JPH09502444A - 蠕虫感染を防止及び治療するための化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 脊椎動物を蠕虫による感染から保護する化合物であって、この化合物が、免疫刺激担体に共有結合したヒアルロニダーゼを含み、上記ヒアルロニダーゼが共有結合している上記免疫刺激担体は、その好適形態において、Ｎ−酸化エチレンピペラジンと臭化Ｎ−エチレンアセチルエチレンピペラジニウムとの共重合体（以下“シンポル”（synpol）と呼ぶ）を含む。また、脊椎動物を蠕虫による感染から保護する方法であって、この方法が免疫刺激担体（シンポルが望ましい）に共有結合したヒアルロニダーゼを含む化合物の治療上効果的な分量を上記脊椎動物に投与することを含み、好適形態において上記化合物はワクチンの形で上記脊椎動物に投与され、上記ワクチンは上記化合物と混合されたシンポルを含み、また上記方法は、上記ヒアルロニダーゼと上記免疫刺激担体とを共有結合させるべく、ある時間及びある温度条件下で上記ヒアルロニダーゼと上記免疫刺激担体とを反応させることをさらに含む。

Description

【発明の詳細な説明】 蠕虫感染を防止及び治療するための化合物 関連出願 本出願は１９９３年９月１０日出願の同時係属米国特許出願第０８／１２０， ００１号の一部継続出願である。 発明の分野 本発明は蠕虫感染に対して脊椎動物内で（の）免疫反応を顕在化・誘発するこ とができる合成物に関する。特に、本発明は寄生体質の蠕虫（寄生虫）による感 染から脊椎動物を保護するために用いられるワクチンに関する。 蠕虫感染は家畜動物及び人間の病気及び死亡の主な原因となっている。一般に 、蠕虫とは扁形動物門（例えば、吸虫、条虫、その他の扁形動物（渦虫））や線 形動物門（例えば、線形動物（回虫）及びこれと同系統のもの）に属する寄生体 質及び非寄生体質の種のことをいう。以下に、蠕虫感染がどのように起きるかを 例示説明する。蠕虫種は、卵又は幼虫を含んだ食物をホスト生体物が、例えば、 経口摂取することにより、卵又は侵襲性の幼虫の形で、ホスト（宿主）となるべ き体内に入る。その後、蠕虫は異なる（色々な）組織、血液及びリンパ液（体液 ）をゆっくりと移動しながら成長する。そして、蠕虫は最終的には「好適な」臓 器・器官に到達して成長し成熟していく。蠕虫が住み付いた臓器は次第に悪影響 を受ける。 これらを抑制・鎮圧・繁茂防止する手段は、衛生学、媒介動物数の減少技術及 び化学療法における進歩・改善・改良に大きく依存している。衛生学及び媒介動 物数減少技術に焦点を当てた抑制・繁茂防止手段は特に発展途上国において問題 があることが判明した。これは、発展途上国では、上記のような感染は非常に一 般的であり且つ上記抑制手段の実行は非常に難しいからである。また、現在の化 学療法による薬物療法は全て、高い毒性を有すること、治療・処理を繰返し行わ なければならないこと、及び免疫性が抑えられるという副作用が生ずること等の 欠点を有している。さらに、このような製剤を使用すると、寄生虫（体）はしば しば化学療法の薬物療法に対して抵抗力（耐性）を有するようになる。事実、ほ とんど全ての国において、反駆虫薬抵抗力（耐性）が発生したケースが報告され ている。このような理由があること、及び化学療法化合物を繰返し投与するため に要する費用が大きいことにより、上記欠点を有さない化合物が強く要望されて いた。 感染した体内には非常に多種類の蠕虫種が存在し得るので、広いスペクトル（ 広範スペクトル）の予防力を有するワクチンを製造することが望ましい。今まで のところ、蠕虫感染の次に（続いて）強い保護免疫質（免疫性）がホスト誘発さ れるのは稀である。これら寄生虫（寄生体）がホストと共に長期間の共進化を経 験すると、ホストと寄生虫との関係が順応レベルに達する。その結果、特定の強 い免疫性（質）を発生することが多い急性感染ではなく、慢性的又は永続的な状 態となる。このため、動物で生ずるほとんどの微生物（細菌）による病気の場合 とは異なり、蠕虫抑制・鎮圧・繁茂防止に役立つワクチンはほとんどない。また 、存在するワクチンは大きな問題点を有している。 蠕虫ワクチンを製造する公知の方法については、非働性（不活性）（inactive d）又は活性・生（living）ワクチンは次の問題点を有する。即ち、かかるワク チンを製造するには多くの労働力が必要であり、免疫原としては非常に弱く、ま た、局所的な炎症、アレルギー反応及び発熱等の副作用を伴う。さらに、ワクチ ンとして（において）で減毒・弱毒された形で用いられると、毒性・悪性の（野 生の：wild）形の寄生虫により誘発される病気に類似した病気がしばしば発生す る。加えて、これらワクチン製剤で用いられる高分子担体タンパク質（キャリア プロテイン）は、ワクチン注射された生物体において多くの免疫病理学的副作用 を引起こす。 その他の入手可能なクラスのワクチンは、遺伝子工学的に強化された抗原から 成るものである。しかし、この抗原も免疫原としては非常に弱い。 以上要するに、入手可能なタイプのワクチンは一般に効果的ではなく、非常に 狭い範囲・用途でしか用いることができない（１つの寄生虫に対してのみ用いる ことができる）。 報告された進展・開発状況 蠕虫のライフサイクル中、組織内移動（tissue-migration）が重要な役割を果 たす蠕虫についての詳細な説明及び蠕虫が引起こす病理学的状態についての議論 は例えば、E.J.Soulsby の「Helminth，Arthropods and Protozoa of Domestica ted Animals,7th Edition」、出版社Lea and Febiger（アメリカ合衆国フィラデ ルフィア）（1982）及びG.M．Urquhart の「VeterinaryParasitology（Longman Scientific and Technical）」（イギリス）（1987）に記載されている。 全ての寄生虫が免疫反応を顕在化させるが、多くの理由により寄生虫はホスト の免疫反応に対して、動く（捕らえることができない）と共に時々可視的ではな い（認識不可能な）ターゲットを提供する。これは、通常の抑制・鎮圧メカニズ ムでは鎮圧不可能であり、且つ、免疫性（質）の代わりに（ではなく）免疫学的 ダメージをしばしば引起こす。その結果、頻繁にホストは、効果的でなく且つし ばしば逆効果の（意図とは逆の結果を招く）免疫反応を停止し、大きな病理学上 の変化及び免疫抑制が生じてしまう。 寄生体質の蠕虫の構造的及び抗原的多様性は、それらが顕在化する特定の免疫 反応の不均一性に反映されている。寄生体質の蠕虫はしばしば、それらの抗原表 面を覆って（マスキングして）そぎ落とす（shedding）ことにより免疫システム を回避することができ、また、脊椎動物ホストに居座っている間それらの抗原を 変えることにより、免疫システムを回避することができる。上記のように表面抗 原をマスクし、落とし（流し）、変化させる能力は、蠕虫感染に対して効きめ（ 効能）のあるワクチンを製造する上で従来存在していた困難・問題点の主な原因 である。 寄生虫による病気の処置・治療に用いられる最近のワクチンの再考察・検討は J.H.L Playfairその他の The Lancet 335（1990）（1263-1266 頁）に記載され ている。また、寄生体質の蠕虫に対するホストの免疫学的反応の性質・特性につ いてのより一般的な議論はS.Lloyd 及びE.J.L.Soulsby の「Parasitology in Fo cus:Facts and Trends」Ed.H.Mehlhorn,Springer-Verlag（1988）（619-650 頁 ）の論文に記載されている。上記Playfairその他による再検討記事に示されてい るように、また、本明細において既に述べられたように、現存する蠕虫抑制・鎮 圧手段は高価であり大規模（広範囲）な実施が困難であるので、ホストにおいて 蠕虫感染の強さ及び優勢・普及率（有病率・羅患率）を減少させることができる ワクチンが強く望まれていた。 本発明がなされる以前にあっては、特定の種に対してでさえ、効果的な抗・反 蠕虫ワクチンを製造する際には上記困難・問題点に直面するので、１つの抗原の みでは広範囲の蠕虫感染に対して十分な保護を与えることは不可能であろうと考 えられていた。蠕虫によって生ずる医学的及び科学的難題の全般的な再検討につ いては、A.A.F.Mahmoud 著の「Science 246（1989）」の1015-1021 頁を参照さ れたい。（また、免疫学百科事典 I.M.Roitt and P.J.Delves，Academic Press （1992）の D.J.Mclaren による“Parasites,Escape from Immunity”という見 出しの部分及びF.E.G.Cox による“Parasites,Immunity to”という見出しの部 分も参照されたい。） 発明の開示 本発明によれば、蠕虫による感染から脊椎動物を保護するための化合物であっ て、免疫刺激担体（immunostimulating carrier）に共有結合的に結合・抱合さ れたヒアルロニダーゼ（hyaluronidaze）から成る化合物が提供される。好適な 態様にあっては、本発明の化合物は脊椎動物にワクチンの形で投与され、ヒアル ロニダーゼが共有結合的に結合している免疫刺激担体は、Ｎ−酸化エチレンピペ ラジン及び臭化Ｎ−エチルアセチルエチレンピペラジニウム（以下、「シンポル （synpol）」という）のコーポリマ（共重合体）から成っている。 本発明は、幼虫・幼態の蠕虫種が感染したホスト生物体の体内の組織バリアを 貫通・浸透・透過（penetrate）するために、幼虫・幼態の蠕虫種によりヒアル ロニダーゼ酵素が生成されるという発見に部分的に基づいている。実際の場合、 本発明は、蠕虫により作られたヒアルロニダーゼに対する免疫反応を顕在化する ことができるので、蠕虫が組織バリアを貫通し動物に感染する能力を、完全にな くすか徹底的に弱く・小さくすることができる。 本発明の他の態様によれば、蠕虫による感染から脊椎動物を保護する方法であ って、免疫刺激担体（好ましくはシンポル）に共有結合的に結合・連結したヒア ルロニダーゼから成る化合物を治療上効果のある量だけ脊椎動物に投与すること を特徴とする方法が提供される。好適な態様にあっては、上記化合物は、化合物 と混合したシンポルを含むワクチンの形で脊椎動物に投与される。本発明によっ て治療・処置できる脊椎動物の例としては、人間、畜牛、羊、豚、犬、馬、猫、 ヤギ、水牛、ラクダ及び家禽（飼鳥）が挙げられる。 本発明の他の態様によれば、ヒアルロニダーゼと上記免疫原（性）の担体とを 共有結合的に結合・連結させる時間と温度とを与えるという条件下でヒアルロニ ダーゼと免疫刺激担体とを反応させるステップを有する方法が提供される。 本発明は、蠕虫感染から脊椎動物を保護する従来の技術に比べ多くの利点を有 すると考えられる。本発明の化合物は、ホスト生物体の体内での移動を促進する 際にヒアルロニダーゼを利用するタイプの蠕虫種による感染に対して、脊椎動物 を保護するものである。従って、本発明の化合物は広範スペクトルの蠕虫種に対 して有効である。このことは、１つの（ある）特定の蠕虫種からのみホストを保 護することしかできないことが多い従来のワクチンに比べると顕著な効果である 。 本発明のワクチンが有する他の利点・効果は、ワクチンが強い免疫原性を有す る（免疫原になる力が強い）ことである。従来の抗蠕虫ワクチンは非常に免疫原 性が弱いことが多く、望ましくない副作用（例えば、局所的な炎症、アレルギー 反応及び発熱）を誘発する。さらに、しばしば従来のワクチンは、ワクチン注射 ・投与された生物体において多数の免疫病理学的副作用を引起こす高分子担体プ ロテインを使用している。 従来の抗蠕虫ワクチンの上記及びその他の色々な欠点・課題は、本発明の化合 物によって解決される。なぜなら、本発明の化合物は、従来の抗蠕虫ワクチン製 剤にしばしば見られる副作用を引起こすことなく、強い免疫原性反応を引出すこ とができるからである。さらに、本発明の化合物は発育・成長や生殖能力に影響 を及ぼさない。 強い免疫原性反応を引起こすと共に、多くの蠕虫種に対する広範スペクトルの 保護を与えることができるという本発明のワクチンの能力により、従来の抗蠕虫 ワクチンには見られなかった利点が提供される。 図面の簡単な説明 図１は、シンポルの一般的な式を示している。 図２は、例１で説明された手順・方法で製造されたシンポルの構造式を示して いる。 図３は、例２で説明された手順・方法で製造されたシンポルの構造式を示して いる。 図４は、本発明の化合物の注射の後におけるラット体重の変化を示すグラフで ある。 発明の詳細な説明 本発明の一つの態様によれば、免疫刺激担体とヒアルロニダーゼの反応生成物 から成る原料・材料・素材が提供される。 ここで用いられるヒアルロニダーゼという用語は、自然に発生する多糖類、特 に、ヒアルロン酸及び硫酸コンドロイチン（４−，６−，Ｄ及びＥ）等のグリコ サミノグリカンを加水分解する酵素族のことを意味する。これら重合体物質は細 胞外のマトリックス（母体・基質）の半固体のゲル状構造の本質的成分・構成要 素である。ヒアルロニダーゼは上記重合体物質を裂く・割る（cleave）ことがで き、よって、細胞外マトリックスを破壊することができる。非常に多くの蠕虫種 がヒアルロニダーゼを作り出し、これを用いてホスト生物体の細胞外マトリック スの上記成分を加水分解するので、蠕虫は組織バリアを貫通することができ、ま た、蠕虫が成長して成熟するのに好ましい臓器に到達するまで蠕虫はホスト生物 体の体内で移動することができる。 ヒアルロニダーゼ族は、上記タイプのマトリックス（基質・基体）を加水分解 する同族（関連）酵素を含む。これらは、ヒアルロン酸ポリマ分子の構造内にお いて異なる連鎖・リンケージを有するという特徴・特異性に基づいてグループ分 けすることができる。特に、ヒアルロニダーゼは３つの主な（大きな）グループ に分けることができる。１つはヒアルロノグルコザミニダーゼ（hyaluronogluco saminidases）、１つはヒアルロノグルクロニダーゼ（hyaluronoglucuronidases ）、そして、もう１つはグルコロネートリアーゼ（glucoronate lyases）である 。（B.Fiszer-Szafarz,Analytical Biochemistry，vol.143,p.76（1984）） 自然のままの・天然の（native）ヒアルロニダーゼだけでは極めて弱い免疫原 性しか示さないし、可視的な・認識できる抗ヒアルロニダーゼ抗体の生成を誘発 しない（繰返し注射・注入した後であっても）。 ヒアルロニダーゼは種々のソース（源）から分離されてきた。例えば、ヘビや 蜂の毒液、ヒルの唾液、精子・精虫の先体顆粒（acrosomal granula）、種々の 細胞のリソゾーム顆粒あるいは細菌（性の）毒素から分離されてきた。本発明の 実施に用いることができるヒアルロニダーゼの模範的なソースとしては、畜牛及 び羊の精巣・睾丸、蠕虫、ヒル、蜂及びヘビの毒液及び細菌が挙げられる。 ヒアルロニダーゼの細菌ソースとしては、これらに限定されるわけではないが 、連鎖球菌ミラリ（Streptococcus millery）（P.F.Unsworth,J.Clin.Pathology ,（London）1989，42(5),506-510）、連鎖球菌ピオジネス（Streptococcus pyog enes）（W.L.Hynes and J.J.Ferretti,Infection and Immunity,1989,57(2),533 -539）、連鎖球菌キシミリス（Streptococcus equisimilis）（R.Sting et al., Med.Sci.Res.,1989,vol.17,No.17,pp.723-725）、クロストリディウム属の細菌 のディフィシィクル（Clostridium difficicle）（S.V.Seddon et al.,J.Med.Mi crobiol.,1990,v.31,no.3,pp．169-174）、連鎖球菌ウベリス（Stroptococcus u beris）（P.Schaufuss et al.,Zentralbl.Bakteriol.FRG,1989,V.271,no.1,pp， 46-53）及び連鎖球菌ディスガラクティアエ（Streptococcus dysgalactiae）（A .Hamai et al.,Agric.Biol.Chem.,1989,v.53,no.8,pp．