PT86648B

PT86648B - Metodo para a preparacao de composicoes anti-retrovirais contendo 3'-azido-2',3'-disesoxiuridina

Info

Publication number: PT86648B
Application number: PT86648A
Authority: PT
Original assignee: Chung Kwang Chu; Schinazi Raymond F
Priority date: 1987-01-28
Filing date: 1988-01-28
Publication date: 1991-02-08
Also published as: US4916122A; EP0301064A1; ATE110271T1; ES2009168A6; BR8804823A; JPH0649652B2; JPH01502027A; AU1242688A; IL85078A0; AU606391B2; PT86648A; MX167702B; WO1988005657A1; CA1313498C; DE3851187D1; EP0301064B1; AR240251A1

Description

Governo dos E.U.A. possui direitos sobre esta invenção, em resultado das investidações conducentes a esta invenção terem, em parte, por base um VA Merit Revieui Aujard.

Esta é uma continuação em parte do pedido de patente dos

E.U.A. ηδ. 007 473 intitulado 3’-Azido-2·,3'-Dideoxypyrimidines and Related Compounds as Antiviral Agents depositado em 28 de Janeiro de 1987 por Chung K. Chu e Raymond F. Schinazi.

ANTECEDENTES DO INVENTO presente invento refere-se à 3'-azido-2 ’ , 3’-didesoxiurj. dina (designada aqui por CS-87) e às suas composições, como agentes para a prevenção e tratamento de doenças retrovirais, particularmente contra o vírus da imunodeficiência humana adqui. rida (SIDA)-(HIV-l; também conhecido por HTLV-IIl/LAV), que provoca a síndroma da imunodeficiência adquirida (SIDA).

Breve Descrição dos Antecedentes:

A SIDA foi reconhecida em 1979. 0 número de casos relatados aos Centers for Disease Control (CDC) aumentou dramatica mente todos os anos desde então para cá e em 1982 o CDC declarou a SIDA uma nova doença epidémica. Neste momento é geralmente aceite que a SIDA é uma consequência da infecção com o retrovírus designado por vírus linfotrópico T humano do tipo III (HTLV-IIl), vírus associado à linfoadenopatia (LAV), retro vírus associado à SIDA (ARV) ou vírus da imunodeficiência huma na (HIV-1). Os anticorpos para estes vírus estão presentes em mais de 80% dos pacientes aos quais se diagnosticou SIDA ou sindroma pré-SIDA e têm-se encontrado com elevada frequência nos grupos de risco identificados.

Existe considerável dificuldade em diagnosticar o risco de desenvolvimento de SIDA. Sabe-se que a SIDA se desenvolve em pelo menos 10% dos indivíduos infectados com HIV, embora se suspeite que esta percentagem é muito superior.

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-4Geralmente, diagnostica-se SIDA num paciente quando um adulto anteriormente saudável, com um sistema imune intacto, adquire uma imunidade enfraquecida das células T. A imunidade enfraquecida surge geralmente num período de dezoito meses a três anos. Como resultado deste enfraquecimento da imunidade, o paciente torna-se susceptível a infecçães oportunistas, vários tipos de cancro, como o sarcoma de Kaposi e outras desordens associadas ao funcionamento reduzido do sistema imune.

Outra condição associada ao HIV é o complexo relacionado com SIDA ou ARC. Pensa-se que esta condição pode, eventualmeri te, conduzir a SIDA.

Presentemente não existe nenhum tratamento capaz de prevenir ou reverter a imunodeficiência de SIDA ou ARC. Todos os pacientes com infecçães oportunistas e aproximadamente metade de todos os pacientes com sarcoma de Kaposi morreram durante dois anos de diagnóstico. As tentativas para restaurar os sis. temas imunes dos pacientes com SIDA não têm sido sucedidas.

Vários compostos têm demonstrado actividade antiviral contra este vírus, sendo eles HPA-23, interferães, ribavirina, fosfonoformato, ansamicina, suramina, imutiol, penicilamina, rifabutina, AL-721, 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT) e outros 2’,3’-didesoxinucleósidos.

Neste momento a AZT parece ser a droga de eleição. No entanto, resultados preliminares indicam que a AZT exibe toxicidade numa determinação clínica. Ver Yarchoan et al., Lancet 575-580 (1986). A AZT foi sintetizada originalmente por Horu/itz et al., 3. Org. Chem. 29, 2076-2078, 1974. A sua actividade contra □ vírus da leucemia de Friend (um retrovírus) foi relatada em 1973 (ver Ostertag et al., Proc. Natl. Acad, Sei. USA 71, 4980-4985 (1974)J Krieg et al., Exptl. Cell. Res, 116, 21-29, 1978 e referências aí citadas).

Em geral, os inibidores dos processos celulares limitarão frequentemente a replicação virai, mas esses agentes são também usualmente bastante tóxicos para o hospedeiro. A maioria das drogas antivirais que foram descobertas até agora não

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-5podem ser prescritas para um período de tempo prolongado em virtude da sua toxicidade. Por exemplo, um composto estruturalmente afim com os compostos do presente invento, a idoxuridina, tem a sua utilidade clínica limitada à aplicação tópica em soluçães oftálmicas para o tratamento de queratite herpética em virtude da sua toxicidade para as células normais. Existe, evidentemente, uma grande procura de novos agentes antivirais de baixa toxicidade.

