JPS6121A - ワクチンおよびその製造法 - Google Patents
ワクチンおよびその製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
この発明はグラム陰性菌疾患に対する免疫および治療の
ためのワクチンおよび血清に係わり、特に、腸炎菌（８
ａ１ｍｏｎｅｌｌａ ＠ｎｔｅｒＬｔｉｄｉａ）の菌突
然変異体および腸内菌族中にグラム陰性菌を生成する内
毒素に基因する疾患に対し哺乳動物および鳥類を免疫す
る複合ワクチンにこの菌突然変異体を使用することに関
する。
ためのワクチンおよび血清に係わり、特に、腸炎菌（８
ａ１ｍｏｎｅｌｌａ ＠ｎｔｅｒＬｔｉｄｉａ）の菌突
然変異体および腸内菌族中にグラム陰性菌を生成する内
毒素に基因する疾患に対し哺乳動物および鳥類を免疫す
る複合ワクチンにこの菌突然変異体を使用することに関
する。
さらに、この発明は他の抗原との組合せで動物、ヒトの
治療に有用な解毒された内毒素免疫モジュレータおよび
その製造法および使用法に関する。
治療に有用な解毒された内毒素免疫モジュレータおよび
その製造法および使用法に関する。
畜産業において、内毒素疾患は家畜の健康に重大な問題
を生じさせ、その経済的影響も大きい。
を生じさせ、その経済的影響も大きい。
馬の場合、この内毒素疾患としては、腸炎（すなわち、
椎弓炎）、仙痛（すなわち、飽食および他のストレス現
象、たとえば腹部閉塞、腸貧血、グラム陰性菌性腸炎、
下痢、消化不良、運搬ストレス、分娩等に関連する腹部
発症）、数置病性関節炎、グラム陰性子宮内感染等があ
る。
椎弓炎）、仙痛（すなわち、飽食および他のストレス現
象、たとえば腹部閉塞、腸貧血、グラム陰性菌性腸炎、
下痢、消化不良、運搬ストレス、分娩等に関連する腹部
発症）、数置病性関節炎、グラム陰性子宮内感染等があ
る。
牛の場合の内毒素疾患としては乳牛および食肉牛におけ
る椎弓炎、食肉牛の突然死症候群、乳牛の乳房炎、子牛
の赤痢、伝染性下痢症、大腸菌症、ノヤラチフス下痢等
である。
る椎弓炎、食肉牛の突然死症候群、乳牛の乳房炎、子牛
の赤痢、伝染性下痢症、大腸菌症、ノヤラチフス下痢等
である。
豚の内毒素疾患としては異常無札症（すなわちグラム陰
性子宮内膜炎に関連する孔線不全）、水腫炎、子豚パラ
チフス下痢等である。
性子宮内膜炎に関連する孔線不全）、水腫炎、子豚パラ
チフス下痢等である。
鳥類の内毒素疾患としてはノやラチフス下痢、敗血症、
肺胞、含気側の感染症、鳥コレラ等である。
肺胞、含気側の感染症、鳥コレラ等である。
これらの内毒素媒介疾患の従来の処置は病気が発展した
のちにおこなうものであり、化学的療法に限られていた
。したがって予防処置はとられていなかった。グラム陰
性敗血症又は毒血症に対するワクチンによる予防は、（
ａ）種々の抗原性エピトープ（Ｋ−抗原又は〇−炭水化
物側鎖）を示す０原バクテリア分離物からなる個体化ワ
クチン又は（ｂｌ減減車は抹殺変性バクテリア分離物か
らなる生ワクチンを介してのみおこなわれてきた。
のちにおこなうものであり、化学的療法に限られていた
。したがって予防処置はとられていなかった。グラム陰
性敗血症又は毒血症に対するワクチンによる予防は、（
ａ）種々の抗原性エピトープ（Ｋ−抗原又は〇−炭水化
物側鎖）を示す０原バクテリア分離物からなる個体化ワ
クチン又は（ｂｌ減減車は抹殺変性バクテリア分離物か
らなる生ワクチンを介してのみおこなわれてきた。
この内毒素媒介疾患を処置する従来法の主な欠点はその
ような処置か病気が進展し、又、しばしば病気が取シ返
しができなくなったのちに初めて々されることである。
ような処置か病気が進展し、又、しばしば病気が取シ返
しができなくなったのちに初めて々されることである。
０原バクテリア分離物からなる個体化ワクチンを用いた
グラム陰性敗血症又は毒血症に対する従来のワクチンに
よる予防法は時間的、費用的又は生産上の点で効率的で
ない。なぜならばそのようなワクチンは病気が進展した
のちに後発、的に生産されるからである。
グラム陰性敗血症又は毒血症に対する従来のワクチンに
よる予防法は時間的、費用的又は生産上の点で効率的で
ない。なぜならばそのようなワクチンは病気が進展した
のちに後発、的に生産されるからである。
種々の抗原エピトープ（Ｋ−抗原又は〇−炭水化物側鎖
）を示す複合バクテリア分前物からなる多価ワクチンの
主な欠点はある時点において、病気をもたらすバクテリ
ア分離物が抗原工′ ピトープにおいて、疫学的に移動
ないし変動しがちで抗原特異性を変化させ、その予防機
能を喪失させることである。Ｋ−抗原又は〇−炭水化物
側鎖も又、動物、特にウマにおいてアナフィラキシ一様
反応を生じさせる免疫グロブリンＩｇＥの刺激剤である
。
）を示す複合バクテリア分前物からなる多価ワクチンの
主な欠点はある時点において、病気をもたらすバクテリ
ア分離物が抗原工′ ピトープにおいて、疫学的に移動
ないし変動しがちで抗原特異性を変化させ、その予防機
能を喪失させることである。Ｋ−抗原又は〇−炭水化物
側鎖も又、動物、特にウマにおいてアナフィラキシ一様
反応を生じさせる免疫グロブリンＩｇＥの刺激剤である
。
減車又は抹消変性バクテリア分離物からなる生ワクチン
の主な欠点はこれらが野生型親菌株に変換する能力を有
し、種痘した動物の病原性を継続させることである。
の主な欠点はこれらが野生型親菌株に変換する能力を有
し、種痘した動物の病原性を継続させることである。
そのため、グラム陰性バクテリアによる疾患に対し、従
来の如き欠点をともなわずに免疫、治療をおこなうこと
ができるワクチンおよび血清の開発が求められていた。
来の如き欠点をともなわずに免疫、治療をおこなうこと
ができるワクチンおよび血清の開発が求められていた。
この発明はこのような要請をグラム陰性菌用ワクチンお
よび血清を提供することを目的とする。
よび血清を提供することを目的とする。
この発明は菌突然変異体、免疫モジュレータおよびタン
パク、脂質結合担体を具備してなる内毒素関連疾患から
動物を守ることのできる複合ワクチンおよび超免疫血清
を提供するものである。
パク、脂質結合担体を具備してなる内毒素関連疾患から
動物を守ることのできる複合ワクチンおよび超免疫血清
を提供するものである。
さらに、この発明は菌突然変異体と免疫モジユレータと
を組合せる工程と、この結合体をタンノ９り、脂質結合
担体中に懸濁させる工程とを具備してなるワクチンの製
造法を提供するものである。
を組合せる工程と、この結合体をタンノ９り、脂質結合
担体中に懸濁させる工程とを具備してなるワクチンの製
造法を提供するものである。
さらに、この発明は滅菌され、腸内菌族から選ばれた菌
二次培養突然変異体で富化された肉汁を接種し、温度約
３７℃でこの肉汁を好気的に培養して最大に繁殖させ、
バクテリア剤でバクテリア突然変異体を殺し、さらにこ
れを洗滌し、所定の濃度に上記バクテリアを再生するこ
とを特徴とする菌突然変異体の製造法を提供するもので
ある。
二次培養突然変異体で富化された肉汁を接種し、温度約
３７℃でこの肉汁を好気的に培養して最大に繁殖させ、
バクテリア剤でバクテリア突然変異体を殺し、さらにこ
れを洗滌し、所定の濃度に上記バクテリアを再生するこ
とを特徴とする菌突然変異体の製造法を提供するもので
ある。
さらにこの発明はグラム陰性バクテリア内毒素をピリジ
ン−ギ酸液と混合する工程と：この混合物を全還流蓋−
留によりメチル化する工程と：このメチル化内毒素混合
物をアルコールを用いて析出させる工程と；このアルコ
ール／メチル化内毒素混合物を遠心分離する工程と；得
られた析出物を蒸留水と混合して内毒素を所定の濃度と
する工程とを具備してなる免疫モジュレータの製造法を
提供するものである。
ン−ギ酸液と混合する工程と：この混合物を全還流蓋−
留によりメチル化する工程と：このメチル化内毒素混合
物をアルコールを用いて析出させる工程と；このアルコ
ール／メチル化内毒素混合物を遠心分離する工程と；得
られた析出物を蒸留水と混合して内毒素を所定の濃度と
する工程とを具備してなる免疫モジュレータの製造法を
提供するものである。
さらに、この発明は複合ワクチンから得られる超免疫血
清の製造およびグラム陰性菌疾患の動物を治療する方法
を提供する。さらに、この発明は突然変異体と担体の紹
合せを提供するものである。
清の製造およびグラム陰性菌疾患の動物を治療する方法
を提供する。さらに、この発明は突然変異体と担体の紹
合せを提供するものである。
本発明は数個の異なる概念を含むものである。
すなわち、（１）、菌突然変異体およびタンパク／脂質
結合担体からなるワクチンであって、脂質／タンパク親
和性が大きく、抗体の持続的解放を可能とする均質懸濁
液を形成するもの、およびこれに解毒された内毒素であ
る免疫モジュレータを添加したもの：（２）広範な予防
機能を有するバクテリア突然変異体、特に、腸内菌族か
らの非−〇−炭水化物側鎖バクチリア突然変異体：（３
） Ｂ −ＩＪンノヤ球増殖に対する特異性を有する上
記免疫モジュレータであって、抗原親和性および結合性
が大きく、中和およびオゾンニン作用抗体を初期におい
て多量に発生させるもの、およびそのような免疫モジュ
レータの製造方法；（４フグラム陰性菌疾患を治療する
超免疫血清およびその製造法である。
結合担体からなるワクチンであって、脂質／タンパク親
和性が大きく、抗体の持続的解放を可能とする均質懸濁
液を形成するもの、およびこれに解毒された内毒素であ
る免疫モジュレータを添加したもの：（２）広範な予防
機能を有するバクテリア突然変異体、特に、腸内菌族か
らの非−〇−炭水化物側鎖バクチリア突然変異体：（３
） Ｂ −ＩＪンノヤ球増殖に対する特異性を有する上
記免疫モジュレータであって、抗原親和性および結合性
が大きく、中和およびオゾンニン作用抗体を初期におい
て多量に発生させるもの、およびそのような免疫モジュ
レータの製造方法；（４フグラム陰性菌疾患を治療する
超免疫血清およびその製造法である。
免疫方法として、このワクチンは筋肉内、又は皮下に、
菌１×１０ および免疫モジュレータ１００μｍ以上の
濃度で投与δれる。グラム陰性バクテリアによる病気を
有する動物の治療に対しては種痘された供与体から血清
がつくられ、保護に十分な量の抗体が投与される。
菌１×１０ および免疫モジュレータ１００μｍ以上の
濃度で投与δれる。グラム陰性バクテリアによる病気を
有する動物の治療に対しては種痘された供与体から血清
がつくられ、保護に十分な量の抗体が投与される。
この複合ワクチンの利点は予防的性格を有することであ
って、従来の病気発止後に開始される治療と異なる。他
の利点は内毒素疾患からの急速かつ高度の保護作用が発
現し、従来のワクチンに伴なう危険、たとえば（ａ）致
命的なアナフィラキシ−；（ｂ）生のバクテリアが非病
原性から病原性に戻ることによる致命的感染；（Ｃ）バ
クテリア疾患の種の相対的変化により保静誘発能が減退
するとと；のおそれはない。
って、従来の病気発止後に開始される治療と異なる。他
の利点は内毒素疾患からの急速かつ高度の保護作用が発
現し、従来のワクチンに伴なう危険、たとえば（ａ）致
命的なアナフィラキシ−；（ｂ）生のバクテリアが非病
原性から病原性に戻ることによる致命的感染；（Ｃ）バ
クテリア疾患の種の相対的変化により保静誘発能が減退
するとと；のおそれはない。
複合ワクチンの解毒内毒素成分はＢ−リンパ球特異性を
