PT789586E - Compostos para a prevencao e tratamento de infeccoes por helmintas - Google Patents

Description

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ DESCRICÃO "Compostos para a prevenção e tratamento de intecções por helmintas"

Campo do Invento U presente invento rcfore-se a composições capazes de eliciar uma resposta imunitária em vertebrados contra infecções por helmintas. Em particular, o presente invento refere-se a vacinas que podem ser utilizadas para proteger um vertebrado contra a infecção por helmintas parasitas.

Antecedentes do Invento

As infecções por helmintas são a principal causa de morbidade e mortalidade em animais domésticos e populações humanas. Em geral, o termo helminta refere-se a espécies parasitas e não parasitas pertencentes aos filos platelmintas (por exemplo, tremátodo, ténias e outros vermes planos) e nematelmintas (por exemplo, nemátodo) e seus relacionados.

Uma descrição detalhada dos helmintas, em cujos ciclos de vida a migração para os tecidos desempenha um papel importante, assim como uma discussão das condições patológicas que eles causam pode ser encontrada, por exemplo, em E.J. Soulsby, Helminth, Arthropods and Protozoa of Domesticated Animais, 7a Edição, Lea e Febiger, Filadélfia (1982) e em G.M. Urquhart, "Veterinary Parasitology", Longman Scientific and Technical, Reino Unido (1987).

Todos os parasitas eliciam respostas imunitárias, mas por muitas razões são capazes de apresentar um alvo móvel e por vezes invisível à resposta imunitária do hospedeiro, numa tal extensão que os mecanismos de controlo normais falham ocorrendo frequentemente lesão imunológica em vez de imunidade. Isto, por sua vez, conduz frequentemente a que o hospedeiro "desligue" a sua resposta imunitária ineficaz e frequentemente contraprodutiva, resultando assim em alterações patológicas grosseiras e imunossupressão. A diversidade* estrutural e antigénica dos helmintas parasitas está reflectida na heterogeneidade das respostas imunitárias específicas que eliciam. 86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 2

Os helmintas parasitas eludem frequentemente o sistema imunitário mascarando e largando os seus antigénios de superfície ou variando os seus antigénios durante a sua residência em hospedeiros vertebrados. Esta capacidade para mascarar, largar e variar os antigénios de superfície é a principal causa das dificuldades experimentadas até agora, na produção de vacinas eficazes contra a infecção por helmintas.

Uma revisão das vacinas modernas utilizadas no tratamento de doenças por parasitas é fornecida em, J.H.L. Playfair et al., The Lancet, 335 (1990): 1263-1266, embora possa ser encontrada uma discussão mais geral da natureza da resposta imunológica dos hospedeiros a helmintas parasitas no artigo de S. Uoyd e E.J.L. Soulsby em. "Parasitology in Focus: Facts and Trends", Ed. H. Mehlhorn, Springer-Verlag (1988), pgs 619-650. Como indicado no artigo de revisão de Playfair et al., e como acima mencionado, uma vez que as medidas de controlo de helmintas existentes são dispendiosas e difíceis de implementar numa grande escala, há uma forte necessidade de vacinas capazes de reduzir a intensidade e prevalência da infecção por helmintas, em populações de hospedeiros.

Antes do presente invento, considerava-se improvável que um só antigénio pudesse conferir protecção adequada contra uma vasta gama de infecções por helmintas, com base nas dificuldades acima referidas, encontradas na produção de vacinas anti-helmínticas eficazes até contra espécies específicas. Para uma revisão global dos desafios médicos e científicos proporcionados pelos helmintas, ver A.A.F. Mahmoud, Science, 246 (1989): 1015-1021. (Adicionalmente ver também as entradas "Parasites, Escape from Immunity", por D.J. Mclaren e "Parasites, Immunity to" por F.E.G. Cox, na Encyclopedia of Immunology, eds. I.M. Roitt e P.J. Delves, Academic Press, 1992.)

Sumário do Invento

De acordo com o presente invento, um composto adequado para protecção de um vertebrado contra a infecção por helmintas compreende hialuronidase covalentemente acoplada a um transportador imunoestimulante. Na forma preferida, o composto do presente invento é administrado ao vertebrado na forma de uma vacina e o transportador imunoestimulante ao qual \ ' \ '

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 3 a hialuronidase está covalentemente acoplada compreende um copolímero de N-óxido de etilenopiperazina e brometo de N-etilacetiletilenopiperazínio (a seguir referido como "sinpol"). O presente invento é baseado, em parte, na verificação de que a enzima hialuronidase é produzida por espécies helmintas larvares de modo a penetrar as barreiras dos tecidos, no corpo dc um organismo hospedeiro que infectaram. Na prática, o presente invento é capaz de eliciar uma resposta imunitária contra hialuronidase, como produzida pelos helmintas, reduzindo assim drasticamente, se não eliminando, a capacidade dos helmintas para penetrar as barreiras dos tecidos e assim infectar um animal. 0 composto do presente invento pode ser utilizado para protecção de um vertebrado contra a infecção por helmintas. Na forma preferida, o composto é administrado ao vertebrado na forma de uma vacina que inclui, em mistura com o composto, sinpol. Exemplos dos vertebrados que podem ser tratados de acordo com o presente invento incluem o homem, gado vacum, ovelhas, porcos, cães, cavalos, gatos, cabras, búfalos, dromedários e aves domésticas.

Um aspecto adicional do presente invento é o de proporcionar um processo que compreende a reacção da hialuronidase e de um transportador imunoestimulante, sob condições de tempo e temperatura, para acoplar covalentemente a hialuronidase e o referido transportador imunogénico.

Pensa-se que o presente invento oferece uma variedade de vantagens sobre as técnicas da arte anterior para protecção dos vertebrados contra infecções por helmintas. O composto do presente invento proporciona protecção contra a infecção por espécies de helmintas que utilizam hialuronidase para facilitar a sua migração no corpo de um organismo hospedeiro. Por conseguinte, o composto do presente invento é eficaz contra um largo espectro de espécies de helmintas. Esta é uma vantagem significativa sobre as vacinas da arte anterior que estão frequentemente limitadas à protecção de um hospedeiro apenas contra uma espécie específica de helminta.

Uma vantagem adicional oferecida pelas vacinas do presente invento é a de que 3ão fortemente imunogénicas. As vacinas anti-helmínticas da arte anterior são com frequência apenas fracamente imunogénicas e induzem efeitos

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ secundários indesejáveis tais como inflamação localizada, resposta alérgica e febre. Adicionalmente, as vacinas da arte anterior utilizam frequentemente proteínas transportador macromoleculares que causam um certo número de efeitos imunopatológicos secundários no organismo vacinado.

Estas e várias outras desvantagens das vacinas anti-helmínticas da arte anterior foram ultrapassadas pelo fornecimento do composto do presente invento visto que é capaz de eliciar uma forte resposta imunogénica sem os efeitos secundários frequentemente observados em preparações de vacina anti-helmíntica da arte anterior. Além disso, os compostos do presente invento não parecem afectar o desenvolvimento ou a fertilidade. A capacidade da vacina do presente invento para eliciar uma resposta imunogénica forte e proporcionar um amplo espectro de protecção contra uma variedade de espécies de helmintas oferece vantagens até agora não observadas na arte das vacinas anti-helmínticas.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 ilustra a fórmula geral para o sinpol. A Figura 2 constitui a fórmula estrutural do sinpol que é produzido como descrito no Exemplo 1. A Figura 3 constitui a fórmula estrutural do sinpol que é produzido como descrito no Exemplo 2. A Figura 4 é um gráfico que indica as alterações no peso corporal do rato após injecção de um composto do presente invento.

Descrição Detalhada do Invento

Um aspecto do presente invento consiste em proporcionar um material que compreenda o produto de reacção da hialuronidase e de um transportador imunoestimulante.

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Ο termo hialuronidase, como aqui utilizado, refere-se a uma família de enzimas que hidrolisam os polissacáridos que ocorrem naturalmente, em particular, o ácido hialurónico e os glicosaminoglicanos tais como sulfatos de condroitina (4-, 6-, D e E). Estas substâncias poliméricas são componentes essenciais da estrutura semelhante a gel, semi-sólida, da matriz extracelular. A hialuronidase cliva estas substâncias poliméricas sendo, por conseguinte, capaz de destruir as matrizes extracelulares. Uma grande variedade de espécies de helmintas produz e utiliza hialuronidase para hidrolisar os componentes acima mencionados das matrizes extracelulares do organismo hospedeiro permitindo assim aos helmintas penetrar as barreiras dos tecidos e migrar no corpo de um organismo hospedeiro até atingirem um órgão preferido onde crescem e amadurecem. A família hialuronidase inclui enzimas relacionadas que hidrolisam os substratos do tipo acima mencionado. Estas podem ser agrupadas de acordo com a sua especificidade para diferentes ligações na estrutura das moléculas de polímero de ácido hialurónico. Em particular, as hialuronidases podem ser agrupadas em três grupos principais: hialuronoglucosaminidases, hialuronoglucuronidases e glucuronato-liases (B. Fiszer-Szafarz, Analytical Biochemistry, vol. 143, pg. 76 (1984)). A hialuronidase nativa isolada demonstra uma imunogenicidade extremamente fraca e não induz a produção visível de anticorpos anti-hialuronidase, mesmo após injecções repetidas. A hialuronidase tem sido isolada a partir de uma variedade de fontes, incluindo venenos de cobra e abelha, saliva de sanguessuga, os grânulos acrossómicos de espermatozóides, os grânulos lisossómicos de várias células e de toxinas bacterianas. Fontes exemplificativas de hialuronidase que podem ser utilizadas na prática do presente invento incluem testículos de gado vacum e ovelhas, helmintas, sanguessugas, venenos de abelha e cobra e bactérias.

