KR100270980B1 - 기생충 감염을 방지하고 처리하기 위한 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역 자극성 담체에 공유결합된 히알루로니다제를 포함하는 기생충에 감염된 척추동물을 보호하기 위한 화합물에 관한 것이다. 상기 면역자극성 담체의 바람직한 형태로는 히알루로니다제가 에틸렌피페라진 N-옥사이드 및 N-에틸아세틸에틸렌피페라지늄 브로마이드(이하에서 "신폴"이라 함)가 있다. 본 발명은 또한 면역자극성 담체, 바람직하게는 신폴에 공유결합된 히알루로니다제를 포함하는 화합물, 바람직한 형태로는 이 화합물과 함께 신폴을 포함하는 왁친의 형태로 척추동물에 투여되는 화합물올 치료학적으로 효과적인 양으로 척추동물에 투여하는 것으로 이루어지는 기생충 감염에 대한 척추동물을 보호하는 방법 및 히알루로니다제 및 면역성 담체를 공유결합시키기 위한 온도와 시간의 조건하에서 히알루로니다제 및 면역자극성 담체를 반응시키는 것으로 이루어지는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

기성층 감염을 방지하고 처리하기 위한 화합물

[관련출원]

본 출원은 1993년 9윌 10일 출원된 줄원계류중인 제 08/120,001 호의 일부계속 출원이다.

[발명의 배경]

본 발명은 기생충 감염에 대한 척추동물에서의 면역반응을 유도할 수 있는 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 기생충 감염으로부터 척추동물을 보호하기 위해 사용될 수 있는 왁친에 관한 것이다.

기생충 감염은 사육동물 및 인체에서 사망율 및 폐사율의 주된 원인이 된다. 일반적으로 기생충은 편형동물(platyhelminth) 문(門)(예를 들어 디스토마, 촌충 및 다른 편충) 및 선형동물(nemathelminth)(예를 들어 회충 및 다른 관련류)에 속하는 기생적인 그리고 비기생적인 종(種)을 의미한다. 기생충 감염이 어떻게 일어나는가에 대한 예시를 하기에 설명한다. 기생충 종은 예를 들어 알 또는 침습성(侵襲性)유충의 형태로 숙주의 체내로 들어가는데 이것은 알 또는 유층을 포함하는 숙주에 의한 음식물 섭취의 결과이다. 그 다음 기생충은 발생하여 다른 조직, 혈액 및/또는 림프를 통하여 천천히 이동한다. 결국 "바람직한" 기관에 도달하여 성장하고 성숙된다. 따라서 그것들이 기생하는 기관은 해악적으로 영양을 받게 된다.

조절 방법은 위생학면에서의 개선, 보균자 개체수의 감소, 및 화학요법에 대부분 의존한다. 위생학 및 보균자 개체수의 감소에 중점을 둔 조절방법은 그러한 감염이 가장 만연되어 있고 그러한 조절방법이 사용되기에 가장 어려운 개발 도상국에서 특히 문제점인 것으로 판단되었다. 현재 사용되는 화학요법 약제는 모두 고독성, 치료가 반복도어져야 할 필요서, 및 면역억제성 부작용과 같은 결점을 가진다. 더욱 이들 방법을 사용하게 되면 화학요법 약제에 대한 저항성을 가지는 기생충이 발생하게 된다. 실제로 거의 모든 나라는 항기생충 저항성의 경우를 상세히 보도하고 있다. 화학요법 화합물의 반복적인 투여비용 뿐만 아니라 상기에서와 같은 이유로 이러한 결점을 가지지 않은 화합물이 절실히 요구되어 왔다.

많은 종류의 기생충 종이 감염된 인구에서 발견될 수 있기 때문에 넓은 범위의 예방활성을 가지는 왁친의 생산이 바람직할 것이다. 이제까지 기생충 감염 후 강한 보호성 숙주 면역의 유도는 흔하지 않은 일이었다. 이들 기생충이 그것들의 숙주와 함께 긴 기간 동안 진화해 왔다는 경험칙에 의하여 일반적으로 강한 특이성 면역을 생성시키는 급성감염보다 만성적이거나 지속적인 질빙이 되는 적응단계인 것으로 숙주-기생충 관계를 이끌어 낼 수 있다. 이러한 이유로 대부분의 동물의 미생물에 의한 질병에 따른 상황과는 달리 기생충 조절에는 이용될 수 있는 왁친은 거의 없고 현존하는 것은 충분한 결점을 가지고 있다.

