JPH02502538A

JPH02502538A - 分子状デコイアント及びその使用方法

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Publication number: JPH02502538A
Application number: JP63507516A
Authority: JP
Inventors: ガーショニ，ジョナサン・エム
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Current assignee: Individual
Priority date: 1987-08-30
Filing date: 1988-08-30
Publication date: 1990-08-16
Anticipated expiration: 2013-08-27
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】光１ＦＬ五笠− 分子状デコイアント及びその使用方法見吸ａ挟丘左毘本発明は、内因性受容体との最初の結合の後にだけ好ましくない効果を及ぼす異物を加えられた人間を含めた動物の治療に有用な物質に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、自然内因性受容体から直接または間接的に誘導されるそのような物質およびそれらの使用方法に間するものである。

見咀旦１１ビールス、バクテリアそしてまた毒素のような多くの病原体および有毒物質の作用が生体内に及ぶには、これらが特定の結合部位、例えば細胞表面受容体、に付かなければならない、そのような結合現象はビールス病伝染の最初の段階として必要であり、または重要な生理学的作用の毒性不活性化に欠くことのできないものである。受容体は特定のリガンドと相互に作用する細胞成分である。アゴニストとして分類されるリガンドは、それらの受容体と結合すると、エフェクター系を活性化し、生体反応を開始する。アンタゴニストとして分類されるリガンドは、受容体を抑制したりあるいはアゴニストの作用を阻害する。

例えば、コブラの毒液またはクラレをコリン作動性受容体に付けると、アセチルコリンの結合が妨げられる。そのような特定のりガント−受容体複合体の形成を妨げることは、病原体または有毒物質の有害な効果と戦う上で有益なことである。

複合体形成の防止は、いくつかの根本的に異なる方法で行なうことができる０例えば、抗毒性抗血清の生成は、ヘビに噛まれたときの治療の際の有用な方法であることが証明されてきた。

ビールスおよびバクテリアの不活性化は予防接種に欠くことのできないものである。これらのどちらの場合も、浸透物質を、その物質がその作用目葆に達するのを妨げるものである。

また、別の方法が最近蝉案されており、それは、異物の類似物を使って宿主受容体結合部位を先取りし、それによってビールスまたはバクテリアが常態では混入するはずであった組織に結合するのを妨げるものである。

これらの公知の解決方法には、いくつかの根本的な欠点がある。免疫学的不活性化は「リガンド−特異物質（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」である、さらに、多くのバクテリアおよびビールスは、突然変異および再結合プロセスによって免疫原エピトープを周期的に変える能力を持ち、それによって免疫グロブリンを効果の無いものにする。リガンド類似物の使用は「受容体−特異物質（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」である、しかしながら、限定することによって、そのような類似物は受容体を占領してその作用力を妨げる。

本発明は、そのようなりガント−受容体複合体の形成を妨げる問題を解決する新しい方法であり、この方法は「受容体−特異物質」であるが、本来の受容体の作用力を妨げないものである。

ｉ肌ａ！紅本発明の目的は、従来技術の欠点を無くすことである。

本発明の別の目的は、リガンド−受容体複合体の形成を妨げる新解決方法であり、この方法は「受容体−特異物質」であるが、受容体部位の作用力を妨げないものである。

本発明の別の目的は、本来の受容体の部位に結合しているリガンドの分子構造より実質的に大きくなく、かつ病原体または毒性物質を生体内で「標的−特異物質」法で結合することのできる、分子デコイアント（ｄｅｃｏｙｉｎｔ）を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、実質的に非免疫性であるように十分に小さい、かつ生体内でおとり物質として作用して自然結合部位と競い合い、そして特定のリガンドをさえぎり、それらを不活性化する、物質を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、内因性受容体との最初の結合の後にだけ好ましくない効果を及ぼす異物を加えられた、人間を含めた動物の治療方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、内因性受容体の結合部位の作用特質によく似た分子デコイアントを投与することによる上記のような方法を提供することである。

本発明のこれらのおよび他の目的は、以下の好ましい具体例および添付の２面から、さらによく理解されるであろう。

リガンドが内因性受容体に特定的に結合することによって好ましくない効果を及ぼす異物である場合、リガンド−受容体複合体の形成を妨げる問題を解決する新しい方法は、本来の受容体中のリガンド結合部位の分子構造の確認および偽のリガンド結合部位の生成を伴う、これらの部位を生体内に使用すると、ｒｇ的−特異物質」操作で、毒素またはビールスまたは別の異物を結合することができる。

従って、本発明の偽のリガンド結合部位は動物の体内で自然の結合部位と競い合う、すなわち、おとりとして作用する。そのような物質を本発明者は、「分子デコイアント」と呼んできた。

自然の受容体の方がどちらがと言えば大きな構造であって、数百のアミノ基よりなり、約２５０，０００もの分子量であることがあると考えられている。しかしながら、特定の結合部位はより小さい、このことは、特定のビールス、バクテリア、毒素等を結合するのに効果的であり、しがもずっと少ない数のアミノ基よりなり（好ましくは１００未満）、従って分子量ががなり小さく、それ故免疫原性も相当して低い、人工的な合成結合部位の製造の可能性を開くものである。アミノ基が約２０程度の特定のリガンドを結合するのに適した、そのような結合部位疑似分子デコイアントを製造することができることを見出だした。そのようなどちらかと言えば小さなペプチド構造は、内因性受容体を物理的に分離することによって製造でき、あるいはメリーフィールド合成のようなペプチド化学の製造手Ｒまたは遺伝子工学によって合成することができる。これによって、そのようなペプチドの大規模な製造の可能性、および病原体または毒性物質を受けた動物の治療にそれらを活性物質として使用する可能性が開かれる。