2163-2168）が挙げられ る。また、カンジダ属の各種の菌（の類）の酵母にもヒアルロニダーゼが含ま れていることが判明している（M.T.Shimizu,Rev.Microbiol.,1988,v.19,no.4,pp ．442-445）。 既知の種の中では、ヒアルロニダーゼは一般には単量体及び低重合体の形で見 つけることができ、その際、例えば、同じサブユニットの二量体及び四量体がし ばしば存在する。連鎖球菌ピオジネス殺菌ウイルスにより作られたヒアルロニダ ーゼ（用）アミノ酸シーケンスが判明し（W.L.Hynes et al.,Infection and Imm unity 57（1989）：533-539）、また、蜂の毒液のヒアルロニダーゼが最近判明 した（配列がわかった）（M.Gmachl et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,3569-3 573（1993））。ヒアルロニダーゼを符号化する遺伝子の配列・整列化（sequenc ing）及びクローニング（cloning）が、本発明の実施において用いるＤＮＡ組換 えに基づくヒアルロニダーゼの生成の基礎となるであろうことが予想される。 市場において入手可能なヒアルロニダーゼ製剤の多くは、本発明の化合物を準 備・製造するために用いることができるであろう。例えば、ＲＥＡＮＡＬ ＣＯ ．から販売されているウシのヒアルロニダーゼ製剤（カタログ番号０７０５）を 用いることができる。このソースから得られるヒアルロニダーゼのポリアクリル アミドゲル電気泳動（PAGE：Polyacrylamide gel electrophoresis）は、分子量 が約６３ｋＤａ（キロダルトン）の大きな（major）プロテインバンドの存在を 示している。また、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から販売されている 羊の精巣・睾丸から得られる材料（カタログ番号Ｈ２１２６）も使用することが できる。このソースから得られるヒアルロニダーゼのポリアクリルアミドゲル電 気泳動により、分子量が約３９ｋＤａの大きなプロテインバンドの存在が判明し ている。さらに、ヒアルロニダーゼはＳｅｒｖａからも得ることができる（カタ ログ番号２５１１９及び２５１２１）。 種々の市場化されているソースから得られるヒアルロニダーゼ製剤は、ＰＡＧ Ｅにより証明されているように、優位を占める（支配的な）プロテイン種におい ては異なるが、種々の市場入手可能なヒアルロニダーゼ製剤は全て、酵素的には （としては）アクティブ（反応性を有す・活性を有す）であり、且つ、免疫学的 には互いに交差反応を起こし得るものである。さらに、実際には、調査した全て の製剤は、分子量が約６０−６９ｋＤａのプロテイン種を少なくとも微量含んで おり、ＰＡＧＥプロセスで用いられたリダクション条件・状態（reducing condi tion）において存在する短い（shorter）ポリペプチドチェーンが（一定の）生 理学的条件・状態下で約６０−９０ｋＤａの低重合体に組立てられる・構築され る可能性を否定することはできない。 雄羊の睾丸と雄牛の睾丸の双方から分離したヒアルロニダーゼを用いた本発明 の化合物は、特に望ましい免疫原性、費用効果性及び便利性の組合せを提供して くれることが予想される。かかるヒアルロニダーゼの精製・浄化・純化（purifi cation）方法は比較的進歩しており・開発されており、抽出、沈殿・析出、遠心 分離（遠心沈殿）、限外濾過、イオン交換及びゲルクロマトグラフィという通常 用いられるステップから成る。羊又は牛の精巣・睾丸から分離されたヒアルロニ ダーゼを用いた本発明の化合物は、蠕虫ヒアルロニダーゼに対する免疫反応を誘 発する。羊又はウシ属の精巣・睾丸から分離されたヒアルロニダーゼを用いると 、蠕虫の幼虫（幼生）から分離したヒアルロニダーゼに比べ、著しく高い費用効 果がみられる。精巣・睾丸を出所源とするヒアルロニダーゼはヒアルロン酸を裂 く・割る（cleave）ことが判明しており、硫化コンドロイチンを認識することが できる（Bartolucci et al.,Int.J.Tissue React.,13(6)(1991),p.311）。従っ て、本発明の化合物の特に好適な実施例は、雄羊又は雄牛の睾丸から得られたヒ アルロニダーゼを用いて作られる。この点に関しては、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから販売されている羊又はウシ属を起源とするヒアルロ ニダーゼが本発明の実施に適していることが判明した。 本発明の処置・治療を受けた動物以外の種・ソースから得られたヒアルロニダ ーゼを用いた本発明の化合物はしばしば、処置・治療された種から分離されたヒ アルロニダーゼを用いた化合物よりも高い（強い）免疫原性を有することが観察 された。例えば、羊から分離されたヒアルロニダーゼは畜牛から分離されたヒア ルロニダーゼと比較すると、畜牛において（対して）より強い免疫反応を誘発す る傾向がある。羊及び畜牛の処置・治療を高い費用効果で且つ便利に行うために は、雄羊のヒアルロニダーゼと雄牛のヒアルロニダーゼの混合物から作られる化 合物の使用について考慮する必要がある。 本発明の範囲内にある化合物は、上述ヒアルロニダーゼと、免疫刺激担体の反 応生成物から成る。本明細書にあっては、「免疫刺激担体（immunostimulating carrier）」という用語は、所定の抗原と結合されると高い免疫原性の複合体・ 合成物・錯体（complex）（抗原と免疫刺激薬との複合体）を提供する化合物を 意味する。これは、低反応（応答）性の個体（low responding individual）に さえ、所定の抗原に対する免疫性を効率的に・効果的に与えることもある。本発 明の実施に用いることができる免疫刺激担体の例は、下記の刊行物に記載されて いる。この刊行物には、免疫刺激物としての合成・人工ポリイオン（polyion） の使用についての議論が記載されている。その刊行物とは「Khaitov,R.,Annals New York Academy of Sciences,685,788-802,June 23,1993」である。この刊行 物には、本発明で用いられるシンポル（synpol）と同等・均質なポリオキシドニ ウム（polyoxidonium）についての説明も記載されている。 好適実施例にあっては、ヒアルロニダーゼと反応する免疫刺激担体はシンポル である。ここで用いられる「シンポル（synpol）」という用語はＮ−酸化エチレ ンピペラジンと臭化Ｎ−エチルアセチルエチレンピペラジニウムの共重合体を意 味し、図１に示した式に対応する。尚、ｎ＝２００−２０００、ｑ＝（０．２− ０．３５）ｎ、ｚ＝（０．４−０．６５）ｎ、ｍ＝（０−０．４）ｎである。 シンポルは、ほとんどの他の担体（キャリア）及びアジュバンドとは異なり、 非免疫原性である（免疫原性を有さない）。シンポルは、認識・確認可能な抗原 性の決定子（デテルミナント）を全く有していないと考えられ、従って、免疫反 応を引起こさない。よって、ワクチン製剤に用いられる他のほとんどのアジュバ ント及び担体において観察される望まれない副作用を回避することができる。 簡便な方法で多くの種のシンポルをそれぞれ他から識別するために、「シンポ ル」という用語は上記文字「ｎ」，「ｑ」，「ｚ」及び「ｍ」のそれぞれを付し て用いることとする。例えば、ｎ＝１０００，ｑ＝０．３５，ｚ＝０．６０，ｍ ＝０．０５のＮ−酸化エチレンピペラジン及び臭化Ｎ−アセチルエチレンピペラ ジニウムは「シンポル１０００−３５／６０」と表記する。 本発明のワクチン実施例の免疫刺激担体として適切に使用できる特定のシンポ ル種共重合体の一例をここでは「シンポル１０００−２０／５０」と称する。少 なくとも分子量が約１５ｋＤａの又はこれより大きな分子量を有するシンポルが 本発明の実施においては好適である。また、分子量が少なくとも約３０ｋＤａよ り大きなシンポルは特に好適である。 本発明の化合物は例えば、ヒアルロニダーゼを免疫刺激担体に共有結合的に結 合・連結することによってヒアルロニダーゼを免疫刺激担体に化学的にリンクさ せる方法であればどのような方法によっても作ることができる。このような共有 結合による結合は、ヒアルロニダーゼの反応基・族・原子団（reactive groups ）と免疫刺激担体の反応基・族・原子団との間で直接形成することができる。あ るいは、上記結合は１つまたは２つ以上の結合基・族・原子団（linking groups ）により（を介して）形成することができる。以下に示す例からわかるように、 本発明の好適な免疫刺激担体（即ち、シンポル）とヒアルロニダーゼの反応生成 物を準備・製造するための好適な方法は、アジ化合物方法（azide method）を用 いる。この方法は、酸又はエステルの形のシンポルをヒドラジンを用いてヒドラ ジドに変換し、その後、所定の反応生成物を生成できる条件下で、ヒドラジドを ヒアルロニダーゼに結合させるステップから成る。所定の反応生成物とは、ヒア ルロニダーゼがシンポルと共有結合的に結合しているものである。尚、以下の例 に示されているように、シンポルとヒアルロニダーゼの反応生成物を作る他の好 適な方法にあっては、スクシンイミド（succinimide）エーテル又はシンポルを 形成するステップが含まれる。その後、スクシンイミドエーテルは、本発明の実 施に用いられる化合物を作るための条件下において、ヒアルロニダーゼと結合さ れる。 本発明の化合物は、蠕虫による感染から脊椎動物を保護する場合に非常に広範 囲で用いることができる。この目的のために、ヒアルロニダーゼと免疫刺激担体 の反応による生成物はワクチンの形で用いられることが好適である。ここで用い られる「ワクチン」という用語は、本発明の化合物を含む合成物を意味し、脊椎 動物に投与できる形のものをいう。典型的には、上記ワクチンは通常の塩水・含 塩物（saline）又は緩衝剤処理された（buffered）水溶液媒体を含み、この中に 本発明の化合物が浮遊又は溶解している。この形にあっては、本発明の化合物は 蠕虫感染の防止又は軽減、あるいはこれを治療する際に便利に用いることができ る。 好適な態様にあっては、本発明のワクチンはさらに、本発明の化合物に対して 小さな又は大きな比率で存在するアジュバントを含む。ここで用いられる「アジ ュバント（adjuvant）」という用語は、免疫反応の（に対して）非特異性の刺激 物質（non-specific stimulator）を意味する。これは、本発明のワクチンと結 合すると、強い免疫反応を引起こすものである。多くのアジュバントを使用する ことができる。例としては、完全又は不完全フロインド（Freund´s）アジュバ ント，水酸化アルミニウム及び変性・変態・修正ムラミルヂペプチド（modified muramyldipeptide）が挙げられる。本発明の好適実施にあっては、シンポルを アジュバントとして用いて本発明の化合物と混合する。 上述したように、本発明の化合物は、蠕虫感染から脊椎動物種を保護するため に用いられるものである。本発明により治療・処置することができる脊椎動物の 例としては、人間及び種々の家畜動物（例えば、畜牛、羊、豚、犬、馬、猫、ヤ ギ）並びにその他のウマ科ものもの、水牛、ラクダ及び家禽が挙げられる。特に 、本発明の化合物は、ヒアルロニダーゼを用いる蠕虫種にさらされる動物におけ る寄生質（性）蠕虫感染の防止及び治療に効き目を有することが期待される。 本発明の化合物は、筋（肉）注射・投与、皮下注射・投与又は皮内注射・投与 により非経口的に注射・投与することができる。所定の生物体に対する好ましい 注射・投与ルートは、本願の「例」のセクションを参照することによって見出だ せる・決定できるであろう。好ましい投与・服用（量）範囲は、治療される動物 や適用される環境において最も優勢な蠕虫種によって異なるが、一般的には動物 の体重１ｋｇに対し約０．０５ｍｇプロテインのワクチン投与が効果的であるこ とが判明した。有効な投与量範囲についてのさらなる説明については下記の「例 」のセクションを参照されたい。 ヒアルロニダーゼをシンポルに共有結合させる際に用いられるのが好ましい緩 い・マイルドな状態・条件（mild condition）は、ヒアルロニダーゼの抗原性エ ピトープに著しい影響を与えない。従って、高免疫原性の化合物が得られる。抗 ヒアルロニダーゼ抗体により、シンポルに共役・接合・結合された（conjugated ）ヒアルロニダーゼのエピトープを認識できることが、固体相の酵素リンク免疫 学的検定（法）（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunoassays）によって示された 。即ち、ＥＬＩＳＡによって、上記エピトープが残っていることが示された。 また、ヒアルロニダーゼをシンポルに共有結合した後にあってもヒアルロニダ ーゼの酵素としての機能位置が維持される・残されることも判明した。特に、ヒ アルロニダーゼのみの基質・基体・培養基（substrate）の劣化・減成・崩壊の 割合・速度（degradation rate）は、シンポルと共有結合されたヒアルロニダー ゼのそれ（サブストレートデクラデーションレート）にほぼ等しいことが観察さ れた。また、ヒアルロニダーゼはシンポルに結合されると、天然の（自然のまま の）酵素に比べかなり安定である。このことは、ヘパリン媒介（heparin mediat ed）反応停止（抑制）に対する抵抗及び熱安定性テストを含むヒアルロニダーゼ 酵素不活性化・非働化（inactivation）テストを用いて実証された。 ヒアルロニダーゼがシンポルに結合したことによりヒアルロニダーゼの安定性 が増大し、このことにより、本発明の化合物を広範スペクトルで他に利用するこ とができる。蠕虫感染を防止することができるという能力に加え、本発明の化合 物は他の病原体や生物体・有機体に対する免疫反応を誘発するのに用いることが できるであろうことが予想される。上記病原体及び生物体とは、例えば、ある種 類のバクテリア（細菌）や毒素等のように、組織を消化・蒸解・分解（digest） するためにヒアルロニダーゼを用いる病原体及び生物体である。また、本発明の 化合物は、ヒアルロニダーゼを含む毒液（例えば、蜂やヘビの毒液）の作用・活 動を止め、あるいは、上記毒液の広がりを局部的なものにするために用いること ができる。 さらに、本発明の範囲には、脊椎動物内の繊維症を治療するために、シンポル に共有結合したヒアルロニダーゼを用いる方法が含まれる。この方法は、シンポ ルに共有結合したヒアルロニダーゼからなる化合物を投与することを含む。 また、本発明の化合物は美容術においても利用することができる。即ち、上記 化合物を、皮膚をよりなめらかに且つ柔らかくするために用いられるクリームそ の他の製品の反応性・活性（active）成分として使用することができる。この点 に関してロシアでは人間の精液を含む原料・材料がスキンケア製品として用いら れてきた点に注目したい。しかしながら、このような製品を使用することは非常 に限定・制限される。なぜなら、ヒアルロニダーゼが不安定だからである。本発 明の化合物は安定で、水に溶け、毒性もないので、この分野においてただちに使 用することができる。また、この点に関して上記化合物を用いた場合の調査を実 際に行った。本発明の範囲にはさらに、シンポルと共有結合したヒアルロニダー ゼを、治療・薬物療法の効果・効率を増大するための拡散因子として使用するこ とも含まれる。また、本発明は医学的な使用において拡散を改善したり（速くし たり）、吸収を促進するために用いることもできる。例えば、獣医学上の使用に おいてウシの乳房炎の治療に用いる抗生作用（抗生物質）溶液の成分として用い ることができる。過去にあっては、上記の場合には不安定なヒアルロニダーゼが 用いられてきた（例えば、The Merck Index,8th Edition を参照されたい）。従 って、本発明により提供される安定化された形のヒアルロニダーゼによれば、天 然の形のヒアルロニダーゼを用いる化合物と比べ顕著な効果が得られることが期 待できる。 