JP2534032B2 - 免疫モジュレ―タおよびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】この発明はグラム陰性菌疾患に対する免疫
および治療のためのワクチンおよび血清に係わり、特
に、他の抗原との組合せで動物、ヒトの治療に有用な解
毒（無毒化）された内毒素免疫モジュレータおよびその
製造法および使用法に関する。

【０００２】蓄産業において、内毒素疾患は家畜の健康
に重大な問題を生じさせ、その経済的影響も大きい。

【０００３】馬の場合、この内毒素疾患としては、腸炎
（すなわち、椎弓炎）、疝痛（すなわち、飽食および他
のストレス現象、たとえば腹部閉塞、腸貧血、グラム陰
性菌性腸炎、下痢、消化不良、運搬ストレス、分娩等に
関連する腹部発症）、敗血症性関節炎、グラム陰性子宮
内感染等がある。

【０００４】牛の場合の内毒素疾患としては乳牛および
食肉牛における椎弓炎、食肉牛の突然死症候群、乳牛の
乳房炎、子牛の赤痢、伝染性下痢症、大腸菌症、パラチ
フス下痢等である。

【０００５】豚の内毒素疾患としては異常無乳症（すな
わちグラム陰性子宮内膜炎に関連する乳線不全）、水腫
炎、子豚パラチフス下痢等である。

【０００６】鳥類の内毒素疾患としてはパラチフス下
痢、敗血症、肺胞、含気洞の感染症、鳥コレラ等であ
る。

【０００７】これらの内毒素媒介疾患の従来の処置は病
気が発展した後に行なうものであり、化学的療法に限ら
れていた。したがって予防処置はとられていなかった。
グラム陰性敗血症又は毒血症に対するワクチンによる予
防は、（ａ）種々の抗原性エピトープ（Ｋ−抗原又はＯ
−炭水化物側鎖）を示す自原バクテリア分離物からなる
個体化ワクチン又は（ｂ）減毒又は欠失変性バクテリア
分離物からなる生ワクチンを介してのみ行なわれてき
た。

【０００８】この内毒素媒介疾患を処置する従来法の主
な欠点はそのような処置が、病気が進展し、又、しばし
ば病気が取り返しがつかなくなった後に初めてなされる
ことである。自原バクテリア分離物からなる個体化ワク
チンを用いたグラム陰性敗血症又は毒血症に対する従来
のワクチンによる予防法は時間的、費用的又は生産上の
点で効率的でない。なぜならばそのようなワクチンは病
気が進展した後に後発的に生産されるからである。

【０００９】種々の抗原エピトープ（Ｋ−抗原又はＯ−
炭水化物側鎖）を示す複合バクテリア分離物からなる多
価ワクチンの主な欠点は、ある時点において、病気をも
たらすバクテリア分離物が抗原エピトープにおいて、疫
学的に移動ないし変動しがちで抗原特異性を変化させ、
その予防機能を喪失させることである。Ｋ−抗原又はＯ
−炭水化物側鎖も又、動物、特にウマにおいてアナフィ
ラキシー様反応を生じさせる免疫グロブリンＩｇＥの刺
激剤である。

【００１０】減毒又は欠失変性バクテリア分離物からな
る生ワクチンの主な欠点は、これらが野生型親菌株に変
換する能力を有し、種痘した動物の病原性を継続させる
ことである。

【００１１】そのため、グラム陰性バクテリアによる疾
患に対し、従来の如き欠点を伴わずに免疫、治療を行な
うことができるワクチンおよび血清の開発が求められて
いた。

【００１２】この発明は、このような要請に応じて、グ
ラム陰性菌用ワクチンおよび血清を提供することを目的
とする。

【００１３】この発明は菌突然変異体、免疫モジュレー
タおよびタンパク、脂質結合担体を具備してなる内毒素
関連疾患から動物を守ることのできる複合ワクチンおよ
び超免疫血清を提供するものである。

【００１４】さらに、この発明は菌突然変異体と免疫モ
ジュレータとを組合わせる工程と、この結合体をタンパ
ク、脂質結合担体中に懸濁させる工程とを具備してなる
ワクチンの製造法を提供するものである。

【００１５】さらに、この発明は滅菌され、腸内菌族か
ら選ばれた菌二次培養突然変異体で富化された肉汁を接
種し、温度約３７℃でこの肉汁を好気的に培養して最大
に繁殖させ、殺菌剤でバクテリア突然変異体を殺し、さ
らにこれを洗滌し、所定の濃度に上記バクテリアを再生
することを特徴とする菌突然変異体の製造法を提供する
ものである。

【００１６】さらにこの発明はグラム陰性バクテリア内
毒素をピリジン−ギ酸液と混合する工程と；この混合物
を全還流蒸留によりメチル化する工程と；このメチル化
内毒素混合物をアルコールを用いて析出させる工程と；
このアルコール／メチル化内毒素混合物を遠心分離する
工程と；得られた析出物を蒸留水と混合して内毒素を所
定の濃度とする工程とを具備してなる免疫モジュレータ
の製造法を提供するものである。

【００１７】さらに、この発明は複合ワクチンから得ら
れる超免疫血清の製造およびグラム陰性疾患の動物を治
療する方法を提供する。さらに、この発明は突然変異体
と担体の組合せを提供するものである。

【００１８】本発明は数個の異なる概念を含むものであ
る。すなわち、（１）菌突然変異体およびタンパク／脂
質結合担体からなるワクチンであって、脂質／タンパク
親和性が大きく、抗体の持続的解放を可能とする均質懸
濁液を形成するもの、およびこれに解毒された内毒素で
ある免疫モジュレータを添加したもの；（２）広範な予
防機能を有するバクテリア突然変異体、特に、腸内菌族
からの非−Ｏ−炭水化物側鎖バクテリア突然変異体；
（３）Ｂ−リンパ球増殖に対する特異性を有する上記免
疫モジュレータであって、抗原親和性および結合性が大
きく、中和およびオプソニン作用抗体を初期において多
量に発生させるもの、およびそのような免疫モジュレー
タの製造方法；（４）グラム陰性菌疾患を治療する超免
疫血清およびその製造法である。