有する有効免疫モジュレータとして抗体幹細胞をよシ急
速に増殖させるだけでなく、活性化状態を早急に生じさ
せる。そのため、従来のバクテリアワクチンの場合に較
べ、ワクチン接種後の寄生体内における抗体の保護レベ
ルに達する時間がより早くなる。
有する有効免疫モジュレータとして抗体幹細胞をよシ急
速に増殖させるだけでなく、活性化状態を早急に生じさ
せる。そのため、従来のバクテリアワクチンの場合に較
べ、ワクチン接種後の寄生体内における抗体の保護レベ
ルに達する時間がより早くなる。
裸コア抗原（２−ケト−３−デオキシオフトン酸−脂肪
Ａ）を示す突然変異体からなり、従来のバクテリアワク
チンの如き〇−炭水化物側鎖（Ｋ抗原）を含まない複合
ワクチンの細菌ワクチン成分は〇−炭水化物特異性免疫
グロブリンＥ （ＩｇＥ 、 Ｒｅａｇｉｎ）の発育を
阻止し、したがって種痘後のＩｇＥ媒介アナフィラキシ
−の誘発を生じさせる。〇−炭水化物側鎖（Ｋ−抗原血
清型）とは対照的に裸コア抗原は多くのグラム陰性バク
テリアに共通するものであるから、広範な交叉的保護の
抗体を誘発するとともに、０−炭水化物側鎖（Ｋ−抗原
、血清型）における疫学的移動又は変動による保護効果
の損失を排除する。
Ａ）を示す突然変異体からなり、従来のバクテリアワク
チンの如き〇−炭水化物側鎖（Ｋ抗原）を含まない複合
ワクチンの細菌ワクチン成分は〇−炭水化物特異性免疫
グロブリンＥ （ＩｇＥ 、 Ｒｅａｇｉｎ）の発育を
阻止し、したがって種痘後のＩｇＥ媒介アナフィラキシ
−の誘発を生じさせる。〇−炭水化物側鎖（Ｋ−抗原血
清型）とは対照的に裸コア抗原は多くのグラム陰性バク
テリアに共通するものであるから、広範な交叉的保護の
抗体を誘発するとともに、０−炭水化物側鎖（Ｋ−抗原
、血清型）における疫学的移動又は変動による保護効果
の損失を排除する。
この複合ワクチンおよびこの複合ワクチンにより誘発さ
れた超免疫血清の開発の以前においては、治療は内毒素
疾患の発生後に初めて王として化学療法に頼るものであ
った。この超免疫血清の利点は明らかに病気になった非
ワクチン接種動物において、病気の進行を軽減させ、た
とえば馬等の工具又は死亡を阻止させ得る−ことである
。
れた超免疫血清の開発の以前においては、治療は内毒素
疾患の発生後に初めて王として化学療法に頼るものであ
った。この超免疫血清の利点は明らかに病気になった非
ワクチン接種動物において、病気の進行を軽減させ、た
とえば馬等の工具又は死亡を阻止させ得る−ことである
。
菌血症又は毒血症又は種々のグラム陰性バクテリアによ
る病気に対する複合ワクチン又は複合ワクチン誘発超免
疫血清を介しての広範な保′護は応用免疫学における新
しい分子概念を用いる動物産業にとって経済的進展とな
る。この複合ワクチンによシ保饅の対象となる病気とし
ては内毒素媒介溝管内凝結に関連するものを含む。
る病気に対する複合ワクチン又は複合ワクチン誘発超免
疫血清を介しての広範な保′護は応用免疫学における新
しい分子概念を用いる動物産業にとって経済的進展とな
る。この複合ワクチンによシ保饅の対象となる病気とし
ては内毒素媒介溝管内凝結に関連するものを含む。
たとえば腸炎菌、ネズミチフス菌、チフス菌、サルモネ
ラミネソタ薗、ウシ流産菌、大腸菌によるものである・ 以下、本発明の個々の成分について述べる。
ラミネソタ薗、ウシ流産菌、大腸菌によるものである・ 以下、本発明の個々の成分について述べる。
突然変異体
この突然変異体はＡＴＣＣＡ ５３０００としてＡｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｖ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｌｏｎ に寄託さ・れている。
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｖ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｌｏｎ に寄託さ・れている。
遺伝的に変性された突然変異体種Ｒ−１７の製造に用い
られる親分難物はＵｎｉマｅｒｓｌｔｙ ｏｆＭｉｓａ
ｏｕｒｌ ＣｏＣｏ１１ｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｌｎａｙ
Ｍｅｄｌｅｌｎｅでウマの活性下痢膿染したものから
分離した。この原分・難物はマツコンキースアガー（Ｍ
ａｃＣｏｎｋｅｙｓａｇａｒ ）上に分離され、これは
３７℃、２４時間の培養の結果、ラクトース陰性で滑ら
かな粘液様の光沢性集落３．５〜４霞（直径）を示した
。
られる親分難物はＵｎｉマｅｒｓｌｔｙ ｏｆＭｉｓａ
ｏｕｒｌ ＣｏＣｏ１１ｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｌｎａｙ
Ｍｅｄｌｅｌｎｅでウマの活性下痢膿染したものから
分離した。この原分・難物はマツコンキースアガー（Ｍ
ａｃＣｏｎｋｅｙｓａｇａｒ ）上に分離され、これは
３７℃、２４時間の培養の結果、ラクトース陰性で滑ら
かな粘液様の光沢性集落３．５〜４霞（直径）を示した
。
これをＡＰＩ輪郭認識システムに関連してＡＰＩシステ
ム（ＡＰＩ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製品、２０’ＯＥｘ
ｐｒｅｓｓｓｔ−＋ Ｐｌａｉｎｖｌｅｗｓ 二、−ヨ
ーク１１８０３ ）を用いた生物学的分析および通常の
実験による特徴検査をおこなった結果、原発難物が腸炎
菌（Ｓｍｌｍｏｎｅｌｌａ ＠ｎｔｓｒｌｔｌｄｉａ
： ８ｅｒｏｔｙｐａ Ｂ−ｔｙｐｈＩｍｕｒｉｕｍ
）であることが判明した。この微生物は文献、Ｍａｎｕ
ａｌ ｏｆ Ｃｌ１ｎｉｃａｌ Ｍｊｅｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ。
ム（ＡＰＩ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製品、２０’ＯＥｘ
ｐｒｅｓｓｓｔ−＋ Ｐｌａｉｎｖｌｅｗｓ 二、−ヨ
ーク１１８０３ ）を用いた生物学的分析および通常の
実験による特徴検査をおこなった結果、原発難物が腸炎
菌（Ｓｍｌｍｏｎｅｌｌａ ＠ｎｔｓｒｌｔｌｄｉａ
： ８ｅｒｏｔｙｐａ Ｂ−ｔｙｐｈＩｍｕｒｉｕｍ
）であることが判明した。この微生物は文献、Ｍａｎｕ
ａｌ ｏｆ Ｃｌ１ｎｉｃａｌ Ｍｊｅｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ。
２ｎｄ Ｅｄ、ワシント７ ＃ Ａｎｆｅｒｉｃａｎ
５ｏｃＩｅｔｙ ｆｏｒＭｉｅｒｏｌｌ’ｏｌｏｇｙ、
１９７Ｃ腸内菌）に記載されている。
５ｏｃＩｅｔｙ ｆｏｒＭｉｅｒｏｌｌ’ｏｌｏｇｙ、
１９７Ｃ腸内菌）に記載されている。
この発明の微生物の具体例はイオン化放射線により得ら
れる腸炎菌（Ｂ −ｔｙｐｈ１ｍｕｒｉｕｍ血清型）の
親分難物の抹消突然変異種である。このイオン化放射線
は高エネルギー浸透により遊離ラジカルを生じさせ、細
胞質分子を不安定にさせデオ、キシリＩ核酸中に一本鎖
切断を生じさせ、これによル抹消突然変異体を高い割合
で生じさせる。生存突然変異体は完全なリポ多糖の合成
に対する様々な程度の不能性の表現型発現をケす。
れる腸炎菌（Ｂ −ｔｙｐｈ１ｍｕｒｉｕｍ血清型）の
親分難物の抹消突然変異種である。このイオン化放射線
は高エネルギー浸透により遊離ラジカルを生じさせ、細
胞質分子を不安定にさせデオ、キシリＩ核酸中に一本鎖
切断を生じさせ、これによル抹消突然変異体を高い割合
で生じさせる。生存突然変異体は完全なリポ多糖の合成
に対する様々な程度の不能性の表現型発現をケす。
このような突然変異体は直径１が比較的小さく、平坦な
ラフ集落（Ｒ）であり、親バクテリアによりつくられる
大きく、凹み又は凸状のスムーズ集落（Ｓ）と対照的な
ことから容易に認識することができる。
ラフ集落（Ｒ）であり、親バクテリアによりつくられる
大きく、凹み又は凸状のスムーズ集落（Ｓ）と対照的な
ことから容易に認識することができる。
Ｘ（変異生成は生活観バクテリアで接種した標準流動プ
レート上でおこなわれた。すなわち、Ｍａｅｈｅｌｅｔ
ｔ ＯＥＧ ６０ Ｘ−線管であってベリリウム窓を有
するものを用い、５０ ｋＶピークおよび２５ｍＡで操
作し、２５０ ｒａｄルの投射速度で５秒の増度を以っ
て最大３５秒、上記プレートに照射をおこなった。この
照射されたプレートを４℃、で２〜４時間保持し、つい
で暗所で３７℃で培養し、光回復を排除するようＫした
。この培養２４時間後に、プレートを集落形態の質化に
ついて検査した。直径２＋ａと同−又は小さい集落でラ
フ形態（Ｒ）を示すものを選び固体プレート媒体上で少
なくとも１ｅ回、継代接種し、さ、らに実験用マウスの
腹腔内接種により少なくとも３回継代接種して安定なラ
フ（Ｒ）表現型発現を確実なものとした。この突然変異
種Ｒ−１７を胃内接種、を介して標準マウス効力評価法
により親分難物との比較にお−て、その弱毒性を評価し
た。この突然変異種Ｒ−１７からの精製リポ多糖と親分
難物を電気泳動にょシ２・チナトリウムドデシルサルフ
ェー）−１０％ポリアクリルアミドｒル中で化学分析し
た（ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０７ ：１３７−１４３ ＋ネ
ズミチフス菌におけるリポ多糖の異質成分、ナトリウム
ドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分析）。さらに、色素形１１ｍｕｌｕｓ １ｙｓ
ａｔｅ評価（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＣＩｉｎｉｃａｌ
ＭｌｅｒＣｌｌｎｉｃａｌ １２ （５）： ６４４−
６５０． Ｌｉｒｎｕｌｕ Ｌｙｓｊｒｔｅ使用による
血液中の内毒素菌の定量分析、１９８０゜Ｗｅｂｓｔａ
ｒ、 Ｃ−Ｊ−）により生物学的に分析した。
レート上でおこなわれた。すなわち、Ｍａｅｈｅｌｅｔ
ｔ ＯＥＧ ６０ Ｘ−線管であってベリリウム窓を有
するものを用い、５０ ｋＶピークおよび２５ｍＡで操
作し、２５０ ｒａｄルの投射速度で５秒の増度を以っ
て最大３５秒、上記プレートに照射をおこなった。この
照射されたプレートを４℃、で２〜４時間保持し、つい
で暗所で３７℃で培養し、光回復を排除するようＫした
。この培養２４時間後に、プレートを集落形態の質化に
ついて検査した。直径２＋ａと同−又は小さい集落でラ
フ形態（Ｒ）を示すものを選び固体プレート媒体上で少
なくとも１ｅ回、継代接種し、さ、らに実験用マウスの
腹腔内接種により少なくとも３回継代接種して安定なラ
フ（Ｒ）表現型発現を確実なものとした。この突然変異
種Ｒ−１７を胃内接種、を介して標準マウス効力評価法
により親分難物との比較にお−て、その弱毒性を評価し
た。この突然変異種Ｒ−１７からの精製リポ多糖と親分
難物を電気泳動にょシ２・チナトリウムドデシルサルフ
ェー）−１０％ポリアクリルアミドｒル中で化学分析し
た（ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０７ ：１３７−１４３ ＋ネ
ズミチフス菌におけるリポ多糖の異質成分、ナトリウム
ドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分析）。さらに、色素形１１ｍｕｌｕｓ １ｙｓ
