KR20090064931A

KR20090064931A - 헬리코박터 파일로리로부터 유래된 항원을 이용하여헬리코박터 파일로리 특이 항체 생산을 위한 백신을제조하는 방법

Info

Publication number: KR20090064931A
Application number: KR1020070132316A
Authority: KR
Inventors: 배만종; 박창호
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2007-12-17
Filing date: 2007-12-17
Publication date: 2009-06-22
Also published as: KR100982489B1

Abstract

본 발명은 헬리코박터 파일로리로부터 유래된 항원을 이용하여 H. pylori 특이 항체 생산을 위한 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은,

H. pylori 균주로부터 분리된 Whole cell, OMP 및 Urease로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 항원으로 하여 H. pylori 특이 항체 생산을 위한 백신을 제조하는 것을 특징으로 한다.

이때, H, pylori로부터 분리된 항원의 면역독성을 고려하여 아나필락시스 쇼크반응, 이종 수동 피부 아나필락시스 반응시험 및 피부감작 시험에서 모두 음성반응을 나타내는 Urease를 항원으로 하는 것을 특징으로 한다.

또한 위에서, 면역증진물질(adjuvant)로서 FCA, TMG 또는 MPL을 사용하는 것을 특징으로 한다.

특히, 부종 생성을 고려하여 체내 대사 가능한 oil로 구성된 TMG 또는 MPL을 면역증진물질로 사용하는 것을 특징으로 한다.

마지막으로 본 발명은 H. pylori 균주로부터 분리된 Urease를 항원으로 하되 항원농도를 20μg/100μL로 하고, 면역증진물질로서 TMG 또는 MPL을 사용하여 H. pylori 특이 항체 생산을 위한 백신을 제조하는 것을 특징으로 한다.

헬리코박터 파일로리, 백신, Whole cell, OMP, Urease, FCA, TMG, MPL

Description

헬리코박터 파일로리로부터 유래된 항원을 이용하여 헬리코박터 파일로리 특이 항체 생산을 위한 백신을 제조하는 방법{The manufacturing method of H. pylori vaccine using antigen originated H. pylori}

사람은 이물질의 침입을 받았을 때, 이물질을 자기의 신체 성분과 식별하여 제거함으로써 자신의 신체를 보호하는 방어기전을 갖고 있다. 척추동물의 특이한 방어기구는 체액성 면역반응과 세포성 면역반응으로 나뉜다. 체액성 면역은 이물질에 대항하는 항체를 생산하여 면역기능을 나타내는 면역반응이고 세포성면역은 바이러스의 파괴, 피부염증과 같은 지연성과민반응, 또는 암세포나 이식조직에 대한 거부반응 등에 관여하는 면역반응이다.

근래 들어 면역시스템 기법이나 항원항체 반응을 이용한 특이항체의 생산 및 그 활용도가 점점 증대되고 있다. 수동면역 소재로서의 항체는 선천적 또는 후천적 면역결핍증을 앓고 있는 신생아나 어린이처럼 면역기능이 떨어져 항체를 생산할 수 없는 이들에게 소화관 감염에 대한 보호기능이 있고, 또한 약물, 영양결핍, 노화에 의해 면역기능이 떨어진 성인이나 어린이에게도 활용할 수 있다. Rotavirus는 신생아에게 장염을 일으키는 주요감염원이며, 이들에 대한 특이항체의 경구투여는 Rotavirus에 의한 설사병에 유용한 약물이 될 수 있다는 보고도 있다.

Helicobacter pylori(H. pylori)는 우측나선형 몸통과 4~8개의 유초성 편모(flagella)를 가진 그람 음성 단간균으로서 위 점막세포 사이사이에서 urease를 분비하면서 서식하고 있다. 1983년 오스트레일리아의 Marshall과 Warren에 의해 최초로 활동성 위염환자에서 분리 동정된 이후 위염, 위궤양, 십이지장 궤양, 위 림프종 및 위암을 일으키는 것으로 밝혀졌고, 1994년 IARC(International Agency for Research on Cancer)에서 H. pylori가 확실한 발암물질로 발표되었다. 이처럼 H. pylori 감염은 상부 위장관 질환의 중요한 원인 인자로 인식되고 있는데 선진국에서는 감염률이 낮은 반면 개발도상국이나 후진국에서는 높은 감염률을 보이고 지역적 또는 인종 간의 큰 차이를 보여 경제 수준이나 위생 및 환경 상태에 의하여 좌우되는 것으로 알려져 있다. H. pylori의 감염률은 전 세계적으로 상당히 높아 미국에서는 30~40% 이상 감염되어 있으며 개발도상국가나, 신흥공업국의 경우 성인의 80~90% 이상이 감염된 것으로 추정되고 있다. 국내에서 H. pylori 감염률은 2002년 대한 소화기학회 보고에 의하면 소아에서는 17.2%, 16세 이상 성인에서는 66.9%로 밝혀졌다. 또한 만성활동 위염환자에서는 70~92%의 감염률을 보이고 있고, 소화성궤양, 위암의 원인에도 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다.

H. pylori가 비침습성 세균임에도 불구하고 위 점막에 염증반응을 일으키는 직접적 기전은 H. pylori에서 분비되는 여러 세포독성인자가 위 상피세포에 손상을 주는 것과 urease에 의하여 생성된 암모니아가 위 점막 손상을 일으키는 것, H. pylori로부터 호중구를 끌어들일 수 있는 화학구성 인자가 점막 내로 흡수되어 혈액 내 호중구의 점막침윤을 유도하는 것 등이다. 간접적 기전으로는 위 상피세포에서 IL-8등의 케모킨(chemokine)의 분비가 증가되어 염증세포가 침윤하는 경우도 있다. 한편 H. pylori의 병원성에 대한 연구가 진행됨에 따라 균주의 다양성이 밝혀지고 있으며, 현재 CagA(cytotoxin-associated protein, 110~128kDa protein) 및 VacA(vacuolating cytotoxin, 87kDa protein)는 일부 균주에서만 발현되지만 H. pylori에 의한 임상적 질환에 관여하는 병리인자로 보고되고 있다.

H. pylori 제균치료에 있어 많은 약제가 단독 혹은 이제 및 삼제 병합요법으로 투여 되어왔지만 약제의 효과 및 부작용, 환자의 순응도, 경제적인 측면, 재감염 등이 문제시되어 왔다. 따라서 이러한 항생제의 문제점을 보완하기 위해 H. pylori 제균 치료법에 대한 새로운 연구가 계속되고 있으며, 최근에는 백신의 구성, 항원제조, 좋은 아쥬반트(Adjuvant), 투여방법의 개발 등 면역학적 안전성 문제를 보완한다면 백신으로써의 개발가능성이 있는 것으로 보고되고 있다. 그리고 질병에 관련된 사망률과 의약치료 등 사회적비용을 생각하면 백신개발이 경제적 비용절감을 나타내는 것으로 보고되고 있다.

백신은 감염물질 및 독소 또는 이들에 의해 생성되는 항원에 대한 특별한 활성 면역을 유도할 수 있는 항원물질을 함유한 것을 의미한다. 백신에는 화학적 또 는 물리학적 수단으로 불활성화 시켜 적절한 면역원성을 갖도록 하는 사백신과 자연적으로 병원성이 없거나(avirulent) 적절한 면역원성을 유지하면서 병원성을 약화시킨 생백신 그리고 생물로부터 추출되거나, 분비되는 항원 및 유전자재조합 기술로 만들어지는 항원 등이 있다. 항원은 자연상태 또는 화학적, 물리적 수단을 이용하여 무독화 시켜서 사용할 수 있으며, 면역원성을 높이기 위하여 집합, 중합, 또는 운반체(carrier)에 결합될 수 있다.

항원성 시험은 원칙적으로 모든 의약품에 대해서 실시해야 하며 특히 화학구조상 생체 내에서 단백질과 강하게 결합할 가능성이 있는 의약품, 펩타이드 또는 단백질을 성분으로 하는 의약품 및 고분자 구조를 가진 의약품의 경우 반드시 실시해야 한다. 또한 제제가 유효성분 외에 새로운 첨가 성분(부형제, 안정화제 등)을 함유한 경우에는 이들 첨가제에 대해서도 항원성 시험을 실시할 필요가 있다.

항원성의 평가방법으로는 기니피그(guinea pig)를 이용한 아나필락시스(anaphylaxis) 쇼크 반응시험 및 동종 수동 피부 아나필락시스(anaphylaxis) 반응시험 또는 mouse-rat 이종 수동 피부 아나필락시스(anaphylaxis) 반응시험이 권장되고 있다.

한편 최종 백신 제품에는 하나 이상의 아쥬반트(면역증진물질)가 존재한다. 지난 수십 년간 아쥬반트(Adjuvant)는 백신 항원에 대한 면역 반응을 향상시킬 목적으로 사용되어 졌다. 아쥬반트(Adjuvant)의 사용목적은 백신 제형에 아쥬반트(Adjuvant)를 조합함으로써 백신 항원에 대한 특이적 면역반응을 증대, 촉진 및 연장하려는 데 있다. 아쥬반트(Adjuvant)는 면역원성이 약한 항원의 면역성을 증대 시키고, 성공적인 면역획득에 필요한 항원량을 줄이고, 면역획득에 필요한 추가 접종 빈도를 줄여준다. 또한 노인 및 면역력이 약화된 백신접종자의 면역반응을 증가시키는 장점을 가지고 있으며, 선택적으로 면역글로불린과 관련한 면역반응을 일으키고 세포독성 또는 보조 T 림프구의 반응을 유도하기 위해 이용하기도 한다. 어떤 아쥬반트(Adjuvant)는 점막 면에서 항체 반응을 촉진하는 데 이용하기도 한다.

