JP2625099B2 - ワクチンおよびその製造法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 この発明はグラム陰性菌疾患に対する免疫および治療
のためのワクチンおよび血清に係わり、特に、腸炎菌
（Salmonella enteritidis）の菌突然変異体および腸内
菌族中にグラム陰性菌を生成する内毒素に基因する疾患
に対し哺乳動物および鳥類を免疫する複合ワクチンにこ
の菌突然変異体を使用することに関する。
のためのワクチンおよび血清に係わり、特に、腸炎菌
（Salmonella enteritidis）の菌突然変異体および腸内
菌族中にグラム陰性菌を生成する内毒素に基因する疾患
に対し哺乳動物および鳥類を免疫する複合ワクチンにこ
の菌突然変異体を使用することに関する。
さらに、この発明は他の抗原との組合せで動物、ヒト
の治療に有用な解毒された内毒素免疫モジュレータおよ
びその製造法および使用法に関する。
の治療に有用な解毒された内毒素免疫モジュレータおよ
びその製造法および使用法に関する。
畜産業において、内毒素疾患は家畜の健康に重大な問
題を生じさせ、その経済的影響も大きい。
題を生じさせ、その経済的影響も大きい。
馬の場合、この内毒素疾患としては、腸炎（すなわ
ち、椎弓炎）、疝痛（すなわち、飽食および他のストレ
ス現象、たとえば腹部閉塞、腸貧血、グラム陰性菌性腸
炎、下痢、消化不良、運搬ストレス、分娩等に関連する
腹部発症）、敗血病性関節炎、グラム陰性子宮内感染等
がある。
ち、椎弓炎）、疝痛（すなわち、飽食および他のストレ
ス現象、たとえば腹部閉塞、腸貧血、グラム陰性菌性腸
炎、下痢、消化不良、運搬ストレス、分娩等に関連する
腹部発症）、敗血病性関節炎、グラム陰性子宮内感染等
がある。
牛の場合の内毒素疾患としては乳牛および食肉牛にお
ける椎弓炎、食肉牛の突然死症候群、乳牛の乳房炎、子
牛の赤痢、伝染性下痢症、大腸菌症、パラチフス下痢等
である。
ける椎弓炎、食肉牛の突然死症候群、乳牛の乳房炎、子
牛の赤痢、伝染性下痢症、大腸菌症、パラチフス下痢等
である。
豚の内毒素疾患としては異常無乳症（すなわちグラム
陰性子宮内膜炎に関連する乳線不全）、水腫炎、子豚パ
ラチフス下痢等である。
陰性子宮内膜炎に関連する乳線不全）、水腫炎、子豚パ
ラチフス下痢等である。
鳥類の内毒素疾患としてはパラチフス下痢、敗血症、
肺胞、含気洞の感染症、鳥コレラ等である。
肺胞、含気洞の感染症、鳥コレラ等である。
これらの内毒素媒介疾患の従来の処置は病気が発展し
たのちにおこなうものであり、化学的療法に限られてい
た。したがって予防処置はとられていなかった。グラム
陰性敗血症又は毒血症に対するワクチンによる予防は、
（ａ）種々の抗原性エピトープ（Ｋ−抗原又はＯ−炭水
化物側鎖）を示す自原バクテリア分離物からなる個体化
ワクチン又は（ｂ）減毒又は抹殺変性バクテリア分離物
からなる生ワクチンを介してのみおこなわれてきた。
たのちにおこなうものであり、化学的療法に限られてい
た。したがって予防処置はとられていなかった。グラム
陰性敗血症又は毒血症に対するワクチンによる予防は、
（ａ）種々の抗原性エピトープ（Ｋ−抗原又はＯ−炭水
化物側鎖）を示す自原バクテリア分離物からなる個体化
ワクチン又は（ｂ）減毒又は抹殺変性バクテリア分離物
からなる生ワクチンを介してのみおこなわれてきた。
この内毒素媒介疾患を処置する従来法の主な欠点はそ
のような処置が病気が進展し、又、しばしば病気が取り
返しができなくなったのちに初めてなされることであ
る。自原バクテリア分離物からなる個体化ワクチンを用
いたグラム陰性敗血症又は毒血症に対する従来のワクチ
ンによる予防法は時間的、費用的又は生産上の点で効率
的でない。なぜならばそのようなワクチンは病気が進展
したのちに後発的に生産されるからである。
のような処置が病気が進展し、又、しばしば病気が取り
返しができなくなったのちに初めてなされることであ
る。自原バクテリア分離物からなる個体化ワクチンを用
いたグラム陰性敗血症又は毒血症に対する従来のワクチ
ンによる予防法は時間的、費用的又は生産上の点で効率
的でない。なぜならばそのようなワクチンは病気が進展
したのちに後発的に生産されるからである。
種々の抗原エピトープ（Ｋ−抗原又はＯ−炭水化物側
鎖）を示す複合バクテリア分離物からなる多価ワクチン
の主な欠点はある時点において、病気をもたらすバクテ
リア分離物が抗原エピトープにおいて、疫学的に移動な
いし変動しがちで抗原特異性を変化させ、その予防機能
を喪失させることである。Ｋ−抗原又はＯ−炭水化物側
鎖も又、動物、特にウマにおいてアナフィラキシー様反
応を生じさせる免疫グロブリンIgEの刺激剤である。
鎖）を示す複合バクテリア分離物からなる多価ワクチン
の主な欠点はある時点において、病気をもたらすバクテ
リア分離物が抗原エピトープにおいて、疫学的に移動な
いし変動しがちで抗原特異性を変化させ、その予防機能
を喪失させることである。Ｋ−抗原又はＯ−炭水化物側
鎖も又、動物、特にウマにおいてアナフィラキシー様反
応を生じさせる免疫グロブリンIgEの刺激剤である。
減毒又は抹消変性バクテリア分離物からなる生ワクチ
ンの主な欠点はこれらが野生型親菌株に変換する能力を
有し、種痘した動物の病原性を継続させることである。
ンの主な欠点はこれらが野生型親菌株に変換する能力を
有し、種痘した動物の病原性を継続させることである。
そのため、グラム陰性バクテリアによる疾患に対し、
従来の如き欠点をともなわずに免疫、治療をおこなうこ
とができるワクチンおよび血清の開発が求められてい
た。
従来の如き欠点をともなわずに免疫、治療をおこなうこ
とができるワクチンおよび血清の開発が求められてい
た。
この発明はこのような要請をグラム陰性菌用ワクチン
および血清を提供することを目的とする。
および血清を提供することを目的とする。
〔発明の概要〕 この発明は菌突然変異体、免疫モジュレータおよびタ
ンパク、脂質結合担体を具備してなる内毒素関連疾患か
ら動物を守ることのできる複合ワクチンおよび超免疫血
清を提供するものである。
ンパク、脂質結合担体を具備してなる内毒素関連疾患か
ら動物を守ることのできる複合ワクチンおよび超免疫血
清を提供するものである。
さらに、この発明は菌突然変異体と免疫モジュレータ
とを組合せる工程と、この結合体をタンパク、脂質結合
担体中に懸濁させる工程とを具備してなるワクチンの製
造法を提供するものである。
とを組合せる工程と、この結合体をタンパク、脂質結合
担体中に懸濁させる工程とを具備してなるワクチンの製
造法を提供するものである。
さらに、この発明は滅菌され、腸内菌族から選ばれた
菌二次培養突然変異体で富化された肉汁を接種し、温度
約37℃でこの肉汁を好気的に培養して最大に繁殖させ、
バクテリア剤でバクテリア突然変異体を殺し、さらにこ
れを洗滌し、所定の濃度に上記バクテリアを再生するこ
とを特徴とする菌突然変異体の製造法を提供するもので
ある。
菌二次培養突然変異体で富化された肉汁を接種し、温度
約37℃でこの肉汁を好気的に培養して最大に繁殖させ、
バクテリア剤でバクテリア突然変異体を殺し、さらにこ
れを洗滌し、所定の濃度に上記バクテリアを再生するこ
とを特徴とする菌突然変異体の製造法を提供するもので
ある。
さらにこの発明はグラム陰性バクテリア内毒素をピリ
ジン−ギ酸液と混合する工程と；この混合物を全還流蒸
留によりメチル化する工程と；このメチル化内毒素混合
物をアルコールを用いて析出させる工程と；このアルコ
ール／メチル化内毒素混合物を遠心分離する工程と；得
られた析出物を蒸留水と混合して内毒素を所定の濃度と
する工程とを具備してなる免疫モジュレータの製造法を
提供するものである。
ジン−ギ酸液と混合する工程と；この混合物を全還流蒸
留によりメチル化する工程と；このメチル化内毒素混合
物をアルコールを用いて析出させる工程と；このアルコ
ール／メチル化内毒素混合物を遠心分離する工程と；得
られた析出物を蒸留水と混合して内毒素を所定の濃度と
する工程とを具備してなる免疫モジュレータの製造法を
提供するものである。
さらに、この発明は複合ワクチンから得られる超免疫
血清の製造およびグラム陰性菌疾患の動物を治療する方
法を提供する。さらに、この発明は突然変異体と担体の
組合せを提供するものである。
血清の製造およびグラム陰性菌疾患の動物を治療する方
法を提供する。さらに、この発明は突然変異体と担体の
組合せを提供するものである。
本発明は数個の異なる概念を含むものである。すなわ
ち、（１）、菌突然変異体およびタンパク／脂質結合担
体からなるワクチンであって、脂質／タンパク親和性が
大きく、抗体の持続的解放を可能とする均質懸濁液を形
成するもの、およびこれに解毒された内毒素である免疫
モジュレータを添加したもの；（２）広範な予防機能を
有するバクテリア突然変異体、特に、腸内菌族からのＯ
−炭水化物側鎖を含まない内毒素を産生する細菌突然変
異体；（３）Ｂ−リンパ球増殖に対する特異性を有する
上記免疫モジュレータであって、抗原親和性および結合
性が大きく、中和およびオプソニン作用抗体を初期にお
いて多量に発生させるもの、およびそのような免疫モジ
ュレータの製造方法；（４）グラム陰性菌疾患を治療す
る超免疫血清およびその製造法である。
ち、（１）、菌突然変異体およびタンパク／脂質結合担
体からなるワクチンであって、脂質／タンパク親和性が