As fontes bacterianas de hialuronidase incluem, mas não estão limitadas, às seguintes: Streptococcus millery (P.F. Unsworth, J. Clin. Pathology, (Londres) 1989, 42(5), 506-510); Streptococcus pyogenes (W.L. Hynes e J.J. Ferretti, Infection and Immunity, 1989, 57(2), 533-539); Streptococcus equis/milis (R. Sting et a!., Med. Sei. Res., 1989, vol. 17, No. 17, pgs. 723- 86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 6

725); Clostridium difficile (S.V. Seddon et aí., J. Med. Microbiol., 1990, v. 31, no. 3, pgs. 169-174); Streptococcus uberis (P. Schaufuss et ai, Zentralbi Dekterioi FRG, 1989, v. 271, no. 1, pgs. 46-53); e Streptococcus dysga/actiae (A. Hamai et ai, Agríc. Biol. Chem., 1989, v. 53, No. 8, pgs. 2163-2168). Adicionalmente, as leveduras do género candida mostraram também conter hialuronidase. M.T. Shimizu, Rev. Microbiol., 1988, v. 19, No. 4, pgs. 442-445).

Numa dada espécie, a hialuronidase pode ser geralmente encontrada na forma monomérica assim como em formas oligoméricas, estando frequentemente presentes, por exemplo, dímeros e tetrâmeros da mesma subunidade. A sequência de aminoácidos para a hialuronidase produzida pelo bacteriófago de Streptococcus pyogenes foi determinada (W.L. Hynes et ai, Infection and Immunity, 57 (1989): 533-539) e a hialuronidase de veneno de abelha foi recentemente sequenciada (M. Gmachl et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90, 3569-3573 (1993)). Prevê-se que a sequenciação e clonagem dos genes que codificam a hialuronidase sejam a base para a produção de hialuronidase à base de ADN recombinante, para utilização na prática do presente invento.

Pode-se utilizar, para preparar o composto do presente invento, uma variedade de preparações de hialuronidase comercialmente disponíveis, incluindo, por exemplo, uma preparação de hialuronidase de bovino vendida por REANAL CO. (N° de catálogo 0705). A electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) da hialuronidase obtida a partir desta fonte indica a presença de uma banda de proteína principal tendo um peso molecular aproximado de 63 quilodaltons (kDa). Pode também ser utilizado um material obtido a partir de testículos de ovelhas vendido por Sigma Chemical Co. (N° de catálogo H2126). A electroforese em gel de poliacrilamida da hialuronidase obtida a partir desta fonte revela uma banda de proteína principal tendo um peso molecular aproximado de aproximadamente 39 kDa. A hialuronidase pode ser também obtida a partir de Serva (N° de catálogo 25119 e N° de catálogo 25121).

Embora as preparações de hialuronidase obtidas a partir de várias fontes comerciais difiram relativamente à espécie proteica predominante presente, como evidenciado por PAGE, verificou-se que as várias preparações de hialuronidase comerciais são todas enzimaticamente activas, sendo também

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 7 imunologicamente reactivas em reacção e cruzada umas com as outras. Adicionalmente, praticamente todas as preparações investigadas contêm, pelo menos, traços de uma espécie proteica que tem um peso molecular de aproximadamente 60-69 kDa, não se podendo excluir a possibilidade de as cadeias polipeptídicas mais pequenas presentes nas condições de redução, utilizadas no processo de PAGE, serem montadas sob condições fisiológicas em oligómeros de cerca de 60-90 kDa.

Prevê-se que os compostos do presente invento que utilizam hialuronidase isolada a partir de testículos de carneiros e touro possam oferecer uma combinação de imunogenicidade, rentabilidade económica e conveniência, particularmente desejáveis. Os métodos de purificação de tais hialuronidases estão relativamente bem desenvolvidos e incluem os passos de extracção, precipitação, centrifugação, ultrafiltração, permuta iónica e cromatografia em gel normalmente utilizados. Os compostos do presente invento que utilizam hialuronidase isolada de testículos de ovelha ou bovino provocam uma resposta imunitária à hialuronidase de helminta. A utilização de hialuronidase isolada de testículos de ovelha ou bovino é também significativamente mais economicamente rentável do que o isolamento da hialuronidase a partir de larvas de helmintas. Verificou-se que a hialuronidase de origem testicular cliva o ácido hialurónico sendo também capaz de reconhecer sulfatos de condroitina. (Barttolucci et a!., Int. J. Tissue React., 13(6) (1991), p. 311). Por conseguinte, as concretizações particularmente preferidas dos compostos do presente invento são feitas utilizando hialuronidase obtida dos testículos de ovelhas não castrados ou touros. Neste aspecto verificou-se que a hialuronidase de origem em ovelha ou bovino vendida por Sigma Chemical Company é adequada na prática do presente invento.

Observou-se que os compostos do presente invento que utilizam hialuronidase obtida a partir de uma fonte diferente do animal que recebe o tratamento do presente invento são frequentemente mais imunogénicos do que os compostos que utilizam hialuronidase isolada a partir das espécies a tratar. Por exemplo, a hialuronidase isolada de ovelha tende a eliciar uma resposta imunitária mais forte no gado vacum do que a hialuronidase isolada de gado vacum. Para a rentabilidade económica e conveniência do tratamento de ovelhas e gado vacum, deve-se ter em consideração a utilização de um 8 86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ composto que é preparado a partir de uma mistura de hiaiuronidases de carneiro e touro.

Os compostos no âmbito do presente invento compreendem o produto de reacção da hialuronidase, como acima descrita, e de um transportador imunoestimulante. Como aqui utilizado, o termo "transportador imunoestimulante" refere-se a um composto que, quando combinado com um dado antigénio, proporciona um complexo altamente imunogénico (antigénio-imunoestimulante) que pode imunizar eficazmente até mesmo indivíduos fracos respondedores a um dado antigénio. Exemplos dos transportadores imunoestimulantes que podem ser utilizados na prática do presente invento estão descritos na publicação seguinte que inclui uma discussão da utilização de poli-iões sintéticos como imunoestimulantes: Khaitov, R., Anna/s New York Academy of Sciences, 685, 788-802, Junho 23, 1993. É feita referência neste artigo ao polioxidónio que é equivalente ao Sinpol utilizado no presente invento.

Em concretizações preferidas, o transportador imunoestimulante que é feito reagir com hialuronidase é sinpol. Como aqui utilizado, o termo "sinpol" refere-se a copolímeros de N-óxido de etilenopiperazina e brometo de N-etilacetiletilenopiperazínio, correspondente às fórmulas apresentadas abaixo na Figura 1, na qual n= 200-2000; q= (0,2-0,35)n; z= (0,4-0,65)n; m= (0-0,4)n. O sinpol, contrariamente à maioria dos outros transportadores e adjuvantes não é imunogénico. Pensa-se que o sinpol não tem determinantes antigénicos reconhecíveis e por conseguinte não provoca uma resposta imunitária evitando assim os efeitos secundários indesejáveis observados com a maioria dos outros adjuvantes e transportadores utilizados em preparações de vacina.

De modo a identificar de forma adequada as várias espécies de sinpol, umas das outras, o termu "sinpol" é utilizado em comhinação e sequencialmente com valores para cada uma das letras acima mencionadas "n", "q", "z" e "m". Por exemplo, o N-óxido de etilenopiperazina e o brometo de N-acetiletilenopiperazínio com n= 1000, q= 0,35, z= 0,60, m= 0,05 é referido como "sinpol 1000-35/60".

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Um exemplo de um copolímero de espécie específica de sinpol utilizado com sucesso como transportador imunoestimulante nas concretizações de vacina do presente invento será aqui referido como "sinpol 1000-20/50". O sinpol tendo um peso molecular de, pelo menos, cerca de 15 kDa ou superior é preferido na prática do presente invento, sendo especialmente preferido o Sinpol que tem um peso molecular superior a, pelo menos, cerca de 30 kDa. 0 composto do presente invento pode ser preparado por um qualquer método adequado que efectue a ligação química da hialuronidase ao transportador imunoestimulante, por exemplo, por ligação covalente da hialuronidase ao transportador imunoestimulante. Tais ligações covalentes podem ser formadas directamente entre grupos reactivos da hialuronidase e do transportador imunoestimulante ou podem ser formadas através de um ou mais grupos de ligação. Como se poderá observar a partir dos exemplos descritos abaixo, um método preferido para a preparação do produto de reacção da hialuronidase e do transportador imunoestimulante preferido do presente invento, isto é, sinpol, envolve a utilização do método da azida. Este método envolve a conversão da forma ácido ou éster de sinpol na hidrazida, por utilização de hidrazina e, em seguida, combinação desta com hialuronidase sob condições que produzem um produto de reacção em que a hialuronidase está covalentemente acoplada ao sinpol. Alternativamente, e também como ilustrado nos exemplos seguintes, um outro método preferido para a preparação do produto de reacção de hialuronidase e sinpol envolve a formação de um éter de succinimida ou sinpol. 0 éter de succinimida é então combinado com hialuronidase sob condições que produzem um composto para utilização na prática do presente invento.