【００１９】免疫方法として、このワクチンは筋肉内、
又は皮下に、菌１×１０⁷ および免疫モジュレータ１０
０μｇ以上の濃度で投与される。グラム陰性バクテリア
による病気を有する動物の治療に対しては種痘された供
与体から血清がつくられ、保護に十分な量の抗体が投与
される。

【００２０】この複合ワクチンの利点は予防的性格を有
することであって、従来の病気発生後に開始される治療
とは異なる。他の利点は内毒素疾患からの急速かつ高度
の保護作用が発現し、従来のワクチンに伴なう危険、た
とえば（ａ）致命的なアナフィラキシー；（ｂ）生のバ
クテリアが非病原性から病原性に戻ることによる致命的
感染；（ｃ）バクテリア疾患の種の相対的変化により保
護誘発能が減退すること；のおそれはない。

【００２１】複合ワクチンの解毒内毒素成分はＢ−リン
パ球特異性を有する有効免疫モジュレータとして抗体始
原細胞をより急速に増殖させるだけでなく、活性化状態
を早急に生じさせる。そのため、従来のバクテリアワク
チンの場合に較べ、ワクチン接種後の寄生体内における
抗体の保護レベルに達する時間がより早くなる。

【００２２】裸コア抗原（２−ケト−３−デオキシオク
トン酸−脂肪Ａ）を示す突然変異体からなり、従来のバ
クテリアワクチンの如きＯ−炭水化物側鎖（Ｋ抗原）を
含まない複合ワクチンの細菌ワクチン成分は、Ｏ−炭水
化物特異性免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ，Ｒｅａｇｉｎ）
の発育を阻止し、したがって種痘後のＩｇＥ媒介アナフ
ィラキシーの誘発を生じさせる。Ｏ−炭水化物側鎖（Ｋ
−抗原血清型）とは対照的に裸コア抗原は多くのグラム
陰性バクテリアに共通するものであるから、広範な交叉
的保護の抗体を誘発するとともに、Ｏ−炭水化物側鎖
（Ｋ−抗原、血清型）における疫学的移動又は変動にに
よる保護効果の損失を排除する。

【００２３】この複合ワクチンおよびこの複合ワクチン
により誘発された超免疫血清の開発の以前においては、
治療は内毒素疾患の発生後に初めて、主として化学療法
に頼るものであった。この超免疫血清の利点は、明らか
に病気になった非ワクチン接種動物において、病気の進
行を軽減させ、例えばウマ等の不具又は死亡を阻止させ
得ることである。

【００２４】菌血症又は毒血症又は種々のグラム陰性バ
クテリアによる病気に対する複合ワクチン又は複合ワク
チン誘発超免疫血清を介しての広範な保護は、応用免疫
学における新しい分子概念を用いる動物産業にとって経
済的進展となる。この複合ワクチンにより保護の対象と
なる病気としては、内毒素媒介血管内凝結に関連するも
のを含む。たとえば腸炎菌、ネズミチフス菌、チフス
菌、サルモネラミネソタ菌、ウシ流産菌、大腸菌による
ものである。

【００２５】以下、本発明の個々の成分について述べ
る。

【００２６】突然変異体 この突然変異体はＡＴＣＣ Ｎｏ．５３０００としてＡ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎに寄託されている。

【００２７】遺伝的に変性された突然変異体種Ｒ−１７
の製造に用いられる親分離物はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｃｏｌｌｅｇｒ ｏｆ Ｖｅ
ｔｅｒｉｎａｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅでウマの活性下痢感
染したものから分離した。この原分離物はマッコンキー
スアガー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙｓ ａｇａｒ）上に分離
され、これは３７℃、２４時間の培養の結果、ラクトー
ス陰性で滑らかな粘液様の光沢性集落３．５〜４ｍｍ
（直径）を示した。これをＡＰＩ輪郭確認システムに関
連してＡＰＩシステム（ＡＰＩ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
製品、２００Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｔ．，Ｐｌａｉｎｖｉ
ｅｗ，ニューヨーク１１８０３）を用いた生物学的分析
および通常の実験による特徴検査をおこなった結果、原
分離物が腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉ
ｔｉｄｉｓ；Ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｂ−ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ）であることが判明した。この微生物は文献、Ｍ
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．ワシントン，Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ．１９７４，腸内菌）に記載されている。

【００２８】この発明の微生物の具体例は、イオン化放
射線により得られる腸炎菌（Ｂ−ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ血清型）の親分離物の欠失突然変異種である。このイ
オン化放射線は高エネルギー浸透により遊離ラジカルを
生じさせ、細胞質分子を不安定にさせてデオキシリボ核
酸中に一本鎖切断を生じさせ、これにより欠失突然変異
体を高い割合で生じさせる。生存突然変異体は完全なリ
ポ多糖の合成に対する様々な程度の不能性の表現型発現
を示す。このような突然変異体は直径が比較的小さく、
平坦なラフ（Ｒ）コロニーであり、親バクテリアにより
つくられる大きく、凹み又は凸状のスムーズ（Ｓ）コロ
ニーと対照的なことから容易に認識することができる。