大きく、抗体の持続的解放を可能とする均質懸濁液を形
成するもの、およびこれに解毒された内毒素である免疫
モジュレータを添加したもの；（２）広範な予防機能を
有するバクテリア突然変異体、特に、腸内菌族からのＯ
−炭水化物側鎖を含まない内毒素を産生する細菌突然変
異体；（３）Ｂ−リンパ球増殖に対する特異性を有する
上記免疫モジュレータであって、抗原親和性および結合
性が大きく、中和およびオプソニン作用抗体を初期にお
いて多量に発生させるもの、およびそのような免疫モジ
ュレータの製造方法；（４）グラム陰性菌疾患を治療す
る超免疫血清およびその製造法である。
免疫方法として、このワクチンは筋肉内、又は皮下
に、菌１×107および免疫モジュレータ100μｇ以上の濃
度で投与される。グラム陰性バクテリアによる病気を有
する動物の治療に対しては種痘された供与体から血清が
つくられ、保護に十分な量の抗体が投与される。
に、菌１×107および免疫モジュレータ100μｇ以上の濃
度で投与される。グラム陰性バクテリアによる病気を有
する動物の治療に対しては種痘された供与体から血清が
つくられ、保護に十分な量の抗体が投与される。
この複合ワクチンの利点は予防的性格を有することで
あって、従来の病気発生後に開始される治療と異なる。
他の利点は内毒素疾患からの急速かつ高度の保護作用が
発現し、従来のワクチンに伴なう危険、たとえば（ａ）
致命的なアナフィラキシー；（ｂ）生のバクテリアが非
病原性から病原性に戻ることによる致命的感染；（ｃ）
バクテリア疾患の種の相対的変化により保護誘発能が減
退すること；のおそれはない。
あって、従来の病気発生後に開始される治療と異なる。
他の利点は内毒素疾患からの急速かつ高度の保護作用が
発現し、従来のワクチンに伴なう危険、たとえば（ａ）
致命的なアナフィラキシー；（ｂ）生のバクテリアが非
病原性から病原性に戻ることによる致命的感染；（ｃ）
バクテリア疾患の種の相対的変化により保護誘発能が減
退すること；のおそれはない。
複合ワクチンの解毒内毒素成分はＢ−リンパ球特異性
を有する有効免疫モジュレータとして抗体幹細胞をより
急速に増殖させるだけでなく、活性化状態を早急に生じ
させる。そのため、従来のバクテリアワクチンの場合に
較べ、ワクチン接種後の寄生体内における抗体の保護レ
ベルに達する時間がより早くなる。
を有する有効免疫モジュレータとして抗体幹細胞をより
急速に増殖させるだけでなく、活性化状態を早急に生じ
させる。そのため、従来のバクテリアワクチンの場合に
較べ、ワクチン接種後の寄生体内における抗体の保護レ
ベルに達する時間がより早くなる。
裸コア抗原（２−ケト−３−デオキシオクトン酸−脂
肪Ａ）を示す突然変異体からなり、従来のバクテリアワ
クチンの如きＯ−炭水化物側鎖（Ｋ抗原）を含まない複
合ワクチンの細菌ワクチン成分はＯ−炭水化物特異性免
疫グロブリンＥ（IgE,Reagin）の発生を阻止し、したが
ってワクチン接種のIgE媒介アナフィラキシーの誘発を
阻止させる。Ｏ−炭水化物側鎖（Ｋ−抗原血清型）とは
対照的に裸コア抗原は多くのグラム陰性バクテリアに共
通するものであるから、広範な交叉的保護の抗体を誘発
するとともに、Ｏ−炭水化物側鎖（Ｋ−抗原、血清型）
における疫学的移動又は変動による保護効果の損失を排
除する。
肪Ａ）を示す突然変異体からなり、従来のバクテリアワ
クチンの如きＯ−炭水化物側鎖（Ｋ抗原）を含まない複
合ワクチンの細菌ワクチン成分はＯ−炭水化物特異性免
疫グロブリンＥ（IgE,Reagin）の発生を阻止し、したが
ってワクチン接種のIgE媒介アナフィラキシーの誘発を
阻止させる。Ｏ−炭水化物側鎖（Ｋ−抗原血清型）とは
対照的に裸コア抗原は多くのグラム陰性バクテリアに共
通するものであるから、広範な交叉的保護の抗体を誘発
するとともに、Ｏ−炭水化物側鎖（Ｋ−抗原、血清型）
における疫学的移動又は変動による保護効果の損失を排
除する。
この複合ワクチンおよびこの複合ワクチンにより誘発
された超免疫血清の開発の以前においては、治療は内毒
素疾患の発生後に初めて主として化学療法に頼るもので
あった。この超免疫血清の利点は明らかに病気になった
非ワクチン接種動物において、病気の進行を軽減させ、
たとえば馬等の不具又は死亡を阻止させ得ることであ
る。
された超免疫血清の開発の以前においては、治療は内毒
素疾患の発生後に初めて主として化学療法に頼るもので
あった。この超免疫血清の利点は明らかに病気になった
非ワクチン接種動物において、病気の進行を軽減させ、
たとえば馬等の不具又は死亡を阻止させ得ることであ
る。
菌血症又は毒血症又は種々のグラム陰性バクテリアに
よる病気に対する複合ワクチン又は複合ワクチン誘発超
免疫血清を介しての広範な保護は応用免疫学における新
しい分子概念を用いる動物産業にとって経済的進展とな
る。この複合ワクチンにより保護の対象となる病気とし
ては内毒素媒介導管内凝結に関連するものを含む。たと
えば腸炎菌、ネジミチフス菌、チフス菌、サルモネラミ
ネソタ菌、ウシ流産菌、大腸菌によるものである。
よる病気に対する複合ワクチン又は複合ワクチン誘発超
免疫血清を介しての広範な保護は応用免疫学における新
しい分子概念を用いる動物産業にとって経済的進展とな
る。この複合ワクチンにより保護の対象となる病気とし
ては内毒素媒介導管内凝結に関連するものを含む。たと
えば腸炎菌、ネジミチフス菌、チフス菌、サルモネラミ
ネソタ菌、ウシ流産菌、大腸菌によるものである。
以下、本発明の個々の成分について述べる。
突然変異体 この突然変異体はATCC No.53000としてAmerican Type
Culture Collectionに寄託されている。
Culture Collectionに寄託されている。
遺伝的に変性された突然変異体種Ｒ−17の製造に用い
られる親分離物はUniversity of Missouri College of
Veterinay Medicineでウマの活性下痢感染したものから
分離した。この原分離物はマッコンキースアガー（MacC
onkeys agar）上に分離され、これは37℃、24時間の培
養の結果、ラクトース陰性で滑らかな粘液様の光沢性集
落3.5〜4mm（直径）を示した。これをAPI輪郭認識シス
テムに関連してAPIシステム（API Laboratory製品、200
Express st.,Plainview,ニューヨーク11803）を用いた
生物学的分析および通常の実験による特徴検査をおこな
った結果、原分離物が腸炎菌（Salmonella enteritidi
s;Serotype B−typhimurium）であることが判明した。
この微生物は文献、Manual of Clinical Microbiology,
2nd Ed.ワシントン,American Society for Microliolog
y,1974,腸内菌）に記載されている。
られる親分離物はUniversity of Missouri College of
Veterinay Medicineでウマの活性下痢感染したものから
分離した。この原分離物はマッコンキースアガー（MacC
onkeys agar）上に分離され、これは37℃、24時間の培
養の結果、ラクトース陰性で滑らかな粘液様の光沢性集
落3.5〜4mm（直径）を示した。これをAPI輪郭認識シス
テムに関連してAPIシステム（API Laboratory製品、200
Express st.,Plainview,ニューヨーク11803）を用いた
生物学的分析および通常の実験による特徴検査をおこな
った結果、原分離物が腸炎菌（Salmonella enteritidi
s;Serotype B−typhimurium）であることが判明した。
この微生物は文献、Manual of Clinical Microbiology,
2nd Ed.ワシントン,American Society for Microliolog
y,1974,腸内菌）に記載されている。
この発明の微生物の具体例はイオン化放射線により得
られる腸炎菌（Ｂ−typhimurium血清型）の親分離物の
抹消突然変異種である。このイオン化放射線は高エネル
ギー浸透により遊離ラジカルを生じさせ、細胞質分子を
不安定にさせデオキシリポ核酸中に一本鎖切断を生じさ
せ、これにより抹消突然変異体を高い割合で生じさせ
る。生存突然変異体は完全なリポ多糖の合成に対する様
々な程度の不能性の表現型発現を示す。このような突然
変異体は直径が比較的小さく、平坦なラフ集落（Ｒ）で
あり、親バクテリアによりつくられる大きく、凹み又は
凸状のスムーズ集落（Ｓ）と対照的なことから容易に認
識することができる。
られる腸炎菌（Ｂ−typhimurium血清型）の親分離物の
抹消突然変異種である。このイオン化放射線は高エネル
ギー浸透により遊離ラジカルを生じさせ、細胞質分子を
不安定にさせデオキシリポ核酸中に一本鎖切断を生じさ
せ、これにより抹消突然変異体を高い割合で生じさせ
る。生存突然変異体は完全なリポ多糖の合成に対する様
々な程度の不能性の表現型発現を示す。このような突然
変異体は直径が比較的小さく、平坦なラフ集落（Ｒ）で
あり、親バクテリアによりつくられる大きく、凹み又は
凸状のスムーズ集落（Ｓ）と対照的なことから容易に認
識することができる。
Ｘ−線変異生成は活性親バクテリアで接種した標準流
動プレート上でおこなわれた。すなわち、Machelett OE
