-Fosfono-2-metilpropil) -leucil^-N ,O-dimetil-L-tirosina.

mida (E4)

éster de dimetilo (D12) (0 ,5 g) foi dissolvido em diclorometano (10 ml) e tratado com bromo trimetilsilano (1,4 ml). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 48 h, foi adicionado metanol (20 ml) e o solvante evaporado a vácuo para se obter o produto cru como uma espuma amarela. A cromatografia em coluna do produto cru usan do sílica da fase invertida, eluindo com um gradiente de 5% a 10% de metanol em água, deu o composto mencionado no título co mo uma mistura de isómero (0,3 g).

Observou-se FAB (M + H)⁺ 458. ^21^36^3^^6^ ^rec3^uer íl 457.

-36N- /'N-(1-Fofonoetil )-leucil_7-N-metil-L-triptof anamida (E5)

EXEMPLO 5

Algumas das fracções da coluna obtidas na purificação do éster de dietilo de N- /N-(1-fosfonc> etil )-leucilJ-N-metil-L-triptof anamida (D13 ) foram individualmente desesterifiçados por tratamento com bromotrimetilsilano.

a) A fracção 25 do diéster (D13) (250 mg), que continham pelo menos 3 diastereómeros, a partir dos seus espectos rmn, foi convertida para o composto mencionado no título pelo método do E9. A purificação por cromatografia de fase invertida com H₂O aumentando para MeOH 50%/H₂O deu um sólido branco contendo 3 diastereómeros por rmn, sendo um deles o mais abundante (80%).

Uma purificação posterior por um preparativo de HPLC numa coluna de Hamilton PRP1 /fase móvel 7,5:92,5 acetonitrilo: acetato de amónio 0,05M (pH5) com um caudal de 7,0 ml/min/ / deu o componente mais abundante como um diástereómero isolado. Isómero E5. A $ (CD^OD) 0,87 (3H,d), 1,22 (3H,dd),

1,3-1,7 ( 3H,m), 2,6-2,8 (1H,m) sobrepondo-se em 2,67, (3H,s), 3,12 (dd,lH), 3,27 (dd,!H parcialmente obscurecido por

-37CHD₂OD), 3,75 (brt,lH) 4,72(lH,dd), 6,95-7,08 ( 2H,m),

7,11 (lH,s), 7,32 (lH,d), 7,6 (lH,d).

b) A fracção 27 do diéster D13(80 mg), essencialmente um dias tereómero isolado a partir dos seus espectros rmn, foi con vertido para o composto mencionado no título pelo método do El. Após operação metanôlica o resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica de fase invertida,inici^ almente com água como eluente que aumentou para metanol a 50% água, para dar um isómero isolado.

Isómero E5 B (18,8 mg). (CDjOD):0 ,92 (3H,d), 0,95 (3H,d),

1,18 (3H,dd), 1,58 (3H,m), 2,45 (lH,m), 2,72 (3H,s), 3,12 (lH,dd)

3,30 (1H, m parcialmente obscurecido pelo nível CHE>₂OD),

4,25 (lH,t), 7,07 (2H,m), 7,18 (lH,s), 7,35 (lH,d), 7,66 (lH,m). Em adiantamento, há indicações de um nível (m) abaixo do grande pico a 4,75 (HOD).

Observou-se FAB (M + H)⁺ 439; ^20^31^4θ5^ ^re<3^uer 438 .

c) A fracção 23 do diéster (D13) (80 mg), que, a partir dos seus espectros rmn, continha 2 diastereómeros, foi convertido para o composto mencionado no título seguindo o método do El. A cromatografia de fase invertida , com água aumentando para MeOH 30% H₂O como eluente, deu várias fracções contendo dois isómeros, uma fracção contendo os isómeros C/D numa proporção de 3,3:1. Isómeros E5 C/D (produto total

32,7 mg; a fracção acima 12 mg) 4(CD^OD): 0,5-0 ,7 (6H, m) , 1,18-1,5 (6H,m), 2,74 (s) /juntamente com 3H), 2,93-3,20 (2H,nv

3,3-3,6 (1H,m) , 4 ,0 3 (t) , 4,22 (dd) ( juntamente com 1H),

4,7-5,0 (lH,m), 6,95-7,15 (3H,m), 7,33 (lH,d), 7,62 (lH,d).

-38A expansão da região para os sinais a 4,22

3,9-4,4 deu os C/D na proporção de e 4,0 3 respectivamente.