따라서 축산물을 이용하여 생산된 특이항체는 세균성감염에 의한 설사병 치료와 충치예방에 효과가 있고, 특히 계란을 이용한 IgY는 비교적 산과 열에 안정하다는 실험결과가 보고되어 있다. 식품분야에 특이항체를 식품소재로 산업화에 활용한 빈도는 아직 미미한 상태에 있다. 그 이유는 경제적 적용성과 기술적 측면에서 만족을 충족시키지 못한 것으로 판단되나 최근에 면역학, 단백질공학, 생명공학 등의 발전과 기술 향상으로 식품 소제로써의 활용성이 점차 높아질 것으로 기대되고 있다.

또한 H. pylori 제균 치료에 항생제가 아닌 식물, 포도주 및 마늘 등의 비항생제성 물질에 대한 항균효과 연구가 진행되고 있다. 이러한 관점에서의 H. pylori에 대한 면역항체가 포함된 계란을 개발하여 H. pylori 제균 치료에 대한 효과는 이미 밝혀진 바 있으며, 젖소에 적용된 면역우유 생산에 관한 연구도 보고되어 있다.

본 발명에서는 H. pylori의 감염을 예방하기 위한수단으로 동물을 통한 피동면역용 항체생산과 더불어 면역기법에 응용할 동물용 백신개발의 기초자료를 확인하고자 하였다. 그 방법으로 H. pylori 균으로부터 항원을 분리하고, 분리된 항원으로부터의 항체생산 및 H. pylori 균에 대한 응집활성을 알아보았다. 다음으로 백신을 반복 투여했을 때 야기될 수 있는 알레르기 및 과민반응을 예측하고, 페니실린 쇼크와 같은 심각한 부작용 및 독성유발 가능성을 검색하기 위하여 백신의 면역독성을 평가하였다. 또한 항원이 우수한 면역원이 되기 위해서는 아쥬반트(Adjuvant)의 적합성 및 안전성이 평가되어야 하는데 이 아쥬반트(Adjuvant)의 잠재적인 위험성과 항체생산성에 대해서도 연구하였다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은,

본 발명의 발명자들의 연구에 따르면, H. pylori의 감염을 예방하기 위한 수단으로서 H. pylori 균으로부터 유래된 항원을 이용함으로써 우수한 면역기능이 실증적으로 확인된 백신을 획득할 수 있으며, 나아가 백신을 반복 투여했을 때 야기될 수 있는 부작용을 사전에 예측하여 필요에 따라 선택하여 사용할 수 있고, 또한 항원이 우수한 면역원이 되는 데 필요한 아쥬반트(Adjuvant)를 사용할 수 있다.

이하, 본 발명과 관련된 실시예를 상세히 설명한다.

Ⅰ. 실험 재료 및 방법

1. 실험 재료 및 시약

본 실험에 사용한 Helicobacter pylori는 한국유전자은행에서 KCTC 12083을 분양받아 계대 배양하여 사용하였다. 배지에 사용된 항생제는 Helicobacter pylori selective supplement(Oxoid, SR0147E), 그람염색에 사용된 시약은 crystal violet(Becton Dickinosn, USA), carbol fuchsin(Becton Dickinosn, USA)을 구입하였다.

H. pylori의 OMP(outer membrane protein) 분리에는 sodium laurylsarcosine(Sigma L9150), LPS분리는 LPS extraction kit (Intron biotechnology, Korea), 분리된 항원의 농도측정은 단백질정량 Kit(Sigma 690-A), 분자량 측정 maker는 SeeBlue^® Plus2 Pre-stained standard(Invitrogen, LC5925) 구입하여 사용하였다.

항체 생산에 이용된 아쥬반트(Adjuvant)는 Freund's complete adjuvant(FCA, Sigma F-5506), Freund's incomplete adjuvant(FIA, Sigma F-5881), MPL^®+TDM adjuvant(Sigma M 6536), Titermax gold adjuvant(Sigma T 2684)를 사용하였으며, 항체분석을 위하여 2차 항체는 anti-mouse IgG(whole molecule) alkaline phosphatase conjugate(Sigma A2418)와 anti-mouse IgA(whole molecule) alkaline phosphatase conjugate(Sigma A4937)를 이용하였고, 항체함량 측정을 위한 표준품으로 mouse IgG(Sigma I5381)를 사용하였다. 발색 기질용액은 10% diethanolamine buffer, 1% phosphatase substrate(Sigma N2765)를 이용하였고, western blotting에 사용된 시약은 NC membrane(Nitrocellulose, Gelman Sciences co.)과 Lumi-Phos WB(PIERCE 34150, USA) substrate를 사용하였다. 기타 연구에 사용된 용매 및 시약은 특급으로 사용하였다.

2. 실험방법

2.1. H. pylori 균주의 배양 및 항원 분리

2.1.1. H. pylori 균주 배양

H. pylori 균주는 한국유전자은행으로부터 분양받아 사용하였다. 분양받은 균주는 37℃, CO₂ 농도 10% 환경에서 5% FBS(fetal bovine serum)과 항생제(Helicobacter pylori selective supplement)가 포함된 Brucella agar plate에서 2~3일 간격으로 계대배양 하였다. 계대배양으로 활성화된 균주는 Brucella broth에서 48~72시간 동안 액체배양하였다.

2.1.2. 균주확인

2.1.2.1. 그람염색( Gram stain )

그람 염색법(Gram staining method)은 4단계 순서로 진행되는데 우선 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 1분간 염색한 후 그람 이오딘(gram iodine)으로 1분간 염색한다. 에탄올에 1분간 세척한 후 카볼 푹신(carbol fuchsin)으로 10분간 염색한다. 모든 과정이 끝난 후 건조하여 광학 현미경(×1,000)으로 형태(morphology)를 관찰하여 균주 및 오염상태를 확인하였다.

2.1.2.2. Urease 활성검사

Urea broth(pH 6.8, Yeast extract 0.1mg/mL, monopotassium phosphate 9.1mg/mL, dipotassium phosphate 9.5mg/mL, urea 20mg/mL, phenol red 0.01mg/mL)를 1mL씩 Eppendorf-tube에 분주하여 냉장 보관하였고, 튜브에 H. pylori를 접종시켜 색이 붉게 변화는 것으로 균주를 확인하였다.

2.2. 항원분리

2.2.1. Whole cell

Whole cell(WC) 항원은 Fig. 1과 같이 먼저 액체 배양된 균주를 4℃, 4,000×g로 30분간 원심분리 하여 회수한다. 회수된 균주는 10mM Tris HCl(pH 8.5) - 2mM EDTA로 4℃, 4,000×g로 30분간 원심분리 하여 1회 세척 후 멸균된 증류수에 현탁시킨다. 세척된 균은 얼음물에서 30초간 4회 초음파처리(sonicate, pulse 20, duty cycle 50)한 다음 시린지 필터(syringe filter, 0.45μm)로 여과하였다. 여과 된 whole cell의 농도는 Lowry법을 이용한 단백질정량 키트(kit)로 측정하여 사용 전까지 -70℃에 냉동 보관하였다.

2.2.2. OMP ( outer membrane protein ) 분리

액체 배양된 균주를 10mM Tris HCl(pH 8.5) - 2mM EDTA로 4℃, 4,000×g로 30분간 원심분리로 1회 세척한 후 차가운 증류수에 현탁하였다. 강하게 vortex(2,500rpm, 1min)한 후 원심분리(25,000×g, 15min, 4℃)된 침전물을 얼음물에서 30초간 4회 sonicate(pulse 20, duty cycle 50)한다. 파쇄된 균은 4℃, 10,000×g로 10분 동안 원심분리 한 다음 상층액을 4℃, 100,000×g로 1시간동안 원심분리한다. 침전물을 1%(w/v) sodium laurylsarcosine이 함유된 10mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)로 현탁시킨 후 4℃, 10,000×g로 10분 동안 원심분리하는 과정을 1회 반복한다. 최종 침전물은 10mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)로 현탁시키고 syringe filter(0.45 μm)로 여과한다. 여과된 OMP항원은 SDS-PAGE(12%)로 분자량을 확인하였고, 농도는 Lowry법을 이용한 단백질정량 kit로 정량하여 사용 전까지 -70℃에 냉동 보관하였다.

2.2.3. Crude urease 분리

액체 배양된 균주를 10mM Tris HCl(pH 8.5) - 2mM EDTA로 4℃, 4,000×g로 30분간 원심분리로 1회 세척한 후 차가운 증류수에 현탁하였다. 강하게 vortex(2,500 rpm, 1 min)한 후 원심분리(25,000×g, 15 min, 4℃)된 상층액을 crude urease항원으로 사용하였다. 분리된 crude urease는 SDS-PAGE(12%)로 분자량을 확인하였고, 항원 농도는 Lowry법을 이용한 단백질정량 kit로 정량하여 사용 전 까지 -70℃에 냉동보관 하였다^.

2.2.4. LPS ( Lipopolysaccharide ) 분리

LPS는 그람음성 균의 외막에 존재하는 성분이다. 일반적인 추출법으로는 오랜 시간이 걸리고 복잡한 방법의 hot phenol-water extraction법이 이용되고 있다. 본 실험에서는 H. pylori 균의 LPS 추출을 위하여 LPS extraction kit를 이용하였다. 분리된 LPS는 SDS-PAGE(12%) 은염색법으로 분자량을 확인하였다.

