附图说明
以下图片形成本说明书的部分,并且包括以下图片以进一步证实本发明的某些方面。参考这些图片中的一个或多个结合本文出现的具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。
图1A-1E:通过凝胶迁移和蛋白印迹实验证实的不同制品中缀合物的存在。图1A:凝胶迁移实验,考马斯蓝,以及图1B:凝胶迁移实验,银染,证实从150kDa的纯化的TT单体(泳道2)至缀合物中超过250kDa的厚条带(泳道3-4)的相当大的迁移,由共价添加随机数量的115kDa CPS链至蛋白所致。图1C:利用抗CPS mAb的蛋白印迹。在所有凝胶中包括解聚的CPS作为对照(泳道5)。图1D:利用抗TT mAb对照染色显示在缀合物中保留TT的抗原性。应当注意2:1和1:1缀合物制品之间信号强度的差异(图1A-D,泳道3-4)可能与10μg装载样品/泳道内蛋白含量的总量(分别为4.5μg vs.6.3μg)有关。图1E:通过超声辐照解聚猪链球菌2型荚膜多糖(CPS)。在不同时间点采集CPS样品并通过大小排阻色谱加上多角度光散射(SEC-MALS)分析以确定分子量(Mw)。60min之后,Mw进入平台期,如虚线所示。
图2:HPLC分析证实缀合物(>250kDa)的洗脱,游离CPS(100kDa)和游离TT(150kDa)的洗脱。
图3A-3C:用25μg的CpG(FIG 3A);(FIG 3B)或Gold(FIG3C)佐剂化的2:1缀合物疫苗免疫的小鼠的总抗体应答动力学。将小鼠(n=10)在第0天免疫并在第21天加强。将ELISA板用天然荚膜多糖(CPS)或破伤风类毒素(TT)包被并用1:100或1:20,000稀释的血液样品温育以分别测量抗CPS和抗TT抗体。示出对象小鼠的总(IgG+IgM)抗体水平,水平条表示O.D.450nm值的平均±SEM。在第21天的箭头表示加强。为了简化图,各安慰剂组的动力学在图3D-3F中示出。图3D-3F:仅用佐剂免疫的小鼠未表现出任何非特异性抗体应答。将安慰剂组用CpG(FIG 3D)、(FIG 3E)或Gold(FIG3F)佐剂化的PBS注射。将小鼠(n=5)在第0天注射并在第21天加强。将ELISA板用天然荚膜多糖(CPS)或破伤风类毒素(TT)包被并用1:100或1:20,000稀释的血液样品温育以分别测量抗CPS和抗TT抗体。示出对象小鼠的总(IgG+IgM)抗体水平动力学,水平条表示O.D.450nm值的平均±SEM。在第21天的箭头表示加强。
图4A-4H:分别用1μg、2.5μg、5.0μg或25μg的游离解聚荚膜多糖(CPS)(图4A-4D);或者分别用1μg、2.5μg、5.0μg或25μg的Gold佐剂化的2:1缀合物混合物(图4E-4H)免疫的小鼠的总抗体水平上的剂量-应答效应。将小鼠组(n=8)在第0天注射并在第21天加强。将ELISA板用天然CPS包被并用1:100稀释的血液样品温育。示出对象小鼠的总(IgG+IgM)抗CPS抗体水平,水平条表示O.D.450nm值的平均±SEM。在第21天的箭头表示加强。
图5A-5F:用Gold佐剂化的缀合物疫苗免疫的小鼠中不同抗CPS抗体同种型的滴度。图5A.小鼠Ig[G+M];图5B.小鼠IgG1;图5C.小鼠IgG2c;图5D.小鼠IgM;图5E.小鼠IgG2b;图5F.小鼠IgG23。分别利用特异性HRP缀合的抗小鼠Ig[G+M]、IgM、IgG1、IgG2b、IgG2c或IgG3抗体检测同种型。示出对象小鼠的滴度,水平条表示平均±SEM。#表示与安慰剂组显著不同的滴度(P<0.05),而其他组之间的差异表示为:**,P<0.01和***,P<0.001。小鼠组如下:安慰剂(n=5),2:1缀合物制剂(n=18,来自以前2次用25μg免疫的动物),1:1缀合物制剂(n=10),2:1缀合物HPLC-级分(n=10),2CPS:1TT未缀合的对照混合物(n=10)。将所有小鼠在第0天用Gold中的25μg抗原免疫,在第21天加强并在第42天采集血清。为了比较目的还包括来自6只小鼠的超免疫小鼠血清池。为了滴定,将ELISA板用天然CPS包被并用血清的2倍系列稀释液温育。
图6A-6C:图6A:在第42天猪链球菌2型菌株S735的调理吞噬杀死-来自用Gold佐剂化的不同CPS缀合物疫苗免疫的小鼠的血清。小鼠组如下:安慰剂(n=5),2:1缀合物制剂(n=10),2:1缀合物HPLC-级分(n=10),2CPS:1TT未缀合的对照混合物(n=10)。结果表示为对象小鼠的细菌杀死%,水平条表示平均±SEM。#表示与安慰剂组显著不同的值(P<0.01),而其他组之间的差异表示为:***,P<0.001。图6B:用中的2:1缀合物疫苗免疫的小鼠中诱导的抗体的分型。将小鼠(n=10)用25μg的佐剂化的2:1缀合物制剂在第0天免疫并在第21天加强。将安慰剂小鼠(n=5)用佐剂化的PBS相似地注射。在第42天收集血清。图6C:在第42天猪链球菌2型菌株S735的调理吞噬杀死-来自用25μg的佐剂化的2:1缀合物制剂免疫的小鼠的血清。结果表示为对象小鼠的细菌杀死%,水平条表示平均±SEM。
图7A-7B:猪中的免疫原性和保护研究。将动物按窝分隔,然后随机分配至4组之一:第1组,n=14;第2组,n=10,第3组,n=15;以及第4组,n=5。将第1-4组混合直至在研究第35天去除第4组(严格对照)。在研究第0、21和34天收集血液样品用于确定血清抗体水平。将小猪用2ml的佐剂化的相应疫苗或安慰剂以3-周间隔肌肉内注射两次(研究第0和21天):将第1组用佐剂化的猪链球菌2型菌苗免疫接种,将第2组用佐剂化的2:1缀合物疫苗注射,第3组给予2ml佐剂化的PBS。图7A:免疫猪的血清抗体应答动力学。将ELISA板用天然荚膜多糖包被,用血清的2倍系列稀释液温育1h,并且利用特异性HRP缀合的抗猪Ig[G+M]或IgG1抗体检测同种型。示出对象猪的抗体滴度,水平条表示平均±SEM。在第21天的箭头表示加强。如通过单因素ANOVA确定的,**,P<0.01和***,P<0.001。图7B:保护研究。在第36天,将第1-3天用3x 109CFU/剂量的猪链球菌2型分离株ATCC 700794腹腔内攻击。攻击之后,在7天的时间中每天监测猪的临床表现的存在。注意:在第21天,由于血清收集之后的并发症,将来自菌苗组的一只动物安乐死,其在第34天剩下(n=14)并用于攻击。与安慰剂(攻击对照)组相比,菌苗和2:1缀合物免疫接种组均为**,P<0.01。
发明详述
本发明提供一种免疫原性组合物,其包含:荚膜多糖-蛋白缀合物,连同生理上可接受的媒介物,其中所述缀合物包含缀合至载体蛋白的来自猪链球菌的荚膜多糖,其中所述荚膜多糖制备自猪链球菌血清型1、2、7或9,或者任何其他血清型,或者它们的组合。
在另一实施方案中,所述免疫原性组合物包含选自以下的载体蛋白:天然或灭活的细菌毒素、细菌外膜蛋白、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、结核菌素。
在另一实施方案中,所述载体蛋白是选自以下的灭活的细菌毒素:破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的无毒性交叉反应性物质(CRM197)、百日咳类毒素、霍乱类毒素、大肠杆菌(E.coli)LT、大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌(Pseudomona aeruginosa)的外毒素A,人中使用的任何其他典型蛋白载体,或者衍生自上述的任何免疫原性肽/片段。
在另一实施方案中,所述载体蛋白是猪链球菌衍生的免疫原性菌体蛋白和/或分泌蛋白,其选自但不限于溶血素、MRP、EF、烯醇化酶、枯草杆菌蛋白酶和DNAse。
在一优选实施方案中,来自猪链球菌的荚膜多糖缀合至载体蛋白破伤风类毒素,所述荚膜多糖制备自猪链球菌血清型1、2、7或9,或者任何其他血清型,或者它们的组合。
本发明的一实施方案是多价免疫原性组合物,其包含:制备自至少两种不同猪链球菌血清型的多糖-蛋白缀合物,连同生理上可接受的媒介物,其中每种缀合物包含缀合至载体蛋白的来自猪链球菌的荚膜多糖,其中所述荚膜多糖制备自猪链球菌血清型1、2、7和/或9或者任何其他血清型。
在另一实施方案中,制备自至少两种不同猪链球菌血清型的多价免疫原性组合物缀合至载体蛋白,其中所述载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的无毒性交叉反应性物质(CRM197)、百日咳类毒素、霍乱类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌的外毒素A,人中使用的任何其他典型蛋白载体,或者衍生自上述的任何免疫原性肽/片段。
在另一实施方案中,制备自至少两种不同猪链球菌血清型的多价免疫原性组合物缀合至载体蛋白,其中所述载体蛋白选自猪链球菌衍生的免疫原性菌体蛋白和/或分泌蛋白,所述猪链球菌衍生的免疫原性菌体蛋白和/或分泌蛋白选自但不限于溶血素、MRP、EF、烯醇化酶、枯草杆菌蛋白酶和DNAse。