기생충 왁친을 생산해 내는 공지의 방법중에서 비활성화되고 살아있는 왁친은 생산하는데 노력이 많이 필요하고 단지 약한 면역성을 나타내는 결점을 가지며 국부적인 염증, 알레르기 반응, 및 발열과 같은 부작용을 유도한다. 더욱이 왁친으로 사용되는 약화된 형태는 기생충의 병원성(야생형) 형태에 의해서 유도되는 질병과 유사한 질병을 야기시킨다. 또한 이들 왁친 제조에 사용되는 거대분자인 담체 단백질은 예방접종된 유기체내에서 많은 면역 병리학적 부작용을 야기시킨다.

다른 사용가능한 종류의 왁친은 유전적으로 개발된 항원으로 구성된다. 그러나 이것도 너무 약한 면역성을 가질 뿐이다.

요약해서 설명하면 사용가능한 형태의 왁친은 일반적으로 비효율적이고 좁은 특이성을 가져서 단일의 기생충에 대해 작용할 뿐이다.

[보고된 개발방법]

생활사(1ife-cycle) 조직내-이동이 중요한 역할을 하는 기생충외에도 그것이 야기시키는 병리학적 질병의 논의도 E.J. Soulsby, Helminth, Arthropod and Protozoa of Domesticatedl Animals, 7판 Lea 및 Febiger, Philadelphia(1982) 및 G.M.Urquhart, "Veterinary Parasitology", Longman Scientific and Techincal, Unitecl Kingdom(1907)에 상세히 설명되어 있다.

모든 기생충은 면역 반웅올 유도하지만 많은 이유로 정상적인 조절 메키니즘이 작동하지 않게 되고 면역성 대신에 면역학적 손상이 종종 일어나는 정도로까지 숙주의 면역 반응에 대하여 이동하는 형태로 종종 비가시적인 표적으로 존재할 수 있다. 이것은 때때로 그것의 효율적이고 종종 역효과적인 면역반응을 숙주가 차단시키도록 한다. 그럼으로써 전체 병리학적 변화 및 면역억제 효과가 있게 된다.

기생적인 기생충의 구조 및 항원 다양성은 그것들이 야기시키는 특정 면역반응의 이질성으로 반영된다. 기생적인 기생충은 그것의 표면 항원을 차단하고 분리시킴으로써 그리고 척추동물 숙주내에서 기생하는 동안 그것의 항원을 변형시킴으로써 면역체계를 피할 수 있다. 표면 항원을 차단, 분리 및 변형시킬 수 있는 것은이제까지 기생충 감염에 대한 효율적인 왁친을 생산해내는 데 있어서 곤란성의 주된 요인이 되고 있다.

기생충 질병의 치료에 사용되어 온 새로운 왁친은 J.H.L. Playfair et al., The Lancet 335(1990): 1236-1266에 검토되어 있는 반면 기생적인 기생충에 대한 숙주의 면역학적 반응의 속성에 대한 일반적인 논의가 S. Lloyd 및 E.J.L. Soulsby에 의한 논문, "Parasitology in Focus : Facts and Trends", 편집자 H. Mehlhorn, Springer-Verlag(1988) pp. 619-650에 기재되어 있다. 상기에서 언급된 Playerfair등의 재고(再考) 논문에서 지적된 바와 같이 현 기준의 기생충 조절 방법이 비용이 많이 들고 넓은 범위에서 사용되기 어렵기 때문에 숙주 기체내에서의 기생충 감염의 강도와 우세성을 감소시킬 수 있는 왁친에 대한 필요성이 강하게 요청되고 있다.

본 발명 이전에는 특이 종에 대한 효과적인 항-기생충 왁친을 생산하는 데 있어서 상기 봉착했던 곤란성에 기초하는 넓은 범위의 기생충 감염에 대하여 적당한 보호룰 단지 항원 그 자체만으로 부여할 수 있으리라고는 생각하지 않았다. 기생충에 의해서 제공되는 의학적 및 과화적 설명의 전체적인 검토를 하려면 A.A.F.Mahmoud, Science 246 (1989): 1015∼1021을 참고하기 바란다( 또한 Encyclopedia of Immunology, 편집자 I.M Roitt 및 P.J. Delves, Academic press의 "Parasites, Escape from Immunity", 저자 D.J. Mclaren 및 "Parasites, Immunity to", 저자 F.E.G. Cox를 참조할 수도 있을 것이다).

[발명의 요약]

본 발명은 기생충에 의한 감염에 대하여 척추동물올 보호하기 위한 화합물을제공하는 것으로 이 화합물은 면역자극성(immunostimulating) 담체에 공유결합적으로 결합된 히알루로니다제(hyaluronidase)로 구성된다. 바람직한 형태로서 본 발명의 화합물은 왁친 및 면역자극성 담체의 형태로 척추동물에 투여되고 상기 히알루로니다제가 공유결합에 의해서 결합된 면역자극성 담체가 에틸렌피페라진 N-옥사이드 및 N-에틸아세틸에틸렌피페라지늄 브로마이드(이하에서 "신폴(synpo1)"로 언급된다) 공중합체를 포함한다.

