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PROCEDE DE PREPARATION D'ALGUES AYANT UN EFFET BIOLOGIQUE
AMELIORE.
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La présente Invention est relative à un procédé pour la préparation d'algues ayant des effets biologiques améliorés.
Les algues ont été utilisées depuis des temps imméariaux par l'humanité à des fins de nutrition et d'alimentaiton. Les algues sont donc princlpalement consommées par les peuples de l'extréme Orient; ces derniers temps, cependant, elles sont largement utilisées sous forme sèche ou sous la forae de comprises également dans les pays développés. Les algues sont les supports de natlères nutritives extrêment intéressantes plusque leur forme séchée contient en fortes concentrations, des substances qui sont essentielles pour une vie en bonne santé, comme des vitamines, des protéines, des complexes de protéinea ovec des microéléments, des saccharldes, des oaldes gras polyinsaturés et similaires.
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La pollution de)'enuironneoent est devenue un probleae sondial cea dernicrco annéea. Rctuelle*ent, ta contatination des wera et des océans par des létaux lourds toxlques (par exemple le ploob, le sercure, le cadmium, le cuivre) ainsi que par des agents induisant des tumeurs (par example des composés aro. atique3 polycycliques conden5é) J n'est pa négligeable. Le fait que ces agents soient accumulés dans les algues constitue un probtMe d ! fficile.
Hinai,'des Qlgues coeptetes* provenont de to Ber ou cultivées dons d'autres conditions naturelles, ne peuvent pas etre utilisées d des fins de nuitrition humaine ou animale, pour des prodults allmentaires, cosmétiques et thérapeutiques; on ne peut utiliser que les fractions de ces "algues complètes" qui ont
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ete preofobteeent debopasseea por purificotion des ratières nuisibles du point de vue biologique. Un procédé de purification de ce type est décrlt par exempte par Caramels de Guovéa cosmetics and toiletries 95, 47 (1980)].
Cependant, une operation de purification signifie une intervention décomposant une partie des substances biologiquement actives de l'algue, si bien que la valeur biologique de la fraction d'algue ainsi obtenue est notablement réduite
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[Zojic : Properties and Products of Algae : Edition Planum, New-York, zo
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I en resutte que) a preparotion d'atguee sterites qui ne sont pas gates par l'environnement, est devenue de plus en plus importante.
On connu ! t un certain nombre de procédés de culture
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art ! f ! cletle d'o ! gues qu ! peuuent etre effectués, par exeple, dons un bassin ouvert d culière solaire ou dans un espace clos dons des cond ! tiona oeauront ta st & p ! i ! te, ao ! t aous un éclairage naturel ou artificiel, soit à l'abri de toute luiere.
Selon la demande publiée de brevet japonals No.
56. 96690, des algues sont cuitivées à partir de souches d'olgues maritimes dans de l'eau de mer stérilisée, dans une solution contenont divers sels nutritifs sous une source de lumière artificielle.
Selon la demande publiée de brevet japonais No.
45. 17146, la culture industrielle d'algues Chlorella vertes unicellulaires est effectuée sur un milieu de culture d'eau douce stérile d l'exclusion de dioxyde de carbone et de Iuttère.
La culture des algues uertes unicellulaires d'eou douce est aussi décrite dans la spécification de brevet français
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Ho. 2. 103. 462, acion loquelle la cultured 1'6chelie industrielle est réalisée photosgnth6ttqueMnt ö f'a ! de de 3oiut ! ons nutn ! t ! ve3 contenant des sels nutritifs appropries.
Selon des demandes publiées de brevet hongrois No.
4613/84 et 4614/84, to culture des olques est accomplie dons une eau minérale d'origine naturelle, une eau médicinale ou thermale ou dans un mélange de celles-ci enrichies par un composée atonique jusqu'à une concentration de 10-2 Mle/litre.