在另一实施方案中,制备自至少两种不同猪链球菌血清型的多价免疫原性组合物缀合至载体蛋白,其中每种荚膜多糖单独缀合至破伤风类毒素载体蛋白。
本发明的另一实施方案包括一种减少猪链球菌相关感染的临床表现的方法,包括但不限于猪中的受损的行为、跛行、脑部病变和中枢神经系统相关临床表现的频率、菌血症、细菌从内部组织的恢复和/或定殖、胸腔和腹腔中的炎症以及死亡率,所述方法包括向有此需要的动物施用免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含:荚膜多糖-蛋白缀合物,连同生理上可接受的媒介物,其中所述缀合物包含缀合至载体蛋白的来自猪链球菌的荚膜多糖,其中所述荚膜多糖制备自猪链球菌血清型1、2、7或9,或者任何其他血清型或它们的组合。
在一优选实施方案中,一种减少猪链球菌相关感染的临床表现(包括但不限于猪中的受损的行为、跛行、脑部病变和中枢神经系统相关临床表现的频率、菌血症、细菌从内部组织的恢复和/或定殖、胸腔和腹腔中的炎症以及死亡率)的方法包括向有此需要的动物施用免疫原性组合物,所述免疫原性组合物包含来自猪链球菌的荚膜多糖,其制备自猪链球菌血清型1、2、7或9,或者任何其他血清型或它们的组合,缀合至载体蛋白破伤风类毒素。
在另一实施方案中,一种减少猪链球菌相关感染的临床表现(包括但不限于猪中的受损的行为、跛行、脑部病变和中枢神经系统相关临床表现的频率、菌血症、细菌从内部组织的恢复和/或定殖、胸腔和腹腔中的炎症以及死亡率)的方法包括向有此需要的动物施用包含多价免疫原性组合物的免疫原性组合物,其包含:制备自至少两种不同猪链球菌血清型的多糖-蛋白缀合物,连同生理上可接受的媒介物,其中每种缀合物包含缀合至载体蛋白的来自猪链球菌的荚膜多糖,其中所述荚膜多糖制备自猪链球菌血清型1、2、7或9,或者任何其他血清型。
本发明的实施方案还包括一种制备免疫原性缀合物的方法,所述免疫原性缀合物包含:猪链球菌血清型1、2、7和/或9或者任何其他血清型荚膜多糖,或者它们的组合,共价连接至载体蛋白,所述方法包括:(a)通过超声处理或噬菌体降解、温和酸水解或臭氧化解聚猪链球菌血清型1、2、7和/或9或者任何其他血清型的荚膜多糖;(b)使步骤(a)的解聚的荚膜多糖(CPS)与高碘酸钠反应以通过化学或酶促氧化产生<10%氧化水平(或任何其他氧化水平而不损失免疫原性)的唾液酸残基或任何其他靶糖残基,如能够特异性地修饰CPS的一部分的特定糖的半乳糖氧化酶和相关的酶;(c)通过CPS-蛋白缀合物疫苗领域中已知的还原氨基化或任何其他缀合方法将步骤(b)的高碘酸盐处理的荚膜多糖(CPS)共价偶联至载体蛋白,导致多糖:载体蛋白缀合物;以及(d)使多糖:载体蛋白缀合物反应以减少游离醛基团;其中所得的CPS:载体蛋白比例为2:1或1:1或者允许保留CPS或载体蛋白的免疫原性的任何其他比例。
在一实施方案中,制备免疫原性缀合物的方法包含猪链球菌血清型1、2、7和/或9或者任何其他血清型荚膜多糖,或者它们的组合,共价连接至载体蛋白,其中所述载体蛋白选自灭活的细菌毒素、细菌外膜蛋白、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素。
在另一实施方案中,制备免疫原性缀合物的方法包含猪链球菌血清型1、2、7和/或9或者任何其他血清型荚膜多糖,或者它们的组合,共价连接至载体蛋白,其中所述载体蛋白是灭活的细菌毒素,选自破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的无毒性交叉反应性物质(CRM197)、百日咳类毒素、霍乱类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌的外毒素A,人中使用的任何其他典型蛋白载体,或者衍生自上述载体蛋白的任何免疫原性肽/片段。
在另一实施方案中,制备免疫原性缀合物的方法包括猪链球菌血清型1、2、7和/或9荚膜多糖,或者任何其他血清型,或者它们的组合,共价连接至载体蛋白,其中所述载体蛋白是猪链球菌衍生的免疫原性菌体蛋白和/或分泌蛋白,其选自但不限于溶血素、MRP、EF、烯醇化酶、枯草杆菌蛋白酶和DNAse。
在一优选实施方案中,制备免疫原性缀合物的方法包括猪链球菌血清型1、2、7和/或9或者任何其他血清型荚膜多糖,或者它们的组合,共价连接至载体蛋白,其中所述载体蛋白是破伤风类毒素。
除非另有说明,本发明的实施会采用本领域技术内的分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白和多糖化学以及免疫学的常规技术。这类技术在文献中充分解释。参见,例如,Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Vols.I,IIand III,Second Edition(1989);DNA Cloning,Vols.I and II(D.N.Glover ed.1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984);Animal Cell Culture(R.K.Freshney ed.1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL press,1986);Perbal,B.,A Practical Guide toMolecular Cloning(1984);the series,Methods In Enzymology(S.Colowick andN.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.);Protein purification methods–a practicalapproach(E.L.V.Harris and S.Angal,eds.,IRL Press at Oxford University Press);and Handbook of Experimental Immunology,Vols.I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwelleds.,1986,Blackwell Scientific Publications);R.Roy in:Carbohydrate-basedvaccines,ACS Symposium Series,989,2008。
在详细描述本发明之前,应当理解本发明并不限于特定DNA、多肽序列或过程参数,因此当然可以变化。还应当理解本文中使用的术语仅仅是为了描述本发明的特定实施方案的目的,并不是为了限制。必须注意,当用于本说明书和所附权利要求时,除非内容另有明确指定,单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个”包括复数指称。因此,例如,提到“抗原”包括两种或更多种抗原的混合物,提到“赋形剂”包括两种或更多种赋形剂的混合物等。
A.定义
除非另有定义,在提交时本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域技术人员通常理解的相同意义。术语的含义和范围应当是清楚的;但是,在任何潜在歧义的情况下,本文提供的定义优先于任何词典或外在定义。而且,除非上下文另有要求,单数术语应当包括复数,并且复数术语应当包括单数。在本文中,除非另有说明,使用“或者”表示“和/或”。此外,术语“包括(including)”以及其他形式如包括“(includes)”和“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制。本文提到的所有专利和出版物均援引加入本文。
“疾病防护”、“保护性免疫”、“功能性免疫”和相似短语表示通过施用本发明的一种或多种治疗组合物或者它们的组合产生的针对疾病或疾病状况的应答,其导致比已暴露于疾病或感染的未免疫的对象中预期的少的有害效应。即,感染的有害效应的严重程度在免疫接种的对象中减轻。在免疫接种的对象中可以减少、减缓或可能完全预防感染。在本文中,当表示完全预防感染时,其具体说明。如果未说明完全预防,则该术语包括部分预防。
在本文中,“临床表现的发生率和/或严重程度减少”或者“临床症状减少”表示但不限于与野生型感染相比,减少组中感染对象的数量,减少或消除表现出感染的临床表现的对象数量,或者减少一个或多个对象中存在的任何临床表现的严重程度。例如,其应当指病原体负荷的任何减少、病原体脱落、病原体传播减少或猪链球菌感染的任何临床表现症状的减少。优选地,与未接受所述组合物并感染的对象相比,在接受本发明的治疗组合物的一个或多个对象中这些临床表现减少至少10%。更优选地,在接受本发明的组合物的对象中临床表现减少至少20%、优选至少30%、更优选至少40%、甚至更优选至少50%、并且甚至更优选70%。