A CS-87 é um composto conhecido. Ver, por exemplo, Lin et al., 3. Med. Chem. 26, 1691-1696 (1983), Lin e Mancini,

3. Med. Chem. 26, 544-548, Colla et al., Eur. 3, Med. Chem. - Chim. Ther. 295-301 (1985).

Lin et al. testaram a actividade in vitro da CS-87 e o

DDC contra células de L1210 e de sarcoma 180 e verificaram que os dois compostos eram inactivos contra ambas as linhas cjs lulares. Lin et al. referiram também que a CS-87 e o DDC exibiam apenas actividade inibidora marginal em relação a duas eri zimas particulares isoladas a partir das células L1210. Lin et al. não referem uma composição contendo estes compostos numa concentração baixa, suficiente para inibir a replicação do HIV ou mesmo que estes compostos possam ser usados para tratar HIV.

Lin e Mancini referem que a CS-87 e o DDC são ambos inacti vos contra células L1210. Não é referida qualquer outra activi. dade para estes compostos.

Colla et al, referem que a CS-87 é inactiva contra vários vírus. Colla et al. referem em particular que a CS-87 é inacti. va contra o vírus 84 de Coxsackie, o poliovírus-1, o reovírus-1, o vírus-3 da para-gripe, o vírus Sindbis e Sarampo. Colla et al. concluem assim que derivados azido tais como CS-87 não têm actividade antiviral significativa.

%

A luz do estado actual da técnica é evidente que existe uma grande necessidade de novos agentes antivirais, especialmejn te daqueles que possuem toxicidade baixa para células normais. Em particular, devido à elevada mortalidade provocada pela SIDA

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e à falta da um tratamento eficaz para esta doença existe uma grande necessidade de se desenvolverem novos agentes de toxici dade baixa para esse tratamento, em virtude dos pacientes com SIDA necessitarem de uma terapia a longo prazo, possivelmente até ao fim da vida. Foi neste contexto que se realizou o presente invento.

z

E por consequência objectivo do presente invento proporcionar novas composições antivirais possuindo toxicidade baixa em relação a células não infectadas.

E ainda objectivo deste invento proporcionar composições para a inibição do crescimento de HIV.

z

E ainda um outro objectivo do presente invento proporcio nar um método para a prevenção e tratamento de infecção por HIV.

SUMARIO DO INVENTO

Estes e outros objectivos do invento, que daqui em diante se tornarão mais evidentes, foram conseguidos proporcionando composições possuindo como ingrediente activo o seguinte composto:

onde R¹ é OH, monofosfato, difosfato ou trifosfato; ou um seu sal farmacologicamente aceitável.

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-7Α principal vantagem deste composto é a sua actividade anti-retroviral altamente selectiva, i.e., ele diminui significativamente a replicação virai, medida em actividade da transcriptase inversa, ao mesmo tempo que demonstra citotoxicidade com ordens de grandeza inferiores às dos outros compostos antivirais,como por exemplo AZT.

Este composto é fornecido como ingrediente activo em com posições adequadas à administração a um paciente e está aí coji tido numa quantidade suficiente para exibir actividade in vitro ou in vivo contra HIV. Numa concretização preferida o com I posto está presente numa quantidade suficiente para inibir a actividade da transcriptase inversa do HIV mas que não iniba significativamente a actividade da ADN polimerase humana. Estão também incluídos no âmbito deste invento o mono-, di- e trifosfato de 3'-azido-2 ’, 3’-didesoxiuridina e composições cojn tendo estes compostos como agentes activos.

Está também englobado no presente invento um método de prevenção ou tratamento de SIDA ou ARC, que envolve administrar uma composição, contendo o composto anterior, a uma pessoa infectada com HIV ou em risco de adquirir o vírus. A administra ção da droga pode ser efectuada oralmente, num dispositivo de libertação controlada ou em combinação com um sistema de dis| tribuição de lipossoma, por injecção, ou por outros meios conhecidos na técnica, sozinha ou em combinação com outros agentes activos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um gráfico que mostra os efeitos relativos da AZT, CS-85 (3·-azido-2',3’-didesoxi-5-etil-uridina) e CS-87 na formação de colónias de células precursoras de granulócitos e macrófagos.

A Figura 2 mostra os efeitos da CS-87 no crescimento de (a) células Vero e (b) células mononucleares do sangue periférico (PBM) humano.

A Figura 3 é um gráfico que mostra o efeito da CS-85 e

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-8da CS-87 no peso de ratinhos BALB/c.

A Figura 4 mostra os efeitos da CS-85 e da CS-87 nas enzimas do fígado (a) SGPT e (b) SGOT em macacos rhesus.

A Figura 5 compara o efeito da CS-87, AZT e d2C (2’,3'-didesoxicitidina) contra HIV-1 (Estirpe RFIl) em células HeLa-T4, percentagem de inibição em função da concentração.

A Figura 6 é um gráfico da actividade de vários análogos de nucleósidos contra HIV-1 e vírus da imunodeficiência símia (SIV) em células de PBM humano em função da concentração média eficaz.