本発明の範囲にはまた、次のような治療においてシンポルに共有結合したヒア ルロニダーゼを使用することも含まれる。それは、自由な・フリーの（不安定な ）ヒアルロニダーゼが有利な効果を発揮できることが判明している場合の治療に おいてである。それらは、心筋梗塞（E.J.Flint et al，The Lancet，April 17( 1982)pp．871-874 及びD.Maclean et al,Science,vol.194,pp.199-200（1976） 参照）、網膜機能の改善（B.S.Winkler et al,Arch．Opthalmol.103（1985）pp. 1743-1746 参照）、癌腫瘍の治療において細胞成長・増殖抑止剤と共に用いる場 合（G.Baumgartner et al.,J.Exp.Clin.Cancer.Res.4（1985）p.3,及びW.Scheit hauer et al.,Anticancer Res.,vol8,pp.391-395（1988）参照）、結節状の・結 核性の脊髄蜘蛛膜炎の処置（M.Gourie-Devi et al.,J.Neurol.Sci.,vol.102,pp. 105-111（1991）参照）、及び高リスクの危険な患者の被包性の・莢膜で囲まれ た（encapsulated）脳膿瘍の処置（A,Pasaoglu,Acta Neurochir.,vol.100,pp.79 -83（1989）参照）である。さらに、例えばセルフリーシステム（cell free sys tem）においてヒアルロン酸を解重合する（単量体に分解する）ために又は、例 えば細胞培養工程においてヒアルロン酸シンセターゼを刺激するために、ヒアル ロニダーゼを試験管内で（生体外で）使用した（L.H.Philipson et al,Bioche m istry 24（1985）pp．7899-7906 参照）。本発明の範囲にはさらに、上記の場 合においてシンポルに共有結合したヒアルロニダーゼから成る化合物を使用する ことも含まれる。 また、本発明の範囲には、シンポルと抗原とを結合・接合・共役（conjugate ）させたワクチンが含まれる。この場合、抗原は、ヒアルロニダーゼに類似した プロテインを含む。上記ワクチンは例えば、組織を消化・温浸（digest）又は劣 化・分解（degrade）させるべく病原体によって使用された他の酵素を抗原とし て含むワクチンである（異なる特異性のコラゲナーゼ及びプロテイナーゼを含む ）。 本発明の範囲にはさらに、ホスト内での所定（既知）のアレルゲンに対するア レルギー反応を抑止すべく、アレルゲンに結合させたシンポルを使用することも 含まれる。広範囲の・詳細にわたる調査の結果、上記のような抗原とシンポルの 結合体・接合体・共役体（conjugate）を投与すると、対象としているアレルゲ ンに対して非アレルギー性の抗体同基準標本（アイソタイプ）が優先的に生成さ れることが判明した。この通常の・ノーマルな非病原性（非発病性）アイソタイ プは、既に存在しているアレルゲン性アイソタイプ（例えば、ＩｇＥ免疫グロブ リン）と対抗し・競い、特にアレルゲンを破壊する。この特定の脱感作（除感作 ）方法ははっきりと実証され、今では臨床実験の第１段階にきている。 本発明の範囲にはまた、結合した抗原の免疫原性を強化すべく、下記の抗原に 結合させたシンポルを使用することも含まれる。このように免疫原性を強化する と、効果的な予防免疫反応の誘発を促進することができる。「下記の抗原」とは 、コレラ毒素のベータサブユニット、タイプＡ及びＢのインフルエンザウイルス のエンベロープからの（赤）血球凝集素、Ｂ炭痘・脾脱疽（anthracis）からの ｐ． ９０毒素、サルモネラ菌からのＶｉ抗原、Ｅ結腸・大腸菌（E.coli）及びサルモ ネラ菌の細胞壁からのポリン（porin）プロテイン，ＨＩＶ−１のｇｐ１６０エ ンベローププロテイン（env-protein）の人工片並びに免疫グロブリンのＦ（ａ ｂ）２片（抗遺伝型タイプ（anti-idiotype）の反応を誘発するため）である。 例 最初の２つの例は、以下に示すように、２種のシンポルの作成・製剤を例示し たものである。 例１…シンポル１０００−２０／５０の作成 ３つのステップからなる手順・方法を用いてＮ−酸化エチレンピペラジンと臭 化Ｎ−アセチルエチレンピペラジニウムの共重合体を合成した。 （１）最初の（第１の）ポリマである１，４−エチレンピペラジンが第１ステ ップで合成された。このために、１，４−diazabicyclo[2.2.2]octane のリビン グ（living）チェーン重合化が下記のプロトコル（実験計画案・記録）に従って 行われた。 １０ｇの予備的に（前もって）昇華させたモノマと０．０５ｇの臭化アンモニ ウム臭化物を１０ｍｌのガラスアンプル（内）にシールした。真空ポンプを使っ て、残留圧が５×１０^-3ｍｍＨｇの真空をアンプル内で作った。このアンプルを サーモスタット（恒温器）内で２００℃に２５時間さらした。ポリマ収率は約１ ００％であった（Ｍ．Ｗ．１２００００）（ＬＡＬＬＳローアングルレーザ光散 乱により評価した）。Ｍ．Ｗ．は、分子量の略である。 （２）第２ステップにより、ポリ−１，４−エチレンピペラジンのＮ−酸化物 を作った。 ５ｇのポリ−１，４−エチレンピペラジン（Ｍ．Ｗ．１２００００，ｎ＝１， ０００）を２５０ｍｌの１％酢酸溶液内で溶かした。その後、４ｍｌの３０％Ｈ₂ Ｏ₂を加えた。酸化は３６時間続いた。限外濾過及び凍結乾燥の後、ポリ−１， ４−エチレンピペラジンのＮ−酸化物（Ｍ．Ｗ．１１００００，ｚ＝０．５ｎ） が得られた。 （３）上記ポリ−Ｎ−酸化物のアルキル化が第３ステップ中に行われた。 第２ステップ中に生成されたＮ−酸化ポリ−１，４−エチレンピペラジンを１ ２５ｍｌのメタノール内で溶し、１６．５ｇのブロム酢酸が加えられた。アルキ ル化反応は１０時間２５℃で行われた。溶剤・溶媒を真空で蒸発・脱水させ、沈 殿物・堆積物（deposit）を水に溶かし、水に対して２４時間濾膜分析・透析し 、凍結乾燥により乾燥させた。最終的に、下記の（化学）式を有する臭化Ｎ−ア セチルエチレンピペラジニウムとＮ−酸化エチレンピペラジンの共重合体が得ら れた（図２参照）。 収率（yield）は９５％だった。酸化比は染料（有色化合物）を用いた方法（ 又はチタン滴定）により評価し、また、２．５−４．５m.d.域のＰＭＲスペクト ルバンドの積分強度（全体強度）の比により評価した。染料又はチタン滴定方法 とは、二価クロム又は三価チタン塩により還元されたＮ−酸化物族の量を決定・ 判定する方法を意味する（Brooks,R.T．and P.D.Sternglanz,Anal.Chem.,1959,v .31,N4,p．561-565）。酸化比はｚ＝０．５ｎだった。アルキル化比はＩＲスペ クトラ（１７３５ｃｍバンド）とＰＭＲスペクトラ（２．５−４．５m.d.域）に より決定・測定したところ、ｑ＝０．２ｎだった。 例２…シンポル２００−３５／６５の作成 Ｍ．Ｗ．２５０００（ｎ＝２００，ｑ＝０．３５ｎ，ｚ＝０．６５ｎ）を有す る臭化Ｎ−アセチルエチレンピペラジニウムとＮ−酸化エチレンピペラジンの共 重合体を、例１と同様の３ステップからなる方法を用いて合成した。 （１）第１ステップでは、１０ｇの予備的に（前もって）昇華させたモノマと ０．１１ｇの臭化アンモニウムを１０ｍｌのガラスアンプルにシールした。その 後、真空ポンプにより真空状態（５×１０^-3ｍｍＨｇ）をアンプル内に作った。 そして、アンプルを２００℃に１５時間保持した。ポリ−１，４−エチレンピペ ラジンの収率は約１００％であった（Ｍ．Ｗ．８００００）（ＬＡＬＬＳにより 計測した）。 （２）第２ステップでは、ポリ−１，４−エチレンピペラジンのＮ−酸化が以 下の様に行われた。 第１ステップで得られた５ｇのポリ−１，４−エチレンピペラジンを２５０ｍ １の１％酢酸溶液内で溶かした。その後、緩やかな攪拌により４．６ｍｌの３０ ％Ｈ₂Ｏ₂を２−４℃で加えた。酸化は４８時間続いた（続けた）。その後、限外 フィルタ（ultrafilter）により洗浄を行なって凍結乾燥をした後に、ポリ−１ ，４−エチレンピペラジン（Ｍ．Ｗ．５００００，ｚ＝０．６５ｎ）が回収され た（recovered）。 （３）上記ステップ（２）で作られたＮ−酸化ポリ−１，４−エチレンピペラ ジンを１２５ｍｌのメタノール中で溶かし、その後、１６．５ｇのブロム酢酸を 加えた。アルキル化反応が３０℃で２４時間行われた。溶剤を真空中で蒸発させ 、その結果出来た沈殿（堆積）物を水に溶かし、水に対して２４時間濾膜分析・ 透析（dialyze）を行い、凍結乾燥させた。下記の（化学）式を有する臭化Ｎ− アセチルエチレンピペラジニウムとＮ−酸化エチレンピペラジンの共重合体が得 られた（図３参照）。 収率は９５％だった。酸化及びアルキル比は例１と同様に評価され、それぞれ ｚ＝０．６５ｎ及びｑ＝０．３５ｎであった。 次の４つの例は本発明の範囲内にある化合物の製剤・作成を例示したものであ り、ヒアルロニダーゼと種々の免疫刺激担体（即ち、上記例１及び例２で対象と していたタイプのシンポル）の種の反応生成物から成るものである。 例３…シンポル１，０００−２０／５０にヒアルロニダーゼ（ＨＹＡ） を共有結合的に結合したもの（共役させたもの）の作成 ＨＹＡをシンポル１０００−２０／５０に結合したもの（共役させたもの：co njugate）を合成すべく、アジ化物方法（azide method）を用いた２つのステッ プから成る手順・手法を実施した。 （１）第１ステップを用いてシンポル１０００−２０／５０のヒドラジドを作 った。 Ｎ−酸化エチレンピペラジンと臭化Ｎ−［エチルアセチル］エチレンピペラジ ニウムの共重合体（ｎ＝１０００，ｑ＝０．２０，ｚ＝０．５）を上記例１に示 した方法に基づいて合成した。但し、第３ステップにおいて１つ異なることがあ る。即ち、アルキル化の際にブロム酢酸の代わりにブロム酢酸のエチルエステル を用いた。 ５００ｍｇの上記共重合体を２５ｍｌのメタノール中で溶かした。その後、０ ．２ｍｌのヒドラジン水和物（水化物）（０．２ｍｍｏｌ）が加えられ、反応は ２４時間２０℃で続いた。メタノールが蒸発した後、反応生成物が得られ、これ を水に溶かした。その後、エーテル抽出が行われ、主な生成物が限外濾過によっ て分離されて中空ファイバ（Amicon）上に置かれ、凍結乾燥させられた。 ２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸により第一次アミノ基を判別する ために、変性・変態・修正（modified）共重合体のヒドラジド基の中身・内容を 通常・従来の方法により評価した。（S.L．Snyder and P.Z．Sobooinsky,“Impr oved 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid method for determination of amin e,”Anal.Biochem.,1975,v.64,N1,p.284-288） （２）第２ステップでは、シンポル１０００−２０／５０のヒドラジドとＨＹ Ａとの縮合・凝縮・凝結（codensation）反応を生じさせて、プロテインとポリ マとの共有結合的結合（共役）体を作った。 これを達成するために、１００ｍｇのシンポル１０００−２０／５０のヒドラ ジドを４ｍｌの１Ｍ ＨＣｌ内で溶かした。溶液を攪拌し、０−２℃に冷却した 。また、同時に、１．１５ｍｌの３％亜硝酸ナトリウム溶液（０．５ｍｍｏｌ） が加えられた。１５分間で、活性化され（activated）シンポル１０００−２０ ／５０溶液のｐＨは、２Ｍ ＮａＯＨを用いて８．５に調整された。その後、１ ０ｍｌの０．０５Ｍ燐酸塩緩衝剤（ｐＨ８．５，燐酸（水素ニ）カリウム（pota ssium dihydrogen phoshate），燐酸（水素）ナトリウム二（disodium hydrogen phosphate）中に１２ｍｇのＨＹＡを入れた溶液を、上記の活性化したシンポル １０００−２０／５０の溶液に加えた。反応混合物を攪拌して冷却し（２−４℃ ）、ｐＨは２Ｍ ＮａＯＨを用いて１２時間の反応時間中、８．５に維持した。 反応混合物の成分を分別してＨＹＡとシンポルの結合体・接合体・共役体を精 製する（不純物を除去する）ために、Biogel P-100を用いたゲル濾過を利用した 。即ち、クロマトグラフィコラム（２６×９００ｍｍ）をBiorad Inc．から入手 可 能なBiogel P-100で満たし、０．０５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）と（を用いて ）０．０５Ｍ燐酸（塩）緩衝剤とにより平衡させた。分別したものを同じ緩衝剤 で溶離し・溶出し（elute）、出力はフローＵＶフォトメータ（flow UV-photome ter）（２２６ｎｍ）により制御された。得られた結合体・共役体（conjugate） は螢光分光器技術とポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、その プロテイン含有量を評価すると共に結合体・共役体を分析した。１ｍｇの結合体 ・共役体製剤には０．１０ｍｇのＨＹＡが含まれていることが示された。 例４…ヒアルロニダーゼ（ＨＹＡ）をシンポル２００− ３５／６５に共有結合的に結合・共役させた結合体 ・共役体の作成 Ｎ−酸化エチレンピペラジンと臭化Ｎ−アセチルエチレンピペラジニウムの共 重合体（Ｍ．Ｗ．２５０００．ｎ＝２００．ｑ＝０．３５，ｚ＝０．６５）を、 上記の例２で説明した方法に基づいて合成した。ＨＹＡを上記共重合体に結合・ 共役させる工程・手法は上記例３に記載されているものと同様である。ポリマを ＨＹＡに縮合・凝縮させる工程は、ポリマ対プロテインの比を５対１（ｐＨ＝８ ）として行った。最終的な製剤の共役・結合体は、１ｍｇの共役体に対して０． １５ｍｇのＨＹＡを含んでいた。 例５…活性（化された）エーテル方法を用いてシンポル １０００−２０／５０にヒアルロニダーゼ（ＨＹＡ） を共役・接合させること Ｎ−酸化エチレンピペラジンと臭化Ｎ−アセチルエチレンピペラジニウムの共 重合体（ｎ＝１０００，ｑ＝０．２ｎ，ｚ＝０．５）を、上記例１に基づいて合 成した。２つのステップから成る化学的手順を用いてＨＹＡと共重合体との共有 結合的結合体・接合体・共役体を作った。 （１）第１ステップでは、共重合体のスクシンイミドエーテルを準備した。こ のために、１００ｍｇの共重合体を４ｍｌのジメチルホルムアミド（dimethylfo rmamide）中で浮遊させ（懸濁させ）、攪拌中に、７７．２ｍｇ（０．３０ｍｍ ｏｌ）のジシクロヘキシド−カルボジイミド（dicyclohexid-carbodiimide）と ３６ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）のＮ−水酸化スクシンイミド（Ｎ−hydroxysucci nimide）が加えられた。反応は２４時間続き、この間、反応混合物（体）は攪拌 され冷却された（２−４℃）。反応混合物は、ダイオキシン，エチルエーテル及 びアセトンを用いて数回洗浄され、真空乾燥ボックス内で乾燥された。低分子混 合物・きょう雑物・混和材（admixture）が存在していないことが、ｎ−ブタノ ール対水対酢酸の比が４対１対１のＳｉｌｕｆｏｌプレートに対して（を用いて ）薄層クロマトグラフ法を適用することによって示された。その後、活性エーテ ル基の中身を標準的な方法で評価した。（T．Miron and M．Wilchex,Anal.Bioch em..1982,v.126,N2,pp.433-435）（0.1 M NH₃水溶液（pH=8.5,259nm）吸光係数 ＝９700 1/mol x cm）モル吸光係数「イプシロン：ε」は下記のランバート・ベ ール（Lambert-Beer）の公式により計算した。 Ｄ＝イプロシンｘＣｘＬ， ここで Ｄは、光学的密度の値 Ｃは、試験対象となった溶液中での化合物の濃度 Ｌは、光学距離・光路である。 活性エーテル基の中身は１ｇの変性・変態・修正（modified）共重合体当り９× １０^-4ｍｏｌであった。 （２）第２ステップでは、ＨＹＡを上記共重合体スクシンイミドエーテルに共 有結合的に接合・共役させることが行われた。このために、上記ステップ（１） で作られた活性共重合体を１００ｍｇだけ１０ｍｌの０．０５Ｍ燐酸緩衝剤溶液 （ｐＨ６．