术语“增加的保护”在本文中表示但不限于在免疫接种的对象组对未免疫接种的对象对照组中,与感染性物质感染相关的一种或多种临床症状分别统计上显著减少。术语“临床症状的统计上显著减少”表示但不限于用感染性物质攻击之后,免疫接种的对象组中至少一种临床症状的发生频率比未免疫接种的对照组低至少10%、优选20%、更优选30%、甚至更优选50%、并且甚至更优选70%。
“长期保护”应当是指持续至少3周,但是更优选至少3个月,更优选至少6个月的“提高的效力”。在家畜的情况下,最优选长期保护应当持续直至将动物出售肉类的平均年龄。
“免疫原性或免疫组合物”是指包含至少一种在宿主中引发对所述组合物的细胞或抗体介导的免疫应答的细菌荚膜多糖-蛋白缀合物的物质组合物。在本发明的一优选实施方案中,免疫原性组合物诱导免疫应答,并且更优选地,赋予针对猪链球菌感染的一种或多种临床表现的保护性免疫。
如本文所用的“免疫原性”细菌荚膜多糖-蛋白缀合物或“抗原”是指如本文所述引发免疫学应答的偶联至蛋白载体的多糖。“免疫原性”细菌荚膜多糖-蛋白缀合物包括衍生自猪链球菌血清型1、2、7和9或者任何其他血清型的多糖,其中所述(多)糖通过本领域技术人员已知的合成方法获得,或者在缀合至蛋白载体之前解聚至100-400kDa的分子量。例如,在一方面,分子量范围为100-350kDa、100-300kDa、100-250kDa、100-200kDa、100-150kDa、200-400kDa、200-350KDa、200-300kDa、200-250kDa、300-400kDa、或300-350kDa、或5-400kDa或者如其合成的寡糖片段。在一实施方案中,共价偶联至多糖的载体蛋白是来自破伤风、白喉、百日咳、假单胞菌(Pseudomonas)、大肠杆菌、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或沙门氏菌(Salmonella)的类毒素,或者衍生自以上的任何免疫原性肽/片段。为最佳免疫原性组合物优化的CPS或其合成片段的大小连同蛋白比例通常由5kDa或更高的CPS以及4-5CPS(片段):1蛋白(或肽片段)的比例组成。
如本文所用的术语“缀合物”是指共价缀合至载体蛋白的多糖。本公开的缀合物和包含它们的免疫原性组合物可以包含一定量的游离(未共价连接的)多糖和游离载体蛋白。
如本文所用,“缀合(to conjugate)”、“缀合(conjugated)”和“缀合(conjugating)”是指将多糖或细菌荚膜多糖共价连接至载体分子或载体蛋白的过程。缀合可以根据下文描述的方法或通过本领域已知的其他过程进行。缀合增强荚膜多糖的免疫原性。
如本文所用的术语“糖”可与“多糖”或“寡糖”交换使用,是指细菌荚膜多糖,在一优选实施方案中分离自猪链球菌。
“免疫应答”或“免疫学应答”表示但不限于发展对所关注的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常,免疫或免疫学应答包括但不限于一种或多种以下效应:产生抗体,激活B细胞、辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞,特异性地针对所关注的组合物或疫苗中包括的抗原或多种抗原。优选地,宿主会表现出治疗性或保护性免疫学(记忆)应答,从而对新感染的抗性会增强和/或疾病的临床严重程度降低。这样的保护会通过以下证实:症状的数量、症状的严重程度减少,或者缺少与病原体感染相关的一种或多种症状,猪链球菌相关感染的临床表现发生的延迟,包括但不限于受损的行为、跛行、脑部病变和中枢神经系统相关临床表现的频率、菌血症、细菌从内部组织的恢复和/或定殖、胸腔和腹腔中的炎症以及死亡率。
如本文所用,“药学或兽医学可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。在一些优选实施方案中,特别是那些包括冻干免疫原性组合物的实施方案,本发明中使用的稳定剂包括用于冻干或冷冻-干燥的稳定剂。
“稀释剂”可以包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐等。
“分离的”表示“人工”使其自天然状态改变,即,如果其天然存在,则将其自原始环境改变或移除,或者二者。例如,在本文中采用该术语时,天然存在于活生物体中的细菌荚膜多糖是未“分离的”,但是自其天然状态的共存物质分离的相同荚膜多糖是“分离的”。
如本文所用,术语“免疫接种(vaccination)”或“免疫接种(vaccinating)”或其变体表示但不限于一个过程,其包括施用本发明的免疫原性组合物,当施用至动物时,所述免疫原性组合物引发或能够引发—直接或间接地—动物中针对猪链球菌的免疫应答。
在本发明的上下文中,“死亡率”是指由猪链球菌感染引起的死亡,并且包括感染如此严重以至于将动物安乐死以防止痛苦和为其生命提供人道结局的情况。
在本文中,“有效剂量”表示但不限于引发或能够引发免疫应答的抗原量,其减少施用抗原的动物中的临床症状。
如本文所用,在组合物的上下文中,术语“有效量”表示能够诱导免疫应答的免疫原性组合物的量,所述免疫应答减少动物中感染或疾病事件的发生率或者减轻其严重程度。或者,在治疗的上下文中,术语“有效量”是指治疗的量,其足以减少或改善疾病或病症的严重程度或持续时间,或者其一种或多种症状,防止疾病或病症的发展,引起疾病或病症的消退,防止与疾病或病症相关的一种或多种症状的复发、发展、发生或进展,或者增强或提高另一疗法或治疗剂的预防或治疗。
B.载体分子
本发明的猪链球菌荚膜多糖可以缀合或共价连接的载体分子优选上文描述的那些。优选的载体包括但不限于灭活的细菌毒素,如来自破伤风、白喉、百日咳、假单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、产气荚膜梭菌或沙门氏菌的类毒素;或者细菌外膜蛋白、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素;或者猪链球菌衍生的免疫原性菌体蛋白和/或分泌蛋白,选自但不限于溶血素、MRP、EF、烯醇化酶、枯草杆菌蛋白酶、DNAse;或者衍生自以上但不限于以上的任何免疫原性肽/片段(如)。优选地,载体蛋白本身是免疫原。
本发明的猪链球菌荚膜多糖可以通过本领域技术人员已知的标准技术制备。例如,荚膜多糖可以制备自各种猪链球菌血清型,包括但不限于血清型1、2、7和9。单独多糖通过离心、沉淀、超滤和凝胶过滤/大小排阻色谱纯化;然后通过超声处理或噬菌体降解、温和酸水解或臭氧化解聚;或者,单独寡糖可以通过本领域技术人员已知的合成方法获得。将纯化/解聚/合成的多(寡)糖化学活化以使它们可与载体蛋白反应。一旦活化,将每种荚膜多糖缀合至载体蛋白以形成“猪链球菌荚膜多糖-蛋白缀合物”。
猪链球菌荚膜多糖可以通过本领域已知的任何方便方法共价偶联至载体(R.Roy,Carbohydrate-based vaccines,ACS Symp.Ser,989,2008)。例如,本公开提供方法,其包括(1)分离荚膜多糖;(2)解聚多糖;(3)活化多糖;(4)使活化的多糖与载体蛋白反应,其中终产物是稳定的多糖-蛋白缀合物。在一实施方案中,荚膜多糖通过超声处理或者通过噬菌体降解、温和酸水解或臭氧化解聚,其中通过大小排阻色谱确定解聚后的分子量。然后将解聚的多糖在氧化剂的存在下活化,在非限制性实例中,氧化剂是高碘酸钠或常用碱金属高碘酸盐,或者任何靶糖残基的任何其他化学或酶促氧化。通过气相色谱/HPLC-MS评价唾液酸或其他糖残基的氧化程度。将处理的多糖在氰基硼氢钠(但不限于此)的存在下在控制缓冲液中通过还原氨基化偶联,2:1或1:1缀合比例,或者对最佳免疫原性组合物优化的任何比例,通常由5kDa或更高的CPS以及4-5CPS(片段):1蛋白(或肽片段)的比例组成。
如通过平均分子量定义的,免疫原性组合物的大小可变并取决于所选的衍生自猪链球菌血清型1、2、7或9或者任何其他血清型的细菌荚膜多糖,蛋白载体,以及解聚的方法和将细菌荚膜多糖偶联至载体的方法。因此,其可以小到1,000道尔顿(103)或大于106道尔顿。
这类分子的毒性和治疗效力可以通过细胞培养或实验动物中例如确定LD50(对群体的50%致死的剂量)的标准制药方法来确定。
本发明的疫苗可以是多价或单价的。多价疫苗制备自多种衍生自猪链球菌血清型1、2、7或9或者任何其他血清型的细菌荚膜多糖与载体分子的免疫缀合。
在另一方面,细菌荚膜多糖-蛋白缀合物组合物包含有效免疫量的免疫原性缀合物,与额外的免疫刺激剂组合;以及生理上可接受的媒介物。如本文的上下文中所用,“免疫刺激剂”意图涵盖能够增强免疫系统活性的任何化合物或组合物,无论其是与特异性抗原组合的特异性增强作用,或者简单地对免疫应答的一个或多个元素活性的独立影响。免疫刺激剂化合物包括但不限于矿物胶,例如,氢氧化铝;表面活性物质如溶血卵磷脂、普流尼克(pluronic)多元醇;聚阴离子;肽;油乳剂;以及MDP。利用这些材料的方法是本领域已知的,并且确定用于给定疫苗的刺激剂的最佳量在技术人员的能力之内。一种以上免疫刺激剂可以用于给定制剂。还可以将免疫原(CPS)非共价并入胶束或脂质体组合物用于疫苗制剂。