Fig. 1. whole cell의 준비(Scheme of whole cell preparation)

Fig. 2. OMP의 준비(Preparation of outer membrane protein antigen)

Fig. 3. Crude urease의 준비(Preparation of crude urease)

2.2.5. SDS - PAGE

H. pylori 균으로부터 분리된 항원의 분자량은 SDS-PAGE(sodium dodesyl sulfate - Polyacrylamide gel electrophoresis)로 측정하였다. 0.5M Tris-HCl과 10% SDS, 30% acrylamide를 함유한 4.0%(v/v) 농축겔(stacking gel)을 사용하고, 분리겔(separating gel)은 1.5 M Tris-HCl과 10% SDS, 30% acrylamide을 함유한 12%(v/v) 겔을 사용하였다. 분리된 항원단백질은 50μg/μL(DW)를 sample buffer로 1:4 비율로 희석하여 각 well에 20μL씩 loading하였다. Marker는 SeeBlue^® Plus2 Pre-stained standard를 5μL씩 loading하였다. 전기영동 후 은염색법으로 단백질 band를 확인하였다.

2.3. 항체생산

2.3.1. 실험동물

실험동물은 효창사이언스(주)(대구, 한국)에서 BABL/c 수컷 6주령 18-20g을 구입하여 1주간 순화시킨 후 실험에 사용하였으며, 5마리씩 배치하여 사육하였다. 사육실은 실험동물 환경조건인 온도 22±3℃, 상대습도 55±5%, 환기횟수 10~12회/hr, 명암주기 12시간으로 유지하였다. 순화시기 및 시험기간 중 실험동물은 고형사료(퓨리나코리아(주))와 음수를 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.

2.3.2. 면역

시험동물은 각 군당 5마리씩 나누어 Table 1과 같이 나누어 면역하였고, 면역횟수는 2주 간격으로 총 3회 실시하였다. 1차 면역은 각 항원 단백질(20μg/100ul)을 Freund's complete adjuvant 100μL와 1:1 비율로 emulsion하여 등 쪽 피하에 200μL씩 투여하였다. 2, 3차 면역은 1차 면역 후 2주 간격으로 각 단백질 항원과 Freund's incomplete adjuvant를 동량 같은 방법으로 투여하였다.

2.3.3. 항체역가 및 항원성 측정

2.3.3.1. 항혈청 분리

최종면역 후 1주 지난 mouse를 CO₂ 가스로 마취하여 채혈한 혈액을 실온에서 3시간 응고시킨 다음 원심분리 하여 항혈청을 얻었다. 분리된 항혈청은 -70℃에 보관 후 항체역가 분석에 이용하였다.

Table 1. 그룹당 실험동물의 수와 처치(Experimental design and number of mice per group)

2.3.3.2. ELISA

효소와 결합시킨 항체를 이용하여 항원과 항체를 정성 또는 정량하는 방법으로 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)을 이용하여 H. pylori균으로부터 분리된 각종 항원에 대한 mouse혈청의 항체활성을 측정하였다. Whole Cell 항원을 immunoglobulin 96 well plate에 단백질 농도 200μg/100μL씩 coating하고 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 항원 coating시 mouse IgG를 standard로 coating하였다. 각 well을 washing buffer(10 mM PBS pH 7.4, 0.5% Tween 20)로 3회 세척 후 blocking액(PBS pH 7.4, 5% skim milk)을 150μL넣고 실온에서 30분 이상 방치 후 washing buffer로 3회 세척하였다. 각 항원에 의해 생산된 혈청항체를 washing buffer에 단계별로 희석한 다음 각 well에 100μL씩 분주하고 실온에 2시간 방치 후 세척하였다. Alkaline phosphatase conjugated Anti-mouse IgG(whole molecule)와 alkaline phosphatase conjugated anti-mouse IgA(whole molecule)를 2차 항체로 각각 1:15,000과 1:30,000으로 희석하여 100μL씩 분주하고 실온에 1시간동안 방치하였다. 3회 세척 후 기질용액(10% diethanolamine buffer, 1% phosphatase substrate)을 100μL씩 넣은 후 30분 반응 후 3N-NaOH 50μL을 가하여 반응을 정지시켰다. 반응정지 후 ELISA reader로 405nm 파장에서 IgG와 IgA항체의 역가를 측정하였다.

2.3.3.3. Western blotting

H. pylori 항원에 의해 생성된 anti-H. pylori 항체가 항원에 특이적으로 반응하는지를 알아보기 위해 Western blotting을 실시하였다. H. pylori whole cell을 sonicator로 파쇄하여 원심분리(4,000rpm, 5min, 4℃)한 상등액을 sample buffer와 1:4 비율로 희석하여 각 well에 20μL씩 loading후 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝나면 Fig. 4와 같이 NC membrane에 transfer하여 western blotting하였다.

1차 항체(primary antibody)는 mouse 항혈청을 항원에 결합시키고, 2차 항체(secondary antibody)는 anti-mouse IgG(whole molecule) alkaline phosphatase conjugate를 1:40,000 비율로 희석하여 반응시켰다. Alkaline phosphatase 검출용 화학발광 기질인 Lumi-Phos WB substrate를 사용하여 3분 반응시켜 X-ray 필름상에 감광시켜 항원물질을 확인하였다.

Fig. 4. 웨스턴블로팅 과정(Process of western blotting).

3. 항체활성 측정

3.1. Anti - H. pylori 항체에 의한 H. pylori 균 응집반응

H. pylori를 PBS buffer(pH 7.4)에 현탁시켜 OD=1.0(405nm)으로 조절하여 well당 100μL씩 coating 후 2시간 동안 실온에 incubation하였다. Anti-H. pylori 항혈청(antiserum)을 생리식염수로 공비 2배로 10단계 희석하여 각 well당 100 μL씩 분주하고 2시간 동안 incubation 후 응집정도를 × 400배 광학현미경으로 관찰하였다.

3.2. Anti - H. pylori 항체에 의한 urease 활성억제 효과검색

H. pylori 각 항원에 의해 생성된 항혈청으로 H. pylori의 urease활성 억제능을 측정하였다. Urease 활성억제능은 H. pylori균 현탁액(OD=1.0(405nm), saline) 50μL에 2⁶배 희석된 각각의 항혈청 50μL와 2시간 동안 반응 후 urea broth(Yeast extract 0.1mg/mL, monopotassium phosphate 9.1mg/mL, dipotassium phosphate 9.5mg/mL, urea 20mg/mL, phenol red 0.01mg/mL) 100 μL가 들어있는 immunoglobulin 96 well plate에 놓고 30분 경과 후 urea의 분해에 따른 phenol red의 color intensity의 변화를 ELISA reader를 이용하여 550nm에서 측정하였다.

4. H. pylori 백신에 대한 면역독성 평가

4.1. 아나필락시스 ( anaphylaxis ) 쇼크반응

4.1.1. 실험동물

실험동물은 한림실험동물(주)(경기도 화성, 한국)에서 Hartley계 guinea pig 6주령(250~350 g, ♂)을 구입하여 1주일간 순화시킨 후 시험에 사용하였다. 사육실은 실험동물 환경조건인 온도 22±3℃, 상대습도 55±5%, 환기횟수 10~12회/hr, 명암주기 12시간으로 유지하였다. 순화시기 및 시험기간 중 실험동물은 고형사료(퓨리나코리아(주))와 비타민의 공급을 위해 양배추를 사료와 동시에 자유 급여하였고, 음수도 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.

4.1.2. 감작투여

감작투여는 항원성을 지니는가를 알아보기 위해 실시하는 아나필락시스(anaphylaxis) 쇼크반응시험, 수동 피부 아나필락시스(anaphylaxis) 반응시험 및 간접 적혈구 응집 반응시험을 실시할 때 시험동물의 면역계를 활성화시키기 위하여 사용하는 방법이다.

본 시험에서는 시험동물을 각 군당 5마리씩 나누어 Table 2와 같이 정상군, 대조군, 양성대조군, 시험물질 투여군으로 설정하였으며, 양성대조군 및 시험물질 투여군은 저용량군과 고용량군으로 나누어 감작시켰다. 감작항원량은 20μg/100μL의 농도로 아쥬반트(Adjuvant)와 동량으로 emulsion하여 등 쪽 피하투여 하였다. 감작횟수는 2주 간격으로 총 3회 실시하였다.

4.1.3. 시험물질 야기투여

최종감작투여 1주와 2주 후 시험물질(야기항원)을 귀정맥 내 투여하여 아나필락시스(anaphylaxis) 쇼크증상의 발현유무를 알아보았다. 감작에 이용한 용량은 투여용량 중 고용량을 적용하였다. 1차와 2차 야기항원 투여 후 30분간 전신의 증상을 관찰하고, 아나필락시스(anaphylaxis) 쇼크반응을 판정기준에 따라 판정하여 기록하였다.

4.1.4. 관찰자료의 해석 및 평가

아나필락시스(anaphylaxis)는 종합적으로 쇼크정도에 따라 음성[-]은 아무런 임상증상이 관찰되지 않을 때, 경증[±]은 불안(Restlessness), 기모(Piloerection), 진전(Tremor), 코를 문지르거나 핥음(Rubbing or licking nose)의 증상이 나타날 때, 중등도[＋]는 재채기(Sneezing), 기침(Coughing), 호흡촉진(Hyperpnea), 배뇨(Urination), 배변(Evacuation), 유루(Lacrimation)의 증상이 보일 때, 중증[＋＋]은 호흡곤란(Dyspnea), 찍찍거리는 소리(Rhonchus), 청색 증(Cyanosis), 보행불안(Staggering gait), 도약(Jumping), 헐떡거리고 몸부리침(Gasping and writhing), 경련(Convulsion), 횡와(Side position), Cheyne-Stokes 호흡의 증상이 나타날 때, 그리고 사망시(Death)[＋＋＋]로 판정하였다.

4.2. Guinea pig - rat 를 이용한 heterologous passive cutaneouse 아나필락시스( PCA ) 시험

4.2.1. Guinea pig 을 이용한 항혈청 생산

아나필락시스(anaphylaxis) 시험에서 감작시킨 guinea pig으로부터 최종감작 1주 후 채혈하고 실온에 3시간 응고시킨 후 원심분리하여(3,000×g, 10min) 혈청을 얻었다. 분리한 혈청은 다음 시험까지 -70℃에 보관하여 사용하였다.