【００２９】Ｘ線変異生成は、生活親バクテリアで接種
した標準流動プレート上で行なわれた。すなわち、Ｍａ
ｃｈｅｌｅｔｔ ＯＥＧ ６０ Ｘ線管であってベリリ
ウム窓を有するものを用い、５０ｋＶピークおよび２５
ｍＡで操作し、２５０ｒａｄ／秒の投射速度で５秒の増
度を以って最大３５秒、上記プレートに照射をおこなっ
た。この照射されたプレートを４℃で２〜４時間保持
し、ついで暗所で３７℃で培養し、光回復を排除するよ
うにした。この培養２４時間後に、プレートをコロニー
形態の変化について検査した。直径２ｍｍと同一又は小
さいコロニーでラフ形態（Ｒ）を示すものを選び、固体
プレート媒体上で少なくとも１０回継代接種し、さらに
実験用マウスの腹腔内接種により少なくとも３回継代接
種して安定なラフ（Ｒ）表現型発現を確実なものとし
た。この突然変異種Ｒ−１７を、胃内接種を介して標準
マウス効力評価法により、親分離物との比較においてそ
の弱毒性を評価した。この突然変異種Ｒ−１７からの精
製リポ多糖と親分離物を電気泳動により２％ナトリウム
ドデシルサルフェート- １０％ポリアクリルアミドゲル
中で化学分析した（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０７：１３７−
１４３，ネズミチフス菌におけるリポ多糖の異質成分、
ナトリウムドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動による分析）。さらに、色素形ｌｉｍｕｌｕ
ｓ ｌｙｓａｔｅ評価（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｃｌｉｎ
ｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １２（５）：６
４４−６５０，Ｌｉｍｕｌｕ Ｌｙｓａｔｅ使用による
血液中の内毒素菌の定量分析、１９８０、Ｗｅｂｓｔｅ
ｒ，Ｃ．Ｊ．）により生物学的に分析した。その結果、
血清凝集（Ｓｅｒｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１〜１４１，１９８４，Ｌ
ｉｎｄｂｅｒｇ，Ａ．Ａ．＆Ｌ．Ｌｅ Ｍｉｎｏｒ；Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔ．
Ｂｅｒｇａｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニュー
ヨーク，１９８４）が認められ、Ｏ−炭水化物抗原は認
められなかった。したがって、この突然変異種Ｒ−１７
は化学型Ｉ又はII、裸コア突然変異体からなる新規なも
のであることが判明した。

【００３０】［リポ多糖のトリクロロ酢酸抽出物（Ｂｏ
ｖｉｎ法）］リポ多糖を、アセトン乾燥バクテリア又は
５容量倍の蒸留水に懸濁させた湿潤バクテリアから０．
２５Ｎトリクロロ酢酸水溶液を用いて抽出した。このリ
ポ多糖（ＬＰＳ）（上澄液）を遠心分離（５０００×
ｇ、３０分、４０℃）して残留するバクテリア（ペレッ
ト）から分離した。この上澄液を１０ＮのＮａＯＨを用
いてｐＨ６．８に調整し、冷無水エチルアルコール２容
量倍を添加し、この上澄液からＬＰＳを析出させた。こ
の析出したＬＰＳを遠心分離（１０，０００×ｇ、１時
間、４℃）により集め、冷無水エタノールで洗滌し、親
液化し、使用時まで４℃にて貯蔵した。

【００３１】［免疫モジュレータの製造］トリクロロ酢
酸抽出リポ多糖（ＬＯＳ）をピリジン／９０％ギ酸
（２：１容量比）１００容量倍液に溶解させ、徐々に加
温して沸点まで上昇させ、そこで約１５分間又は透明化
するまで保持した。次いで、等量の蒸留水をこのＬＰＳ
−ピリジン−ギ酸溶液に添加し、６０分間還流させるこ
とにより解毒を行なった。この解毒ＬＰＳを冷無水エタ
ノール４容量倍の添加により一晩かけて析出させ、次い
で、遠心分離（１０，０００×ｇ、１時間、４℃）を行
ない、冷無水エタノールで３回洗滌し、さらにこの親液
化解毒ＬＰＳ免疫モジュレータを４℃で貯蔵し、免疫相
乗作用を生じさせるために使用し得るように０．１％ト
リエチルアミン水溶液中で再構成させた。

【００３２】［免疫モジュレータによる免疫応答とハイ
ブリドーマ融合の相乗作用］精製リポ多糖は試験官内で
リンパ球胚子発生、すなわち組織細胞を生じさせること
が知られている。ヒトおよび他の動物リンパ球はインタ
ーロイキン（ＩＬ−１，ＩＬ−２）を生じさせ、これが
免疫応答を媒介し、これによりエイコサテトラエン酸代
謝産物（すなわち、プロスタノイド又はプロスタグラン
ジン）を介して抗体が生じる。また、精製リポ多糖はＩ
Ｌ−１およびプロスタシリン合成を生体内で増強するこ
とが知られている。しかし、精製リポ多糖又は自然の
（グラム陰性バクテリア自体に関連する）リポ多糖は完
全なＯ−炭水化物側鎖抗原を保持し、これは生体（哺乳
動物）内に導入された場合毒性を示し、都合の悪い熱性
応答、凝血異常、又は感作された宿主中におけるアナフ
ィラキシー様反応による伝染性血管内凝固を生じさせ
る。この精製リポ多糖はμｇあるいはｎｇ程度の濃度で
も哺乳動物の組織又は細胞（試験管内培養）に有害であ
る。

【００３３】この発明は（１）哺乳動物および組織細胞
培養物に対し無害な免疫モジュレータの製造法；（２）
哺乳動物を粒状又は可溶性抗原に対し免疫するための免
疫モジュレータを用いる方法であって、急速に、かつ大
きく抗体応答を促進させ、抗原因子（エピトープ）のス
ペクトルの広い認識を増強させ、広範な免疫学的特異性
を生じさせる方法；（３）抗体合成形質細胞腫とＢ−リ
ンパ球との間の交雑度を細胞培養中で１５〜３０％から
８５％に高める方法であって、免疫モジュレータの存在
下で粒状又は可溶性抗原を用い供与哺乳動物の一次免疫
を行なう方法；を含む。

【００３４】免疫モジュレータは抗原と同時に投与した
場合、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの一次免疫応答を高め
る。この増進効果は緑膿菌の如き粒状抗原のみならず、
キーホールドアオガイヘモシアニンの如き可溶性抗原を
用いた場合でも生ずる。抗原と免疫モジュレータを同時
に注射した動物は、抗原のみを与えた動物に較べて、注
射後７，１４、および３５日後の抗体力価が大きいこと
が認められた。免疫モジュレータは免疫応答の初期にお
いて抗体力価を増進させるだけでなく、血清抗体レベル
を高い状態に持続させることができ、このことは極めて
重要な点である。免疫モジュレータによる特異的抗体応
答の増進は注射経路によって実質的に影響されることは
ない。なぜならば、フロイントの不完全アジュバントで
抗原および免疫モジュレータを静脈内、腹腔内又は皮下
に注射した場合のいずれでもこの増進がみられるからで
ある。