ａｔｅ評価（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＣＩｉｎｉｃａｌ
ＭｌｅｒＣｌｌｎｉｃａｌ １２ （５）： ６４４−
６５０． Ｌｉｒｎｕｌｕ Ｌｙｓｊｒｔｅ使用による
血液中の内毒素菌の定量分析、１９８０゜Ｗｅｂｓｔａ
ｒ、 Ｃ−Ｊ−）により生物学的に分析した。
その結果、血清凝集（Ｓｅｒｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓａ１
ｍｏｎｅｌｌａ＊Ｖｏ１．１５． ＰＰ−１〜１４１
、１９８４ 、 Ｌｌｎｄｂｓｒｇ、 Ａ、Ａ。
ｍｏｎｅｌｌａ＊Ｖｏ１．１５． ＰＰ−１〜１４１
、１９８４ 、 Ｌｌｎｄｂｓｒｇ、 Ａ、Ａ。
＆ Ｌ、 Ｌｅ Ｍｉｎｏｒ： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉ
ｎ ＭｉａｒｏｂｌｏｌｏｇＦｍ Ｔ−Ｂｅｒｇａｒ＋
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ＋−ニューヨーク、１
９８４）が認められ、〇−炭水化物抗原は認められなか
った０したがって、この突然変異種Ｒ−】７は化学型■
又は■、裸コア突然変異体からなる新規なものであるこ
とが判明した。
ｎ ＭｉａｒｏｂｌｏｌｏｇＦｍ Ｔ−Ｂｅｒｇａｒ＋
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ＋−ニューヨーク、１
９８４）が認められ、〇−炭水化物抗原は認められなか
った０したがって、この突然変異種Ｒ−】７は化学型■
又は■、裸コア突然変異体からなる新規なものであるこ
とが判明した。
リポ多糖をアセトン乾燥バクテリア又は５容量倍の蒸留
水に懸濁させた湿潤バクテリアから０、２５ Ｎ ）リ
クロロ酢酸水溶液を用いて抽出した。このリポ多糖（Ｌ
ＰＳ） （上澄液）を遠心分離（５０００Ｘ、Ｐ、３０
分、４０℃）して残留するバクテリア（ペレット）から
分離した。この上澄液を１ＯＮのＮａＯＨを用いｐＨ６
，８に調整し、冷無水エチルアルコール２容量倍を添加
し、この上澄液からＬＰＳを析出させた。この析出した
Ｉ、ＰＳを、遠心分離（１０，０００Ｘ＃、１時間、４
℃）ＫよｌＦ４め冷無水エタノールで洗滌し、親液化し
、使用時まで４℃にて貯蔵した。
水に懸濁させた湿潤バクテリアから０、２５ Ｎ ）リ
クロロ酢酸水溶液を用いて抽出した。このリポ多糖（Ｌ
ＰＳ） （上澄液）を遠心分離（５０００Ｘ、Ｐ、３０
分、４０℃）して残留するバクテリア（ペレット）から
分離した。この上澄液を１ＯＮのＮａＯＨを用いｐＨ６
，８に調整し、冷無水エチルアルコール２容量倍を添加
し、この上澄液からＬＰＳを析出させた。この析出した
Ｉ、ＰＳを、遠心分離（１０，０００Ｘ＃、１時間、４
℃）ＫよｌＦ４め冷無水エタノールで洗滌し、親液化し
、使用時まで４℃にて貯蔵した。
（免疫モジュレータの製造）
トリクロロ酢酸抽出リポ多糖（ＬＰＳ）をピリジン７９
０係ギ？！（２：１容量比）１００容量倍液に溶解させ
、徐々に加温して沸点まで上昇させ、そこで約１５分間
又は透明化するまで保持した。ついで解毒を等量の蒸留
水をこのＬＰＳ −ピリジン−ギ酸溶液に添加し、６０
分間還流させることによりおこなった。この解毒ＬＰＳ
を冷無水エタノール４容量倍の添加により一晩かけて析
出させ、ついで、遠心分離（１０，０００Ｘｉ１時間、
４℃）をおこない、冷無水エタノールで３回洗滌し、さ
らにこの親液化解毒ＬＰＳ免疫モジュレータを４℃で貯
蔵し、免疫相乗作用を生じさせるために使用し得るよう
に０．１チドリエチルアミン水溶液中で再構成させた。
０係ギ？！（２：１容量比）１００容量倍液に溶解させ
、徐々に加温して沸点まで上昇させ、そこで約１５分間
又は透明化するまで保持した。ついで解毒を等量の蒸留
水をこのＬＰＳ −ピリジン−ギ酸溶液に添加し、６０
分間還流させることによりおこなった。この解毒ＬＰＳ
を冷無水エタノール４容量倍の添加により一晩かけて析
出させ、ついで、遠心分離（１０，０００Ｘｉ１時間、
４℃）をおこない、冷無水エタノールで３回洗滌し、さ
らにこの親液化解毒ＬＰＳ免疫モジュレータを４℃で貯
蔵し、免疫相乗作用を生じさせるために使用し得るよう
に０．１チドリエチルアミン水溶液中で再構成させた。
精製リポ多糖は試験管内でリン・や球胚子発生、すなわ
ち組繊細胞を生じさせることが知られている。ヒトおよ
び他の動物リンパ球はインターリューキン（ＩＬ−１，
ＩＬ−２）を生じさせ、これが免疫応答を媒介させ、こ
れによりエイコサテトラエン酸代謝産物（すなわち、プ
ロスタノイド又はプロスタグランジン）を介して抗体を
生じさせる。また、精製リポ多糖はＩＬ−１およびプロ
スタシリン合成を生体内で増強することが知られている
。しかし、精製リポ多糖又は自然の（グラム陰性バクテ
リア自体に関連する）り辿多糖は完全な〇−炭水化物側
鎖抗原を保持し、これは生体（哺乳動物）内に導入され
た場合、毒性を示し、都合の悪い熱性応答、凝血異常、
又は感作された寄生中におけるアナフィラキシ一様反応
による伝染性導管内凝固を生じさせる。
ち組繊細胞を生じさせることが知られている。ヒトおよ
び他の動物リンパ球はインターリューキン（ＩＬ−１，
ＩＬ−２）を生じさせ、これが免疫応答を媒介させ、こ
れによりエイコサテトラエン酸代謝産物（すなわち、プ
ロスタノイド又はプロスタグランジン）を介して抗体を
生じさせる。また、精製リポ多糖はＩＬ−１およびプロ
スタシリン合成を生体内で増強することが知られている
。しかし、精製リポ多糖又は自然の（グラム陰性バクテ
リア自体に関連する）り辿多糖は完全な〇−炭水化物側
鎖抗原を保持し、これは生体（哺乳動物）内に導入され
た場合、毒性を示し、都合の悪い熱性応答、凝血異常、
又は感作された寄生中におけるアナフィラキシ一様反応
による伝染性導管内凝固を生じさせる。
この精製リポ多糖はμμｍあるいはｎ１ｍ度の濃度でも
哺乳動物の組織又は細胞（試験管内培養）に有害である
。
哺乳動物の組織又は細胞（試験管内培養）に有害である
。
この発明は（１）哺乳類および組繊細胞培養に対し無害
な免疫モジュレータの製造法：（２）哺乳類を粒状又は
可溶性抗原に対し免疫するための免疫モジ−レータを用
する方法であって、急速かつ大きい抗体応答を促進させ
、抗原因子（エピトープ）の広いスペクトルの認識を増
強させ、広範な免疫特異性を生じさせる方法：（３）抗
体合成形質細胞腫とＢ −＋７ンパ球との間の交雑度を
細胞培養中で１５〜３０係から８５％に高める方法であ
って、免疫モジュレータの存在下で粒状又は可溶性抗原
を用い供与哺乳類の第一次免疫をおこなう方法；を含む
。
な免疫モジュレータの製造法：（２）哺乳類を粒状又は
可溶性抗原に対し免疫するための免疫モジ−レータを用
する方法であって、急速かつ大きい抗体応答を促進させ
、抗原因子（エピトープ）の広いスペクトルの認識を増
強させ、広範な免疫特異性を生じさせる方法：（３）抗
体合成形質細胞腫とＢ −＋７ンパ球との間の交雑度を
細胞培養中で１５〜３０係から８５％に高める方法であ
って、免疫モジュレータの存在下で粒状又は可溶性抗原
を用い供与哺乳類の第一次免疫をおこなう方法；を含む
。
免疫モジュレータは抗原と同時に投与した場合、Ｃ５７
ＢＬ／６Ｊマウスの第一次免疫応答を高める。この増進
効果は緑膿菌の如き粒状抗原のみならず、キーホールド
アオガイヘモシアニンの如き可溶性抗原を用いた場合で
も生ずる。抗原と免疫モジュレータを同時に注射した動
物は抗原のみを与えた動物に較べて注射後７，１４、お
よび３５日後の抗体力価が大きいことが認められた。免
疫モジュレータは免疫応答の初期において抗体力価を増
進させるだけでなく、血清抗体レベルを高い状態に持続
させることができ、このことは極めて重要な点である。
ＢＬ／６Ｊマウスの第一次免疫応答を高める。この増進
効果は緑膿菌の如き粒状抗原のみならず、キーホールド
アオガイヘモシアニンの如き可溶性抗原を用いた場合で
も生ずる。抗原と免疫モジュレータを同時に注射した動
物は抗原のみを与えた動物に較べて注射後７，１４、お
よび３５日後の抗体力価が大きいことが認められた。免
疫モジュレータは免疫応答の初期において抗体力価を増
進させるだけでなく、血清抗体レベルを高い状態に持続
させることができ、このことは極めて重要な点である。
免疫モジュレータによる特異的抗体応答の増進は注射経
路によって実質的に影響されることはない。なぜならば
フロイントの不完全アジュバントで抗原および免疫モジ
ュレータを静脈内、腹腔内又は皮下に注射した場合のい
ずれでもこの増進がみられるからである。
路によって実質的に影響されることはない。なぜならば
フロイントの不完全アジュバントで抗原および免疫モジ
ュレータを静脈内、腹腔内又は皮下に注射した場合のい
ずれでもこの増進がみられるからである。
これらの結果を表Ａに示す。これらの実験において、各
グルーグに５匹の動物を用いた。これらの実験動物は抗
原と免疫モジュレータ（７５μＩ／−投与）を投与され
、参照動物は同一量の抗原と滅菌食塩が投与された。血
清抗体力価は間接的ＥＬＩＳＡ評価法により測定した６
免疫モジユレータは細胞培養成長に対する影響から毒性
がないことが証明されている。８Ｐ２１０マウス骨髄腫
細胞を培養液１−当シ、１００゜１．０．１ｎＩＩの濃
度の免疫モジュレータで培養したところ、細胞密度が相
応する参照培養試料と同等もしくは若干大きくなってい
ることが判明した。骨髄腫細胞を１０係胎児のウシ血清
、２％Ｌ−グルタミン、１係ピルペン酸ナトリウムおよ
び抗体を添加したＲＰＭＩ １６４０媒体中で培養した
。免疫モジュレータはこの媒体中に適当な濃度で滅菌水
溶液として添加した。細胞密度は免疫モジ、レータおよ
び滅菌蒸留水め等量を添加り、りのち、２４，４８．７
２および９６時間後に判定した・ ワクチン ワクチンは菌突然変異体（細菌ワクチン）、免疫モジュ
レータ（内毒素）およびタンノやりおよび脂肪結合担体
（アジュバント）からなっている。このワクチンは筋肉
又は皮下に、ｌＸｌ０”菌（好ましくはｌＸｌ０”菌）
又はそれ以上、ｉｏ。
グルーグに５匹の動物を用いた。これらの実験動物は抗
原と免疫モジュレータ（７５μＩ／−投与）を投与され
、参照動物は同一量の抗原と滅菌食塩が投与された。血
清抗体力価は間接的ＥＬＩＳＡ評価法により測定した６
免疫モジユレータは細胞培養成長に対する影響から毒性
がないことが証明されている。８Ｐ２１０マウス骨髄腫
細胞を培養液１−当シ、１００゜１．０．１ｎＩＩの濃
度の免疫モジュレータで培養したところ、細胞密度が相
応する参照培養試料と同等もしくは若干大きくなってい
ることが判明した。骨髄腫細胞を１０係胎児のウシ血清
、２％Ｌ−グルタミン、１係ピルペン酸ナトリウムおよ
び抗体を添加したＲＰＭＩ １６４０媒体中で培養した
。免疫モジュレータはこの媒体中に適当な濃度で滅菌水
溶液として添加した。細胞密度は免疫モジ、レータおよ
び滅菌蒸留水め等量を添加り、りのち、２４，４８．７
２および９６時間後に判定した・ ワクチン ワクチンは菌突然変異体（細菌ワクチン）、免疫モジュ
レータ（内毒素）およびタンノやりおよび脂肪結合担体
（アジュバント）からなっている。このワクチンは筋肉
又は皮下に、ｌＸｌ０”菌（好ましくはｌＸｌ０”菌）