０）中で溶かし、冷却し、連続攪拌の間、１２ｍｌの０．０５Ｍ燐酸 緩衝剤（ｐＨ７．５）に溶かした１５ｍｇのＨＹＡの溶液が加えられた。縮合・ 凝縮（condensation）反応は１８時間０℃で続いた。その後、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ −１００（ＢｉｏＲａｄ）コラムに対してコラムクロマトグラフ法を適用するこ とにより共役体・接合体を反応混合物から分離し、分析した（上記例３で説明し たのと同様な方法で）。プロテインとポリマの共役体・接合体の最終的な製剤は 、１ｍｇの共役体当り０．１０ｍｇのＨＹＡを含んでいた。 例６…結合体・共役体・接合体中で２対１の比を有するように ＨＹＡをシンポルに共有結合的に接合・共役化させた製剤 シンポル１０００−２０／５０を上記例１に記載した方法に基づいて合成した 。ＨＹＡをシンポルに共役・接合・結合させる工程・方法は上記例３と同様であ るが、１つだけ異なる点がある。それは、反応混合物中でのＨＹＡに対するシン ポルの当初の比を２対１としたことである。最終的な共役・接合製剤は１ｍｇ当 り０．３ｍｇのＨＹＡを含んでいた。 例７…ワクチンの作成 作られたワクチンは、ＨＹＡとシンポルの共役・接合体と、免疫（性）アジュ バンド（immunoadjuvant）として働くシンポルそのものとから成る。 シンポル１０００−２０／５０を上記例１と同様に作った。ＨＹＡをシンポル に接合・共役・結合する工程は例３の場合と同様にして行ったが当初のポリマ対 プロテインの比を１対１とした。即ち、５ｍｇのＨＹＡを５ｍｇのシンポル１０ ００−２０／５０にヒドラジド方法（hydrazide method）で接合した。そして、 ４０ｍｇのシンポル１０００−２０／５０の水溶液を精製後の（不純物除去後の ）共役・接合体に加え、混合し、凍結乾燥させた。最終的な合成製剤のＨＹＡ含 有量を例３と同様な手法で分析したところ、１ｍｇの製剤当り０．１ｍｇのＨＹ Ａが存在していた。 例８…免疫アジュバントとしてムラミルジペプチド （muramyldipeptide）の派生物・誘導体（derivative） を含むワクチン複合体（vaccine complex） 作られたワクチン複合体はＨＹＡとシンポルの共役・接合体とムラミルジペプ チドのグリコサミニル（glycosaminyl）誘導体（公知の免疫アジュバンド）とか ら成る。 シンポル１０００−２０／５０を例１と同様に合成した。ＨＹＡとシンポルの 共有結合的共役・接合体は、ポリマ対プロテインの比を１対１つとして例３の手 法を用いて得た。即ち、５ｍｇのＨＹＡを５ｍｇのシンポル１０００−２０／５ ０に接合・結合した。その後、１０ｍｇのＮ−アセチルグルコサミニル−Ｎ´− アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（N-acetylglucosamin yl-N´-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine）（GMDP）が加えられ、複合 混合体を凍結乾燥した。 例９…免疫アジュバントとして水酸化アルミニウムを含有する ワクチン複合体（vaccine complex） そのワクチン複合体は、免疫アジュバントとしての水酸化アルミニウムとＨＹ Ａ−シンポル共役体・結合体とからなる。 シンポル１０００−２０／５０を、例１と同様にして得た。シンポルのＨＹＡ との共有結合体を例３で述べた方法を用いて作る際に、重合体とたんぱく質（プ ロテイン）の割合を１対１とした。共有体製剤は、動物に免疫を与える直前に準 備なしに水酸化アルミニウムの懸蜀液に完全に混ぜた。 例１０…Ｈ−ポリバックの病状発現前・臨床前の安全評価 Ｈ−ポリバックは、蠕虫のうち移動性のものに対する重合体と抗原とのワクチ ンである。このワクチンは、重合体免疫刺激性シンポルとヒアルロニダーゼ（Ｈ ＹＡ）との共役体・結合体である。このプロテイン抗原であるＨＹＡは、多くの 種類の幼生蠕虫に共通している。シンポルは、本発明者により開発され、徹底的 に研究された。この重合体は、１回に０．２５ｍｇ／ｋｇ服用しても人間の臓器 には安全であることが判明しており、したがって、おそらく、独立の免疫刺激剤 として、また、ワクチンのアジュバント若しくはキャリアとして推奨できる。免 疫生物学的薬剤の委員会は、共役体ワクチンの化合物としてシンポルを注射する ことを承認した。Ｈ−ポリバックの羊や子牛等の農業用の動物に対する好適な投 与量は、１頭当たり４ｍｇである（ＨＹＡ抗原を０．５ｍｇ含有する）。 この研究の目的は、Ｈ−ポリバックワクチンの毒物学的評価を行って安全性を 評価することにある。入手したデータの信頼性を増すために、研究は３種類の動 物（マウス、ラット、テンジクネズミ）について実施された。研究は、種痘・ワ クチン接種に近い投与による影響ばかりでなく、さらに、ワクチン接種投与の１ ０から１００倍もの過投与のもたらす効果についても行われた。毒物学的な研究 にあっては、過剰投与をすることによりターゲットとすべき臓器を特定できると 共に、用意された製剤の毒物学的特徴を見つけることができる。過剰注射の間に みられる病理上の変化は臨床での試行を禁忌すべき理由とは考えず、むしろ検査 された製剤の制限（限界）に関する価値ある情報をもたらすものである。 行っ たテストの詳細とそのテストにより得られたデータを示す前に、まず、データを 理解・説明するのに役立つ寸評を以下に述べる。下記の表８に示すように、対照 標準プラーシボグループのラットの１０から２０％のラットに肺炎、アテレクタ ーゼ及び肺膿瘍が発生した。大きな研究所の飼育設備で平均的な状態で飼養され ている大多数のラット、マウス及びその他の実験動物が完全に健康な状態でない ことは、動物病理学の専門家の間でよく知られた事実である。これら実験動物は 、事実、実験動物の内部組織と内臓に関する病理形態学的な試験をせずには通常 わからないさまざまな病気に苦しんでいる。 例えば、細菌が原因となる潜在的な感染は、実験動物において入念に研究され ている（K.Benirschke編集 ニューヨーク1978年 「Pathology of Laboratory Animals」）。（臨床上健康に）対照標準したラットに肺の疾患が発生する頻度 はかなり高い。Ｇ．ＰａｇｅｔとＰ．Ｌｅｍｏｎとによれば、９９パーセント以 上の対照標準した実験用ラットは肺に潜在的な病状を有している（W.Ribelin 及 びJ．McCoy 編集 スプリングフィールド1965年 「Pathology of Laboratory A nimals」 pp.382-405）。同じく、Ｊ．Ｎｅｌｓｏｎは対照標準した実験用ラッ トに８１パーセントの頻度で肺炎が発生することを証明した（E.Cotchin 及びF. Roe 編集 オックスフォード1967年 「Pathology of Laboratory Rats and Mic e」 p.259）。実験用ラットのいわゆる潜在的慢性呼吸器系疾患の病理形態学は Ｊ．Ｌｉｎｄｓｅｙその他（シカゴ1971年 「Disease of Laboratory Animals Complicating Biomedical Research」 pp.675-716）だけでなくＪ．Ｉｎｎｅｓ その他（Am.J.Path 1956年 v.32,pp.141-160 並びにE.Cotchin 及びF.Roe 編集 オックスフォード1967年 「Pathology of Laboratory Rats and Mice」 pp.2 29-259）によって説明されている。 Ｊ．Ｌｉｎｄｓｅｙ（前掲書中），Ｅ．Ｖｅｎｚｏｎその他（Philipp.J.Vet. Med.1979年 v.18,pp.117-124）及びＭ．Ｖａｎ Ｚｗｉｅｔｅｎその他（Lab.An im.Sci．1980年 v.30,pp.215-221）によれば、ラットの肺の隠された病理学上の 進行・過程は主に、マイコプラズマ肺炎ウイルス（Mycoplasma pneumoniae）， パスツレラ スパイラル（Pasteurella spiralis）若しくはマウス肺炎ウイルス によって引き起こされる。 臨床上正常なＷＡＧ（オーガスト（August）とウィスター（Wistar）とを同系 交配させたラット）についての広範囲の検査・調査及びロシア医科学協会（Russ ian Academy of Medical Sciences）の生産コロニーの非同系交配の動物につい ての広範囲の検査・調査により、４０−９６パーセントのラットが慢性呼吸器系 疾患による影響を受けていることが証明された。呼吸器官は上部呼吸系気管・気 管支において部分的又は全体的に慢性カタル、又はカタル性の化膿した炎症を起 こしていると共に、慢性の巣状の介在間質侵入型の肺炎（chronic focal inters titial pneumonia）を起こしていた（E.Abdrashitova,Bull.Acad.Med.Sci.Russ. 1993年 「Respiratory organs of rats bred in the production colonies」 N 9,81-85）。慢性の腸炎に関して、我々は正確な原因は確立していないが、それ らが隠れた感染症の症状であるらしいということに注目した。おそらく、これら の場合、それは上記のようにある種のバクテリアによって引き起こされた臨床上 の隠れた慢性の炎症であろう。 よって、いわゆる正常の動物がしばしば隠れた感染により苦しむことは、明白 である。これがほとんどの自然飼育場で見られる選択の余地のない生活環境のた めに起こるということは広く受け入れられている意見である。化合物についての 調査・研究作業と動物実験に関しては、上記状況は最適とはいえないが、本試験 における実験用の対照標準した動物については幾つかの良い点がある。つまり、 使用した動物は隠された感染により弱められているので、実験結果は、健康な動 物だけでなく弱った動物に対しての、Ｈ−ポリバック（１０倍の投与量で１０回 注射）の完全な安全性を証明したことになる。最後に、正常に感染された実験動 物についての実験結果は、実際の飼育場で得られたものに非常に近いということ を付け加える。 １．研究の素材と方法 Ｈ−ポリバックの症状発現前の安全評価は、マウスの腹膜内への注入中におけ る急性の毒性の評価と、ワクチン接種より１０倍高いＨ−ポリバックの注射を１ ０日間に亘って毎日継続する間の慢性的な毒性の評価とを含む。そして、末梢の 血液の分析、肝臓及び腎臓の機能上の検査、心臓血管組織の検査及び内臓の変化 に対する病理形態学的な分析が同時に行われた。そしてさらに、注射による局部 的な反応についての調査と、アレルギー性、突然変異性、発熱性及び発癌性の作 用についての調査とが実施された。 ４ｍｇ（１０〜１５ｋｇの羊には０．５ｇのたんぱく質となる）の薬を、１回 のワクチン投与量とした。 ２．Ｈ−ポリバックの急性及び亜急性の毒性の評価 Ｈ−ポリバックの平均的な致死量は、２５ｍｇを基準体重としたマウスへの短 時間の実験により判明した。動物は、それぞれ基準体重と１ｇと違わない、すな わち５％と違わないように体重にしたがって慎重に選別された。それぞれの薬は １６日の観察の間、６匹の動物に試された。死亡率の点検は、毎日行われた。 ２週間の観察が終了すると、動物達は殺され、動物達の臓器は形態学的な検査 を受けた。Ｈ−ポリバックのサンプルを生理的な溶剤に溶かした後、５％の溶剤 が準備され、３ｇ／ｋｇ、１．５ｇ／ｋｇ及び０．７５ｇ／ｋｇのワクチンを含 有する薬を腹膜（組織）内に注射した。 平均的な薬の致死量は、リッチフィールド（Litchfield）及びウィルコックソ ン（Wilcockson）のプロビット分析法を用いて測定された。この方法は、比較的 完全な情報が得られ、最も広く適用できる方法である。 表１のデータは、Ｈ−ポリバックＬＤ−５０が１．６６＋０．０４ｇ／ｋｇで あることを示している。 ３．Ｈ−ポリバックの注射に対する局部的な反応の評価 皮膚内の注射。Ｈ−ポリバックの注射に対する局部的な反応を評価する実験は 、ソビエト連邦厚生省指示番号３１で推奨される「Unification of Immunobiolo gical Drug Control Technｉques」の技法に従って行われた。 ５匹のテンジクネズミがこの実験に使われた。毛の取り除かれた異なる部分に １：１０と１：１００とに薄められた生理的な溶剤とＨ−ポリバック（０．１ｍ ｌ中８００ｍｇ）とが一度に０．１ｍｌ注射された。 観察期間は１ケ月であった。 結論：観察期間の間、明白な皮膚炎の徴候は現れなかった。 ４．Ｈ−ポリバックの亜急性の中毒性評価 その実験は、基礎体重が２７０−３２０ｇのウィスターラット（Wistar rat） の雄６０匹を用いて実施された。これらを２０匹ずつ３つのグループに分けた。 第３クループを対照標準グループとし、この対照標準グループには生理溶液を投 与したのに対して、第１グループには０．４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックを投与 し、第２グループには４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックを投与した。筋肉内にＨ− ポリバックを１０日間毎日注射した。Ｈ−ポリバックの投与終了直後に死亡する ものもあれば、投与後４週間生き延びるものもいた。標準体重評価・定期的な体 重評価のみならず、生理学的、生化学的、血液学的、更に組織学的試験も行われ た。その結果は、統計学上の方法によって評価した。 結果：観察期間（６週間）において、４ｍｇ／ｋｇ投与したものは０．４ｍｇ ／ｋｇ投与したものよりも体重の増加が少なかったが、対照標準のものと比較し て、Ｈ−ポリバックを投与したものには観察期間全体でも体重の変化に顕著な違 いは見られなかった（表４）。 ４．１．肝臓及び腎臓の機能上の試験 血清分析は、Ｆ−９０１生化学分析器（フィンランド製）とＬＡＨＥＭＡ診察 器具（ソ連製）を使用して行われた。その結果を表２に示す。表に示すように、 ０．４ｍｇ／ｋｇ服用後と４ｍｇ／ｋｇ服用後の両方共にいくらかのＡＬＴ機能 の増加が観測された（それぞれ１４．５％と１９％）。研究終了後４週間経過し ても、実験動物の血清の生化学的範囲は、対照標準動物の範囲と変わらなかった 。 腎臓機能を評価するために、毎日の利尿と利尿速度を検査した。加えて、腎糸 球体の濾過作用と経路再吸収（channel reabsorption）についても検査した。そ の結果を表３及び４に示す。得られたデータを分析すると、腎臓濾過膜浸透性、 経路再吸収及び腎糸球体の濾過作用のいずれにもＨ−ポリバックを２週間毎日注 射したことによる影響がなかったことがわかる。 ４．２．血液学的分析 ゴルヤエフチャンバ（Goryaev Chamber）を用いてヘモグロビン濃度、ヘマト クリット値、色素指数及び血球のヘモグロビン濃度だけでなく、赤血球数と全白 血球数も末梢血液の状態を評価するために測定した。色素指数を次のように規定 した。 血球中のヘモグロビン濃度を次のように規定した。 ここで、Ｈｔはヘマトクリット、Ｈｂはヘモグロビンを示す。 その結果を表５に示す。 対照標準グループと比較すると、４ｍｇ／ｋｇの１０倍服用したグループに関 してのみヘマトクリット値が著しく減少したことがデータに現れている。この減 少は、ラットに関するパラメーターの通常の生理学上の変化の限度を越えていな い。１０Ｈ−ポリバック注射直後と投与終了後１ケ月のどちらにも末梢血液にお ける顕著な異常は見られなかった。 ４．３．中枢神経系（ＣＮＳ）状態検査 実験は雄のウィスターラットを使って行われた。対照標準グループに生理溶液 を投与する一方で、筋肉内にＨ−ポリバックを１０日間毎日注射した。ＣＮＳの 機能状態におけるＨ−ポリバックの影響評価は、注射最終日の次の日とその１ケ 月後に実施された。 以下の試験を行った。 −− 定位・指向性反応（orientation reaction）と移動機能（locomotion act ivity）について。これらは中枢神経系状態と神経筋機能を表わす・反映する統 合的なパラメーターである。 −− “ホール（Hole）”反射運動について。これもまた定位性・指向性反応を 特徴づけるものである。 −− 脊髄“尾の弾き（tail flick）”反射運動について。これは動物の痛み認 知を特徴づけるものである。 −− “ひも（string）”試験。