分子デコイアントは、好ましくない効果を働かせるのに必要な内因性受容体との結合のためにリガンドが必要とするちょうどその部位で、リガンドに結合するので、リガンドによってこの部位は変えられてそれ自体不活性化する。すなわち、デコイアントは免疫グロブリンよりはるかに信顆のおけるものとなり、長時間効果を有するものである。

様々なリガンドに特有な分子デコイアントを製造することができるので、本発明は非常に広い範囲に応用がきくという特徴を有する０本発明には、活性分子デコイアント構造体を適した濃度および量で含有する予防および治療組成物も含まれる。

区ｍ茎塾匪吸第１区は、組換え体ＤＮＡ法による１７アミノ酸配列ＷＫＨＷＶＹＹＴＣＣＰＤＴＰＹＬＤを得るための工程を示すものである。

第２区は、ｔｒｐＥ溶１ｄ（ｆｕｓｊｏｎ）蛋白質の誘導のために培養したＲ４１３７クローンの種々の試料のポリアクリルアミドゲル上での分離結果を示すものである。細胞を試料バッファー（Ｙ）中で可溶化するか、または高度の塩バッファー（５００ｍＭ）中で音波処理し、遠心分離した。上澄み液（Ｓ＋）は、ペレット（Ｐ、）と同じように４０〜６０％の溶融蛋白質を含んでいた。

ペレットをさらに水で抽出して本来の溶融蛋白質含有量の１５％を含む上澄み液（Ｓ２）およびペレット（Ｒ２）を生成した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の後、試料をクマシーブリリアントブルーで着色するか（上部）、または１２Ｓ工標識α−プンガロトキシン（ＢＴＸ）をプロット（ｂｌｏｔ）するかまたは重ね、その後オートラジオグラフィーを行なった（底部）、矢印は溶融蛋白質の位置を示す、数字はｋＤａ中の関連する分子の質量を示す。

第３区は、特定の時間（Ｃｔ）で結合した毒素の濃度を、１２ｓＩ標ｍＢＴＸを有するＲ４１３７を指示した異なる時間培養した後、平衡（Ｃｅｑ）に達しな濃度で割った値を示すグラフである。濃度は、アリコートを正に帯電したメンブランフィルタ−ディスクにかけた後、測定した０時間はパネルＡでは分、パネルＢでは秒で測定した。

第４図は、Ｒ４１３７に結合している毒素のスキャッチャード分析を示すグラフである。平衡に達するまで（３０分）異なる濃度の＋２Ｊ標識ＢＴＸと共に培養した後、１．０００倍過剰量の非放射性ＢＴＸを加えることによって正味結合ＢＴＸを測定し、そして各時点の結合毒素と遊ＭＩ！素とを計算した。

第５２は、ＢＴＸ結合の競い合いを示すグラフである。以下のもの二非標ｆｉＢＴＸ（・）、コブラドキシン（△）、デカメトニウム（◇）、ｄ−ツボクラリン（”）、ＮａＣｌ（ロ）、カルバミルコリン（ｘ）またはグリシン（Φ）、の濃度を増加させて混合した後、＋２ｓｒｌｌ識ＢＴＸ（２−１０−ａＭ＞の百分率をプロットした。

これらの混合物は３０分間、２５℃で同量のＲ４１３７と共に培養し、結合した放射性毒素の正味量を測定した。

第６Ａ図は、結合１２５１ＩＩＡ識ＢＴＸの量を、固定されたＡｃＣｈｏＲを有するコンカナバリン−Ａに付いた＋２’ＪＩ標識ＢＴＸの全量の関数としてプロットしたグラフである。

第６Ｂ図は、固定されたＡｃＣｈｏＲを有するコンカナバリン−Ａカラム上の結合＋２’ＩｉｍＢＴＸの量を、種々の量のＲ４１３７および一定量の１２Ｊ標識ＢＴＸを付けた後、コラムに付いたＲ４１３７の量の関数としてプロットしたグラフである。

第７図は、ｄ−ツボクラリンを注射したマウスの生存率に及ぼすＲ４１３７の影響を示すグラフである。Ｂａ１ｂ／Ｃマウスの２つのグループ（各３５匹）にｐＡＴＨ２またはＲ４１３７（約３ｎｍｏｌ　ＢＴＸ結合部位／マウス）のいずれかをＭＭ内注射した。

５分後マウスにｄ−ツボクラリンと与えたく約１５ｎ＋ｏｏｌ、９μｇ／マウス、皮下注射）、生き残ったマウスの数を毒素を注射した後の時間の関数として示す（データは表１の実験２および３かち得たものである）。

ましい　　　のＦｉ４シヨ本発明は、どのような内因性受容体の結合部位に似せた分子デコイアントにも適用できるが、コリン作動性結合部位について詳しく述べる。ヘビの毒液のα−神経毒であるα−ブンガロトキシン（ＢＴＸ）は、コリン作動性リガンドのニコチン性アセチルコリン受容体（ＡｃＣｈｏＲ）への結合を妨げることによって、その毒素の効果を働かせる。神経筋接合部は、神経が筋肉繊維と出会う部位である。その接触点はシナプスであり、神経と筋肉が実際に物理的に接続しているのではなく、むしろ化学的な接合部を形成しているという特徴を有する。神経パルスが軸索の先端に達すると、神経伝達物質であるアセチルコリンが神経と筋肉との間の隙間、すなわち「シナプス間隙」、に分泌する。

アセチルコリンは、接合部のシナプス後部位である筋肉の細胞外膜上にあるその受容体によって結合される。２分子のアセチルコリンがそれらの受容体に結合することにより、イオン−チャンネルが開き、腹は減極し、その結果筋肉収縮が生じることになる。