如果期望,组合物可以存在于包装或分配器装置中,其可以包含一个或多个单位剂型,所述单位剂型包含活性成分。例如,所述包装可以包含金属或塑料薄膜,如透明包装。所述包装或分配器装置可以附有施用的说明书,优选施用至哺乳动物,特别是猪。与这类容器相关的可以是管理药物或生物产品的生产、使用或销售的政府机构所规定形式的提示,该提示反映用于人施用的生产、使用或销售的机构的批准。
C.佐剂
为了进一步增加本文提供的免疫原性组合物的免疫原性,其包含一种或多种猪链球菌荚膜多糖-蛋白缀合物,还可以包含一种或多种佐剂。
在一些实施方案中,本发明的免疫原性组合物包含佐剂。如本文所用,“佐剂”可以包括例如氢氧化铝和磷酸铝,皂草苷[例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)],GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL),油包水乳剂,水包油乳剂,水包油包水乳剂[例如,油包水制剂,包括Gold(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和(Specol,LifeTechnologies)]。所述乳剂可以特别地基于轻质液体石蜡油(欧洲药典类型);类异戊二烯油如角鲨烷或角鲨烯;由烯烃(特别是异丁烯或癸烯)的寡聚化产生的油;包含直链烷基的酸或醇的酯,更具体而言为植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯;支化脂肪酸或醇的酯,特别是异硬脂酸酯。将油与乳化剂组合使用以形成乳剂。乳化剂优选为非离子型表面活性剂,特别是山梨醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇以及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯(任选地乙氧基化),以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段,特别是Pluronic产品,尤其是L121。参见Hunter et al.,The Theoryand Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.),JohnWiley andSons,NY,pp51-94(1995)和Todd et al.,Vaccine 15:564-570(1997)。示例性佐剂是M.Powell and M.Newman,Plenum Press,1995编辑的“Vaccine Design,The Subunit andAdjuvant Approach”的第147页上描述的SPT乳剂以及该书第183页上描述的乳剂MF59。
佐剂的另一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物,特别是与糖类或多元醇的聚烯基醚交联。已知这些化合物为术语卡波姆(Phameuropa Vol.8,No.2,June1996)。本领域技术人员还可以参考美国专利第2,909,462号,其描述了与聚羟基化化合物交联的这类丙烯酸聚合物,所述聚羟基化化合物具有至少3个(优选不多于8个)羟基,至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团代替。优选基团是包含2-4个碳原子的那些基团,例如乙烯基、烯丙基和其它烯化的(ethylenically)不饱和基团。不饱和基团本身可以包含其他取代基如甲基。以名称卡巴普(Carbopol)(BF Goodrich,Ohio,USA)出售的产品特别适合。它们可以与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。其中可以提到卡巴普974P、934P和971P。最优选使用卡巴普971P。在马来酸酐和烯基衍生物的共聚物中是共聚物EMA(Monsanto),其是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物溶解于水中导致酸溶液,优选将其中和至生理pH,以便给出佐剂溶液,将免疫原性、免疫学或疫苗组合物本身加入其中。
其他合适的佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组或其他方式)、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽、CpG ODN细菌寡核苷酸的合成版本[例如,ODN 1826VACCIGRADETM(InvivoGen,SanDiego,CA)]或者天然存在或重组的细胞因子或其类似物或者内源细胞因子释放的刺激剂等。
预期可以以约100μg-约10mg/剂量的量,优选以约100μg-约10mg/剂量的量,更优选以约500μg-约5mg/剂量的量,甚至更优选以约750μg-约2.5mg/剂量的量,并且最优选以约1mg/剂量的量添加佐剂。或者,佐剂可以浓度为最终产物体积的约0.01-65%,优选浓度为最终产物体积的约2%-30%,更优选浓度为最终产物体积的约5%-25%,更优选浓度为最终产物体积的约7%-22%,并且最优选浓度为最终产物体积的10%-20%。通过按照已知技术在适当的无菌条件下物理混合佐剂与猪链球菌荚膜多糖-蛋白缀合物制备本发明的疫苗组合物,产生佐剂组合物。
预期可以以约100μg-约10mg/剂量的量,优选以约100μg-约10mg/剂量的量,更优选以约500μg-约5mg/剂量的量,甚至更优选以约750μg-约2.5mg/剂量的量,并且最优选以约1mg/剂量的量添加佐剂。或者,佐剂可以浓度为最终产物体积的约20%-65%,优选浓度为最终产物体积的约20%-30%,更优选浓度为最终产物体积的约5%-25%,更优选浓度为最终产物体积的约7%-22%,并且最优选浓度为最终产物体积的10%-20%。
D.生理上可接受的媒介物
可以利用与用于其他药物多肽组合物的那些相似的技术配制本发明的疫苗组合物。因此,佐剂和猪链球菌荚膜多糖-蛋白缀合物可以以冻干形式储存并在生理上可接受的媒介物中重组以在施用之前形成悬浮液。或者,佐剂和缀合物可以储存在媒介物中。优选的媒介物是无菌溶液,特别是无菌缓冲液溶液,如磷酸缓冲盐水。在媒介物中组合佐剂和缀合物从而提高免疫原性组合物的免疫效果的任何方法都是适当的。
本发明的疫苗的单一剂量的体积可以变化,但是一般在常规疫苗通常采用的范围内。单一剂量的体积优选约0.1ml-约3ml,优选约1.0ml-约3.0ml,并且更优选约1.0ml-约2.0ml,在上文提到的缀合物和佐剂浓度下。
本发明的疫苗组合物可以通过任何方便的方式施用。
E.制剂
包含偶联至载体分子的猪链球菌荚膜多糖的免疫原性缀合物可以用作疫苗用于针对一种或多种血清型的猪链球菌免疫,包括但不限于血清型1、2、7和9。包含生理上可接受的媒介物中的免疫原性缀合物的疫苗可用于免疫动物的方法,优选免疫猪,用于预防猪链球菌感染。
通过用免疫原性缀合物免疫针对本发明的免疫原性缀合物产生的抗体可以用于预防猪链球菌感染的被动免疫疗法。
组合物的施用对象优选是猪。在另一实施方案中,所述对象是人。
本发明的制剂包含有效免疫量的一种或多种免疫原性组合物或其抗体以及生理上可接受的媒介物。疫苗包含有效免疫量的一种或多种免疫原性组合物以及生理上可接受的媒介物。所述制剂应当适合施用模式。
如果期望,免疫原性组合物还可以包含最小量的湿润剂或乳化剂,或者pH缓冲剂。免疫原性组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、胶囊、缓释制剂。
F.有效剂量
本文描述的化合物可以以治疗有效剂量施用至对象以预防猪链球菌相关疾病。剂量取决于接受疫苗的宿主以及诸如宿主年龄的因素。
制剂中采用的本发明的免疫原性缀合物或抗体的精确量取决于施用途径和对象性质(例如,物种、年龄、大小),并且会在如政府监管机构要求的效力研究中证实。
化合物的毒性和治疗效力可以在实验动物中确定。虽然可以使用表现出毒性副作用的化合物,但是应当小心设计递送系统,将这类化合物靶向至受影响的组织位点,以便最小化对未感染细胞的潜在损害,从而减少副作用。
获得自动物研究的数据可以用于制定在猪中使用的剂量范围。剂量可以在这个范围内变化,取决于采用的剂型和利用的施用途径。
组合物的免疫原性可以通过使用本领域已知的任何免疫测定在用组合物免疫之后监测受试对象的免疫应答确定。体液(抗体)应答和/或细胞介导的免疫的产生可以用作免疫应答的指征。受试对象可以包括动物如猪、小鼠、仓鼠、狗、猫、兔、牛、马、羊、家禽(例如鸡、鸭、鹅和火鸡)和人。