4.2.2. 항혈청 감작투여

Sprague-Dawley(♂, 6주령, 250~350g) rat에 개체별로 분리된 혈청을 멸균 생리식염수로 공비 2배로 10단계 희석하였다. 군당 3마리씩 배부위에 일정한 간격으로 1회용 주사기(26 G, 1mL)로 100μL씩 피내주사 후 주사부위를 표시 하였다.

4.2.3. 시험물질 야기

피내투여 24시간 후, 야기항원과 Evan's blue 1:1 혼합액(5mg/1mL/body)을 꼬리정맥 내로 투여하였고, 30분 경과 후 CO₂ 가스로 마취시킨 후 경동맥 부위를 가위로 잘라 실혈 치사시켰다. 치사시킨 guinea pig을 배부위 피부를 절취하여 뒷면으로부터 청색반점(Blue spot)을 확인하였다.

4.2.4. 관찰자료의 해석 및 평가

주사부위에 출현한 청색반점의 생성여부를 관찰하여 청색반점의 직경((장경+단경)/2)이 5mm 이상이면 양성으로 간주하고, 양성을 나타내는 가장 마지막 혈청희석액의 희석배수를 최대희석배수로 하였으며, 그 혈청의 최종 항체역가로 정하여 아나필락시스(anaphylaxis)와 관련이 있는 IgE가 생성되는 것으로 판정하였다.

4.3. 피부감작성 시험

4.3.1. 실험동물

실험동물은 한림실험동물(주)(경기도 화성, 한국)에서 Hartley계 guinea pig 6주령(250~350 g, ♂)을 구입하여 1주일간 순화시킨 후 시험에 사용하였다. 사육실은 실험동물 환경조건인 온도 22±3℃, 상대습도 55±5%, 환기횟수 10-12회/hr, 명암주기 12시간으로 유지하였다. 순화시기 및 시험기간 중 실험동물은 고형사료(퓨리나코리아(주))와 비타민의 공급을 위해 양배추를 사료와 동시에 자유 급여하였고, 음수도 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.

4.3.2. 피내주사 시 감작 항원량

시험물질인 whole cell(WC)은 80μg/100μL, 40μg/100μL, 20μg/100μL, 10μg/100μL의 농도로 urease는 80μg/100μL, 40μg/100μL, 20μg/100μL의 농도별로 희석하여 제모된 guinea pig 등부위 피내에 100μL씩 주사한다. 피내주사 후 주사부위를 관찰하여 2마리 guinea pig 모두 다 피부괴사가 나타나지 않는 최고 농도를 감작항원량으로 정하였다.

5. 아쥬반트 ( Adjuvant ) 종류에 따른 항체생성

5.1. 항체생산

5.1.1. 항원농도

H. pylori 균주의 whole cell 항원은 앞에서 언급된 방법에 따라 제조하였으며, 제조된 항원단백질의 농도는 20μg/μL로 생리식염수로 조절하여 사용하였다.

5.1.2. 실험동물

실험동물은 효창사이언스(주)(대구, 한국)에서 BABL/c 수컷(♂) 6주령 18~20 g과 SD(Sprague-Dawley) rat 수컷 6주령 250~350 g을 구입하여 1주간 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 사육실은 실험동물 환경조건인 온도 22±3℃, 상대습도 55± 5%, 환기횟수 10~12회/hr, 명암주기 12시간으로 유지하였다. 순화시기 및 시험기간 중 실험동물은 고형사료(퓨리나코리아(주))와 음수를 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.

5.1.3. 면역

시험동물을 각 군당 5마리씩 나누어 Table 3과 같이 나누어 면역시켰으며 면역횟수는 2주 간격으로 총 2회 실시하였다. 1차 면역은 whole cell 항원 단백질과 각각의 아쥬반트(Adjuvant)를 1:1 비율로 emulsion하여 등 쪽 피하에 200 μL씩 투여하였다. Boost injection은 1차 면역 2주 후 항원용액(antigen solution) 100μL를 등쪽 피하부위에 Table 3과 같은 방법으로 면역시켰다. 채혈은 추가백신 2주후 희생하여 복부대동맥에서 채취하였다.

5.1.4. IgG , IgA 항체 역가측정

Whole Cell 항원을 immunoglobulin 96 well plate에 단백질 농도 200μg/100μL씩 coating하고 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 항원 coating시 mouse IgG를 standard로 coating하였다. 각 well을 washing buffer(10 mM PBS pH 7.4, 0.5% Tween 20)로 3회 세척 후 blocking액(PBS pH 7.4, 5% skim milk)을 150μL넣고 실온에서 30분 이상 방치 후 washing buffer로 3회 세척하였다. 각 항원에 의해 생산된 혈청항체를 washing buffer에 단계별로 희석한 다음 각 well에 100μL씩 분주하고 실온에 2시간 방치 후 세척하였다. Alkaline phosphatase conjugated anti- mouse IgG(whole molecule)와 alkaline phosphatase conjugated anti-mouse IgA를 2차 항체로 각각 1:15,000과 1:30,000 비율로 희석하여 100μL씩 분주하고 실온에 1시간 동안 방치하였다. 3회 세척 후 기질용액(10% diethanolamine buffer, 1% phosphatase substrate)을 100μL씩 넣은 후 30분 반응 후 3 N-NaOH 50 μL을 가하여 반응을 정지시켰다. 반응정지 후 ELISA reader로 405nm 파장에서 IgG와 IgA항체의 역가를 측정하였다.

5.2. 부종측정

백신투여 후 아쥬반트(Adjuvant)에 의한 부종생성 여부를 알아보기 위하여 각각의 아쥬반트(Adjuvant) 100μL를 rat 발바닥 피하에 투여하고, 일정간격으로 증가된 발의 두께((넓이+두께)/2)를 측정하여 부종정도를 나타내었다.

5.3. 직장온도 측정

백신투여로 인한 부작용 및 생리적 변화를 알아보기 위해 백신투여 0hr, 3hr, 6hr, 24hr 간격으로 직장온도를 측정하였다.

5.4. 체중측정

백신투여로 인한 생리적 변화를 알아보기 위하여 실험기간 동안 2주 간격으로 체중을 측정하여 일당증체량(mg/day)으로 표시하였다.

6. 통계학적 분석

본 실험에서 얻은 측정치에 대한 통계처리는 SPSS(SPSS 12.0KO for Windows)를 이용하여 평균치와 표주편차를 구하였고, 유의성검증은 Duncan's multiple range test를 이용하여 유의수준 p<0.05일 때 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

Ⅱ. 결과 및 고찰

1. H. pylori 균주의 항원분리 및 항체생산

1.1. H. pylori 균주확인

H. pylori는 배양 3~4일째까지는 가장 활발한 운동성을 보이는 간균이 많고 7일이 지나면서 운동성이 매우 떨어지고 균수가 현저히 떨어지기 때문에 본 실험에서도 3~4일째 균주를 이용하였다. H. pylori 균주 확인은 세포벽의 물리적 특성이 서로 다른 점을 이용하여 그람염색을 실시하였다. 이 세포벽은 일반적으로 진핵생물과는 달리 단단하며 원핵생물의 형태를 유지하는데 중요한 요소다. 이 세포벽의 구조에 따라 세균은 그람 음성과 그람 양성균으로 구별할 수 있다. 세포벽이 그람양성균에서는 그람음성 균에 비해 복잡하고 단단하게 결합된 구조로 되어있다. 이러한 차이에 따라 염색한 결과 Fig. 5에서와 같이 붉은색으로 염색되어 그람음성균임을 알 수 있었다. 또한 이 균은 urease 생성이 강하므로 urea를 강하게 가수분해하는 생화학적 성상에 따라 urease 활성을 검사하였다. 그 결과 30분 이내 urea broth가 노란색에서 붉은색으로 변화하는 것을 관찰하고 urease의 강한 활성을 확인할 수 있었다(Fig. 6).

<그람 염색(Gram stain)>

Fig. 5. 광학현미경에 의한 관찰(Light micrograph showing a gram negative stained of H. pylori. Magnification, ×1,000)

<우레아제 테스트(Urease test)>

Fig. 6. 우레아제 활성 테스트(The urease activity testes color were change from the yellow to the red.)

1.2. 항원준비( Antigen preparation )

1.2.1. Whole Cell

세균항원은 일반적으로 항혈청 제조와 분석을 위하여 일반적으로 두 가지 형태가 사용되어 왔다. 한 가지 형태는 정제된 항원과 세균세포(bacterial cell), 편모(flagellum) 또는 협막(capsule) 으로부터 분리된 것이 있고, 또 다른 형태는 일 반적으로 열, formalin, acetone 또는 alcohol로 사멸된 whole cell이 있다.

본 연구에서는 H. pylori 균을 처리하여 나타나는 균체 단백질의 종류를 알아보고 그중 면역원성(immunogen)을 나타내는 항원성 단백질을 알아보고자 하였다. H. pylori의 whole cell(WC) 단백질은 SDS-PAGE로 분자량을 측정한 결과 12종류의 주요단백질 band를 확인할 수 있었다(Fig. 7).

1.2.2. Crude OMP 분리

세균의 외막단백질(OMP, outer membrane protein)은 백신항원으로 많이 개발하여 사용되어 왔으며, H. pylori 균으로부터 분리된 외막단백질(OMP)은 분자량이 다른 7종류의 주요 단백질로 분리되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 7).