ＢＴＸはＡｃＣｂｏＲに結合するアンダゴニストであり、それによってアセチルコリンがその受容体に達するのを妨げ、そして筋肉が収縮するのを妨げる０分子デコイアントを、ＢＸＴを受けた動物の治療用にするためには、まず特定のＢＴＸ結合部位を確認しなければならない、これを行なうための好ましい方法は、リガンドに蛋白質プロット（ｂｌｏｔ）を重ねる方法によるものである。且、結合部位を確認したら、その最小限の配列を生成する。そのような配列を投与すると、デコイアントは結合部位のふりをして、ＢＴＸと結合し、それによって毒素の好ましくない活性を妨げる。

ＡｃＣｂｏＲ上のＢＴＸ用の特定の結合部位はそのα−サブユニット上にあることが知られている。ＢＴＸに対し妥当な親和力を有しかつ選択的、特定的な結合を許す結合部位の最小限必須の要件は、蛋白質プロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によってさらに確認し得る。蛋白質プロッティングの方法については、ゲルショニー（Ｇｅｒｓｈｏｎｉ）の便覧「生化学分析法」、出版デビット・グリツク・ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、第３３巻、第１〜５５頁、１９８８年に詳しく記載されている。この方法は、分解したポリペプチドをクロマトグラフィーゲルから移して母体に固定することよりなるものである。

試料を沸騰させることのない穏やかな変性下でかつドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の代わりにドデシル硫酸リチウムを使用して、精製したＡｃＣｂｏＲをポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）させる０次にプロットを生成し、＋２ＳＩ標識ＢＴＸについて探る（ｐｒｏｂｅ）、そのような実験は、ＡｃＣｈｏＲのα−サブユニットが標識化されていることを示している［ゲルショニー等の「単離トルベト・　ルフオルニ力のアセチルコリン受容体のα−サブユニットへのα−ブンガロトキシンの結合（Ｂｉｎｄｉｎｇ　　ｏｆ　　ａ−Ｂｕｎ６ａｒｏｔｏｘｉｎ　　ｔｏ　　ｌ５ｏｌａｔｅｄ　　ａ　−５ｕｂｕｎｉｔ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ａｃｅｔｙｌｅｈｏｌｉｎｅ　　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　　ｏｆＴｏｒｐｅｄｏ　　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）：タンパク質プロットでの定量分析」Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、（ＵＳＡ）、８０：４９３−４９７７（１９８３）］、次いでα−サブユニットを蛋白質加水分解し、そのタンパク質プロットを、アルカリ性ホスファターゼヒドラジド、コンカナバリン−ＡＢ、ＢＴＸ、および共に毒性結合部位を領域α−１６０−３３０、より詳しくはα−１６０−２１０、さらに詳しくはα−１８０−２００にマツピングさせている、抗体に特有の配列について探る（「アセチルコリン受容体のα−サブユニットを有するα−ブンガロトキシン結合部位のマツピング［（Ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　　ａ−ＢｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎＢｉｎｄｉｎｇ　　　５ｉｔｅ　　ｗｉｔｈ　　　ｔｈｅ　　　ａ−３ｕｂｕｎｉｔ　　ｏｆ　　　ｔｈｅＡｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ　　Ｒｅｅｅｐｔｏｒ）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）、８３：３００８−３０１１（１９８６）］、コリン作動性結合部位をさらに詳しく判定するなめに、いくつかの合成ペプチドを生成し、そしてコリン作動性リガンドを結合するそれらの容量を推定した。試験を行なった多くのペープチドの中で、ＢＴＸ結合が可能なもののみが、配列α−１８５−１９６を含んでいた。このペプチドは、親和力は小さい（１０“＠Ｍ）が、高度に特異性のＢＴＸ結合能力を有することが分かった。配列α−１７３−２０４は親和力がさらに大きい（１０−”）ことが分かった。

ＢＴＸ結合配列は、組換えＤＮＡ法によって生成することもでき、マウスまたは　ルベド・　ルフ　ル二　のα−サブユニットのｃＤＮＡのサブ−コリンは表現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ）を使って生成される。ｔｒｐＥ溶敵ベクターｐＡＴＨを使用した。プラスミドｐ４２の制限フラグメント、Σ ／）＜Ｆ二を匹≦７ｔ７１≦孔カーＡｃＣｈｏＲのα−サブユニットのｃＤＮＡクローンを１％アガロースゲル上で精製した０分離量のプラスミドが得られ、旦 −１直細胞株ＨＢ１０１の形質転換における連結反応をマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法（「分子クローニング二冥験室の手引き」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク州、スプリング、ハーバ−，１９８２）によって行なった。これによって、溶融蛋白質がＥ、ｃｏｌｉ形質転換体中に生成された（ゲルショニー、「大腸菌形質転換体によるニコチン性アセチルコリン受容体のα−ブンガロトキシンの表現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　ａ−Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ　　ＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｎ１ｃｏｔｉｎｉｃ　　Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ　　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｂｙ　　　Ｅｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ　　　ｃｏｌｉ　　　Ｔｒａｎｓｆｏｒｓ＋ａｎｔ」）、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、８４．４３１８　４３２１（１９８７）。

これらの溶融蛋白質はＢＴＸを特定的に結合することが示されたく親和カニ１０ ’Ｍ）、すなわち、例えば、細菌によって表現された蛋白質を含むα−１６６− ２００は毒素を結合し、一方これらを表現するα−２０１−３１５は結合しない。

した、これらは細菌によって好まれるコドンを使って作り、アミノ酸配列にライてコード化した：ＧＩｙ　−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ　−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｂｒ−Ｃｙｓ　−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａｓｐ　−Ｔｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔｙｒ　−Ｌｃｕ　−Ａｓｐ、これはＬルペド・　ルフオルニ　Ａ　ｃ　Ｃｈ　ｏ　ＰＬのα−１８４−２００並びにＮ −末端を残りのＷ２Ｂ５に誘導したペンタペプチドを含む。

