PT87016B

PT87016B - Processo para a cultura de algas tendo efeitos biologicos aperfeicoados

Info

Publication number: PT87016B
Application number: PT87016A
Authority: PT
Inventors: Peter Literati Nagy; Jeno Szilbereky; Gabor Bozoki; Erzsebet Radvany; Miklos Fabian; Edit Szabo
Original assignee: Caola Kozmetikai
Priority date: 1988-02-09
Filing date: 1988-03-18
Publication date: 1993-09-30
Also published as: GB2214928A; HUT51669A; LU87172A1; NO881215D0; GR1000446B; SE8800991D0; NO881215L; PT87016A; FR2626890A1; IT8819836A0; AT389888B; SE8800991L; CN1034842A; BE1001675A3; IT1216140B; GB8806532D0; GB2214928B; ATA73588A; FR2626890B1; DK148888D0

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA DO INVENTO para

PROCESSO PARA A CULTURA DE ALGAS TENDO EFEITOS

BIOLÓGICOS APERFEIÇOADOS que apresenta

CAOLA KOSMETIKAI ES HÁZTARTÁSVEGYIPARI VALLÁLAT, húngara, industrial, com sede em 90, Bocskai ut, Budapest, Hungria

RESUMO

A presente invenção refere-se ao processo para a cultura de algas ricas em selénio tendo um efeito biológico melhorado. Em condições de cultura esterilizada, num processo fotossintético ou com exclusão de ar, desenvolve-se uma estirpe de algas que é capaz de incorporar adequadamente selénio, e cultiva-se num meio de cultura contendo selénio numa concentração compreendida entre 10 moles/litro e 2 x 10 ^J moles/litro.

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de algas tendo efeitos biológicos aperfeiçoados.

As algas têm sido usadas, desde há longo tempo pelo Homem, para fins de alimentação. Assim, eram consumidas, essencial2 : τ' ’ mente, pelos povos do Extremo Oriente. No entano, hoje em dia também são utilizadas, na sua forma seca ou em forma de comprimidos, pelos países desenvolvidos. As algas são os veículos de elementos de elevado valor nutritivo, uma vez que a sua forma seca contém concentrações elevadas de substâncias que são essenciais para a saúde, como sejam as vitaminas,proteínas, complexos de microelementos proteicos, sacarícLeos, ácidos gordos poli-insaturados e similares.

ι Na época actual- a poluição do ambiente tornou-se um problema à escala mundial. Hoje em dia a contaminação dos mares e oceanos pelos metais pesados tóxicos (por exemplo chumbo, mercúrio, cádmio, cobre) como também pelos agentes indutores de tumor (por exemplo compostos aromáticos policíclicos condensados) não pode ser considerado um problema desprezível. Estes agentes ao serem incorporados no organismo das algas começam a tornar-se um problema difícil. Deste modo, as algas completas obtidas a partir do mar ou cultivadas sob quaisquer condições naturais não podem ser usadas para fins de nutrição animal ou humana, alimentação, cosméticos e terapia; apenas podem ser utilizadas aquelas partes que tenham ficado isentas dos materiais nocivos biologicamente. Um processo de purificação deste tipo está descrito, por exemplo, por Carames de Guovéa (Cosmetics and Toiletries 95, 47 (1980)). No en tanto, uma operação de purificação significa uma intervenção que decompõe uma parte das substâncias activas biologicamente das algas pelo que o valor biológico da fracção de algas assim obtido é significativamente reduzido (Zajic: Properties and Products of Algae: Edition Planum, New York, (1970)).

Como consequência, a preparação de algas estérás, isentas dos efeitos nocivos ambientais, está-se a tornar cada vez mais im portante.

São conhecidos vários processos de cultura artificiais de algas que podem ser realizadas, por exemplo em tanque aberto ao sol ou em espaço fechado sob condições assegurando esterilida de, quer sob iluminação artificial ou natural quer por exclusão de qualquer tipo de luz.