As Figuras 7a, b e c são gráficos do efeito do tratamento de retardamento com AZT (a), CS-87 (b) e CS-91 (3'-azido-2’,3’-didesoxicitidina) (c) em células de PBM humano, como percentagem de inibição em função de droga administrada diaria mente.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS presente invento é baseado na descoberta de que a 3'-azido-2',3’-didesoxiuridina (CS-87) e os seus derivados acila dos e fosforilados exercem uma actividade antiviral altamente selectiva contra HIV, exibindo, ao mesmo tempo, uma toxicidade notavelmente baixa em relação às células normais. Embora a CS-87 seja um composto conhecido per se, não era até agora sabido que este composto pode exercer uma actividade antiviral potente contra HIV, e deste modo também não eram conhecidas composições contendo este composto nas concentrações baixas sjj ficientes para exercerem essa actividade contra HIV com um mínimo de efeitos secundários. Vários investigadores referiram anteriormente que a CS-87 tinha pouca ou nenhuma actividade quer contra uma grande variedade de vírus quer contra certas células de tumor. Devido à actividade baixa ou inexistente fo ram usadas soluções relativamente concentradas deste composto, mas mesmo estas composições não tiveram como resultado uma actividade significativa.

Descobriu-se agora que a dose eficaz para 50% da popula67 255

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ção (ECgg^), em cultura celular, de CS-87 contra HIV é inferior a 1 micromolar, mais precisamente é de 200 nanomolar, mesmo tendo em consideração que a dose eficaz e a toxicidade do composto varia de acordo com o tipo de célula. A não toxicidade relativa do composto foi demonstrada em cultura celular e em animais, incluindo ratinhos e macacos. Embora a CS-87 e os compostos afins exibam toxicidade reduzida para as células no_r mais (ver Figuras e Secção de valores Biológicos a seguir) a administração de uma concentração elevada desta droga produziria no entanto alguns efeitos secundários adversos. Por concentração elevada entende-se uma dosagem que resultaria numa concentração no soro sanguíneo de aproximadamente 100yxM ou sju perior. Assim, as composições possuindo uma elevada concentra ção do ingrediente activo não são consideradas como terapeuticamente eficazes.

Embora a AZT seja de algum modo mais activa contra HIV do que a CS-87, esta tem um índice terapêutico semelhante quari do testada no mesmo tipo de culturas celulares. 0 índice tera pêutico de um composto é determinado dividindo a dose inibidora ou letal para 50/ da população (IC_5O θυ LD_5Q) pela dose efi caz para 50/ da população (EC^g).

A descoberta de que os presentes compostos são activos contra HIV a concentrações baixas e que ao mesmo tempo têm uma toxicidade bastante baixa para células hospedeiras normais à concentração mais baixa, foi surpreendente, uma vez que/compos. to conhecido,com uma semelhança estrutural grande,que está actu almente em ensaios clínicos, AZT, exibe uma toxicidade muito sjj perior como se verificou em várias experiências. Os resultados apresentados na Figura 1 mostram claramente uma diferença significativa do efeito da CS-87 na formação de colónias de cê lulas precursoras da granulócitos-macrófago humanas quando coni parado com o da AZT. Deve notar-se que a CS-87 parece mesmo exercer uma toxicidade mais baixa em relação a estas células do que a CS-85, que é o objecto de pedido de patente U.S. N5. de Série 857 947, depositado a 1 de Maio de 1986, pelos mesmos inventores, e que é agora Patente U.S. NS. 4 681 933 que é aqui

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’......»’«»·**

Z

-10incorporada para referência.

A expressão actividade antiviral é usada neste invento para referir a capacidade que uma composição tem de inibir o crescimento de HIV. A composição reivindicada também exibe actividade antiviral em relação a outros retrovírus.

A capacidade que as presentes camposiçães apresentam de inibir HIV pode ser medida por várias técnicas experimentais. Uma dessas técnicas envolve a inibição da replicação virai em células mononucleares de sangue periférico humano. A quantidade de vírus produzido é determinada medindo a transcriptase inversa codificada por vírus (uma enzima encontrada em retrovírus). Os resultados deste ensaio são ilustrados no Quadro 3 (ver Secção de Valores Biológicos) e descritos nos exemplos experimentais abaixo. Descrevem-se outros ensaios como se segue.

MÉTODOS

Ensaios Antivirais

Avaliação em células mononucleares de sangue periférico humano (PBM), estimuladas com fito-hemaglutinina (PHA), infectadas com HIV-1 (estirpe LAV)

A. PBM (2 x 10⁶ células/ml; volume 5 ml) de um indivíduo saudável que tinham sido cultivadas durante 3-4 dias após estimulação com PHA são colocadas em duplicado num frasco de 25 cm .

B. 0 meio, com a droga (2 vezes a concentração final) ou sem droga, é então adicionado aos frascos (5 ml; volume final 10 ml). Inclui-se AZT como controlo positivo.

C. As células são expostas ao vírus (cerca de 10 000 contagens/ml, como determinado num ensaio de transcriptase inversa) e são então colocadas numa incubadora com C0₂. 0 HIV-1 (estirpe LAV) é obtido dos Centers for Disease Control, Atlajn ta, Georgia. Os níveis de RT do vírus de concentrado são usu6 almente de 10 cpm RT/ml. Obtêm-se resultados semelhantes quari do se realiza o passo C antes do passo B.

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D. No 52 dia, as células e sobrenadantes são transferidos para um tubo de 15 ml e centrifugados a cerca de 900 g durante 10 minutos. Removem-se cinco ml de sobrenadante e concentra-se o vírus por centrifugação a 40 000 rpm durante 30 mi nutos (rotor Beckman 70.1 Ti). A pelota de vírus solubilizada é processada para determinação dos níveis de transcriptase inversa. 0s resultados são expressos em dpm/ml de sobrenadante amostrado.