初めのグリシンは、機能的５ｅａ１部位を維持するのに必要なトリヌクレオチドｄＧＧＧの結果である０次の配列ＩＥＧＲは凝析ファクターＸａ（ＣＦ　Ｘ）に対する特定の切断部位である。すなわち、表現溶融蛋白質はこの酵素によって切断できるようになり、それによって関心のある部位、すなわち、１７アミノ酸配列：ＷＫＨＷＶＹＹＴＣＣＰＤＴＰＹＬＤ、の最後の排除が可能となる。２つのヌクレオチドを１：１の割合で混合し、加熱し、そしてアニーリングさせて９− 塩基対：重体を形成した。

次に補足ストランドを第１（２）図に示すようにフレノウポリメラーゼ（１μｍ、５ユニツト）を使って酵素によってｒ満たしくｆｉｌｌｅｄ　　ｉｎ）」、その後ＤＮＡをフェノール抽出し、キャリヤーとしてグリコーゲンを用いてエタノール中に沈澱させた０次に組み立てた物と５ａｉｌ−ｃｕｔ、精製したｐＡＴＨ２表現ベクターとを連結した。アローンハイム（Ａｒｏｎｈｅｉｍ）等の方法［「バクテリアによって表わしたコリン作動性結合部位へのα−ブンガロトキシンの結合の特徴（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｔｈｅＢｉｎｄｉｎｇ　　ｏｆ　　ａ−Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ　　ｔｏ　　Ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ　−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　　Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｅ　　Ｂｉｎｄｉｎｇ　　５ｉｔｅ」、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、２６３．２０：９９３３　９９３７（１９８８）］に従い、連結したベクターをｌ：、ｃｏｌｉ細胞株ＨＢＩＯＩの形質転換に使用した。

適当な配列で挿入体を含む形質転換バクテリアコリンはコロニープロットの１２Ｓ工標ｍＢＴＸオーバーレイによって選んだ。

これらの形質転換は、十分な毒素結合溶融蛋白質（Ｒ４１３７と呼ぶ３６ｋＤａ、第２図）を生成することが分かった。　Ｒ４１３７は形質転換細胞を燐酸塩バッファー＋５００ｍＭ塩中で音波処理することによって高度に富ませることができた。遠心分離で全Ｒ４１３７の４０〜６０％を含むペレットが生じた（第２図Ｐ、）、このベレットを水で抽出すると、主にＲ４１３７である可溶性の留分が得られたく第２図、Ｓ２）。

Ｓ２留分中のＲ４１３７は、ゲルショニー等の方法［「分子デコイ：マウスをキュラリメチイック神経毒から保護するりガント−結合組換え蛋白質（Ｌ　ｉｇａｎｄ−’Ｂ　ｉｎｄｉｎｇ　　ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰ　ｒｏｔｅｉｎｓ　　Ｐ　ｒｏｔｅｅｔ　　Ｍ　ｉｃｅ　　ｆｒｏｍ　　ＣｕｒａｒｉｍｅｔｉｃＮｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ）」、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　（ＬＪ　ＳＡ）、８５　。

４０８７−４０８９（１９８８）］によってそこに結合している毒素を測定することにより、生化学的に特徴づけられる。本質において、Ｓ２のアリコートは！２％Ｉ標１ＢＴＸと共に培養しな。

次にこの混合物を帯電変性メンブランフィルタ−でシ過して結合毒素と遊離毒素とに分離した０次に一過物を放射能について計数した。この方法を使ったところ、４０秒内に５０％が完了、６分後に約９０％が完了する疑似−次速度論で、ＢＴＸがＲ４１３７と結合することが分かった（第３図）、平衡時（反応３０分）の毒素結合の測定から、毒素はＲ４１３７にＫＤ＝１．２×１０’Ｍで結合することが分かった（第４図）、この結合は、無傷の受容体に知られている進行効率と同様な進行効率で、他のコリン作動性リガンドと競い合うことができた（第５図）。

従って、Ｒ４１３７は、アミノ酸配列：ａ　　１８４−Ｔｒｐ　−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｂｒ　−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　−２００がＢＴＸ結合に十分なものであることを示している。この結合は、手を付けていない受容体のものより多少少ないが、ＡｃＣｈｏＲの完全なα−サブユニット（４３７アミノｖｉ）の結合特性と似ている一Ｒ４１３７が神経毒な受けた動物の治療に使うことができるかどうかを立証するために、Ｒ４１３７がＢＴＸの普通のおよび制限されたプールについて、手を付けていないＡｃＣｈｏＲと競い合うことができることを証明する実験を行なった。これを行なうためには、結合ＢＴＸを遊１１ｉＢＴＸか、ら分離するだけでなく、ＡｃＣｈｏＲ結合毒素とＲ４１３７結合毒素との区別をしなければならない、これを行なうため、ＡｃＣｈｏＲをまずコンカナバリン−Ａカラムに結合した。これは毒素結合にほとんどまたは全く効果を及ぼさないことが分かった（第６Ａ図）０次に、このように固定したＡｃＣｈｏＲを異なる濃度のＲ４１３７および一定量の１２１１標識ＢＴＸと混合した。その後、遠心分離／再悲濁を繰り返すことによってカラムを洗浄し、カラムと結合した放射能量を測定しな、（第６図）で分かるように、Ｒ４１３７はＢＴＸＡについてＡｃＣｈｏＲと効果的に競い合う。