Dons l'une quelconque des solutions connues, des
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algues devant être utXtseea pour ! o fabr ! cotton d'QNtent de fourrage ou de aedtcoeents sont produites de façon artificielle dans des conditions stéri 18S, Dans ces procédés, des algues sont cultivées dans de3 condition3 teiles quc les propriétés de3 algue3 obtenues sont analogues d celles des algues se developpant spontanément dans la nature dons des conditions du milieu sons danger; ou lets propriétés des algues ainsi produites ne different
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que tres peu, en fonctlon du mode de culture artificielle Les o) gues cuttivees artificielleBent seton es procédés de I'art antérieur ne contiennent que des traces, si elles en contiennent, de plusieurs elements te!aque!eaetemut,tez!nc ou I'argent.
On soit de plus, que le seten ! ux a des fonctions biologiques variées, COlle cela est publié dans un rapport complet de Thressa et col 11. [Hut r i ti on Reu i e. 35, 7 (1977) ], Shalberger [J. of Env. Path. and Tox. 1, 305 (1960)], ou nasukoa et cott. [Experientio 39,m 405 (1983)].
Le selenium en lui--Me, a un effet hypotenseur, il améliors les états ischémique, hyposique et infarci
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du coeur et il ! nh ! be ! o Hpofuscinoae cerotdate du système nerueux central; il exerce aussl un effet bénéfique sur la périodontite et i I été montré qu'il diminue la probabilité du développement des maladies cancéreuses;
de plus, on considère qu' ! t est un agent inhibant la tutogenese. On a démontré que de nombreuses odtftcottons ou maladies, respectivement, coame une nécrose du ofie, une myonécrose, une destruction de ta membrane des
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erythrocytes, des es ! ons interstit ! et) es, une etevotton de ST dans l'ECG, le syndrome de Kwashiorkor (sous-alimentation en, protéines) et une schlérose en plaques, sont induites par une insuffisance en selenium.
L'action bénef ! que du sélénine repose surtout sur son effet d'activation dirige contre l'enzyme glutathion peroxydase, qui est l'inhibiteur endogène le plus important des processus nocifs de peroxydation. Dans la mesure où le sélénium est un constituant indispensable du groupe prosthétique de l'enzyme glutathion peroxydase, il est l'une des substances les plus
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importantes et les plus Indispensables 10 vle qul n'est pas occutulé dans t'organisse et doit donc etre fourni en continu.
Jusqu'à. aintenant, le séléniul a et exclusivement introduit dons !'organi3ee eous t a forae de composés inorganiques (d i oxyde de selenlua, sélénite de sodium ou sloilaipe).
La présente invention 0 pour but de fournir des algues ayant des propriétés biologiques particulières et qu; sont, grace à
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leur teneur accrue en selénium, capables d'assurer f'effet biologique du selenium.
L'invention repose sur la constatotion selon laquelle, dan certaines conditions, l'algue peut non aeulesent fitre maiuntenue vivante dans des solutions contenant du selenium,
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c'est-a-dire ne pas périr, is égalerent se développer et elle peut done etre cultivée dons une solution nutritive contenant du séléniu8 en forte concentration, Cette contotation eat surprenante puisque, selon l'art antérieur, on s'attend d ce que I'algue soft tuée par le séléniut toxique.
De plus, l'tnvention repose sur t o constatation selon taquette) e aeteniux eat ! ncorpore dano !'organ ! aM d'une atgue cultlvde sur un ellieu de culture contenant du sdldnlum dans certaines conditions.
L'invention concerne donc un procédé pour la préparation d'alguea ayant des effets biologiques améliorés, selon lequel la souche d'algue cho Isle est cultuée dans des conditions st er i t es sur un tiHeu de culture consistant en eau douce et en sels nutritifs en présence de dioxyde de carbone et de lumière de
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façon photosynthétique, ou d 1'exclusion de Iutière sur un milieu de culture contenant ouest une source de carbone, d'hydrogène, d'oxygène et d'azote, apres quo ! l'olgue ainsi obtenue est séparée.