Pensa-se que o composto do presente invento será mais amplamente utilizado para proteger vertebrados da infecção por helmintas. Para este fim, prefere-se que o produto da reacção de uma hialuronidase e de um transportador imunoestimulante seja utilizado na forma de uma vacina. Como aqui utilizado, o termo "vacina" refere-se a umo composição que contém o composto do presente invento e que está numa forma que é capaz de ser administrada a um vertebrado. A vacina compreende tipicamente, um meio de solução salina ou solução aquosa tamponada convencional no qual o composto do presente invento está suspenso ou dissolvido. Desta forma, o composto do 86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 10

presente invento pode ser adequadamente utilizado para prevenir, melhorar ou de outro modo tratar uma infecção por helmintas.

Na forma preferida, a vacina do presente invento inclui adicionalmente um adjuvante que pode estar presente quer numa proporção menor quer numa proporção maior relativamente ao composto do presente invento. O termo “adjuvante" como aqui utilizado refere-se a estimulantes não específicos da resposta imunitária que quando combinados com a vacina do presente invento, proporcionam uma resposta imunitária melhorada. Pode-se utilizar uma grande variedade de adjuvantes. Os exemplos incluem adjuvante de Freund completo e incompleto, hidróxido de alumínio e muramildipétido modificado. Em concretizações preferidas do presente invento, o sinpol é utilizado como um adjuvante em mistura com o composto do presente invento.

Como acima mencionado, os compostos do presente invento destinam-se a ser utilizados para proteger espécies de vertebrados de infecções por helmintas. Exemplos dos vertebrados que podem ser tratados de acordo com o presente invento incluem o homem e vários animais domesticados, incluindo, por exemplo, gado vacum, ovelhas, porcos, cães, cavalos, gatos e cabras, assim como outros equinos, búfalos, dromedários e aves domésticas. Em particular, espera-se que os compostos do presente invento sejam eficazes na prevenção e tratamento de infecções por helmintas parasitas em animais que são expostos a espécies de helmintas que utilizam hialuronidase. 0 composto do presente invento pode ser parentericamente administrado por administração intramuscular, subcutânea ou intradérmica. A via preferida da administração para um dado organismo pode ser encontrada por referência à secção de Exemplos do pedido. As gamas de doses preferidas podem variar dependendo do animal a ser tratado e da espécie helminta mais prevalente, num dado ambiente, mas em geral, uma dose de vacina de aproximadamente 0,05 mg de proteína/kg de peso do animal mostrou ser eficaz. Uma orientação adicional referente à gamas de doses eficazes pode ser encontrada por referência à secção de Exemplos abaixo.

Verificou-se que as condições moderadas que podem ser utilizadas, de preferência, para acoplamento covalente da hialuronidase ao sinpol não afectam os epítopos antigénicos da hialuronidase de uma forma significativa; por 11 11 4? JlçJÊr&sia 86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ conseguinte, obtém-se um composto altamente imunogénico. Os imunoensaios com ligação de enzimas em fase sólida (ELISA) mostraram que os anticorpos anti-hialuronidase podem reconhecer os epítopos da hialuronidase que foram conjugados com sinpol, demonstrando que estes epítopos são mantidos.

Verificou-se também que o local enzimático da hialuronidase é mantido após o acoplamento covalente da hialuronidase ao sinpol. Em particular, observou-se que a taxa de degradação de substrato de hialuronidase sozinha é substancialmente idêntica à taxa de degradação de substrato de hialuronidase que foi covalentemente acoplada a sinpol. Além disso, a hialuronidase quando acoplada ao sinpol, é significativamente mais estável do que a enzima nativa. Isto foi demonstrado utilizando testes de inactivação enzimática de hialuronidase, incluindo ensaios de termoestabilidade e resistência à inibição mediada por heparina. A estabilidade melhorada da hialuronidase proporcionada pela sua conjugação ao sinpol proporciona um amplo espectro de outras utilidades para o composto do presente invento. Em adição à sua capacidade para inibir infecções por helmintas, prevê-se que o composto do presente invento possa ser utilizado para eliciar uma resposta imunitária a outros patogénios ou organismos, por exemplo, os patogénios ou organismos que utilizam a hialuronidase para digerir tecido, tal como, por exemplo, certas bactérias e suas toxinas. Adicionalmente, o composto do presente invento pode ser utilizado para bloquear a acção ou localizar a disseminação de venenos contendo hialuronidase (tais como os venenos de abelha e cobra). O presente invento inclui também no seu âmbito métodos de utilização da hialuronidase covalentemente acoplada ao sinpol para tratar a fibrose em vertebrados por administração de uma composição que compreende a hialuronidase covalentemente acoplada a sinpol.

Adicionalmente, o composto do presente invento pode ser utilizado em cosmetologia como ingrediente activo em cremes e outros produtos utilizados para tornar a pele mais macia e mais suave. Neste aspecto, deve-se observar que os materiais contendo esperma humano têm sido utilizados como produtos protectores da pele na Rússia. No entanto, a utilização de um tal produto está altamente limitada devido à instabilidade da hialuronidase. Uma vez que o composto do presente invento é estável, solúvel e não tóxico, tem aplicações imediatas nesta área, tendo de facto sido realizadas investigações sobre a sua utilização nesta área. O presente invento inclui também no seu âmbito a utilização da hialuronidase covalentemente ligada a sinpol como um factor de disseminação para aumentar a eficácia de medicamentos. Pode também ser utilizado para aumentar a difusão e acelerar a absorção na utilização médica, pnr exemplo. como ingrediente numa solução de antibiótico para o tratamento da mastite de bovino em utilização veterinária. No passado, a hialuronidase não estabilizada tem sido utilizada nestes contextos (cf., por exemplo, The Merck Index, 8a Edição) esperando-se, por conseguinte, que a forma estabilizada de hialuronidase proporcionada pelo presente invento proporcione vantagens significativas sobre as composições que utilizam a forma nativa de hialuronidase. O presente invento inclui também no seu âmbito a utilização da hialuronidase covalentemente ligada a sinpol nos seguintes contextos terapêuticos onde a hialuronidase livre (não estabilizada) tem mostrado ter efeitos benéficos: enfarte do miocárdio (cf. E.J. Flint et aí., The Lancet, 17 de Abril (1982), pgs. 871-874 e também D. Maclean et ai, Science, vol. 194, pgs. 199-200 (1976)); função retiniana melhorada (cf. B.S. Winkler et ai, Arch. Opthalmoi 103 (1985), pgs. 1743-1746); em combinação com citostáticos no tratamento de tumores cancerígenos (G. Baumgartner et ai, J. Exp. Clin. Câncer. Res. 4 (1985), pg. 3 e W. Scheithauer et ai, Anticancer Res., vol. 8, pgs. 391-395 (1988); no controlo da aracnoidite espinal tuberculosa (cf. M. Gourie-Devi et ai, J. Neuroi Sei., vol. 102, pgs. 105-111 (1991)); para o controlo dos abcessos cerebrais encapsulados em doentes de alto risco (cf. A. Pasaoglu, Acta Neurochir., vol. 100, pgs. 79-83 (1989)). Além disso, a hialuronidase tem sido utilizada in vitro para despolimerizar ácido hialurónico num sistema isento de células, por exemplo, ou para estimular a ácido hialurónico-sintetase, por exemplo, em procedimentos de cultura de células (L.H. Philipson et ai, Biochemistry 24 (1985), pgs. 7899-7906).

Exemplos

Os primeiros dois exemplos são ilustrativos da preparação das duas espécies de sinpol, identificadas nos exemplos.