【００３５】これらの結果を表Ａに示す。これらの実験
において、各グループに５匹の動物を用いた。これらの
実験動物は抗原と免疫モジュレータ（７５μｇ／−投
与）を投与され、参照動物は同一量の抗原と滅菌食塩が
投与された。血清抗体力価は間接的ＥＬＩＳＡ評価法に
より測定した。

【００３６】免疫モジュレータは細胞培養成長に対する
影響から毒性がないことが証明されている。ＳＰ２／Ｏ
マウス骨髄腫細胞を培養液１ｍｌ当り、１００，１，
０．１ｎｇの濃度の免疫モジュレータで培養したとこ
ろ、細胞密度が相応する参照培養試料と同等もしくは若
干大きくなっていることが判明した。骨髄腫細胞を１０
％胎児のウシ血清、２％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン
酸ナトリウムおよび抗体を添加したＲＰＭＩ１６４０媒
体中で培養した。免疫モジュレータはこの媒体中に適当
な濃度で滅菌水溶液として添加した。細胞密度は免疫モ
ジュレータおよび滅菌蒸留水の等量を添加したのち、２
４，４８，７２および９６時間後に判定した。

【００３７】

【表１】 ワクチン ワクチンは菌突然変異体（細菌ワクチン）、免疫モジュ
ーレータ（内毒素）およびタンパクおよび脂肪結合担体
（アジュバント）からなっている。このワクチンは筋肉
又は皮下に、１×１０⁷ 菌（好ましくは１×１０¹⁰菌）
又はそれ以上、１００μｇ以上（好ましくは１００〜４
０００μｇ）の解毒内毒素の濃度（脂質−タンパク親和
性吸収担体中）で投与した。

【００３８】この細菌ワクチンは、腸炎菌の非−Ｏ−炭
水化物側鎖突然変異体の滅殺懸濁液からなるものであ
る。このバクテリアは腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）突然変異体の二次培養で富化
された滅菌肉汁を接種し、３７℃で好気的に最大限に培
養してつくられた。このバクテリアをマーシオレートの
如き殺菌剤で滅殺した後、その非生活性をチェックし
た。次いで、非発熱性滅菌生理食塩水で４回洗滌した
後、他のワクチン成分との混合のための所望の貯蔵濃度
に再構成させた。

【００３９】解毒内毒素はグラム陰性バクテリア内毒素
をピリジン−ギ酸（２：１）溶液に添加してつくられ
た。この内毒素−ピリジン−ギ酸混合物は滅菌還流凝縮
装置中で十分に混合し、温度を沸点まで上昇させ、最良
の内毒素メチル化物を得るべく還流させた。次いで、こ
のメチル化解毒内毒素をアルコールの添加により還流混
合水から析出させ、遠心分離により集め、アルコール中
に再懸濁することにより洗滌し、再遠心分離し、最後に
非発熱性蒸留水に溶解し、ワクチンの他の成分と混合す
るために所望の貯蔵濃度に調整した。

【００４０】細菌ワクチンのタンパク質分および解毒内
毒素の脂質分を吸収するのに十分な高親和性を有する親
脂質、タンパク担体からなるアジュバントが用いられ
る。このアジュバントは、好ましくは脂肪酸系のもの、
オイル系のもの、又は明ばん系（例えばＡｌ₂ Ｏ₃ ）の
ものが用いられる。このジアルミニウムトリオキシドの
担体特性は均一な懸濁状態を保持し、細胞ワクチンおよ
び解毒内毒素の持続的解放を保持し、著しい抗体の生産
を確実にする。このジアルミニウムトリオキシドをタン
パク−脂質高親和性アジュバントとして用いる場合、
１．５％容量％が最適である。

【００４１】この複合ワクチンで通常のウマを免疫した
ときは、炭水化物で飽食させた場合（自然界で生ずる飽
食に似せたもの）でも、又、細菌内毒素を静脈注射した
場合（すなわち、自然界で起る場合に似せて人工的に発
病させる）でも、血流中に十分な保護をなし得る抗体が
生じた。同様にウシに対して免疫を施した場合も体温の
上昇は見られず、白血球の数、型の異常な増加が見られ
た。この複合ワクチンの利点は、（ａ）細胞壁中に通常
存在し、好ましくないアナフィラキシー様反応を生じさ
せる成分を含まない突然変異バクテリアであること；
（ｂ）バクテリア又は解毒化内毒素を持続的に解放さ
せ、多量の中和抗体を生じさせるアジュバント又は担体
であること；（ｃ）完全な内毒素およびバクテリアに対
し望ましい中和抗体を早急かつ多量に生じさせる解毒化
内毒素であること；を含む。この複合ワクチンは多くの
グラム陰性菌疾患に対し、広範な保護を与える品質を有
する。なぜならば抗原の基本的構造は、ほとんどのグラ
ム陰性菌に対し共通するからである。しかし、この複合
ワクチンは望ましくないアナフィラキシーを生じさせる
従来のワクチン成分を含まない。

【００４２】炭水化物の過度の負担は腸（大腸）中の酸
の濃度を増加させ、これが腸壁を害し、同時に腸内のグ
ラム陰性バクテリアの数を減少させる。これは血流中へ
の移行増大（敗血症）および酸による滅殺による。この
バクテリアの滅殺は細胞壁からの内毒素の解放をもたら
し、これは酸破壊腸壁を通過して血流に移行することに
なる。血流中の内毒素は毛細血管中の血液凝固を生じさ
せる。ウマおよび他の蹄動物の場合、これらの血液凝固
は最終的に蹄組織を死滅させて不具又は死亡の原因とな
る。

