FI100169B - Menetelmä molekulaarisen syötin valmistamiseksi - Google Patents

Description

100169 MENETELMÄ MOLEKULAARISEN SYÖTIN VALMISTAMISEKSI Keksinnön alue Tämä keksintö koskee menetelmää farmaseuttisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa menetelmässä valmistetaan yhdiste, joka vaikuttaa vieraan aineen aiheuttaessa ei-toivotun vaikutuksen sitouduttuaan endogeeniseen reseptoriin.

Keksinnön tausta

Monien patogeenisten ja toksisten aineiden kuten virusten, bakteerien ja myös toksiinien ja myrkkyjen on aiheuttaakseen vaikutuksensa elävässä kehossa jouduttava kosketuksiin spesifisiin sitoutumiskohtiin, esimerkiksi solupinnan reseptoreihin. Tällaiset sitoutumisilmiöt saattavat olla välttämättömiä ensimmäisenä vaiheena viraalisessa tarttumisessa tai ne saattavat olla välttämättömiä fysiologisen toiminnon toksiselle inaktivoinnille. Reseptori on solukomponentti, joka on vuorovaikutuksessa spesifisen ligandin kanssa. Agonisteiksi luokitellut ligandit aktivoivat reseptoreihinsa sitoutuneena efek-torijärjestelmän ja laukaisevat biovasteen. Antagonisteiksi luokitellut ligandit alentavat reseptoreiden toimintaa tai estävät agonistin toiminnan. Kun esimerkiksi kobran myrkky tai kurare kiinnittyy kolinergiseen reseptoriin, estyy asetyyliko-liinin sitoutuminen. Tällaisten määrättyjen ligandi/reseptori- ;·. kompleksien muodostumisen estäminen olisi eduksi taistelussa * « · patogeenisten tai toksisten aineiden haitallisia vaikutuksia • · · vastaan.

• » • « • · # • · ♦

Kompleksinmuodostuksen esto on saavutettavissa joukolla perus- .·;·. teiltään erilaisia lähestymistapoja. Esimerkiksi antitoksiini-• · · ... . seerumivasta-aineiden muodostaminen on osoittautunut käyttö-• ·· kelpoiseksi lähestymistavaksi käärmeenpistojen hoitoon. Virusten ja bakteerien immunologinen inaktivointi on rokotuksen perusta. Molemmissa näistä tapauksista hyvin stereospesifiset immunoglobuliinit pidättävät sisälle soluttautuvan aineen, 2 100169 mikä puolestaan ehkäisee ainetta saavuttamasta vaikutuskoh-taansa.

Vaihtoehtoisesti on äskettäin esitetty toisenlainen lähestymistapa, jonka mukaan käytetään vieraalle aineelle analogista materiaalia esimiehittämään isäntäreseptorin sitoutumiskohta, ja siten ehkäistään virusten ja bakteerien liittyminen kudokseen, jonka ne tavallisesti tartuttaisivat. Näillä tunnetuilla lähestymistavoilla on eräitä perustavaa laatua olevia haittoja. Immunologinen inaktivointi on "ligandispesifistä". Edelleen monilla bakteereilla ja viruksilla on kyky ajoittain muunnella immunogeenistä ilmiasuaan randomtyyppisillä mutaatioilla ja uudelleenjärjestymistavoilla, mikä tekee immunoglobu-liinin tehottomaksi. Ligandianalogien käyttö on "reseptoris-pesifistä". Määritelmän mukaan sellaiset analogit miehittävät reseptorin ehkäisten sen toiminnan.

Tämä keksintö käyttää uutta lähestymistapaa ongelmaan sellaisten ligandi/reseptori-kompleksien muodostumisen estämiseksi, lähestymistavan ollessa "reseptorispesifinen", ehkäisemättä perustilaisen reseptorin toimintaa.

; ‘ Keksinnön yhteenveto Tämän keksinnön kohteena on poistaa tekniikan tason haitat.

• · * • · · V : Tämän keksinnön on antaa käyttöön uusi lähestymistapa ligan- :·. di/reseptori-kompleksien muodostumisen ehkäisemiseksi, joka • · · lähestymistapa on "reseptorispesifinen" muttei ehkäise resep- • · torivaikutuskohtien toimintaa.

»M • » · • · · • · !/.! Keksinnön kohde on lisäksi antaa käyttöön molekulaariset syötit, jotka eivät ole olennaisesti suurempia kuin perustilaisen reseptorin ligandinsitoutumiskohdan molekulaarinen rakenne, ja jota voidaan käyttää sitomaan patogeenisiä tai toksisia aineita in vivo "kohdespesifisellä" tavalla. Eli ne ovat tarpeeksi 3 100169 pieniä ollakseen olennaisen ei-immunogeenisiä ja jotka toimivat syötteinä in vivo kilpailemaan luonnollisten sitoutumiskohtien kanssa ja sieppaamaan spesifiset ligandit ja inakti-voimaan ne.

Nämä ja keksinnön muut kohteet tulevat paremmin ymmärretyiksi tutkittaessa seuraavaa yksityiskohtaista edullisten suoritusmuotojen kuvausta oheisten piirrosten kanssa.

Keksinnölle on tunnusomaista se, että menetelmä käsittää seu-raavat vaiheet: 1) liuotetaan endogeeninen reseptori, jonka jälkeen proteeni-karkoituksella valitaan mainitun reseptorin pienin osa, joka tarvitaan endogeenisen reseptorin sitoutumispaikan elementtien säilyttämiseksi, säilytetään reseptorin kyky tunnistaa valikoivasti ja spesifisesti vieras aine ja sitoutua siihen affi- . niteetilla, joka estää vieraan aineen sitoutumista mainittuun endogeeniseen reseptoriin; 2) syntetisoidaan kemiallisesti ja/tai rekombinaatti-DNA-tek-• niikan avulla yhdiste, jonka kemiallinen rakenne vastaa olen- naisilta osin mainitussa vaiheesa 1) valittua yhdistettä, joka

! I [ I

;, tunnistaa valikoivasti ja spesifisesti vieraan aineen ja si-v'' toutuu siihen, yhdisteeseen lisätään edullisesti farmaseuttisesti hyväksyttävä lisäosuus, joka ei vaikuta yhdisteen kykyyn : '·1 tunnistaa vieras esine ja sitoutua siihen.

··· • · · • · · :·. Uusi ratkaisu ligandi/reseptori-kompleksienmuodostumisongel-• «· maan, kun ligandi on vieras aine, joka saa aikaan ei-toivotun • · vaikutuksen liittymällä spesifisesti endogeeniseen reseptoriin käsittää ligandin sitoutumiskohdan molekyylirakenteen identi-• · i/.i fioimisen perustilaisessa reseptorissa ja matkivien ligandin-sitoutumiskohtien tuoton. Näitä kohtia saatetaan käyttää in vivo sitomaan toksiineja tai viruksia tai mitä hyvänsä muita vieraita aineita "kohdespesifisesti". Siten tämän keksinnön matkivat ligandin sitoutumiskohdat kilpailevat eläimen kehon luonnollisten sitoutumiskohtien kanssa toimien siten syöttei- 4 100169 na. Tämän keksinnön tekijä on nimittänyt sellaiset aineet "molekulaarisiksi syöteiksi".