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Exemplo Ί - Preparação de Sinpol 1000-20/50

Utilizou-se um procedimento de três passos para sintetizar um copolímero de N-óxido de etilenopiperazina e brometo de N-acetiletilenopiperazínio. (1) O polímero inicial, a 1,4-etilenopiperazina, foi sintetizado no primeiro passo. Para este fim, realizou-se a polimerização de cadeia viva de 1,4-diazabicicio[?.?.?]octano, de acordo com o protocolo seguinte. 10 g do monómero preliminarmente sublimado e 0,05 g de brometo de amónio foram selados em ampolas de vidro de 10 ml. Produziu-se na ampola, utilizando uma bomba de vácuo, um vácuo de 5x10'3 mmHg de pressão residual. A ampola foi exposta durante 25 horas a 200°C num termostato. O rendimento em polímero foi de aproximadamente 100%, P.M.. 120000 (calculado por dispersão de luz laser de baixo ângulo LALLS). (2) O segundo passo foi realizado para produzir o poli(N-óxido de 1,4-etilenopiperazina). 5 g de poli-1,4-etilenopiperazina (P.M. 120000, n= 1000) foram dissolvidos em 250 ml de solução de ácido acético a 1 % Em seguida, adicionaram-se 4 ml de H202 a 30% e a oxidação durou 36 horas. Após ultrafiltração e liofilização, obteve-se o poli(N-óxido de 1,4-etilenopiperazina) (P.M. 110000, z= 0,5n). (3) A alquilação do poli-N-óxido acima foi realizada durante o terceiro passo. 0 poli(N-óxido de 1,4-etilenopiperazina) produzido durante o segundo passo foi dissolvido em 125 ml de metanol tendo-se adicionado 16,5 g de ácido bromoacético. A reacção de alquilação foi realizada durante 10 horas a 25°C. 0 solvente foi evaporado em vácuo e o depósito foi dissolvido em água, dialisado contra água durante 24 horas e seco utilizando liofilização. Finalmente, obteve-se o copolímero de N-óxido de etilenopiperazina e brometo de N-acetiletilenopiperazínio com a fórmula seguinte (ver Figura 2). O rendimento foi de 95%. A razão de oxidação foi estimada pelo método cromométrico (ou titulação titanométrica) e pela razão das intensidades

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 14 integrais das bandas dos espectros de PMR, na região 2,5-4,5 m.d. O método de titulação cromométrica ou titanométrica refere-se ao método de determinação quantitativa dos grupos N-óxido reduzidos por sais de crómio bivalente ou titânio trivalente (Brooks, R.T. e P.D. Sternglanz, Anal. Chem., 1959, v. 31, N4, p. 561-565). A razão de oxidação igualou z= 0,5η. A razão de alquilação foi determinada por espectros IV (banda a 1735 cm) e espectros PMR (região 2,5-4,5 m.d.) e igualou q= 0,2n.

Exemplo 2 - Preparação de Sinpol 200-35/65

Um copolímero de N-óxido de etilenopiperazina e brometo de N-acetiletilenopiperazínio, com P.M. 25000 (n= 200, q= 0,35n, z= 0,65n) foi sintetizado utilizando um procedimento de três passos, similar ao do Exemplo 1. (1) No primeiro passo, 10 g do monómero preliminarmente sublimado e 0,11 g de brometo de amónio foram selados numa ampola de vidro de 10 ml. Em seguida, produziu-se na ampola um vácuo (5x10"1 mmHg), utilizando uma bomba de vácuo, e a ampola foi mantida a 200°C durante 15 horas. O rendimento em poli-1,4-etilenopiperazina foi de aproximadamente 100%, P.M. 80000 (medido por LALLS). (2) No segundo passo, realizou-se a N-oxidação da poli-1,4-etilenopiperazina, da forma seguinte. 5 g de poli-1,4-etilenopiperazina obtida no primeiro passo foram dissolvidos em 250 ml de solução de ácido acético a 1%. Em seguida, adicionaram-se 4,6 ml de H202 a 30%, a 2-4°C, utilizando agitação suave. A oxidação durou 48 horas. Em seguida, após limpeza por ultrafiltração e liofilização, recuperou-se o poli(N-óxido de 1,4-etilenopiperazina) (P.M. 50000, z= 0,65n). 1 A quantidade de poli(N-óxido de 1,4-etilenopiperazina) produzido no passo (2) acima foi dissolvido em 125 ml de metanol tendo-se adicionado 16,5 g de ácido bromoacético. A reacção de alquilação foi realizada a 30°C durante 24 horas. O solvente foi evaporado em vácuo e o depósito resultante foi dissolvido em água, dialisado durante 24 horas contra água e liofilizado. 15 86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ

Produziu-se um copolímero de N-óxido de etilenopiperazina e brometo de N-acetiletilenopiperazínio tendo a fórmula seguinte (ver Figura 3). O rendimento foi de 95%. A razão de oxidação e alquilação, ambas calculadas como no Exemplo 1, foram de z = 0,65n e q= 0,35n, respectivamente.

Os quatro exemplos seguintes são ilustrativos da preparação dos compostos no âmbito do presente invento e compreendem os produtos de reacção da hialuronidase e de várias espécies de um transportador imunoestimulante, nomeadamente, sinpóis do tipo que é o objecto dos Exemplos 1 e 2, acima.

Exemplo 3 - Preparação do Conjugado Covalente de Hialuronidase (HYA) com Sinpol 1000-20/50

Realizou-se um procedimento de dois passos utilizando o método da azida, de forma a sintetizar o conjugado de HYA com sinpol 1000-20/50. (1) 0 primeiro passo do procedimento foi utilizado para produzir a hidrazida de Sinpol 1000-20/50.

Um copolímero de N-óxido de etilenopiperazina e brometo de N-[etilacetil]etilenopiperazínio (n= 1000, q= 0,20, z= 0,5) foi sintetizado de acordo com o método descrito no Exemplo 1 acima, com excepção de uma alteração no terceiro passo: utilizou-se para alquilação o éster etílico do ácido bromoacético em vez do ácido bromoacético. 500 mg do copolímero foram dissolvidos em 25 ml de metanol. Em seguida, adicionaram-se 0,2 ml de hidrato de hidrazina (0,2 mmol) e a reacção continuou durante 24 horas a 20°C. Depois de evaporar o metanol, o produto de reacção foi colhido e dissolvido em água. Em seguida, realizou-se a extracção com éter e o produto principal foi isolado por ultrafiltração em fibras ocas (Amicon) e liofilizado. 0 teor de grupos hidrazida no polímero modificado foi calculado utilizando um método convencional para a determinação de grupos amino primários por

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 16 ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico [S.L. Snyder e P.Z. Sobooinsky, "Improved 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid method for determination of amine", Anal. Biochem., 1975, v. 64, N1, pgs. 284-288], (2) No segundo passo, a reacção de condensação do HYA com a hidrazida de sinpol 1000-20/50 foi realizada de forma a produzir o conjugado de proteína-polímero cnvalente.

Para conseguir isto, dissolveram-se 100 mg da hidrazida de sinpol 1000-20/50 em 4 ml de HCI 1M. A solução foi agitada e arrefecida até 0-2°C e em simultâneo adicionou-se 1,15 ml de solução de nitrito de sódio a 3% (0,5 mmol). Em 15 minutos, o pH da solução de sinpol 1000-20/50 activada foi ajustado a 8,5 utilizando NaOH 2M. Em seguida, adicionou-se uma solução de 12 mg de HYA em 10 ml de tampão de fosfato 0,05M (pH 8,5, di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato dissódico) à solução acima mencionada de sinpol 1000-20/50 activado. A mistura reaccional foi agitada e arrefecida (2-4°C) e o pH foi mantido a 8,5 utilizando NaOH 2M durante um tempo reaccional de 12 horas.

Utilizou-se a filtração em gel em Biogel P-100 de forma a fraccionar os componentes da mistura reaccional e purificar o conjugado HYA-sinpol. A coluna de cromatografia (26 x 900 mm) foi cheia com Biogel P-100 disponível a partir de Biorad Inc. e equilibrada em tampão de fosfato 0,05M com NaCI 0,05M (pH 7,5). As fracções foram eluídas utilizando o mesmo tampão e a saída foi controlada por um fotómetro de UV de fluxo (226 nm). O conjugado que foi obtido foi sujeito a espectroscopia de fluorescência e electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para calcular o teor de proteína e para analisar o conjugado. Foi mostrado que 1 mg da preparação de conjugado continha 0,10 mg de HYA.

Exemplo 4 - Preparação do Conjugado Covalente de Hialuronidase (HYA) com Sinpol 200-35/65

Um copolímero de N-óxido de etilenopiperazina e brometo de N-acetiletilenopiperazínio (P.M. 25000, n= 200, q= 0,35, z= 0,65) foi sintetizado de acordo com o método descrito no Exemplo 2 acima. A conjugação da HYA com o copolímero foi realizada como descrito no Exemplo 3

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 17 acima. A condensação do polímero com HYA foi realizada utilizando a razão de polímero/proteína de 5:1, a pH = 8. A preparação final do conjugado continha 0,1 5 mg de HYA por 1 mg de conjugado.