Esta experiência mostra que a CS-87 tem uma actividade significativa na inibição da replicação in vitro de HIV. Avaliação em células ATH-8 infectadas com HIV-1 (estirpe HTLV-III)

A CS-87 foi analisada relativamente à sua actividade antiviral em células ATH-8 (S. Broder et al., NCI/NIH, Bethesda, Maryland). As células ATH-8 são primeiro tratadas com Polybre ne (2 g/ml em meio de crescimento) durante 30 minutos a 372C. As células são então recolhidas por centrifugação suave (40 g durante 15 minutos a 49C) e ressuspensas em sobrenadante com dois dias, clarificado (8 000 g durante 15 minutos a 42C), obtido a partir de células infectadas comH9HTLVIIΙθ. A seguir a um período de adsorção de 60 minutos, a 37SC, as células são colocadas em cavidades de fundo em U de tabuleiros com 96 cavi, dades (2 x 10⁴ células em 0,1 ml por cavidade). Adiciona-se então a cada cavidade um volume igual (0,1 ml) de meio RPMI 1640 suplementado, contendo o composto em ensaio e duas vezes a concentração normal de interleucina-2.

Os compostos em ensaio são avaliados em sete meios log de diluições, variando entre 100 e Ojl^ug/ml. Em cada nível de dosagem incluem-se culturas infectadas com vírus, em tripli cado, e uma cultura não infectada de controlo da citotoxicida, de do composto. As culturas são incubadas a 372C numa atmosfera humidificada de uma incubadora com 5% de C0₂~95% de ar. As dimensões das pelotas de células nas cavidades do composto de teste são comparadas, diariamente durante 10 dias, com as dimensões das pelotas nas cavidades com células infectadas e

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-12nas de controlo com células não infectadas. Na 102 dia após infecção recolhem-se alíquotas das cavidades individuais e determina-se o número total de células e a viabilidade das células (baseada na exclusão com corante azul de tripano). Incluem -se a 2 ’,3'-didesoxicitidina e a AZT como controlos positivos.

Avaliação em células HeLa-T4 infectadas com HIV-1 (estirpe RF-II).

Mantêm-se células HeLa-T4 (descritas em Cell 47:333, 1986) em meio Fagle modificado de Dulbecco contendo soro de v_i telo fetal inactivado a 10%, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100yAg/ml) e o antibiótico 0418 (1 mg/ml). As células são semeadas numa placa de 96 cavidades (2 x 10^ células/cavidade por 0,1 ml) e dois dias depois o sobrenadante é removido e o vírus adicionado. Após adsorção durante 45 minutos, o inó culo é removido e as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (pH 7,2). Os compostos a concentrações diferentes são então adicionados em meio de manutenção (conten do 2% de soro). As placas são incubadas numa incubadora humidificada com 5% de C0₂-95% de ar e deixa-se desenvolver os siri cícios durante 48 horas antes da fixação. As células são fixas com uma mistura de 5% de ácido acético glacial/95% de etanol durante 15 minutos e são então coradas com Giemsa (20% em PBS) durante 4 horas. As placas são então lavadas e secas. 0s focos são em seguida enumerados com um estereomicroscópio de dissecação.

Procedimento de RIA para p24 sobrenadante da cultura isento de células é ajustado a 0,5% de Triton X-100 antes da determinação dos níveis de HIV-1 p24 usando um conjunto de RIA da DuPont. Gera-se uma curva pa. drão na gama de 0,625 a 20 ng/ ml de p24 usando lisado virai inactivado, parcialmente purificado, (calibrado em relação a p24 purificado). 0 limite inferior da sensibilidade deste ensaio é de 30 pg/ml de p24.

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-13Análises por Western blot

A pelota virai é dissolvida em tampão Tris 2,5 mM (pH 8,0) contendo SDS a 1%, DTT 50 mM e corante de impressão e sub metida a análise por Western blot por uma técnica semelhante à descrita por Burnette em Anal. Biochem. 112,195-203 (1981). Usa-se um anti-soro bem definido, obtido de um paciente com SIDA, para detectar as proteínas separadas. A intensidade das bandas é determinada semi-quantitativamente (visualmente) ou com um densitometro de láser.

Os compostos deste invento têm a seguinte estrutura:

onde R¹ é OH, monofosfato, difosfato ou trifosfato ou um seu sal farmacologicamente aceitável, e estão em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Os compostos incluídos no presente invento podem estar, também, na forma de sais de, por exemplo, potássio, sédio e sais quaternários de amina, etc.. Análogos lixo- dos compostos do presente invento são também abrangidos pelo âmbito deste invento. Por exemplo, o substituinte 3' pode ter a configju ração oposta à apresentada na figura.

Os compostos deste invento podem ser sintetizados por mé todos conhecidos na arte. Lin et al, Colla et al., e Lin e Mancini, discutidos anteriormente, proporcionaram, cada um, procedimentos sintéticos que podem ser usados para preparar

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-14esses compostos. Um método específico de síntese conducente à CS-87 é o seguinte.

5^,-0-Tritil-2'-desoxiuridina (2)

Coloca-se, num frasco pré-aquecido (1005C), uma solução de 2’-desoxiuridina (50 g, 0,22 moles) e 62 g (0,22 moles) dé cloreto de tritilo em 350 ml de piridina seca e agita-se a 100SC sob um condensador de ar durante duas horas. A mistura reaccional é arrefecida até à temperatura ambiente e vertida lentamente em 4 1 de água gelada vigorosamente agitada. 0 sólido obtido é filtrado, lavado com água até que esteja livre de piridina, e dissolvido em clorofórmio e seco (NazSO^ ou MgSO^). A filtração e a evaporação do clorofórmio dá origem ao produto, sob a forma de um xarope (96 g, 93/0, que é usado na reacção seguinte sem mais purificação.