De acordo com o pedido de patente japonês publicado sob o n9. 56.96690, as algas são cultivadas utilizando estirpes de algas marítimas em água salgada esterilizada, numa solução contendo vários sais nutrientes sob uma fonte de luz artificial.

De acordo com o pedido de patente japonês publicado sob o n2. 45.17146, a cultura industrial de algas Chlorella verdes unicelulares é levada a cabo num meio de cultura constituído por água doce e com exclusão de dióxido de carbono e luz.

A cultura de algas verdes unicelulares em água doce também está descrita na especificação da patente francesa n^. 2103462, de acordo com a qual a cultura à escala industrial é realizada fotossintéticamente utilizando soluções nutrientes contendo os respectivos sais nutrientes apropriados.

De acordo com os pedidos de patente húngaros nSs. 4613/84 e 4614/84 a cultura de algas é realizada em água mineral de ori gem natural, em água termal ou medicinal ou numa sua mistura enriquecida com um composto metálico até uma concentração de 10”² mole/litro.

Em qualquer das soluções conhecidas as algas utilizadas para alimentação, forragem ou medicamentos são produzidas artificialmente sob condições estéreis. Segundo estes processos as algas assim obtidas são cultivadas respeitando as condições de que resultam serem as propriedades idênticas às das algas em crescimento espontâneo na Natureza sob condições ambientais não prejudiciais; ou das propriedades das algas assim produzidas serem ligeiramente diferentes, dependendo do modo da cultura artificial.

As algas cultivadas artificialmente utilizando os processos

da técnica anterior contêm apenas traços de elementos variados como sejam o selénio, zinco ou prata.

Sabe-se também que o selénio apresenta uma função biológica versátil como o demonstra os estudos publicados por Thressa et al. (Nutrition Review 35, 7 (1977)), Shamberger (J. of Env, Path. and Tox. 4, 305 (1980)) ou Masukawa et al. (Experientia ;39, 405 (1983)). Deste modo, é sabido que o próprio selénio tem um efeito hipotensivo, melhora os estados de isquemia, hlpoxia e enfarte do coração e inibe a lipofuscinose ceroidal , do sistema nervoso central; também exerce um efeito benéfico sobre a periodontite e provou minimizar a probabilidade do 'desenvolvimento das doenças canceríginas; para além disto, é considerado ser um agente inibidor da mutagénese. Um variado número de alterações ou doenças, nomeadamente a necrose do fígado, mionécronse; destruição da membrana eritrócita, lesões intersticiais, elevação ST no ECG, síndrome de Kwashiorcor (deficiência em proteínas) e esclerose múltipla provaram ser ocasionadas por uma deficiência em selénio.

A acção benéfica do selénio é baseada, principalmente, no seu efeito activador dirigido ao enzima peroxidase-glutationa que é o inibidor endogénio mais importante dos nocivos processos de peroxidação. Sendo um constituinte indispensável do grupo prostético do enzima peroxidase glutationa, o selénio é uma das substâncias mais importantes e indispensável à vida que não é acumulada no organismo e assim tem que ser continuamente fornecida. Até hoje, o selénio, tem-sido, exclusivamente, introduzido no organismo através de compostos inorgânicos (dic xido de selénio, selenito de sódio e similares).

objectivo da presente invenção é proporcionar algas possuindo propriedades biológicas particulares e, devido ao seu elevado teor em selénio, que sejam capazes de o manter como efeito biológico.

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A invenção é baseada no facto de que, sob certas condições, a alga não só pode ser mantida com vida em soluções contendo selénio, isto é, não se extingue mas também se desenvolve e assim pode ser cultivada numa solução nutriente contendo selénio numa elevada concentração. Este facto é surpreendente, uma vez que, de acordo com a técnica anterior esperava-se que a alga morresse devido ao selénio venenoso.

Adicionalmente, a invenção é baseada no facto de que o selénio é incorporado no organismo de uma alga cultivada num meio de cultura contendo selénio, sob certas condições.