最後に、Ｒ４１３７を、生体内でのＡｅＣｈｏＲとの競い合いについて試験した。共に近交系（Ｂａｌｂ／Ｃ）および異交系（ＣＤ１）のオスとメスのマウス（約５週間、２０〜２５９）にまずＲ４１３７まなはプラセボーーー非変性ベクターｐＡＴＨ２で形質転換したバクテリアから誘導した同様な留分くこれらの細胞は毒素結合容量を持たない）−ｍ−を腹膜的注射した。５分後、全てのマウスに種々の量のｄ−ツボクラリンまたはα−コブラドキシン（ＣＴＸ）を与えた。投与量は未処理のマウスの８０％が死ぬ量を標準にした。毒素を動物のえり首に皮下注射して投与した。動物を観察し、毒素の注射後２時間の内に死んだ数を記録した。結果を表１に示す、第７図に示すように、Ｒ４１３７処理したマウスの中の生き残った割合は、対照に較べて著しく改良され１回復したマウスの絶対数はプラセボを与えた場合よりも少なくとも３００％多かった。

Ｒ４１３７１０３マウスにまず致死量のコブラ毒を投与して、１時間後にプラシーボまたはコリン作動デコイアントのいずれかを投与する実験も行った。プラシーボを投与したマウスはいずれも死亡したがコリン作動デコイアントを投与したマウスはかなり致死を免れた（９０％が生存）、結果はまとめて第２表に示した。なお、ＢＴＸ、ＣＴＸおよびｄ−ツボクラリンのいずれもデカトニウムおよび狂犬病ビールスのように同一の受容体サイトを有していることを理解すべきである。

・　　　２１　　　の　　　（Ｒ４１３７（ｄｅｃｏｙａｎｔ）　　　　　　３０　　　　　　　６／１０＾ＴＯＩａｅｅｂｏ　　　　　　　６０　　　　　　　０１０Ｒ４１３７が毒素に対するデコイアントであることが証明されたという事実は、治療薬たる一般的な分子デコイアントに対してのみあてはまる。ＡｃＣｈｏＲ，Ｒ４１３７または上記の分子デコイアントの改良体のような特種なものは、とくにコブラ等のヘビにかまれた場合に毒物中のα−トキシンを阻害し、解毒剤として作用する。また、− 一ツボクラリンは神経筋の遮断剤として外科手術に日常的に用いられており、Ｒ４１３７を基にしたデコイアントは解毒剤としてきわめて有用である。従来技術として記載されるリガンド類を使用するのはその遮断薬を使用するのと同じくらい好ましからぬことである。従って、デコイアントの有用性はかかる場合等に極めて重要であるといえる。

さらに、狂犬病ビールスはとくにＡｃＣｂｏＲと結合しやすく、しかもその結合はｄ−ツボクラリンまたはＢＴＸの存在下でも完全に行われ得るものである（レンツ（Ｌｅｎｔｚ）ら、すΔ≦Ｌン２２゜２１５．１８２−１８４（１９８２））、従って、Ｒ４１３７を基にしたデコイアントはまた、狂犬病の治療剤としても有用であるといえる。

当業者は一般的な操作や化学反応によって、Ｒ４１３７をコリン作動デコイアントとしてより有効なものにすることができると考えられる。従って、Ｒ４１３７はかかる改良を可能ならしめる中間物であることが理解されるべきである。従って、本発明にはＲ４１３７にある特異な１７のアミノ酸配列だけが含まれるのではなく、その機能や薬理的性格を維持して好ましい作用を発揮するように改良を加えた、Ｒ４１３７の改良物や誘導体も含まれる０例えば、天然の受容体に対してより効果的に作用するように、通常の技術を用いてアミノ酸配列を改良し、製造物について好ましい毒素結合性の試験することが簡単にできる。このような改良の方法として、アミノ酸の置換、削除、挿入や化学修飾が挙げられる。これらの方法によれば、例えば、比較的長期間効果を有するデコイアントを調製することができる。デコイアントがインビボで酵素による劣化を受けると、あるものは効果持続期間が比較的短くなる。このような劣化を防ぐための手段としてｄ−アミノ酸を含む合成ペプチドをつくる方法がある。また、毒素との間に機能的な界面を形成するというデコイアントに対する物理化学的要請を満たすために、融合蛋白ブループリント、有機分子（すなわち非蛋白）を基にしたものをつくることもできる。

また、薬物を合成しやすくしたりデコイアントにさらに別の機能を付加するために、本発明のデコイアントのペプチド鎖を長くしたり、特種な化学構造部分を付は加えたりすることもできる。かかる改良の手段として、溶解性を改良するために、特定の化学構造部分を付は加えてペプチド鎖を延ばす方法がある。

例えば、セリン等の親木性残基やグルタミン酸等のｔ′Ｒを有する残基を付は加えることができる。さらに、デコイアントを安定化した上、所望のコンホーメーションで保存するために、デコイアントにシスティンを付は加えてジスルフィド結合を形成させることもできる。

デコイアントを修飾するもう１つの理由は、デコイアントを投与した後でさえ検出可能にするためである。これは、放射性ヨウ素同位元素による放射性ヨウ素化によって直接に、あるいは、続く放射性ヨウ素化のためにチロシンを添加することによって行うことができる。そのような検出可能なデコイアントを使用して特定の病原体またはトキシンの存在および／まなは位置を検出できた。たとえば、犬による咬傷部分におけるＲ４１３７の蓄積は狂犬病ウィルスの存在を示すであろう、このように、検出可能なデコイアントを特定の外来物質の選択的検出および存在位置の決定またはそのような物質の侵入を診断するのに使用できた。

デコイアントを修飾するもう１つの理由は、共役外来物質の体からの浄化を促進することである。たとえば、アシアログリ゛コ一部分に結合したデコイアントは肝臓によって浄化されよう。

このように、たとえば、抗癌化学療法剤の受容部位を擬態し、そのようなアシアログリコ一部分またはその浄化を助ける他の部分を有するデコイアントを使用して、治療が完了した後過剰の化学療法剤を不活性化し、すばやく除去することにより副作用を低下させることができよう。