Exemplo 5 - Conjugação da Hialuronidase (HYA) a Sinpol 1000-20/50 Utilizando o Método de Éteres Activados

Um copolímero de N-óxido de etilenopiperazina e brometo de N-acetiletilenopiperazínio (n= 1000, q= 0,2n, z= 0,5) foi sintetizado de acordo com o Exemplo 1 acima. Utilizou-se um procedimento químico de dois passos de forma a obter o conjugado covalente de HYA com o copolímero. (1) No primeiro passo, preparou-se um éter de succinimida do copolímero. Para este fim, suspenderam-se 100 mg do copolímero em 4 ml de dimetilformamida e adicionaram-se, com agitação, 77,2 mg (0,30 mmol) de diciclo-hexilcarbodiimida e 36 mg (0,30 mmol) de N-hidroxissuccinimida. A reacção durou 24 horas, tempo durante o qual a mistura reaccional foi agitada e arrefecida (2-4°C). A mistura reaccional foi lavada várias vezes com dioxano, éter etílico e acetona e seca numa caixa secadora de vácuo. A ausência de misturas de baixo peso molecular foi mostrada por cromatografia em camada fina em pratos de "Silufol" em n-butanol:água:ácido acético (4:1:1). Em seguida, o teor de grupos éter activados foi calculado pelo método padrão (T. Miron e M. Wilchek, Anal. Biochem., 1982, v. 126, N2, pgs. 433-435) (solução em água de NH3 0,1M a pH = 8,5, 259 nm, coeficiente de extinção = 9700 l/molxcm). O coeficiente de extinção molar "epsilon" foi calculado a partir da equação de Lambert-Beer: D= epsilon x C x L, na qual: D - valor de densidade óptica; C - concentração do composto na solução examinada; e L - percurso óptico. O teor de grupos éter activados era de 9x10'4 mole por 1 g do copolímero modificado. 86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ

18 (2) No segundo passo do procedimento, realizou-se o acoplamento covalente da HVA ao éter de succinimida do copolímero acima. Para este fim, dissolveram-se 100 mg do copolímero activado produzido no posso (1) acima em 10 ml de solução de tampão fosfato 0,05M (pH 6,0), arrefeceu-se e adicionou-se, com agitação contínua, uma solução de 15 mg de HYA dissolvidos em 12 ml de tampão fosfato 0,05M (pH 7,5). A reacção de condensação durou 18 horas, a 0°C. Em seguida, o conjugado foi isolado a partir da mistura reaccional por cromatografia em coluna na coluna Biogel P-100 (BioRad) e analisado como descrito no Exemplo 3 acima. A preparação final do conjugado proteína-polímero continha 0,10 mg de HYA por 1 mg de conjugado.

Exemplo 6 - Preparação do Conjugado Covalente de HYA e Sinpol com uma Relação de 2:1 no conjugado 0 sinpol 1000-20/50 foi sintetizado de acordo com o método descrito no Exemplo 1 acima. A conjugação da HYA com sinpol foi realizada como descrito no Exemplo 3 acima apenas com uma alteração no protocolo de procedimento: a relação inicial de sinpol para HYA na mistura reaccional foi de 2:1. A preparação final do conjugado continha 0,3 mg de HYA por 1 mg.

Exemplo 7 - Preparação de Vacina A vacina preparada consistia no conjugado HYA-sinpol e numa quantidade adicional de sinpol actuando ele próprio como um imunoadjuvante. O sinpol 1000-20/50 foi obtido como no Exemplo 1. A conjugação da HYA com o Sinpol foi realizada como no Exemplo 3 utilizando uma razão inicial de polímero/proteína de 1:1. Nomeadamente, conjugaram-se 5 mg de HYA utilizando o método da hidrazida, com 5 mg de Sinpol 1000-20/50. Em seguida, a solução em água de 40 mg de Sinpol 1000-20/50 foi adicionada ao conjugado purificado, misturada e liofilizada. O teor de HYA na preparação final de complexo íoi analisado como no Exemplo 3 e revelnu 0,1 mg de HYA por 1 mg da preparação.

Exemplo 8 - Complexo de Vacina Contendo o Derivado de Muramildipéptido como o Imunoadjuvante 86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 19 Ο complexo de vacina preparado era composto quer de conjugado HYA-Sinpol quer do derivado glicosaminilo de muramildipéptido, um imunoadjuvante conhecido. O sinpol 1000-20/50 foi sintetizado como no Exemplo 1. O conjugado covaifinte de HYA com o Sinpol foi obtido como no Exemplo 3 utilizando a razão de polímero/proteína de 1:1. Nomeadamente, conjugaram-se 5 mg de HYA com 5 mg de Sinpol 1000-20/50. Em seguida, adicionaram-se 10 mg de N-acetilglucosaminil-N'-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina (GMDP) e a mistura de complexo foi liofilizada.

Exemplo 9 - Complexo de Vacina Contendo Hidróxido de Alumínio como um Imunoadjuvante O complexo de vacina consistia em conjugado HYA-Sinpol e hidróxido de alumínio como um imunoadjuvante. O sinpol 1000-20/50 foi obtido como no Exemplo 1. Utilizou-se a razão de polímero/proteína de 1:1 durante a conjugação covalente de Sinpol com HYA utilizando o método descrito no Exemplo 3. A preparação de conjugado foi cuidadosamente misturada com uma suspensão de hidróxido de alumínio extemporânea, imediatamente antes da imunização dos animais.

Exemplo 10 - Avaliação Pré-clínica da Segurança de H-Polyvac H-Polyvac é uma vacina de polímero-antigénio contra as formas migratórias de helmintas. A vacina é um conjugado de hialuronidase, HYA, com o polímero imunoestimulante Sinpol. A proteína antigénica HYA é comum em muitas formas de helmintas larvares. 0 sinpol foi desenvolvido e cuidadosamente investigado pelos requerentes. O polímero mostrou ser seguro para o organismo humano numa dose de 0,25 mg/kg, podendo, por conseguinte, pode ser recomendado quer como um imunoestimulante isolado quer como um adjuvante e/ou transportador para vacinas. O Comité para fármacos Imunobiológicos deu permissão para a injecção de Sinpol como um composto de vacinas conjugadas. A dose recomendada para animais agrícolas

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 20 (ovelhas, vitelos) de H-Polyvac é de 4 mg/animal contendo 0,5 mg de antigénio HYA. A avaliação da segurança da H-Polyvac foi realizada de acordo com os requisitos do Comité Farmacológico do Ministério da Saúde da URSS (Directiva de 31.12.1983) assim como os requisitos do "The Veterinary Pharmacological Committee" (1974).

As experiências foram realizadas em várias espécies de animais: ratinhos (linhas CBA e C57BI/6), 220 animais; ratos Wistar, 180 animais; cobaias, 85 animais.

Os resultados demonstram que a H-Polyvac é uma substância praticamente não tóxica (classe 5 de perigo, de acordo com SOST 12.1.07-76) sendo a DL50 de 1,66 + 0,4 g/kg durante a infusão intraperitoneal. A toxicidade crónica foi testada durante injecções diárias multisseriadas de H-Polyvac, em doses de vacinação (0,4 mg/kg) e 10 vezes superiores (4 mg/kg).

De acordo com as análises hematológicas, fisiológicas, bioquímicas e imunológicas, não houve efeitos negativos da H-Polyvac nos pesos corporais, no comportamento, no sistema nervoso central, no sistema cardiovascular, na função hepática e renal ou no sangue dos animais. Não foram determinadas alterações patológicas em quaisquer órgãos internos e tecidos por análise patomorfológica. A ausência de actividade irritante no local de injecção, assim como a ausência de actividade alérgica, imunotóxica e mutagénica foram também estabelecidas. Não foi detectada qualquer actividade carcinogénica, durante a administração prolongada de H-polyvac (8 meses) e observação dos animais durante 2,2 anos.

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 21

Por conseguinte, os resultados do estudo de avaliação da segurança da H-Polyvac demonstram a segurança da H-Polyvac assim como uma ampla área de razão terapêutica (superior a 400). Uma dose terapêutica de 4 mg/kg de H-Polyvac pode ser considerada como absolutamente segura.

Exemplo 11 - Ensaios Experimentais e em Pastagens

Para avaliar a eficácia da vacina, concretização do presente invento, realizou-se uma série de ensaios experimentais e em pastagens na anterior URSS. O termo "H-Polyvac" como utilizado nesta secção de Exemplos refere-se à composição de vacina do presente invento.

Numa primeira experiência, que envolveu 24 cães de três meses de idade, investigou-se uma gama entre 0,5 mg e 50 mg de H-Polyvac. Três grupos separados contendo 6 cães cada foram intramuscularmente injectados duas vezes com 0,5 mg, 5 mg ou 50 mg de H-Polyvac. A imunização de reforço foi feita 21 dias após a primeira. Os 6 cães restantes de um grupo placebo receberam injecções de solução salina de NaCI a 0,9%. Duas semanas após a imunização de reforço cada um dos 24 cães foi oralmente infectado com 16000 "protoscolices" de E. granulosus. Um mês mais tarde todos os cães foram mortos e dissecados, obtendo-se o número de helmintas de E. granulosus parasitas dos intestinos.

Os resultados sugerem claramente que a imunização preliminar dos cães aumenta significativamente a sua resistência a uma invasão por E. granulosus. O número de equinococos encontrados nos intestinos de cães imunizados por H-Polyvac, foi 15-120 vezes inferior ao do grupo de controlo com placebo. Além disso, a intensidade de protecção dependia obviamente da dose de H-Polyvac. A dose de aproximadamente 5 mg de H-Polyvac parece ser óptima para imunização de cães por injecções duas vezes repetidas. A Tabela 1 apresenta os resultados de uma segunda experiência em cães. A Tabela 2 apresenta os resultados de um teste que utiliza leitões com um mês de idade. A dose de inoculação foi administrada por injecção dupla. A injecção de reforço foi feita 7 dias (grupo I), 14 dias (grupo II) ou 21 dias (grupo III) após a injecção de inoculação de H-Polyvac. 20 dias após a imunização de reforço, todos os animais foram artificialmente desafiados por E. granulosus utilizando doses de 10000 oncosferas per os. Sete meses mais tarde, os porcos foram mortos tendo-se contado a forma em vesícula dos equinococos no fígado.