Deste modo, a invenção refere-se a um processo para a preparação de algas tendo efeitos biológicos aperfeiçoados, no qual a estirpe de alga seleccionada é cultivada em condições esterilizadas num melo de cultura constituído por água doce e sais nutrientes na presença de dióxido de carbono e de luz, de forma a realizar-se a fotossíntese, ou com exclusão de luz num meio de cultura contendo também uma fonte de carbono, hidrogénio, oxigénio e azoto, depois do que se separam as algas assim obtidas. De acordo com o processo da presente invenção, são adicionados compostos orgânicos e/ou inorgânicos de selénio ao meio de cultura numa concentração compreendida entre 10 e 2 x 10 mole/litro, sendo em seguida inoculado o meio de cultura com uma cultura de algas puras capaz de rapidamente incorporar selénio. A referida cultura de algas puras é obtida por inoculação da estirpe de alga seleccionada num meio de cultura líquido contendo produtos nutrientes inorgânicos e eventualmente orgânicos, e em seguida é tratada com N-metil--N’-nitro-N-nitroso-guanidina. A partir das algas individuais da estirpe assim obtida por mutação, são seleccionadas aquelas que são capazes de rapidamente incorporar selénio quando cultivadas depois da mutação num meio de cultura contendo selénio e têm uma taxa de crescimento que é, pelo menos, idêntica à da estirpe original. Depois da inoculação do meio de cul· . tu.ra com a cultura de algas puras assim obtida, e depois do período de cultura, a alga é separada, se desejado, seca a um teor de água opcional e feita a sua decomposição por ultra-som ou trituração segundo um método conhecido per se.

De acordo com a invenção, a cultura de algas puras que é capaz de incorporar selénio é preparada, de preferência, a partir de algas verdes ou azuis unicelulares, como por exemplo as estirpes Chlorella sp., Scenedesmus sp. ou Spirulina sp., de tal modo que, depois do tratamento com N-metil-N’-nitro-N-nitroso-guanidina, as células são cuidadosamente lavadas ã parte e dispersas em séries de meios de cultura sólidos preparadas dividindo a diluição em duas e complementados com um composto de’ selénio a uma concentração compreendida entre 10 e 2 x 10 mole/litro. Das estirpes apresentando um crescimento rápido e capazes de rapidamente incorporar selénio são escolhidas as mais preferidas que posteriormente são cultivadas num meio líquido e, em seguida, a cultura de algas puras assim mantida é sujeita à produção industrial.

Deste modo, o selénio é incorporado, durante o crescimento, ao organismo da alga, tratada como descrito anteriormente, , , 4 numa concentração que e em média 10 vezes superior a da estirpe de alga original.

S utilizada água destilada como líquido no meio de cultura empregue para a cultura industrial das estirpes de alga que são capazes de rapidamente incorporar selénio. Além dos materiais nutrientes conhecidos geralmente utilizados, estes meios de cultura também são complementados com compostos de selénio inorgânicos e/ou orgânicos. 0 meio de cultura esterilizado e assim preparado é inoculado com a estirpe de alga, obtida como descrito anteriormente, que seja capaz de rapidamente incorporar selénio. No curso do seu crescimento, a alga incorpora selénio no seu próprio organismo sem que tenham lugar as

indesejáveis contaminações tóxicas já referidas.

A alga assim preparada é separada do meio de cultura e cuidadosamente seca, segundo um processo conhecido sob condições moderadas, a uma temperatura óptima de 65°C nunca ultrapassando os 80°C. A alga já seca é então convenientemente decomposta por trituração a um tamanho de partícula de cerca de 1 yum. Como alternativa, o concentrado de alga humedecido pode ser decomposto por ultra-som e em seguida seco sob as condições já referidas.

A alga assim obtida é um pó contendo entre 250 e 4000yUg/g de selénio que pode ser consumida directamente ou ser utilizada ela própria ou em alimentos, forragem, cosméticos ou juntamente com substâncias activas biologicamente e de utilização terapêutica e/ou com os seus aditivos, sob a forma de qualquer formulação disponível comercialmente destes produtos, de preferência sob a forma de comprimidos e cápsulas ou sob outras formas.