Selon le procdé de la présente invention, un ou plusieurs cosposés
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inorganiquea et/ou organiquea du aetcmux sont ajoutco ou t ! Heu de culture d une concentration de t0' d 2xt0' M < e/ ! ! tre, puts) e t ! Heu de culture est inoculé avec une culture d'algue pure capable d8 ineorporar faei Je. ent le sélénlu.. La culture pure ast obtenue par inoculation de la souche d'atgue choi9 ! e sur un milieu de culture Hquide contenant des motieres nutrit ! ues norganiques et eventuellement organiques et ensuite traite. ent de celle-ci avec de la H-tethut-n'-nitro-n-nitrosoguanidine.
On choisit parti les individu de la souche ainsi obtenus par mutation, ceux qui sont capables d'incorporer fuellement du 3e) en ! ux foraqu'Hs aont cultivés après mutation sur un milieu de culture contenont du seteniux et qui ont un taux de croissance identique au moins à
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celui de la souche sauuage. Rpres t'inocuation du aHieu de culture avec la culture pure ainsi obtenue et la période de culture, I'olgue est séparé, éventuellement séchée a une teneur en eau donnée et décomposée par ultrason ou broyage de façon connue en e I I e-moae.
Selon la présente inuent ion, 10 culture dtalgue pure qui est capoble d'incorporer du sélénium, est de preference préparée à port ir d'0 I gues un i ce 11 ufo i res b 1 eues ou vertex, comme Chlopetic sp., Scenedesmus sp. ou Spipulina sp., de tell e façon que, après le traitement avec 10 H-methyl-H'-nitroM-nitrosoguanidine, lea cellules sont soigneusement lavées et di spersés sur une sér i e de li 1 i eux de culture solides, dilues successive < ent d aolt) e et cotplétés ouec un compost de sélénlue d une concentration comprise entpe 10-7 et 2xlo-3 mole/litre.
On se) ect ! onne pari tee souches qu ! se devetoppent ! ci tee aouchee lea plus avantageuaea qui ont une croissance rapide et sont capables d'incorporer facllement du sélénlul et on les cultive d nouveau dons un milieu liquide, puis on soumet la culture d'algue pure ainei nointenue 6 une production industrielle.
Le sélénium est donc incorporée pendant la croissance dans l'organisme de l'algue traitée de la façon décrite plus haut, à une concentration qui est en moyenne 101 fois supérieure à celle de la souche d'olgue d'origine.
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L'eou d ! ati ee eat ut i I i aee coaae I i qu i de dana te milleu de culture employ6 pour la culture lndustrielle de la souche d'algue qui est capable d'incorporer facileiient le sildnium. En plus des matières nutritives connues couramment utilisées, ces milieux de culture sont complétés aussi avec des composés inorganiques et/ou orgontques du séiénium. Le milleu de culture ainsi prépare et stérilisé est inoculé avec la souche d'algue, obtenue de la façon décrite plus haut, qui est capable d'incorporer facilement le sélénium. Tout en se développant, l'algue incorpore
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le sélénlul dans son propre organ sons les contaminations toxiques indesirées discutees plus haut.
L'algue ainsi préparée est séparée du milieu de
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culture et soigneusement séchée de façon connue dans des conditions douces à une température optimale de 65 C et ne depossont pas 80 C.
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L ' o l gus séchée est convenab I esent décoeposée par broyage a une dimension particulaire d'environ I pe. Dan* une variante, le concentrot d'atgue hut ! de est decotpoe par ultrason et ensufte seche dans les conditions définies plus haut.
L'algue ainsi obtenue est une poudre contenant 250 d
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tûOû 9/g de sélénium, qui peut etre d ! recteoent conaoaee ou utlilsés en elle-mime ou dans des aliments, des fourrages, des cosmétiques ou avec des substances actives biologiquement et utiles du point de vue thérapeutique et/ou en tant qu'additifs de ceux-ci, sous la forme d'une quelconque formulation disponible industriellement de ces produits, de préférence sous la forte de comprimés et de capsules ou d'autres fortes.