1.2.3. Crude Urease 분리

Urease는 짧은 chain의 urease A와 긴 chain의 urease B로 두 가지의 subunit 구조로 구성되어 있으며, 활성 urease효소를 생산하기 위해서는 적어도 5개의 추가 단백질을 더 필요로 하는 것으로 알려져 있다. 또한 면역학적 연구에서 urease에서 정제된 urease B는 높은 면역원(immunogenic)이 되는 것으로 보고되고 있다.

H. pylorir 균으로부터 분리정제된 urease에서도 분자량이 32kDa인 urease A와 62kDa인 urease B 두 가지 subunit로 나누어지는 것으로 보고되고 있으며, 본 실험방법에 의해 분리된 crude urease는 25, 36, 64kDa의 분자량을 갖는 3종류의 단백질 band를 확인할 수 있었다(Fig. 7).

1.2.4. LPS 분리

LPS(Lipopolysaccharide)는 그람음성균의 외막에 존재하는 성분으로서 체내에 들어오면 혈압을 저하시키며, 발열, 호중구 감소증, 혈액 응고, 쇼크 등의 endotoxin으로 작용할 수 있다. 또한 LPS에 의하여 대식세포가 IL-1과 TNF를 분비하거나, LPS가 보체의 대체경로를 활성화시키거나, B 임파구를 형질세포로 분화시키는 작용을 한다.

Pasteurella haemolytica에서 분리된 LPS는 20~24 kDa 정도에 위치하는 것으로 보고되고, 본 실험에서 H. pylori 균으로부터 분리된 LPS는 20kDa 부위에 한 종류의 band가 형성되는 것을 볼 수 있었다(Fig. 7).

Fig. 7. SDS-PAGE 결과(Sliver-stained gel after SDS-PAGE patterns of the several antigens which separated from the H. pylori .)

Lane 1, separated whole cell; Lane 2, separated OMP; Lane 3, separated crude urease; Lane 4, separated LPS; Lane M, makers.

1.3. 항체생성

1.3.1. IgG 항체생성

IgG는 감마(γ) 사슬을 가진 immunoglobulin으로 포유동물의 3/4를 차지하여 가장 많은 양을 차지한다. 항체의 작용 중에서 독성물질이나 바이러스에 결합하여 그것을 무해화하는 작용 및 백혈구의 식살균 작용의 보조기능을 하는 중화항체, 옵 소닌항체 대부분은 IgG에 속한다. H. pylori로부터 분리된 각 항원에 대한 IgG항체 함량을 측정한 결과 Fig. 8과 같이 나타났다. 항원의 종류에 따라 생성된 IgG항체 생성량은 WC(H) 113.5±0.4μg/mL, WC(L) 77.9±6.4μg/mL, OMP 84.9±6.4μg/mL, Urease 123.8±2.9μg/mL로 나타났으며, 동일 항원농도에서의 IgG항체 생성은 urease 항원이 123.8±2.9μg/mL으로 가장 많은 양을 생산하였다.

항원 투여농도가 60μg/100μL인 WC(H)와 20μg/100μL인 WC(L)에서의 IgG항체 생성량이 각각 113.5±0.4μg/mL, 77.9±6.4μg/mL로 나타났다. 따라서 같은 항원에서 3배의 농도인 WC(H)가 WC(L)에 비해 항체생성량에 있어서는 항원농도에 비례하여 생성되지 않는 것으로 나타났다. 이에 반하여 urease 항원은 동일한 농도의 다른 항원들보다 가장 많은 IgG항체를 생성하였고, 항원농도가 3배인 WC(H)항원의 항체생성량과 비교할 때 유의적인 차이는 없었으나 많은 항체를 생산하는 것으로 조사되었다.

따라서 각 항원에 대한 IgG항체 생성측면에서 urease 항원이 123.8±2.9μg/mL로 가장 많은 항체를 생산하는 것으로 볼 때 면역원성이 가장 큰 것으로 사료된다.

Fig. 8. H. pylori로부터 분리된 각 항원에 대한 IgG항체 함량을 측정한 결과(Changes of IgG levels in mice serum during the immunization period.)

1.3.2. IgA 항체생성

IgA 항체는 소화기관 혹은 장관, 호흡기, 생식관 등의 상피에서 분비되어 세균, 바이러스 및 기타 병원체의 부착을 방지하는데 큰 역할을 한다. IgA의 주합성 장소와 작용 부위는 신체의 점막이며, IgA를 분비하는 형질세포는 주로 상피의 기저막 아래에 있는 고유판(Lamina propria)이라 부르는 결체조직에 주로 분포하고 있다. IgG가 신체 내의 세포외 방어인 반면에 IgA의 주기능은 상피세포로 침입하는 감염원을 방어하는 것이다. IgA 항체는 세균 또는 독소가 상피세포에 부착하는 것을 방지하여 다양한 병원체에 대한 일차방어 작용을 나타낸다.

위염환자에서 위조직의 세균 감염으로 IgA가 코팅되며, 그 다음으로 위염이 활발해진 감염환자에서 IgG와 IgM이 코팅되는 것으로 보고되고 있다. 그러한 각각 의 항체반응으로 감염을 치료할 수는 없지만, H. pylori 분리된 Urease A 와 B로 면역된 mouse혈청이 면역되지 않은 mouse에 비해 10배 이상의 IgA 항체반응을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 또한 Salmonella vaccine에 의한 urease A와 B는 체액성과 점막성 면역반응을 유발하고, 동시에 H. pylori 감염에 대한 방어 효과도 있는 것으로 나타나있다.

따라서 본 실험에서는 H. pylori로부터 분리된 각 항원에 대한 IgA항체 함량을 측정한 결과 다음과 같다. 생성된 IgA 함량은 같은 항원농도 20μg/100μL에서 WC(L) 2.5±0.32μg/mL, OMP 2.0±0.43μg/mL, Urease 1.3±0.25μg/mL로 IgA항체 생성은 WC(L) 항원이 가장 많은 것으로 조사되었다. 항원농도 60μg/100μL인 WC(H)와 20μg/100μL인 WC(L)의 IgA항체 생산에 있어서는 각각 2.5±0.18μg/mL과 2.5±0.32μg/mL로 나타났으며, 항원 농도에 따른 IgA항체에는 차이를 나타나지 않았다. 상대적으로 crude urease 항원이 1.3±0.25μg/mL으로 가장 적은 IgA항체 생성량을 나타내었다(Fig. 9).

Fig. 9. H. pylori로부터 분리된 각 항원에 대한 IgA항체 함량을 측정한 결과(Changes of IgA levels in mice serum during the immunization period.)

1.3.3. 면역원성 확인

Western blotting(Immunoblotting)은 antigenic epitope과 반응하는 antibody를 이용하여 bacteria, yest, mammalian cell 등의 단백질 혼합물 중에서 원하는 antigen을 찾아내는 방법이다.

항원인 H. pylori균의 WC, OMP, crude urease를 SDS-PAGE로 분자량 측정결과 각각 12개, 7개, 3개의 주요 단백질 band를 확인할 수 있었다(Fig. 7). 각 항원단백질에 대한 면역원성을 알아보기 위하여 생산된 각 항혈청으로 western blotting을 실시하였다. 그 결과 각 항체에 대한 항원성 물질은 WC항원 10종류, OMP항원 6종류, crude urease항원 3종류의 단백질이 면역원성이 있는 것으로 확인되었다(Fig. 10).

특히, H. pylori urease는 subunit A와 B로 나누어지며, 각각 30.5kDa과 62.5kDa의 분자량을 나타내는 것으로 알려져 있다. H. pylori 단클론(monoclonal) 항체에서 면역성이 urease B는 약하나, urease A는 강한작용을 하는 것으로 보고되고 있다. 본 실험방법에 의해 분리된 crude urease는 25, 36, 64kDa의 분자량을 가진 단백질 모두가 면역원성을 가지는 것을 볼 수 있었다. 그리고 36, 64kDa 분자량을 가진 단백질 band가 urease A, B subunit인 것으로 사료된다.

Fig. 10. H. pylori균에서 분리된 각 항원으로 생성된 항혈청에 western blotting을 실시한 결과(Western blots of anti-sera from mice given separated H. pylori antigens.)

Lane 1, whole cell SDS-PAGE pattern; Lane 2, anti-whole cell serum ; Lane 3, anti-OMP serum; Lane 4, anti- crude urease serum; lane 5, standard protein markers.

2. 항균활성

2.1. Anti - H. pylori 항체에 의한 H. pylori 균 응집반응

특이 항혈청에 의한 박테리아의 응집은 미생물의 세포표면, 협막 또는 편모 항원에 의해 유래된 항혈청의 유무에 의해 기인된다. 응집반응은 박테리아 항원성 조성, 감염성질병의 진단을 위한 임상실험, 박테리아 분류를 위한 분류학상으로 기본연구를 위한 연구실험으로 사용된다. 응집반응은 항체를 첨가하여 특정 항원(세균)을 응집시키는 것을 뜻한다. 육안 또는 현미경으로 관찰할 수 있으며, 항원 또는 항체 측정에도 사용된다. 현재는 세포나 입자 표면에 항원기만 있으면 대부분의 항체는 응집을 일으키는 것으로 알려져 있다. H. pylori 백신으로 미리 면역된 mouse에서 질병예방 효과는 나타나지 않았으나, 세균의 양을 줄일 수 있으며, 위염 염증과 관련된 균체의 colonization의 감소와 제거현상이 나타나는 것으로 보고되고 있다.