Uskotaan, että luonnolliset reseptorit ovat melko suuria rakenteita käsittäen muutamia satoja aminohappoja, ja ne saattavat olla niin suuria kuin molekyylipainoltaan noin 25.000. Spesifinen sitoutumiskohta on kuitenkin paljon pienempi ja tämä luo mahdollisuuden valmistaa keinotekoisia, synteettisiä sitoutumiskohtia, jotka ovat tehokkaita sitomaan määritettyjä viruksia, bakteereja, toksiineja jne., mutta jotka silti käsittävät paljon pienemmän lukumäärän aminohappoja, edullisesti alle 100, ja joilla on sen vuoksi merkittävästi pienempi mole-kyylipaino ja siten vastaavasti pienempi immunogeenisuus. On havaittu mahdolliseksi valmistaa sellaisia sitoutumiskohtia matkivia molekulaarisia syöttejä, jotka ovat mukautuneet sitomaan spesifisiä ligandeja, ja joiden koko on luokkaa 20 aminohappoa. Tällaiset melko pienet peptidirakenteet voidaan valmistaa fysikaalisesti jakamalla endogeeninen reseptori tai ne voidaan valmistaa synteettisesti peptidikemian preparatiivi-:silla tavoilla, kuten Merrifield-synteesillä, tai geenitekno-logialla. Tämä luo mahdollisuuden tällaisten polypeptidiraken- teiden suuren mittakaavan tuotantoon, ja niiden käyttöön vaikuttavina aineina hoidettaessa eläimiä, jotka ovat joutuneet alttiiksi patogeenisille tai toksisille aineille.

* * · • · · • · ·

« « I

·. Koska molekulaariset syötit sitoutuvat ligandiin samassa koh-• · j dassa, jonka ligandi tarvitsee sitoutuakseen endogeeniseen res’": septoriin joka tarvitaan saamaan aikaan sen ei-toivottu vaiku- · i tus, ei ligandi pysty muuttamaan tätä kohtaa deaktivoitumatta.

• · · * · · ’ , Siten syötit ovat paljon luotettavampia kuin immunoglobuliinit • · · '· *· ja niillä on pitkäkestoinen vaikutus.

Tätä keksintöä voidaan soveltaa laajalla alalla, koska on mahdollista tuottaa molekylaarisia syöttejä, jotka ovat spesifisiä laajalle joukolle ligandeja. Tämä keksintö käsittää ennaltaehkäisevät kuten myös terapeuttiset koostumukset, jotka si- 5 100169 sältävät vaikuttavat molekulaariset syöttirakenteet riittävässä konsentraatiossa ja määrässä.

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuvassa 1 esitetään menetelmävaihe 17 aminohappojakson WKHWVY-YTCCPDTPYLD:n saamiseksi yhdistelmä-DNA-teknologialla.

Kuvassa 2 esitetään tulokset erilaisten trpE-fuusioproteiinien indusoimiseen viljeltyjen R4137-kloonin näytteiden erotuksesta polyamidigeeleillä. Solut joko liuotettiin näytepuskuriin (T) tai sonikoitiin paljon suolaa sisältävässä puskurissa (500 mM) ja sentrifugoitiin. Supernatantti (Si) sisälsi 40 - 60 % fuu-sioproteiinia ja muodosti pelletin (Pi). Pellettiä uutettiin edelleen vedellä supernatantin (Se) muodostamiseksi, joka sisälsi noin 15 % alkuperäisestä fuusioproteiinista, ja pelletin . (Ρε). Polyamidigeelielektroforeesin (PAGE) jälkeen näytteet ♦ 1 · '1 joko värjättiin Coomassie kiiltävänsinisellä (yllä) tai peitettiin (blotted) ja päällystettiin 1SSI-leimatulla a-bungaro-’· ·1 toksiinilla (BTX), jonka seurasi autoradiografinen määritys V : (alla). Nuolenpäät ilmaisevat fuusioproteiinin aseman. Nume- V · rot ilmaisevat suhteelliset moolipainot yksikössä kDa.

Kuva 3 on graafinen esitys erityisinä aikoina (C1) sitoutuneen :·. toksiinin konsentraatiosta jaettuna tasapainokonsentraatiolla • · · (C-c,) R4137:n inkuboinnin jälkeen 1H=5I-leimatulla BTX:llä eri- * 1 · laisia osoitettuja aikoja. Konsentraatiot mitattiin tasamää- • i * · • 2 rien lisäämisen jälkeen positiivisesti varatuille membraani- • · · l...: suodattimille. Aika mitattiin minuutteina taulussa A ja sekun- teinä taulussa B.

• · · · 2 • · · • «·

Kuva 4 on graafinen esitys Scatchard-analyysistä toksiinin sitoutumisesta R4137:ään. 1 1-leimatun BTX:n tasapainon saavut tamiseen asti (30 min) inkuboinnin jälkeen erilaisilla kon-sentraatiolla sitoutuneen BTX:n nettomäärä määritettiin lisäämällä 1000-kertainen ylimäärä ei-radioaktiivista BTX:ää ja 6 100169 sitoutunut/vapaa toksiini laskettiin joka pisteelle.

Kuva 5 on graafinen esitys BTX:n kompetitiivisesta sitoutumisesta. 18831-leimatun BTX:n (2*10-a M) prosenttiosuus kuvattiin sen jälkeen kun oli sekoitettu seuraavien aineiden kasvavien konsentraatioiden kanssa: leimaamaton BTX:ää (·), kobratoksii-ni (Δ ), dekametonium (O), d-tubokurariini (O), NaCl (D), kar-bamyylikoliini (X) tai glysiini (f). Seoksia inkuboitiin tasa-määrillä R4137:ää 30 min 25 °C:ssa ja sitten mitattiin sitoutuneen radioaktiivisen toksiinin nettomäärä.

Kuva 6Ä on graafinen esitys sitoutuneen 1βϊ5Ι-leimatun BTX:n määrästä funktiona kokonaismäärästä iesI-leimattua BXT:tä, joka lisättiin immobilisoitua AcChoR:ää sisältävään konkanava-1iini-A-kolonniin.

. Kuva 6B on graafinen esitys immobilisoitua AcChoR:ää sisältä-·;; · vään konkanavaliini-A-kolonniin sitoutuneen iesI-leimatun '· ' BTX:n määrästä funktiona kolonniin lisätyn R4137:n määrästä sen jälkeen kun kolonniin oli lisätty erilaisia määriä

• I

R4137:ää ja vakiomäärä *»=i-leimattua BTX:ää.