Los principaux avantages du procédé se I on 1I i nvent ion peuvent être résultes comme suit : a) L'algue peut être cultivée dans un équipement simple avec un procédé bon marché et facile 6 mettre en oeuvre.
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b) Rucune purificotion ou troiteaent ò plusleurs étapas n'8st requis apres t a culture. c) L'algue est cultivée dans des condltlons stérlles, d !'excluslon des contaminations de I'enuironneMnt si bien que !'algue peut être utillsée sans problè8e pour la consoamation huaoine. d) 11 est possible de préparer des algues oyant une forte teneur en sé I én i ue et possédant des effets phystologlques et blologlques améliorés par rapport d ceux des algues connues.
e) Los algues obtenues par le procédé de l'inuention peuvent etre largement et de préférence utilisées par exemple pour l'allmentation, dans l'Industrie cosmétique, pour des buts thérapeutiques et dans d'outres domaines,
L'utilisationdesaiguescultivéesparleprocédéde I'Invention est plus préférée en theropte pulsque le séiénluw est
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un agent act iuant du groupe prosthétique de !'enzyme glutathion per oxydase.
Le sé I én i UII nIest pas accumu I é dans I'organ i Sille, si
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bien que son apport complementaire est rendu possible avec le : s algues obtenues par le procédé de l'invention et qu'on peut ainsi tra ! ter tous les troubles de la santé résultants d'une insuffisance en oeleniut.
Le procédé de Invention est illustré en détale par les exemples non ltitatifs suivants.
Example1
Une culture de Scenedesous obtlalusculus est maintenue dans un fiance de 250 1 dans une culture secouée sur un ailieu de
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culture liquide da Bold contenont 100 à 500 IJg/. 1 de H-Mthyl-H'-nitro-H-nitrosoguan : dine 0 25-27"C pendant 30 minutea. Après ce traitement, les cellules sont soigneusement lavées d l'eau et dispersées sur une série de. ilieux de cufture de Bold 8otidif ! ee por de)'ogar. Cette serte de aNieux de cutture conticnt du aetentut dont 10 concentration et doublée régulteretent d chaque fole de 3, 125 pg/al d 400 pg/ol.
Les colonies formées à partir des cellules qu ; se développent et survivent sur cette série de milieux de culture sont isolées et les lignées de cellules sélectionnées sont reproduites à l'échelle du
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laboratolre dons une solution nutritive de Bold contenant ou moins 20 ug/at de seleniut. Les co) on i es qui se developpent, incorporent plus ovantogeuseaent du eeteniu et ont un taux de croosance pratiquement identique à celui d'une souche sauvage (témoin) dans un alleu de culture contenant ou moins 20 g/ml de sélénium.
La teneur en sélénium de l'algue est déterminée par sechage à 650C des cellules préalablement isolées et soigneusement tavela à !'eau, decomposition de celles-ci par ultrason et ensuite mesure de la teneur en sélénium par une méthode d'absorption atomique.
La tenaur en sélénium de la poudre d'algue ainsi obtenue est indiquée ci-après:
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<tb> Souche <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> sélénium
<tb> ( g/g <SEP> de <SEP> poudre <SEP> d'algue)
<tb> Souche <SEP> I <SEP> sauvage <SEP> non <SEP> traitée <SEP> 50
<tb> Souche <SEP> II <SEP> sauvage <SEP> non <SEP> traitée <SEP> 30
<tb> Souche <SEP> Code <SEP> No. <SEP> FM-1-120 <SEP> 1300
<tb> Souche <SEP> Code <SEP> Ho. <SEP> Fin-1-1871 <SEP> 2400
<tb> Souche <SEP> Code <SEP> Ho. <SEP> Fn-441/87 <SEP> 1600
<tb> Souche <SEP> Code <SEP> Ho. <SEP> Fin-119/87 <SEP> 1600
<tb>
Exemple2
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40 ag de sélénite de sodium sont ojoutes A 6 Htrea de milieu de culture de Knop-Pr i ngshe i 1 i nt rodu i t dans un flacon an verre de culture d'algue ayant un volute de 10 litres.