受试对象的免疫应答可以通过各种方法分析,如:所得免疫血清对免疫原性缀合物的反应性,如通过已知技术测定的,例如,酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀等;或者,通过保护免疫宿主免于病原体感染和/或减弱免疫宿主中由于病原体感染的症状,如通过本领域已知的任何方法确定的,用于测定传染病物质的水平,例如,细菌水平(例如,通过培养来自对象的样品),或者本领域已知的其他技术。传染病物质的水平还可以通过测量免疫球蛋白针对的抗原水平确定。传染病物质的水平降低或传染病症状改善表示组合物是有效的。
在猪中体内使用之前,可以体外测试本发明的治疗剂的期望的治疗或预防活性。
G.向对象施用
优选的施用途径包括但不限于鼻内、口服、皮内和肌肉内。在饮用水中施用,最优选以单一剂量施用是可取的。技术人员会认识到本发明的组合物还可以以一个、两个或更多个剂量施用,以及通过其他施用途径施用。例如,这类其他途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内和心内。根据预防所期望的持续时间和有效性,本发明的组合物可以施用一次或数次,还可以间歇施用,例如以每日计施用数天、数周或数月,一年两次,或者每年间隔和以不同剂量。
包括以下实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解下文实施例中公开的技术代表发明人发现在本发明的实施中运作良好的技术,并且因此可以认为构成其实施的优选模式。然而,鉴于本公开,本领域技术人员应当理解在公开的具体实施方案中可以进行许多变化,并且仍获得类似或相似的结果,不会背离本发明的精神和范围。
实施例4:
猪中的免疫原性和保护:
基于以前的结果,选择2:1缀合物制剂以评价猪链球菌天然宿主:猪中的免疫原性和保护。选择佐剂因为其以前已包括在基于猪链球菌菌苗的疫苗中(Wisselink et al.Vet Microbiol.2002;84:155-68;and Swildens et al.VetRec.2007;160:619-21)。将缀合物的表现与用佐剂化的猪链球菌2型菌苗的表现进行比较。
将猪以3周的间隔肌肉内注射两次,并且在第0、21和34天采集血清样品用于抗CPS抗体的滴定和分型(图7A)。在免疫后第21天,2:1缀合物疫苗诱导的总Ig[G+M]抗CPS滴度明显高于(P<0.01)安慰剂和菌苗的。加强之后,在免疫后第34天,对两个免疫接种组均观察到与第21天相比抗CPS滴度增加。但是,仅来自用2:1缀合物制剂免疫接种的猪的滴定明显高于安慰剂对照组(P<0.001)。在加强注射之后(第34天)还测定了不同猪IgG亚类的滴度,即IgG1和IgG2。40%用2:1缀合物疫苗免疫的猪表现出显著水平的抗CPS IgG1亚类(图7A)。未观察到转变为IgG2亚类(数据未示出)。相比之下,用菌苗免疫接种猪不能诱导抗CPS Ig类别转变(图7A和未示出的数据)。
在研究的第36天,将猪用3x109CFU的ATCC 700794(毒性猪链球菌血清型2菌株)的剂量腹腔内攻击。安慰剂组中的大部分猪在猪链球菌感染的全身阶段死亡,达到86.7%的死亡率。相比之下,用菌苗或2:1缀合物疫苗免疫的猪分别表现出28.6%和30.0%的死亡率。存活曲线的分析(图7B)显示一到第3天免疫组和安慰剂组之间就有显著差异(P=0.009)。在猪中猪链球菌攻击感染的全身阶段,2:1缀合物疫苗诱导的保护与对照2型菌苗的相似。
在攻击之后还连续7天监测猪的临床表现(行为、运动问题或CNS表现)。在对菌苗免疫接种组的所有观察的31.6%中以及在对缀合物免疫接种组的所有观察的28.1%中观察到异常行为。这与安慰剂组中的发现相比明显较低,其中90.7%的观察显示异常行为(表2,调整的P值<0.05)。与安慰剂组的89.3%相比,在菌苗免疫接种组的所有观察的26.3%中以及在缀合物免疫接种组的所有观察的33.5%中观察到跛行(表2,调整的P值<0.05)。当对每组每天分析临床评分的分布时也观察到这些差异(数据未示出)。仅在很少猪中观察到CNS表现,并且在三个攻击组之间未观察到统计显著差异(表2)。这可以通过仅在攻击后的7天时间观察动物的事实解释,因为研究设计主要集中在疾病的全身阶段。
表2:用猪链球菌血清型2实验攻击之后免疫的猪的临床评价a。
a评价行为,包括表明攻击对中枢神经系统(CNS)和运动的影响的任何行为。对行为的观察数字评分如下:0=生理,1=抑郁,2=冷漠。对运动的观察评分为0=生理,1=轻微至中度跛行,2=严重跛行/不愿站立,3=动物部分/完全倒下;动物可以起立,但是在10秒内再次躺下。CNS表现评分为0=不存在和1=存在。
b累积观察期的评价。评价的百分比,其中行为、运动或CNS表现跨越数天给出>0的值。数据表示为最小二乘均数(经逆变换,%)。
c调整的P-值(Scheffé’s检验):所有值与攻击对照组相比;评价中不包括严格对照组。NS,不显著,P≥0.05。
将所有发现死亡的猪以及所有安乐死的猪尸检。胸腔(即纤维蛋白、过量流体、心包炎)或关节中大体病变的频率在免疫接种动物中与安慰剂组相比全面减少。然而观察到的差异未达到统计显著性(表3)。缀合物疫苗显著减少来自关节拭子的攻击菌株回收率(P<0.01)。与安慰剂组相比,猪链球菌攻击菌株还较少从脑膜和心包拭子分离,然而差异没有统计上不同(表4)。
表3:来自攻击的猪的尸检(或尸体剖检)的大体病理观察a。
a记录胸腔(包括浆膜表面、心脏和肺)和关节(包括过量流体、纤维蛋白、肿胀)的严重表现。
b具有病理发现/观察的动物的百分比。
c P-值:所有值与攻击对照组相比;评价中不包括严格对照组。NS,不显著,P≥0.05。
表4:在攻击的猪的尸检(或尸体剖检)时从拭子回收猪链球菌血清型2a。
a来自拭子的培养物通过形态学、用2型抗血清血清分型和通过猪链球菌2型PCR确认。
b具有至少一种来自拭子培养物的阳性猪链球菌2型分离株的动物的百分比。
c P-值:所有值与攻击对照组相比;评价中不包括严格对照组。NS,不显著,P≥0.05。
因此,总的来说,检测并发现抗CPS IgM和IgG1抗体在用毒性猪链球菌血清型2体内致死剂量攻击中具有明显的保护作用。虽然菌苗诱导与缀合物疫苗相似水平的保护,但是这种保护与抗CPS抗体无关。这与以前的数据是一致的,表明整个猪链球菌(活的或杀死的)在小鼠或猪模型中不能诱导显著水平的抗CPS抗体(Calzas et al.InfectImmun.2015;83:441-53)。因此,绝对需要将CPS缀合至载体蛋白以产生调理抗CPS抗体,已知其针对荚膜细菌是高度保护性的。在另一方面,菌苗产生的保护可能与抗蛋白抗体有关。但是,与猪链球菌2型的普遍抗原CPS相反,蛋白抗原因菌株来源或序列类型(ST)变化(Fittipaldi et al.Future Microbiol.2012;7:259-79;Galina et al.Can J VetRes.1996;60:72-4;Gottschalk et al.Can J Vet Res.1998;62:75-9;Okwumabua etal.FEMS Microbiol Lett.1999;181:113-21;Fittipaldi et al.Emerg InfectDis.2011;17:2239-44;和Li Y,et al.Infect Immun.2006;74:305-12),因此不易通用。
统计分析:猪研究的总结和数据分析由生物统计学家利用9.3版进行。临床观察(死亡、跛行、CNS表现和行为改变)总结为以天计的频率和治疗。分析每个特征的正常对不正常的发生率,其中适当利用具有二项误差和罗吉特(logit)链接的SAS的GLIMMIX程序。模型包括治疗的固定效应以及窝和残差的随机效应。此外,分析对不正常的每只动物的观察的比例。在分析之前,利用平方根反正弦变换对比例进行变换。混合模型包括治疗的固定效应以及窝和残差的随机效应。所关注的比较包括以下并利用双侧检验评价,α=0.05:组1(菌苗)和2(缀合物)vs.3(提供的针对用分离株ATCC 700794攻击的保护)。
可以根据本公开制备和执行本文公开并要求保护的所有组合物和方法而无需过多实验。虽然本发明的组合物和方法已根据优选实施方案来描述,但是本领域技术人员会清楚变化可以应用于所述组合物和方法以及本文所述方法的步骤或步骤的顺序而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地,显而易见化学和生理相关的某些物质可以取代本文描述的物质,同时会获得相同或相似结果。本领域技术人员显而易见的所有这类相似的取代和修改被视为在如以下权利要求定义的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
如果它们提供示例性程序或补充本文所示那些的其他细节,则以下参考文献特别地援引加入本文。
[1]Gottschalk M.Streptococcosis.In:Zimmerman JJ,Ramirez A,SchwartzKJ,Stevenson GW,editors.Diseases of swine.10th ed.Ames,USA:Wiley-BlackwellPublishing;2012.p.841-55.