3,3:1

ENSAIO DQ INIBIDOR DE COLAGENASE

O teste é realizado essencialmente como em Cawston e Barret Anal. Biochem.99. 340-345 (1979) Os compostos para os testes de ensaio foram dissolvidos em metanol e adicionados a colagenase de osso de coelho purificada ou a colagenase humana purificada a partir das culturas sobrenadantes de linha de células de fibroblasto do pulmão humano, WI-38, diluídas num tãmpão aquoso adequado. Depois de uns 5 min de pré-incubação a 37°C, os tubos de ensaio foram arrefecidos para 4°C e foi adicionado colagénio Tipo I de pele de rato o

C-acetilado. Os tubos de ensaio foram incubados a 37 C duran z z te a noite. Os C-colagemos formam fibrilas insolúveis que são o substrato para a enzima.

Para terminar o ensaio, os tubos de ensaio são feitos girar a 12000 rpm durante 25 min. O ¹⁴C-colagénio não digerido persiste como fibrilas insolúveis e z 14 z esta enovelado, enquanto o C-colagenio digerido fica na parte sobrenadante na forma de peptíderos solúveis. Foi recolhido uma amostra da parte sobrenadante para contagem por cintilação líquida.

A actividade dos inibidores de colagenase (ΙΟ^θ: 50% de concentração inibitória) é expre£ sa como a concentração de compostos que inibe uma concentração conhecida de enzimas (padrão) por 50%, ou como a % de inibição da degradação de colagénio causada pela concentração conhecida (padrão) de enzima, numa concentração estabelecida do composto.

-39Na tabela abaixo são ilustradas as actividades de compostos representativos do invento.

Inibição da colagenase de osso de coelho

Exemplo n2	Isómero	IC5o <μΜ)
1	A/B	0,275-1,9 (6 exp)
1	C/D	68% Inibição em 100
1	A	1,2 )
1	B	3,1 )
1	A/B	1 )
2	A/B	27:
5	B	0 ,69

Inibição da calagenase de fibroblasto do pulmão humano

Exemplo n2	Isómero	IC50 (JUM)
1	A/B	0 ,51
3	A/B	0 ,33
3	C/D	5,4
5	A	0,30 3
5	B	0 ,426
5	C/D	21,9

Claims (10)

1. REIVINDICÃÇOES lã. - Processo para a preparação de um composto de fórmula (I) ou de um seu sal, solvato ou hidrato :

   em que,

   R-j- representa hidrogénio ou hidroxido;

   R₂ representa hidrogénio ou alquilo;

   Rg representa alquilo Cg_g;

   R₄ representa hidrogénio, alquilo, -CH₂-Z, onde Z representa fenilo ou hetero-arilo facultativamente substituído ou R₄ representa um grupo.

   -CH-0-R_o

   O onde Rg representa hidrogénio, alquilo ou -CHg-Ph onde Ph representa fenilo facultativamente substituído e Rg representa hidrogénio ou alquilo; e

   Rg representa hidrogénio ou alquilo; caracterizado por compreender a separação de um grupo R^q de um composto de formula (II):

   (II) em que

   R₁₀ representa alquilo ou benzilo facultativamente substituído

   R'representa R^ ou um grupo nele convertível, e Rg, Rg, e Rg são definidos da mesma maneira que para a fórmula (I) na reivindicação 1, e quando necessário, a conversão de R¹^ em R^ .
2. 2ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R₁ representar hidroxido.
3. 3 °. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por Rg representar hidrogénio, metilo, etilo ou isopropilo.
4. 4ã. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por Rg repre sentar n-butilo, iso-butilo, ou sec-butilo.
5. 5ã. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por R₄ representar benzilo, 4-hidroxibenzilo, 4-metoxibenzilo ou 3-indolil metilo.
6. 6ã. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por Rg repre sentar metilo ou etilo.
7. 7ã. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado por R^ repre sentar hidroxido; Rg representar metilo ou etilo; Rg represen tar iso-butilo; R₄ representar 4-metoxibenzilo ou 3-indolilmetilo; e Rg representar metilo.
8. 8a. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o centro quiral marcado com um asterisco na fórmula (l) ter a configura.
9. 9â. - Processo de acordo com a

   -43reivindicação 1, caracterizado por o composto de fórmula (I) ser escolhido de entre:

   N-/N-(1-Fosfonoetil)-leucil_7-N,0-dimetil-L-tirosinamida;

   N-/”N' -(Fosfonometil )-leucilJ7-N, O-dimetil-L-tirosinamida;

   N-Τ' N- (1-Fosf onopropil) - leuci 1J7-N, O-dimetil-L-tirosinamida;

   N- /N- (1-Fosfono-2-metilpropil )-leucil J-N ,0-dimetil-L-tirosina mida; e

   N-/N- (1-Fosf onoetil) -leucilj/-N-metil-L-triptofanamida.
10. 10ã. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por compreen der a mistura de uma dose unitária de um composto de fórmula (I) como foi definido na reivindicação 1, ou um seu sal, solvato ou hidrato, farmaceuticamente aceitável, com um veículo farmaceuticamente aceitável.