:V: Kuva 7 on graafinen esitys R4137:n vaikutuksesta d-tubokura- riiniruiskeen saaneiden hiirien eloonjäämistiheyteen. Kaksi ryhmää Balb/C-hiiriä (35 kummassakin) ruiskutettiin joko • ·· pÄTH2:lla tai R4137: llä (suunnilleen 3 nmol BXT sitoutumiskoh- • · « tia/hiiri) vatsaontelonsisäisesti. Viisi minuuttia myöhemmin ·· : *·· hiirille annettiin d-tubokurariinia (suunnilleen 15 nmol, 9

Mt ug/hiiri, ihonalaisesti). Eloonjääneiden lukumäärä ajan funk-tiona ruiskeen antamisen jälkeen on esitetty (tiedot ovat tau- • · · • . lukon 1 kokeista 2 ja 3).

* 0 · • *♦ • ·

Yksityiskohtainen kuvaus edullisista suoritusmuodoista

Vaikka tämä keksintö on sovellettavissa molekulaarisille syöteille, jotka matkivat minkä hyvänsä endogeenisen reseptorin 7 100169 sitoutumiskohtaa, se selostetaan yksityiskohtaisesti koliner-gisen sitoutumiskohdan suhteen. Tiedetään, että a-bungarotok-siini (BTX), joka on käärmeenmyrkyn a-neurotoksiini, saa toksisen vaikutuksensa aikaan salpaamalla koliergisten ligandien sitoutumisen nikotiiniseen asetyylikoliinireseptoriin (AcC-hoR) .

Neuromuskulaarinen liitos on kohta, jossa hermot kohtaavat lihassäikeet. Kosketuskohta on synapsi, ja sille on luonteen- Λ omaista se tosiseikka, että hermo ja lihas eivät tosiasiassa ole fyysisessä yhteydessä, vaan muodostavat paremminkin kemiallisen liitoksen. Kun hermoimpulssi saavuttaa aksonin kärjen, erittyy hermon ja lihaksen väliseen aukkoon, se on, "sy-napsirakoon" asetyylikoliinia, neurotransmitteria. Asetyylikoliini sitoutuu reseptoriinsa, joka sijaitsee lihaksen solukalvon pinnalla liitoksen postsynaptisella puolella. Kahden ase-tyylikoliinimolekyylin sitoutuminen reseptoreihinsa saa aikaan ionikanavan aukeamisen, kalvon depolarisoitumisen ja johtaa mahdollisesti lihassupistukseen.

BTX on antagonisti, joka sitoutuu AcChoR:ään ehkäisten siten asetyylikoliinia saavuttamasta reseptoriaan ja ehkäisten li-hassupistuksen. Molekulaarin syötin tekemiseksi BTX:lie altistettujen eläinten hoitoon on ensin identifioitava erityinen i’·.. BTX:n sitoutumiskohta. Edullinen tapa tämän tekemiseksi on :*Γ: ligandinpeittoproteiinikartoitus (ligand overlay of protein ψ ./ blots). Kun sitoutumiskohta kerran on identifioitu, voidaan « · *t<** tuottaa matkiva jakso. Sellaista jaksoa lisättäessä syötti J * *··' matkii sitoutumiskohtaa ja sitoutuu BTX:n kanssa salvaten j*·’: siten toksiinin ei-toivotun vaikutuksen.

» • * « · BXT:n spesifisen sitoutumiskohdan AcChoR:llä tiedetään sijaitsevan sen α-alayksikössä. Vähimmäisvaadittavat sitoutumiskohdan osaset, jotka edelleen mahdollistavat valitsevan ja spesifisen sitoutumisen kohtuullisella affiniteetilla BTX:ään voidaan tunnistaa edelleen proteiinikartoituksen avulla. Pro- 8 100169 teiinikartoitustekniikat on käsitelty yksityiskohtaisesti Gershoni, "Protein Blotting: A Manual" teoksessa Methods of Biochemical Analysis, toimittanut David Glick, John Wiley &

Sons, osa 33, s. 1 - 55, 1988, jonka sisältö liitetään tähän kokonaisuudessaan viitaten. Menetelmä käsittää hajotettujen polypeptidien siirron kromatografiageeleistä immobilisointike-hikkoihin.

BTX on polypeptiditoksiini (74 aminohappotähdettä), joka voidaan jodata ja joka sitoo reseptorin affiniteetilla Kd = 10-11 M. Puhdistettu AcChoR ajetaan polyakryyliamidigeelielektrofo-reesilla (PAGE) lievästi denaturoiden keittämättä näytettä ja litiumdodekyylisulfaattia (SDS) käyttäen. Sitten valmistetaan täplät ja testataan sitten 1£5SSI-leimatulla BTX:llä. Tällaiset kokeet osoittavat, että AcChoR:n a-alayksikkö leimautuu (Gershoni et ai, "Binding of α-Bunarotoxin to Isolated α-Subunit of the Acetylcholine Receptor of Torpedo californica: Quan-titative Analysis with Protein Blots", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80: 493-4977 (1983)). Tämän jälkeen α-alayksikkö pro-: teolysoidaan ja sitten sen proteiinitäplät testataan alkaali- nen fosfataasihydratsidilla, konkanavaliini-A:11a, BXT ja jaksospesifisillä vasta-aineilla, jotka yhdessä mahdollistavat ·, toksisen sitoutumiskohdan kartoituksen alueelle a-160-330 ja erityisemmin a-160-210 ja yhä erityisemmin alueelle a-180-200 (katso Neuman et ai, "Mapping of the α-Bungarotoxin Binding » 4 *"[' Site with the α-Subunit of the Acetylcholine Receptor", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 83: 3008-3011 (1986), jonka sisältö kokonaisuudessaan liitetään tähän viitaten).

* « ·· » : *· ·

Kolinergisen sitoutumiskohdan määrittämiseksi vielä erityisem- : : » ; t min valmistettiin joukko synteettisiä peptidejä, ja määritet-• *» tiin niiden kapasiteetti sitoa kolinergisiä ligandeja. Monista testatuista peptideistä ainoat, jotka pystyivät sitomaan BXT:tä, sisälsivät jakson a-185-196. Tällä peptidillä havaittiin olevan alhainen affiniteetti (10-= M), mutta siitä huolimatta hyvin spesifinen BTX-sitomiskyky. Jaksolla a-173-204 9 100169 havaittiin suurempi affiniteetti (10-"7 M) BXT-sitomisjaksoja voidaan valmistaa myös yhdistelmä-DNÄ-tek-niikalla, valmistettiin hiiren tai Torpedo californican a-alayksiköiden cDNA:n alaklooneja ekspressiovektoreita käyttäen. Käytettiin trpE fuusiovektori pATHeita. Puhdistettiin 1-% agaroosigeeleillä restriktiofragmentteja plasmidista p42, joka on Torpedo californica AcChoR:n α-alayksikön cDNA-klooni. Plasmideista saatiin preparatiivisia määriä, ja suoritettiin liittäminen E. coli kanta HBlOl-muunnelmiin menetelmällä, jonka on kuvaillut Maniatis et ai., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982. Tällä tavoin valmistettiin fuusioproteii-neja E. coli-muunnellussa kannassa (Gershoni, "Expression of the α-Bungarotoxin Binding Site of the Nicotinic Acetylcholine Receptor by Echerichia coli Transformants", Proc. Natl. Acad.