As Tabelas 3, 4 e 5 apresentam resultados das experiências com ovelhas. Na Tabela 3, os cordeiros foram imunizados utilizando injecções intramusculares, duplas, com um intervalo de 21 dias entre as injecções de inoculação e as de reforço. Duas semanas após a imunização secundária, todos os cordeiros foram infectados com E. granulosus por administração oral de 10000 oncosferas. Quatrocentos dias mais tarde, os ovelhas de todos os três grupos foram mortos, dissecados tendo-se contado a forma em vesícula dos E. granulosus nos seus fígados e nos pulmões. A Tabela 4 apresenta um teste similar, que utiliza quer a injecção intramuscular (i/m) quer a subcutânea (s/c).

Para os resultados descritos na Tabela 5, os animais foram mortos e dissecados no 425° dia após o desafio, tendo-se contado o número de helmintas no fígado e pulmões. A Tabela 6 apresenta os resultados utilizando H-Polyvac em dictiocaulase artificialmente induzida. Na primeira experiência, utilizaram-se 12 cordeiros de 3-4 meses de idade: quatro deles foram intramuscularmente injectados duas vezes com 5 mg de H-Polyvac (lote No. 1), enquanto que os outros 4 cordeiros receberam a mesma dose do lote No. 2 de H-Polyvac. A imunização de reforço foi feita 21 dias após a injecção de inoculação.

Duas semanas após a imunização de reforço, os animais foram artificialmente desafiados per os utilizando doses de 500 larvas de Dictyocau/ae. Dois meses mais tarde, os animais foram mortos tendo-se contado o número de D. filaria por organismo.

As Tabelas 7 e 8 apresentam os resultados de experiências nas quais os cordeiros foram imunizados e, duas semanas após a injecção de reforço, artificialmente invadidos por F. hepatica. Para este fim, utilizou-se a

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 23 administração oral de 50 ou 100 larvas invasivas, denominadas metacercárias. Cinco a sete meses mais tarde, os animais foram mortos e dissecados, tendo-se contado as fascíolas nos seus fígados.

Os ensaios iniciais sob condições de pastagem foram realizados na quinta de ovelhas do estado da URSS "Koyadinski" do Distrito de Karaganda (Cazaquistão Central) e na quinta colectiva de ovelhas "Leninsky Poot" da região Chadyr-Langoon (Moldávia). As duas quintas não são favoráveis quanto à equinococose. De facto, mais de 60% dos ovelhas destas quintas estavam normalmente invadidos por equinococos.

De acordo com os protocolos apresentados nas Tabelas 9 e 10 utilizou-se um total de 75 cordeiros de 2-3 meses de idade na quinta "Koyadinsky" assim como 135 cordeiros juntamente com 11 cães pastor na quinta "Leninsky Poot". Os animais foram imunizados duas vezes com 5 ou 10 mg do Lote No. 1 ou Lote No. 2 de H-Polyvac. Foram mantidos separadamente do rebanho ao qual pertenciam durante o período de imunização com H-Polyvac e duas semanas após a imunização de reforço. Em seguida, juntaram-se aos seus rebanhos e viveram sob condições normais de pastagem, estando em contacto com os animais invadidos por equinococos. Um ano mais tarde na quinta "Koyadinsky" e 8 meses mais tarde na quinta "Leninsky Poot", os ovelhas foram mortos tendo-se contado o número de equinococos nos seus fígados e pulmões. Como se pode observar nas Tabelas 9 e 10, os ovelhas não imunizados de controlo estavam altamente invadidos por equinococos. Por contrário, aqueles que tinham sido imunizados utilizando H-Polyvac eram significativamente mais resistentes à invasão. Sob a protecção da H-Polyvac a percentagem de animais invadidos diminuiu de 78% para 26% e o número médio de equinococos por animal invadido diminuiu de 25 para 2 na "Koyadinsky" ou de 4,8 para 1,8 na "Leninsky Poot". Não foram notadas diferenças significativas entre os efeitos protectores do Lote No. 1 e Lote No. 2 de H-Polyvac.

Adicionalmente aos equinococos observou-se a invasão pelos cestodos relativos de outras espécies, nomeadamente, Coenurus cerebralis e Cystycercus tenuicol/is em animais mortos na quinta "Leninsky Poot". Os dados apresentados na Tabela 10 mostram que a imunização com H-Polyvac elevou substancialmente a resistência dos ovelhas não só à invasão por equinococos, mas também à invasão por C. cerebralis e C. tenuicollis.

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 24 11 Cães pastor foram mantidos em pastagens juntamente com 135 ovelhas na quinta "Leninsky Poot". Eram cães adultos e, uma vez que já estavam invadidos por cestodos, foram tratados com um anti-helmíntico denominado "Droncit" para se livrarem dos seus helmintas antes da sua imunização com H-Polyvac. Subsequentemente, foram injectados duas vezes com 10 mg de H-Polyvac (i/m 21 dias de intervalo) e viveram juntamente com os rebanhos que controlavam, habitualmente. Todos os meses, os excrementos de todos os 11 cães foram testados para se avaliar se os cães estavam ou não novamente invadidos por cestodos. Finalmente, 8 meses após as imunizações com H-Polyvac os cães receberam anti-helmíntico para verificar a invasão por cestodos. Durante todo período de observação completo não se encontrou qualquer cestodo nos cães que tinham recebido H-Polyvac.

Adicionalmente, foram realizados ensaios em pastagens na quinta colectiva de ovelhas "Druzhba" (Região Bolshenarymsky, Cazaquistão Oriental) e na quinta de ovelhas "Maximoka" (Região Anneny Noy, Moldávia) ambas não favoráveis no que se refere à dictiocaulase. Normalmente, 90-100% dos ovelhas das quintas "Druzhba" e "Maximoka" estão invadidos por Dictyocaulae. No total utilizaram-se nos ensaios, 220 e 68 cordeiros de 1,5-2 meses de idade, em "Druzhba" e "Maximoka", respectivamente. Os cordeiros foram imunizados por H-Polyvac e, depois, duas semanas após a imunização de reforço voltaram para as pastagens sendo mantidos com os rebanhos aos quais pertenciam. Na quinta "Druzhba" os ovelhas foram mortos 7 meses após a imunização, sendo verificado o número de Dictyocaulae nos seus pulmões (Tabela 11). Os cordeiros envolvidos nos ensaios da quinta "Maximoka" não foram mortos, mas 5 meses após a imunização com H-Polyvac verificou-se a extensão da invasão por D. filaria, por análise coprológica de larvas Dictyocaulae nos seus excrementos (Tabela 12).

Os ensaios foram também realizados na quinta de ovelhas "Poot Rybaka" (Dagestão, Federação Russa) e na quinta de ovelhas ligada à Estação Stavropol para Investigação Veterinária (Distrito Stavropol, Federação Russa). No total, foram envolvidos nos ensaios, 243 e 50 cordeiros, das quintas no Dagestão e Stavropol, respectivamente. Além disso, foram utilizados três lotes diferentes de H-Polyvac, nomeadamente os Lotes Nos. IG-4, IG-8 e IG-16 em três

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 25 rebanhos separados da quinta de ovelhas no Dagestão. Utilizaram-se dois lotes de H-Polyvac (No. 1 e No. 2) no mesmo rebanho da quinta em Stavropol.

Os cordeiros foram imunizados com H-Polyvac e duas semanas mais tarde foram enviados para junto dos seus rebanhos para viver sob as condições normais de pastagem. Após 6, 7 ou 10 meses, os cordeiros foram mortos sendo calculado o número de fascíolos nos seus fígados. Os dados, apresentados nas Tabelas 13 e 14, mostram que a imunização com H-Polyvac diminui significativamente a susceptibilidade dos cordeiros à invasão por fascíolos.

Todos os lotes de H-Polyvac utilizados eram eficazes na profilaxia da fasciolíase em cordeiros. Foi útil saber que a combinação de 5 mg de H-Polyvac com 20 mg de Sinpol, como um imunoadjuvante adicional, apresenta um efeito protector ligeiramente superior ao de 5 mg de H-Polyvac sozinha. Posteriormente, esta observação foi confirmada e utilizada durante ensaios em larga escala com H-Polyvac (ver abaixo).

Assim, embora as características da infecção por desafio artificial agudo que utiliza uma grande quantidade de helmintas invasores (E. granulosus, D. filaria, F. hepatica) sejam significativamente diferentes comparativamente àquelas do desafio espontâneo sob condições normais de pastagem, ambos os ensaios, experimental e em pastagens, com H-Polyvac mostraram a mesma eficácia elevada da preparação na profilaxia das helmintíases acima mencionadas.