又はそれ以上、ｉｏ。
μＩ以上（好ましくは１００〜４０００μｌりの解毒内
毒素の濃度（脂質−タン・やり親和性吸収担体中）で投
与した。 ゛ この細菌ワクチンは腸炎菌の非−〇−炭水化物側鎖突然
変異体の減殺懸濁液からなるものである。このバクテリ
アは腸炎菌（Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ＠ｎｔｅｒｉｔｌｄ
１ｇ ）突然変異体の二次培養で富化された滅菌肉汁を
接種し、３７℃で好気的に最大限に培養してつくられた
。このバクテリアをマージオレートの如き殺菌剤で減殺
したのち、その非生活性をチェ、りした。ついで非発熱
性滅菌生理食塩水で４回洗滌したのち、他のワクチン成
分との混合のための所望の貯蔵濃度に再構成させた。
毒素の濃度（脂質−タン・やり親和性吸収担体中）で投
与した。 ゛ この細菌ワクチンは腸炎菌の非−〇−炭水化物側鎖突然
変異体の減殺懸濁液からなるものである。このバクテリ
アは腸炎菌（Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ＠ｎｔｅｒｉｔｌｄ
１ｇ ）突然変異体の二次培養で富化された滅菌肉汁を
接種し、３７℃で好気的に最大限に培養してつくられた
。このバクテリアをマージオレートの如き殺菌剤で減殺
したのち、その非生活性をチェ、りした。ついで非発熱
性滅菌生理食塩水で４回洗滌したのち、他のワクチン成
分との混合のための所望の貯蔵濃度に再構成させた。
解毒内毒素はグラム陰性バクテリア内毒素をピリジン−
ギ酸（２：１）溶液に添加してつくられた。この内毒素
−ピリジン−ギ酸混合物は滅菌還流凝縮装置中で十分に
混合し、濃度を沸点まで上昇させ、最良の内毒素メチル
化物を得るべく還流させた。ついで、このメチル化解毒
内毒素をアルコールの添加により還流混合水から析出さ
せ、遠心分離により集め、アルコール中に再懸濁するこ
とにより洗滌し、再遠心分離し、最後に非発熱性蒸留水
に解かし、ワクチンの他の成分と混合するために所望の
貯蔵濃度に調整した。
ギ酸（２：１）溶液に添加してつくられた。この内毒素
−ピリジン−ギ酸混合物は滅菌還流凝縮装置中で十分に
混合し、濃度を沸点まで上昇させ、最良の内毒素メチル
化物を得るべく還流させた。ついで、このメチル化解毒
内毒素をアルコールの添加により還流混合水から析出さ
せ、遠心分離により集め、アルコール中に再懸濁するこ
とにより洗滌し、再遠心分離し、最後に非発熱性蒸留水
に解かし、ワクチンの他の成分と混合するために所望の
貯蔵濃度に調整した。
細菌ワクチンのタン／４’り質分および解簿内毒素の脂
質分を吸収するのに十分な高親和性を有する親脂質、タ
ンノ＜？り担体からなるアジュバントが用いられる。こ
のアジュバントは好ましくは脂肪酸系のもの、オイル系
のもの、又は明けん系のもの（たとえばＡｔ２０３）の
ものが用いられる。このシアルミニウムトリオキシドの
担体特性は均一な懸濁状態を保持し、細胞ワクチンおよ
び解毒内毒素の持続的解放を保持し、著るしイ抗体の生
産を確実にする。このシアルミニウムトリオキシドをタ
ンＡ’クー脂質高親和アジュバントとして用いる場合、
１．５チ容量係が最適である。
質分を吸収するのに十分な高親和性を有する親脂質、タ
ンノ＜？り担体からなるアジュバントが用いられる。こ
のアジュバントは好ましくは脂肪酸系のもの、オイル系
のもの、又は明けん系のもの（たとえばＡｔ２０３）の
ものが用いられる。このシアルミニウムトリオキシドの
担体特性は均一な懸濁状態を保持し、細胞ワクチンおよ
び解毒内毒素の持続的解放を保持し、著るしイ抗体の生
産を確実にする。このシアルミニウムトリオキシドをタ
ンＡ’クー脂質高親和アジュバントとして用いる場合、
１．５チ容量係が最適である。
この複合ワクチンで通常のウマを免疫したときは、炭水
化物で飽食させた場合（自然界で生ずる飽食に似せたも
の）でも、又、細菌内毒素を静脈注射した場合（すなわ
ち、自然界で起る場合に似せて人工的に発病させる）で
も、血流中に十分な保瞳をなし得る抗体が生じた。同様
にウシに対して免疫を施した場合も体温の上昇は見られ
ず、白血球の数、型の異常な増加が見られた。この複合
ワクチンの利点は、（ｌＬ）細胞壁中に通常存在し、好
ましくないアナフィラキシ一様反応を生じさせる成分を
含まない突然変異バクテリアであること：（ｂ）バクテ
リア又は解毒化内毒素を持続的に解放させ、多量の中和
抗体を生じさせるアジュバント又は担体であること：（
ｅ）見金な内毒素およびバクテリアに対し望ましい中和
抗体を早急かつ多量に生じさせる解毒化内毒素であるこ
と；を含む。この複合ワクチンは多くのグラム陰性菌疾
患に対し、広範な保護を与える品質を有する。なぜなら
ば抗原の基本的構造はほとんどのグラム陰性菌に対し共
通する示らである。しか肱この複合ワクチンは望ましく
ないアナフィラキシ−を生じさせる従来のワクチン成分
を含まない。
化物で飽食させた場合（自然界で生ずる飽食に似せたも
の）でも、又、細菌内毒素を静脈注射した場合（すなわ
ち、自然界で起る場合に似せて人工的に発病させる）で
も、血流中に十分な保瞳をなし得る抗体が生じた。同様
にウシに対して免疫を施した場合も体温の上昇は見られ
ず、白血球の数、型の異常な増加が見られた。この複合
ワクチンの利点は、（ｌＬ）細胞壁中に通常存在し、好
ましくないアナフィラキシ一様反応を生じさせる成分を
含まない突然変異バクテリアであること：（ｂ）バクテ
リア又は解毒化内毒素を持続的に解放させ、多量の中和
抗体を生じさせるアジュバント又は担体であること：（
ｅ）見金な内毒素およびバクテリアに対し望ましい中和
抗体を早急かつ多量に生じさせる解毒化内毒素であるこ
と；を含む。この複合ワクチンは多くのグラム陰性菌疾
患に対し、広範な保護を与える品質を有する。なぜなら
ば抗原の基本的構造はほとんどのグラム陰性菌に対し共
通する示らである。しか肱この複合ワクチンは望ましく
ないアナフィラキシ−を生じさせる従来のワクチン成分
を含まない。
炭水化物の過度の負担は腸（大Ｉ１％）中の酸の濃度を
増加させ、これが腸壁を害し、同時に腸内のグラム陰性
バクテリアの数を減少させる。
増加させ、これが腸壁を害し、同時に腸内のグラム陰性
バクテリアの数を減少させる。
これは血流中への移行増大（敗癩症）および酸による減
殺による。このバクテリアの減殺は細胞壁からの内毒素
の解放をもたらし、これは酸破壊腸壁を通過して血流に
移行することになる。
殺による。このバクテリアの減殺は細胞壁からの内毒素
の解放をもたらし、これは酸破壊腸壁を通過して血流に
移行することになる。
血流中の内毒素は毛細血管中の血液凝固を生じさせる。
ウマおよび他の蹄動物の場合、これらの血液凝固は最終
的に蹄組織を死滅させて小兵又は死亡の原因となる。
的に蹄組織を死滅させて小兵又は死亡の原因となる。
この複合ワクチンはウマにおいて、皓食による腸炎又は
ストレスにかかったウマの血流中に入り込んだ内毒素又
はグラム陰性バクテリアを中和することにょ９腸炎又は
仙痛の影響を防止し得る利点を有する。ウシの場合でも
血流に浸入した内毒素又はグラム陰性バクテリアを中和
することによシ、内毒素系疾患を防止ないし減少させる
ことができる。食肉ウシにおける突然死症候群（腸のグ
ラム陰性菌からの内毒素により生ずるもの）はそのよう
な病気の古くからの例であり、畜産業において重大な意
味を有する。
ストレスにかかったウマの血流中に入り込んだ内毒素又
はグラム陰性バクテリアを中和することにょ９腸炎又は
仙痛の影響を防止し得る利点を有する。ウシの場合でも
血流に浸入した内毒素又はグラム陰性バクテリアを中和
することによシ、内毒素系疾患を防止ないし減少させる
ことができる。食肉ウシにおける突然死症候群（腸のグ
ラム陰性菌からの内毒素により生ずるもの）はそのよう
な病気の古くからの例であり、畜産業において重大な意
味を有する。
細胞ワクチンとともに免疫調整内毒素の添加が種痘動物
の免疫応答の早期、敏感性を誘発することが見出された
。すなわち、バクテリア＋変性毒素又は細胞ワクチンの
みを筋肉〜投与により成熟したウマ又はポニーの群に接
種した。この実験開始の一週間前にこれらの動物から採
血し、その免疫フロフィールを調べたところ、全て正常
であった（すなわち、椎弓炎の徴候は見られなかった）
。免疫後２４時間ののち、血清サンプルを集め、抗原特
異固相ラジオイムノアッセイ（同位元素標識免疫定量法
）を用いて抗体力価を調べた。第１図に示すデータは細
胞ワクチン−変性毒素で接種した動物は３日後に早くも
抗体力価が認められ、バクテリアのみを受けた動物の場
合の７日後とは対照的であった。
の免疫応答の早期、敏感性を誘発することが見出された
。すなわち、バクテリア＋変性毒素又は細胞ワクチンの
みを筋肉〜投与により成熟したウマ又はポニーの群に接
種した。この実験開始の一週間前にこれらの動物から採
血し、その免疫フロフィールを調べたところ、全て正常
であった（すなわち、椎弓炎の徴候は見られなかった）
。免疫後２４時間ののち、血清サンプルを集め、抗原特
異固相ラジオイムノアッセイ（同位元素標識免疫定量法
）を用いて抗体力価を調べた。第１図に示すデータは細
胞ワクチン−変性毒素で接種した動物は３日後に早くも
抗体力価が認められ、バクテリアのみを受けた動物の場
合の７日後とは対照的であった。
３〜１４日の間の第１図の免疫応答曲線によれば細胞ワ
クチン＋変性肯素を与えた群では細胞ワクチンのみを与
えた群と比較して勾配が急峻である。これは前者の場合
、抗体の生産速度がよＱ大きいことを示して因る。した
がって、細胞ワクチン十内毒素投与の群は早急な保瞳が
得られるものと思わ五る。さらに細胞ワクチンのみを受
けた動物の場合と比較して前者のものは循環流中の中和
又はオゾン′ニン化抗体の高濃度による全般的保護の向
上が見られた。
クチン＋変性肯素を与えた群では細胞ワクチンのみを与
えた群と比較して勾配が急峻である。これは前者の場合
、抗体の生産速度がよＱ大きいことを示して因る。した
がって、細胞ワクチン十内毒素投与の群は早急な保瞳が
得られるものと思わ五る。さらに細胞ワクチンのみを受
けた動物の場合と比較して前者のものは循環流中の中和
又はオゾン′ニン化抗体の高濃度による全般的保護の向
上が見られた。
エントドキンイド（すなわち解毒内毒素、又は変性毒素
）をマウス、ウマ、ポニー、ウシに投与し、細胞ワクチ
ンとともに、免疫調整剤として安全に投与し得る最大量
について調べた。
）をマウス、ウマ、ポニー、ウシに投与し、細胞ワクチ
ンとともに、免疫調整剤として安全に投与し得る最大量
について調べた。
ｃｉ”−１マウスについて、自然の内毒素を０．３〜０
．６■静脈注射した場合、ＬＤ ｓｏは通常７２〜９６
時間内に達せられる。
．６■静脈注射した場合、ＬＤ ｓｏは通常７２〜９６
時間内に達せられる。
；ｔ Ｘ （Ｄ ＣＦ−１７つｘ（Ｌ５−２０＃）の尾
部血管に、０．１−の生理食塩水、０．１−の゛生理食
塩水に内毒素を３００μＩ溶かしたもの、０．１−の生
理食塩水にエンドトキソイドをそれぞれ６００μｇ。
部血管に、０．１−の生理食塩水、０．１−の゛生理食
塩水に内毒素を３００μＩ溶かしたもの、０．１−の生
理食塩水にエンドトキソイドをそれぞれ６００μｇ。
６０００μ、１１２，０００μｙ溶かしたものを接種し
た。これらのマウスについて、２４時間間隔で悪影響お
よび死亡率について観察した。死亡は内毒累投与群（正