3¹-0-Mesil-5'-Tritil-2'-desoxiuridina (3)

A uma solução de 2 (96 g, 0,2 mol), em 350 ml de piridina seca, arrefecida em gelo, adicionou-se gota a gota 70 ml de cloreto de mesilo (98/, sp. gr. 1480). A mistura foi agitada num banho de água gelada durante 3 horas e vertida lentamente em água gelada vigorosamente agitada. 0 sólido precipitado foi filtrado, lavado com água, e seco (101 g, 94/).

(4) 2,3'-Anidro-5^,-0-tritil-2'-desoxiuridina ⁷

Suspendeu-se 3’-0-mesil-5 *-0-tritil-2’-desoxiuridina (101 g, 0,19 mol) em 350 ml de etanol (95/) e aqueceu-se a mis tura ao refluxo. A mistura refluxante adicionaram-se gota a gota 125 ml de uma solução aquosa de hidróxido de sódio (2 N). A mistura reaccional foi concentrada sob vácuo. 0 resíduo xaroposo foi purificado por cromatografia flash em vácuo, numa coluna de sílica-gel eluindo sequencialmente com clorofórmio, clorofórmio-metanol (50:1) e finalmente com clorofórmio-metanol (30:1). A evaporação das fracções puras deu origem a 72 g (88/) de pó branco.

(5)

3^,-Azido-5 '-O-tritil-2 *, 3 *-didesoxiuridina⁷

Uma mistura de 4. (72 g, 0,165 mol) e 50 g de azida de lí.

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-15tio em 250 ml de dimetilformamida seca foi aquecida a 110-120QC durante 12 horas. A mistura reaccional foi arrefecida e verti da lentamente em 4 1 de água gelada. 0 sólido obtido foi filtrado, lavado com água e dissolvido em clorofórmio e seco (MgSO^). A filtração e a evaporação do clorofórmio deu origem a 63 g (80%) do produto sob a forma de um xarope.

3¹-Azido-2*,3¹-didesoxiuridina (CS-87)

Aqueceu-se a 95-1009C durante duas horas, uma mistura de 3'-azido-5’-0-tritil-2’,3’-didesoxiuridina ' (63 g, 0,132 mol) e 300 ml de ácido acético (80%), A mistura reaccional foi arrefecida num banho de gelo e o sólido separado foi filtrado. 0 filtrado foi evaporado até à secura. 0 resíduo foi dissolvi, do numa mistura de metanol-clorofórmio e concentrado até se obter um xarope. A purificação do resíduo por cromatografia flash em vácuo, numa coluna de sílica-gel, com eluição sequencial com clorofórmio-metanol (70:1), clorofórmio-metanol (50:1) e finalmente com clorofórmio-metanol (30:1) deu origem a 23 g (70%) de produto incolor*

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-16SINTESE

HO

255 /

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-17Os humanos que sofrem de doenças provocadas por HIV podem ser tratados administrando ao paciente uma quantidade farmaceju ticamente eficaz de CS-87, na presença de um veículo ou diluen. te farmaceuticamente aceitável. Um veículo/diluente preferido para administração oral é água, especialmente água esterilizada. Quando se usa administração intravenosa os veículos/diluentes preferidos são soro fisiológico ou solução salina tamponada com fosfato (ΡΒΞ). Os compostos de acordo com o presente invento estão incluídos no veículo ou diluente farmaceuticameri te aceitável numa quantidade suficiente para exercer um efeito inibidor terapeuticamente útil em HIV in vivo sem exibirem efeitos tóxicos adversos no paciente tratado. Por quantidade inibidora de HIV entende-se uma quantidade de ingrediente activo suficiente para exercer um efeito inibidor em HIV medido por, por exemplo, um ensaio como os descritos aqui.

Podem também ser incluídos como parte da composição, agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis e/ou materiais adjuvantes. Os materiais activos podem também ser mistura dos com outros materiais activos que não prejudiquem a acção desejada e/ou que suplementem a acção desejada. Os materiais activos de acordo com o presente invento podem ser administrados por qualquer via, por exemplo, oralmente, parentericamente, intravenosamente, intradermicamente, subcutaneamente ou tópica, mente, na forma líquida ou sólida.

Um modo de administração preferido dos compostos deste invento é o oral. As composições orais incluirão geralmente um diluente inerte ou um veículo edível. Eles podem ser encer rados em cápsulas de gelatina ou comprimidos em comprimidos. Tendo por fim a administração terapêutica oral, os compostos citados podem ser incorporados com excipientes e usados na for. ma de comprimidos, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias, pastilhas elásticas e análogos. Estas prepa rações deverão produzir uma concentração de ingrediente activo no soro de cerca de 0,2 a 40^1^1. Uma gama de concentrações preferida é de 0,2 a 20^μΜ e mais preferivelmente de cerca de 1 a 10^caM. No entanto, a concentração de ingrediente activo na composição da droga dependerá ela própria da biodisponibili.

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-18dade da droga e de outros factores conhecidos dos especialistas .