[2]Field HI,Buntain D,Done JT.Studies on pigletmortality.I.Streptococcal meningitis and arthritis.Vet Rec 1954;66:453-5.
[3]Jansen EJ,Dorssen CA.[Meningo-encephalitis in pigs caused byStreptococci].Tijdschr Diergeneeskd 1951;76:815-32.
[4]de Moor CE.Septicaemic infections in pigs,caused by haemolyticStreptococci of new Lancefield groups designated R,S and T.Antonie VanLeeuwenhoek 1963;29:272-80.
[5]Elliott SD.Streptococcal infection in young pigs.I.Animmunochemical study of the causative agent(PM Streptococcus).J Hyg(Lond)1966;64:205-12.
[6]Windsor RS,Elliott SD.Streptococcal infection in young pigs.IV.Anoutbreak of streptococcal meningitis in weaned pigs.J Hyg(Lond)1975;75:69-78.
[7]Goyette-Desjardins G,Auger JP,Xu J,Segura M,GottschalkM.Streptococcus suis,an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-anupdate on the worldwide distribution based on serotyping and sequencetyping.Emerg Microbes Infect 2014;3:e45.
[8]Higgins R,Gottschalk M.Streptococcal diseases.In:Straw BE,D'Allaire S,Mengeling WL,Taylor DJ,editors.Diseases of swine.9th ed.Ames,USA:Blackwell Publishing;2006.p.769-83.
[9]Sanford SE,Tilker ME.Streptococcus suis type II-associateddiseases in swine:observations of a one-year study.J Am Vet Med Assoc 1982;181:673-6.
[10]Cloutier G,D’Allaire S,Martinez G,Surprenant C,Lacouture S,Gottschalk M.Epidemiology of Streptococcus suis serotype 5 infection in a pigherd with and without clinical disease.Vet Microbiol 2003;97:135-51.
[11]Segura M.Fisher scientific award lecture-The capsularpolysaccharides of Group B Streptococcus and Streptococcus suis differentlymodulate bacterial interactions with dendritic cells.Can J Microbiol 2012;58:249-60.
[12]Lapointe L,D'Allaire S,Lebrun A,Lacouture S,Gottschalk M.Antibodyresponse to an autogenous vaccine and serologic profile for Streptococcussuis capsular type 1/2.Can J Vet Res 2002;66:8-14.
[13]Baums CG,Brüggemann C,Kock C,Beineke A,Waldmann K-H,Valentin-Weigand P.Immunogenicity of an autogenous Streptococcus suis bacterin inpreparturient sows and their piglets in relation to protection afterweaning.Clin Vaccine Immunol 2010;17:1589-97.
[14]Wisselink HJ,Stockhofe-Zurwieden N,Hilgers LAT,SmithHE.Assessment of protective efficacy of live and killed vaccines based on anon-encapsulated mutant of Streptococcus suis serotype 2.Vet Microbiol 2002;84:155-68.
[15]Busque P,Higgins R,Caya F,Quessy S.Immunization of pigs againstStreptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain.Can JVet Res 1997;61:275-9.
[16]Fittipaldi N,Harel J,D'Amours B,Lacouture S,Kobisch M,GottschalkM.Potential use of an unencapsulated and aromatic amino acid-auxotrophicStreptococcus suis mutant as a live attenuated vaccine in swine.Vaccine 2007;25:3524-35.
[17]Fittipaldi N,Segura M,Grenier D,Gottschalk M.Virulence factorsinvolved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogenand zoonotic agent Streptococcus suis.Future Microbiol 2012;7:259-79.
[18]Calzas C,Lemire P,Auray G,Gerdts V,Gottschalk M,Segura M.Antibodyresponse specific to the capsular polysaccharide is impaired in Streptococcussuis serotype 2-infected animals.Infect Immun 2015;83:441-53.
[19]Song JY,Moseley MA,Burton RL,Nahm MH.Pneumococcal vaccine andopsonic pneumococcal antibody.J Infect Chemother 2013;19:412-25.
[20]Heath PT.An update on vaccination against Group BStreptococcus.Expert Rev Vaccines 2011;10:685-94.
[21]Bottomley MJ,Serruto D,Sáfadi MAP,Klugman KP.Future challenges inthe elimination of bacterial meningitis.Vaccine 2012;30:B78-B86.
[22]Roy R,Shiao TC.Organic chemistry and immunochemical strategies inthe design of potent carbohydrate-based vaccines.Chimia 2011;65:24-9.
[23]Elliott SD,Clifton-Hadley F,Tai J.Streptococcal infection inyoung pigs.V.An immunogenic polysaccharide from Streptococcus suis type 2with particular reference to vaccination against streptococcal meningitis inpigs.J Hyg(Lond)1980;85:275-85.
[24]Charland N,Jacques M,Lacouture S,Gottschalk M.Characterizationand protective activity of a monoclonal antibody against a capsular epitopeshared by Streptococcus suis serotypes 1,2 and 1/2.Microbiology 1997;143:3607-14.
[25]Knuf M,Kowalzik F,Kieninger D.Comparative effects of carrierproteins on vaccine-induced immune response.Vaccine 2011;29:4881-90.
[26]Byrd W,Kadis S.Preparation,characterization,and immunogenicity ofconjugate vaccines directed against Actinobacillus pleuropneumoniae virulencedeterminants.Infect Immun 1992;60:3042-51.
[27]Byrd W,Harmon BG,Kadis S.Protective efficacy of conjugatevaccines against experimental challenge with porcine Actinobacilluspleuropneumoniae.Vet Immunol Immunopathol 1992;34:307-24.
[28]Andresen LO,Jacobsen MJ,Nielsen JP.Experimental vaccination ofpigs with an Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5b capsularpolysaccharide-tetanus toxoid conjugate.Acta Vet Scand 1997;38:283-93.
[29]Van Calsteren MR,Gagnon F,Lacouture S,Fittipaldi N,GottschalkM.Structure determination of Streptococcus suis serotype 2 capsularpolysaccharide.Biochem Cell Biol 2010;88:513-25.
[30]Segura M,Stankova J,Gottschalk M.Heat-killed Streptococcus suiscapsular type 2 strains stimulate tumor necrosis factor alpha andinterleukin-6 production by murine macrophages.Infect Immun 1999;67:4646-54.
[31]Calzas C,Goyette-Desjardins G,Lemire P,Gagnon F,Lachance C,VanCalsteren MR,et al.Group B Streptococcus and Streptococcus suis capsularpolysaccharides induce chemokine production by dendritic cells via Toll-likereceptor 2-and MyD88-dependent and-independent pathways.Infect Immun 2013;81:3106-18.