La solution nutritive résultante est stérilisée à 1210C sous une surpression de I bar pendant 30 minutes. Ensulte, la solutlon stdrile est refroidie et inoculée avec une culture pure de Scenedestus abtisiusculus qui est capable d'incorporer facitexent du séléniu*.
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On fait barbotter da I'air stérile contenant 51 en volume de dioxyde de carbone d travers) le milieu de culture d 25OC, tout en eclairant le systee por un tube à décharge électrique travaillant auec 4000 lux, à une longueur d'onde de 110 a 520 et de 640 à 700 pe.
Après une periode du culture de 1 Jours, I'algue est séparée du milieu de cutture, puts tavee ö t'eou. La Msse d'atgues ainsi obtenue est décomposée par ultrason et soigneusement séchée 6 une température inférieure à 65OC. la teneur en selenium de la poudre d'algue ainsi obtenue est de 1200 g/g.
Exemple 3
8,0 g de nitrite'de de sodium, 0,8 g de sulfate de
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lognéslum heptahydrat6, zo g 9 de phosphate acide dlpotasslque, 2, 5 el de solution d'ol igoe ! etents d'Rrnon ains ! que 5 9 de glucose,
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OJ g de cystéine et OJ 9 de méthionine sont dissous dons 6 litres d'eau distillée introduite dons un fermenteur de culture d'algue ayant un volume de 10 itres. La solution nutritive ainsi obtenue est complétée avec 50 mg de sélénite de sodium, puia la solution est versée à travers un filtre stérillsant et Inoculée dons des conditions stériles maintenues avec soin, avec une culture d'algue pure de Scenedesmus obtisiusculus capable d'incorporer facilement le sélénium.
Rprès une période de culture de 4 jours à 25-28 C dans l'obscurlte, I'algue est séparée du milieu de culture et lavée à l'eau. La masse d'algues ainsi obtenue est décomposée par ultrason et finalement séchée à une temperature inférieure à
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65OC. La teneur en 5éléniuI de 10 poudre d'algue ainsi obtenue eat de 1380 ug/g.
Exemple4
Le procede decrit dans l'exemple 2 est répété, souf qu'ou lieu d'être traité à chaud, le allieu de culture est
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steri I ise par ecouleeent Åa travers un filtre stérilisant le8 bactéries du type 6-5. la teneur en séléniul de 10 poudre d'algue ainsi obtenue est de 1300 9/g.
Exemple 5
Le procedo decrit dans l'exemple 2 ou 3 est répété, sauf que la souche Scenedesous abtisiusculus est remplocée par une
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souche d'aigue Chlorella vulgaris capable d'incorpoper facilement du sélénium et qui a été soumise ou traitement de tutotion decrit dans 1'exemple 1.
La teneur en sélénium de 10 poudre d'algue ainsl obtenue est indiquée ci-après:
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<tb> Souche <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> seteniuo
<tb> ( g/g <SEP> de <SEP> poudre <SEP> d'algue)
<tb> Souche <SEP> I <SEP> "sauvage" <SEP> 140
<tb> Souche <SEP> II <SEP> "sauvage" <SEP> 140
<tb> Souche <SEP> DV-35-42 <SEP> 3200
<tb> Souche <SEP> DU-76-20 <SEP> 2300
<tb> Souche <SEP> DU- <SEP> ! <SEP> 04-21 <SEP> 1500
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Exeog e 6 Le procédé décr i t dans I'exelp I e 2 ou 3 est répété, sauf que to souche Scenedesaus obtlsOusculus est rexplacee par une souche d'algue Chlopelia minitissiso capable d'incopporep facilement du sélénium. La teneur en séléniul de 10 poudre d'algue ainsi obtenue est de HOO g/g.