As vantagens principais do processo de acordo com a presente invenção podem ser resumidas do seguinte modo:

a) a alga pode ser cultivada num simples equipamento utilizando um processo barato e facilmente exequível;

b) depois da cultura não é necessária qualquer purificação ou trabalho em várias fases;

c) a alga é cultivada sob condições estéreis não ocorrendo contaminações ambientais pelo que a alga obtida é utilizável inequivocamente para consumo humano;

I

d) torna-se possível a preparação de algas com um elevado teor em selénio e possuindo efeitos fisiológicos e biológicos aperfeiçoados, comparados com os das algas conhecidas ;

e) as algas obtidas segando o processo da invenção podem, de preferência, ser amplamente utilizadas, por exemplo, na alimentação, indústria cosmética, em fins terapêuticos, bem como em outras áreas.

As algas cultivadas segundo o processo da presente invenção são utilizadas, preferivelmente, na terapia, uma vez que o selénio é um agente activador do grupo prostético do enzima peroxidase glutationa. Em virtude do selénio não ser acumulado no organismo, a sua complementação é tornada possível graças às algas obtidas pelo processo segundo a invenção, pelo que podem ser medicamentados todos os problemas de saúde que sejam consequência de deficiência em selénio.

processo da presente invenção será ilustrado, em pormenor, reportando-se aos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1

Uma cultura de algas Scenedesmus obtisiusculus é mantida num recipiente de,250 ml, sob agitação, sobre um meio de cultura líquido de Bold contendo entre 100 e 500 ^.g/ml de N-metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina, entre 25 e 27°C durante 30 minutos. Depois deste tratamento, as células são cuidadosamente lavadas com água e dispersas em séries do meio de cultura de Bold solidificado com agar. Estas séries do meio de cultura contêm selénio numa concentração que vai aumentando regularmente para o dobro de cada uma, desde 3,125 yUg/ml até 400 ^ig/ /ml. As colónias formadas a partir das células crescendo e sobrvivendo nestas séries do meio de cultura são isoladas e as linhas de célula escolhidas são propagadas numa escala de laboratório numa solução nutriente de Bold contendo pelo menos 20 /Ug/ml de selénio. São propagadas as colónias que, de preferência, incorporam mais selénio e têm uma taxa de crescimen9 to idêntica à da estirpe original (controlo) num meio cie cultura contendo pelo menos 20 ug/ml de selénio.

teor de selénio da alga é determinado utilizando o método de absorção atómica depois de secar a 65²C as células previamente isoladas e cuidadosamente lavadas com água, e de serem decompostas por ultrassons.

teor de selénio do pó de alga assim obtido é o seguinte:

Estirpe

Teor de selénio /g de pó de alga) estirpe I original não tratada estirpe II original não tratada estirpe n². código FM-1-120

1300 estirpe n² código FM-1-1871

2400 estirpe n². código FM·

1600 estirpe n². código FM-449/87

1800

Exemplo 2

São adicionados 40 mg de selenito de sódio a 8 litros de meio de cultura Knop-Fringsheim que se encontra num recipiente de vidro de cultura de algas com uma capacidade de 10 litros. A solução nutriente assim obtida é esterilizada a 121²C sob a pressão de 1 bar durante 30 minutos. Em seguida, a solução estéril é arrefecida e inoculada com uma cultura de algas Scene10

desunis obtisiusculus capaz de rapidamente incorporar selénio. Faz-se borbulhar ar estéril, contendo 5 % em volume de dióxido de carbono, através do melo de cultura a uma temperatura de 25°C, enquanto o sistema é iluminado por uma lâmpada de 4000 lux com um comprimento de onda entre 440 e 520 e entre 640 e 700 ^im.