E de notar que os valores da dosagem variarão também com a gravidade da condição da doença a ser aliviada. E ainda de notar que para todo □ sujeito particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados às necessidades individuais e à apreciação profissional da pessoa que administra z ou supervisiona a administração das composições citadas. E também de notar que as gamas de concentrações estabelecidas aqui são apenas exemplos e não limitam o âmbito ou prática do invento. 0 ingrediente activo pode ser administrado de uma só vez ou pode ser dividido em várias doses mais pequenas para se. rem administradas com intervalos de tempo variáveis.

Os comprimidos, pílulas, cápsulas, pastilhas e análogos podem conter os seguintes ingredientes: um ligante tal como celulose microcristalina, goma de tragacanto ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose; um agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel, amido de milho e análogos; um lubrificante tal como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante tal como dióxido de sílicio coloidal; e um agente adoçante tal como sacarose ou sacarina ou pode adicionar-se um agente aromatizante tal como hortelã pimenta, salicilato de metilo ou aromatizante de laranja. Quando a forma de unidade de dosagem é uma cápsula, ela pode conter, em adição ao material do tipo anterior, um veículo líquido tal como um ácido gordo. Outras formas de unidade de dosagem podem cojn ter outros materiais diferentes que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, como revestimentos. Esses comprimidos ou pílulas podem ser revestidos com açúcar, verniz ou outros agentes de revestimento entérico. Um xarope pode conter, além dos compostos activos, sacarose como agente adoçante e certos conservantes, pigmentos corantes e corantes e aromas. Os materiais usados na preparação destas várias compjo sições devem ser farmaceuticamente puros e não tóxicos nas quantidades usadas.

As soluções ou suspensões podem também incluir os seguin

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-19tes componentes: um diluente estéril, tal como água para injecção, solução salina, óleos fixos, polietileno-glicóis, gli cerina, propileno-glicol ou outros solventes sintéticos; agejn tes antibacterianos tal como álcool benzílico ou metilparabenos; anti-oxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tal como ácido etilenodiaminatetraacéticoj tampões tal como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para ajuste da tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parentérica pode ser encerrada em âmpo, las, seringas descartáveis e frascos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico.

As composições do presente invento são preparadas como formulações com veículos farmaceuticamente aceitáveis. São preferidos os veículos que protejam o composto activo contra rápida eliminação do corpo, tal como uma formulação para libej? tação controlada, incluindo implantes e sistemas de distribuição micro-encapsulada. Podem-se usar polímeros biocompatíveis, biodegradáveis, tal como poli-anidridos, ácido poli-glicólico, colagénio e ácido poli-láctico. Métodos de preparação destas formulações serão evidentes para os especialistas.

As suspensões lipossómicas (incluindo iipossomas destinados a células infectadas, com anticorpos monoclonais para ar» tigénios virais) são também preferidas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos dos especialistas, por exemplo, como descrito na Patente dos E.U. N9. 4 522 811 (cujas porções pertinentes são aqui incorporadas para referência). Por exemplo, as formulações lipossómicas podem ser preparadas por dissolução de lípido(s) apropriado(s) (tal como estearoíl-fosfatidil-etanolamina, estearoíl-fosfatidil-colina, aracadoíl-fosfatidil-colina e colesterol) num solvente inorgânico que é em se. guida evaporado, deixando na superfície do recipiente, um filme fino de lípido seco. E então introduzida no recipiente uma solução aquosa do composto activo (p.e. CS-87, monofosfato de CS-87, difosfato de CS-87 e/ou trifosfato de CS-87). 0 recipi. ente é então rodado à mão para libertar o material lipídico das ²⁵⁵ /

U-650/53-568 . '' ‘X-20paredes do recipiente e para dispersar agregados de lípidos, formando assim a suspensão lipossómica.

Os compostos de fosfato do presente invento são preparados por fosforilação de CS-87, como se descreve abaixo.

monofosfato pode ser preparado de acordo com o procedi, mento de Imai et al., 3. Org. Chem. 34(6), 1547-1550 (Bunho de 1969). Por exemplo, cerca de 100 mg de CS-87 e cerca de 280^x1 de cloreto de fosforilo são feitos reagir, com agitação, em cerca de 8 ml de acetato de etilo seco, a cerca de 09C durante cerca de quatro horas. A reacção é interrompida com gelo. A fase aquosa é purificada numa coluna de carvão activado, eluin do com hidróxido de amónio a 5% numa mistura de 1:1 de etanol e água. A evaporação do eluente deu 100 mg de monofosfato de 3'-azido-2',3'-didesoxiuridina, sob a forma de sal de amónio.

difosfato pode ser preparado de acordo com o procedime_n to de Davisson et al., 3« Org. Chem., 52(9) 1794-1801 (1987). 0 difosfato de 3’-azido-2',3'-didesoxiuridina é preparado a pa.r tir do tosilato de CS-87 que pode ser preparado, por exemplo, fazendo reagir CS-87 com cloreto de tosilo em piridina à tempe. ratura ambiente durante 24 horas, trabalhando o produto da fojr ma usual (p.e., lavando, secando e cristalizando-o).

trifosfato pode ser preparado de acordo com □ procedimento de Hoard et al., 3. Am. Chem. Soc., 87(8), 1785-1788 (1965). Por exemplo, o monofosfato de 3'-azido-2 ’,3'-didesoxi. uridina é activado (produzindo umaimidazoHda, de acordo com mé todos conhecidos dos especialistas) e tratado com pirofosfato de tributil-amónio em DMF. A reacção dá principalmente trifos. fato de 3'-azido-2’,3’-didesoxiuridina com algum monofosfato não reagido e algum difosfato. A purificação por cromatografia de permuta aniónica numa coluna de DEAE é seguida por isolamento do trifosfato de CS-87, p.e. sob a forma de sal de tetrassódio.