본 실험에서는 H. pylori균에서 분리된 각 항원으로 생성된 항혈청의 H. pylori균에 대한 응집정도를 알아보기 위해 광학현미경으로 관찰하였다(Fig. 11). 각 항혈청을 단계별로 희석하여 H. pylori균과 반응시켜 광학현미경으로 관찰하였을 때 절반이상 응집반응을 나타내는 희석배수를 응집가로 결정 하였다. 따라서 면 역되지 않은 항혈청에서는 응집반응이 일어나지 않았으나, WC, OMP, crude urease에 의해 생성된 항혈청에 대해 모두 높은 응집가를 나타내었다. 그리고 응집가 이상의 항혈청 희석에서도 응집정도는 약했으나 균의 활동성이 현저히 저하되는 것을 관찰할 수 있었다. 항체의 H. pylori균에 대한 응집정도를 나타내는 응집가(Agglutination value)는 anti-WC(H), anti-WC(L), anti-OMP, anti-urease 항혈청에서 각각 2⁵, 2⁵, 2⁶, 2⁷으로 나타났으며, 상대적으로 anti-urease 항혈청이 높은 응집가를 나타내었다(Table 4).

(A) (B)

(C) (D)

Fig. 11. H. pylori균에서 분리된 각 항원으로 생성된 항혈청의 H. pylori균에 대 한 응집정도(Agglutination of Helicobacter pylori by anti-H. pylori antibody.)

H. pylori strains show change of agglutination after treatment anti-WC serum(B), anti-OMP serum(C) and anti-urease serum(D) when compared with normal serum(A). Magnification; ×400.

2.2. Urease 활성억제 효과 검색

Urease 활성억제 효과는 urease 작용에 대한 항체의 억제효과가 커질수록 요소가 적게 분해되어 pH 증가가 적을 것이며, phenol red는 오렌지색이 유지되어 흡광도(OD) 가 상대적으로 낮은 성질을 이용하였다.

각 항혈청에 대한 urease 활성억제를 나타내는 흡광도(OD=550nm)가 WC(H) 0.14±0.01, WC(L) 0.16±0.01, OMP 0.18±0.03, crude urease 0.18±0.04로 대조구 0.26±0.02와 비교할 때 유의적으로 낮게 나타났다. 각각의 항혈청에 대한 urease 활성 억제에 대해서는 유의적인 차이를 볼 수 없었으나, 각 항혈청과 양성대조군과 비교할 때 urease활성 억제효과가 있는 것으로 관찰되었다(Fig. 12).

Fig. 12. 우레아제 활성억제 효과(Inhibition of H. pylori urease activity by various against separated H. pylori antigen in mice anti-sera.)

3. H. pylori 백신에 대한 면역독성 평가

3.1. 전신성 아나필락시스 ( anaphylaxis ) 쇼크반응

아나필락시스 과민반응은 항원에 의하여 이미 감작된 개체에 동일한 항원을 재차 투입하였을 때 IgE 항체에 의해 일어나는 즉시형 과민반응을 뜻한다. IgE는 혈청중에 극소량으로 존재하지만 아나필락시스(anaphylaxis) 반응을 일으키는 작용을 가지고 있다. 전신성 아나필락시스(anaphylaxis)는 수초 이내에 일어나며, 기도 및 기관지 수축으로 인하여 호흡곤란을 초래하며, 혈압강하로 쇼크에 이른다. 일차 매개물질은 히스타민, 세로토닌, 호산구 주화물질, 헤파린, 각종효소 등이며, 이차매개물질은 항원이 IgE와 결합한 후 서서히 분비되기 시작하며 혈소판 활성인자, 블라디키닌 등이 이에 속한다. 국소 아나필락시스(anaphylaxis) 반응은 피부, 비후막, 위장관막 등에서 국소적인 항원에 의한 급성염증을 일으킨다.

전신성 아나필락시스(anaphylaxis) 쇼크반응의 유무를 평가하기 위해 각 군당 5마리의 guinea pig에 감작투여한 후 최종감작 1주와 2주째에 귀정맥(ear vein)으로 야기항원을 투여하였다. 아나필락시스(anaphylaxis) 쇼크 반응 시험에서 5마리 중 1마리가 양성반응을 나타낸 경우 의약품의 안전성 평가라는 관점에서는 양성으로 판정한다. H. pylori의 whole cell에 대한 1차 및 2차 야기항원 투여 후 전신성 아나필락시스(anaphylaxis) 쇼크반응에 대한 관찰결과는 다음과 같다.

3.1.1. H. pylori 균의 whole cell 백신에 대한 아나필락시스 ( anaphylaxis ) 쇼크반응

1차 야기투여 시 양성대조군인 BSA(H) 투여군에서는 중증인 코를 문지르거나 핥음, 재채기, 배뇨, 보행불안, 횡와 증상과 3마리가 사망에 이르는 현상을 나타내었다. BSA(L) 투여군에서도 중증인 핥음, 재채기, 배뇨, 보행불안, 횡와 증상과 1 마리가 사망에 이르는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 시험물질 투여군인 WC(H)에서는 불안, 코를 문지르거나 핥음 증상이 1마리에서 관찰할 수 있었으며, WC(L) 투여군 에서는 음성대조군(Control)과 같이 어떠한 증상도 관찰되지 않았다(Table 5).

2차 야기투여 시 양성대조군인 BSA(H) 투여군에서는 1차 야기투여 후 살아남은 2마리 모두 중증의 횡와 증상을 나타내었고, BSA(L) 투여군에서는 코를 문지르거나 핥음, 재채기, 호흡촉진 등의 중증과 1차 야기투여 후 살아남은 4마리중 3마리가 사망에 이르는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 시험물질 투여군인 WC(H)에서는 불안, 코를 문지르거나 핥음 증상을 1마리에서 관찰할 수 있었으며, WC(L) 투여군에서는 음성대조군(Control)과 같이 어떠한 증상도 관찰되지 않았다(Table 6).

이와 같이 H. pylori균의 whole cell에 대한 전신성 아나필락시스(anaphylaxis) 쇼크반응은 WC(H) 60μg/100μL의 항원농도에서 1차, 2차 모두 경증의 증상을 나타내었고, WC(L) 20μg/100μL의 항원농도에서는 아무런 아나필락시스(anaphylaxis) 쇼크 증상이 관찰되지 않았다. 따라서 H. pylori균 whole cell 백신 제조시 항원농도가 고려되어야 할 것으로 사료된다.

3.1.2. H. pylori 균의 urease 백신에 대한 아나필락시스 ( anaphylaxis ) 쇼크반응

1차 야기투여 시 양성대조군인 BSA(H) 투여군에서는 코를 문지르거나 핥음, 재채기, 배뇨, 보행불안, 횡와 등의 중증과 3마리가 사망에 이르는 현상을 나타내었다. BSA(L) 투여군에서도 핥음, 재채기, 배뇨, 보행불안, 횡와 등의 중증과 1마리가 사망에 이르는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 음성대조군과 시험물질 투여군인 urease(H)와 urease(L)에서는 아나필락시스(anaphylaxis)로 보이는 어떠한 증상도 관찰되지 않았다(Table 7).

2차 야기투여 시 양성대조군인 BSA(H) 투여군에서는 1차 야기투여 후 살아남은 2마리 모두 횡와 증상의 중증의 증상을 나타내었고, BSA(L) 투여군 에서는 코를 문지르거나 핥음, 재채기, 호흡촉진 등의 중증과 1차 야기투여 후 살아남은 4마리중 3마리가 사망에 이르는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 1차 투여와 같이 음성대조군, 시험물질 투여군에서는 모두 어떠한 증상도 관찰되지 않았다(Table 8).

이와 같이 H. pylori균의 urease에 대한 전신성 아나필락시스(anaphylaxis) 쇼크반응은 항원농도 20μg/100μL의 urease(L)와 60μg/100μL의 urease(H) 모두 아무런 증상도 관찰되지 않았다. 따라서 whole cell과 비교할 때 urease로 분리된 항원에 대해서는 아나필락시스(anaphylaxis) 쇼크증상으로부터 더 안전한 결과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다.

3.2. Guinea pig - rat 를 이용한 heterologous passive cutaneous 아나필락시스( PCA ) 시험

PCA 실험은 IgE 항체를 피하주사하여 일정한 잠복기간이 경과한 후에 해당 항원과 색소(Evan's Blue)를 정맥주사하면, 항체를 주사한 부위에서 국소 아나필락시스(anaphylaxis) 반응이 일어나고 색소가 혈관에서 유출되어 그 해당 부위가 청색으로 되는 반응이다. 즉시형 과민반응을 일으키는 항체의 연구에 사용된다. 그리고 수동 피부 아나필락시스(anaphylaxis) 반응시험에서 2마리 중 1마리가 양성반응을 나타낸 경우 의약품의 안전성 평가라는 관점에서는 양성으로 판정한다.

본 시험법은 항원으로 감작시켜 얻은 Guinea pig 항혈청을 rat의 배부 피내에 수동면역 시킨 후 항원을 정맥 내에 주사하여 조직 친화성 항체(IgE)의 역가를 알아보았다. 각 항혈청을 희석하여 피내주사하고 항원과 Evans Blue 혼합액을 정맥주사한 결과, 양성대조군인 BSA(L)에서는 개체에 따라 2³~2⁶배, BSA(H)는 2⁵~2⁶배 희석배율까지 5mm 이상 크기의 청색반점을 나타내었다(Table 9, 10). 그러나 음성대조군과 시험물질 투여군인 WC(H), WC(L), Urease(H), Urease(L)에서는 청색반점을 관찰 할 수 없었다. 따라서 H. pylori 균에서 분리된 whole cell 과 urease 항원의 PCA 실험결과 조직 친화성 항체 IgE를 생성하지 않는 것으로 나타났다.

3.3. 피부감작성 시험

피부 외용제로 사용되는 의약품의 피부에서 접촉감작 위험성을 예측하기 위 한 것으로서 접촉하는 약물의 피부감작성을 평가하기 위하여 피내주사 후 주사부위를 관찰하여 2마리 guinea pig 모두 다 피부괴사가 나타나지 않는 최고 농도를 감작항원량으로 정한다.