これは筋肉の緊張状態と運動状態の関係を特徴 づけるものである。 これらの試験により、中枢神経系状態の全てについて検査をすることができる 。（中毒学研究における動物の反射行動に関する方法論勧告、キエフ、１９８０ 年） その結果を表６及び７に示した。０．４ｍｇ／ｋｇ投与したグループと対照標 準グループとでは移動機能に統計上大きな違い（ｐ＜０．０５）があるけれども 、移動機能（レース(race)）の低下は投与終了後の両方のグループで現れた。回 復期間後にあっては、移動機能は対照標準と同様である。それ以外の試験に関し ては対照標準動物と比較して大きな違いはない。 ４．４．病理形態学的分析 病理形態学的分析はウィスターラットの雄を使って行われた。０．４ｍｇ／ｋ ｇ又は４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックが、１０回にわたって筋肉内注射された。 生理溶液を対照標準液として使用した。研究対象とした臓器は、Ｈ−ポリバック 注射直後（第１回目の実験２６匹）と、投与終了１か月後（回復期間をおいて、 第２回目の実験２５匹）の２度採取された。すべてのラットが首を切ることによ って犠牲にされた。 生化学分析のために、採血後に死体解剖が実施され、更に、内臓の重量、色、 血液充満レベル、血液機能性障害その他の異常の測定だけでなく、内臓、しょう 液膜及びくぼみ・腔・窩（cavity）の顕微鏡観察を行った。 下記の臓器・器官の組織学的分析を行うために、臓器・器官及び組織のサンプ ルを３６匹の動物から採取した（各組から６匹のラット）。その器官及び組織と は、注射された位置の、肝臓、腎臓、心臓、肺、睾丸、副腎、胸腺、脾臓、異な る位置のリンパ節、脳、脊髄、胃、腸、結腸、すい臓、甲状腺、脳下垂体、皮下 脂肪細胞及び注射された位置の筋肉である。全部の器官並びに器官及び組織サン プルが１０％のホルムアルデヒド塩水内に固定され（fixed）、洗われ、エタノ ールで処理され、そしてパラフィン中に置かれた。少なくとも２つの切断部位が ガラス板上に置かれ、ヘマトキシリン−エオシン染料で着色された。 感染と寄生虫病（上述）が対照標準動物の器官に非常に大きく広がっており、 病理学的及び反応についての変化は対照標準動物の器官に頻繁に観察された。従 って、それぞれの組の中に多くの異常が見受けられた。 ４．４．２．顕微鏡検査の結果 Ｈ−ポリバックを投与終了直後に死亡したもの（殺したもの）と４週間後に死 亡したもの（殺したもの）について、外部の検査時と死体解剖中に観察された変 化を表８と表９に示す。Ｈ−ポリバックを投与終了直後に死亡したものと４週間 後に死亡したものの検査部位の色や血液充満レベルは、対照標準パラメーターと 同じだった。表１０は第１回目の実験と第２回目の実験のラットの絶対的な内部 重量（absolute internal weight）のパラメーターを表している。Ｈ−ポリバッ クを４ｍｇ／ｋｇ投与したグループの鼠径部のリンパ節の重量は微少に増加した が、０．４ｍｇ／ｋｇ投与した第１回目の実験の組の脾臓重量は微少に減少した 。Ｈ−ポリバックの投与直後に犠牲になったものだけでなく４週間後に死亡した ものの内臓重量の相対指数も、対照標準動物の内臓重量の相対指数と似通ってい た（表１１）。ここで使った“内臓重量の相対指数”という表現は、それぞれの 動物の個々の内臓重量を体重で割ると共に１００％を掛けた比率の平均を表して いる。 Ｈ−ポリバックを注射した位置（皮下脂肪細胞、筋肉）を顕微鏡検査したが、 Ｈ−ポリバックの投与終了直後に死亡したものに血液機能性障害は現れなかった （第１回目の実験）。９匹の対照標準動物の内の１匹と０．４ｍｇ／ｋｇ投与し た組の８匹の内の１匹だけが皮下脂肪細胞に出血の跡を有していた。第２回目の 実験（回復期間）の中では皮下脂肪細胞の出血の跡は８匹の対照標準動物の内の １匹から観察された。上記２回の実験の全ての組において、炎症（赤み、浸潤物 ）の痕跡はなかった。 ４．４．３．顕微鏡検査結果注射位置 最初のシリーズ（対照標準グループ、０．４ｍｇ／ｋｇおよび４ｍｇ／ｋｇの 投与グループ）のラットにおける皮下細胞組織および臀部筋肉の組織変化検査中 に、微小循環系の異常は全く認められなかった。実験グループ及び対照標準グル ープにおいて、浮腫、皮下浸潤（subcutaneous cellular）および（皮下）生産 反応は全く無かった。 実験動物および対照標準動物のどちらにおいても、類壊死（死生）とジストロ フィー（栄養失調）によって起こる筋繊維の変化は観察されなかった。 対照標準ラットの筋組織に炎症の徴候は全く無かった。同時に、１回につき０ ．４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの投与を受けたラット６匹の内の３匹において 、中位の（moderate）単核の浸潤物が観察された。また、これらラットにあって は、単核白血球およびマクロファージが優勢であった・行き渡っていた。、また 、４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの投与を受けたラット６匹の内の４匹に、単核 浸潤物の数と大きさの両方において増加があった。細胞は、リンパ球が優勢にな り（行き渡っており）、血漿細胞が頻繁に検出されるという変化を受けていた。 Ｈ−ポリバックの投与終了の４週間後の注射跡位置での組織構造の検査中に、 僅かな（小さな）単核の浸潤物が、対照標準グループの内の１匹の動物だけに筋 組織中において観察され、また、１回につき０．４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバック の投与を受けたグループの内の１匹のラットにおいて、僅かな（小さな）単核の 浸潤物が筋組織の中に観察された。ジストロフィー（栄養失調）または類壊死（ 死生）によって起こる変化及び微小循環系の異常は全く認められなかった。体内器官（内臓） Ｈ−ポリバックの注射の終了。心臓 対照標準ラット６匹の内の１匹の心筋において、および１回につき０．４ｍｇ ／ｋｇのＨ−ポリバックの投与を受けたラット６匹の内の１匹の心筋において、 多くの小さな血管周囲出血が観察された。実験グループ及び対照標準グループに おける微小循環系の他の変化は、全く観察されなかった。 浮腫または細胞組織の間の腫れは全く無く、また、炎症性の浸潤または基質心 筋の（stromal myocardial）生産活動も全く無かった。筋源繊維の円盤状の分断 （disintegration）または筋細胞崩壊（myocytolysis）も全く観察されなかった 。 血管および毛細血管の充血は、全てのグループの肺において、時には出血を伴 って観察された。肺拡張不全（肺胞壁の部分痙縮（拘縮））はもちろん、小巣状 の肺気腫も、実験グループと対照標準グループの両方の動物の数匹において発見 された。複及び単核の浸潤物は、細胞組織の間に、両方のグループにおいて観察 された。また、気管支に付随したリンパ組織の適度の（moderate）作用（activi ty）が発見された。Ｈ−ポリバックは、１回につき０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍ ｇ／ｋｇの投与を行っても、微小循環系における鬱血（充血）事象の増加を引き 起こさず、また、ジストロフィー（栄養失調）や類壊死の徴候、及び炎症の徴候 は全く無かった。 微小循環系における変化は全く無く、また、ネフロンの糸球体及び細管におけ るジストロフィー（栄養失調）や類壊死によって起こる変化は無く、さらに、１ 回につき０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇの投与を行っても、炎症性の反応 の徴候は無かった。 肝臓の微小循環系における異常は、どのグループ（組）においても全く無かっ た。実験グループおよび対照標準グループの器官・臓器の構造は類似していた。 肝細胞において、ジストロフィー（栄養失調）によって起こる変化は認められな かった。実験グループ及び対照標準グループにおいて、類壊死の徴候は無かった にも関わらず、１匹の対照標準ラットに小さな壊死性の病巣があった。炎症性の 変化（網内系細胞の増殖や肥大、複・単核の浸潤物）は、試験グループの中に１ つも発現しなかった。 膵臓の微小循環系の変化は、検査した全ての動物においても全く無かった。外 分泌腺部（膵臓の腺房）の構造的変化は観察されなかった。１回につき０．４ｍ ｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの注射後における、ジストロフィ ー（栄養失調）、類壊死および炎症性の変化の徴候は無かった。食道および胃 １回につき０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの注射後に おける、微小循環系の変化は全く無かった。食道の上皮損傷の徴候は全く無く、 また、胃部の噴門、基底部、幽門における上皮損傷も全く無く、同様に炎症性の 反応も全く無かった。 小腸における慢性腸炎の徴候は、柔突起の肥厚、変形、および時には柔突起同 士の付着と一緒に、全ての対照標準動物において観察された。上皮のジストロフ ィー（栄養失調）、および柔突起基質の浸潤を伴う落屑が認められた。陰窩（cr ypt）破壊を伴った深在性の変化が、小腸の幾つかの部分において発現した。慢 性腸炎の発現は、軽度の萎縮性のものから重度の萎縮性のものまであった。対照 標準グループと比較すれば、１回につき０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇの Ｈ−ポリバックの投与を受けたグループにおける変化は全く無かった。大腸 １回につき０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの注射を受 けたグループおよび対照標準グループにおいても微小循環系の変化は全く無かっ た。大腸粘膜は無傷で、すべすべとなったように認められ、浮腫は無かった。柔 突起および陰窩上皮（crypt epithelium）の損傷、ジストロフィー（栄養失調） によって起こる変化、または落屑の徴候は全く無かった。上皮を再生させる活動 は、高くなったように見える。炎症性の浸潤物は全く無かった。 対照標準動物において、胸腺の微小循環系における変化は全く無かった。１回 につき０．４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの投与を受けた６匹の内の１匹のラッ トは、胸腺の皮質帯において出血があった。さらなる出血を伴う血管壁の浸透性 における増加は、１回につき４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの投与を受けた６匹 の内の３匹のラットにおいて見られた。このグループは偶発的な胸腺退縮の徴候 （皮質帯域の減少および結合組織域の増加に反映されている）を有しているよう であった。炎症性の反応は、検査したグループにおいて全く認められなかった。脾臓 １回につき０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの注射を受 けたグループ及び対照標準グループにおいて、微小循環系の変化は全く無かった 。 白色の肉質部（pulp）域が適度に・中位に（moderate）縮小するという傾向は、 胚種中央部の減少と共に、実験グループにおいて認められた。白色の肉質部の細 胞構造（構築）（胚中心部（胚中枢部）、Ｔ−従属（dependent）および周縁・ 末端域の割合）は、変わっていなかった。実験グループにおける機能ゾーンの活 動は、対照標準グループにおける機能帯の活動と違わなかった：免疫胚細胞およ び血漿細胞の数は、有糸分裂の数・形態および核凝縮がそうであったように、定 常的に低いままであった。ジストロフィー（栄養失調）、類壊死及び炎症の徴候 は、実験グループ及び対照標準グループのどちらにおいても全く無かった。腸間膜および鼠蹊部のリンパ結節（lymph nodes） 実験グループ及び対照標準グループにおいては、微小循環系における変化は全 く無く、また、ジストロフィー（栄養失調）、類壊死および炎症の徴候は無かっ た。スリーランクシステム（three-rank system）に基づいて評価された３タイ プの免疫（Ｔ−免疫、Ｂ−免疫、マクロファーガル免疫）の活動のパラメーター は、実験グループと対照標準グループの両方で類似していると共に、正常の範囲 内であった。大脳 大脳切開の組織学検査中に、対照標準グループ及び１回につき０．４ｍｇ／ｋ ｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの注射を受けたグループにおける微小循 環系の変化は全く見られなかった。脳室または髄膜の脈管における変化は全く無 かった。増殖した膠反応を伴う脳の皮質その他におけるニューロン（neuron）の 構造的変化は、観察されなかった。脊髄 １回につき０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの注射投与 を受けたグループ、または対照標準グループにおいて、微小循環系の変化は全く 無かった。前角（anterior horn）および後角、膠細胞、白質組織の構造的変化 、または炎症性の反応は全く認められなかった。下垂体 実験グループ及び対照標準グループにおいて、微小循環系の変化は全く無かっ た。１回につき０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの注射を 受けたラットの下垂体の細胞構造（腺下垂体、下垂体中枢、下垂体神経）は、対 照標準動物の下垂体の細胞構造と類似していた。ホルモン生産細胞の全てのタイ プが下垂体腺上皮に現れており、また、全ての検査グループにおいてジストロフ ィー（栄養失調）性、類壊死性及び炎症性の反応の徴候は全く無かった。甲状腺 全ての調査グループにおいて、微小循環系の変化は全く無かった。実験グルー プにおける甲状線機能ユニット（小胞）の組織構造は、対照標準グループにおけ る甲状線機能ユニット（小胞）の組織構造と違いが無かった。上皮細胞は単層の 立方体構造を有しているが、小胞は無液胞・無空胞化（nonvacuolized）コロイ ドで均質に満たされていた。甲状線細胞およびＣ−細胞には、ジストロフィー（ 栄養失調）の徴候が無く、また成長あるいは壊死の増加もない（ように見えた） 。対照標準グループ及び１回につき０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＨ− ポリバックの注射を受けたラットグループにおいて、炎症性の基質（stromal） の反応は認められなかった。副腎 １回につき０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの注射投与 を受けたグループ及び対照標準グループにおいて、微小循環系の変化は全く無か った。どちらの実験グループにおける機能域（皮質および脊髄ゾーン）の割合も 、対照標準グループにおける機能域に類似した割合のままであった。全ての検査 グループにおける分泌細胞中のジストロフィー（栄養失調）または類壊死によっ て起こる変化の徴候、または炎症性の反応は全く無かった。精巣 実験グループ及び対照標準グループにおける微小循環系の変化は全く無かった 。全ての調査グループにおける精巣上体の構造は無損傷のままであり、また、ジ ストロフィー（栄養失調）または類壊死によって起こる変化、精子形成上皮及び セルトリ細胞の落屑は全く無く、さらに、精液形成欠如は１つも無かった。ライ ジヒ細胞における病理学上の変化または細胞組織の間の間質性の炎症は全く発現 し なかった。 従って、病理形態学の分析により以下のことが実証された。 −− １回につき０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックを長期 的（常習的）に筋肉注射しても、ジストロフィー（栄養失調）および類壊死に起 因するる変化は検査した全器官・臓器において生じない。 −− 次の器官の微小循環系においては無視して構わない異常があった；１回に つき０．