G 60 X−線管であってベリリウム窓を有するものを用
い、50kVピークおよび25mAで操作し、250rad/秒の投射
速度で５秒の増度を以って最大35秒、上記プレートに照
射をおこなった。この照射されたプレートを４℃で２〜
４時間保持し、ついで暗所で37℃で培養し、光回復を排
除するようにした。この培養24時間後に、プレートを集
落形態の変化について検査した。直径2mmと同一又は小
さい集落でラフ形態（Ｒ）を示すものを選び個体プレー
ト媒体上で少なくとも10回、継代接種し、さらに実験用
マウスの腹腔内接種により少なくとも３回継代接種して
安定なラフ（Ｒ）表現型発現を確実なものとした。この
突然変異種Ｒ−17を胃内接種を介して標準マウス効力評
価法により親分離物との比較において、その弱毒性を評
価した。この突然変異種Ｒ−17からの精製リポ多糖と親
分離物を電気泳動により２％ナトリウムドデシルサルフ
ェート10％ポリアクリルアミドゲル中で化学分析した
（European Journal of Biochemistry 107:137−143,ネ
ズミチフス菌におけるリポ多糖の異質成分，ナトリウム
ドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分析）。さらに、色素形limulus lysate評価（Jo
urnal of Clinical Microbiology 12（５）:644−650,L
imulu Lysate使用による血液中の内毒素菌の定量分析、
1980,Webster,C.J.）により生物学的に分析した。その
結果、血清凝集（Serology of Salmonella,Vol.15,pp.1
〜141,1984,Lindberg,A.A.＆ L.Le Minor;Methods in M
icrobiology,T.Bergar,Academic Press,ニューヨーク,1
984）が認められ、Ｏ−炭水化物抗原は認められなかっ
た。したがって、この突然変異種Ｒ−17は化学型Ｉ又は
II、裸コア突然変異体からなる新規なものであることが
判明した。
動プレート上でおこなわれた。すなわち、Machelett OE
G 60 X−線管であってベリリウム窓を有するものを用
い、50kVピークおよび25mAで操作し、250rad/秒の投射
速度で５秒の増度を以って最大35秒、上記プレートに照
射をおこなった。この照射されたプレートを４℃で２〜
４時間保持し、ついで暗所で37℃で培養し、光回復を排
除するようにした。この培養24時間後に、プレートを集
落形態の変化について検査した。直径2mmと同一又は小
さい集落でラフ形態（Ｒ）を示すものを選び個体プレー
ト媒体上で少なくとも10回、継代接種し、さらに実験用
マウスの腹腔内接種により少なくとも３回継代接種して
安定なラフ（Ｒ）表現型発現を確実なものとした。この
突然変異種Ｒ−17を胃内接種を介して標準マウス効力評
価法により親分離物との比較において、その弱毒性を評
価した。この突然変異種Ｒ−17からの精製リポ多糖と親
分離物を電気泳動により２％ナトリウムドデシルサルフ
ェート10％ポリアクリルアミドゲル中で化学分析した
（European Journal of Biochemistry 107:137−143,ネ
ズミチフス菌におけるリポ多糖の異質成分，ナトリウム
ドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分析）。さらに、色素形limulus lysate評価（Jo
urnal of Clinical Microbiology 12（５）:644−650,L
imulu Lysate使用による血液中の内毒素菌の定量分析、
1980,Webster,C.J.）により生物学的に分析した。その
結果、血清凝集（Serology of Salmonella,Vol.15,pp.1
〜141,1984,Lindberg,A.A.＆ L.Le Minor;Methods in M
icrobiology,T.Bergar,Academic Press,ニューヨーク,1
984）が認められ、Ｏ−炭水化物抗原は認められなかっ
た。したがって、この突然変異種Ｒ−17は化学型Ｉ又は
II、裸コア突然変異体からなる新規なものであることが
判明した。
リポ多糖をアセトン乾燥バクテリア又は５容量倍の蒸
留水に懸濁させた湿潤バクテリアから0.25Nトリクロロ
酢酸水溶液を用いて抽出した。このリポ多糖（LPS）
（上澄液）を遠心分離（5000×g,30分,40℃）して残留
するバクテリア（ぺレット）から分離した。この上澄液
を10NのNaOHを用いpH6.8に調整し、冷無水エチルアルコ
ール２容量倍を添加し、この上澄液からLPSを析出させ
た。この析出したLPSを遠心分離（10,000×g,1時間,4
℃）により集め冷無水エタノールで洗滌し、親液化し、
使用時まで４℃にて貯蔵した。
留水に懸濁させた湿潤バクテリアから0.25Nトリクロロ
酢酸水溶液を用いて抽出した。このリポ多糖（LPS）
（上澄液）を遠心分離（5000×g,30分,40℃）して残留
するバクテリア（ぺレット）から分離した。この上澄液
を10NのNaOHを用いpH6.8に調整し、冷無水エチルアルコ
ール２容量倍を添加し、この上澄液からLPSを析出させ
た。この析出したLPSを遠心分離（10,000×g,1時間,4
℃）により集め冷無水エタノールで洗滌し、親液化し、
使用時まで４℃にて貯蔵した。
（免疫モジュレータの製造） トリクロロ酢酸抽出リポ多糖（LPS）をピリジン/90％
ギ酸（2:1容量比）100容量倍液に溶解させ、徐々に加温
して沸点まで上昇させ、そこで約15分間又は透明化する
まで保持した。ついで解毒を等量の蒸留水をこのLPS−
ピリジン−ギ酸溶液に添加し、60分間還流させることに
よりおこなった。この解毒LPSを冷無水エタノール４容
量倍の添加により一晩かけて析出させ、ついで、遠心分
離（10,000×g,1時間、４℃）をおこない、冷無水エタ
ノールで３回洗滌し、さらにこの親液化解毒LPS免疫モ
ジュレータを４℃で貯蔵し、免疫相乗作用を生じさせる
ために使用し得るように0.1％トリエチルアミン水溶液
中で再構成させた。
ギ酸（2:1容量比）100容量倍液に溶解させ、徐々に加温
して沸点まで上昇させ、そこで約15分間又は透明化する
まで保持した。ついで解毒を等量の蒸留水をこのLPS−
ピリジン−ギ酸溶液に添加し、60分間還流させることに
よりおこなった。この解毒LPSを冷無水エタノール４容
量倍の添加により一晩かけて析出させ、ついで、遠心分
離（10,000×g,1時間、４℃）をおこない、冷無水エタ
ノールで３回洗滌し、さらにこの親液化解毒LPS免疫モ
ジュレータを４℃で貯蔵し、免疫相乗作用を生じさせる
ために使用し得るように0.1％トリエチルアミン水溶液
中で再構成させた。
精製リポ多糖は試験管内でリンパ球胚子発生、すなわ
ち組織細胞を生じさせることが知られている。ヒトおよ
び他の動物リンパ球はインターリューキン（IL−1,IL−
２）を生じさせ、これが免疫応答を媒介させ、これによ
りエイコサテトラエン酸代謝産物（すなわち、プロスタ
ノイド又はプロスタグランジン）を介して抗体を生せ
る。また、精製リポ多糖はIL−１およびプロスタシリン
合成を生体内で増強することが知られている。しかし、
精製リポ多糖又は自然の（グラム陰性バクテリア自体に
関連する）リポ多糖は完全なＯ−炭水化物側鎖抗原を保
持し、これは生体（哺乳動物）内に導入された場合、毒
性を示し、都合の悪い熱性応答、凝血異常、又は感作さ
れた寄主中におけるアナフィラキシー様反応による伝染
性導管内凝固を生じさせる。この精製リポ多糖はμμｇ
あるいはng程度の濃度でも哺乳動物の組織又は細胞（試
験管内培養）に有害である。
ち組織細胞を生じさせることが知られている。ヒトおよ
び他の動物リンパ球はインターリューキン（IL−1,IL−
２）を生じさせ、これが免疫応答を媒介させ、これによ
りエイコサテトラエン酸代謝産物（すなわち、プロスタ
ノイド又はプロスタグランジン）を介して抗体を生せ
る。また、精製リポ多糖はIL−１およびプロスタシリン
合成を生体内で増強することが知られている。しかし、
精製リポ多糖又は自然の（グラム陰性バクテリア自体に
関連する）リポ多糖は完全なＯ−炭水化物側鎖抗原を保
持し、これは生体（哺乳動物）内に導入された場合、毒
性を示し、都合の悪い熱性応答、凝血異常、又は感作さ
れた寄主中におけるアナフィラキシー様反応による伝染
性導管内凝固を生じさせる。この精製リポ多糖はμμｇ
あるいはng程度の濃度でも哺乳動物の組織又は細胞（試
験管内培養）に有害である。
この発明は（１）哺乳類および組織細胞培養に対し無
害な免疫モジュレータの製造法；（２）哺乳類を粒状又
は可溶性抗原に対し免疫するための免疫モジュレータを
用いる方法であって、急速かつ大きい抗体応答を促進さ
せ、抗原因子（エピトープ）の広いスペクトルの認識を
増強させ、広範な免疫特異性を生じさせる方法；（３）
抗体合成形質細胞腫とＢ−リンパ球との間の交雑度を細
胞培養中で15〜30％から85％に高める方法であって、免
疫モジュレータの存在下で粒状又は可溶性抗原を用い供
与哺乳類の第一次免疫をおこなう方法；を含む。
害な免疫モジュレータの製造法；（２）哺乳類を粒状又
は可溶性抗原に対し免疫するための免疫モジュレータを
用いる方法であって、急速かつ大きい抗体応答を促進さ