【００４３】この複合ワクチンは、ウマにおいて、飽食
による腸炎又はストレスにかかったウマの血流中に入り
込んだ内毒素又はグラム陰性バクテリアを中和すること
により、腸炎又は疝痛の影響を防止し得る利点を有す
る。ウシの場合でも、血流に浸入した内毒素又はグラム
陰性バクテリアを中和することにより、内毒素系疾患を
防止ないし減少させることができる。食肉ウシにおける
突然死症候群（腸のグラム陰性菌からの内毒素により生
ずるもの）はそのような病気の古くからの例であり、畜
産業において重大な意味を有する。

【００４４】ワクチン成分の作用および安全性 細胞ワクチンとともに免疫調整内毒素を添加することが
種痘動物の免疫応答の早期、敏感性を誘発することが見
出された。すなわち、バクテリア＋変性毒素又は細胞ワ
クチンのみを筋肉投与により成熟したウマ又はポニーの
群に接種した。この実験開始の一週間前にこれらの動物
から採血し、その免疫プロフィールを調べたところ、全
て正常であった（すなわち、椎弓炎の徴候は見られなか
った）。免疫後２４時間の後、血清サンプルを集め、抗
原特異固相ラジオイムノアッセイ（同位元素標識免疫定
量法）を用いて抗体力価を調べた。図１に示すデータ
は、細胞ワクチン−変性毒素で接種した動物は３日後に
早くも抗体力価が認められ、バクテリアのみを受けた動
物の場合の７日後とは対照的であった。３〜１４日の間
の図１の免疫応答曲線によれば、細胞ワクチン＋変性毒
素を与えた群では細胞ワクチンのみを与えた群と比較し
て勾配が急峻である。これは前者の場合、抗体の生産速
度がより大きいことを示している。したがって、細胞ワ
クチン＋内毒素投与の群は早急な保護が得られるものと
思われる。さらに細胞ワクチンのみを受けた動物の場合
と比較して、前者のものは循環流中の中和又はオプソニ
ン化抗体の高濃度による全般的保護の向上が見られた。

【００４５】エンドトキソイド（すなわち解毒内毒素、
又は変性毒素）をマウス、ウマ、ポニー、ウシに投与
し、細胞ワクチンとともに、免疫調整剤として安全に投
与し得る最大量について調べた。ＣＦ−１マウスについ
て、自然の内毒素を０．３〜０．６ｍｇ静脈注射した場
合、ＬＤ₅₀は通常７２〜９６時間内に達せられる。

【００４６】オスのＣＦ−１マウス（Ｌ５−２０ｇ）の
尾部血管に、０．１ｍｌの生理食塩水、０．１ｍｌの生
理食塩水に内毒素を３００μｇ溶かしたもの、０．１ｍ
ｌの生理食塩水にエンドトキソイドをそれぞれ６００μ
ｇ，６０００μｇ，１２，０００μｇ溶かしたものを接
種した。これらのマウスについて、２４時間間隔で悪影
響および死亡率について観察した。死亡は、内毒素投与
群（正の対照）において４８時間以内に認められ、最大
死亡率（５６％）は７２時間後に認められた（表１）。
これに対し、変性毒素の２倍（６００μｇ）を投与した
群では死亡は見られず、２０倍（６０００μｇ）投与し
た群では死亡率がわずか１７％であり、４０倍（１２，
０００μｇ）投与した群ではＬＤ₅₃となった。このこと
から、変性毒素は天然の内毒素よりも毒性が少なくとも
４０分の１以下であると判定した。

【００４７】

【表２】 成熟したウマおよびポニーをエンドトキソイド５ｍｇ以
下で筋肉内に接種した。これらの動物を発熱、末梢灌
流、心脈、血圧、嗜眠、下痢について４日間、１日２回
の割合で観察した。２．５ｍｇの投与を受けた動物は、
一匹も何んらの悪い影響を示さなかった。５ｍｇの投与
を受けた動物は体温が１０３〜１０５°Ｆに不規則的に
上昇した。又、心脈が若干上り、末梢灌流の若干の損失
が見られた。これらの症状は８〜１２時間以内に減退し
た。しかし、下痢、血液疾患その他の不可逆的症状を示
した動物は見当らなかった。これらの結果から２．５ｍ
ｇ以下（２５００μｇ以下）又はワクチン中に免疫調整
剤として導入され得るとした変性毒素１００μｇの２５
倍をウマおよびポニーに安全に使用し得ることが確認さ
れた。

【００４８】ウシについては変性毒素を１０００μｇ以
下筋肉内に接種し、２日間隔で１６日間、発熱、白血球
減少又は白血球症、単核細胞異常（鑑別血球計算）、赤
血球異常、嗜眠、下痢について観察した。しかし、何ん
らの不都合な作用も見られなかった。このことから、変
性毒素を１０００μｇまで免疫調整剤としてワクチンに
安全に添加し得ると判定した。

【００４９】ワクチンの安全性 以下の基準に関してワクチンの安全性を評価した。

【００５０】（１）通常の接種法での好適量に関連させ
て、マウス、ウマ、ウシに大量投与（５倍以下）した場
合；（２）短時間間隔で多数回の投与をウマ、ウシに施
した場合；（３）接種経路（筋肉内、皮下、腹腔内）；
（４）将来の品質制御の手段として実験マウス中；
（５）多標準を評価し得る実験用ウマおよびポニー中；
（６）野外研究で、多数のウマ、ポニーおよびウシ、分
布広汎な遺伝子プールにおいて、限られた因子について
の評価。

【００５１】成熟したメスおよびオスのマウス（２０−
２５ｇｍ）の群についてワクチン又はワクチン成分１ｍ
ｌ分量を接種した。これらマウスを死亡率、毛並み、脊
髄彎曲および複合（末梢筋冷却を示すもの）、脱水、嗜
眠、下痢、膿瘍について９６時間観察した。