Os análogos estruturalmente afins, tais como os derivados fosforilados e acilados de CS-87 e os seus derivados de uridina e C-nucleósidos possuirão actividades semelhantes, geralmente,

255

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-21às mesmas gamas de concentração.

invento estando agora descrito na generalidade, será melhor compreendido fazendo-se referência a certos exemplos e£ pecíficos que são aqui incluídos apenas para ilustrar e que não se destinam a limitar o invento ou qualquer sua concretiza: ção, a menos que se especifique o contrário.

Realizaram-se várias experiências para demonstrar os efeitos da CS-87 no crescimento de determinadas células, os efeitos da CS-87 quando administrada in vivo e os efeitos da CS-87 na replicação de HIV.

I

Efeito da CS-87 no crescimento celular efeito da CS-87 na formação de colónias de células pre cursoras de granulócitos-macrófagos foi comparado com os efeitos da AZT e da CS-85 na Figura 1. 0 efeito da CS-87 em células Vero é apresentado na Figura 2a. As células Vero são célu las de crescimento muito rápido e pode ver-se na Figura 2a que até uma concentração de cerca de 400 micromolar existe uma toxicidade relativamente pequena para estas células. As células de PBM são de certo modo mais sensíveis à CS-87 do que as célu las Vero, mas estas células ainda tolerarão uma concentração de CS-87 de até cerca de 200 micromolar antes de se notar uma inibição significativa (ver Figura 2b).

Efeito de CS-87 em Animais

A Figura 3 mostra o efeito da CS-85 e da CS-87 no peso de ratinhos BALB/c não infectados. Pode ver-se que não existe diferença significativa entre a CS-87, CS-85 e o controlo. Os valores hematológicos de ratinhos NIH suiços tratados com AZT e com CS-87 (tendo-se-lhes administrado oralmente 0,5 mg/ml ad libitum durante um total de 67 dias) são apresentados no Quadro

1. A toxicidade significativamente inferior da CS-87 comparada com a da AZT torna-se evidente das diferenças nos valores de RBC e MCV.

Como se pode observar na Figura 4, existiu uma subida transiente de SGPT e SGOT, nos macacos, com a administração in travenosa de CS-87. No entanto, os animais voltaram ao normal

255

U-650/53-563

-22uma semana depois. Pode-se observar da Figura 4 que a adminis tração oral (po) é menos tóxica do que a administração intrav£ nosa.

No Quadro 2 apresenta-se a farmacocinética da CS-87 (níveis no soro e no cérebro) em ratinhos adultos. Nos macacos rhesus, os parâmetros farmacocinéticos após uma dose oral de 920 mg de CS-87 são os seguintes:

tl/2k da eliminação = 0,48 h remoção do sangue = 1,74 1/h/kg AUC = 113,43 mg h/1 volume de distribuição (Vss) = 1,2 1/kg constante da velocidade de absorção (Ka) = 1,73 h”^ tl/2 da velocidade de absorção = 0,40 h constante da velocidade de eliminação, K = 1,43 h

Efeito de CS-87 na Repljcação de HIV em Diferentes Tipos de Células

A CS-87 tem actividade anti-HIV-1 selectiva em células mononucleares de sangue periférico (PBM), como se mostra no Quadro 3 em conjungação com os valores anteriores.

Uma vez que a actividade antiviral de análogos de nucleó sido pode depender do tipo de ensaio e do tipo de células usados, a actividade da CS-87 foi determinada em várias células susceptíveis a HIV-1. Além das células de PBM usaram-se as cé lulas ATH-8 e as células HeLa-T4 recentemente descritas (Cell c n ' ~

47:333, 1986). A dose média eficaz (EC^ ) ou a concentração mínima inibidora (MIC) da CS-87 relativamente a 3'-azido-3‘-desoxitimidina (AZT) e 2',3'-didesoxicitidina (d2C) é descrita no Quadro 4.

Os resultados indicam que a potência da CS-87 e dos compostos afins variou de acordo com o sistema celular usado. Em bora a CS-87 tivesse uma actividade comparável à da d2C em células ATH-8, era menos activa em células HeLa-T4 e PBM. A CS-87 não foi tóxica para as células não infectadas quando testada até 200y*M. A percentagem de inibição da CS-87, AZT e d2C, em relação a HIV-1 (Estirpe RFII) em células HeLa-T4 em função da

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255

U-2 3concentração é apresentada na Figura 5.

Efeito da C5-87 em Retrovírus de Humanos, de Primatas não Humanos e de Murinos

No Quadro 5 apresenta-se uma comparação das diferenças entre as concentrações antivirais médias eficazes em humanos, primatas não humanos e murinos. A CS-87 é muito mais eficaz contra HIV (LAV-1) e SIV (SMM) do que contra Friend (EY-1O) ou ecotrópico de ratinho (vírus Cas-Br-M). Uma outra comparação da actividade de vários análogos de nucleósido, incluindo CS-87, contra HIV-1 e SIV em células PBM humanas é apresentada na Figura 6. 0 efeito do tratamento de retardamento, com AZT, CS-87 e CS-91, na replicação de HIV-1 e SIV em células PBM huma* nas é apresentado na Figura 7a, b, c. E evidente que o tempo de administração é crítico para a eficácia do tratamento.