せ、抗原因子（エピトープ）の広いスペクトルの認識を
増強させ、広範な免疫特異性を生じさせる方法；（３）
抗体合成形質細胞腫とＢ−リンパ球との間の交雑度を細
胞培養中で15〜30％から85％に高める方法であって、免
疫モジュレータの存在下で粒状又は可溶性抗原を用い供
与哺乳類の第一次免疫をおこなう方法；を含む。
免疫モジュレータは抗原と同時に投与した場合、C57B
L/6Jマウスの第一次免疫応答を高める。この増進効果は
緑膿菌の如き粒状抗原のみならず、キーホールドアオガ
イヘモシアニンの如き可溶性抗原を用いた場合でも生ず
る。抗原と免疫モジュレータを同時に注射した動物は抗
原のみを与えた動物に較べて注射後7,14、および35日後
の抗体力価が大きいことが認められた。免疫モジュレー
タは免疫応答の初期において抗体力価を増進させるだけ
でなく、血清抗体レベルを高い状態に持続させることが
でき、このことは極めて重要な点である。免疫モジュレ
ータによる特異的抗体応答の増進は注射経路によって実
質的に影響されることはない。なぜならばフロイントの
不完全アジュバントで抗原および免疫モジュレータを静
脈内、腹腔内又は皮下に注射した場合のいずれでもこの
増進がみられるからである。
L/6Jマウスの第一次免疫応答を高める。この増進効果は
緑膿菌の如き粒状抗原のみならず、キーホールドアオガ
イヘモシアニンの如き可溶性抗原を用いた場合でも生ず
る。抗原と免疫モジュレータを同時に注射した動物は抗
原のみを与えた動物に較べて注射後7,14、および35日後
の抗体力価が大きいことが認められた。免疫モジュレー
タは免疫応答の初期において抗体力価を増進させるだけ
でなく、血清抗体レベルを高い状態に持続させることが
でき、このことは極めて重要な点である。免疫モジュレ
ータによる特異的抗体応答の増進は注射経路によって実
質的に影響されることはない。なぜならばフロイントの
不完全アジュバントで抗原および免疫モジュレータを静
脈内、腹腔内又は皮下に注射した場合のいずれでもこの
増進がみられるからである。
これらの結果を表Ａに示す。これらの実験において、
各グループに５匹の動物を用いた。これらの実験動物は
抗原と免疫モジュレータ（75μg/−投与）を投与され、
参照動物は同一量の抗原と滅菌食塩が投与された。血清
抗体力価は間接的ELISA評価法により測定した。
各グループに５匹の動物を用いた。これらの実験動物は
抗原と免疫モジュレータ（75μg/−投与）を投与され、
参照動物は同一量の抗原と滅菌食塩が投与された。血清
抗体力価は間接的ELISA評価法により測定した。
免疫モジュレータは細胞培養成長に対する影響から毒
性がないことが証明されている。SP2/Oマウス骨髄腫細
胞を培養液1ml当り、100,1,0.1ngの濃度の免疫モジュレ
ータで培養したところ、細胞密度が相応する参照培養試
料とし同等もしくは若干大きくなっていることが判明し
た。骨髄腫細胞を10％胎児のウシ血清、２％Ｌ−グルタ
ミン、１％ピルベン酸ナトリウムおよび抗体を添加した
RPMI 1640媒体中で培養した。免疫モジュレータはこの
媒体中に適当な濃度で滅菌水溶液として添加した。細胞
密度は免疫モジュレータおよび滅菌蒸留水の等量を添加
したのち、24,48,72および96時間後に判定した。
性がないことが証明されている。SP2/Oマウス骨髄腫細
胞を培養液1ml当り、100,1,0.1ngの濃度の免疫モジュレ
ータで培養したところ、細胞密度が相応する参照培養試
料とし同等もしくは若干大きくなっていることが判明し
た。骨髄腫細胞を10％胎児のウシ血清、２％Ｌ−グルタ
ミン、１％ピルベン酸ナトリウムおよび抗体を添加した
RPMI 1640媒体中で培養した。免疫モジュレータはこの
媒体中に適当な濃度で滅菌水溶液として添加した。細胞
密度は免疫モジュレータおよび滅菌蒸留水の等量を添加
したのち、24,48,72および96時間後に判定した。
ワクチン ワクチンは菌突然変異体（細菌ワクチン）、免疫モジ
ュレータ（内毒素）およびタンパクおよび脂肪結合担体
（アジュバント）からなっている。このワクチンは筋肉
又は皮下に、１×107菌（好ましくは１×107菌）又はそ
れ以上、100μｇ以上（好ましくは100〜4000μｇ）の解
毒内毒素の濃度（脂質−タンパク親和性吸収担体中）で
投与した。
ュレータ（内毒素）およびタンパクおよび脂肪結合担体
（アジュバント）からなっている。このワクチンは筋肉
又は皮下に、１×107菌（好ましくは１×107菌）又はそ
れ以上、100μｇ以上（好ましくは100〜4000μｇ）の解
毒内毒素の濃度（脂質−タンパク親和性吸収担体中）で
投与した。
この細菌ワクチンは腸炎菌のＯ−炭水化物側鎖を含ま
ない内毒素を産生する細菌突然変異体の滅殺懸濁液から
なるものである。このバクテリアは腸炎菌（Salmonella
enteritidis）突然変異体の二次培養で富化された滅菌
肉汁を接種し、37℃で好気的に最大限に培養してつくら
れた。このバクテリアをマーシオレートの如き殺菌剤で
滅殺したのち、その非生活性をチェックした。ついで非
発熱性滅菌生理食塩水で４回洗滌したのち、他のワクチ
ン成分との混合のための所望の貯蔵濃度に再構成させ
た。
ない内毒素を産生する細菌突然変異体の滅殺懸濁液から
なるものである。このバクテリアは腸炎菌（Salmonella
enteritidis）突然変異体の二次培養で富化された滅菌
肉汁を接種し、37℃で好気的に最大限に培養してつくら
れた。このバクテリアをマーシオレートの如き殺菌剤で
滅殺したのち、その非生活性をチェックした。ついで非
発熱性滅菌生理食塩水で４回洗滌したのち、他のワクチ
ン成分との混合のための所望の貯蔵濃度に再構成させ
た。
解毒内毒素はグラム陰性バクテリア内毒素をピリジン
−ギ酸（2:1）溶液に添加してつくられた。この内毒素
−ピリジン−ギ酸混合物は滅菌還流凝縮装置中で十分に
混合し、温度を沸点まで上昇させ、最良の内毒素メチル
化物を得るべく還流させた。ついで、このメチル化毒素
内毒素をアルコールの添加により還流混合水から析出さ
せ、遠心分離により集め、アルコール中に再懸濁するこ
とにより洗滌し、再遠心分離し、最後に非発熱性蒸留水
に解かし、ワクチンの他の成分と混合するために所望の
貯蔵濃度に調整した。
−ギ酸（2:1）溶液に添加してつくられた。この内毒素
−ピリジン−ギ酸混合物は滅菌還流凝縮装置中で十分に
混合し、温度を沸点まで上昇させ、最良の内毒素メチル
化物を得るべく還流させた。ついで、このメチル化毒素
内毒素をアルコールの添加により還流混合水から析出さ
せ、遠心分離により集め、アルコール中に再懸濁するこ
とにより洗滌し、再遠心分離し、最後に非発熱性蒸留水
に解かし、ワクチンの他の成分と混合するために所望の
貯蔵濃度に調整した。
細菌ワクチンのタンパク質分および解毒内毒素の脂質
分を吸収するのに十分な高親和性を有する親脂質、タン
パク担体からなるアジュバンドが用いられる。このアジ
ュバントは好ましくは脂肪酸系のもの、オイル系のも
の、又は明ばん系のもの（たとえばAl2O3）のものが用
いられる。このジアルミニウムトリオキシドの担体特性
は均一な懸濁状態を保持し、細胞ワクチン および解毒内毒素の持続的解放を保持し、著るしい抗体
の生産を確実にする。このジアルミニウムトリオキシド
をタンパク−脂質高親和アジュバントとして用いる場
合、1.5容量％が最適である。
分を吸収するのに十分な高親和性を有する親脂質、タン
パク担体からなるアジュバンドが用いられる。このアジ
ュバントは好ましくは脂肪酸系のもの、オイル系のも
の、又は明ばん系のもの（たとえばAl2O3）のものが用
いられる。このジアルミニウムトリオキシドの担体特性
は均一な懸濁状態を保持し、細胞ワクチン および解毒内毒素の持続的解放を保持し、著るしい抗体
の生産を確実にする。このジアルミニウムトリオキシド
をタンパク−脂質高親和アジュバントとして用いる場
合、1.5容量％が最適である。
この複合ワクチンで通常のウマを免疫したときは、炭
水化物で飽食させた場合（自然界で生ずる飽食に似せた
もの）でも、又、細菌内毒素を静脈注射した場合（すな
わち、自然界で起る場合に似せて人工的に発病させる）
でも、血流中に十分な保護をなし得る抗体が生じた。同
様にウシに対して免疫を施した場合も体温の上昇は見ら
れず、白血球の数、型の異常な増加が見られた。この複
合ワクチンの利点は、（ａ）細胞壁中に通常存在し、好
ましくないアナフィラキシー様反応を生じさせる成分を
含まない突然変異バクテリアであること；（ｂ）バクテ
リア又は解毒化内毒素を持続的に解放させ、多量の中和
抗体を生じさせるアジュバント又は担体であること；
（ｃ）完全な内毒素およびバクテリアに対し望ましい中
和抗体を早急かつ多量に生じさせる解毒化内毒素である
こと；を含む。この複合ワクチンは多くのグラム陰性菌
疾患に対し、広範な保護を与える品質を有する。なぜな
らば抗原の基本的構造はほとんどのグラム陰性菌に対し
共通するからである。しかし、この複合ワクチンは望ま
しくないアナフィラキシーを生じさせる従来のワクチン
成分を含まない。
水化物で飽食させた場合（自然界で生ずる飽食に似せた
もの）でも、又、細菌内毒素を静脈注射した場合（すな
わち、自然界で起る場合に似せて人工的に発病させる）
でも、血流中に十分な保護をなし得る抗体が生じた。同
様にウシに対して免疫を施した場合も体温の上昇は見ら
れず、白血球の数、型の異常な増加が見られた。この複