インビボでのトキシンに対するデコイアントとしてのＲ４１３７の効果を証明することによって、本発明の一般的概念の応用可能性が確立する。よって、本発明はコリン作動性結合部位にもとづくデコイアントのみでなく、内生受容体への結合後にのみ望ましくない作用を示す外来物質に対する内生受容体にもとづくデコイアントをも包含することを理解されたい０本発明によるデコイアントの第一の要件は、内生受容体の疑似物であること、すなわち、物理的には異なるが結合部位と機能が似ていることである。「機能が似ている」とは問題となっている外来物質に対してデコイアントが選択的かつ特異的に適当な親和性を以って結合することを意味する０本発明の目的のために、受容体は、たとえば従来の：ｔａｙｍ表面受容体のリガンド結合部位、酵素の基質結合部位、ガングリオシドのリガンド結合部位等としての何らかのりガント−結合分子であり得る。。

しかし、本発明のデコイアントは免疫グロブリンまたは免疫グロブリン類から誘導されるものではあり得ないことを理解されない、病原物質の「結合領域」に対する免疫グロブリンは一般に誘引物（ｄｅｃｏｙ）として機能できようが、そのようなものは本発明の概念に含まれるものとはみなされない。

本発明のデコイアントは実質的に免疫原性であってはならない、そのサイズを小さくすることは、物質の免疫原性を減少させる手段であるが、かならずしも大きな分子すべてがいくつかの小さな分子の免疫原性と同程度であるとはかぎらない０本発明によるデコイアントとして分類されるためには、物質はそのサイズにかかわりなく宿主の系中で実質的に非免疫原性でなければならないが、可能なかぎり最小のサイズが好ましい。しかし、デコイアントは、インビボで投与されたとき内生受容体に対して自己免疫応答を示すのに充分非免疫原性であることがとても重要である。コリン作動性受容体の場合、そのような自己免疫応答は重症筋無力症を生起せしめるかもしれない。

本発明のデコイアントは受容体の結合部位の必須要素から成るものであって、それ以外は実質的に含まない０本発明の目的のために、結合部位の「必須要素」とは、デコイアント活性に必須の要素であって、リガンド認識および結合である。

受容体は多くの残基から構成され、そのいくつかのみがリガンド認識と結合に係わる。しかし、上述の如く、本発明のデコイアントはドラッグデザインのためにさらに修飾できる。たとえば、ＡｅＣｈｏＲのα−サブユニット全体はデコイアントとして作用できないであろうが、免疫原性であると同時に、必要とされるよりかなり長い、しかし、α−サブユニットはデコイアントのデザインと構成に必要な潜在的情報、すなわち配列α−１８４−２００を含有する。いくつかの付加ペプチドユニットが存在することにより、たとえば必須の配列の溶解性を改善できるという事実は、その構造が実質的に非免疫原性で、選択的、特異的であり、適当な親和性を有する限り、デコイアントのカテゴリーから該構造を除外することはないであろう、糖分子の付加は同じ効果を伴う修飾であり得よう、かくして、ドラッグデザインのための分子の付加は、本物質が、問題となっている外来物質に対する結合のために必要とされる内生受容体の要素以上のものを実質的に含有しているか否かを決定するときには考慮されない。

前述したように、デコイアントはそれ自身がデザインされている物に関して選択的、特異的、且つ適切な親和性を有した物でなければならない、従って、例えば、マンノースは単なる糖類であるが、タイプ−Ｉマンノース特異的ビリを持つ細菌による感染を妨げることができる；しかじ、マンノースの選択性は十分ではなく、且つその親和性もない。

デコイアントは望ましくない影響を有する侵入異物を捕獲する（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）ようにデザインされている薬剤である。その異物には、トキシン、毒物、細菌、レトロウィルスを含むウィルス等が含まれている。異物が宿主中の受容体部位に結合した後のみにその病原性もしくは毒性影響（又は除去することが望ましいその信金ての影響）を発揮する場合には、デコイアントはそのような結合を阻止し、そしてそれによりそのような望ましくない影響を除去することができるように本発明に従ってデザインされることができる。リガンド結合部位を含んでいるそのような受容体画分はインビボ（ｉｎ　　ｖｉｖｏ）でリガンドと競合的にまだ結合することができるという事実及び本発明の方法が一旦理解されたならば、当業者は他の受容体由来のデコイアント（他の病原性物及びトキシンに結合するようにデザインされている）を慣用的な方法のみを用いて得られることが理解できるであろう。

本発明に従ってデコイアントが既に得られている病原性の物−受容体の対の中にはＴ細胞表面糖蛋白質ＣＤ４（Ｔ４）があり、それはヒト免疫不全症ウィルス、タイプ１（ＨＩＶ−１）（後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を起こすウィルス属の最初のメンバーである）についての細胞性受容体である。ＨＩＶウィルスの感染はそのエンベロープ蛋白質（ｇｐ１２０）がＴリンパ球上にあるＴ４受容体（ＣＤ　４　’）に結合することを介して開始される。

ＣＤ４の可溶性である分泌型はＨＩＶ−１に競合的に結合させるのに使用でき、そしてそのようにしてＨＩ　Ｖ　−１の感染性を中和する（スミス（Ｓｓｗｉｔｈ）ら、“ＣＤ４抗原の可溶性、分泌型によるＨＩＶ−１感染性の阻止（Ｂ　ｌｏｃｋｉｎｇ　　ｏｆ　　ＨＩ　Ｖ　−ＩＩｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　　　ｂｙ　　　ａ　　　５ｏｌｕｂｌｅ、５ｅｃｒｅｔｅｄ　　　Ｆｏｒｔｈ　　　ｏｆ　　　ｔｈｅＣＤ　４　　Ａｎｔｉｇｅｎ）″、サイエンス（Ｓｅｉｅｃｅ）、２　Ｂ　８　、１７０４−１７０７（１９８７））ことが最近確認された。インタクトＣＤ４はその大きさから判断すると本発明のデコイアントではないであろう、しかしながら、それはデコイアントの本質は含んでいる。ＣＤ４の最小結合ドメインはコリン作動性の受容体に対する最小結合ドメインに達するなめにここで述べられている手段、例えば蛋白質分解及び蛋白質プロット及びそれに続く組み換えＤＮＡ手法などの手段による慣用的方法のみを使用して同定することができる。