【００５２】

【表３】 表２のデータによればワクチン１ｍｌの投与（皮下又は
筋肉内）は実験マウスに対し全く危険はない。しかし、
接種の腹腔投与の場合は脂質−タンパク親和性担体の体
重に対する割合が高く（１：２０）、したがってタンパ
ク質の脱水のため３０％の死亡率を示した。この腹腔内
投与の悪い影響は問題とはならないと判定された。なぜ
ならば、ワクチンの目標種は担体に対する体重比が異常
に大きいからである。なお、接種の経路は腹腔内よりも
筋肉内又は皮下がより好ましい。

【００５３】健康な成熟ウマに筋肉を介してワクチンを
５倍（５×１０¹⁰バクテリア、５０μｇ変性毒素）６日
間隔で２回続けて接種した。これらの動物を無食欲症、
嗜眠、下痢、脱水および注射部位での膿瘍、はれ、柔軟
化について観察した。その結果、悪い影響は注射部位に
おける若干のはれ、柔軟化が見られただけで、４８−７
２時間以内に消えた。

【００５４】５００〜６５０ポンドのウシで、筋肉を介
して１８日間隔で４．５倍（４．５×１０¹⁰バクテリ
ア、４３７μｇ変性毒素）を２回連続して接種した。
又、１頭のウシについては１１．２５倍（１．１２５×
１０¹⁰バクテリアおよび１ｍｇの変性毒素）のワクチン
を１回のみ接種した。全ての動物について、１日２回、
無食欲症、嗜眠、下痢、脱水、注射部位における柔軟
化、はれ、膿瘍について観察したが、悪い反応は全く見
られなかった。

【００５５】この結果からウマ、ウシに対して適当と定
められた投与量、方法においては危険性は全くないこと
が確認された。

【００５６】健康な成熟ウマに対し、筋肉を介してワク
チンを２．５倍（２．５×１０¹⁰バクテリア、２００μ
ｇの変性毒素）を３日置きに９日間投与し、次いで７日
間休ませた後、３投与・３日間隔の接種をさらに５回施
した。したがって、６４日間に１８回の接種を行なっ
た。連続投与は首部と尻部とを交互に変えて行なった。

【００５７】これらの動物について、無食欲症、嗜眠お
よび下痢、脱水および注射部の柔軟化、はれ、膿瘍につ
いて観察したが、悪い反応は局部的柔軟化、はれ、膿瘍
が１０回の接種の後に一頭の動物に見られたにすぎなか
った。この膿瘍は排液したところ急速に解け、接種処置
を続行することができた。他の悪影響は全く見られなか
った。

【００５８】１９０〜６５０ポンドの子ウシに対しワク
チンを４倍投与（４×１０¹⁰バクテリア、変性毒素４０
０μｇ）を皮下に施した。１７日後、これらの子ウシの
一部に筋肉を介してワクチンの１倍投与を施した。これ
ら全ての動物について、無食欲症、嗜眠、下痢、脱水に
ついて１２０日間毎日観察した。又、体重、体温、血液
疾患について、最初の１５日間は３日間隔、その後の１
２０日間は３０日間隔で観察した。その結果、５頭は固
い局部的小結節が最初の４倍皮下接種の後に見られた
が、８−１２日以内に分解吸収された。このような小結
節の発生は筋肉内１倍投与を再び施した場合には見られ
なかった。

【００５９】一群のウマ、ポニーにワクチン（１×１０
¹⁰バクテリア、変性毒素１００μｇ／体重１ｋｇ当り）
を筋肉内を介して１４日間隔で２回投与した。次いで、
無食欲症、嗜眠、下痢、脱水および注射部位における軟
化、はれ、膿瘍について毎日観察した。その結果、数頭
の動物について、注射部位における若干の軟化が見られ
たにすぎなかった。

【００６０】５５０〜６５０ポンドの食肉ウシにワクチ
ン（１×１０¹⁰バクテリア、変性毒素１００μｇ／体重
１ｋｇ当り）を接種した。一部のウシに対しては筋肉
内、他のウシに対しては皮下に接種した。これらのウシ
について、無食欲症、嗜眠、下痢、脱水、注射部位の軟
化、はれ、膿瘍を５０日間毎日観察した。その結果、注
射部位を含め、悪影響は全く見られなかった。また小結
節の発生も皮下投与のウシについて全く認められなかっ
た。

【００６１】これらの結果から、適当量および適当投与
方法でワクチンをウマ、ウシ、ポニー等に施した場合
は、これらの動物に対する危険性は筋肉内又は皮下投与
の場合でも全くないことが確認できた。

【００６２】ワクチンの効能 健康な成熟ウマおよびポニーに筋肉内投与を介して１倍
量のワクチン（１×１０¹⁰バクテリアおよび変性毒素１
００μｇ）を２週間間隔で２回施した。これらの動物か
ら約一週間間隔で採血し、抗体力価をラジオイムノアッ
セイ法により測定した。その結果、一次免疫後２０〜３
０日経過時に大部分が免疫応答の曲線がピークとなり、
また、二次又は既往免疫の後１０〜２０日経過時に免疫
応答がピークとなった。予防効能は、炭水化物飽食（経
口）又は接種動物に対する致死量以下の変性毒素投与
（静脈内）による二次免疫後の種々の時点で判定した。
非ワクチン投与ウマ又はポニーの７０〜８０％は、Ｏｂ
ｅｌ度３−４の急性椎弓炎が、トウモロコシ−おがくず
粉がゆを胃管を介して１７．６ｇ／体重１ｋｇの投与で
炭水化物を飽食させた後４０〜５０時間に発生してい
た。非ワクチン投与ウマ又はポニーの１００％は、内毒
素を１０μｇ（体重１ｋｇ当り）静脈投与した後２−３
分以内に頻呼吸、呼吸困難、運動失調を発生し、４５分
以内に液様の形のない便が出た。