の制御）において、４８時間以内に認められ、最大死亡
率（５６％）は７２時間後に認められた（表１）。これ
に対し、変性毒素の２倍（６００μｙ）を投与した群で
は死亡は見られず、２０倍（６０００μｇ）投与した群
では死亡率がわずか１７％であり、４０倍（１２，００
０μｌ投与した群ではＬＤ５３となった。このことから
、変性毒素は天然の内毒素よシも毒性が少なくとも４０
分の１以下であると判定した。
た。これらのマウスについて、２４時間間隔で悪影響お
よび死亡率について観察した。死亡は内毒累投与群（正
の制御）において、４８時間以内に認められ、最大死亡
率（５６％）は７２時間後に認められた（表１）。これ
に対し、変性毒素の２倍（６００μｙ）を投与した群で
は死亡は見られず、２０倍（６０００μｇ）投与した群
では死亡率がわずか１７％であり、４０倍（１２，００
０μｌ投与した群ではＬＤ５３となった。このことから
、変性毒素は天然の内毒素よシも毒性が少なくとも４０
分の１以下であると判定した。
表 １
（ＣＦ−１マウスにおける変性毒素と内毒素との比較）
成熟したウマおよびポニーをエンドトキソイド５Ｉｌｌ
！７以下で筋肉内に接種した。これら動物を発熱、末梢
環流、６脈、剪圧、嗜眠、下痢について４日間、１日２
回の割合で観察した。２．５〜の投与を受けた動物は一
匹も何んらの悪い影響を示さなかった。５■の投与ｉ受
けた動物は体温が１０３＝１０５’Ｆに不規則的に上昇
した。又、６脈が若干上り、末梢環流の若干の損失が見
られた。これらの症状は８〜１２時間以内に減退した。
成熟したウマおよびポニーをエンドトキソイド５Ｉｌｌ
！７以下で筋肉内に接種した。これら動物を発熱、末梢
環流、６脈、剪圧、嗜眠、下痢について４日間、１日２
回の割合で観察した。２．５〜の投与を受けた動物は一
匹も何んらの悪い影響を示さなかった。５■の投与ｉ受
けた動物は体温が１０３＝１０５’Ｆに不規則的に上昇
した。又、６脈が若干上り、末梢環流の若干の損失が見
られた。これらの症状は８〜１２時間以内に減退した。
しかし、下痢、血液疾患その他の不可逆的症状を示した
動物は見当らなかった。これらの結果から２，５〜以下
（２５００μＩ以下）又はワクチン中に免疫調整剤とし
て導入され得るとした変性毒素１００μＩの２５倍をウ
マおよびポニーに安全に使用し得ることが確認された。
動物は見当らなかった。これらの結果から２，５〜以下
（２５００μＩ以下）又はワクチン中に免疫調整剤とし
て導入され得るとした変性毒素１００μＩの２５倍をウ
マおよびポニーに安全に使用し得ることが確認された。
ウシについては変ｉ毒素を１０００μｇ以下筋肉内に接
種し、２目間隔で１６日間、発熱、白血球減少又は白血
球症、単核細胞異常（ｆＭ別血球計算）、赤血球異常、
嗜眠、下痢について観察した。しかし、何んらの不都合
な作用は見られなかった。このことから変性毒素１００
０μｇまで免疫調整剤としてワクチンに安全に添加し得
ると判定した。
種し、２目間隔で１６日間、発熱、白血球減少又は白血
球症、単核細胞異常（ｆＭ別血球計算）、赤血球異常、
嗜眠、下痢について観察した。しかし、何んらの不都合
な作用は見られなかった。このことから変性毒素１００
０μｇまで免疫調整剤としてワクチンに安全に添加し得
ると判定した。
ワクチンの安全性 ・
以下の規準処関してワクチンの安全性を評価した。
、 （１）通常の接種法での好適量に関連させて、マウス５
．ウマ、ウシに大量投与（５倍以下）した場合；（２）
短時間間隔で多数回の投与をウマ、ウシに施した場合；
（３）接種経路（筋肉内、皮下、腹腔内）：（４）将来
の品質制御の手段として実験マウス中；（５）多標準を
評価し得る実験用ウマおよびに一中：（６）野外研究で
、多数のウマ、に−およびウシ、分布広汎な遺伝子プー
ルにおいて、限られた因子についての評価。
、 （１）通常の接種法での好適量に関連させて、マウス５
．ウマ、ウシに大量投与（５倍以下）した場合；（２）
短時間間隔で多数回の投与をウマ、ウシに施した場合；
（３）接種経路（筋肉内、皮下、腹腔内）：（４）将来
の品質制御の手段として実験マウス中；（５）多標準を
評価し得る実験用ウマおよびに一中：（６）野外研究で
、多数のウマ、に−およびウシ、分布広汎な遺伝子プー
ルにおいて、限られた因子についての評価。
成熟したメスおよびオスのマウス（２０−２５１ｍ）の
群についてワクチン収はワクチン成分１ゴ分量を接種し
た。これらマウスを死亡率、毛並み、を髄彎曲および抱
合（末梢筋冷却を示すもの）、脱水、嗜眠、下痢、膿瘍
について９６時間観察した。
群についてワクチン収はワクチン成分１ゴ分量を接種し
た。これらマウスを死亡率、毛並み、を髄彎曲および抱
合（末梢筋冷却を示すもの）、脱水、嗜眠、下痢、膿瘍
について９６時間観察した。
表 ２
（マウスに対するワクチン接種）
（注）＊・・・サイズが小さいためｌＯ〜０．１−分量
をマウスの筋肉内に接種 林・・・脂質−タンパク高親和性担体による血清タンノ
母りの吸着のため数回の脱水でマウスは死亡した＠ ＊＊＊・・・１−分量（２−のワクチン中の担体の量に
相当）をのちに腹腔的投与。
をマウスの筋肉内に接種 林・・・脂質−タンパク高親和性担体による血清タンノ
母りの吸着のため数回の脱水でマウスは死亡した＠ ＊＊＊・・・１−分量（２−のワクチン中の担体の量に
相当）をのちに腹腔的投与。
表２のデータによればワクチン１ ｍｌの投与（皮下又
は筋肉内）は実験マウスに対し全く危険はない。しかし
、接種の腹腔投与の場合は脂質−タンパク親和性担体の
体重に対する割合が高（（１：２０）、Ｉ−たがってタ
ンノやりηの脱水のため３０係の死亡率を示した。この
腹腔的投与の悪い影響は問題となら々いと判定された。
は筋肉内）は実験マウスに対し全く危険はない。しかし
、接種の腹腔投与の場合は脂質−タンパク親和性担体の
体重に対する割合が高（（１：２０）、Ｉ−たがってタ
ンノやりηの脱水のため３０係の死亡率を示した。この
腹腔的投与の悪い影響は問題となら々いと判定された。
なぜならばワクチンの目標種は担体に対する体重比が異
常に大きいからである。なお、接種の経路は腹腔内より
も筋肉内又は皮下がより好ましい。
常に大きいからである。なお、接種の経路は腹腔内より
も筋肉内又は皮下がより好ましい。
健康な成熟ウマに筋肉を介してワクチンを５倍（５Ｘ１
０１０バクテリア、５０μＩ変性毒素）６目間隔で２回
続けて接種した。これら動物を無食欲症、嗜眠、下痢、
脱水および注射部位での膿瘍、はれ、柔軟化について観
察した。その結果、悪い影響は注射部位における若干の
はれ、柔軟化が見られただけで、４８−７２時間以内に
消えた。
０１０バクテリア、５０μＩ変性毒素）６目間隔で２回
続けて接種した。これら動物を無食欲症、嗜眠、下痢、
脱水および注射部位での膿瘍、はれ、柔軟化について観
察した。その結果、悪い影響は注射部位における若干の
はれ、柔軟化が見られただけで、４８−７２時間以内に
消えた。
５００〜６５０ポンドのウシで筋肉を介して１８日目間
隔４．５倍（４，５Ｘ１０ バクテリア、４３７μＩ
変性毒素）を２回連続して接種した。
隔４．５倍（４，５Ｘ１０ バクテリア、４３７μＩ
変性毒素）を２回連続して接種した。
又、１頭のウシについては１１．２５倍（１，１２５×
１０ バクテリアおよび１■の変性毒素）のワクチンを
１回のみ接種した。全ての動物について、１日２回、無
食欲症、嗜眠、下痢、脱水、注射部位［おける柔軟化、
はれ、膿瘍について観察したが、悪い反応は全く見られ
なかった。
１０ バクテリアおよび１■の変性毒素）のワクチンを
１回のみ接種した。全ての動物について、１日２回、無
食欲症、嗜眠、下痢、脱水、注射部位［おける柔軟化、
はれ、膿瘍について観察したが、悪い反応は全く見られ
なかった。
この結果からウマ、ウシに対し適当として定められた投
与量、方法においては危険性は全くないことが確認され
た。
与量、方法においては危険性は全くないことが確認され
た。
健康な成熟ウマに対し、筋肉を介してワクチンを２゜５
倍（２，５Ｘ１０ バクテリア、２００μＩの変性毒
素）を３日置きに９日間投与し、ついで７日間休ませた
のち、３投与・３目間隔の接種をさらに５回施した。し
たがって、６４日間に１８回の接種をおこなった。連続
的投与は首部と尻部とを交互に変えておこなった。
倍（２，５Ｘ１０ バクテリア、２００μＩの変性毒
素）を３日置きに９日間投与し、ついで７日間休ませた
のち、３投与・３目間隔の接種をさらに５回施した。し
たがって、６４日間に１８回の接種をおこなった。連続
的投与は首部と尻部とを交互に変えておこなった。
これらの動物について、無食欲症、嗜眠、および下痢、
脱水および注射部の柔軟化、はれ、膿瘍について観察し
たが、悪い反応は局部的軟化、はれ、ｓｇが１０回の接
種ののちに一部の動物に見られたにすぎなかった。この
Ｓ瘍は排液したところ急速に解け、接種処置を続行する
ことができた。他の悪影響は全く見られなかった。
脱水および注射部の柔軟化、はれ、膿瘍について観察し
たが、悪い反応は局部的軟化、はれ、ｓｇが１０回の接
種ののちに一部の動物に見られたにすぎなかった。この
Ｓ瘍は排液したところ急速に解け、接種処置を続行する
ことができた。他の悪影響は全く見られなかった。
−１９０〜６５０ポンドの子ウシに対しワクチンを４倍
投与（４Ｘ１０ バクアリア、変性毒素４００μｇ）
を皮下に施した。１７日後、これらの子ウシの一部に筋
肉を介してワクチンの１倍投与を施した。これら全ての
動物について、無食欲症、嗜眠、下痢、脱水について１
２０日間。
投与（４Ｘ１０ バクアリア、変性毒素４００μｇ）
を皮下に施した。１７日後、これらの子ウシの一部に筋
肉を介してワクチンの１倍投与を施した。これら全ての
動物について、無食欲症、嗜眠、下痢、脱水について１
２０日間。
毎日観察した。又、体重、体温、血液疾患について、最
初の１５日間は３目間隔、その後の１２０日間は３０日
目間隔観察した。その結果、５頭は固い局部的小結節が
最初の４倍皮下接種ののぢに見られたが、８−１２日以
内に分解吸収された。このような小結節の発生は筋肉内
１倍投与を再び施した場合には見られなか−）ｆｃ。
初の１５日間は３目間隔、その後の１２０日間は３０日
目間隔観察した。その結果、５頭は固い局部的小結節が
最初の４倍皮下接種ののぢに見られたが、８−１２日以
内に分解吸収された。このような小結節の発生は筋肉内
１倍投与を再び施した場合には見られなか−）ｆｃ。
一群のウマ、ポニーにワクチン（１×１０ バクテリア
、変性毒素１００μＩ／体１１１ｋｇ当シ）を筋肉内を
介して１４日目間隔２回投与した。ついで無食欲症、嗜
眠、下痢、脱水および注射部位における軟化、はれ、膿
瘍について毎日観察した。その結果、数頭の動物につい
て、注射部位における若干の軟化が見られたにすぎなか
った。
、変性毒素１００μＩ／体１１１ｋｇ当シ）を筋肉内を
介して１４日目間隔２回投与した。ついで無食欲症、嗜
眠、下痢、脱水および注射部位における軟化、はれ、膿
瘍について毎日観察した。その結果、数頭の動物につい
て、注射部位における若干の軟化が見られたにすぎなか
った。
５５０〜６５０／ンドの肉食ウシにワクチン（ＩＸＩＯ
バクテリア、１００μＩの変性毒素／体重１ｋｌＦ当り
）を接種した。一部のウシに対しては筋肉内、他のウシ
に対しては皮下に接種した。
バクテリア、１００μＩの変性毒素／体重１ｋｌＦ当り