４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの投与を受けた１匹のラット（６匹の内 ）の胸腺および１回につき４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの投与を受けた３匹の ラット（６匹の内）の胸腺；１匹（６匹の内）の対照標準ラットの心臓および１ 回につき０．４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバックの投与を受けた１匹（６匹の内）の 実験ラットの心臓。 −− Ｈ−ポリバックの筋肉注射は、突発的・自発的な腸炎（spontaneous ente ritis）の発生の頻度および程度に影響しなかった。 −− 両方の実験グループにおける胸腺および脾臓の実質組織活動域（parenchy mal working area）（胸腺の皮質帯および脾臓の白色肉質部域）は、減少する傾 向があった。しかしながら、突発的慢性（spontaneous chronic）腸炎の成長の 結果として免疫系が活動するので、得られた結果のを解釈は難しい。回復期間 全ての検査グループにおける器官（上述したように小腸を除いて）において、 Ｈ−ポリバックの投与終了から４週間後に行われた組織構造の検査中に、微小循 環異常の徴候、ジストロフィー（栄養失調）または類壊死によって起こる変化及 び炎症性の反応は全く見られなかった。 肺拡張不全および小巣状の肺気腫は、実験グループおよび対照標準グループの （６匹の内の２匹のラットの）肺に観察された。 全ての検査グループにおける小腸において、突発的慢性腸炎の徴候が認められ た。上皮ジストロフィー（栄養失調）および落屑、並びに、柔突起基質の丸い細 胞浸潤が認められた。全ての検査グループにおいて、腸炎の程度は軽度のものか ら重度のものまであった。 非常に低い皮質活動を伴う老齢退縮の徴候は、全てのグループ（対照標準グル ープ、０．４ｍｇ／ｋｇおよび４ｍｇ／ｋｇの投与グループ）の胸腺において認 められた。 赤色肉質部内側における低程度の血漿細胞反応と、時折、骨髄外の造血巣（he mopoietic focuses）とを伴う脾臓の機能域の適度な活動が認められた。結論 Ｈ−ポリバックを１０回筋肉注射した動物に対して行われた病理学的分析の結 果によれば、１回につき０．４ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇのＨ−ポリバック を投与しても、全ての検査器官・臓器において、病理学上の変化は１つも生じな いということが証明された。 ５．アレルギー誘発性についてのＨ−ポリバックの実験試験 従来の実験では、シンポルの感作・増感作用(sensitization activity)の欠如 が例証されてきた。シンポルはここでタンパク質抗原と共に使用されるので、本 実験の目的はＨ−ポリバックワクチンをそのアレルギー誘発性に関しチェックす ることであった。 本実験はモルモット４０匹を、４つのグループに分けて行われた：第１グルー プは対照標準グループであり、第２グループにはタンパク質抗原、第３グループ にはシンポルそして第４グループにはＨ−ポリバックが１週間に１度２ｍｇ／ｋ ｇずつ皮下注射された。 皮膚（上）落下試験が２％のタンパク質とシンポルの水溶液を用いて行われた 。 酵素による加水分解準備のアレルギー誘発効果を評価するためのヒスタミン刺 激法（１９８０年にP.L.Zeltser 及びV.N.Drozdov により考案された）が、感作 反応を検知するために用いられた。この方法では試験される抗原を０．０３ｍｇ ／ｋｇのヒスタミンと共に腹膜内及び皮内に注射し、その後１．５〜２時間アナ フィラキシー反応が続く。この方法によると、ヒスタミンは、弱い抗原の感作特 徴をより迅速且つ顕著に反映するための血管アジュバンドとして機能する。二重 ロゼット形成反応及び細胞分裂促進剤で刺激されたロゼット形成反応（ＭＳＲＦ ）における異なるリンパ球集団の量的比率及び機能状態（表１２参照；なお、こ れ はDudintsava他によって１９８２年にモルモット試験用に修正されたものである ）が、免疫リンパ球に対するＨ−ポリバックの影響を決定するために、１０回の 実験及び３０匹の対照標準動物において評価された。 この結果によると、２％タンパク質抗原溶液の場合において、Ｈ−ポリバック 導入後の最初の数分間に、第一期刺激効果が血管拡張及び充血に反映された形で 生じただけであった。感作のより迅速なあるいは遅滞した進行を示す反応は皆無 であった。 これらの実験によって、（生物体としての）人間が高分子抗原ワクチンで治療 された後、感作もリンパ球の数量的もしくは機能的異常も進行しないであろうこ とが例証された。しかし、禁忌状態においては、血管に対するある種の逆効果を 考慮する必要がある。 ６．Ｈ−ポリバックの優性致死変異誘発能力の評価 本実験は、「新薬の突然変異誘発性に対する抑制・鎮圧に関する勧告」（１９ ８１年にソ連保健省により採択）に基いて実行された。 本実験は、精子形成の減数分裂前後の５週間にわたり継続された。Ｈ−ポリバ ックがマウス一匹当たり０．６ｍｇ及び一匹当たり３０ｍｇの２通りで腹膜内に 注射され、このようにＨ−ポリバック処理された雄に３匹の処女雌が投入された 。１８日後、雌のマウスは解剖されて、死亡した胎児及び生存している胎児の数 が考究された。 結論：Ｈ−ポリバックはマウスの胎児細胞に致死的突然変異を誘起しなかった 。またマウス一匹当たりの投与量３０ｍｇ（これは１．５ｇ／ｋｇに当たる）は ＬＤ−５０（１．６６＋０．０４ｇ／ｋｇに等しい）に近く、投与後第１日目に 投与された雄は死亡した。 ７．Ｈ−ポリバックの発ガン作用の評価 Ｈ−ポリバックの発ガン作用の評価は、「発ガン物質委員会」の勧告に従って 実行された。 本実験を行った理由は、高分子化合物シンポルがワクチン内に存在するという 事実があったからである。 本実験は、２種類の動物を用いて行われた。基礎体重が１５０〜１８０ｇの雌 のウィスターラット（Wister rat）４００匹、及び腫瘍を速やかに発達させる体 質(C57BI/6)のマウス４０匹であった。 生理含塩水に溶解した０．１％Ｈ−ポリバック溶液０．５ｍｌが週に２度、８ カ月間腹膜内に注射され、１４〜１５の異なる注射位置が各々２週間間隔で使用 された。動物は注射全体で１００ｍｇのタンパク質／ｋｇを摂取した。生理含塩 水が、対照標準動物に腹膜内注射により投与された。観察は基本的には動物が自 然死するまで継続された。その間ラットが（腫瘍による衰弱、病気により）死亡 すると、その腫瘍及び内臓は１０％のホルムアルデヒド溶液内に固定され、その 後腫瘍の大きさが測定されると共に内臓の顕微鏡写真が撮影された。 本実験は２年と１カ月続行した。対照標準グループにおいては、本実験開始後 ９カ月間の異なる時期に４匹のマウスに腫瘍が自然発生し、一方実験グループで は（腫瘍発生は）３匹であった。 実験グループにおいて、最初の腫瘍は対照実験グループのそれよりも半年遅く 出現した。腫瘍の発達の速度及びサイズもまた実験グループのラットの方が顕著 に低かった。Ｈ−ポリバックの発ガン性能をより明確にするために、Ｃ５７ＢＩ ／６マウスを用いて他の一連の実験が行われ、肺におけるルイス癌腫の発達に対 するＨ−ポリバックの影響を評価した。 マウスは、その体重（１６ｇ）を基準に注意深く選択され、各グループ１０匹 ずつの４グループに分割された。表皮性ルイス肺癌腫が、溶媒１９９に溶かした １：１腫瘍溶液を０．５ｍｌ皮下注射することにより全動物に移入された。 第１グループは対照水準グループであり、第２及び第３グループは５ｍｇ／ｋ ｇのＨ−ポリバックを（癌腫移入の）４８時間後に腹膜及び皮下注射により投与 された。一方、第４グループは、２．５ｍｇ／ｋｇの担体（溶媒）を皮下注射さ れ、これは第２及び第３グループのマウスに投与された担体の量に一致する。こ の投与は毎日、計５日間継続された。 各個体の体重及び腫瘍の大きさは、腫瘍移入の１週間後、即ちＨ−ポリバック 投与５日目の終わりに測定された。マウスは殺された後体重を測定された。その 腫瘍は体積を測定された後で分離され、重さが測定された。その結果が、表１４ に記載されている。表１４によると、Ｈ−ポリバックの場合と担体のみの場合の 両方で、腫瘍の発達が（重量比で）４３〜２８％減少している。腫瘍の大きさ及 び重量は、対照水準グループと比較すると、全実験グループにおいて顕著に低い 。 恐らく、高分子免疫刺激剤シンポルは坑腫瘍作用を有していると思われる。こ れらの特徴は、高分子−抗原間の共役結合においても維持あるいは増幅されてい る（表１４，２，４列） ８．結論 Ｈ−ポリバックの完全な前臨床安全評価研究がロシア保健省の薬事診断方式実 験室において実行された。 Ｈ−ポリバックは、タンパク質抗原と高分子免疫刺激剤シンポルとの複合体で ある。Ｈ−ポリバックは、体内移行形態の蠕虫に対するワクチンとして（宿主の ）動物の体重１ｋｇ当たり０．０５ｍｇタンパク質重量を投与するのが望ましく 、またこれはＨ−ポリバックの０．４ｍｇ／ｋｇ筋内注射２回分に相当する。 Ｈ−ポリバックの安全評価は、「獣医薬理学委員会」の要求条項（１９７４） 並びにソ連保健省薬理学委員会の要求条項（１９８３年１２／３１指令）に従っ て実施された。 本実験は各種の動物を用いて行われた。内訳はマウス（ＣＢＡ及びＣ５７ＢＩ ／６系統）２２０匹、ウィンスターラット１８０匹及びモルモット８５匹である 。 その結果により、Ｈ−ポリバックは実質的に毒性のない物質であり（ＳＯＳＴ １２．１．０７−７６によると危険度クラス５），腹膜内注入時ＬＤ−５０は １．６６＋０．４ｇ／ｋｇであることが例証された。 Ｈ−ポリバックの慢性的な毒性は、これを０．４ｍｇ／ｋｇまたその１０倍の ４ｍｇ／ｋｇ毎日連続してワクチン注射することにより試験された。 血液学、生理学的、生化学的及び免疫学的分析によれば、Ｈ−ポリバックは動 物の体重、行動、中央神経系統、心血管系統、肝臓及び腎臓機能もしくは血液に 対して全く悪影響を及ぼさなかった。 病理形態学的分析によると、病理学的変化はどの内臓器官及び組織においても 全く判明しなかった。アレルギー作用、免疫毒素作用及び突然変異誘発作用がな いことのみならず、注射位置における炎症作用もないことが確認された。 Ｈ−ポリバックの長期間の投与（８カ月）及び２．２年間にわたる動物個体の 観察において、発ガン作用は全く検知されなかった。 ゆえに、Ｈ−ポリバックの安全性評価研究の上記結果により、Ｈ−ポリバック の安全性及び広範な治療比率範囲（４００以上）が実証された。Ｈ−ポリバック を治療上４ｍｇ／ｋｇ投与することは、絶対的に安全であるとみなしてよい。 例１１…実験及び放牧地試験 本発明のワクチンの実施例の効果を評価するため、一連の実験及び放牧地試験 が旧ソ連で行われた。この例で用いられる「Ｈ−ポリバック」という用語は、本 発明のワクチン組成物のことである。 １．イヌサナダ（Echinococcus granulosus）を用いた実験的攻撃に対してＨ− ポリバックがもたらした保護 １．１．序論 イヌサナダ（Echinococcus granulosus）のライフサイクルは連続した複数の 段階から成り、第１段階は犬の体内において開始され次いで羊、豚もしくは人間 の体内に移行する。イヌサナダはその成長段階のうちの２つの段階（各々特有か つ異なる形態を有する）において上記種の動物体内において寄生者として生活す る。テープ状の形をした頭節（scolex）は犬の腸内で生活する。そのテープ状体 部の最後節（イヌサナダの約千個のオンコスフェーラ卵（onchospherea）を内包 する）は蠕虫本体から分離して宿主の糞内に散布される。イヌサナダのオンコス フェーラ卵は、羊、豚もしくは人間の体内に口から侵入する。嚢(Cysta)形を有 するエキノコックス(echinococcus)は、その後上記の種の動物もしくは人間の肝 臓及び・もしくは肺に損傷を引起こす。エキノコックスに対するＨ−ポリバック ワクチンの効果を評価するために、（その一つである）イヌサナダによる動物に 対する人為的攻撃と同蠕虫の動物体内への自然侵入の両方が調査された。犬は原 始頭節（protoscolices）を用いて人為的に感染させられ、一方仔羊及び仔豚は イヌサナダのオンコスフェーラを用いて感染させられた。 １．２．イヌサナダ（E.granulosus）による実験的攻撃を受けた犬に対する保護 第１に、Ｈ−ポリバックにはイヌサナダ（E.granulosus）に対する保護効果が あるか否かを判断し、また犬に対する効果的な投与範囲を大まかに見積もる必要 がある。 第１の実験（生後３カ月の犬２４匹を使用）において、０．５ｍｇから５０ｍ ｇの範囲のＨ−ポリバックが調査された。３つに分けられたグループ（各グルー プが６匹の犬から成る）に、各々０．５ｍｇ，５ｍｇもしくは５０ｍｇのＨ−ポ リバックが２回筋内注射された。追加免疫注射が第１回目の２１日後に行われた 。プラシーボグループである残りの６匹は０．９％ＮａＣｌ水溶液を注射された 。追加免疫注射の２週間後に２４匹の犬の各々をイヌサナダの原始頭節（protos colices）１６０００個体に経口で感染させた。１カ月後使用された全ての犬を 屠殺して解剖し、その腸に寄生しているイヌサナダ蠕虫の数が得られた。 表１５に表されている結果は、犬に予備的な免疫注射を施すことで犬のイヌサ ナダの侵入に対する抵抗力が顕著に強化されることを明確に示している。Ｈ−ポ リバックにより免疫処置を施された犬の腸内で発見されたエキノコックスの数は 、プラシーボグループの腸内で発見されたエキノコックスの数の１／１５〜１／ １２０であった。また、保護の度合は明らかにＨ−ポリバック注射量に依存して いた。Ｈ−ポリバックを約５ｍｇの範囲で注射するのが、犬を２度の注射により 免疫化する場合最適のようであった。 次の実験の目標は、エキノコックスに対するＨ−ポリバックの保護効果を再測 定することと、Ｈ−ポリバックを５ｍｇ前後のどの値で注射するのが最適である かを調査することの両方であった。これらの目的のため、今回は４つの独立した グループ（各グループが３匹の犬を含む。計１２匹）が使用された（表１６）。 第１グループの犬は４ｍｇ（ｉ／ｍ）のＨ−ポリバックを２度投与され、この第 １次免疫処置と第２次免疫処置との間に２１日間の間隔が置かれた。第２グルー プの犬は８ｍｇのＨ−ポリバックを２度注射された。第３グループの犬はまず４ ｍｇのＨ−ポリバックを注射され、次いで８ｍｇを追加注射された。第４グルー プの犬は塩水を注射され、プラシーボ対照標準として使用された。追加免疫処置 の２週間後、使用された全ての犬はイヌサナダの原始頭節（protoscolices）を 個体数５０００経口投与され、これに人為的に感染させられた。１カ月後、上記 犬は屠殺、解剖され、投与の結果としてのイヌサナダ侵入度は、腸内のイヌサナ ダの数を計上することにより測定された。 得られた結果が表１６に表されており、先述の実験データを確認するものとな っている。この結果により、第１に犬をイヌサナダによる激しい侵入から保護す ることにおいてＨ−ポリバックが優れた効力を有すること、第２に５〜１０ｍｇ のＨ−ポリバックを注射するのが犬の筋内注射による免疫化には最適であること が例証される。実際、Ｈ−ポリバックを注射されなかった第４グループの対照標 準グループの犬たちはひどい侵入を受け、各々腸内に約２０００のエキノコック スを持っていた。逆に、４ｍｇＨ−ポリバックを２度注射された第１グループの 犬は（第４グループの犬と比較して）１／１００〜１／３００のエキノコックス しか持っていなかった。Ｈ−ポリバックの注射量を８ｍｇに増加すると、エキノ コックスに対する保護効力が増大した。（８ｍｇ＋８ｍｇ）のＨ−ポリバックに より免疫化された第２グループ及び（４ｍｇ＋８ｍｇ）のＨ−ポリバックにより 免疫化された第３グループの犬の腸内には、各々ごくわずかな数（０〜３）のエ キノコックスしか発見されなかった（表１６）。 １．３．イヌサナダ（E.granulosus）による豚への実験的攻撃に対するＨ−ポリ バック 全体で４０匹の仔豚（生後１カ月）が各グループ１０匹ずつの４グループに分 けられた。第１，第２及び第３グループの全ての豚に５ｍｇのＨ−ポリバックが ２度注射された。Ｈ−ポリバックの最初の注射の７日後（第１グループ）、１４ 日後（第２グループ）あるいは２１日後（第３グループ）に追加注射が行われた 。第４グループの１０匹の仔豚はＨ−ポリバックの代わりに塩水を注射された。 追加注射の２０日後に、全ての豚はイヌサナダ（E.granulosus）のオンコスフェ ーラ（onchospherea）１００００個の経口投与により、人為的にイヌサナダの攻 撃を受けた。