, Sci. (USA), 84, s. 4318-4321 (1987), jonka sisältö liitetään

I

' tähän kokonaisuudessaan viitaten). Nämä fuusioproteiinit < I 1 osoittautuivat sitovan BTX:ää spesifisesti (affiniteetti: lO-'^ \ .·' M). Siten esimerkiksi bakteerisesti ekspressoidut proteiinit, * » /·] jotka sisältävät a-166-200 sitovat toksiinia kun taas ne, • ; : jotka ekspressoivat a-201-315, eivät.

1 · I

Valmistettiin kaksi oligonukleotidia kuvassa 1(1) kuvaillulla tavalla. Ne suunniteltiin bakteriaalisesti suosittuja kodo- i ·♦ ··· neita käyttäen koodittamaan aminohappojajaksoja: Gly-Ile-Glu- * * i

Gly-Arg-Trp-Lys-His-Trp-Val-Tyr-Tyr-Thr-Cys-Cys-Pro-Äsp-Thr- « * \ *·· Pro-Tyr-Leu-Asp, joka käsittää Torpedo californica AcChoR:n a- • 0 ♦ ♦,4ii 184-200 kuten myös tähteeseen W184 N-terminaalisesti lisätyn t pentapeptidin. Ensimmäinen glysiini on tulos trinukleotidista

1 · I

^ . dGGG, joka on välttämätön toiminnallisen Smal-kohdan säilyt-tämiselle. Seuraava jakso on koagulointitekijän Xa (CFX) spesifinen katkaisukohta. Siten ekspressoitu fuusioproteiini tulee tällä entsyymillä katkaistavaksi, joka mahdollistaa kiinnostuksen kohteena olevan kohdan vapauttamisen, se on, 17 aminohapon jakson: WKHWVYYTCCPDTPYLD. Kaksi oligonukleotidia 10 100169 kuumennettiin yhdessä suhteessa 1:1 ja annettiin karkaistua muodostamaan 9 emäsparin dupleksin. Komplementaariset säikeet "täytettiin" entsymaattisesti Klenow-polumeraasia käyttäen (1 μ!; 5 yksikköä), kuten ilmenee kuvasta 1(2), jonka jälkeen DNA uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolissa glykogeeniväli-aineessa. Muodostelma liitettiin sitten Smal:llä katkaistun, puhdistetun pATH2 ekspressiovektorin kanssa. Liitetyt vektorit käytettiin muuntamaan E. coli kanta HB101, kokonaan Aron-heim et al.:n kuvaileman tekniikan mukaisesti: "Characterization of the Binding of α-Bungarotoxin to Bacterially-Expressed Cholinergic Binding Sites", J. Biol. Chem., 263, 20:9933-9937 (1988), jonka sisältö liitetään tähän kokonaisuudessaan viitaten .

Muunnellut bakteerikloonit, jotka sisälsivät lisäyksen oikeassa suunnassa, valittiin pesäketäplien 1<2=SI-leimatun BTX:n päällystämisellä. Näiden muunnosten havaittiin tuottavan teho-kasta toksiiniin sitoutuvaa fuusioproteiinia (36kDa merkitty ·,,,' R4137, kuva 2). R4137 voitiin rikastaa sonikoimalla muunnellut : solut fosfaattipuskurissa + 500 mM suolaa. Sentrifugointi ·.'·.· tuotti pellettejä, jotka sisälsivät R4137:ää 40 - 60 % koko-naisuudesta ja vähän yli (kuva 2, Pi ) . Tämä pelletti voitiin .·.·. uuttaa vedellä antamaan liukoisen jakeen, joka oli pääosin R4137:ää (kuva 2, SE).

* · • · · *... SE-jakeen R4137 karakterisoitiin biokemiallisesti mittaamalla • · · *·] ’ toksiinin sitoutuminen siihen tekniikalla, jonka on kuvaillut : Gershoni et ai, "Molecular Decoys: Ligand-Binding Recombinant :***: Proteins Protect Mice from Curarimimetic Neurotoxins" , Proc.

• · ·

Natl. Acad. Sci (USA), 85, 4087-4089 (1988), jonka sisältö • · · • · · * . liitetään tähän kokonaisuudessaan viitaten. Olennaisesti tasa-• · · *· * määrät Se:ta inkuboitiin ie=5I-leimatun BTX:n kanssa. Sitten seos suodatettiin varausmuunnellun membraanisuodattimen läpi erottamaan sitoutunut toksiini vapaasta. Sen jälkeen laskettiin suodattimien radioaktiivisuus. Tätä tekniikkaa käyttäen havaittiin, että BXT yhdistyy R4137:n kanssa pseudo ensimmäi- 11 100169 sen asteen kinetiikalla, joka saavuttaa 50 % täydentymisen 40 sekunnissa ja noin 90 % täydentymisen 6 min. jälkeen (kuva 3). Mittaukset toksiinin sitoutumisesta tasapainotilassa (30 minuutin reaktio) osoitti, että toksiinin sitoutumisessa R4137:ään Kd = 1,2 ΙΟ-"7 M (kuva 4). Muut kolinergiset ligandit pystyivät kilpailemaan tämän sitoutumisen kanssa samanlaisilla tehokkuuksien etenemisellä kuin mitä tunnetaan perustilaisille reseptoreille (kuva 5).

Sen mukaisesti, R4137 osoittaa, että 17 aminohapon jakso: a-184-Trp-Lys-His-Trp-Val-Tyr-Tyr-Thr-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Pro-Tyr-Leu-Asp-200 on riittävä BTX:n sitomiseen. Vaikka tämä sitominen on olennaisesti vähäisempää kuin perustilaisella reseptorilla, se muistuttaa AcCHoR:n täydellisen a-alayksikön (437 aminohappoa) sitomisominaispiirteitä.

Jotta selvitettäisiin, voitaisiinko R4137:ää käyttää hoitamaan eläimiä, jotka ovat altistuneet neurotoksiinille, suoritettiin koe selvittämään että R4137 voi kilpailla perustilaisia . AcChoRrta vastaan yhteisellä ja rajoitetulla BTX-annoksella.

Tämän suorittamiseksi ei ole ainoastaan erotettava sitoutunut-: : : ta BTX:ää vapaasta, vaan on myös tehtävä ero AcChoR-sitoutu- :Y: neen ja R4137-sitoutuneen toksiinin välillä. Tämän suorittami seksi AcChoR sidottiin ensin konkanavaliini-A-kolonniin. Ha- ;·. vaittiin, että tällä oli vähän tai ei lainkaan vaikutusta • · · toksiinin sitoutumiseen (kuva 6A). Sitten tällaista immobili- • · · soitua AcChoR:ää sekoitettiin erilaisilla R4137:n konsentraa- • · : *·· tioilla ja vakiomäärillä 1E=SI-leimattua BTX:ää. Kolonnit pes-• · · tiin jälkikäteen toistetuilla sentrifugointi/uudelleensuspen-soinneilla ja määritettiin kolonniin liittyvän radioaktiivi- • · · S, ; suuden määrä. Kuten voidaan nähdä (kuva 6B), R4137 kilpailee • ·· BTX:stä AcChoR:ää vastaan.