Após revisão dos dados dos ensaios experimentais e em pastagens acima, a Direcção Principal do Estado para Medicamentos Veterinários e a Inspecção Veterinária do Estado da anterior URSS decidiram realizar ensaios em larga escala com H-Polyvac sob condições de pastagem (ordem No. 46 de 11 de Maio de 1990). O projecto de ensaio de controlo estatal procurava pelo menos dois objectivoo: em primeiro lugar a verificação da eficácia da H-Polyvac em quintas de animais situadas em regiões do país geográfica e climaticamente diferentes, e em segundo lugar, uma estimativa do efeito protector da H-Polyvac utilizando grandes populações de animais. 86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 26

A lista de quintas de ovelhas, não favoráveis quanto à equinococose, dictiocaulase ou fasciolíase, incluíram quintas localizadas na Ucrânia (Regiões Kharkov e Soomy, Distrito da Crimeia), Moldávia (Região Anneny Noy e Região Garakly), Georgia, Uzbequistão (Região Samarkand), Cazaquistão Central, Sul e Oriental, partes sul da Federação Russa (Distritos Dagestão e Stavropol) e partes centrais da Federação Russa (Nyzhny Novgorod, Voronezh, Belgorod e Belaya Tserknv). A Tabela 15 sumariza a informação acerca das localidades e número de animais utilizados durante os ensaios estatais. Os dados de todos os ensaios confirmaram completamente os resultados iniciais apresentados anteriormente. Em resumo, é adequado resumir os resultados obtidos utilizando o coeficiente de eficácia (CE), que é: CE= C - V x 100%

C em que C é o número médio de helmintas por organismo no grupo de controlo e V é o mesmo parâmetro no grupo de animais vacinados que receberam H-Polyvac.

Utilizando o coeficiente de eficácia os dados mostram que a eficácia da H-Polyvac alcança entre 82% e 90% na profilaxia da dictiocaulase, e aproximadamente 90% na profilaxia da fasciolíase e finalmente quase 100% na prevenção da equinococose. Como exemplos da forma pela qual os ensaios foram conduzidos, segue-se uma breve discussão dos dados dos ensaios que envolveram milhares de ovelhas, e que foram realizados no Cazaquistão Oriental. É uma opinião geralmente aceite entre os peritos em epidemiologia e epizootiologia que, quanto maior for a população investigada, mais precisos são os dados obtidos relativamente à epidemiologia de uma infecção. Isto é também verdade para se estimar a eficácia dc uma nova vacina e, por conseguinte, os dados dos ensaios com H-Polyvac realizados em milhares de ovelhas são de grande valor. Alguns exemplos são dados abaixo.

As propriedades protectoras da H-Polyvac foram testadas na quinta colectiva "Druzhba" (Cazaquistão Oriental) em 11000 cordeiros em pastagens. 86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 27 A vacina foi administrada duas vezes em doses de 5 mg por animal, a cordeiros de 20-30 dias de idade, com um intervalo de 21 dias, 45 dias antes dos cordeiros serem colocados nas pastagens. Um ano maio tarde, quando 1127 cordeiros foram mortos, encontraram-se em 6 ovelhas 3-4 cenuros por animal, ao passo que não foram encontrados quaisquer Dictyocaulae, fascíolos ou equinococos. A percentagem de animais invadidos entre os ovelhas não vacinados variou entre 80% e 100%, em diferentes rebanhos da quinta.

No ano subsequente, a H-Polyvac foi testada na mesma quinta colectiva "Druzhba" em 11700 cordeiros em pastagens. Nesta altura, a vacina foi injectada duas vezes numa dose de 5 mg mais 20 mg de Sinpol por animal, em cordeiros de 20-30 dias de idade, com um intervalo de 21 dias, 45 dias antes de serem colocados nas pastagens. Sete meses mais tarde, após a morte de 5000 cordeiros, encontraram-se 1-3 Dictyocaulae em 25 cordeiros, não se tendo encontrado quaisquer fascíolos ou equinococos. A extensão de invasão nos rebanhos de controlo (não vacinados) foi de 90-100%.

Os dois exemplos de ensaios em larga escala com H-Polyvac demonstram claramente a sua muito alta eficácia sob condições reais de animais em quinta. TABELA 1

GRUP 0 NO. ANIMAIS POR GRUPO PROGRAMA DE IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC HELMINTAS POR ANIMAL 1 MÊS APÓS DESAFIO COM 5000 PROTOSCOLICES NÚMERO IDADE (Meses) INOCULAÇÃO INTERVALO (dias) REFORÇO I 3 CÃES 3 4 mg 21 4 mg 8; 16; 12 (i/m) (i/m) II 3 CÃES 3 8 mg 21 8 mg 2; 0; 1 (i/m) (i/m) III 3 CÃES 3 4 mg 21 8 mg 3; 2; 2 (i/m) (i/m) IV 3 CÃES 3 SOLUÇÃO 21 SOLUÇÃO 2475; 2500; 1573 SALINA SAUNA

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 28 TABELA 2 GRUPO NO. NÚMERO DE ANIMAIS PROGRAMA DE IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC QUISTOS HIDÁTIDOS DE HELMINTAS NO FÍGADO INOCULAÇÃO INTERVALO (dias) REFORÇO EI’ II “ * 1 10 LEITÕES 5 mg 7 5 mg 30% 3; 3; 4 II 10 LEITÕES 5 mg 14 5 mg 10% 1 III 10 LEITÕES 5 mg 21 5 mg 20% 1; 2 IV 10 LEITÕES SOLUÇÃO SALINA 21 SOLUÇÃO SALINA 100% 10; 10; 9; 12; 8; 12; 12; 11; 8; 9 *) EI - EXTENSÃO DA INVASÃO (PERCENTAGEM DE ANIMAIS INVADIDOS); **) II - INTENSIDADE DE INVASÃO (NÚMERO DE HELMINTAS POR ANIMAL). TABELA 3 CORDEIROS POR GRUPO IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC HELMINTAS NO FÍGADO E PULMÕES, 400 DIAS APÓS DESAFIO NÚMERO IDADE (meses) INOCULAÇÃO INTERVALO (dias) REFORÇO NÚMERO DE EQUINOCOCOS POR ANIMAL TAMANHO APROX. DOS QUISTOS HIDÁTIDOS (mm) 4 3-4 5 mg i/m 21 5 mg i/m 3; 6; 4; 11 (média = 6) 1-2-0,5 4 3-4 10 mg i/m 21 10 mg i/m 9; 13, 8; 12 (média = 88) 1-2-0,5 4 3-4 SOLUÇÃO SALINA 21 SOLUÇÃO SALINA 52; 78; 77; 146 (média = 6) 4-9

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 29 TABELA 4 CORDEIROS POR GRUPO IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC HELMINTAS NO FÍGADO E PULMÕES NÚMERO IDADE (meses) DOSE MODO DE INJECÇÃO INTERVALO (dias) EQUINOCOCOS POR ANIMAL (média + DP) TAMANHO DOS QUISTOS HIDÁTIDOS (mm) 0 3 5 mg x 2 i/m 21 6 + 4 1-3 8 3 5 mg x 2 s/c 21 5 + 4 1-4 4 3 SOLUÇÃO SAUNA s/c 21 63 + 23 5-9 TABELA 5 COMPARAÇÃO DE DOIS LOTES DIFERENTES DE H-POLYVAC RELATIVAMENTE À SUA EFICÁCIA NA PROTECÇÃO DE OVELHAS CONTRA UM DESAFIO EXPERIMENTAL COM 10000 ONCOSFERAS DE E. granulosus. GRUPO NO. OVELHAS POR GRUPO IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC VESÍCULAS DE HELMINTAS NO FÍGADO E PULMÕES 425 DIAS APÓS 0 DESAFIO COM E. granulosus NÚMERO IDADE (MESES) LOTE DOSE INTERVALO (dias) I 8 4,5 LOTE NO. 1 5 mg x 2 i/m 21 1 ;0;3;8; 0;0;9;4 (média = 3) 2-3 II 8 4,5 LOTE NO. 2 5 mg x 2 i/m 21 2;2;3;2; 3;2;3;3 (média = 65) 2-3 III 4 4,5 SOLUÇÃO SALINA i/m 21 49;64;81 ;65 (média = 65) 5-7 TABELA 6 CORDEIROS POR GRUPO IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC HELMINTAS NOS PULMÕES 2 MESES APÓS DESAFIO NÚMERO IDADE (meses ) LOTE NO. DOSE (i/m) DESAFIO ARTIFICIAL POR D. filaria (per os) NÚMERO DE HELMINTAS POR ANIMAL (média + DP) PERCENTAGEM DE ANIMAIS INVADIDOS POR Dictyocauiae 4 3-4 LOTE 1 0 mg x 2 500 larvac 4 + 2 85% 4 3-4 LOTE 2 5 mg x 2 500 larvas 5 + 1 85% 4 3-4 SOLUÇÃO SAUNA 2 ml 500 larvas 67 + 9 100%