７カ月後、豚は屠殺され、肝臓内の嚢状のエキノコックスの数が計 上された。 プラシーボグループ（第４グループ）の全ての豚はエキノコックスの侵入を受 けた。１５〜２０ｍｍ程もある大型の嚢状のエキノコックスが発見され、蠕虫の 数は肝臓１個当り８〜１２であった（表１７）。これとは逆に、Ｈ−ポリバック を注射された豚の大部分からはエキノコックスが全く発見されなかった。第１， 第２及び第３グループの豚において、各々７０％，９０％，８０％の豚が全くエ キノコックスの侵入を受けなかった。さらに、上記グループにおいては蠕虫が発 見された場合でも、その数は肝臓１個当りの嚢状エキノコックス１〜４個であっ た。また、Ｈ−ポリバックにより免疫処置を施された豚において発見された蠕虫 の幼態は非常に小型であった（約２〜３ｍｍ）。 表１７に示されたデータによって、Ｈ−ポリバックの第１回目の注射と第２回 目の注射との間の表に記載の諸間隔のうち、１４〜２１日間の間隔が仔豚の免疫 処置のために望ましいことが明らかに例証されている。 得られたデータにより、豚において実験的に誘発された包虫症（echinococcos is）に対する防御に関してＨ−ポリバックが高い効力を有することが明らかに示 されている。さらに、上記結果により、Ｈ−ポリバックによる仔豚の効果的予防 接種のための注射量及び予防注射スケジュールの両方が確立された。 １．４．羊に対するイヌサナダ（E.granulosus）による実験的攻撃からの防御 生後２〜５カ月の仔羊が、この調査において使用された。３つの独立した実験 （各々１２，２０，２０頭の羊を使用）が行われた。 第１の実験はＨ−ポリバックの２通りの注射量、即ち５ｍｇ及び１０ｍｇ（こ れらは犬及び豚に対して効果的注射量であると判明した）を羊において試験する よう構成された。１２頭の仔羊（各生後３〜４カ月）が各グループ４頭の３つの グループに分けられた（表１８）。第１グループの羊は、Ｈ−ポリバック５ｍｇ を１回目の注射と追加の注射との間に２１日間の間隔を置いて２回筋内注射する ことにより免疫処置を施された。同様に、Ｈ−ポリバック１０ｍｇが第２グルー プに２回投与された。残りの４頭はプラシーボ（対照標準）グループとして用い られ、０．９％のＮａＣｌ水溶液を注射された。 ２回目の免疫注射の２週間後、使用された全ての羊はイヌサナダのオンコスフ ェーラ１００００個の経口投与によりイヌサナダに感染した。４００日後、３つ のグループの羊は全て屠殺、解剖され、その肝臓及び肺内の嚢状のイヌサナダの 数が数えられた。 得られた結果が表１８に表されており、これにおいてプラシーボグループの羊 がひどい侵入を受けていることが明確に理解される。多数のイヌサナダの包虫（ hydatid cysts）がこのグループの羊の内臓において発見された（平均値＝８８ ／羊）。Ｈ−ポリバックにより免疫処置を施された羊は、その内臓内のエキノコ ックスの数がプラシーボグループの羊の１／８〜１／１５であった。また、Ｈ− ポリバックで免疫処置された羊において発見された嚢状のエキノコックスの大き さは１〜２．５ｍｍであり、これに対して免疫処置されなかった対照標準グルー プの羊において発見されたものの大きさは４〜９ｍｍであった。 続いて行われた同様の実験は生後３カ月の仔羊２０頭を使用し、これらの羊が ３つのグループに分けられた。８頭の羊がＨ−ポリバック５ｍｇを２１日間の間 隔を置いて２回筋内注射（ｉ／ｍ）することにより免疫処置された（表１９）。 別のグループの８頭の羊にはＨ−ポリバック５ｍｇが２１日間の間隔を置いて２ 回皮下注射（ｓ／ｃ）された。最後に、残りの４頭の羊には０．９％ＮａＣｌ水 溶液が皮下注射され、プラシーボ（対照標準）グループとして用いられた。（第 ２回目の）追加免疫注射の２週間後、全ての羊はイヌサナダのオンコスフェーラ １００００個によりイヌサナダに感染した。表１９に表された本実験の結果は第 １の実験の結果に極めて類似している（表１８参照）。 表１９の結果は、（Ｈ−ポリバック５ｍｇを２度繰返し注射することにより行 われる）上記免疫処置が、羊を１００００個のイヌサナダのオンコスフェーラに よる実験的攻撃から保護するに当り優れた効力を有することを示すと共に、Ｈ− ポリバックの筋内注射(i/m)及び皮下注射(s/c)がどちらも予防接種の方法として 受容できることをも示している。 第３の最終実験においては、生後４．５カ月の仔羊２０頭が表２０に表されて いる実験計画案に従い３つのグループに分けられた。Ｈ−ポリバックに関して、 ２つの異なるロットが免疫処置のため使用された。第１グループの８頭の羊は、 第１ロットのＨ−ポリバック５ｍｇにより２回免疫処置された。第２グループの ８頭の羊は、第２ロットのＨ−ポリバック５ｍｇにより２回免疫処置された。残 りの４頭の羊はプラシーボ（対照標準）グループとして用いられた。そして（第 ２回目の）追加免疫注射の２週間後、２０頭の羊全部がイヌサナダのオンコスフ ェーラ１００００個の経口投与によりイヌサナダに感染させられた。 上記のイヌサナダによる攻撃の４２５日後、全ての羊は屠殺、解剖され、その 肝臓及び肺内部の蠕虫の数が数えられた。得られた結果により、イヌサナダの多 数の六鉤幼虫（オンコスフェーラ）による実験での攻撃に対し羊を保護する上で のＨ−ポリバックの優れた効力を再確認できる（表２０）。実際、プラシーボ（ 対照標準）グループの羊はイヌサナダにひどく侵入され、肝臓及び肺内部に多数 のイヌサナダ（平均値＝６５蠕虫／羊）を有していた。Ｈ−ポリバックの第１， 第２ロットの両方（５ｍｇずつ２回筋内注射された）が、イヌサナダの攻撃に対 する羊の抵抗力を大きく増進させた。これらの羊のうち何頭かは（第１グループ においては８頭のうち３頭、即ち３７．５％）、その内臓に全くイヌサナダを有 していなかった。免疫処置を施された羊のうち残りのものは少数の嚢状のイヌサ ナダ（平均値は第１，第２グループにおいて各々３，２．５／羊）を肝臓及び肺 に有していた。さらに、Ｈ−ポリバックで免疫処置された羊において発見された 蠕虫の包虫（hydatid cysts）のサイズ（２〜３ｍｍ）は、対照標準グループの 羊において発見された包虫のサイズ（５〜７ｍｍ）よりも小さかった。 １．５．実験による犬、豚及び羊の包虫症に対するＨ−ポリバックの保護効力に 関する結論 （条項１．１−１．４において上記のように見直された）多数のイヌサナダを 投与して人為的にイヌサナダに感染させた動物におけるＨ−ポリバックの作用に 関する調査により、以下の結論が導き出せる：（ａ）犬、羊及び豚に対する予備 的な免疫処置は、イヌサナダの侵入に対する動物の抵抗力を顕著に増大させる； （ｂ）Ｈ−ポリバックによる免疫処置は、上記各種の動物を強烈且つ集中的なエ キノコックスの攻撃（本実験では何千もの侵入力の強い蠕虫を用いて動物を人為 的且つ急に攻撃することによりこれを模擬している）からも保護する；（ｃ）イ ヌサナダに対するＨ−ポリバックの保護効果は、Ｈ−ポリバック投与（の仕方） に強く依存している。５〜１０ｍｇのＨ−ポリバックを第１回目の注射と第２回 目の追加注射との間に１４〜２１日間の間隔を置いて２回筋内もしくは皮下注射 するのが、仔犬、生後１カ月の仔豚もしくは生後３〜５カ月の仔羊のどれを免疫 処置するにも最適であると判明した。 ２．ディクチオカウルス・フィラリア（Dictyocaulus filaria）を用いた実験的 攻撃に対しＨ−ポリバックがもたらした保護 Ｈ−ポリバックに含まれているヒアルロニダーゼ抗原は他種の蠕虫にも共通し て存在するので、エキノコックスに対してだけでなく他種の蠕虫に対してもＨ− ポリバックの保護作用が期待されることになる。本明細書の当セクションは、多 数のディクチオカウルス・フィラリア（D．filaria）に羊を人為的に攻撃させ、 これに対する羊の抵抗力という点で羊におけるＨ−ポリバックの保護効果を評価 しようとした調査が記載されている。この蠕虫はその第３段階幼生（Ｌ３）時に 侵入力を有し、動物体内に経口で侵入し感染する。蠕虫はその後、腸壁を通過し 、宿主体内を移動して最終的に肺に達する。蠕虫は肺で数週間を過ごして成長し 、成熟段階に至る。肺の組織内部で成長する肺虫は成熟すると３〜１０ｃｍにも なり周囲の微環境を破壊するので、結果として肺炎、肺拡張不全及び肺膿瘍を引 起こす。ディクチオカウルス・フィラリアのライフサイクルを考慮に入れ、実験 による攻撃において羊はＬ３幼生５００個により口径感染させられ、その２カ月 もしくは３カ月後に肺内部のディクチオカウルス・フィラリアの数が数えられた 。 全体では、人為的にディクチオカウルス・フィラリアに感染させた状況におい て、Ｈ−ポリバックを用いた３つの独立した実験が行われた。第１の実験では、 生後３〜４カ月の羊１２頭が使用された。これら羊のうち４頭には第１ロットの Ｈ−ポリバック５ｍｇが２回筋内注射され、一方、他の４頭の羊には第２ロット のＨ−ポリバックが同量注射された。１回目の注射の２１日後に２回目の追加免 疫注射がなされた。残りの４頭の羊はプラシーボ（対照標準）として用いられた （表２１）。 追加免疫注射の２週間後、羊はディクチオカウルス・フィラリアの幼生５００ 個を経口投与することにより人為的に攻撃された。２カ月後動物は屠殺され、羊 一頭当りのディクチオカウルス・フィラリアの数が数えられた。Ｈ−ポリバック を用いて羊に免疫処置を施すことにより、羊はディクチオカウルス・フィラリア による集中的な急性侵入（幼生５００個の経口投与）に対して抵抗性を持った。 上記攻撃の２カ月後、免疫処置を施された羊の約１５％は全くディクチオカウル ス・フィラリアを有していなかった。Ｈ−ポリバックにより免疫処置を施された 羊の残りのものには少数のディクチオカウルス・フィラリアによる侵入が見られ た（平均値約４ないし５蠕虫／羊）が、一方対応する対照標準グループの免疫処 置を施されていない羊はディクチオカウルス・フィラリアの甚だしい侵入を受け た（平均値＝６７蠕虫／羊）。 次の２つの実験（表２２に要約されている）により、表２１の結果と極めて類 似した結果がもたらされた。即ち、生後２〜３カ月の仔羊をＨ−ポリバック５ｍ ｇを用いて免疫処置（２１日間の間隔を置いた２回の筋内注射）することで、羊 はディクチオカウルス・フィラリアの幼生５００個による激しい攻撃から保護さ れた。 よって、Ｈ−ポリバックの保護的影響力はイヌサナダに限定されない。本例で 明らかに示されたように、Ｈ−ポリバックはディクチオカウルス・フィラリアの 羊に対する激しい侵入という実験モデルにおいても効果的である。調査された両 蠕虫において、同じＨ−ポリバック注射量及び免疫処置スケジュールが効果的で あると判明した。 ３．肝蛭（Fasciola hepatica）を用いた実験的攻撃に対してＨ−ポリバックが もたらした保護 生後３〜４カ月の仔羊が、以下説明される２つの実験において使用された。羊 は、表２３及び表２４に示されている実験計画書に従いＨ−ポリバック３〜１０ ｍｇを用いて免疫処置された。追加注射の２週間後、免疫処置された羊は、対照 標準（プラシーボ）グループの動物と共に、肝蛭（F.hepatica）の人為的な侵入 を受けた。この目的のため、侵入力のある幼態（メタケルカリア：metacercaria ）５０ないし１００個が経口投与された。５〜７カ月後、羊は屠殺，解剖され、 肝 臓内の肝蛭の数が数えられた。 得られた結果は、Ｈ−ポリバックの顕著な保護的影響力を例証している。Ｈ− ポリバック３乃至５ｍｇを２回繰返し注射することにより、１００個のメタケル カリアの経口投与といった激しい攻撃の後でさえ、宿主（羊）の体内で生き残っ た蠕虫の数は５０％減少した（表２３参照）。 攻撃に用いられたメタケルカリアの投与量が半分になると、Ｈ−ポリバックの 保護効果は９５−９６％に達した（表２４参照）。 実施された上記実験により、多数の肝蛭の人為的な攻撃に対する免疫防御をＨ −ポリバックが促進するという明らかな証拠が構成される。上記の条項１及び２ で見直されたデータと共に考慮されれば、各データはＨ−ポリバックが３種類の 異なる蠕虫、即ち肝蛭（F.hepatica），ディクチオカウルス・フィラリア及びイ ヌサナダのどれに対しても保護的効果を有すると共にまた、各々の種類ごとにそ の保護効果の特殊性が維持されることを示している。さらに、もしＨ−ポリバッ クで免疫処置を施すことにより多数の蠕虫を使用した集中的な急性攻撃から動物 が保護されたなら、自然条件で自然に蠕虫の侵入を受ける動物においても当然こ のワクチンの保護効果を期待できよう。Ｈ−ポリバックの放牧地試験は、この予 想が正しいことを示した。 ４．イヌサナダ，ディクチオカウルス・フィラリア及び肝蛭の自然侵入に対する 、Ｈ−ポリバック使用による複数の特殊性を有する保護 ある種の蠕虫の侵入が、ある動物農場及び／またはある動物飼育地帯に特有な ものとして発生することは周知である。幾つかの地域（もしくは農場）はディク チオカウルス・フィラリアの被害という点で望ましくなく、他は条虫類幼態の侵 入という点で、または肝蛭という点で、といった具合である。ここで、「望まし くない」という言葉は、毎年その農場／地帯で生まれる新世代の動物が同様の（ 嬬虫による）侵入を受けると共に侵入を被った動物の割合が非常に高いこと（し ばしば５０％以上）、ゆえに結果的にはその動物体に寄生している特定種の蠕虫 の数が、その動物に蠕虫病の臨床上の兆候を発症させるほど顕著に多いことを意 味する。これを考慮に入れ、Ｈ−ポリバックの本放牧地試験は、エキノコッ クス、ディクチオカウルス・フィラリアもしくは肝蛭に関して望ましくない様々 な動物農場及び地帯において行われた。本試験の期間中、（上記の）複数種の蠕 虫により侵入を受けた例も時として発生した。 ４．１．放牧条件下における羊及び犬へのサナダムシによる自然侵入の防止 第１の試験は、ソ連邦国家牧羊農場（中央カザフスタンのカラガンダ地方の“ Koyadinsky”農場）及び牧羊集団農場（モルドバのChadyr-Langoon地方の“Leni nsky Poot ”農場）で行われた。両農場共にエキノコックスに関して望ましくな い。実際、これらの農場の羊の６０％以上が通常エキノコックスの侵入を受けて いた。 表２５及び２６に示されている実験計画書に従い、生後２〜３カ月の仔羊計７ ５頭が“Koyadinsky”農場において使用され、また、１３５頭の仔羊並びに１１ 匹の牧羊犬が“Leninsky Poot ”農場において使用された。動物たちは第１ロッ トもしくは第２ロットのＨ−ポリバック５もしくは１０ｍｇにより２回免疫処置 された。これらの動物たちは、Ｈ−ポリバックによる免疫処置期間及び追加免疫 処置後の２週間を、所属する群れから分離して飼育された。その後、動物はその 所属する群れに戻り、エキノコックスに既に侵入されている動物たちと接触しな がら、通常の放牧条件下で生活した。“Koyadinsky”農場においては１年後、“ Leninsky Poot ”農場においては８カ月後、羊は屠殺され、その肝臓及び肺内部 のエキノコックスの数が数えられた。表２５及び２６から分かるように、対照標 準グループである免疫処置されていない羊はエキノコックスの甚だしい侵入を受 けた。逆に、Ｈ−ポリバックを用いて免疫処置された羊は侵入に対し顕著に抵抗 力があった。Ｈ−ポリバックにより保護された結果蠕虫の侵入を受けた羊の割合 は７８％から２６％に低下し、侵入された羊一頭当たりのエキノコックスの平均 値は、“Koyadinsky”農場で２５から２に、“Leninsky Poot ”農場で４．８か ら１．８に減少した。Ｈ−ポリバックの第１ロット及び第２ロットの間には、そ の保護効果において顕著な差異は見出だされなかった。 エキノコックスに加えて、関連のある他種の条虫（Coenurus cerebralis,Cyst icercus tenuicollis）が“Leninsky Poot ”農場で屠殺された羊において発見 された。表２６に表されたデータは、Ｈ−ポリバックによる免疫処置を施すこと でエキノコックスによる侵入のみでなくC.cerebralis及びC.tenuicollis による 侵入に対しても羊の抵抗力が増大することを示している。 “Leninsky Poot ”農場では、１１匹の牧羊犬が１３５頭の羊と共に、放牧地 で飼育された。犬たちは成犬であり既に条虫の侵入を受けていたので、Ｈ−ポリ バックによる免疫処置を施す前にその体内の蠕虫を駆除するべく、“Droncit ” という駆虫薬によって治療された。