Exemple ?
On répète le procédé décrit dans l'exemple 2 ou 3, auf que l'on laisse la solution nutritive se réchauffer 6 une température d'au maxleaus 500C et qu'on utilise une souche d'algue Rphanocapso thermales qui est thermodurique et capable d'incorporer
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(aeile. enl du séléniul.
La teneur en séléniul de 10 poudre d'algue oina ! obtenue eat indtquee ci-oppea :
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<tb>
<tb> Souche <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> sélénium
<tb> ( g/g <SEP> de <SEP> poudre <SEP> d'algue)
<tb> Souche <SEP> "souvage" <SEP> 130
<tb> Souche <SEP> DU-12-220 <SEP> 1100
<tb> Souche <SEP> DU-12-340 <SEP> 1550
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txemQ. e 0 Le procede decrit dons)'exeap} e 2 est repete sauf que 10 souche Scenedes8u8 obtialusculue eat remplac6e par une aouche d'algue Spirulina sp. appartenont aux otgues bleuea copable d'incopporer facilement du silinluit.
La teneur en sélFnlu de la poudre d'atgue ainai obtenue est indiquée cl-après :
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<tb> Souche <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> sélénium
<tb> ( g/g <SEP> de <SEP> poudre <SEP> d'algue)
<tb> Souche <SEP> I <SEP> "sauvage" <SEP> 50
<tb> Souche <SEP> II <SEP> "sauvage" <SEP> 30
<tb> Souche <SEP> 87-104 <SEP> 1100
<tb> Souche <SEP> 89-241 <SEP> 1200
<tb> Souche <SEP> 89-302 <SEP> 1500
<tb>
Exemple 9
On répète le procédé décrit dans l'exemple 2, sauf que l'on abaisse fa teaperature de la solution nutritive d 8"C et
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qu'on uti) ! ae une souche d'atgue Hostoc cotune b ! eue fHiforte qui résiste ou froid et eat capable d'incorporer facilement du sélénium.
La teneur en sélénium de la poudre d'otgue ainsi obtenue est indiquée ci-apres :
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<tb> Souche <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> sélénium
<tb> ( g/g <SEP> de <SEP> poudre <SEP> d'algue)
<tb> Souche <SEP> "sauvage" <SEP> 140
<tb> Souche <SEP> BK-1218-2 <SEP> 1140
<tb>
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Example 10 5 x zen de séléniate de sodium est ajouté à 8 litres de milieu de culture de Bold stérilisé par filtration et introduit dans une flacon de cu I ture d'otgue oyant un wtuM de 10 ! ! tre3. Le elifeu de culture ainsi obtenu est Inoculé ovec une culture pure de Ch ! oreHo fusco preparee 3e ! on ! a procedure decr ! te dans t'exeapte 1 et capable d'lncorporer faeiletent du seteniu*. L'atgue est cuttivee pendont H joura oeton ta procedure de !'exetp < e 2.
La masse d'algues est enoulte flitree, soigneuseeent lovée d l'eou et séchee à Mo ns de 80 C. La teneur en sélénium de la poudre d'algue ainsi obtenue est de 2700 ug/g.
Example 11Une souche Scenedessus obHquus cu I t i vée de f a façon décrite dons I'exelple 1 et capable dincorporep facilesent du se) en ! u eot inocutee dana un flacon de culture contenant 8 litres de solution nutritive de Bold et 10-1n de sélénlte de sodlul. le procédé de 1'exemple 10 eat ensuite suivi pour obtenir une poudre d'algue oyant une teneur en se ! en ! ut de 300 pg/9.
Exemi) I a 12 Le procédé décrit dans l'exeeple 2 est répéte, souf que l'algue séparés est séchée 0 65"C et ensuite deco < posee par broyage à une diwenaion particutaire de 1 pe. La teneur en aeleniuo de la poudre d'algue alnsl obtenue est de 1200 ug/g.