本発明のデコイアントの調製に特に適したその他のりガント−受容体対は有機リン酸−アセチルコリンエステラーゼである。

そのような囮（デコイ）は神経ガスの影響の一部を和らげる。他の例はＬＳＤ及びセロトニン受容体及びストリキニン及びグリシン受容体である。

第３表は、慣用的方法のみを用いて本発明のデコイアントをデザインすることのできるその他のりガント−受容体対を示している。

第３表 ”！”）’　　　　　　　　　　ｒμ（−カルシウム　　　牛小脳及び腎臓の２８ｋＤｉのカルモジュリンヘパリン　　　　ヒト血漿の１ｐｏＥ及びａｐｏＢ本発明のデコイアントは、それがデザインされているＢ物の望ましくない影響を改善するためにヒト思考を含む動物に投与することができる。このデコイアントはヒトの治療のみならず、ホ乳顕、家禽類、魚類等を含む他の動物の治療についても使用することができる。更に、本発明のデコイアントは植物の治療、予防用にデザインすることもできる。侵入した異物の治療についての特定の有効な投与量は余分な実験をせずに当業者により経験的に容易に決定されるであろう、しかしながら、当業者はデコイアントの投与量は宿主系中の異物の量に依存していることが理解できるであろう、デコイアントと異物分子の比率は好ましくは１：１〜１：１０の範囲である。動物試験の結果は、過剰のデコイアントは効力を高めるのに必要ではないことを示した。好ましくは、宿主の血流中における異物（ｆｏｒｅｉｇｎ　　ａｇｅｎｔ）の量を監視しながら、治療中においてその量に応じてデコイアントの薬用量を調節するのが良い。

本発明の範囲に包含される組成物には、デコイアントがその意図した目的を達成するために有効な量存在するような種々の組成物が含まれる。デコイアントの有効量の決定は、当業界の慣用手段によって当業者が必要に応じて適宜なし得る技術事項本発明のデコイアントに加えて、本発明による薬剤組成物は、種々の賦形剤や様々な補助剤（ａｕｘｉｌｉａｒｙ）からなる薬剤学的に許容される種々の担体（ｃａｒｒｉｅｒ）を含有していてもよい、これらの担体は、有効成分を薬剤学的に使用し得る製剤＜ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の形に加工することを容易にする。製剤、特に注射用の製剤は、約０．１ないし９９重量％の有効成分、望ましくは約２５ないし８５重量％の有効成分を賦形剤とともに含有しているのが好ましい。

本発明のデコイアントを投与する場合には、従来のいかなる投与方法を利用しても良い、好ましい投与形態は、注射、例えば静脈内注射、皮内注射、腹腔的注射等、による方法であるが、経口投与、坐剤としての投与又はその他のいかなる方法によっても良い。

上記従来方法によらない、他の投与手段であって本発明の範囲に含まれるものも考えられる０例えば、バクテリア由来の有効成分の圧出（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に対する現行のシステム（ｓｙｓｔｅｍ）には、バクテリアの圧出ベクターｐＡ　Ｔ　Ｈ２（ｂａｃｔｅｒｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　　ｖｅｅｔｏｒ　　ｐＡ　Ｔ　Ｈ２）があるが、実際に培地（ｍｅｄｉａｍ）中に圧出それた蛋白質（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　　ｐｒｏｔｅｉｎ）を分泌するバクテリア圧出システム（ｂａｃｔｅｒｉａｌ　　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　　ｓｙｓｔｅｍ）というものもいくつか存在する。したがって、デコイアントを生体外で（ｅｘ　　ｖｉｖｏ）製造して宿主に投与するという方法よりもむしろ宿主の生体内でデコイアントを産生ずるためにこのような分泌圧出システム（ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　　ｓｙｓｔｅｍ）を使用することができるのではないかと考えられる。この分泌システムは宿主と適合しなければならないことは明白である０本願明細書の詳細な説明の項及び特許請求の範囲の項で使用している「投与（ａｄ＋＊１ｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）　Ｊという用語には、このような生体内（ｉｎ　　ｖｉｖｏ）分泌システムも包含されている。

本発明の製剤は、それ自体公知の、例えば従来技術による混合方法、溶解方法又は凍結乾燥方法によって製造することができる。非経口投与のための適切な処方例として、有効成分を水溶性の形にした水溶液が挙げられる。また、注射用として適切な油性懸濁液として有効成分の懸濁液を投与しても良い、適当な親油性溶媒又は賦形薬（ｖｅｈｉｃｌｅ）の例としては、ゴマ油のような脂肪油又はオレイン酸エチルもしくはトリグリセライドのような合成脂肪油が挙げられる。水性懸濁注射剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／スはデキストランのような懸濁液の粘性を増加させる物質を含んでｔ）て・も良い、また、水性懸濁注射剤は、所望により安定化剤を含んでいでも良い０本発明のデコイアントは、また、リポソーム（Ｉ　ｉｐｏｓｏｍｅ）の形態で投与しても良い。更に、本発明のデコイアントは、脂質の層に付着する水性包囲層（ａｑｕｅｏｕｓ　　ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｌａｙｅｒ）からなる微粒子（ｃｏｒｐｕｓｃｌｅ）に分散されたか、もしくは様々な状態で存在している（νａｒｉｏｕｓｌｙ　　ｐｒｅｓｅｎｔ）有効成分の薬剤組成物という形で投与しても良い、この場合、有効成分は、水性層及び脂質の層の両方に存在している可能性もあるし、又は、いずれにしても、リポソーム懸濁液（ｌｉｐｏｓｏ＋ｍｉｃ　　５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）として一般に公知である不均一系（ｎｏｎｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ　　ｓｙｓｔｅｍ）に存在していると言える。