【００６３】

【表４】 表３は、ワクチン投与動物の約９０％は炭水化物飽食後
のＯｂｅｌ度３−４の急性椎弓炎を起さなかったのに対
し、ワクチン非投与参照動物（１２〜１４才以上の１０
０頭の動物）ではそれがわずか１５〜２５％であったこ
とを示しており、これにより、予防効果が６５〜７５％
であったことが示唆される。同様の比較を致死量以下の
内毒素をウマに与えた場合について行なった結果、予防
効果は６０％以上であった。これらの実験からワクチン
を１倍量、２回投与したウマ又はポニー（成熟したも
の）は、炭水化物誘導椎弓炎については９０％の予防効
果、内毒素誘導疾患については６０％以上の予防効果が
あることが判明した。

【００６４】年令、性別が混在したウシについて皮下に
ワクチンを投与し、１５日間に亘り３日間隔で、さらに
その後１２０日間は３０日間隔で採血し血清を得た。こ
れらの抗体力価はラジオイムノアッセイ法により判定し
たところ、接種から２０日以内に全ての動物で抗体力価
が２〜４倍となった。ワクチン投与後１２０日の時点で
動物の７０％にはかなりの力価が存在した。一部の動物
についてはワクチン投与後３０日間炭水化物の食事を与
えた。しかし、１７週間経過後も無食欲症、下痢、跛
行、急死症候群の徴候は全く見られなかった。

【００６５】５５０〜６５０ポンドの食肉ウシに１−
（１×）投与量のワクチンを施し、下痢、跛行、突然死
について毎日観察したが、１１週間経過後も全く異常は
見られなかった。

【００６６】血 清 明らかに内毒素による疾患を持ったワクチン非投与動物
は、複合ワクチン接種後でも、抗体を予防に十分なレベ
ルまで増強させる余裕を、それ自身の免疫システムでと
ることができないとの理論に基づいて、超免疫血清の開
発および治療上の使用がなされている。すなわち、他の
動物により発展させ、予め貯蔵された抗体（超血清）で
受動免疫化することにより短期間の保護手段が得られ、
これによりその動物自身の免疫システムが十分に予防的
となるまで内毒素疾患の改善に役立つものである。ワク
チン非投与ウマの急性椎弓炎因子が偶発的に穀物容器内
に入り込み、これが後に腸炎の原因となることはウマの
飼育場における古くからの例である。

【００６７】超免疫血清は、凝固血清又はそれらの一部
（γ−グロブリン、イムノグロブリン又はイムノグロブ
リンＩｇＧＴ）からなり、分類学上の腸内菌族のバクテ
リアの内毒素中のコア成分（２−ケト−３−デオキシオ
クトン酸−脂質Ａ）に対し特異性を示す抗体を含んでい
る。この抗体は、複合ワクチンにより動物を超免疫化す
ることにより誘発される。

【００６８】超血清は、健康な成熟ウマに複合ワクチン
２．５ｍｌを３日間隔で６回連続的に、さらに７日間隔
で２．５ｍｌを２回連続的に筋肉内を介して注射するこ
とによって得られる。血清サンプルはワクチン投与前に
このウマから採取され、その後、３日間隔で血清学上の
分析がなされる。抗原特異イムノグロブリン（ｇＧ、Ｇ
Ｔ、Ａ、Ｍ）の濃度は、 ¹²⁵Ｉ−プロテインＡを用いた
ラジオイムノアッセイにより判定される。各動物の免疫
応答が高平部に達したとき、全血を１２Ｌ採血する。超
免疫血清は、凝固（約２４時間後）の後遠心分離により
分取し、次いで加熱無活性化（５６℃、３０分）し、さ
らにγ−グロブリン又はイムノグロブリンの後の精製又
は使用まで４℃にて貯蔵される。

【００６９】γ−グロブリンは、５０％飽和アンモニウ
ムスルフェート（ＳＡＳ）を用いて超免疫血清から析出
させてつくる。この析出物を、０．０１Ｍのりん酸塩緩
衝液（ＰＢ、ＮａＨ₂ ＰＯ₄ −ＮａＨＰＯ₄ 、ｐＨ８）
中に再懸濁させ、同じ緩衝液に対して完全に透析させて
ＳＡＳを除去した。

【００７０】超免疫血清５０ｍｌから得られたγ−グロ
ブリンを、ＰＢで平衡させたジエチルアミノエタノール
（ＤＥＡＥ）セルロース（ｐＨ＝８）のカラム（５×５
０ｃｍ）に吸収させた。このカラムは最初に平衡緩衝液
（ＰＢ、ｐＨ＝８）で処理し、ＩｇＧを溶出させ、つい
でこのＰＢに対してＮａＣｌグラジエント（０．０３
Ｍ）を添加し、ＩｇＧ（Ｔ）を解離させる。この溶出液
を冷凍分留捕集器を用いて５ｍｌづつに集め、ベックマ
ンＤＢ−ＧＴ分光光度計を用いて溶出ピークを連続的に
モニターし、二重波長３６０ｎｍおよび３８０ｎｍを得
る。タンパク質濃度は、Ｗａｒｂｅｒｇ−Ｃｈｒｉｓｔ
ｉａｎ定数を用いて判定し、Ｌｏｗｒｙ法により確認す
る。ＩｇＧ（Ｔ）分を貯め、親液化し、受動免疫化に用
いるため−４０℃で貯蔵した。炭水化物で飽食させて、
又はバクテリア内毒素の腹腔内注射により実験的に腸炎
を生じさせたウマに、複合ワクチンで接種した他のウマ
から得た超免疫血清を投与したところ急速な改善が得ら
れた。同じようにしてワクチン接種されたウマから得た
超免疫血清で免疫することにより、マウスもバクテリア
内毒素の静脈注射による死亡を回避することができる。

【００７１】健康な成熟マウス（２０ｍｇ、ＣＦ−１）
に腹腔を介してウマ超免疫全血清の１００％、１０％、
０．１％溶液１ｍｌを４日間連続して接種した。これら
の動物について、呼吸困難、硬直、鼻および尾環流、眼
のはれ、外被組織、死亡について４日間、１２時間間隔
で観察した。その結果、ＩＰ血清注射による悪影響は全
く見られなかった。