본 실험에서는 투여하고자 하는 항원의 감작항원량을 결정하기 위하여 whole cell(WC) 항원과 urease 항원을 피내 감작시킨 후 염증이나 이상반응이 발생하지 않는 최고 농도를 알아보고 그 농도를 결정하고자 하였다. 실험결과 WC와 urease항원 모두 20μg/100μL의 농도에서 피부 이상증상 반응을 나타내지 않았으며, 항원농도 80μg/100μL와 40μg/100μL에서는 염증증상은 아니지만 붉은 반점의 이상증상을 나타내는 것을 볼 수 있었다. 따라서 피부이상증상이 발생하지 않는 최고 항원농도는 40μg/100μL 이하로 관찰되었으며, 20μg/100μL 항원농도를 가장 적합한 감작항원 농도로 결정하였다(Fig 13).

Fig. 13. whole cell(WC) 항원과 urease 항원의 스킨 테스트(Skin test of separated whole cell and crude urease antigen from H. pylori.)

W1, whole cell 80μg/100μL dose; W2, whole cell 40μg/100μL dose; W3, whole cell 20μg/100μL dose; W4, whole cell 10μg/100μL dose; U1, urease 80μg/100μL dose; U2, urease 40μg/100μL dose; U3, urease 20μg/100μL dose; Con, control(1-chloro-2,4-dinitrobenzene) 20μg/100μL.

4. 아쥬반트 ( Adjuvant ) 종류에 따른 항체생성

4.1. 아쥬반트 ( Adjuvant ) 종류에 따른 항체생성

4.1.1. IgG 항체생성

대부분의 단백질은 단독 투여될 경우 매우 약한 면역력을 보이거나 혹은 거의 면역력을 보이지 못한다. 단백항원에 대한 강력한 적응면역반응을 유발하기 위해서는 언제나 항원을 아쥬반트(Adjuvant)와 함께 투여하여야 한다. 아쥬반트(Adjuvant)는 면역반응을 항진시키는 물질로서 면역원은 아니며 혼자 면역반응을 일으키지 못하는 것으로 알려져 있다. 대부분은 특이 면역글로불린의 양을 증가시키기 위한 반응으로 사용되며 대식세포의 활성이나 세포성 면역에도 가끔 사용되어진다. 아쥬반트(Adjuvant)의 작용기전은 수용성 단백질 항원이 아쥬반트(Adjuvant)와 반응하여 대식세포와 같은 항원제공세포(APC)에 쉽게 섭취되도록 유도하기도 하고, 항원이 alum과 같은 아쥬반트(Adjuvant) 입자에 흡착되거나 광유(mineral oil)에 유화되어 아쥬반트(Adjuvant)의 작용이 증강되기도 한다.

H. pylori 균에서 아쥬반트(Adjuvant) 종류에 따른 anti-H. pylori IgG 항체 함량을 측정한 결과 정상군, 대조군, FCA, MPL, TMG 각각 1.42±0.17μg/mL, 3.23±0.28μg/mL, 8.91±0.83μg/mL, 5.78±0.36μg/mL, 6.38±0.27μg/mL로 나타났으며, FCA 아쥬반트(Adjuvant)가 가장 많은 IgG 항체를 생산하는 것으로 나타났다. 항원만 투여한 대조군에서도 유의적인 차이로 정상군에 비해 많은 항체가 생성되는 것을 볼 수 있었으나, 아쥬반트(Adjuvant)가 첨가된 처리군에 비해 비교적 적은 양 의 IgG항체가 생성되는 것으로 관찰되었다. 그리고 아쥬반트(Adjuvant)가 첨가된 처리군에서는 항체 생성량에 따라 FCA > TMG > MPL 순서대로 항체 생성량에 차이를 나타내는 것으로 나타났다. 이는 유화(emulsion)방식에 따라 water in oil 형식인 FCA와 TMG 그리고 oil in water 형식인 MPL로 구분할 수 있으며, 또한 oil의 형태에 따라 체내에서 대사가 되지 않는 oil로 구성된 FCA와 체내에 대사 가능한 oil인 TMG와 MPL에서도 항체생성량에 차이를 나타내는 것으로 나타났다(Fig. 14).

결론적으로 IgG 항체 생성에서 아쥬반트(Adjuvant)의 emulsion방식에 따라 oil in water 방식인 MPL보다 water in oil 방식인 FCA 와 TMG가 더 많은 항체를 생성하였고, oil의 체내 대사 여부에 따라 흡수되는 TMG보다 흡수되지 않는 FCA가 보다 많은 IgG 항체를 생산하였다. 따라서 FCA가 가장 강한 보조제 역할을 할 수 있을 것으로 판단된다.

4.1.2. IgA 항체생성

H. pylori 균에서 아쥬반트(Adjuvant) 종류에 따른 anti-H. pylori IgA 항체 함량을 측정한 결과 정상군, 대조군, FCA, MPL, TMG 각각 0.02±0.00μg/mL, 0.96±0.00μg/mL, 1.22±0.06μg/mL, 1.26±0.04 μg/mL, 1.31±0.10μg/mL로 나타났으며, 처리군과 정상, 대조군과의 차이는 나타났으나 처리군간 항체함량에 있어서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 따라서 IgA항체 생성에서는 아쥬반트(Adjuvant) 종류에 따라 항체생성의 차이를 나타내지 않았다(Fig. 15).

Fig. 14. 몇 가지 아쥬반트에서 IgG 항체생성(The change of IgG concentration against several adjuvants in blood serum according to immunization period.)

No, saline immunized; Co, whole cell immunized; FCA, whole cell+FCA immunized; MPL, Whole Cell+MPL^®+TDM adjuvant; TMG, whole cell+Titermax gold adjuvnat.

Fig. 15. 몇 가지 아쥬반트에서 IgA 항체생성(The change of IgA concentration against several adjuvants in blood serum according to immunization period.)

4.2. 부종측정

광유 emulsion 같은, 사람에게 사용하기에는 반응원성이 너무 큰 백신이 동물 백신으로 몇 건이 허가가 되어 있다. Complete Freund's adjuvant는 알려진 것 중 가장 강력한 아쥬반트(Adjuvant)의 하나임에도 불구하고, 사람이 사용하기에는 적당하지 않다. Freund's adjuvant는 면역을 강화시키기 위하여 사용되는 water in oil 상태의 현탁액이다. 사멸시킨 mycobacteria의 첨가여부에 따라 Freund's complete adjuvant(FCA)와 Freund's incomplete adjuvant(FIA)와의 두 가지로 구분된다. FCA는 주사부위에 육아종을 유발시켜 면역반응을 증강시킨다. 따라서 면역능이 약한 항원은 FCA를 함께 주사하면 자신의 항원도 면역원이 된다. 따라서 상용되어 오던 아쥬반트(Adjuvant)의 잠재적인 위험성을 평가하기 위하여 아쥬반트(Adjuvant) 투여 후 국소반응을 알아보기 위해 부종의 크기를 측정하였다.

부종 측정결과 백신투여 후 부종은 4일째 FCA 투여군에서 2.38±0.64mm로 가 장 크게 형성되었고, 1주 후 FCA와 TMG 투여군에서 정상 대조군과 비교할 때 부종이 각각 1.20±0.30, 0.99±0.25mm로 크게 형성되는 것을 관찰할 수 있었다. 백신투여 2주 후 FCA 는 MPL, TMG 처리군과 비교할 때 부종의 크기가 1.13±0.22mm로 작아졌으나 지속적으로 유지되는 경향이었으며, TMG 투여군에서는 부종의 크기가 0.68±0.19mm로 FCA 투여군과 비교할 때 1주 때 생성되었던 부종이 차츰 사라지는 것을 볼 수 있었다(Fig. 16).

이상의 결과에서 water in oil 유화방식인 FCA와 TMG에서는 부종이 형성되었으나, TMG의 경우 체내 대사 가능한 oil로 구성되어 백신투여 2주 후부터 부종이 사라지는 경향을 나타내었다. 따라서 백신으로 인한 부종을 예방하기 위해서는 MPL 또는 TMG 아쥬반트(Adjuvant)가 적당할 것으로 나타났다.

Fig. 16. 부종의 측정 결과(Influence of adjuvant-induced paw edema in rats.)

4.3. 체온 변화

염증은 세포 및 혈관이 변화하여 조직 손상이 뒤따르는 상태이다. 염증의 4가지 중요한 특징은 발열, 통증, 발적, 부종이다. 급성염증은 수분에서 수 시간이내에 나타난다. 백신을 성공적으로 사용하기 위해서는 생물학적 부작용(adverse biological properties)을 가지지 않아야 하며, 부작용이 없는 아쥬반트(Adjuvant)를 선택하기 위해 전임상 약리·생물학적 측면에서 발열성실험으로 백신투여 후 mouse 직장온도를 측정하였다.

아쥬반트(Adjuvant) 종류에 따른 백신투여 후 직장온도 변화를 나타낸 것으로써 하루 중 기온변화에 따라 체온변화에 다소 영향을 미치는 것으로 관찰되었다. 백신투여 전 시험구간 유의적인 체온 차이는 나타나지 않았으나, 투여 3시간 후 가장 큰 변화를 나타내면서 6시간이 경과하면서 정상군, 대조군, 시험군 모두 평균 체온이 37.5±0.33℃정도로 정상 체온을 유지되는 것을 관찰하였다. 24시간 경과 후 FCA와 TMG 투여군이 정상군, 대조군, FCA 투여군에 비해 높은 체온을 나타내었으나 0.5℃ 이하의 낮은 범위에서 온도변화를 나타내었다.