Depois de um período de cultura de 14 dias a alga é separada do seu meio de cultura e em seguida lavada com água. A massa da alga assim obtida é decomposta por ultra-som e cuidadosamente seca a uma temperatura inferior a 65°C. 0 teor de selénio do pó de alga assim obtido é de 1200 ^ug/g.

Exemplo 3

8,0 g de nitrito de sódio, 0,8 g de heptahidrato de sulfato de magnésio, 0,8 g de hidrogenofosfato de dipotássio, 2,5 ml de solução de oligoelementos de Arnon, como também 5 g de glu cose, 0,1 g de cisteina e 0,1 g de metionina, são dissolvidos em 8 litros de água destilada que se encontra num fermentador de cultura de algas com uma capacidade de 10 litros. A solução nutriente assim obtida é complementada com 50 mg de selenito de sódio, em seguida a solução é passada por um filtro esteriUzante e Inoculada, sob condições estéreis mantidas cui· dadosamente, com uma cultura de algás puras Scenedesmus obtisiusculus capaz de rapidamente incorporar selénio. Depois de um período de cultura de 4 dias a uma temperatura entre 25 e 282C no escuro, a alga é separada do seu meio de cultura e lavada com água. A massa de alga assim obtida é decomposta por ultra-som e finalmente seca a uma temperatura inferior a 65^SC. 0 teor de selénio do pó de alga assim obtido é de 1380

E seguido o processo descrito no Exemplo vez do tratamento a quente, o meio de cultura ser esterilizado fazendo passar por um filtro bacteriano esterilizante do tipo G-5. 0 1300 ^ig/g.

2, excepto por, em teor de selénio do pó de alga assim obtido é de

Exemplo 5

Ê seguido o que, em vez a estirpe de alga Chlorella vulgaris capaz de rapidamente incorporar selénio e a qual foi sujeita ao tratamento de mutação descrito no Exemplo 1.

processo descrito nos Exemplos 2 ou 3, excepto da estirpe Scenedesmus obtisiusculus é utilizada teor de selénio do pó de alga assim obtido é o seguinte:

teor de selénio

Estirpe	( yUg/g de pó de alga)
estirpe I original	140
estirpe II original	140
estirpe DV-35-52	3200
estirpe DV-78-20	2300
estirpe DV-104-21	1500
Exemplo 6
E seguido o processo descrito nos	Exemplos 2 ou 3, excepto

que, em vez da estirpe Scenedesmus obtisiusculus, é utilizada a estirpe de alga Chlorella minitissima capaz de rapida-men+.e incorporar selénio. 0 teor de selénio do pó de alga assim obti do é de 1400 yUg/g.

Exemplo 7 iÉ seguido o processo descrito nos Exemplos 2 ou 3, excepto que, a solução nutriente é aquecida a uma temperatura quando :muito de 50^c e é utilizada a estirpe de alga Aphanocapsa thermalis que é termodúrica e capaz de rapidamente incorporar selénio. 0 teor de selénio do pó de alga assim obtido é 0 seguinte:

Estirpe	teor de selénio (/Ug/g de pó de alga)
estirpe original	130
estirpe DV-12-220	1100
estirpe DV-12-340	1550

Exemplo 8

Ê seguido 0 processo descrito no Exemplo 2, excepto que, em vez da estirpe Scenedesmus obtisiusculus é utilizada a estir pe de alga Spirulina sp. pertencente às algas azuis, capaz de rapidamente incorporar selénio. 0 teor de selénio do pó de alga assim obtido é o seguinte:

í
Estirpe	teor de selénio ( ^ug/g de pó de alga)
estirpe I original	50
estirpe II original	30
estirpe HE-87-104	1100
estirpe HE-89-241	1200
estirpe HE-89-302	1500
i Exemplo 9
lE seguido o processo descrito no Exemplo 2, excepto que, a temperatura da solução nutriente é diminuída para 8°C e é uti lizada a estirpe de alga Nostoc commune azul filiforme, a qual é resistente ao frio e capaz de rapidamente incorporar selénio. 0 teor de selénio do pó de alga assim obtido é o seguinte:
Estirpe	teor de selénio ( ^ug/g de pó de alga)
estirpe original	140
estirpe BK-1218-2	1140