続いて、牧羊犬はＨ−ポリバック１０ｍｇ を２回（２１日間の間隔を置き筋内注射により）注射され、その後普段通りそれ らの監督する羊の群れと共に生活した。１１匹の犬の排泄物が毎月調べられ、犬 たちが再び条虫の再侵入を受けたかどうかが判断された。最終的には、Ｈ−ポリ バックによる免疫処置を施されてから８カ月後に犬に駆虫薬が投与され、条虫に よる侵害の有無が確かめられた。観察期間全体にわたって、Ｈ−ポリバックを注 射された犬から条虫は全く発見されなかった。 ４．２．デクチオカウルス・フィラリア（Dictiocaulus filaria）の自然侵入か らの羊の保護 これらの放牧地試験は牧羊集団農場（東カザフスタン，Bolshenarymsky地方の “Druhba”農場）及び羊牧場（モルドバ，Anneny Noy地方の“Maximoka”農場） において行われ、両者ともにディクチオカウルスに関して望ましくない農場であ った。“Druzhba ”農場及び“Maximoka”農場においては、９０〜１００％の羊 が常にディクチオカウルスの侵入を受けている。“Druzhba ”及び“Maximoka” における試験では、生後１．５〜２カ月の仔羊が前者で２２０頭、後者で６８頭 使用された。羊はＨ−ポリバックにより免疫処置を施され、（２回目の注射であ る）追加免疫注射の２週間後、放牧地に送られ各々の属する群れと共に飼育され た。 “Druzhba ”農場において、羊は免疫処置を施された７カ月後に屠殺され、そ の肺内部のディクチオカウルスの数が確認された（表２７）。“Maxim-oka ”農 場での試験で用いられた羊は屠殺されず、Ｈ−ポリバックによる免疫処置を施さ れた５カ月後、Ｄ．フィラリアの侵入度は、羊の排泄物中のディクチオカウルス の幼態を糞便学的に分析することによって確認された（表２８）。 ４．３．放牧条件下での肝蛭（F.hepatica）による羊への自然侵入の予防 これらの試験は牧羊農場（ロシア連邦，Dagestanの“Poot Rybaka ”農場）及 び Stavropol牧場（獣医学調査用）付属の牧羊農場（ロシア連邦，Stavropol 地 区）で行われた。本試験においては、全体としてDagestanの農場で２４３頭、St avropol 農場で５０頭の羊が各々使用された。さらに、Ｈ−ポリバックの３種類 の異なるロット（即ちロット番号ＩＧ−４，ＩＧ−８及びＩＧ−１６）が、Dage stanの牧羊農場の３つの独立した群れの各々に使用された。Stavropol の農場に おいては、Ｈ−ポリバックの２つのロット（１番及び２番）が同じ群れに対して 用いられた。 羊たちはＨ−ポリバックにより免疫処置を施され、２週間後に各々の属する群 れに戻って通常の放牧条件下で生活した。６，７もしくは１０カ月後に羊たちは 屠殺され、その肝臓内の肝蛭の数が数えられた。表２９及び３０に表されている データは、Ｈ−ポリバックによる免疫処置により、肝蛭の侵入に対する羊の抵抗 力が顕著に高まることが示されている。 Ｈ−ポリバックの使用されたロット全てが羊における肝蛭病を予防する上で効 き目があった。Ｈ−ポリバック５ｍｇを追加の免疫アジュバントとしてのシンポ ル２０ｍｇと組み合わせて使用すると、Ｈ−ポリバック５ｍｇのみ使用するより やや高い保護効果が示されることに気付いたのは有益であった。この観察は、そ の後Ｈ−ポリバックの大規模な試験において確認されまた、利用された（条項５ ．２参照）。 よって、侵入性のある蠕虫（イヌサナダ，Ｄ．フィラリア，肝蛭）を多量に用 いた急性且つ人為的攻撃による感染は、通常の放牧条件下での自然発生的な攻撃 と比較した場合その特徴においてかなり異なっているが、Ｈ−ポリバックを用い た今回の（人為的）実験試験及び放牧地試験は共に上記蠕虫による疾病予防にお ける準備措置として同様の優れた効力を示した。 ５．Ｈ−ポリバックの国家試験 上記の（人為的）実験試験及び放牧地試験のデータを再検討した後、旧ソ連獣 医学及び国家獣医学検査所の長官（the State Chief Directorate）は、Ｈ−ポ リバックの試験を放牧条件下で大規模に実施することを決定した（１９９０年５ 月１１日の指令第４６）。この国家管理下で実施された試験計画は、少なくとも ２つの目標を追及するものであった：第１に、ソ連国内の地理学的、気候学的に 異なる各地方に位置した動物農場におけるＨ−ポリバックの有効性の証明；第２ に多数の動物を用いてＨ−ポリバックの予防効果を評価することであった。 ５．１．本試験が地理学的に広範囲にわたること 包虫病、ディクチオカウラシスによる疾病もしくは肝蛭病に関して望ましくな い牧羊農場のリストには、以下の地方の農場が含まれる。：ウクライナ（Kharko v 及びSoomy 地方，Crimea地区），モルドバ（Anneny Noy及びGarakly 地方）， グルジア，ウズベキスタン（Samarkand 地方），中央・南及び東カザフスタン， ロシア連邦南部（Dagestan及びStavropol 地区），及びロシア連邦中央部（Nyz- nhy Novgorod,Voronezh,Belgorod及びBelaya Tserkov地方）。 表３１は、上記の国家試験中に使用された地域及び動物の数についての情報を まとめたものである。本試験の全てにおいて、その得られたデータは先に得られ た初期の試験結果を完全に確認するものであった。簡単に言えば、得られた結果 を効力係数（EC,efficacy coefficient）を用いて要約することが便利である。 つまり： における動物１体当りの蠕虫数の平均値 上記の効力係数を用いた場合、得られたデータはＨ−ポリバックの効力（係数 ）がディクチオカウルスによる疾病の予防においては８２％と９０％の間、肝蛭 病予防においては約９０％、また包虫病の予防においては１００％近いことを示 す。試験が行われた方法の例として、下記の東カザフスタンで実施された何千頭 もの羊を用いた試験から得られたデータに関する議論（要約）を参照されたい。 ５．２．放牧条件下にある多数の羊に対して行われたＨ−ポリバック試験 調査される動物の数が多ければ多いほど感染に関する疫学上より正確なデータ が得られるということは、疫学及び動物疫学の専門家の間で広く受け入れられて いる意見である。これは新しいワクチンの効力を評価するときも当てはまり、ゆ えに何千頭もの羊を用いて実施されたＨ−ポリバック試験から得られたデータは 大いに価値がある。以下、幾つかの例を挙げる。 Ｈ−ポリバックの予防的特徴が、集団農場“Druzhba”（東カザフスタン）に おいて、放牧されている羊１１０００頭を用いて試験された。ワクチンが、生後 ２０〜３０日の仔羊に対し１頭に付き１回５ｍｇ，２１日間の間隔を置いて２回 投与され、その４５日後羊は放牧地に送られた。１年後１，１２７頭の羊が屠殺 されたとき、６頭の羊から１頭に付き３〜4個の共尾虫（Coenurus）が発見され たが、ディクチオカウルス，肝蛭もしくはエキノコックスは全く発見されなかっ た。免疫処置を施されていなかった羊における蠕虫の侵入を受けた個体の割合は 、この農場の複数の群れにおいてどれも８０％〜１００％に上った。 翌年、Ｈ−ポリバックは同じ集団農場“Druzhba ”において、放牧されている 羊１１７００頭を用いて再び試験された。今回は、生後２０〜３０日の仔羊に対 し、１頭に付き５ｍｇのワクチンが２０ｍｇのシンポルと共に２１日の間隔を置 いて２回注射され、その４５日後羊は放牧地に送られた。７カ月後、５，０００ 頭の羊が屠殺されたとき、２５頭の羊から１〜３個のディクチオカウルスが発見 されたが、肝蛭もしくはエキノコックスは全く発見されなかった。（免疫処置を 施されていない）対照標準グループの群れにおいて、蠕虫侵入度は９０〜１００ ％であった。 以上、大規模に行われたＨ−ポリバック試験の両試験例において、実際の動物 飼育条件下でもＨ−ポリバックが非常に優れた効力を有することが明確に例証さ れている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年１０月１０日 【補正内容】 補正書の写し（翻訳文） 本出願の請求の範囲を以下の如く補正する。 「１．脊椎動物を蠕嬬虫による感染から保護する化合物であって、免疫刺激担体 に共有結合したヒアルロニダーゼを含む化合物。 ２．請求項１記載の化合物を含むワクチンの形での組成物。 ３．上記免疫刺激担体がシンポルである請求項２記載のワクチン。 ４．上記ヒアルロニダーゼが、ヒアルロノグルコザミニダーゼ，ヒアルロノグ ルクロニダーゼ及びグルコロネートリアーゼから成るグループから選択される請 求項２記載のワクチン。 ５．上記ヒアルロニダーゼが、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動） により測定された場合に約６３ｋＤａの分子量を有する請求項２記載の化合物。 ６．アジュバントをさらに有する請求項２記載のワクチン。 ７．上記アジュバントが実質的にシンポルから成る請求項６記載のワクチン。 ８．上記アジュバントが実質的に水酸化アルミニウムから成る請求項７記載の ワクチン。 ９．上記アジュバントが実質的に改良された（modified）ムラミルジペプチド から成る請求項７記載のワクチン。 １０．脊椎動物を嬬虫による感染から保護する方法であって、免疫刺激担体に共 有結合したヒアルロニダーゼを含む化合物の治療上有効な分量を上記脊椎動物に 投与することを含む方法。 １１．上記化合物がワクチンの形で上記脊椎動物に投与される請求項１０記載の 方法。 １２．上記免疫刺激担体がシンポルである請求項１０記載の方法。 １３．上記ヒアルロニダーゼが、ヒアルロノグルコザミニダーゼ，ヒアルロノグ ルクロニダーゼ及びグルコロネートリアーゼから成るグループから選択される請 求項１１記載の方法。 １４．上記ヒアルロニダーゼが、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動） により測定された場合に約６３ｋＤａの分子量有する請求項１０記載の方法。 １５．上記ワクチンがアジュバントを含む請求項１１記載の方法。 １６．上記アジュバントが、実質的にシンポルから成る請求項１５記載の方法。 １７．上記アジュバントが、実質的に水酸化アルミニウムから成る請求項１５記 載の方法。 １８．上記アジュバントが、実質的に改良されたムラミルジペプチドから成る請 求項１５記載の方法。 １９．上記治療上有効な分量が上記脊椎動物の体重１ｋｇ当り約０．０５ｍｇで ある請求項１０記載の方法。 ２０．上記脊椎動物が人，畜牛，羊，豚，犬，馬，猫，山羊，水牛／野牛，ラク ダ科の動物及び家禽類からなるグループから選択される請求項１０記載の方法。 ２１．脊椎動物における嬬虫に対する免疫反応を誘起する方法であって、免疫刺 激担体に共有結合したヒアルロニダーゼを含む化合物を上記脊椎動物体内に投与 することを含む方法。 ２２．上記化合物が、ワクチンの形で上記脊椎動物に投与される請求項２１記載 の方法。 ２３．上記免疫刺激担体がシンポルである請求項２２記載の方法。 ２４．上記ヒアルロニダーゼが、ヒアルロノグルコザミニダーゼ，ヒアルロノグ ルクロニダーゼ及びグルコロネートリアーゼから成るグループから選択される請 求項２２記載の方法。 ２５．上記ヒアルロニダーゼが、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動） により測定された場合に約６３ｋＤａの分子量を有する請求項２２記載の方法。 ２６．上記ワクチンがアジュバントを含む請求項２２記載の方法。 ２７．上記アジュバントが、実質的にシンポルから成る請求項２６記載の方法。 ２８．上記アジュバントが、実質的に水酸化アルミニウムから成る請求項２６記 載の方法。 ２９．上記アジュバントが、実質的に改良されたムラミルジペプチドから成る請 求項２６記載の方法。 ３０．ヒアルロニダーゼと免疫原担体とが反応して生成される反応生成物。 ３１．上記免疫原担体がシンポルである請求項３０記載の反応生成物。」

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 カイトフ，ラキム，エム ロシア 123056 モスクワ ボルシャヤ・ グルシンスカヤ・ストリート フラット 120 ハウス39（無番地) (72)発明者 アタウラカノフ，ラフシャン，アイ ロシア 129224 モスクワ セフェロドウ インスカヤ・ストリート フラット262 ビルディング１ ハウス13（無番地) (72)発明者 ネクラソフ，アルカディ，ヴィー ロシア 121353 モスクワ クンセフスカ ヤ・ストリート フラット420 ビルディ ング１ ハウス４（無番地) (72)発明者 ダウガリエファ，エマ，ケー ロシア 121614 モスクワ クリラットス カヤ・ストリート フラット354 ビルデ ィング１ ハウス29（無番地)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．脊椎動物を蠕虫による感染から保護する化合物であって、免疫刺激担体に 共有結合したヒアルロニダーゼを含む化合物。 ２．請求項１記載の化合物を含むワクチンの形での組成物。 ３．上記免疫刺激担体がシンポルである請求項２記載のワクチン。 ４．上記ヒアルロニダーゼが、ヒアルロノグルコザミニダーゼ，ヒアルロノグ ルクロニダーゼ及びグルコロネートリアーゼから成るグループから選択される請 求項２記載のワクチン。 ５．上記ヒアルロニダーゼが約６３ｋＤａの分子量を有する請求項２記載の化 合物。 ６．アジュバントをさらに有する請求項２記載のワクチン。 ７．上記アジュバントが実質的にシンポルから成る請求項６記載のワクチン。 ８．上記アジュバントが実質的に水酸化アルミニウムから成る請求項７記載の ワクチン。 ９．上記アジュバントが実質的に改良された（modified）ムラミルジペプチド から成る請求項７記載のワクチン。 １０．脊椎動物を蠕虫による感染から保護する方法であって、免疫刺激担体に共 有結合したヒアルロニダーゼを含む化合物の治療上有効な分量を上記脊椎動物に 投与することを含む方法。 １１．上記化合物がワクチンの形で上記脊椎動物に投与される請求項１０記載の 方法。 １２．上記免疫刺激担体がシンポルである請求項１０記載の方法。 １３．上記ヒアルロニダーゼが、ヒアルロノグルコザミニダーゼ，ヒアルロノグ ルクロニダーゼ及びグルコロネートリアーゼから成るグループから選択される請 求項１１記載の方法。 １４．上記ヒアルロニダーゼが約６３ｋＤａの分子量有する請求項１０記載の方 法。 １５．上記ワクチンがアジュバントを含む請求項１１記載の方法。 １６．上記アジュバントが、実質的にシンポルから成る請求項１５記載の方法。 １７．上記アジュバントが、実質的に水酸化アルミニウムから成る請求項１５記 載の方法。 １８．上記アジュバントが、実質的に改良されたムラミルジペプチドから成る請 求項１５記載の方法。 １９．上記治療上有効な分量が上記脊椎動物の体重１ｋｇ当り約０．０５ｍｇで ある請求項１０記載の方法。 ２０．上記脊椎動物が人，畜牛，羊，豚，犬，馬，猫，山羊，水牛／野牛，ラク ダ科の動物及び家禽類からなるグループから選択される請求項１０記載の方法。 ２１．脊椎動物における蠕虫に対する免疫反応を誘起する方法であって、免疫刺 激担体に共有結合したヒアルロニダーゼを含む化合物を上記脊椎動物体内に投与 することを含む方法。 ２２．上記化合物が、ワクチンの形で上記脊椎動物に投与される請求項２１記載 の方法。 ２３．上記免疫刺激担体がシンポルである請求項２２記載の方法。 ２４．上記ヒアルロニダーゼが、ヒアルロノグルコザミニダーゼ，ヒアルロノグ ルクロニダーゼ及びグルコロネートリアーゼから成るグループから選択される請 求項２２記載の方法。 ２５．上記ヒアルロニダーゼが約６３ｋＤａの分子量を有する請求項２２記載の 方法。 ２６．上記ワクチンがアジュバントを含む請求項２２記載の方法。 ２７．上記アジュバントが、実質的にシンポルから成る請求項２６記載の方法。 ２８．上記アジュバントが、実質的に水酸化アルミニウムから成る請求項２６記 載の方法。 ２９．上記アジュバントが、実質的に改良されたムラミルジペプチドから成る請 求項２６記載の方法。 ３０．ヒアルロニダーゼと免疫原担体とが反応して生成される反応生成物。 ３１．上記免疫原担体がシンポルである請求項３０記載の反応生成物。