【００７２】健康な成熟ポニーに、超免疫血清７００ｍ
ｌに乳酸加リンゲン液１０００ｍｌを添加したものを静
脈点滴により９０分間投与した。この動物を体温、心
脈、末梢環流および不安又はストレスに関して６．５時
間、１０〜１５分間隔でモニターしたところ、不安、ス
トレスの徴候は全くなく、体温、心脈が問題にならない
程度の微上昇（１００．４°Ｆ→１０１．３°Ｆ；５０
→５６ビート／分）が上記点滴開始の６０〜９０分後に
見られた。

【００７３】９００ポンドのウマで敗血症性ショックに
よる合併症を有するものに、乳酸加リンゲン液に超免疫
血清を溶かしたもの１２００ｍｌを１０時間に亘り腹腔
内投与により接種した。この動物は毒性による徴候を示
さず、著しい改善を示した。

【００７４】筋肉内接種の安全性を確かめるため、健康
な成熟ポニーに超免疫血清を筋肉を介して０、１０、２
０、および４０ｍｌ投与した。この接種後１、２、４、
８、１２および２４時間後の時点について、（１）放
尿；（２）下痢：（３）硬直；（４）末梢灌流；（５）
体温；（６）呼吸；（７）心脈；（８）白血球症（又は
減少症）；（９）赤血球症（又は減少症）をモニターし
た。その結果、悪影響は全く見られず、一頭の４０ｍｌ
の投与を受けたポニーの首に分散した小結節が見られた
が、これは４時間以内に消えた。

【００７５】保護抗体を含むγ−グロブリンを超免疫血
清から抽出し、タンパク質１ミリグラム単位で保護能を
評価した。前免疫および超免疫血清であって、ワクチン
で超免疫したウマから採取したものを、内毒素を静脈投
与する前に２日間連続でＣＦ−１マウスに分割して接種
することにより、種々の濃度のγ−グロブリンと比較し
た。図２、３に示すデータは、受動免疫マウスモデルを
用い、２頭の別々のウマ（＃２３，＃２４）からの前免
疫および超免疫グロブリンを比較したものである。超免
疫グロブリンは超免疫化後、２度（＃２３Ａ，＃２３
Ｂ）、ウマ＃２３からつくられたものである。＃２３前
免疫又は超免疫（＃２３Ａおよび＃２３Ｂ）グロブリン
の５０ｍｇ以上をもって受動的に免疫されたマウスの内
毒素投与９６時間後の生存率の比較によれば、超免疫グ
ロブリンを受けたマウスは生存率が少なくとも２０（＃
２３Ｂの場合）ないし５０％（＃２３Ａの場合）上昇し
ていることが示唆されている（図２）。さらに＃２４前
免疫を＃２４超免疫と比較した場合、その程度が若干落
ちるがほぼ同様の効能があることが明らかであろう（図
３参照）。この結果から、超免疫血清は致命的内毒素か
らマウスを保護し得る抗体を含むことが確認された。

【００７６】超免疫γ−グロブリンの効能をウマおよび
ポニーを用い、これに抗体タンパクを５、１５又は２０
ｍｇ（体重１ｋｇ当り）を静脈内接種した後、内毒素又
は炭水化物飽食を投与することにより行なった。すべて
の動物に＃２３Ａおよび＃２３Ｂの超免疫γ−グロブリ
ン混合物が与えられた。この２種類の製剤の組合せは、
公知の抗体タンパクの適当量を確認するために必要とし
た。予防効果は致死量以下の内毒素投与又は炭水化物飽
食動物における直後の生活性の顕著な遅延又は回復、Ｏ
ｂｅｌ度２の疾患又はそれ以下の発生として規定した。

【００７７】

【表５】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のワクチンの効能を比較例と比較して示
す第１の線図。

【図２】本発明のワクチンの効能を比較例と比較して示
す第２の線図。

【図３】本発明のワクチンの効能を比較例と比較して示
す第３の線図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハロルド・イー・ガーナー アメリカ合衆国、ミズリー州 65202、 コロンビア、ボックス 345、ルート 11

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物および組織細胞培養物に対して
   非毒性の免疫モジュレータであって、活性化機能状態に
   おいて抗体始原細胞であるＢリンパ球の急速な増殖およ
   びその早期の発現を引き起こす特異的な傾向を有し、並
   びに哺乳動物において粒状または可溶性抗原と結合した
   場合、ワクチン接種後の宿主において、該免疫モジュレ
   ータを含有しないバクテリアワクチンよりも、急速かつ
   大きく増進した抗体応答をもたらし、広範なスペクトル
   を有する抗原決定基（エピトープ）の認識および宿主循
   環系中における広範な免疫学的特異性を有する産生物を
   増強する、凍結乾燥された無傷の解毒リポ多糖内毒素免
   疫モジュレータを含む免疫モジュレータ。
2. 【請求項２】 哺乳動物および組織細胞培養物に対して
   非毒性であり、ＴおよびＢリンパ球の増殖を誘発し得る
   免疫モジュレータの製造方法であって、 ａ）細菌を抽出する工程、 ｂ）無傷のリポ多糖を回収する工程、 ｃ）無傷の該リポ多糖を解毒する工程、および ｄ）活性化機能状態において抗体始原細胞であるＢリン
   パ球の急速な増殖およびその早期の発現を引き起こす特
   異的な傾向を有し、並びに哺乳動物において粒状または
   可溶性抗原と結合した場合、ワクチン接種後の宿主にお
   いて、該免疫モジュレータを含有しないバクテリアワク
   チンよりも、急速かつ大きく増進した抗体応答をもたら
   し、広範なスペクトルを有する抗原決定基（エピトー
   プ）の認識および宿主循環系中における広範な免疫学的
   特異性を有する産生物を増強する、凍結乾燥された無傷
   の解毒リポ多糖内毒素免疫モジュレータを回収する工
   程、を包含する方法。
3. 【請求項３】 細菌をトリクロロ酢酸で抽出する請求項
   ２記載の方法。
4. 【請求項４】 ピリジン−ギ酸と混合して還流すること
   によりリポ多糖を解毒する請求項２または３に記載の方
   法。