合ワクチンの利点は、（ａ）細胞壁中に通常存在し、好
ましくないアナフィラキシー様反応を生じさせる成分を
含まない突然変異バクテリアであること；（ｂ）バクテ
リア又は解毒化内毒素を持続的に解放させ、多量の中和
抗体を生じさせるアジュバント又は担体であること；
（ｃ）完全な内毒素およびバクテリアに対し望ましい中
和抗体を早急かつ多量に生じさせる解毒化内毒素である
こと；を含む。この複合ワクチンは多くのグラム陰性菌
疾患に対し、広範な保護を与える品質を有する。なぜな
らば抗原の基本的構造はほとんどのグラム陰性菌に対し
共通するからである。しかし、この複合ワクチンは望ま
しくないアナフィラキシーを生じさせる従来のワクチン
成分を含まない。
炭水化物の過度の負担は腸（大腸）中の酸の濃度を増
加させ、これが腸壁を害し、同時に腸内のグラム陰性バ
クテリアの数を減少させる。これは血流中への移行増大
（敗血症）および酸による滅殺による。このバクテリア
の滅殺は細胞壁からの内毒素の解放をもたらし、これは
酸破壊腸壁を通過して血流に移行することになる。血流
中の内毒素は毛細血管中の血液凝固を生じさせる。ウマ
および他の蹄動物の場合、これらの血液凝固は最終的に
蹄組織を死滅させて不具又は死亡の原因となる。
加させ、これが腸壁を害し、同時に腸内のグラム陰性バ
クテリアの数を減少させる。これは血流中への移行増大
（敗血症）および酸による滅殺による。このバクテリア
の滅殺は細胞壁からの内毒素の解放をもたらし、これは
酸破壊腸壁を通過して血流に移行することになる。血流
中の内毒素は毛細血管中の血液凝固を生じさせる。ウマ
および他の蹄動物の場合、これらの血液凝固は最終的に
蹄組織を死滅させて不具又は死亡の原因となる。
この複合ワクチンはウマにおいて、飽食による腸炎又
はストレスにかかったウマの血流中に入り込んだ内毒素
又はグラム陰性バクテリアを中和することにより腸炎又
は疝痛の影響を防止し得る利点を有する。ウシの場合で
も血流に浸入した内毒素又はグラム陰性バクテリアを中
和することにより、内毒素系疾患を防止ないし減少させ
ることができる。食肉ウシにおける突然死症候群（腸の
グラム陰性菌からの内毒素により生ずるもの）はそのよ
うな病気の古くからの例であり、畜産業において重大な
意味を有する。
はストレスにかかったウマの血流中に入り込んだ内毒素
又はグラム陰性バクテリアを中和することにより腸炎又
は疝痛の影響を防止し得る利点を有する。ウシの場合で
も血流に浸入した内毒素又はグラム陰性バクテリアを中
和することにより、内毒素系疾患を防止ないし減少させ
ることができる。食肉ウシにおける突然死症候群（腸の
グラム陰性菌からの内毒素により生ずるもの）はそのよ
うな病気の古くからの例であり、畜産業において重大な
意味を有する。
ワクチン成分の作用および安全性 細胞ワクチンとともに免疫調整内毒素の添加が種痘動
物の免疫応答の早期、敏感性を誘発することが見出され
た。すなわち、バクテリア＋変性毒素又は細胞ワクチン
のみを筋肉投与により成熟したウマ又はポニーの群に接
種した。この実験開始の一週間前にこれらの動物から採
血し、その免疫フロフィールを調べたところ、全て正常
であった（すなわち、椎弓炎の徴候は見られなかっ
た）。免疫後24時間ののち、血清サンプルを集め、抗原
特異固相ラジオイムノアッセイ（同位元素標識免疫定量
法）を用いて抗体力価を調べた。第１図に示すデータは
細胞ワクチン−変性毒素で接種した動物は３日後に早く
も抗体力価が認められ、バクテリアのみを受けた動物の
場合の７日後とは対照的であった。３〜14日の間の第１
図の免疫応答曲線によれば細胞ワクチン＋変性毒素を与
えた群では細胞ワクチンのみを与えた群と比較して勾配
が急峻である。これは前者の場合、抗体の生産速度がよ
り大きいことを示している。したがって、細胞ワクチン
＋内毒素投与の群は早急な保護が得られるものと思われ
る。さらに細胞ワクチンのみを受けた動物の場合と比較
して前者のものは循環流中の中和又はオプソニン化抗体
の高濃度による全般的保護の向上が見られた。
物の免疫応答の早期、敏感性を誘発することが見出され
た。すなわち、バクテリア＋変性毒素又は細胞ワクチン
のみを筋肉投与により成熟したウマ又はポニーの群に接
種した。この実験開始の一週間前にこれらの動物から採
血し、その免疫フロフィールを調べたところ、全て正常
であった（すなわち、椎弓炎の徴候は見られなかっ
た）。免疫後24時間ののち、血清サンプルを集め、抗原
特異固相ラジオイムノアッセイ（同位元素標識免疫定量
法）を用いて抗体力価を調べた。第１図に示すデータは
細胞ワクチン−変性毒素で接種した動物は３日後に早く
も抗体力価が認められ、バクテリアのみを受けた動物の
場合の７日後とは対照的であった。３〜14日の間の第１
図の免疫応答曲線によれば細胞ワクチン＋変性毒素を与
えた群では細胞ワクチンのみを与えた群と比較して勾配
が急峻である。これは前者の場合、抗体の生産速度がよ
り大きいことを示している。したがって、細胞ワクチン
＋内毒素投与の群は早急な保護が得られるものと思われ
る。さらに細胞ワクチンのみを受けた動物の場合と比較
して前者のものは循環流中の中和又はオプソニン化抗体
の高濃度による全般的保護の向上が見られた。
エンドトキソイド（すなわち解毒内毒素、又は変性毒
素）をマウス、ウマ、ポニー、ウシに投与し、細胞ワク
チンとともに、免疫調整剤として安全に投与し得る最大
量について調べた。CF−１マウスについて、自然の内毒
素を0.3〜0.6mg静脈注射した場合、LD50は通常72〜96時
間内に達せられる。
素）をマウス、ウマ、ポニー、ウシに投与し、細胞ワク
チンとともに、免疫調整剤として安全に投与し得る最大
量について調べた。CF−１マウスについて、自然の内毒
素を0.3〜0.6mg静脈注射した場合、LD50は通常72〜96時
間内に達せられる。
オスのCF−１マウス（L5−20g）の尾部血管に、0.1ml
の生理食塩水、0.1mlの生理食塩水に内毒素を300μｇ溶
かしたもの、0.1mlの生理食塩水にエンドトキソイドを
それぞれ600μg,6000μg,12,000μｇ溶かしたものを接
種した。これらのマウスについて、24時間間隔で悪影響
および死亡率について観察した。死亡は内毒素投与群
（正の制御）において、48時間以内に認められ、最大死
亡率（56％）は72時間後に認められた（表１）。これに
対し、変性毒素の２倍（600μｇ）を投与した群では死
亡は見られず、20倍（6000μｇ）投与した群では死亡率
がわずか17％であり、40倍（12,000μｇ）投与した群で
はLD53となった。このことから、変性毒素は天然の内毒
素よりも毒性が少なくとも40分の１以下であると判定し
た。
の生理食塩水、0.1mlの生理食塩水に内毒素を300μｇ溶
かしたもの、0.1mlの生理食塩水にエンドトキソイドを
それぞれ600μg,6000μg,12,000μｇ溶かしたものを接
種した。これらのマウスについて、24時間間隔で悪影響
および死亡率について観察した。死亡は内毒素投与群
（正の制御）において、48時間以内に認められ、最大死
亡率（56％）は72時間後に認められた（表１）。これに
対し、変性毒素の２倍（600μｇ）を投与した群では死
亡は見られず、20倍（6000μｇ）投与した群では死亡率
がわずか17％であり、40倍（12,000μｇ）投与した群で
はLD53となった。このことから、変性毒素は天然の内毒
素よりも毒性が少なくとも40分の１以下であると判定し
た。
成熟したウマおよびポニーをエンドトキソイド5mg以
下で筋肉内に接種した。これら動物を発熱、末梢環流、
心脈、血圧、嗜眠、下痢について４日間、１日２回の割
合で観察した。2.5mgの投与を受けた動物は一匹も何ん
らの悪い影響を示さなかった。5mgの投与を受けた動物
は体温が103〜105゜Fに不規則的に上昇した。又、心脈
が若干上り、末梢環流の若干の損失が見られた。これら
の症状は８〜12時間以内に減退した。しかし、下痢、血
液疾患その他の不可逆的症状を示した動物は見当らなか
った。これらの結果から2.5mg以下（2500μｇ以下）又
はワクチン中に免疫調整剤として導入され得るとした変
性毒素100μｇの25倍をウマおよびポニーに安全に使用
し得ることが確認された。
下で筋肉内に接種した。これら動物を発熱、末梢環流、
心脈、血圧、嗜眠、下痢について４日間、１日２回の割
合で観察した。2.5mgの投与を受けた動物は一匹も何ん
らの悪い影響を示さなかった。5mgの投与を受けた動物
は体温が103〜105゜Fに不規則的に上昇した。又、心脈
が若干上り、末梢環流の若干の損失が見られた。これら
の症状は８〜12時間以内に減退した。しかし、下痢、血
液疾患その他の不可逆的症状を示した動物は見当らなか
った。これらの結果から2.5mg以下（2500μｇ以下）又
はワクチン中に免疫調整剤として導入され得るとした変
性毒素100μｇの25倍をウマおよびポニーに安全に使用
し得ることが確認された。
ウシについては変性毒素を1000μｇ以下筋肉内に接種
し、２日間隔で16日間、発熱、白血球減少又は白血球
症、単核細胞異常（鑑別血球計算）、赤血球異常、嗜
眠、下痢について観察した。しかし、何んらの不都合な
作用は見られなかった。このことから変性毒素1000μｇ
まで免疫調整剤としてワクチンに安全に添加し得ると判
定した。
し、２日間隔で16日間、発熱、白血球減少又は白血球
症、単核細胞異常（鑑別血球計算）、赤血球異常、嗜