[32]Van Calsteren MR,Gagnon F,Calzas C,Goyette-Desjardins G,Okura M,Takamatsu D,et al.Structure determination of Streptococcus suis serotype 14capsular polysaccharide.Biochem Cell Biol 2013;91:49-58.
[33]Houde M,Gottschalk M,Gagnon F,Van Calsteren M-R,SeguraM.Streptococcus suis Capsular Polysaccharide Inhibits Phagocytosis throughDestabilization of Lipid Microdomains and Prevents Lactosylceramide-DependentRecognition.Infect Immun 2012;80:506-17.
[34]U.S.Code of Federal Regulations.Title 9-Animals and AnimalProducts,Chapter I-Animal and Plant Health Inspection Service,Department ofAgriculture;Subchapter E;Part 117.4 Test animals.1998.
[35]Higgins R,Gottschalk M.An update on Streptococcus suisidentification.J Vet Diagn Invest 1990;2:249-52.
[36]Goyette-Desjardins G,Roy R,Segura M.Murine whole-bloodopsonophagocytosis assay to evaluate protection by antibodies raised againstencapsulated extracellular bacteria.In:Lepenies B,editor.Methods in MolecularBiology-Carbohydrate-based vaccines.New York,USA:Springer;In press.
[37]Szu SC,Zon G,Schneerson R,Robbins JB.Ultrasonic irradiation ofbacterial polysaccharides.Characterization of the depolymerized products andsome applications of the process.Carbohydr Res 1986;152:7-20.
[38]Reuter G,Schauer R,Szeiki C,Kamerling JP,Vliegenthart JF.Adetailed study of the periodate oxidation of sialic acids inglycoproteins.Glycoconj J 1989;6:35-44.
[39]Wessels MR,Paoletti LC,Kasper DL,DiFabio JL,Michon F,Holme K,etal.Immunogenicity in animals of a polysaccharide-protein conjugate vaccineagainst type III Group B Streptococcus.J Clin Invest 1990;86:1428-33.
[40]Merril C,Goldman D,Sedman S,Ebert M.Ultrasensitive stain forproteins in polyacrylamide gels shows regional variation in cerebrospinalfluid proteins.Science 1981;211:1437-8.
[41]Chu RS,Targoni OS,Krieg AM,Lehmann PV,Harding CV.CpGoligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1(Th1)immunity.J Exp Med 1997;186:1623-31.
[42]Stills HF.Adjuvants and antibody production:dispelling the mythsassociated with Freund's complete and other adjuvants.ILAR Journal 2005;46:280-93.
[43]Leenaars PPAM,Hendriksen CFM,Angulo AF,Koedam MA,ClaassenE.Evaluation of several adjuvants as alternatives to the use of Freund'sadjuvant in rabbits.Vet Immunol Immunopathol 1994;40:225-41.
[44]Bennett B,Check IJ,Olsen MR,Hunter RL.A comparison ofcommercially available adjuvants for use in research.J Immunol Methods 1992;153:31-40.
[45]Sommariva M,de Cesare M,Meini A,Cataldo A,Zaffaroni N,TagliabueE,et al.High efficacy of CpG-ODN,cetuximab and cisplatin combination for veryadvanced ovarian xenograft tumors.J Transl Med 2013;11:25.
[46]Jennings VM.Review of selected adjuvants used in antibodyproduction.ILAR Journal 1995;37:119-25.
[47]Kateregga J,Lubega GW,Lindblad EB,Authie E,Coetzer TH,BoulangeAF.Effect of adjuvants on the humoral immune response to congopain in miceand cattle.BMC Vet Res 2012;8:63.
[48]Dalsgaard K,Hilgers L,Trouve G.Classical and new approaches toadjuvant use in domestic food animals.Adv Vet Sci Comp Med 1990;35:121-60.
[49]Plotkin SA.Correlates of protection induced by vaccination.ClinVaccine Immunol 2010;17:1055-65.
[50]Swildens B,Nielen M,Wisselink HJ,Verheijden JHM,StegemanJA.Elimination of strains of Streptococcus suis serotype 2 from the tonsilsof carrier sows by combined medication and vaccination.Vet Rec 2007;160:619-21.
[51]Gilbert FB,Poutrel B,Sutra L.Immunogenicity in cows ofStaphylococcus aureus type 5 capsular polysaccharide—ovalbuminconjugate.Vaccine 1994;12:369-74.
[52]Lee C-J,Lee LH,Frasch CE.Protective immunity of pneumococcalglycoconjugates.Crit Rev Microbiol 2003;29:333-49.
[53]Baker CJ,Rench MA,Edwards MS,Carpenter RJ,Hays BM,KasperDL.Immunization of pregnant women with a polysaccharide vaccine of Group BStreptococcus.N Engl J Med 1988;319:1180-5.
[54]Kasper DL,Paoletti LC,Wessels MR,Guttormsen HK,Carey VJ,JenningsHJ,et al.Immune response to type III Group B streptococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine.J Clin Invest 1996;98:2308-14.
[55]Moens L,Jeurissen A,Nierkens S,Boon L,Van Kaer L,Kasran A,etal.Generation of antibody responses to pneumococcal capsular polysaccharidesis independent of CD1 expression in mice.Infect Immun 2009;77:1976-80.
[56]Schütz K,Hughes R,Parker A,Quinti I,Thon V,Cavaliere M,etal.Kinetics of IgM and IgA antibody response to 23-valent pneumococcalpolysaccharide vaccination in healthy subjects.J Clin Immunol 2013;33:288-96.
[57]Baums CG,Kock C,Beineke A,Bennecke K,Goethe R,C,etal.Streptococcus suis bacterin and subunit vaccine immunogenicities andprotective efficacies against serotypes 2 and 9.Clin Vaccine Immunol 2009;16:200-8.
[58]Duan J,Kasper DL.Oxidative depolymerization of polysaccharides byreactive oxygen/nitrogen species.Glycobiology 2011;21:401-9.
[59]Higashi K,Ly M,Wang Z,Masuko S,Bhaskar U,Sterner E,etal.Controlled photochemical depolymerization of K5 heparosan,a bioengineeredheparin precursor.Carbohydr Polym 2011;86:1365-70.
[60]Anderson P.Antibody responses to Haemophilus influenzae type band diphtheria toxin induced by conjugates of oligosaccharides of the type bcapsule with the nontoxic protein CRM197.Infect Immun 1983;39:233-8.
[61]Svenson SB,Lindberg AA.Oligosaccharide-protein conjugate:A novelapproach for making Salmonella O-antigen immunogens.FEMS Microbiol Lett 1977;1:145-7.
[62]Svenson SB,Lindberg AA.Coupling of acid labile Salmonellaspecific oligosaccharides to macromolecular carriers.J Immunol Methods 1979;25:323-35.
[63]Wessels MR,A,Kasper DL.A model of high-affinity antibodybinding to type III Group B Streptococcus capsular polysaccharide.Proc NatlAcad Sci 1987;84:9170-4.
[64]Paoletti LC,Kasper DL,Michon F,DiFabio J,Holme K,Jennings HJ,etal.An oligosaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine against type III GroupB Streptococcus.J Biol Chem 1990;265:18278-83.
[65]Pawlowski A,Svenson SB.Electron beam fragmentation of bacterialpolysaccharides as a method of producing oligosaccharides for the preparationof conjugate vaccines.FEMS Microbiol Lett 1999;174:255-63.
[66]Paoletti LC,Wessels MR,Michon F,DiFabio J,Jennings HJ,KasperDL.Group B Streptococcus type II polysaccharide-tetanus toxoid conjugatevaccine.Infect Immun 1992;60:4009-14.
[67]Wessels MR,Paoletti LC,Rodewald AK,Michon F,DiFabio J,JenningsHJ,et al.Stimulation of protective antibodies against type Ia and Ib Group BStreptococci by a type Ia polysaccharide-tetanus toxoid conjugatevaccine.Infect Immun 1993;61:4760-6.
[68]Paoletti LC,Wessels MR,Rodewald AK,Shroff AA,Jennings HJ,KasperDL.Neonatal mouse protection against infection with multiple Group Bstreptococcal(GBS)serotypes by maternal immunization with a tetravalent GBSpolysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine.Infect Immun 1994;62:3236-43.