Lopuksi R4137:n kilpailu testattiin AcChoR:ta vastaan in vivo. Koiras- ja naarashiiret (noin 5 viikkoa, 20 - 25 g), sekä su-kusiitettyjä (Balb/C) että ulkosiitettyjä (CD1) kantoja, sai- 12 100169 vat ensin ruiskeen vatsaontelonsisäisesti R4137:llä tai plasebolla - samanlainen jae, joka on peräisin bakteereista, jotka on muunneltu muuntelemattomalla vektorilla pATH2 (näillä soluilla ei ole toksiininsitomiskapasiteettia). Viisi minuuttia myöhemmin kaikki hiiret altistettiin erilaisille määrille d-tubokurariinia tai α-kobratoksiinia (CTX). Mitattiin annos, joka aiheutti 80 % kuoleman käsittelemättömissä hiirissä. Toksiinit annettiin ihonalaisena ruiskeena eläinten niskaan. Eläimiä tarkkailtiin ja rekisteröitiin kuolemantapaukset kahden tunnin aikana toksiiniruiskeesta. Tulokset esitetään taulukossa 1. Kuten kuvasta 7 ilmenee, oli eloonjäämisaste R4137:llä käsitellyillä hiirillä merkittävästi parempi verrattuna kontrolliin ja absoluuttinen paranemislukumäärä oli ainakin 300 % parempi kuin plaseboa saaneilla hiirillä.

TAULUKKO 1 bakteeri- koe proteiini kanta sukup. toksiini annos hiirten eloonj. (i.p.) (s.c.) mg/kg lukum.

1 pATH2 Balb/C K tubo 0,40 10 0 R4137 10 3 2 pATH2 Balb/C K tubo 0,36 10 1 ;·. R4137 10 7 • · ♦ * ··· • · · **.* * 3 pATH2 Balb/C K tubo 0,36 25 5 ·’·· R4137 25 12 • · · i : ♦ · · .···. 4 pATH2 CD1 K tubo 0,36 37 10 • · · *. . R4137 38 21 ♦ · · ♦ · · • · 5 pÄTH2 CD1 N tubo 0,29 20 6 R4137 20 15 6 pATH2 CD1 K CTX 0,15 10 1 13 100169 6 R4137 10 10 7 pATH2 CD1 K CTX 0,15 21 6 R4137 20 12

Suoritettiin edelleen kokeita, joissa hiiret ruiskutettiin ensin tappavalla annoksella kobran myrkkyä ja tunti myöhemmin annettiin joko plaseboa tai kolinergistä syöttiä. Plaseboa saaneet eläimet kuolivat kaikki, kun taas syöttiä saaneet eläimet säästyivät dramaattisesti (90 % eloonjääneitä). Tulokset esitetään taulukossa 2. On ymmärrettävä, että sama resep-torikohta on yhteydessä kaikkiin joukosta BTX, CTX ja d-tubo-kurariini kuten myös decametonium ja rabiesvirus.

TAULUKKO 2 ruiskutettu aine aika toksiinin jälkeen eloonjääneet • · · ' (minuuttia) R4137 (syötti) 30 6/10 ·/! 60 9/10 90 6/7 pATH (plasebo) 60 0/10 < « • · i

Tosiseikka, että R4137 on osoittautunut syötiksi toksiinille, • · · on vain yksi tapaus liittyen yleisen väitteeseen molekulaari- • · : *·· sista syöteistä terapeuttisina aineina. AcChoR:n erkoistapauk-• · · sessa R4137 tai parannetut versiot tästä molekulaarisesta syö-tistä saattavat toimia vasta-aineena kobrantyyppisille käär- • · · t·'; meenpistoille sieppaamalla näiden käärmeenmyrkkyjen ainesosat • · · spesifisesti. Lisäksi d-tubokurariinia käytetään rutiininomaisesti kirurgiassa neuromuskulaarisena salpaajana ja R4137:ään perustuva syötti saattaisi olla äärimmäisen hyödyllinen sen vasta-aineena. Tämä käyttökelpoisuus on erityisen tärkeää, koska tekniikan tasolla kuvaillut ligandianalogit voivat olla 14 100169 yhtä haitallisia kuin salpaajat itse. Edelleen on äskettäin osoitettu, että rabiesvirus sitoutuu spesifisesti AcChoR:ään ja että d-tubokuraniini tai BTX saattavat kilpailla sen sitoutumista vastaan (Lentz et ai., Science, 215, 182-184 (1982)). Siten R4137:ään perustuva syötti antaa myös käyttöön terapeuttisia vaikutuksia rabiesin hoidossa.

On ymmärrettävä, että R4137 on vain välivaihetyökalu joka sallii sen geneettisellä muuntelulla tai kemiallisella käsittelyllä ammattimiesten kehittää vielä tehokkaampia kolinergi-siä syöttejä. Siten tämä keksintö on tarkoitettu käsittämään ei vain R4137:n erityistä 17 aminohapon jaksoa vaan sen muunnelmat ja johdannaiset, joilla on säilyneet ja mahdollisesti parantuneet toiminnalliset tai farmakologiset ominaispiirteet. Esimerkiksi muunneltuja peptidijaksoja voidaan valmistaa helposti ja testata rutiininomaisilla tekniikoilla edullisia tok-siininsitomisominaispiirteitä varten tehokkaammin kilpailemaan perustason reseptorin kanssa. Sellainen muuntaminen saattaa käsittää aminohappojen korvauksen, poistamisen tai lisäyksen tai niiden kemiallisen muuntelun. Esimerkiksi pitkäikäisempiä syöttejä voidaan saada tällä tavalla. Koska syöttien entsy-maattinen hajoaminen in vivo saattaa tehdä jotkin syötit suhteellisen lyhytikäisiksi, olisi eräs menetelmä sellaisen hajoamisen estäminen tekemällä d-aminohappoja sisältäviä syn- :·, teettisiä peptidejä. Vaihtoehtoisesti fuusioproteiiniluonnok- • · · seen perustuen voidaan suunnitella orgaanisia molekyylejä, se • · ♦ *. on, ei-proteiinisia, jotka täyttävät fysikokemialliset vaati- • · • 1·· mukset syötille, jonka on muodostettava toksiinille toiminnal- • · · » · linen esto.

• · · · · » · · • · # . On edelleen ymmärrettävä, että tämän keksinnön syöttejä voi-• · · * 1 daan muunnella laajentamalla polypeptidiä tai lisäämällä erityisiä kemiallisia osia, joiden on tarkoitus auttaa lääkkeen suunnittelijaa antamaan käytettäville syöteille lisäkäyttöjä.