）を接種した。一部のウシに対しては筋肉内、他のウシ
に対しては皮下に接種した。
これらウシについて、無食欲症、嗜眠、下痢、脱水、注
射部位の軟化、はれ、膿瘍を５０日間毎日観察した。そ
の結果、注射部位を含め、悪影響は全く見られなかった
。また小結節の発生も皮下投与のウシについて全く認め
られなかった。
射部位の軟化、はれ、膿瘍を５０日間毎日観察した。そ
の結果、注射部位を含め、悪影響は全く見られなかった
。また小結節の発生も皮下投与のウシについて全く認め
られなかった。
これらの結果から、適当量および適当投与方法でワクチ
ンをウマ、ウシ、ポニー等に施した場合はこれら動物に
対する危険性は筋肉内又は皮下投与の場合でも全くない
ことが確認できた。
ンをウマ、ウシ、ポニー等に施した場合はこれら動物に
対する危険性は筋肉内又は皮下投与の場合でも全くない
ことが確認できた。
ワクチンの効能
健康な成熟ウマおよびポニーに筋肉内投与を介して１倍
量のワクチン（ＩＸＩＯバクテリアおよび１００μＩの
変性毒素）を２週間間隔で２回施した。これら動物から
約−週間間隔で採血し、抗体力価をラジオイミュノアッ
セイ法により測定した。その結果第１次免疫徒２０〜３
０日経過時に大部分が免疫応答の曲線がピークとなり、
また、第２次又は既往免疫ののち１０〜２０日経過時に
免疫応答がピークとなった。予防効能は炭水化物飽食（
Ｐｅｒｕｓ）又は接種動物に対する致死量以下の変性毒
素投与（静脈内）により第２次免疫後の梯々の時点で判
定した。
量のワクチン（ＩＸＩＯバクテリアおよび１００μＩの
変性毒素）を２週間間隔で２回施した。これら動物から
約−週間間隔で採血し、抗体力価をラジオイミュノアッ
セイ法により測定した。その結果第１次免疫徒２０〜３
０日経過時に大部分が免疫応答の曲線がピークとなり、
また、第２次又は既往免疫ののち１０〜２０日経過時に
免疫応答がピークとなった。予防効能は炭水化物飽食（
Ｐｅｒｕｓ）又は接種動物に対する致死量以下の変性毒
素投与（静脈内）により第２次免疫後の梯々の時点で判
定した。
非ワクチン投与ウマ又はポニーの７０〜８０チはＯｂｅ
１度３−４、急性椎弓炎が、トウモロコシ−おがくず粉
がゆを胃管を介して１７．６１１／体重ｉｂの投与で炭
水化物を飽食させたのち４０〜５０時間後に発生してい
た。非ワクチン投与ウマ又はポニーの１ｏｏｓは内毒１
を１０μＩ（体重１にｇ当り）静脈投与したのち２−３
分以内に頻呼吸、呼吸困難、運動失調を発生し、４５分
以内に液様の形のない便が出た。
１度３−４、急性椎弓炎が、トウモロコシ−おがくず粉
がゆを胃管を介して１７．６１１／体重ｉｂの投与で炭
水化物を飽食させたのち４０〜５０時間後に発生してい
た。非ワクチン投与ウマ又はポニーの１ｏｏｓは内毒１
を１０μＩ（体重１にｇ当り）静脈投与したのち２−３
分以内に頻呼吸、呼吸困難、運動失調を発生し、４５分
以内に液様の形のない便が出た。
表 ３
（注）＊・・・Ｏｂｅ１度（３−４）急性椎弓炎又は内
毒素媒介症状を挑戦後に起した動物の数。
毒素媒介症状を挑戦後に起した動物の数。
表３はワクチン投与動物の約９０％は炭水化物飽食後の
Ｏｂｅ １度３−４急性椎弓炎を起さなかったのに対し
、ワクチン非投与参照動物（１２〜１４才以上の１００
頭の動物）ではそれがわずか１５〜２５％であったこと
から予防効果は６５〜７５係であったと認められた。同
様の比較を致死量以下の内毒素をウマに与えた場合につ
いて、おこなった結果、予防効果は６０％以上であった
。これらの実験からワクチンを１倍量、２回投与したウ
マ又はポニー（成熟したもの）は炭水化物誘導椎弓炎に
ついては９０％の予防効果、内毒素誘導疾患については
６０％以上の予防効果があることが判明した。
Ｏｂｅ １度３−４急性椎弓炎を起さなかったのに対し
、ワクチン非投与参照動物（１２〜１４才以上の１００
頭の動物）ではそれがわずか１５〜２５％であったこと
から予防効果は６５〜７５係であったと認められた。同
様の比較を致死量以下の内毒素をウマに与えた場合につ
いて、おこなった結果、予防効果は６０％以上であった
。これらの実験からワクチンを１倍量、２回投与したウ
マ又はポニー（成熟したもの）は炭水化物誘導椎弓炎に
ついては９０％の予防効果、内毒素誘導疾患については
６０％以上の予防効果があることが判明した。
年令、性別が混在したウシについて皮下にワクチンを投
与し、１５日間に亘９３日間隔で、さらにその後１２０
日間は３０日間隙で採血し血清を得た。これらの抗体力
価はラジオイムノアッセイ法により判定したところ、接
種から２０日以内に全ての動物は抗体力価が２〜４倍と
なった。ワクチン投与後１２．０日の時点で動物の７０
％は可成りの力価が存在した。一部の動物についてはワ
クチン投与ｖｊ３０日間炭水化物の食事を与えた。しか
し、１７週間経過後も無食欲症、下痢、彼行、急死症候
群の徴候は全く見られなかった。
与し、１５日間に亘９３日間隔で、さらにその後１２０
日間は３０日間隙で採血し血清を得た。これらの抗体力
価はラジオイムノアッセイ法により判定したところ、接
種から２０日以内に全ての動物は抗体力価が２〜４倍と
なった。ワクチン投与後１２．０日の時点で動物の７０
％は可成りの力価が存在した。一部の動物についてはワ
クチン投与ｖｊ３０日間炭水化物の食事を与えた。しか
し、１７週間経過後も無食欲症、下痢、彼行、急死症候
群の徴候は全く見られなかった。
５５０〜６８０ポンドの食肉ウシに１− （ＩＸ）投与
量のワクチンを施し、下痢、彼行、突然死について毎日
観察したが１１週間経過後も全く異常は見られなかった
。
量のワクチンを施し、下痢、彼行、突然死について毎日
観察したが１１週間経過後も全く異常は見られなかった
。
血清
明らかに内毒素による疾患を持ったワクチン非投与動物
は、複合ワクチン接種後でも、抗体を予防に十分なレベ
ルまで増強させる余裕を、それ自身の免疫システムでと
ることができないとの理論に基づいて、超免疫血清の開
発および治療上の使用がなされている。すなわち、他の
動物により発展させた予め貯そうされた抗体（超血清）
で受動免疫化することにより短期間の保護手段が得られ
、これによシその動物自身の免疫システムが十分に予防
的となるまで内毒素疾患の改善に役立つものである。ワ
クチン非投与ウマの急性椎弓炎因子が偶発的に穀物容器
内に入り込み、これがのちに腸炎の原因となることはウ
マの飼育場における古くからの例である。
は、複合ワクチン接種後でも、抗体を予防に十分なレベ
ルまで増強させる余裕を、それ自身の免疫システムでと
ることができないとの理論に基づいて、超免疫血清の開
発および治療上の使用がなされている。すなわち、他の
動物により発展させた予め貯そうされた抗体（超血清）
で受動免疫化することにより短期間の保護手段が得られ
、これによシその動物自身の免疫システムが十分に予防
的となるまで内毒素疾患の改善に役立つものである。ワ
クチン非投与ウマの急性椎弓炎因子が偶発的に穀物容器
内に入り込み、これがのちに腸炎の原因となることはウ
マの飼育場における古くからの例である。
超免疫血清は凝固血清又はそれらの一部（γ−グロブリ
ン、イムノグロブリン又はイムノグロブリンＩｇＧＴ）
からなシ、分類学上の腸内菌族のバクテリアの内毒素中
のコア成分（２−ケト−３−デオキシオフトン酸−脂質
Ａ）に対し特異性を示す抗体を含んでいる。この抗体は
複合ワクチンにより動物を超免疫化する仁とにより誘発
される。
ン、イムノグロブリン又はイムノグロブリンＩｇＧＴ）
からなシ、分類学上の腸内菌族のバクテリアの内毒素中
のコア成分（２−ケト−３−デオキシオフトン酸−脂質
Ａ）に対し特異性を示す抗体を含んでいる。この抗体は
複合ワクチンにより動物を超免疫化する仁とにより誘発
される。
、超血清は健康な成熟ウマに複合ワクチン２．５−を３
目間隔で６回連続的に、さらに７目間隔で２．５１１１
７！を２回連続的に筋肉内を介シて注射することによっ
て得られる。ｊｎ消サンプルはワクチ゛ン投与前にこの
ウマから採取され、その後、３目間隔で血清学上の分析
がなされる。抗原特異イムノグロブリン（ｇＧ、 ＧＴ
、 Ａ、 Ｍ）の濃度は１２５■−プロティンＡを用い
たラジオイムノアッセイにより判定される。各動物の免
疫応答が高平部に達したとき、全血を−１２に採血する
。超免疫血清は凝固（約２４時間後）ののち遠心分離に
より分取し、ついで加熱“無活性化（５６℃。
目間隔で６回連続的に、さらに７目間隔で２．５１１１
７！を２回連続的に筋肉内を介シて注射することによっ
て得られる。ｊｎ消サンプルはワクチ゛ン投与前にこの
ウマから採取され、その後、３目間隔で血清学上の分析
がなされる。抗原特異イムノグロブリン（ｇＧ、 ＧＴ
、 Ａ、 Ｍ）の濃度は１２５■−プロティンＡを用い
たラジオイムノアッセイにより判定される。各動物の免
疫応答が高平部に達したとき、全血を−１２に採血する
。超免疫血清は凝固（約２４時間後）ののち遠心分離に
より分取し、ついで加熱“無活性化（５６℃。
３０分）シ、さらにｒ−グロブリン又はイムノグロブリ
ンののちのＮ製又は使用まで４℃にて貯ぞうされる。
ンののちのＮ製又は使用まで４℃にて貯ぞうされる。
γ−グロブリンは５０％０％飽和アンモニウムスルフニ
ー（ＳＡＳ ）を用いて超免疫血清から析出させてつく
る。この析出物を０．０１Ｍのりん酸塩緩衝液（ＰＢ、
ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＩ（ＰＯ４，ｐＨ８）中に再懸
濁させ、同じ緩衝液に対し、完全に透析させてＳＡＳを
除去した。
ー（ＳＡＳ ）を用いて超免疫血清から析出させてつく
る。この析出物を０．０１Ｍのりん酸塩緩衝液（ＰＢ、
ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＩ（ＰＯ４，ｐＨ８）中に再懸
濁させ、同じ緩衝液に対し、完全に透析させてＳＡＳを
除去した。
超免疫血清５０ｍから得られたγ−グロブリンをＰＢで
平衡させたジエチルアミノエタノール（ＤＥＡＥ）セル
ロース（ｐＨ＝８）のコラム（５×’５０ ｃｍ ’）
に吸収させた。このコラムは最初に平衡緩衝液（ＰＲ，
ｐ）（＝８）で処理し、ＩｇＧを溶出させ、ついでこの
ＰＢに対し、ＮａＣｌグラジエン）（０，０３Ｍ）を添
加し、ＩｇＧ（Ｔ）を解離させる。
平衡させたジエチルアミノエタノール（ＤＥＡＥ）セル
ロース（ｐＨ＝８）のコラム（５×’５０ ｃｍ ’）
に吸収させた。このコラムは最初に平衡緩衝液（ＰＲ，
ｐ）（＝８）で処理し、ＩｇＧを溶出させ、ついでこの
ＰＢに対し、ＮａＣｌグラジエン）（０，０３Ｍ）を添
加し、ＩｇＧ（Ｔ）を解離させる。
この溶出液を冷凍分留捕集器を用いて５１ｎｔづつに集
め、ベックマンＤＢ−ＧＴ分光光度計を用いて溶出ピー
クを連続的にモニターし、二重波長３６０ ｎｍおよび
３８０ ｎｍを得る。タンパク質濃度はＷａｒｂｅｒｇ
−Ｃｈｒｌａｔｌａｎ定数を用い判定し、Ｌｏｗｒｙ法
により確認する。Ｔ ｇＧ （Ｔ）分を貯め、親液化し
、受゛動免疫化のための使用に供するため一４０℃で貯
ぞうした。炭水化物で飽食させて、又はバクテリア内毒
素の腹腔内注射により実験、的に腸炎を生じさせたウマ
に、複合ワクチンで蒙種した他のウマから得た超免疫血
清を投与したところ急速な改善が得られた。同じように
してワクチン接種されたウマから得た超免疫血清で免疫
することによシマウスもバクテリア内毒素の静脈注射に
よる死亡を回避することができる。