眠、下痢について観察した。しかし、何んらの不都合な
作用は見られなかった。このことから変性毒素1000μｇ
まで免疫調整剤としてワクチンに安全に添加し得ると判
定した。
ワクチンの安全性 以下の規準に関してワクチンの安全性を評価した。
（１）通常の接種法での好適量に関連させて、マウス、
ウマ、ウシに大量投与（５倍以下）した場合；（２）短
時間間隔で多数回の投与をウマ、ウシに施した場合；
（３）接種経路（筋肉内、皮下、腹腔内）；（４）将来
の品質制御の手段として実験マウス中；（５）多標準を
評価し得る実験用ウマおよびポニー中；（６）野外研究
で、多数のウマ、ポニーおよびウシ、分布広汎な遺伝子
プールにおいて、限られた因子についての評価。
ウマ、ウシに大量投与（５倍以下）した場合；（２）短
時間間隔で多数回の投与をウマ、ウシに施した場合；
（３）接種経路（筋肉内、皮下、腹腔内）；（４）将来
の品質制御の手段として実験マウス中；（５）多標準を
評価し得る実験用ウマおよびポニー中；（６）野外研究
で、多数のウマ、ポニーおよびウシ、分布広汎な遺伝子
プールにおいて、限られた因子についての評価。
成熟したメスおよびオスのマウス（20−25gm）の群に
ついてワクチン又はワクチン成分1ml分量を接種した。
これらマウスを死亡率、毛並み、脊髄彎曲および 複合
（末梢筋冷却を示すもの）、脱水、嗜眠、下痢、膿瘍に
ついて96時間観察した。
ついてワクチン又はワクチン成分1ml分量を接種した。
これらマウスを死亡率、毛並み、脊髄彎曲および 複合
（末梢筋冷却を示すもの）、脱水、嗜眠、下痢、膿瘍に
ついて96時間観察した。
表２のデータによればワクチン1mlの投与（皮下又は
筋肉内）は実験マウスに対し全く危険はない。しかし、
接種の腹腔投与の場合は脂質−タンパク親和性担体の体
重に対する割合が高く（1:20）、したがってタンパク質
の脱水のため30％の死亡率を示した。この腹腔内投与の
悪い影響は問題とならないと判定された。なぜならばワ
クチンの目標種は担体に対する体重比が異常に大きいか
らである。なお、接種の経路は腹腔内よりも筋肉内又は
皮下がより好ましい。
筋肉内）は実験マウスに対し全く危険はない。しかし、
接種の腹腔投与の場合は脂質−タンパク親和性担体の体
重に対する割合が高く（1:20）、したがってタンパク質
の脱水のため30％の死亡率を示した。この腹腔内投与の
悪い影響は問題とならないと判定された。なぜならばワ
クチンの目標種は担体に対する体重比が異常に大きいか
らである。なお、接種の経路は腹腔内よりも筋肉内又は
皮下がより好ましい。
健康な成熟ウマに筋肉を介してワクチンを５倍（５×
1010バクテリア、50μｇ変性毒素）６日間隔で２回続け
て接種した。これら動物を無食欲症、嗜眠、下痢、脱水
および注射部位での膿瘍、はれ、柔軟化について観察し
た。その結果、悪い影響は注射部位における若干のは
れ、柔軟化が見られただけで、48−72時間以内に消え
た。
1010バクテリア、50μｇ変性毒素）６日間隔で２回続け
て接種した。これら動物を無食欲症、嗜眠、下痢、脱水
および注射部位での膿瘍、はれ、柔軟化について観察し
た。その結果、悪い影響は注射部位における若干のは
れ、柔軟化が見られただけで、48−72時間以内に消え
た。
500〜650ポンドのウシで筋肉を介して18日間隔で4.5
倍（4.5×1010バクテリア、437μｇ変性毒素）を２回連
続して接種した。又、１頭のウシについては11.25倍
（1.125×1010バクテリアおよび1mgの変性毒素）のワク
チンを１回のみ接種した。全ての動物について、１日２
回、無食欲症、嗜眠、下痢、脱水、注射部位における柔
軟化、はれ、膿瘍について観察したが、悪い反応は全く
見られなかった。
倍（4.5×1010バクテリア、437μｇ変性毒素）を２回連
続して接種した。又、１頭のウシについては11.25倍
（1.125×1010バクテリアおよび1mgの変性毒素）のワク
チンを１回のみ接種した。全ての動物について、１日２
回、無食欲症、嗜眠、下痢、脱水、注射部位における柔
軟化、はれ、膿瘍について観察したが、悪い反応は全く
見られなかった。
この結果からウマ、ウシに対し適当として定められた
投与量、方法においては危険性は全くないことが確認さ
れた。
投与量、方法においては危険性は全くないことが確認さ
れた。
健康な成熟ウマに対し、筋肉を介してワクチンを2.5
倍（2.5×1010バクテリア、200μｇの変性毒素）を３日
置きに９日間投与し、ついで７日間休ませたのち、３投
与・３日間隔の接種をさらに５回施した。したがって、
64日間に18回の接種をおこなった。連続的投与は首部の
尻部とを交互に変えておこなった。
倍（2.5×1010バクテリア、200μｇの変性毒素）を３日
置きに９日間投与し、ついで７日間休ませたのち、３投
与・３日間隔の接種をさらに５回施した。したがって、
64日間に18回の接種をおこなった。連続的投与は首部の
尻部とを交互に変えておこなった。
これらの動物について、無食欲症、嗜眠、および下
痢、脱水および注射部の柔軟化、はれ、膿瘍について観
察したが、悪い反応は局部的軟化、はれ、膿瘍が10回の
接種ののちに一頭の動物に見られたにすぎなかった。こ
の膿瘍は排液したところ急速に解け、接種処置を続行す
ることができた。他の悪影響は全く見られなかった。
痢、脱水および注射部の柔軟化、はれ、膿瘍について観
察したが、悪い反応は局部的軟化、はれ、膿瘍が10回の
接種ののちに一頭の動物に見られたにすぎなかった。こ
の膿瘍は排液したところ急速に解け、接種処置を続行す
ることができた。他の悪影響は全く見られなかった。
190〜650ポンドの子ウシに対しワクチンを４倍投与
（４×1010バクテリア、変性毒素400μｇ）を皮下に施
した。17日後、これらの子ウシの一部に筋肉を介してワ
クチンの１倍投与を施した。これら全ての動物につい
て、無食欲症、嗜眠、下痢、脱水について120日間毎日
観察した。又、体重、体温、血液疾患について、最初の
15日間は３日間隔、その後の120日間は30日間隔で観察
した。その結果、５頭は固い局部的小結節が最初の４倍
皮下接種ののちに見られたが、８−12日以内に分解吸収
された。このような小結節の発生は筋肉内１倍投与を再
び施した場合には見られなかった。
（４×1010バクテリア、変性毒素400μｇ）を皮下に施
した。17日後、これらの子ウシの一部に筋肉を介してワ
クチンの１倍投与を施した。これら全ての動物につい
て、無食欲症、嗜眠、下痢、脱水について120日間毎日
観察した。又、体重、体温、血液疾患について、最初の
15日間は３日間隔、その後の120日間は30日間隔で観察
した。その結果、５頭は固い局部的小結節が最初の４倍
皮下接種ののちに見られたが、８−12日以内に分解吸収
された。このような小結節の発生は筋肉内１倍投与を再
び施した場合には見られなかった。
一群のウマ、ポニーにワクチン（１×1010バクテリ
ア、変性毒素100μg/体重1kg当り）を筋肉内を介して14
日間隔で２回投与した。ついで無食欲症、嗜眠、下痢、
脱水および注射部位における軟化、はれ、膿瘍について
毎日観察した。その結果、数頭の動物について、注射部
位における若干の軟化が見られたにすぎなかった。
ア、変性毒素100μg/体重1kg当り）を筋肉内を介して14
日間隔で２回投与した。ついで無食欲症、嗜眠、下痢、
脱水および注射部位における軟化、はれ、膿瘍について
毎日観察した。その結果、数頭の動物について、注射部
位における若干の軟化が見られたにすぎなかった。
550〜650ポンドの肉食ウシにワクチン（１×1010バク
テリア、100μｇの変性毒素／体重1kg当り）を接種し
た。一部のウシに対しては筋肉内、他のウシに対しては
皮下に接種した。これらウシについて、無食欲症、嗜
眠、下痢、脱水、注射部位の軟化、はれ、膿瘍を50日間
毎日観察した。その結果、注射部位を含め、悪影響は全
く見られなかった。また小結節の発生も皮下投与のウシ
について全く認められなかった。
テリア、100μｇの変性毒素／体重1kg当り）を接種し
た。一部のウシに対しては筋肉内、他のウシに対しては
皮下に接種した。これらウシについて、無食欲症、嗜
眠、下痢、脱水、注射部位の軟化、はれ、膿瘍を50日間
毎日観察した。その結果、注射部位を含め、悪影響は全
く見られなかった。また小結節の発生も皮下投与のウシ
について全く認められなかった。
これらの結果から、適当量および適当投与方法でワク
チンをウマ、ウシ、ポニー等に施した場合はこれら動物
に対する危険性は筋肉内又は皮下投与の場合でも全くな
いことが確認できた。
チンをウマ、ウシ、ポニー等に施した場合はこれら動物
に対する危険性は筋肉内又は皮下投与の場合でも全くな
いことが確認できた。
ワクチンの効能 健康な成熟ウマおよびポニーに筋肉内投与を介して１
倍量のワクチン（１×1010バクテリアおよび100μｇの
変性毒素）を２週間間隔で２回施した。これら動物から
約一週間間隔で採血し、抗体力価をラジオイミュノアッ
セイ法により測定した。その結果第１次免疫後20〜30日
経過時に大部分が免疫応答の曲線がピークとなり、ま
た、第２次又は既往免疫ののち10〜20日経過時に免疫応
答がピークとなった。予防効能は炭水化物飽食（Per
OS）又は接種動物に対する致死量以下の変性毒素投与
（静脈内）により第２次免疫後の種々の時点で判定し
た。非ワクチン投与ウマ又はポニーの70〜80％はObel度