Eräs sellainen muunnelma olisi polypeptidin laajentaminen osilla, joiden on tarkoitus vaikuttaa liukoisuuteen, esimer- 15 100169 kiksi hydrofiilisen tähteen lisäyksellä, kuten seriinin tai varatun tähteen kuten glutamiinihapon. Edelleen syöttiä voitaisiin laajentaa stabiilisuussyistä ja toivotun konfirmaation säilyttämiseksi, kuten lisäämällä kysteiinitähteitä disulfidi-siltojen muodostamiseksi.

Toinen syy syöttien muuntamiseksi olisi syöttien tekeminen havaittaviksi, myös annon jälkeen. Tämä voitaisiin tehdä radio jodauksella radioaktiivisella jodi-isotoopilla, suoraan, tai lisäämällä tyrosiinia seuraavaa radiojodausta varten. Sellaisia havaittavissa olevia syöttejä voitaisiin käyttää erityisten patogeenisten aineiden tai toksiinien läsnäolon ja/tai sijainnin havaitsemiseen. Esimerkiksi R4137:n kerääntymisen havaitseminen koiranpureman alueella ilmaisisi rabies-viruksen läsnäolon. Siten sellaisia havaittavia syöttejä voitaisiin käyttää määrättyjen vieraiden aineiden selektiiviseen havaitsemiseen tai kartoitukseen tai sellaisten aineiden tunkeutumisen diagnosointiin.

Edelleen muu syy muunnella syöttejä olisi vieraan konjugoitu-neen aineen nopeutunut poistuminen kehosta. Esimerkiksi asia-loglyko-osaan liittyneen syötin voisi odottaa eliminoituvan maksan kautta. Siten esimerkiksi antisyöpäkemoterapeuttisten aineiden reseptorikohtaa matkiva syötti ja sellainen, joka sisältää asialoglyko-osan, tai minkä hyvänsä muun osan joka auttaisi sen poistumista elimistöstä, voitaisiin käyttää inak-tivoimaan ja nopeasti poistamaan ylimääräinen kemoterapeutti- • · nen aine terapian loppuunsaattamisen jälkeen sivuvaikutusten | · ···* vähentämiseksi.

* * · • · · ♦ · · # ;\· R4137:n tehokkuuden todistaminen syöttinä in vivo toksiineja • · vastaan näyttää toteen tämän keksinnön yleiskäsitteen. Sen mukaisesti on ymmärrettävä, että tämä keksintö ei käsitä ainoastaan kolinergiseen sitoutumiskohtaan perustuvia syöttejä, vaan mihin hyvänsä vieraiden aineiden endogeeniseen reseptoriin perustuvia syöttejä, vieraiden aineiden aiheuttaessa ei- 16 100169 toivotun vaikutuksen vasta sitouduttuaan tähän endogeeniseen reseptoriin. Ensimmäinen vaatimus tämän keksinnön mukaiselle syötille on, että se matkii endogeenista reseptoria, se on, sen on muistutettava sitoutumiskohtaa toiminnallisesti vaikka sen täytyy erota fysikaalisesti. Käsite "toiminnallinen muistuttaminen" tarkoittaa, että syötti sitoutuu kyseessä olevaan vieraaseen aineeseen selektiivisesti ja erityisellä tavalla ja kohtuullisella affiniteetilla. Reseptori saattaa olla tämän keksinnön tarkoituksiin mikä hyvänsä ligandia sitova molekyyli kuten esimerkiksi perinteisen solupinnan reseptorin ligandia sitova kohta, entsyymin substraattia sitova kohta, gangliosi-din ligandia sitova kohta jne.

On kuitenkin ymmärrettävä, että tämän keksinnön mukainen syötti ei voi olla immunoglobuliini eikä sitä voida johtaa immuno-globuliineista. Vaikka on totta, että patogeenin "sitoutumis-aluetta" kohtaan ohjattu immunoglobuliini saattaisi yleisesti toimia syöttinä, ei sellaista ole tarkoitettu sisällytettäväksi tämän keksinnön käsitteeseen.

Tämän keksinnön mukainen syötti ei saisi olla olennaisen im-munogeeninen. Koon pienentäminen on keino aineen immunogeeni-syyden vähentämiseksi, mutta kaikki suuret molekyylit eivät ole yhtä immunogeenisiä kuin eräät pienet molekyylit. Tämän keksinnön mukaiseksi syötiksi luokitelluksi tulemiseksi aineen » 11 on oltava olennaisen ei-immunogeeninen isäntäjärjestelmässä • » * riippumatta aineen koosta vaikka pienin mahdollinen koko on ·· : ’*· edullinen. On hyvin kuitenkin tärkeää, että syötti ei annet-• · · taessa in vivo ole riittävän immunogeeninen aiheuttamaan au-to immuunia vastetta endogeenistä reseptoria kohtaan. Koliner- • · · ; gisen reseptorin tapauksessa sellainen auto immuunivaste saat-* · · taisi aiheuttaa myasthenia gravis-tapauksen.

Tämän keksinnön mukaisen syötin on sisällettävä reseptorin sitoutumiskohdan olennaiset osaset eikä olennaisesti enempää. Tämän keksinnön tarkoituksiin sitoutumiskohdan "olennaiset 17 100169 osat" määritellään osina, jotka ovat olennaifsia.. syöttivaikutuk-selle, se on, ligandintunnistaminen ja sitoutuminen. Reseptori koostuu useista tähteistä, joista vain harvat liittyvät ligan-dintunnistukseen ja sitoutumiseen. Kuitenkin, kuten edellä todettiin, tämän keksinnön syöttejä voidaan muunnella edelleen lääkesuunnittelusyistä. Siten esimerkiksi koko AcChoR:n a-ala-yksikköä ei kelpuutettaisi syötiksi, sen ollessa sekä immuno-geeninen ja myös huomattavasti pidempi kuin tarpeen, a-alayksikkö sisältää kuitenkin mahdollisen syötin suunnitteluun ja rakentamiseen tarvittavan informaation, se on, jakson a-184-200. Se seikka, että joitain lisäpeptidiyksiköitä olisi läsnä, esimerkiksi parantamaan olennaisen vaadittavan jakson liukoisuutta, ei poistaisi rakennetta syöttien luokasta mikäli se olisi edelleen olennaisen ei-immunogeeninen ja olisi edelleen selektiivinen, spesifinen ja sillä olisi kohtuullinen affiniteetti. Sokerimolekyylien lisäys saattaisi olla samantehoinen muunnelma. Lääkesuunnittelutarkoituksessa tehtyjä lisäyksiä molekyyliin ei huomioida määritettäessä sisältääkö aine olennaisesti enemmän kuin endogeenisen reseptorin osat, jotka tarvitaan kyseessä olevan vieraan aineen sitomiseen.