[69]Wessels MR,Paoletti LC,Pinel J,Kasper DL.Immunogenicity andprotective activity in animals of a type V Group B streptococcalpolysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine.J Infect Dis 1995;171:879-84.
[70]Paoletti LC,Pinel J,Johnson KD,Reinap B,Ross RA,KasperDL.Synthesis and preclinical evaluation of glycoconjugate vaccines againstGroup B Streptococcus types VI and VIII.J Infect Dis 1999;180:892-5.
[71]Paoletti LC,Kasper DL.Conjugate vaccines against Group BStreptococcus types IV and VII.J Infect Dis 2002;186:123-6.
[72]Wessels MR,Paoletti LC,Guttormsen HK,Michon F,D'Ambra AJ,KasperDL.Structural properties of Group B streptococcal type III polysaccharideconjugate vaccines that influence immunogenicity and efficacy.Infect Immun1998;66:2186-92.
[73]Jennings HJ,Lugowski C,Kasper DL.Conformational aspects criticalto the immunospecificity of the type III Group B streptococcalpolysaccharide.Biochemistry 1981;20:4511-8.
[74]Zou W,Mackenzie R,Thérien L,Hirama T,Yang Q,Gidney MA,etal.Conformational epitope of the type III Group B Streptococcus capsularpolysaccharide.J Immunol 1999;163:820-5.
[75]Avci FY,Li X,Tsuji M,Kasper DL.A mechanism for glycoconjugatevaccine activation of the adaptive immune system and its implications forvaccine design.Nat Med 2011;17:1602-9.
[76]Michon F,Uitz C,Sarkar A,D'Ambra AJ,Laude-Sharp M,Moore S,etal.Group B streptococcal type II and III conjugate vaccines:physicochemicalproperties that influence immunogenicity.Clin Vaccine Immunol 2006;13:936-43.
[77]O'Hagan DT,Valiante NM.Recent advances in the discovery anddelivery of vaccine adjuvants.Nat Rev Drug Discov 2003;2:727-35.
[78]Chu RS,McCool T,Greenspan NS,Schreiber JR,Harding CV.CpGoligodeoxynucleotides act as adjuvants for pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccines and enhance antipolysaccharide immunoglobulin G2a(IgG2a)and IgG3 antibodies.Infect Immun 2000;68:1450-6.
[79]Fattom A,Li X,Cho YH,Burns A,Hawwari A,Shepherd SE,et al.Effectof conjugation methodology,carrier protein,and adjuvants on the immuneresponse to Staphylococcus aureus capsular polysaccharides.Vaccine 1995;13:1288-93.
[80]Bode C,Zhao G,Steinhagen F,Kinjo T,Klinman DM.CpG DNA as avaccine adjuvant.Expert Rev Vaccines 2011;10:499-511.
[81]Kovarik J,Bozzotti P,Tougne C,Davis HL,Lambert PH,Krieg AM,etal.Adjuvant effects of CpG oligodeoxynucleotides on responses against T-independent type 2 antigens.Immunology 2001;102:67-76.
[82]Cox JC,Coulter AR.Adjuvants—A classification and review of theirmodes of action.Vaccine 1997;15:248-56.
[83]Leenaars PP,Savelkoul HF,Hendriksen CF,Van Rooijen N,ClaassenE.Increased adjuvant efficacy in stimulation of antibody responses aftermacrophage elimination in vivo.Immunology 1997;90:337-43.
[84]Heegaard P,Dedieu L,Johnson N,Le Potier M-F,Mockey M,Mutinelli F,et al.Adjuvants and delivery systems in veterinary vaccinology:current stateand future developments.Arch Virol 2011;156:183-202.
[85]Hunter RL.Overview of vaccine adjuvants:present andfuture.Vaccine 2002;20 Suppl 3:S7-12.
[86]Peeters CC,Lagerman PR,Weers O,Oomen LA,Hoogerhout P,Beurret M,etal.Preparation of polysaccharide-conjugate vaccines.In:Robinson A,Hudson MJ,Cranage MP,editors.Methods in Molecular Medecine-Vaccine Protocols.2nded.Totowa,USA:Humana Press Inc;2003.p.153-73.
[87]Wilson D,Braley-Mullen H.Antigen requirements for priming of typeIII pneumococcal polysaccharide-specific IgG memory responses:suppression ofmemory with the T-independent form of antigen.Cell Immunol 1981;64:177-86.
[88]Peeters CCAM,Tenbergen-Meekes A-MJ,Poolman JT,Zegers BJM,RijkersGT.Immunogenicity of a Streptococcus pneumoniae type 4 polysaccharide-proteinconjugate vaccine is decreased by admixture of high doses of freesaccharide.Vaccine 1992;10:833-40.
[89]Rodriguez ME,van den Dobbelsteen GP,Oomen LA,de Weers O,van BurenL,Beurret M,et al.Immunogenicity of Streptococcus pneumoniae type 6B and 14polysaccharide-tetanus toxoid conjugates and the effect of uncoupledpolysaccharide on the antigen-specific immune response.Vaccine 1998;16:1941-9.
[90]Romero-Steiner S,Frasch CE,Carlone G,Fleck RA,Goldblatt D,NahmMH.Use of opsonophagocytosis for serological evaluation of pneumococcalvaccines.Clin Vaccine Immunol 2006;13:165-9.
[91]Guilliams M,Bruhns P,Saeys Y,Hammad H,Lambrecht BN.The functionof Fcg receptors in dendritic cells and macrophages.Nat Rev Immunol 2014;14:94-108.
[92]Underhill DM,Ozinsky A.Phagocytosis of microbes:complexity inaction.Annu Rev Immunol 2002;20:825-52.
[93]Ricklin D,Hajishengallis G,Yang K,Lambris JD.Complement:a keysystem for immune surveillance and homeostasis.Nat Immunol 2010;11:785-97.
[94]Perlmutter RM,Hansburg D,Briles DE,Nicolotti RA,David JM.SubclassRestriction of Murine Anti-Carbohydrate Antibodies.J Immunol 1978;121:566-72.
[95]Rubinstein LJ,Stein KE.Murine immune response to the Neisseriameningitidis group C capsular polysaccharide.I.Ontogeny.J Immunol 1988;141:4352-6.
[96]Schreiber JR,Cooper LJN,Diehn S,Dahlhauser PA,Tosi MF,Glass DD,etal.Variable region-identical monoclonal antibodies of different IgG subclassdirected to Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide O-specific side chainfunction differently.J Infect Dis 1993;167:221-6.
[97]Michaelsen TE,Kolberg J,Aase A,Herstad TK,EA.The four mouseIgG isotypes differ extensively in bactericidal and opsonophagocytic activitywhen reacting with the P1.16 epitope on the outer membrane PorA protein ofNeisseria meningitidis.Scand J Immunol 2004;59:34-9.
[98]McLay J,Leonard E,Petersen S,Shapiro D,Greenspan NS,Schreiber JR.γ3 gene-disrupted mice selectively deficient in the dominant IgG subclassmade to bacterial polysaccharides.II.Increased susceptibility to fatalpneumococcal sepsis due to absence of anti-polysaccharide IgG3 is correctedby induction of anti-polysaccharide IgG1.J Immunol 2002;168:3437-43.
[99]Galina L,Vecht U,Wisselink HJ,Pijoan C.Prevalence of variousphenotypes of Streptococcus suis isolated from swine in the U.S.A.based onthe presence of muraminidase-released protein and extracellular factor.Can JVet Res 1996;60:72-4.
[100]Gottschalk M,Lebrun A,Wisselink H,Dubreuil JD,Smith H,VechtU.Production of virulence-related proteins by Canadian strains ofStreptococcus suis capsular type 2.Can J Vet Res 1998;62:75-9.
[101]Okwumabua O,Abdelmagid O,Chengappa MM.Hybridization analysis ofthe gene encoding a hemolysin(suilysin)of Streptococcus suis type 2:evidencefor the absence of the gene in some isolates.FEMS Microbiol Lett 1999;181:113-21.
[102]Fittipaldi N,Xu J,Lacouture S,Tharavichitkul P,Osaki M,SekizakiT,et al.Lineage and virulence of Streptococcus suis serotype 2 isolates fromNorth America.Emerg Infect Dis 2011;17:2239-44.
[103]Li Y,Martinez G,Gottschalk M,Lacouture S,Willson P,Dubreuil JD,et al.Identification of a surface protein of Streptococcus suis andevaluation of its immunogenic and protective capacity in pigs.Infect Immun2006;74:305-12.