Quadro 6 apresenta o efeito dos 5’-trifosfatos de CS-87 e AZT na transcriptase inversa de HIV e na alfa-ADN-polimerase, demonstrando de novo a enorme selectividade do composto CS-87 em relação a HIV e não na actividade dac<-ADN-polimerase na cé lula hospedeira.

As modificações e variações do presente invento, compos.i ções para o tratamento de HIV incluindo 3’-azido-2’,3*-didesoxiuridina e seus derivados, serão óbvios para os especialistas com base na descrição detalhada do invento apresentada. Estas modificações e variações deverão ser feitas no âmbito das reivindicações anexas.

255

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255

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-25QUADRO 2 farmacocinetica apos dose Única preliminar de cs-87 em ratinhos

	ADULTOS °
Tempo após	Níveis no	Níveis no
tratamento	soro	cérebro	Razão: B/S
(min.)	(y.g/ml)	Çug/ ml)
5	71,3	3,10	4,3
5	125,7	7,86	6,3
31	91,0	11,11	12,2
34	55,5	5,67	10,2
71	24,5	6,40	26,1
72	54,8	7,33	13,4
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Administrou	-se a droga	aos ratos numa	dose i.v.

250 mg/kg

255

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255

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-27QUADRO 4

SUMARIO DA ACTIVIDADE ANTIVIRAL CONTRA HIV-1 DA CS-87, AZT e D2C EM VÁRIOS SISTEMAS CELULARES

T ratamento		Sistema celular ÇmM)
	PBM (EC₅₀)	HeLa-T4 (EC_5Q)	ATH-8 (MIC)
CS-87	0,18	1,24	0,40
AZT	0,002	0,34	0,32
d2C(ddC)	0,011	0,48	0,47

QUADRO 5

DIFERENÇAS NAS CONCENTRAÇÕES MEDIAS ANTIVIRAIS EFICAZES ENTRE

RETROVIRUS DE HUMANOS, PRIMATAS NflO HUMANOS E MURINOS ec₅₀ ÇuM)

	HIV	SIV	Friend	Ecotrópico de ratinho
	(LAV-1)	(SMM)	(EY-10)	(Cas-Br-M)
AZT	0,002	0,002	0,004	0,007
CS-87	0,28	0,20	>10	9,10
CS-91	0,39	1,16	ND	77,9
HS-20	2,40	0,52	0,89	0,79
HS-21	3,20	2,30	0,70	1,16
			QUADRO 6
EFEITO DOS 5’-TRIFOSFATOS	DE CS-87 E AZT	NA TRANSCRIPTASE INVER
SA E NA	ALFA-ADN-	POLIMERASE
Composto	HIV RT	^-ADN	pol da célula	hospedeira Razão:
	Kp nM		Κ_χ, mM	Celular/HIV
CS-87-TP	9		1,2	133 333
AZT-TP	40^d		0,23 ⁰	5 750

De acordo com Furman et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 1986.

67 255 U-650/53-568	-28-	ç *
	R E I V I N D I C A Ç Ώ E S

Claims

1 - Método para a preparação de uma composição para o tratamento de doenças virais caracterizado por compreender proporcionar 3’-azida-2’,3'-didesoxiuridina, numa dosagem que tenha como resultado uma concentração, na corrente sanguínea do paciente, de cerca de 0,2 a 40_/ZaM, que para tal é misturada com veículos farmaceuticamente aceitáveis, adequados.

2 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender encapsular a 3’-azido-2’,3'-didesoxiuridina com um veículo farmaceuticamente aceitável num revestimento en térico.

3 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender encapsular a 3'-azido-2*,3’-didesoxiuridina num implante biodegradável.

4 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender proporcionar uma suspensão lipossómica para distribuição da 3'-azido-2’,3’-didesoxiuridina.

5 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda a fosforilação da 3’-azido-2’,3’-dide soxiuridina para formar □ mono, di ou trifosfato.

6 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda a acetilação da 3’-azido-2’, 3'-didesg. xiuridina.

7 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender misturar com a 3’-azido-2',3’-didesoxiuridina, compostos seleccionados do grupo consistindo em água para injecção, solução salina, éleos, polietileno-glicéis, glicerina, propileno-glicol, agentes antibacterianos, antioxidantes, ageji tes quelantes, tampões e agentes para ajustamento da tonicidade.

8 - Método para o tratamento de infecção por HIV e para

67 255

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-29a prevenção de infecção por HIV num humano, que compreende administrar uma quantidade, inibidora de HIV, de uma composição preparada de acordo com as reivindicações 1 a 7, a um ser humano infectado por HIV, numa dosagem que tenha como resultado uma concentração de ingrediente activo no soro de cerca de 0,2 a 40de preferência de 0,2 a 20^λαΜ e com maior preferência numa concentração de 1 a 10^/aM.

9 - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade inibidora de transcriptase inversa de HIV do referido composto.

10 - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizja do por compreender administrar uma quantidade não inibidora de ADN polimerase humana do referido composto.

11 - Método de acordo com as reivindicações 8 a 10, caracterizado por se administrar 3'-azido-2',3'-didesoxiuridina numa dosagem que tenha como resultado uma concentração, na cor. rente sanguínea do paciente, de cerca de 0,2 a 40_/tAM.