め、ベックマンＤＢ−ＧＴ分光光度計を用いて溶出ピー
クを連続的にモニターし、二重波長３６０ ｎｍおよび
３８０ ｎｍを得る。タンパク質濃度はＷａｒｂｅｒｇ
−Ｃｈｒｌａｔｌａｎ定数を用い判定し、Ｌｏｗｒｙ法
により確認する。Ｔ ｇＧ （Ｔ）分を貯め、親液化し
、受゛動免疫化のための使用に供するため一４０℃で貯
ぞうした。炭水化物で飽食させて、又はバクテリア内毒
素の腹腔内注射により実験、的に腸炎を生じさせたウマ
に、複合ワクチンで蒙種した他のウマから得た超免疫血
清を投与したところ急速な改善が得られた。同じように
してワクチン接種されたウマから得た超免疫血清で免疫
することによシマウスもバクテリア内毒素の静脈注射に
よる死亡を回避することができる。
健康な成熟マウス（２０ｇｍ 、 ＣＦ−１）に腹腔を
介してウマ超免疫全血清の１００％、１０％、０．１チ
溶液１−を４日間連続して接種した。これらの動物にら
いて、呼吸困難、硬直、鼻および尾環流、眼のはれ、外
被組織、死亡九ついて４日間、１２時間間隔で観察した
。その結果、ＩＰ血清注射による悪影響は全く見られな
かった。
介してウマ超免疫全血清の１００％、１０％、０．１チ
溶液１−を４日間連続して接種した。これらの動物にら
いて、呼吸困難、硬直、鼻および尾環流、眼のはれ、外
被組織、死亡九ついて４日間、１２時間間隔で観察した
。その結果、ＩＰ血清注射による悪影響は全く見られな
かった。
健康な成熟ポ；−に超免疫血清７００Ｉ１１７！に乳酸
加すンｒン液１０００Ｔｎｌを添加したものを静脈点滴
により９０分間投与した。この動物を体温、心臓、末梢
環流および不安又はストレスに関して６．５分間、１０
〜１５分間隔でモニターしたところ、不安、ストレスの
徴候は全くなく、体温、心１脈が問題になシない程度の
微上昇（１００，４〒→１．．０１．３°Ｆ；５０→５
６ピ一ト／分）が上記点滴開始の？０〜９０分後艷見ら
れた。
加すンｒン液１０００Ｔｎｌを添加したものを静脈点滴
により９０分間投与した。この動物を体温、心臓、末梢
環流および不安又はストレスに関して６．５分間、１０
〜１５分間隔でモニターしたところ、不安、ストレスの
徴候は全くなく、体温、心１脈が問題になシない程度の
微上昇（１００，４〒→１．．０１．３°Ｆ；５０→５
６ピ一ト／分）が上記点滴開始の？０〜９０分後艷見ら
れた。
９００ボンドのウマ工数置溶、性で・ツクによる合併症
を有するものに、乳酸加リンダン液に超免疫血清を溶か
したもの１２００−を１０時間゛に亘９腹腔投与により
接種した。この動物は毒性による徴候を示さず、著るし
い改善を示した。
を有するものに、乳酸加リンダン液に超免疫血清を溶か
したもの１２００−を１０時間゛に亘９腹腔投与により
接種した。この動物は毒性による徴候を示さず、著るし
い改善を示した。
筋肉内接種の安全性を確かめるため、健康な成熟７ｊｅ
ニーに超免疫血清を筋肉を介して０ 、１０゜２０、お
よび４０ＩＩ＋／投与した。この接種後１，２゜４．８
．１２および２４時間後の時点について、（１）放尿；
（２）下痢；（３）硬直；（４）末梢環流；（５）体温
；（６）呼吸；（７）心臓：（８）白血球症（又は減少
症）；（９）赤血球症（又は減少症）をモニターした。
ニーに超免疫血清を筋肉を介して０ 、１０゜２０、お
よび４０ＩＩ＋／投与した。この接種後１，２゜４．８
．１２および２４時間後の時点について、（１）放尿；
（２）下痢；（３）硬直；（４）末梢環流；（５）体温
；（６）呼吸；（７）心臓：（８）白血球症（又は減少
症）；（９）赤血球症（又は減少症）をモニターした。
その結果、悪影響は全く見られず、−頭の４〇−の投与
を受けたポニーの首に分散した小結節が見られたが、こ
れは４時間以内に消えた。
を受けたポニーの首に分散した小結節が見られたが、こ
れは４時間以内に消えた。
保護抗体を含むγ−グロブリンを超免疫血清から抽出し
、タンノぐり質１ミリグラム単位で保護能を評価した。
、タンノぐり質１ミリグラム単位で保護能を評価した。
前免疫および超免疫血清であって、ワクチンで超免疫し
たウマから採取したものを、内毒素で静脈投にする前に
２日間連続で種々の濃度のｒ−グロブリンをＣＦ−１マ
ウスに接種して比較した。第２，３図に示すデータは受
動免疫マウスモデルを用い、２頭の別々のウマ（φ２３
．≠２４）からの前免疫および超免疫グロブリンを比較
したものである。超免疫グロブリンは超免疫化後、２度
（÷２３Ａ、す２３Ｂ）、ウマナ２３からつくられたも
の゛である。ナ２３前免疫又は超免疫（す２３Ａおよび
す２３Ｂ）グロブリン５０μＩ以上を以って受動的に免
疫されたマウスの内毒素投与９６時間後の生存率の比較
によれば、超免疫グロブリンを受けたマウスは生存率が
少なくとも２０（＋２３Ｂの場合）ないし５０％（４２
３Ａの場合）上昇していることが示唆されている（第２
図）。さらに◆２４前免疫を＋２４超免疫と比較した場
合、その程度が若干落るがほぼ同様の効能があることが
明らかであろう（第３図参照）。この結果から超免疫血
清は致命的内毒素からマウスを保護し得る抗体を含むこ
とが確認さ゛れ′非。 −超免疫γ−グロブリ
ンの効能をウマおよびポニーを用い、これに抗体タンパ
クを５．１５又は２０ＩＲ９（Ｋ重１ｋｇ当、υ）を静
脈内接種したのち、内毒素又は炭水化物飽食によフ挑戦
しておこなった。すべての動物に÷２３Ａおよび＋２３
Ｂの超免疫ｒ−グロブリン混合物が与えられた。
たウマから採取したものを、内毒素で静脈投にする前に
２日間連続で種々の濃度のｒ−グロブリンをＣＦ−１マ
ウスに接種して比較した。第２，３図に示すデータは受
動免疫マウスモデルを用い、２頭の別々のウマ（φ２３
．≠２４）からの前免疫および超免疫グロブリンを比較
したものである。超免疫グロブリンは超免疫化後、２度
（÷２３Ａ、す２３Ｂ）、ウマナ２３からつくられたも
の゛である。ナ２３前免疫又は超免疫（す２３Ａおよび
す２３Ｂ）グロブリン５０μＩ以上を以って受動的に免
疫されたマウスの内毒素投与９６時間後の生存率の比較
によれば、超免疫グロブリンを受けたマウスは生存率が
少なくとも２０（＋２３Ｂの場合）ないし５０％（４２
３Ａの場合）上昇していることが示唆されている（第２
図）。さらに◆２４前免疫を＋２４超免疫と比較した場
合、その程度が若干落るがほぼ同様の効能があることが
明らかであろう（第３図参照）。この結果から超免疫血
清は致命的内毒素からマウスを保護し得る抗体を含むこ
とが確認さ゛れ′非。 −超免疫γ−グロブリ
ンの効能をウマおよびポニーを用い、これに抗体タンパ
クを５．１５又は２０ＩＲ９（Ｋ重１ｋｇ当、υ）を静
脈内接種したのち、内毒素又は炭水化物飽食によフ挑戦
しておこなった。すべての動物に÷２３Ａおよび＋２３
Ｂの超免疫ｒ−グロブリン混合物が与えられた。
この２種類の製剤の組□合せは公知の抗体タンノ９りの
適当量を確認するために必要とした。予防効果は致死蓋
以下の内毒素投与又は炭水化物飽食動物における直後の
生活性の顕著な遅延又は回復、０ｂｅ１度２疾患又はそ
れ以下の発生として規定した＠ 表 ４ （前免疫および超免疫血清によるウマの受動免疫）（注
）％は挑戦後のＯｂｅ １度（３−４）推弓炎又は内毒
素媒介徴候の発生を示している。
適当量を確認するために必要とした。予防効果は致死蓋
以下の内毒素投与又は炭水化物飽食動物における直後の
生活性の顕著な遅延又は回復、０ｂｅ１度２疾患又はそ
れ以下の発生として規定した＠ 表 ４ （前免疫および超免疫血清によるウマの受動免疫）（注
）％は挑戦後のＯｂｅ １度（３−４）推弓炎又は内毒
素媒介徴候の発生を示している。
第１図ないし第３図は本発明のワクチンの効能を比較例
と比較して示す線図である。 出願人代理人 弁理士 鈴 江 武 彦ネ←ワウチｙ
＃羽糺（Ｅｌ ’＆ ） Ｌ ＯＧ ＋ｏ ［Ｍ Ｇ ゲロ７″リン］ＬＯＧ
、ｏ ［ＭＧ ウ）ア１７７］手続補正書（方式、
） ４□６へ７”Ｐ Ｅｌ 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 １、事件の表示 特願昭６０−７２４９６号 ２、発明の名称 ワクチンおよびその製造法 ３、補ＩＩＥをする者 事件との関係 特許出願人 名称 デ・キュレイターズ・オブ・デ・ユニバージティ
ー・オツ・ミスリー ４、代理人 昭和６０年６月２５日
と比較して示す線図である。 出願人代理人 弁理士 鈴 江 武 彦ネ←ワウチｙ
＃羽糺（Ｅｌ ’＆ ） Ｌ ＯＧ ＋ｏ ［Ｍ Ｇ ゲロ７″リン］ＬＯＧ
、ｏ ［ＭＧ ウ）ア１７７］手続補正書（方式、
） ４□６へ７”Ｐ Ｅｌ 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 １、事件の表示 特願昭６０−７２４９６号 ２、発明の名称 ワクチンおよびその製造法 ３、補ＩＩＥをする者 事件との関係 特許出願人 名称 デ・キュレイターズ・オブ・デ・ユニバージティ
ー・オツ・ミスリー ４、代理人 昭和６０年６月２５日
Claims (18)
- （１）細菌の突然変異体、並びにタンパクおよび脂質結
合担体を含むワクチン。 - （２）前記細菌突然変異体が、好ましくは、腸炎菌のよ
うな分類学上腸内菌科から得られ、好ましくは死菌懸濁
液として存在する非０炭水化物側鎖の細菌突然変異体か
ら成る特許請求の範囲第１項記載のワクチン。 - （３）好ましくは、Ｂリンパ球増殖傾向を有し、高親和
性の中和およびオプソニン化抗体レベルが高い免疫モジ
ュレータを含む特許請求の範囲第１項または第２項記載
のワクチン。 - （４）前記免疫モジュレータが親和性無毒化リポ多糖で
ある特許請求の範囲第３項記載のワクチン。 - （５）前記タンパク質、脂質結合担体が高い親油性およ
び高いタンパク質親和性を有し、好ましくは均一な成分
の懸濁液の長期にわたる抗原の放出を確実にするために
タンパク質、脂質結合アジュバントを含む特許請求の範
囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載のワクチン
。 - （６）細菌突然変異体がＡＴＣＣ番号５３０００であり
、グラム陰性細菌疾患に対して免疫する特許請求の範囲
第１項ないし第５項のいずれか１項に記載のワクチン。 - （７）ＡＴＣＣ番号５３０００である細菌突然変異体。
- （８）以下の段階、すなわち細菌突然変異体および免疫
モジュレータを組合わせ、前記細菌突然変異体および免
疫モジュレータの組合わせをタンパクおよび脂質結合担
体中に懸濁させることを特徴とする、グラム陰性細菌疾
患に対して免疫するワクチンの製造法。 - （９）前記細菌突然変異体の製造は以下の工程、すなわ
ち、腸炎菌のような分類学上腸内菌科から選ばれる二次
培養突然変異体である細菌を滅菌済みで培養力のある肉
汁に接種し、細菌の大きさを最大にするために前記肉汁
を約３７℃で好気的に培養し、前記細菌をマーシオレイ
トのような殺菌剤で殺菌し、前記細菌を滅菌済みで発熱
物質を含まない生理食塩水で洗浄し、および前記細菌を
予め選んだ濃度になるように再構成することを含む特許
請求の範囲第８項記載の方法。 - （１０）前記免疫モジュレータの製造は以下の工程、す
なわちグラム陰性細菌エンドトキシンを好ましくは濃度
２：１のピリジン−ギ酸溶液に混合し、前記混合物を全
還流蒸留によりメチル化し、前記メチル化エンドトキシ
ン混合物をアルコールで沈殿させ、アルコールとメチル
化エンドトキシン混合物を遠心し、および沈殿物を蒸留