Exemplo 10

São adicionados 5 x 10 m de selenito de sódio a 8 litros de ô

ú meio de cultura de Bold esterilizado por filtração e que se encontra num recipiente de cultura de algas com uma capacidade de 10 litros. 0 meio de cultura assim obtido é inoculado com uma cultura de algas puras Chlorella fusca preparada como descrita no Exemplo 1 e capaz de rapidamente incorporar selénio. A alga é cultivada durante 14 dias, como descrito no Exeraplo 2. Em seguida a massa de alga é filtrada, cuidadosamente lavada com água e seca a uma temperatura inferior a 80°C. 0 teor de selénio do pó de alga assim obtido é de 2700 ag/g.

Exemplo 11

Uma estirpe' de alga Scenedesmus obliquus cultivada segundo o processo descrito no Exemplo 1 e capaz de rapidamente incorporar selénio é inoculada num recipiente de cultura contendo _7 litros de solução nutriente de Bold e 10 M de selenito de sódio. Depois disto é seguido o processo descrito no Exemplo

10, obtend.o-se assim um pó de alga com um teor de selénio de 300 ^ug/g.

Exemplo 12

É seguido o processo descrito no Exemplo 2, excepto que a alga separada é seca a uma temperatura de 65²C e em seguida decomposta por trituração até um tamanho de partículas de 1 ^im. 0 teor de selénio do pó de alga assim obtido é de 1200 ug/g.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1—. - Processo para a cultura de algas tendo um efeito biológico aperfeiçoado, no qual a estirpe de algas seleccionada é cultivada em condições esterilizadas, num meio de cultura constituído por água doce e sais nutrientes na presença de dióxido de carbono e de luz de forma a realizar-se a reacção de fotossíntese, ou com exclusão de luz num meio de cultura contendo também uma fonte de carbono, hidrogénio, oxigénio e ( I azoto, depois do que se separam as algas assim obtidas, carac-terizado pelo facto de compreender a adição de um ou mais com postos orgânicos e/ou inorgânicos de selénio ao meio de cul-7 - 3 tura numa concentração compreendida entre 10 e 2 x 10 mole/litro, a inoculação do meio de cultura com uma cultura de algas puras capaz de rapidamente incorporar selénio, se desejado, a secagem das algas obtidas após a cultura e a desagregação das mesmas por ultrassons ou moagem, sendo a cultura de algas puras obtida por inoculação da estirpe de algas seleccionadas num meio de cultura líquida contendo produtos nutrientes inorgânicos e eventualmente orgânicos, o seu tratamento com N-metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina, em seguida a cultura da estirpe num meio de cultura contendo também selénio e finalmente a selecção das algas individuais que incorporam rapidamente selénio e têm uma taxa de crescimento que é, pelo menos, idêntica à da estirpe original.
2^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender a utilização de selènito de sódio e/ou de dióxido de selénio como composto ou compostos inorgânicos de selénio no meio de cultura.

—
3^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado • pelo facto de compreender a utilização de selenocisteína e/ou de selenometionina como compostos orgânicos de selénio no melo de cultura.
4^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender a utilização de uma estirpe de algas Chlorella ou Scenedesmus como a estirpe de algas seleccionada.
5^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender a utilização de Aphanocapsa thermalis como a estirpe de algas seleccionada.
6a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender a utilização de Nostoc commune como a estirpe de algas seleccionada.
7^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender a utilização de Chlorella minitissi ma ou de Chlorella fusca como a estirpe de algas seleccionada
8â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender a utilização de uma estirpe de algas azuis de água doce como a estirpe de algas seleccionada.
9^a. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de compreender a utilização de Spirulina sp. como a estirpe de alga azul.
10^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado . pelo facto de compreender a utilização de Scenedesmus obtisiusculus ou de Scenedesmus obliquus como a estirpe de algas seleccionada.