Kuten edellä mainittiin, syötin on oltava selektiivinen ja sillä on oltava kohtuullinen affiniteetti aineeseen nähden, jolle se on suunniteltu. Siten esimerkiksi mannoosi, yksin-kertainen sokeri, saattaa vaikuttaa infektioon bakteereilla, /·.·, joilla on tyypin I mannoosispesifinen piluksia; mannoosin • · 4 selektiivisyys ei kuitenkaan ole riittävä eikä myöskään sen t 9 ! “ affiniteetti.

• * » i : ** # ,*j'. Syötti on lääke, joka on suunniteltu sieppaamaan tunkeutuva 4 : vieras aine, jolla on ei-toivottu vaikutus. Sellaiset vieraat *· *' aineet saattavat käsittää toksiineja, myrkkyjä, bakteereita, viruksia, käsittäen retrovirukset jne. Mikäli vieras aine saa aikaan patogeenisen tai toksisen vaikutuksensa (tai minkä hyvänsä muun vaikutuksen, joka halutaan eliminoida) vasta sitouduttuaan reseptorikohtaan jossain isännässä, voidaan suunni- 18 100169 telia tämän keksinnön mukainen sieppaaja estämään sellainen sitoutuminen ja siten poistamaan sellainen ei-toivottu vaikutus. Kun keksinnön tavat kerran tunnetaan, kuten myös se tosiseikka, että sellaiset reseptorin osia sisältävät ligandeja sitovat kohdat sitovat edelleen kompetitiivisesti ligandeja in vivo, ymmärtävät ammattimiehet, attä muista reseptoreista peräisin olevat syötit, jotka on suunniteltu sitomaan muita patogeenisiä aineita ja toksiineja, voidaan saada käyttämättä muita kuin rutiinikokeita.

Patogeenisten aine/reseptori-parien joukossa, joille syötit on helposti saatavissa tämän keksinnön mukaisesti, on T-solupin-nan glykoproteiini CD4 (T4), joka on solureseptori ihmisen im-muniteettikatoviruksessa, tyyppi 1 (HIV-1), ensimmäinen jäsen virusten joukossa, jotka aiheuttavat hankitun immuunivasteen-heikkenemisoireyhtymän (AIDS). HIV-viruksen tartunta alkaa sen kuoriproteiinin (gpl20) sitoutumisella T4-reptoriin (CD4), joka sijaitsee T4-imusoluissa. Äskettäin on varmistettu, että ' liukoisia, eritettyjä CD4:n muotoja voidaan käyttää sitomaan HIV-1 kompetitiivisesti ja siten neutraloimaan HIV-1;n tartut-tavuus (Smith et ai, "Blocking of HIV-1 Infectivity by a So-V : luble, Secreted Form of the CD4 Antigen", Science, 238, 1704- 1707 (1987)). Perustilainen CD4 ei kokonsa puolesta olisi tämän keksinnön mukainen syötti. Sillä on kuitenkin syötin omi-naispiirteet. CD4:n minimaalinen sitomisalue voidaan identi- * fioida käyttämättä muita kuin rutiinikokeita tässä kolinergi- * sen reseptorin minimaalisen sitomisalueen saavuttamiseksi, : ” esimerkiksi proteolyysin ja proteiinitäpläkokeella, jota seu- 9 · 4 raavat yhdistelmä-DNA-työtavat.

«

Ok * I » • · · s’. : Toinen ligandi/reseptori-pari, joka on erityisen sovelias tä- • 9 män keksinnön mukaisten syöttien valmistukselle, on organofos-faatti-asetyylikoliiniesteraasi. Sellainen syötti saattaisi vähentää joitain hermokaasun vaikutuksista. Muita esimerkkejä ovat LSD ja serotoniinireseptori ja strykniini ja glysiinire-septori.

19 100169

Taulukossa 3 esitetään lisää ligandi/reseptoripareja, joille voidaan suunnitella tämän keksinnön mukaisia syöttejä käyttämättä muita kuin rutiinikokeita: TAULUKKO 3 ligandi reseptori kalsium 28 kDa naudan pikkuaivot ja munuai set kalmoduliini

hepariini ihmisen plasman apoE ja apoB

Gonococcus-pilukset CHO-solujen 14 ja 16 kDa proteiinit virus retrovirus tyyppi 3 67 kDa glykoproteiini rotan .·. imu- ja hermosoluissa ,<··, sendaivirus ihmisen punasolujen glykoforiini peruna sukkula kyhmy ydinproteiinit I * ; viroidi ’· (Potato spindle tuber viroid) • · Tämän keksinnön syöttejä voidaan antaa eläimille, käsittäen » * : ihmispotilaan, parantamaan vieraan aineen, jota varten se on :'j‘: suunniteltu, ei-toivotut vaikutukset. Sellaisia syöttejä ei « voida käyttää ainoastaan ihmisten hoitoon, vaan myös muiden ♦ 9 9 99 *... eläinten hoitoon käsittäen nisäkkäät, siipikarjan, kalan jne.

• ♦ ’···* Edelleen tämän keksinnön mukaiset syötit voitaisiin suunnitel-la kasviensuojeluun tai -hoitoon. Ammattimiehet voivat helpos-ti määrittää kokeellisesti erityiset vaikuttavat annokset minkä hyvänsä vieraan aineen käsittelyyn ilman kohtuuttomia kokeita. Ammattimiehet ymmärtävät kuitenkin, että syötin annostelu riippuu jonkin verran vieraan aineen määrästä isäntäjär- 20 100169 jestelmässä. Syötin suhde vieraan aineen molekyyleihin on alueella 1:1 - 1:10. Eläinkokeet ovat osoittaneet, etteivät syötin suuret ylimäärät ole välttämättömiä tehon kannalta.

Vieraan aineen määrää isännän verivirrassa tarkkaillaan edullisesti ja syötin annos säädetään sen mukaisesti hoidon aikana.

Tämän keksinnön suoja-alan käsittämiin koostumuksiin kuuluvat koostumukset, joissa syötti on läsnä tehokkaassa määrässä aiotun tarkoituksen saavuttamiseksi. Tehokkaan määrän määrittäminen on tekniikan tasolla tunnettua.

Tämän keksinnön syöttien lisäksi farmaseuttiset koostumukset saattavat sisältää sopivia farmaseuttisesti hyväksyttäviä väliaineita, jotka käsittävät täyteaineet ja apuaineet, jotka helpottavat vaikuttavan aineen käsittelyä farmaseuttisesti käytettäviksi valmisteiksi. Edullisesti valmisteet, erityisesti ne, jotka voidaan antaa ruiskeena, sisältävät noin 0,1 - 99 %, ja edullisesti noin 25 - 85 paino-% vaikuttavaa ainetta yhdessä täyteaineiden kanssa.

Tämän keksinnön antoon voidaan käyttää mitä hyvänsä tavanomaista antoon käytettyä reittiä. Vaikka edullinen anto on ruiskeena, esimerkiksi laskimonsisäisesti, ihonsisäisesti, vatsaontelonsisäisesti jne., ne voidaan antaa myös oraalises- -ti, peräpuikkona tai muuta reittiä.