３−４、急性椎弓炎が、トウモロコシ−おがくず粉がゆ
を胃管を介して17.6g/体重1kgの投与で炭水化物を飽食
させたのち40〜50時間後に発生していた。非ワクチン投
与ウマ又はポニーの100％は内毒素を10μｇ（体重1kg当
り）静脈投与したのち２−３分以内に頻呼吸、呼吸困
難、運動失調を発生し、45分以内に液様の形のない便が
出た。
倍量のワクチン（１×1010バクテリアおよび100μｇの
変性毒素）を２週間間隔で２回施した。これら動物から
約一週間間隔で採血し、抗体力価をラジオイミュノアッ
セイ法により測定した。その結果第１次免疫後20〜30日
経過時に大部分が免疫応答の曲線がピークとなり、ま
た、第２次又は既往免疫ののち10〜20日経過時に免疫応
答がピークとなった。予防効能は炭水化物飽食（Per
OS）又は接種動物に対する致死量以下の変性毒素投与
（静脈内）により第２次免疫後の種々の時点で判定し
た。非ワクチン投与ウマ又はポニーの70〜80％はObel度
３−４、急性椎弓炎が、トウモロコシ−おがくず粉がゆ
を胃管を介して17.6g/体重1kgの投与で炭水化物を飽食
させたのち40〜50時間後に発生していた。非ワクチン投
与ウマ又はポニーの100％は内毒素を10μｇ（体重1kg当
り）静脈投与したのち２−３分以内に頻呼吸、呼吸困
難、運動失調を発生し、45分以内に液様の形のない便が
出た。
表３はワクチン投与動物の約90％は炭水化物飽食後の
Obel度３−４急性椎弓炎を起さなかったのに対し、ワク
チン非投与参照動物（12〜14才以上の100頭の動物）で
はそれがわずか15〜25％であったことから予防効果は65
〜75％であったと認められた。同様の比較を致死量以下
の内毒素をマウスに与えた場合について、おこなった結
果、予防効果は60％以上であった。これらの実験からワ
クチンを１倍量、２回投与したウマ又はポニー（成熟し
たもの）は炭水化物誘導椎弓炎については90％の予防効
果、内毒素誘導疾患については60％以上の予防効果があ
ることが判明した。
Obel度３−４急性椎弓炎を起さなかったのに対し、ワク
チン非投与参照動物（12〜14才以上の100頭の動物）で
はそれがわずか15〜25％であったことから予防効果は65
〜75％であったと認められた。同様の比較を致死量以下
の内毒素をマウスに与えた場合について、おこなった結
果、予防効果は60％以上であった。これらの実験からワ
クチンを１倍量、２回投与したウマ又はポニー（成熟し
たもの）は炭水化物誘導椎弓炎については90％の予防効
果、内毒素誘導疾患については60％以上の予防効果があ
ることが判明した。
年令、性別が混在したウシについて皮下にワクチンを
投与し、15日間に亘り３日間隔で、さらにその後120日
間は30日間隔で採血し血清を得た。これらの抗体力価は
ラジオイムノアッセイ法により判定したところ、接種か
ら20日以内に全ての動物は抗体力価が２〜４倍となっ
た。ワクチン投与後120日の時点で動物の70％は可成り
の力価が存在した。一部の動物についてはワクチン投与
後30日間炭水化物の食事を与えた。しかし、17週間経過
後も無食欲症、下痢、跛行、急死症候群の徴候は全く見
られなかった。
投与し、15日間に亘り３日間隔で、さらにその後120日
間は30日間隔で採血し血清を得た。これらの抗体力価は
ラジオイムノアッセイ法により判定したところ、接種か
ら20日以内に全ての動物は抗体力価が２〜４倍となっ
た。ワクチン投与後120日の時点で動物の70％は可成り
の力価が存在した。一部の動物についてはワクチン投与
後30日間炭水化物の食事を与えた。しかし、17週間経過
後も無食欲症、下痢、跛行、急死症候群の徴候は全く見
られなかった。
550〜680ポンドの食肉ウシに１−（１×）投与量のワ
クチンを施し、下痢、跛行、突然死について毎日観察し
たが11週間経過後も全く異常は見られなかった。
クチンを施し、下痢、跛行、突然死について毎日観察し
たが11週間経過後も全く異常は見られなかった。
血 清 明らかに内毒素による疾患を持ったワクチン非投与動
物は、複合ワクチン接種後でも、抗体を予防に十分なレ
ベルまで増強させる余裕を、それ自身の免疫システムで
とることができないとの理論に基づいて、超免疫血清の
開発および治療上の使用がなされている。すなわち、他
の動物により発展させた予め貯ぞうされた抗体（超血
清）で受動免疫化することにより短期間の保護手段が得
られ、これによりその動物自身の免疫システムが十分に
予防的となるまで内毒素疾患の改善に役立つものであ
る。ワクチン非投与ウマの急性椎弓炎因子が偶発的に穀
物容器内に入り込み、これがのちに腸炎の原因となるこ
とはウマの飼育場における古くからの例である。
物は、複合ワクチン接種後でも、抗体を予防に十分なレ
ベルまで増強させる余裕を、それ自身の免疫システムで
とることができないとの理論に基づいて、超免疫血清の
開発および治療上の使用がなされている。すなわち、他
の動物により発展させた予め貯ぞうされた抗体（超血
清）で受動免疫化することにより短期間の保護手段が得
られ、これによりその動物自身の免疫システムが十分に
予防的となるまで内毒素疾患の改善に役立つものであ
る。ワクチン非投与ウマの急性椎弓炎因子が偶発的に穀
物容器内に入り込み、これがのちに腸炎の原因となるこ
とはウマの飼育場における古くからの例である。
超免疫血清は凝固血清又はそれらの一部（γ−グロブ
リン、イムノグロブリン又はイムノグロブリンIgGT）か
らなり、分類学上の腸内菌族のバクテリアの内毒素中の
コア成分（２−ケト−３−デオキシオクトン酸−脂質
Ａ）に対し特異性を示す抗体を含でいる。この抗体は複
合ワクチンにより動物を超免疫化することにより誘発さ
れる。
リン、イムノグロブリン又はイムノグロブリンIgGT）か
らなり、分類学上の腸内菌族のバクテリアの内毒素中の
コア成分（２−ケト−３−デオキシオクトン酸−脂質
Ａ）に対し特異性を示す抗体を含でいる。この抗体は複
合ワクチンにより動物を超免疫化することにより誘発さ
れる。
超血清は健康な成熟ウマに複合ワクチン2.5mlを３日
間隔で６回連続的に、さらに７日間隔で2.5mlを２回連
続的に筋肉内を介して注射することによって得られる。
血清サンプルはワクチン投与前にこのウマから採取さ
れ、その後、３日間隔で血清学上の分析がなされる。抗
原特異イムノグロブリン（gG,GT,A,M）の濃度は125I−
プロテインＡを用いたラジオイムノアッセイにより判定
される。各動物の免疫応答が高平部に達したとき、全血
を12採血する。超免疫血清は凝固（約24時間後）のの
ち遠心分離により分取し、ついで加熱無活性化（56℃,3
0分）し、さらにγ−グロブリン又はイムノグロブリン
ののちの精製又は使用まで４℃にて貯ぞうされる。
間隔で６回連続的に、さらに７日間隔で2.5mlを２回連
続的に筋肉内を介して注射することによって得られる。
血清サンプルはワクチン投与前にこのウマから採取さ
れ、その後、３日間隔で血清学上の分析がなされる。抗
原特異イムノグロブリン（gG,GT,A,M）の濃度は125I−
プロテインＡを用いたラジオイムノアッセイにより判定
される。各動物の免疫応答が高平部に達したとき、全血
を12採血する。超免疫血清は凝固（約24時間後）のの
ち遠心分離により分取し、ついで加熱無活性化（56℃,3
0分）し、さらにγ−グロブリン又はイムノグロブリン
ののちの精製又は使用まで４℃にて貯ぞうされる。
γ−グロブリンは50％飽和アンモニウムスルフェート
（SAS）を用いて超免疫血清から析出させてつくる。こ
の析出物を0.01Mのりん酸塩緩衝液（PB,NaH2PO4−NaHPO
4,pH8）中に再懸濁させ、同じ緩衝液に対し、完全に透
析させてSASを除去した。
（SAS）を用いて超免疫血清から析出させてつくる。こ
の析出物を0.01Mのりん酸塩緩衝液（PB,NaH2PO4−NaHPO
4,pH8）中に再懸濁させ、同じ緩衝液に対し、完全に透
析させてSASを除去した。
超免疫血清50mlから得られたγ−グロブリンをPBで平
衡させたジエチルアミノエタノール（DEAE）セルロース
（pH＝８）のコラム（５×50cm）に吸収させた。このコ
ラムは最初に平衡緩衝液（PB,pH＝８）で処理し、IgGを
溶出させ、ついでこのPBに対し、NaClグラジエント（0.
03M）を添加し、IgG（Ｔ）を解離させる。この溶出液を
冷凍分留補集器を用いて5mlづつに集め、ベックマンDB
−GT分光光度計を用いて溶出ピークを連続的にモニター
し、二重波長360nmおよび380nmを得る。タンパク質濃度
はWarberg−Christian定数を用い判定し、Lowry法によ
り確認する。IgG（Ｔ）分を貯め、親液化し、受動免疫
化のための使用に供するため−40℃で貯ぞうした。炭水
化物で飽食させて、又はバクテリア内毒素の腹腔内注射
により実験的に腸炎を生じさせたウマに、複合ワクチン
で接種した他のウマから得た超免疫血清を投与したとこ
ろ急速な改善が得られた。同じようにしてワクチン接種
されたウマから得た超免疫血清で免疫することによりマ
ウスもバクテリア内毒素の静脈注射による死亡を回避す
ることができる。
衡させたジエチルアミノエタノール（DEAE）セルロース
（pH＝８）のコラム（５×50cm）に吸収させた。このコ
ラムは最初に平衡緩衝液（PB,pH＝８）で処理し、IgGを
溶出させ、ついでこのPBに対し、NaClグラジエント（0.