체온변화가 가장 심할 때는 백신투여 후 3시간째 정상군 37.42±0.16℃, 대조군 37.9±0.14℃, FCA 투여군 38.3±0.22℃, MPL 투여군 38.1±0.24℃ 그리고 TMG 투여군 37.6±0.35℃로 TMG, FCA 투여군이 정상, 대조군에 비해 체온상승 현상이 유의적으로 나타났다. 이러한 결과는 백신투여 후 체온변화를 나타낸 다른 연구와 유사한 경향을 타나내었다. 가장 큰 체온변화를 나타낸 TMG, FCA투여군 에서 mouse 정상체온인 37.4℃와 비교할 때 1.2℃내외의 체온변화를 나타내었으나 정상적인 범위에서의 변화인 것으로 관찰되었다. 그리고 항원만 투여된 양성 대조군에 서도 0.5℃의 체온변화를 나타내는 것을 볼 때 발열성의 원인은 아쥬반트(Adjuvant)뿐만 아니라 항원에 의한 것으로도 보여진다(Fig. 17).

결과적으로 백신투여에 의한 체온변화는 투여 3시간 후 가장 높은 체온상승현상을 나타내었으며 정상적인 범위에서의 체온변화였다. 그리고 정상군과 비교할 때 6시간 이후 정상으로 회복되는 것으로 관찰되었다.

Fig. 17. 아쥬반트 종류에 따른 백신투여 후 직장온도 변화(Rectal temperature change of challenge with several adjuvants in mice.)

4.4. 체중측정

백신투여 후 생물학적 측면에 미치는 영향을 알아보기 위해 항체생산기간동안 체중변화를 측정하였다(Table 11). 백신투여 후 평균 일당증체량은 2주 후 0.184±0.037g, 4주 후 0.156±0.024g으로 정상, 양성대조군, 처리군과 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 백신투여가 증체량에는 영향을 미치지 않는 것으로 조사되었다.

Table 11. 백신 투여 후 체중의 변화(Body weight gain in mice of vaccination period)

Ⅲ. 결론

본 발명에서는 Helicobacter pylori의 감염을 예방하고 치료보조제로 사용할 목적으로 포유동물을 통한 피동면역용 항체를 생산하고자 하였다. 따라서 anti-H. pylori 항체를 함유한 면역우유 생산용 백신개발에 기초자료를 얻고자 H. pylori의 면역성과 면역독성에 관한 실험을 수행하였다. 그 첫 번째 방법으로 H. pylori 균으로부터 항원을 분리하고, 분리된 항원에 대한 항체생산 및 H. pylori 균의 응집정도를 알아보았다. 두 번째로 백신을 반복해서 투여했을 때 야기될 수 있는 알레르기 및 과민반응을 예측하고, 페니실린 쇼크와 같은 심각한 부작용 및 독성유발 가능성을 검색하기 위하여 백신의 면역독성을 평가하였다. 마지막으로 H. pylori 항원이 좋은 면역원이 되기 위해서는 아쥬반트(Adjuvant)를 필요로 하게 되는데 이 아쥬반트(Adjuvant)의 잠재적인 위험성에 대해 조사하였다.

1. H. pylori 균으로부터 분리된 주요 항원 단백질은 whole cell(WC), 외막 단백질(OMP), crude urease, lipopolysaccharide(LPS) 각각 12개, 7개, 3개, 1개 종류의 band를 확인할 수 있었다.

2. 분리된 항원의 IgG항체 생성은 동일한 항원농도인 20μg/100ul에서 각각 WC(L) 77.9±6.4μg/mL, OMP 84.9±6.4μg/mL, crude urease 123.8±2.9μg/mL로 crude urease 항원이 가장 많은 것으로 나타났다. 그리고 IgA항체 생성은 WC(L) 2.5±0.32μg/mL, OMP 2.0±0.43μg/mL, crude urease 1.3±0.25μg/mL로 IgA항체 생성은 WC(L) 항원이 가장 많은 것으로 나타났다.

3. Western blotting을 통하여 항원 단백질의 면역원성 알아본 결과 WC 10종류, OMP 6종류, crude urease 3종류의 주요 항원성 물질을 확인할 수 있었다.

4. 항체의 H. pylori균에 대한 응집정도를 나타내는 응집가는 anti-WC(H), anti-WC(L), anti-OMP, anti-crude urease 항혈청에서 각각 2⁵, 2⁵, 2⁶, 2⁷으로 나타났으며, 상대적으로 anti-crude urease 항혈청이 가장 높은 응집가를 나타내었다.

5. 각 항원에 의해 생성된 항혈청의 urease활성 억제에 대한 흡광도(OD=550nm)는 WC(H) 0.14±0.01, WC(L) 0.16±0.01, OMP 0.18±0.03, Urease 0.18±0.04로 대조구 0.26±0.02와 비교할 때 유의적인 억제효과가 있는 것으로 나타났다.

6. H. pylori균의 whole cell에 대한 아나필락시스(anaphylaxis) 쇼크반응은 WC(H) 60μg/100μL의 항원농도에서 1차, 2차 야기항원 투여 모두 경증의 증상을 나타내었고, WC(L) 20μg/100μL의 항원농도에서는 아무런 아나필락시 스(anaphylaxis) 쇼크 증상이 관찰되지 않았다. 그리고 crude urease에 대한 아나필락시스(anaphylaxis) 쇼크반응은 항원농도가 20μg/100μL의 urease(L)와 60μg/100μL의 urease(H) 모두에서 아무런 증상도 관찰되지 않았다.

7. Guinea pig - rat를 이용한 heterologous passive cutaneous anaphylaxis(PCA) 시험에서는 WC(H), WC(L), urease(H), urease(L) 투여군 모두에서 양성반응이 나타나지 않았다.

8. 피부감작성 시험에서 항원농도에 따라 각각 80μg/100μL, 40μg/100μL, 20μg/100μL, 10μg/100 μL일 때 피부이상 증상 즉, 피부 트러블이 발생하지 않는 최고의 항원농도는 40μg/100μL 이하인 것으로 관찰되었으며, 가장 적정 항원농도는 20μg/100μL로 나타났다.

9. 아쥬반트(Adjuvant) 종류에 따른 IgG 항체 생성은 아쥬반트(Adjuvant)의 emulsion방식에 따라 oil in water 방식인 MPL보다 water in oil 방식인 FCA와 TMG가 더 많은 항체를 생성하였고, oil의 체내 대사 여부에 따라 흡수되지 않는 FCA가 흡수되는 TMG보다 더 많은 IgG 항체를 생산하였다. 그러나 IgA항체 생성에서는 차이를 나타내지 않았다. 결과적으로 항체생성에 있어서는 FCA가 가장 강한 보조제 역할을 할 수 있을 것으로 나타났다.

10. 아쥬반트(Adjuvant) 종류에 따른 부종측정에서 water in oil 방식인 FCA와 TMG에서는 부종이 형성되었으나, TMG의 경우 백신투여 2주 후부터 부종이 사라지는 경향을 나타내었다. 따라서 백신으로 인한 부종을 예방하기 위해서는 체내대사 가능한 oil로 구성된 MPL 또는 TMG 아쥬반트(Adjuvant)가 적당할 것으로 나타났 다.

11. 백신투여로 인한 체온변화는 투여 3시간 후 가장 높은 체온상승현상을 나타내었다. 그러나 정상적인 범위에서의 체온변화였으며, 6시간 이후 정상으로 회복되는 것으로 관찰되었다.

12. 백신투여 후 증체량 변화는 시험물질 투여군과 정상군을 비교할 때 유의적인 차이가 나타나지 않았다.

이상의 결과를 종합해 볼 때 H. pylori 항원의 분리와 분리된 항원의 항체 생성능, H. pylori 균의 응집가, urease 활성억제 측면에서 whole cell 및 crude urease항원 모두 높은 항체역가를 나타내었다. 그러나 면역독성 측면에서는 높은 항원농도에서 crude urease 항원이 whole cell 항원보다 안전할 것으로 판단된다. 그리고 아쥬반트(Adjuvant) 종류에 따른 항체생산에서는 아쥬반트(Adjuvant)의 잠재적 위험성인 부종에 대한 문제점을 보완하기 위해서 체내대사가 가능한 emulsion oil로 구성된 water in oil 방식의 TMG 아쥬반트(Adjuvant)가 적합할 것으로 조사되었다.

결론적으로 H. pylori 균으로부터 분리한 crude urease를 항원농도 20μg/100μL로 체내대사 가능한 water in oil 방식의 아쥬반트(Adjuvant) 사용이 부작용 및 면역독성에 안전할 것으로 기대된다.

Claims

H. pylori 균주로부터 분리된 Whole cell, OMP 및 Urease로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 항원으로 하는 것을 특징으로 하는,

H. pylori 특이 항체 생산을 위한 백신의 제조방법.
제1항에 있어서,

H, pylori로부터 분리된 항원의 면역독성을 고려하여 아나필락시스 쇼크반응, 이종 수동 피부 아나필락시스 반응시험 및 피부감작 시험에서 모두 음성반응을 나타내는 Urease를 항원으로 하는 것을 특징으로 하는,

H. pylori 특이 항체 생산을 위한 백신의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,

면역증진물질(adjuvant)로서 FCA, TMG 또는 MPL을 사용하는 것을 특징으로 하는,

H. pylori 특이 항체 생산을 위한 백신의 제조방법.
제3항에 있어서,

부종 생성을 고려하여 체내 대사 가능한 oil로 구성된 TMG 또는 MPL을 면역증진물질로 사용하는 것을 특징으로 하는,

H. pylori 특이 항체 생산을 위한 백신의 제조방법.
H. pylori 균주로부터 분리된 Urease를 항원으로 하되 항원농도를 20μg/100μL로 하고, 면역증진물질로서 TMG 또는 MPL을 사용하는 것을 특징으로 하는,

H. pylori 특이 항체 생산을 위한 백신의 제조방법.