水と混合させ予め定めたエンドトキシン濃度とすること
を含む特許請求の範囲第８項記載の方法。 - （１１）動物に細菌突然変異体、免疫モジュレーター、
並びにタンパクおよび脂質結合担体を接種することを特
徴とする、血管内凝固を仲介し播種するエンドトキシン
で動物を免疫する方法。 - （１２）前記細菌突然変異体の製造は、以下の工程、す
なわち腸炎菌のような分類学上腸内菌科から得られる二
次培養突然変異体である細菌を滅菌済みで培養力のある
肉汁に接種し、細菌の大きさを最大にするために前記肉
汁を約３７℃で好気的に培養し、前記細菌をマーシオレ
イトのような殺菌剤で殺菌し、前記細菌を滅菌済みで発
熱物質を含まない生理食塩水で洗浄し、および前記細菌
を予め選んだ濃度になるように再構成することを含む特
許請求の範囲第１１項記載の方法。 - （１３）免疫モジュレータを調製する工程が、（ア）グ
ラム陰性菌エンドトキシンをピリジン−ギ酸溶液と混合
し、（イ）該混合物を全還流蒸留によってメチル化し、
（ウ）該メチル化エンドトキシン混合物をアルコールで
析出させ、（エ）該アルコールと該メチル化エンドトキ
シン混合物を遠心分離に供し、および（オ）該析出物を
、エンドトキシンが所定濃度となるまで蒸留水と混合す
ることからなる特許請求の範囲第１１項記載の免疫化方
法。 - （１４）グラム陰性菌疾患を治療するための超免疫血清
であって、該血清は、（ア）ワクチンとして、細菌突然
変異体、免疫モジュレータ、並びに蛋白および脂質結合
性担体を混合し、（イ）ドナー動物に該ワクチンを接種
して、該ワクチンに応答して抗原特異性抗体を産生させ
、（ウ）該ドナー動物から全血を集め、および（エ）該
全血から該抗原特異性抗体を含有する凝固血清を生成す
ることによって得たことを特徴とする超免疫血清。 - （１５）グラム陰性菌によって疾患した動物を治療する
ための方法であって、（ア）ワクチンとして、細菌突然
変異体、免疫モジュレータ、並びに蛋白および脂質結合
性担体を混合し、（イ）ドナー動物に該ワクチンを接種
して、該ワクチンに応答して抗原特異性抗体を産生させ
、（ウ）該ドナー動物から全血を集め、（エ）該全血か
ら該抗原特異性抗体を含有する凝固血清を生成させ、お
よび（オ）保護レベルの該抗原特異性抗体を提供するに
充分な割合で該血清を疾患動物に投与することを特徴と
する疾患動物の治療方法。 - （１６）グラム陰性菌疾患に対して免疫化するためのワ
クチンであって、腸内菌属からの非０−炭水化物側鎖細
菌突然変異体よりなる細菌突然変異体、並びに蛋白およ
び脂質結合性担体よりなることを特徴とするワクチン。 - （１７）無毒化され、抽出されたリポ多糖からなる免疫
モジュレータ。 - （１８）細菌を抽出処理に供し、リポ多糖を回収し、該
リポ多糖を無毒化し、および親油化され、無毒化された
リポ多糖を回収することを特徴とする免疫モジュレータ
の調製方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US59711584A | 1984-04-05 | 1984-04-05 | |
| US597115 | 1984-04-05 | ||
| US69700885A | 1985-01-31 | 1985-01-31 | |
| US697008 | 2008-02-08 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7037582A Division JP2638755B2 (ja) | 1984-04-05 | 1995-02-02 | 細菌突然変異体 |
| JP7037581A Division JP2534032B2 (ja) | 1984-04-05 | 1995-02-02 | 免疫モジュレ―タおよびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6121A true JPS6121A (ja) | 1986-01-06 |
| JP2625099B2 JP2625099B2 (ja) | 1997-06-25 |
Family
ID=27082733
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60072496A Expired - Lifetime JP2625099B2 (ja) | 1984-04-05 | 1985-04-05 | ワクチンおよびその製造法 |
| JP7037581A Expired - Lifetime JP2534032B2 (ja) | 1984-04-05 | 1995-02-02 | 免疫モジュレ―タおよびその製造方法 |
| JP7037582A Expired - Lifetime JP2638755B2 (ja) | 1984-04-05 | 1995-02-02 | 細菌突然変異体 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7037581A Expired - Lifetime JP2534032B2 (ja) | 1984-04-05 | 1995-02-02 | 免疫モジュレ―タおよびその製造方法 |
| JP7037582A Expired - Lifetime JP2638755B2 (ja) | 1984-04-05 | 1995-02-02 | 細菌突然変異体 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5641492A (ja) |
| EP (2) | EP0540063A1 (ja) |
| JP (3) | JP2625099B2 (ja) |
| AR (1) | AR242903A1 (ja) |
| AU (2) | AU589552B2 (ja) |
| CA (1) | CA1263306A (ja) |
| DE (1) | DE3587681T2 (ja) |
| ES (2) | ES8802117A1 (ja) |
| IE (1) | IE940698L (ja) |
| PH (1) | PH23104A (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4695624A (en) * | 1984-05-10 | 1987-09-22 | Merck & Co., Inc. | Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency |
| JPS62501726A (ja) * | 1985-01-15 | 1987-07-09 | ユニサ−チ リミテツド | サルモネラ菌検出用イムノアツセイシステム |
| FI871174A (fi) * | 1986-03-18 | 1987-09-19 | Research Corp | Foerfarande foer bestaemning av haptener med hjaelp av immunoanalysteknik. |
| EP0367757B1 (en) * | 1986-05-23 | 1994-11-02 | SANOFI ANIMAL HEALTH, Inc. | Co-vaccination using non-o-carbohydrate side-chain gram-negative bacteria preparation |
| US4789544A (en) * | 1986-05-23 | 1988-12-06 | Midcon Labs. Inc. | Co-vaccination using non-O-carbohydrate side-chain gram-negative bacteria preparation |
| US6887483B2 (en) * | 1995-12-01 | 2005-05-03 | University Of Iowa Research Foundation | Non-toxic mutants of pathogenic gram-negative bacteria |
| WO1998053851A1 (en) * | 1997-05-28 | 1998-12-03 | University Of Iowa Research Foundation | Laft mutants of pathogenic gram-negative bacteria |
| US6682745B1 (en) * | 1998-07-28 | 2004-01-27 | Christiaan Antonius Arnoldus Jacobs | Use of bacterium for manufacture of a vaccine |
| EP1023903B1 (en) * | 1999-01-26 | 2004-01-14 | Akzo Nobel N.V. | Use of life attenuated bacteria for the manufacture of a submucosal vaccine |
| US7026155B2 (en) | 1999-02-02 | 2006-04-11 | Regents Of The University Of California | Method of reducing bacterial proliferation |
| US6379676B2 (en) * | 1999-03-10 | 2002-04-30 | Anitox Corporation | Enhancing immune response in animals |
| WO2006130161A2 (en) * | 2004-07-21 | 2006-12-07 | The Cornell Research Foundation, Inc. | Therapeutic compounds derived from spider venom and their method of use |
| EP2528620B1 (en) | 2010-01-28 | 2019-06-05 | Universiteit Gent | Salmonella vaccine |
| WO2015192216A1 (en) | 2014-06-20 | 2015-12-23 | University Of Saskatchewan | Exotoxin/thermolysin compositions and methods and uses for treating or preventing laminitis |
| CA3208643A1 (en) | 2021-01-18 | 2022-07-21 | Conserv Bioscience Limited | Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US3075883A (en) * | 1961-11-08 | 1963-01-29 | Cons Lab Inc | Novel parenteral vaccine antigen compositions and methods of making and using |
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