03M）を添加し、IgG（Ｔ）を解離させる。この溶出液を
冷凍分留補集器を用いて5mlづつに集め、ベックマンDB
−GT分光光度計を用いて溶出ピークを連続的にモニター
し、二重波長360nmおよび380nmを得る。タンパク質濃度
はWarberg−Christian定数を用い判定し、Lowry法によ
り確認する。IgG（Ｔ）分を貯め、親液化し、受動免疫
化のための使用に供するため−40℃で貯ぞうした。炭水
化物で飽食させて、又はバクテリア内毒素の腹腔内注射
により実験的に腸炎を生じさせたウマに、複合ワクチン
で接種した他のウマから得た超免疫血清を投与したとこ
ろ急速な改善が得られた。同じようにしてワクチン接種
されたウマから得た超免疫血清で免疫することによりマ
ウスもバクテリア内毒素の静脈注射による死亡を回避す
ることができる。
健康な成熟マウス（20gm,CF−１）に腹腔を介してウ
マ超免疫全血清の100％、10％、0.1％溶液1mlを４日間
連続して接種した。これらの動物について、呼吸困難、
硬直、鼻および尾環流、眼のはれ、外被組織、死亡につ
いて４日間、12時間間隔で観察した。その結果、IP血清
注射による悪影響は全く見られなかった。
マ超免疫全血清の100％、10％、0.1％溶液1mlを４日間
連続して接種した。これらの動物について、呼吸困難、
硬直、鼻および尾環流、眼のはれ、外被組織、死亡につ
いて４日間、12時間間隔で観察した。その結果、IP血清
注射による悪影響は全く見られなかった。
健康な成熟ポニーに超免疫血清700mlに乳酸加リンゲ
ン液1000mlを添加したものを静脈点滴により90分間投与
した。この動物を体温、心脈、末梢環流および不安又は
ストレスに関して6.5分間、10〜15分間隔でモニターし
たところ、不安、ストレスの徴候は全くなく、体温、心
脈が問題にならない程度の微上昇（100.4゜F→101.3゜
F;50→56ビート／分）が上記点滴開始の60〜90分後に見
られた。
ン液1000mlを添加したものを静脈点滴により90分間投与
した。この動物を体温、心脈、末梢環流および不安又は
ストレスに関して6.5分間、10〜15分間隔でモニターし
たところ、不安、ストレスの徴候は全くなく、体温、心
脈が問題にならない程度の微上昇（100.4゜F→101.3゜
F;50→56ビート／分）が上記点滴開始の60〜90分後に見
られた。
900ポンドのウマで敗血病性ショックによる合併症を
有するものに、乳酸加リンゲン液に超免疫血清を溶かし
たもの1200mlを10時間に亘り腹腔投与により接種した。
この動物は毒性による徴候を示さず、著るしい改善を示
した。
有するものに、乳酸加リンゲン液に超免疫血清を溶かし
たもの1200mlを10時間に亘り腹腔投与により接種した。
この動物は毒性による徴候を示さず、著るしい改善を示
した。
筋肉内接種の安全性を確かめるため、健康な成熟ポニ
ーに超免疫血清を筋肉を介して0,10,20,および40ml投与
した。この接種後1,2,4,8,12および24時間後の時点につ
いて、（１）放尿；（２）下痢；（３）硬直；（４）末
梢環流；（５）体温；（６）呼吸；（７）心脈；（８）
白血球症（又は減少症）；（９）赤血球症（又は減少
症）をモニターした。その結果、悪影響は全く見られ
ず、一頭の40mlの投与を受けたポニーの首に分散した小
結節が見られたが、これは４時間以内に消えた。
ーに超免疫血清を筋肉を介して0,10,20,および40ml投与
した。この接種後1,2,4,8,12および24時間後の時点につ
いて、（１）放尿；（２）下痢；（３）硬直；（４）末
梢環流；（５）体温；（６）呼吸；（７）心脈；（８）
白血球症（又は減少症）；（９）赤血球症（又は減少
症）をモニターした。その結果、悪影響は全く見られ
ず、一頭の40mlの投与を受けたポニーの首に分散した小
結節が見られたが、これは４時間以内に消えた。
保護抗体を含むγ−グロブリンを超免疫血清から抽出
し、タンパク質１ミリグラム単位で保護能を評価した。
前免疫および超免疫血清であって、ワクチンで超免疫し
たウマから採取したものを、内毒素で静脈投与する前に
２日間連続で種々の濃度のγ−グロブリンをCF−１マウ
スに接種して比較した。第2,3図に示すデータは受動免
疫マウスモデルを用い、２頭の別々のウマ（＃23,＃2
4）からの前免疫および超免疫グロブリンを比較したも
のである。超免疫グロブリンは超免疫化後、２度（＃23
A,＃23B）、ウマ＃23からつくられたものである。＃23
前免疫又は超免疫（＃23Aおよび＃23B）グロブリン50μ
ｇ以上を以って受動的に免疫されたマウスの内毒素投与
96時間後の生存率の比較によれば、超免疫グロブリンを
受けたマウスは生存率が少なくとも20（＃23Bの場合）
ないし50％（＃23Aの場合）上昇していることが示唆さ
れている（第２図）。さらに＃24前免疫を＃24超免疫と
比較した場合、その程度が若干落るがほぼ同等の効能が
あることが明らかであろう（第３図参照）。この結果か
ら超免疫血清は致命的内毒素からマウスを保護し得る抗
体を含むことが確認された。
し、タンパク質１ミリグラム単位で保護能を評価した。
前免疫および超免疫血清であって、ワクチンで超免疫し
たウマから採取したものを、内毒素で静脈投与する前に
２日間連続で種々の濃度のγ−グロブリンをCF−１マウ
スに接種して比較した。第2,3図に示すデータは受動免
疫マウスモデルを用い、２頭の別々のウマ（＃23,＃2
4）からの前免疫および超免疫グロブリンを比較したも
のである。超免疫グロブリンは超免疫化後、２度（＃23
A,＃23B）、ウマ＃23からつくられたものである。＃23
前免疫又は超免疫（＃23Aおよび＃23B）グロブリン50μ
ｇ以上を以って受動的に免疫されたマウスの内毒素投与
96時間後の生存率の比較によれば、超免疫グロブリンを
受けたマウスは生存率が少なくとも20（＃23Bの場合）
ないし50％（＃23Aの場合）上昇していることが示唆さ
れている（第２図）。さらに＃24前免疫を＃24超免疫と
比較した場合、その程度が若干落るがほぼ同等の効能が
あることが明らかであろう（第３図参照）。この結果か
ら超免疫血清は致命的内毒素からマウスを保護し得る抗
体を含むことが確認された。
超免疫γ−グロブリンの効能をウマおよびポニーを用
い、これに抗体タンパクを5,15又は20mg（体重1kg当
り）を静脈内接種したのち、内毒素又は炭水化物飽食に
より抗原投与しておこなった。すべての動物に＃23Aお
よび＃23Bの超免疫γ−グロブリン混合物が与えられ
た。この２種類の製剤の組合せは公知の抗体タンパクの
適当量を確認するために必要とした。予防効果は致死量
以下の内毒素投与又は炭水化物飽食動物における直後の
生活性の顕著な遅延又は回復、Obel度２疾患又はそれ以
下の発生として規定した。
い、これに抗体タンパクを5,15又は20mg（体重1kg当
り）を静脈内接種したのち、内毒素又は炭水化物飽食に
より抗原投与しておこなった。すべての動物に＃23Aお
よび＃23Bの超免疫γ−グロブリン混合物が与えられ
た。この２種類の製剤の組合せは公知の抗体タンパクの
適当量を確認するために必要とした。予防効果は致死量
以下の内毒素投与又は炭水化物飽食動物における直後の
生活性の顕著な遅延又は回復、Obel度２疾患又はそれ以
下の発生として規定した。
第１図ないし第３図は本発明のワクチンの効能を比較例
と比較して示す線図である。
と比較して示す線図である。
Claims (12)
- 【請求項１】動物をグラム陰性菌疾患に対して免疫する
ための、広いスペクトルを有するワクチンであって、 ａ）細菌ワクチンとしての、分類学上腸内細菌科に属す
る菌に由来する、Ｏ−炭水化物側鎖を含まない内毒素を
産生する細菌突然変異体の死菌懸濁液、 ｂ）活性化機能状態において、Ｂリンパ球について抗体
始原細胞の急速な増殖およびそれらの早期の発現を引き
起こし、それにより、宿主の循環系において、無傷の内
毒素および細菌に対する保護的な中和抗体の産生を高め
る、特異的な傾向を有する解毒リポ多糖内毒素免疫モジ
ュレータ、並びに、 ｃ）高い親油性および高いタンパク質親和性を有し、均
一な成分の懸濁および長期にわたる抗原の放出を確実に
する、タンパク質および脂質結合担体、 を含有するワクチン。 - 【請求項２】前記細菌突然変異体が、腸炎菌の、Ｏ−炭
水化物側鎖を含まない内毒素を産生する細菌突然変異体
の死菌懸濁液を包含する特許請求の範囲第１項記載のワ
クチン。 - 【請求項３】前記細菌突然変異体がATCC番号53000であ
る特許請求範囲第１項記載のワクチン。 - 【請求項４】前記死菌懸濁液が少なくとも1X107個の細
菌を含む特許請求の範囲第１項記載のワクチン。 - 【請求項５】前記死菌懸濁液が少なくとも1X1010個の細
菌を含む特許請求の範囲第１項記載のワクチン。 - 【請求項６】前記免疫モジュレータが少なくとも100μ
ｇ含まれる特許請求の範囲第１項記載のワクチン。 - 【請求項７】前記タンパク質および脂質結合担体が、脂
肪酸、油ベースのアジュバントおよびアルミニウムベー
スのアジュバントからなる群より選ばれる特許請求の範
囲第１項記載のワクチン。 - 【請求項８】前記タンパク質および脂質結合単体が、タ
ンパク質および脂質アジュバンとであるジアルミニウム
トリオキシドをさらに1.5容量％含有する特許請求の範
囲第１項記載のワクチン。 - 【請求項９】前記タンパク質および脂質結合単体が、前
記細菌突然変異体中に存在するタンパク質1.5mg当り、
少なくとも1mg含まれる特許請求の範囲第１項記載のワ
クチン。 - 【請求項１０】グラム陰性菌疾患に対して免疫するため
のワクチンの製造方法であって、 （ａ）細菌ワクチンとして糖を欠いた、分類学上腸内細
菌科に属する菌に由来する、Ｏ−炭水化物側鎖を含まな
い内毒素を産生する細菌突然変異体の死菌懸濁液と解脱
リボ多糖免疫モジュレータとをあわせる工程、および
（ｂ）細菌突然変異体と免疫モジュレータとの組み合わ
せをタンパク質および脂質結合担体中に懸濁する工程を
具備する方法。 - 【請求項１１】前記細菌突然変異体が、（ａ）無菌の富
化ブロスに、腸炎菌のような分類学上腸内細菌科に属す
る菌から選ばれた継代培養細菌突然変異体を接種し、
（ｂ）該ブロスを、最大の細菌塊を得るために37℃でイ
ンキュベーションし、（ｃ）該細菌をメチルオレートの
ような殺菌剤で死滅させ、（ｄ）該細菌を、このましく
は無菌の、非発熱性生理食塩水で洗浄し、および（ｅ）
該細菌を予め選択された濃度に再構築することを包含す
る方法で調製される特許請求の範囲第10項記載の方法。 - 【請求項１２】前記免疫モジュレータが、（ａ）グラム
陰性菌内毒素を濃度2:1のピリジン−ギ酸溶液に混合
し、（ｂ）該混合物を全還流蒸留によりメチル化し、
（ｃ）該メチル化内毒素混合物をアルコールで沈殿さ
せ、（ｄ）アルコールとメチル化内毒素混合物を遠心
し、および（ｅ）沈殿物を蒸留水と混合させ予め選択さ
れた内毒素濃度とすることを包含する方法で調製される
特許請求の範囲第10項記載の方法。
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| US4789544A (en) * | 1986-05-23 | 1988-12-06 | Midcon Labs. Inc. | Co-vaccination using non-O-carbohydrate side-chain gram-negative bacteria preparation |
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| WO2015192216A1 (en) | 2014-06-20 | 2015-12-23 | University Of Saskatchewan | Exotoxin/thermolysin compositions and methods and uses for treating or preventing laminitis |
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| ES8802118A1 (es) | 1988-04-01 |
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