上記した本発明の具体的な実施態様によって、本発明の一般的な本質が充分に開示されたものと考えられる。故に、当業者であれば現在の当該技術分野の知識を利用することによって、様々な応用を目的として、本発明の包括的該念から逸脱することなく、上記の開示された具体的実施態様を容易に一部改変したり（＠ｏｄｉｆｙ）、新たな必要性や条件に合うように変更を加えたり（ａｄａｐｔ）できるはずである、したがって、このような変更（ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）及び一部改変（ｍｏｄｉｆ　ｉ＋：ａｔｉｏｎ）は、上記の開示された本発明の実施態様の均等の範囲内に包含されるものと認められる。なお、本明細書中で使用した言い回しくｐｈｒａｓｅｏｌｏｇｙ）及び専門用語（ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ）は、単に本発明の説明のために使用したものであって、本発明を限定する意図はないことが理解されるべきである。

浄書（内容に変更なし） ′：　　　　　　　　＆　　　　　　　　２３２Ｐ２Ｓ、　　　Ｐ、　　Ｔ茸３へ図前聞（躬奴＋　ＢＴ　Ｘ　（ｎ　Ｍ　）Ｒ４１３７（、ａｌ）手続補正書（旗）平成　２年　５月２３日特許庁長官　　吉　１）文毅　殿２、発明の名称分子状デコイアント及びその使用方法３、補正をする者氏　名　　ガーショニ、ジョナサン・エム４、代理人住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正命令の日付　　平成　１年１２月１９日　（離日）６、補正の対象（１）委任状及び翻訳文（２）タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文国際調査報告 −一一〜１＾紳−罪一−？αυ−５ε８１０２９９１

Claims

【特許請求の範囲】１．内因性レセプタと最初に結合した後でのみ好ましくない作用を及ぼす異物に対する内因性レセプタに機能的に似ている化学構造を有する物質からなる分子状デコイアントであって、当該デコイアントは免疫グロブリンでもなく、また免疫グロブリンの誘導体でもなく、次の（１）ないし（３）からなるグループから選択された物質であることを特徴とする分子状デコイアント。（１）生体内に投与された時に天然の内因性レセプタに対する自己免疫応答を引き起こさないように充分小さくした部分片に、又は、実質的な免疫原性を欠いているが当該内因性レセプタヘの結合部位となる必須要素は保持している部分片に、当該内因性レセプタを物理的に分割することによって当該内因性レセプタから得られる物質。（２）化学合成及び／又は組換えＤＮＡ技術により上記物資（１）から得られたものであって、上記内因性レセプタとの機能的類似性を有する化学配列。（３）上記機能的類似性に影響を与えず、薬剤学的に許容されるアクセサリー・モイエッティが上記物質（１）又は（２）に付加されている物質。２．上記物質（１）又は（２）は、上記レセプタの結合部位となる必須要素を保持するために必要とされる大きさよりも実質的に大きくない、請求項１記載の分子状デコイアント。３．上記内因性レセプタはコリン性レセプタであり、上記異物はクラーレ様作用を有する神経毒である、請求項１記載の分子状デコイアント。４．上記内因性レセプタはニコチン様のアセチルコリン・レセプタであり、上記異物はα−ブンガロトキシン、コブラトキシン、ｄ−ツボクラリン、デカメトニウム又は狂犬病ウィルスである、請求項１記載の分子状デコイアント。５．上記内因性レセプタはリンパ球のＴ４細胞抗原であり、上記異物はＨＩＶウィルスである、請求項１記載の分子状デコイアント。６．生体内に投与された時に天然の内因性レセプタに対する自己免疫応答を引き起こさないように充分に小さくした部分片に、又は、実質的な免疫原性を欠いているが当該内因性レセプタヘの結合部位となる必須要素は保持している部分片に、当該内因性レセプタを物理的に分割することによって当該内因性レセプタから得られる物質が分子状デコイアントである、請求項１記載の分子状デコイアント。７．分子状デコイアントが組換えＤＮＡ技術によって遺伝子工学的手法で製造された細胞により圧出されたペプチド鎖である、請求項１記載の分子状デコイアント。８．分子状デコイアントが合成ペプチドである、請求項１記載の分子状デコイアント。９．次のアミノ酸配列、【配列があります】を含む分子状デコイアント、又は、当該アミ酸配列の一部を変えたものであるが、クラーレ様作用を有する神経毒に対する当該アミノ酸配列の結合特性と少なくとも同等の当該神経毒に対する強力な結合性を維持している分子状デコイアントである、請求項３記載の分子状デコイアント。１０．人間を含む動物の体内に入って内因性レセプタと最初に結合した後でのみ好ましくない作用を及ぼす異物に対する当該内因性レセプタに機能的に似ている、請求項１記載の分子状デコイアントを、当該異物による悪影響を軽減するのに充分な量投与することを特徴とする、内因性レセプタと最初に結合した後でのみ好ましくない作用を及ぼす異物が体内に入った人間を含む動物の治療方法。１１．上記異物が蛇毒トキシンである、請求項１０記載の治療方法。１２．上記異物が狂犬病ウィルスである、請求項１０記載の治療方法。１３．上記異物がＨＩＶウィルスである、請求項１０記載の治療方法。１４．内因性レセプタと最初に結合した後でのみ好ましくない作用を及ぼす異物が体内に入った人間を含む動物の治療用薬剤組成物であって、当該異物の悪影響を軽減するのに効果的な量の請求項１記載の分子状デコイアントと薬剤学的に許容される賦形剤とからなることを特徴とする当該薬剤組成物。