»· « · • · ♦

Muita ei-tavallisia antotapoja voidaan kuvitella, jotka myös on tarkoitettu tämän keksinnön suoja-alaan kuuluviksi. Esimer- ♦ · • · · *... kiksi kun nykyisessä järjestelmässä vaikuttavan aineen eks-• · *;·* pressointi bakteerissa käsittää bakteriaalisen ekspressloveksi*: torin pATH2, esiintyy muita bakteriaalisia ekspressiojärjes- telmiä, jotka tosiasiassa erittävät ekspressoituneen proteiinin väliaineeseen. Voitaisiin ajatella, että sellaista eritys-ekspressiojärjestelmää voitaisiin käyttää muodostamaan syöttiä isännän sisältä paremminkin sen tuottaminen ex vivo ja 21 100169 antaminen isännälle. Ilmeisesti eritysjärjestelmän on oltava kilpaileva isännälle. Käsite "anto" tässä julkaisussa ja patenttivaatimuksissa käytettynä on tarkoitettu käsittämään sellaiset in vivo-eritysjärjestelmät.

Tämän keksinnön farmaseuttiset valmisteet valmistetaan sinänsä tunnetulla tavalla, esimerkiksi tavanomaisten sekoitus-, liuotus- tai lyofilisointimenetelmien avulla. Sopivat valmisteet parenteraaliseen antoon käsittävät vesiliukoisessa muodossa olevien vaikuttavien yhdisteiden vesiliuokset. Lisäksi voidaan antaa vaikuttavan aineen suspensioita sopivina öljypohjaisina ruiskesuspensioina. Sopivita lipofiiliset liuottimet tai väliaineet käsittävät rasvaiset öljyt kuten seesamiöljy, tai synteettiset rasvahappoesterit kuten etyylioleaatti tai triglyse-ridit. Vesiruiskesuspensiot saattavat sisältää suspension viskositeettia lisääviä aineita kuten natriumkarboksimetyyli-selluloosa, sorbitoli ja/tai dekstraani. Valinnaisesti suspensio saattaa sisältää stabilaattoreita. Tämän keksinnön syötit voidaan antaa liposomien muodossa, farmaseuttisten koostumus-, ten muodossa, joissa vaikuttava aine sisällytetään joko dis- pergoituna tai vaihtelevasti esiintyen jyväsissä, jotka käsit-1 tävät vesipohjaisia samankeskisiä lipidikerroksiin tarttunei na. Vaikuttava aine saattaa esiintyä sekä vesikerroksessa että lipidikerroksessa, tai, joka tapauksessa, epähomogeenisessä * * 1 ‘järjestelmässä, joka tunnetaan yleensä liposomisuspensiona.

• · • '·· Edeltävä kuvaus erityisistä suoritusmuodoista välittää niin : täysin keksinnön yleisen luonteen, että että muut voivat so- veltamalla nykyistä tietämystä, helposti muuntelemalla ja/tai • · · *... soveltamalla erilaisiin sovellutuksiin kuten erityiset suori- : : ”* tusmuodot poikkeamatta yleiskäsitteestä, ja siksi sellaiset • · · ί#ί · sovellutukset ja muunnelmat on tarkoitettu ymmärrettäviksi :’*.i esitettyjen suoritusmuotojen ekvivalenttien tarkoituksen ja alueen sisälle kuuluviksi. On ymmärrettävä, että tässä käytetty fraseologia ja terminologia on kuvausmielessä eikä rajoittavasti .

Claims (9)

100169

1. Menetelmä farmaseuttisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa menetelmässä valmistetaan yhdiste, joka vaikuttaa vieraan aineen aiheuttaessa ei-toivotun vaikutuksen sitouduttuaan endogeeniseen reseptoriin, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 1. liuotetaan endogeeninen reseptori jonka jälkeen proteenikar-toituksella valitaan mainitun reseptorin pienin osa joka tarvitaan endogeenisen reseptorin sitoutumispaikan elementtien säilyttämiseksi, säilytetään reseptorin kyky tunnistaa valikoivasti ja spesifisesti vieras aine ja sitoutua siihen affiniteetilla joka estää vieraan aineen sitoutumista mainittuun endogeeniseen reseptoriin; 2. syntetisoidaan kemiallisesti ja/tai rekombinantti-DNA-teknii-kan avulla yhdiste, jonka kemiallinen rakenne vastaa olennaisilta osin mainitussa vaiheessa 1) valittua yhdistettä joka tunnistaa valikoivasti ja spesifisesti vieraan aineen ja sitoutuu sii- « · « hen, yhdisteeseen lisätään edullisesti farmaseuttisesti hyväk- • · syttävä lisäosuus joka ei vaikuta yhdisteen kykyyn tunnistaa ’· ·’ vieras aine ja sitoutua siihen. • · · • · V

' 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • 1 että menetelmässä valmistettu yhdiste ei ole olennaisesti suurempi kuin koko, joka tarvitaan säilyttämään reseptorin sitoutu-·1·,. miskohdan olennaiset osat. • M • · · • · a

• 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • · r · • · " että menetelmässä endogeeninen reseptori on kolinerginen resep- • at :...: tori ja mainittu vieras aine on kurarimimeettinen neurotoksiini.

• · · • · · • · · « : 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä endogeeninen reseptori on nikotiininen asetyy-likoliinireseptori ja mainittu vieras aine on o<-bungarotoksiini, kobratoksiini, d-tubokurariini, decametonium tai rabiesvirus. 100169

5. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä endogeeninen reseptori on imusolujen T4-solu-antigeeni ja mainittu vieras aine on HIV-virus.

6. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä aine on tuotettu luonnollisesta endogeenisesta reseptorista jakamalla endogeeninen reseptori osaan, joka on tarpeeksi pieni ettei se saa aikaan autoimmuunivastetta endo-geenistä reseptoria vastaan annettuna in vivo, tai jolta muuten puuttuu olennainen imunogeenisyys, mutta joka silti säilyttää mainitun reseptorin sitoutumiskohdan olennaiset osat.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä aine on peptidiketju, joka on ekspressoitu yh-distelmä-DNA-tekniikalla geenimanipuloiduissa soluissa.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu aine on synteettinen peptidi.

9. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää aminohappojakson: '·. . Trp-Lys-His-Trp-Val-Tyr-Tyr-Thr-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Pro-Typ— ♦ 4 . Leu-Asp tai sen muunnelma, joka säilyttää sitoutumisominaispiir- teet kurarimimeettisellä neurotoksiinilla, sitoutumisomi-naispiirteiden ollessa muunnelmalla ainakin yhtä voimakkaat kuin « « mainitulla jaksolla samalla neurotoksiinilla. • · « ψ · ··« • · · • · · • m • · ♦ · · « • · « • · • · • · · 1 ·« Ψ- m » • · · 100169