86 9/3 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 30 TABELA 7 CORDCinOS POR GRUPO IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC DESAFIO ARTIFICIAL FASCÍOLOS POR FÍGADO 5 MESES NÚMERO IDADE (meses) INOCULAÇÃO INTERVALO (dias) REFORÇO POR F. hepatica APÓS 0 DESAFIO (média + DP) 4 3 3 mg 21 3 mg 100 metacercárias 12+4 4 3 5 mg 21 5 mg 100 metacercárias 10 + 3 4 3 SOLUÇÃO SAUNA 21 SOLUÇÃO SALINA 100 metacercárias 20 + 8 TABELA 8 CORDEIROS POR GRUPO IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC DESAFIO ARTIFICIAL FASCÍOLOS POR FÍGADO 7 MESES NÚMERO IDADE (meses) INOCULAÇÃO (i/m) INTERVALO (dias) REFORÇO (i/m) POR F. hepatica APÓS 0 DESAFIO 10 3-4 5 mg 21 5 mg 50 metacercárias 1-3 10 3-4 10 mg 21 10 mg 50 metacercárias 1-2 10 3-4 SOLUÇÃO SAUNA 21 SOLUÇÃO SALINA 50 metacercárias 28-37 TABELA 9 ENSAIOS EM PASTAGENS COM H-POLYVAC NA QUINTA DE OVELHAS "KOYADINSKY" CORDEIROS POR GRUPO IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC HELMINTAS NO FÍGADO~È PULMÕES 12 MESES APÓS A IMUNIZAÇÃO NÚME RO IDADE (meses) LOTE INOCU LAÇÃO (i/m) INTERVALO (dias) REFORÇO (i/m) NÚMERO DE EQUINOCOCOS POR ANIMAL (média + DP) TAMANHO APROX. (mm) 25 2-3 NO. 1 5 mg 21 5 mg 3 + 2 3 + 4 25 2-3 NO. 2 5 mg 21 5 mg 2+1 2,5-3 25 2-3 SOLUÇÃO SAUNA 21 SOLUÇÃO SAUNA 25+10 6-9

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 31 TABELA 10 ENSAIOS EM PASTAGENS COM H-POLYVAC ΝΛ QUINTA DE OVELHAS "I ENINSKY POOT" CORDEIROS POR GRUPO IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC (i/m) CESTODOS NOS ÓRGÃOS INTERNOS 8 MESES APÓS A IMUNIZAÇÃO NÚME RO IDADE (MESES) E. granulosus C. tenuicollis C. cerebralis EI* II** EI II EI II 45 2.5-3 10 mg x 2 26% 1,8 13% 2,5 0 0 45 2.5-3 5 mg x 2 40% 3,1 46% 1,0 7% 1,0 45 2,5-3 SOLUÇÃO SAUNA 78% 4,8 89% 4,0 11% 1,0 *l EI - EXTENSÃO DE INVASÃO; **) II - INTENSIDADE DE INVASÃO (VER TABELA 3) TABELA 11 ENSAIOS EM PASTAGENS COM H-POLYVAC NA QUINTA DE OVELHAS "DRUZHBA" CORDEIROS POR GRUPO IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC HELMINTAS NOS PULMÕES 7 MESES APÓS A IMUNIZAÇÃO NÚMERO IDADE (meses) INOCULAÇÃO (i/m) INTERVALO (dias) REFORÇO (i/m) D. filaria POR ANIMAL (média + DP) PERCENTAGEM DE ANIMAIS INVADIDOS 100 1,5-2 5 mg (lote 1) 21 5 mg (lote 1) 2+1 12% 100 1,5-2 5 mg (lote 1) 21 5 mg (lote 1) 2 + 1 13% 20 1,5-2 SOLUÇÃO SAUNA 21 SOLUÇÃO SALINA 13 + 3 100% TABELA 12 ENSAIOS EM PASTAGENS COM H-POLYVAC NA QUINTA DE OVELHAS "MAXIMOKA" CORDEIROS POR GRUPO IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC PERÍODO EM PASTAGENS (MESES) PERCENTAGEM DE ANIMAIS INVADIDOS POR D. filaria* NÚMERO IDADE (MESES) INOCULAÇÃO (s/c) INTERVALO (dias) REFORÇO (s/c) 28 1,5-2 5 mg 21 5 mg 6 25% 25 1,5-2 5 mg 21 10 mg 6 16% 15 1,5-2 SOLUÇÃO SAUNA 21 SOLUÇÃO SALINA 6 100%

) COPROLOGIA

86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 32 TABELA 13 ENSAIOS EM PASTAGENS COM H-POLYVAC NA QUINTA “POOT RYBAKA"

REBANHO CORDEIROS POR GRUPO IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC PERÍODO EM PASTAGENS (MESES) F. hepatica POR FÍGADO (média + DP) NÚMERO IDADE (MESE SI LOTE DOSE (i/m) A ΛΟ 2-3 IG-4 5 ma x 2 7 2+1 40 2-3 (IG-4 + P0) (5 mg+ 20 mg) 7 0 20 2-3 SOLUÇÃO x 2 7 13 + 4 SAUNA B 13 3 IG-8 5 mg x 2 7 4 + 3 10 3 SOLUÇÃO 7 91+39 SALINA C 100 2-2.5 IG-8 5 mg x 2 10 8 + 3 20 2-2.5 SOLUÇÃO 10 24+14 SAUNA TABELA 14 ENSAIOS EM PASTAGENS COM H-POLYVAC NA QUINTA DE OVELHAS EM "STAVROPOL" CORDEIROS POR GRUPO IMUNIZAÇÃO COM H-POLYVAC PERÍODO EM PASTAGEM (MESES) NÚMERO DE F. hepatica POR FÍGADO NÚME RO IDADE (MESE S) LOTE INOCULAÇÃO INTERVALO (dias) REFORÇO 20 2-3 NO. 1 5 mg, i/m 21 5 mg, i/m 6 0 20 2-3 NO. 2 5 mg, i/m 21 5 mg, i/m 6 0 10 2-3 SOLUÇÃO SALINA 21 SOLUÇÃO SAUNA 6 7-32 33 86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ TABELA 15

DISTRITO ANIMAIS VACINADOS COM H-POLYVAC HELMINTÍASES NORMAIS NA REGIÃO DISTRITO DO CAZAQUISTÃO ORIENTAL 580 CORDEIROS DICTIOCAULASE REG. SAMARKAND, UZBEQUISTÃO 600 CORDEIROS EQUINOCOCOSE REG. SAMARKAND, UZBEQUISTÃO 80 LEITÕES EQUINOCOCOSE MOLDÁVIA 1000 CORDEIROS EQUINOCOCOSE REG. BELGOROD, FED. RUSS. CENTRAL 70 CORDEIROS FASCIOLÍASE REG. STAVROPOL, FED. RUSS. SUL 500 CORDEIROS FASCIOLÍASE DAGESTÃO, FED. RUSS. SUL 120 CORDEIROS FASCIOLÍASE REG. NYZHNY NOVGOROD, FED. RUSS. CENTRAL 50 CORDEIROS FASCIOLÍASE REG. CRIMEA, UCRÂNIA 1000 CORDEIROS DICTIOCAULASE GEORGIA 50 CORDEIROS FASCIOLÍASE REG. KARAGANDA, CAZAQUISTÃO CENTRAL 75 CORDEIROS EQUINOCOCOSE REG. TSELINOGRAD, CAZAQUISTÃO CENTRAL 30 CORDEIROS DICTIOCAULASE REG. DZHAMBUL, CAZAQUISTÃO SUL 500 CORDEIROS EQUINOCOCOSE REG. KHARKOV, UCRÂNIA 50 CORDEIROS REG. SOOMY, UCRÂNIA 100 CORDEIROS DICTIOCAULASE CAZAQUISTÃO ORIENTAL 7500 CORDEIROS EQUINOCOCOSE CAZAQUISTÃO ORIENTAL 11000 CORDEIROS EQUINOCOCOSE E 200 CÃES EQUINOCOCOSE CAZAQUISTÃO ORIENTAL 1500 CORDEIROS DICTIOCAULASE CAZAQUISTÃO ORIENTAL 11700 CORDEIROS EQUINOCOCOSE E 68 CÃES EQUINOCOCOSE

Lisboa,

Por PETROVAX, INC. - O AGENTE OFICIAL -

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRÀ

Ag. Of. Pr. Ind.

Rua das Flores, 74--4.° 1200-195 LISBOA

Claims (11)

1. ΟΟ 3/0 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES: 1. Composto que compreende hialurunidase covalentemcnte acoplada a um transportador imunoestimulante.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o transportador é um copolímero de N-óxido de etilenopiperazina e brometo de N-etilacetiletilenopiperazínio.
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a hialuronidase é seleccionada a partir de hialuronoglucosaminidases, hialuronoglucuronidases e glucuronato-liases.
4. 4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a hialuronidase tem um peso molecular de cerca de 63 kDa.
5. 5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para protecção de um vertebrado contra a infecção por um helminta.
6. 6. Composição de vacina que compreende o composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
7. 7. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, que inclui um adjuvante adicional.
8. 8. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, em que o adjuvante adicional é hidróxido de alumínio.
9. 9. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, em que o adjuvante adicional é muramildipéptido modificado.
10. 10. Utilização do composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para o fabrico de um medicamento para protecção de um vertebrado contra a infecção por um helminta. 86 973 ΕΡ Ο 789 586/ΡΤ 2/2
11. 11. Utilização do composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para o fabrico de um medicamento para eliciar uma resposta imunitária num vertebrado a um helminta. Lisboa, Por PETROVAX, INC. - 0 AGENTE OFICIAL -