본 발명은 부분적으로 히알루로니다제 효소가 유충 기생충 종에 의해서 생산되어 그것이 감염시키는 숙주 유기체의 체내의 조직 차단벽을 침투하도록 한다는 사실에 기초한다. 실제도 본 발명은 기생충에 의해서 생산될 때 히알루로니다제에 대한 면역 반응을 유도해낼 수 있고, 그럼으로써 조직 차단벽을 침투하여 동물을 감염시키는 기생충의 능력올 제거하거나 그렇지 못하다면 현저히 감소시킬 수 있.

본 발명은 또한 면역 자극성 담체, 바람직하게는 신폴에 공유결합된 히알루로니다제를 포함하는 화합물을 치효학적으로 효과적인 양으로 척추동물에 투여하는 것으로 구성되는, 기생충에 의한 감염에 대하여 척추동물의 보호방법을 제공한다. 바람직한 형태의 화합물은 화합물과 혼합되어 신폴을 포함하는 왁친의 형태로 척추동물에 투여한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 척추동물로는 인간, 소, 양, 돼지, 개, 말, 고양이, 염소, 물소, 카멜리대(Camelidae) 및 가금을 그 예로 들 수 있다.

본 발명은 또한 히아루로니다제 및 면역자극성 담체를 히아루로니다제와 상기 면역학적 담체를 공유결합시키기 위한 시간 및 온도의 조건하에서 반응시키는 것으로 구성되는 방법을 제공한다.

본 발명은 기생충 감염으로부터 척추동물을 보호하는데 사용되는 중래의 기술보다 다양한 이점이 제공되는 것으로 여겨진다. 본 발명의 화합물은 숙주 유기체의 체내에서 이동을 촉진시키기 위해 히아루로니다제를 이용하는 기생충 종에 의한 감염으로부터의 보호방법도 제공한다. 따라서 본 발명의 화합물은 넓은 범위의 기생충 종에 효과적으로 저항한다. 이것은 단지 하나의 특이적 기생충 종으로부터 숙주를 보호하는데 제한되는 종전의 왁친보다 상당히 유리한 것이다.

본 발명의 왁친에 의해서 제공되는 또다른 이점은 그것이 매우 면역성이 있다는 점인데, 종래의 항-기생충 왁친은 종종 약하게 면역성을 나타내고, 국부적인 염증, 알레르기 반응 및 발열과 같은 바람직하지 못한 부작용올 유도시킨다. 또한 종래의 왁친은 예방접종된 유기체내에서 면역 병리학적 많은 부작용을 야기시키는 거대분자인 담체 단백질을 이용한다.

종전의 항-기생충 왁진의 이들 다양한 다른 불리한 단점은 본 발명의 화합물을 제공함으로써 극복되었고 뿐만 아니라 종래의 항-기생충 왁친 제조시 종종 발견되는 부작용 없이 강한 면역성 반옹을 유도할 수 있다. 더욱이 본 발명의 화합물은 발생 또는 수정에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

강한 면역적 반응을 유도해내고 다양한 기생충 종에 대하여 광범위한 보호를 제공하는 본 발명의 왁친의 작용성은 항-기생충 왁친의 기술분야에서 이제까지 볼수 없었던 이점을 제공한다.

[도면의 간단한 실명]

제1도는 신폴의 일반 구조식을 나타낸 것이다.

제2도는 실시에 1에 따라 생산된 신폴의 구조식을 나타낸 것이다.

제3도는 실시예 2에 기재된 바에 따라 생산된 신폴의 구조식을 나타낸 것이다.

제4도는 본 발명의 화합물의 주입후 랫(rat)의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명의 목적은 히알루로니다제 및 면역 자극성 담체의 반응 생성물을 포함하는 물질을 제공한다.

히알루로니다제는 본 명세서에 사용된 용어로서는 자연계에 존재하는 다당류, 특히 콘드로이틴 황산염(4-, 6-, D 및 E)와 같은 히알루론산 및 글리코사미노클리칸을 가수분해하는 효소 족(family)을 의미한다. 이들 중합체 물질은 세포외 매트릭스의 반고체성 겔-유사 구조의 필수적 성분이다.

히알루로니다제는 이들 중합체 물질을 절단시키므로 세포의 매트릭스를 파괴할 수 있는 것이다. 많은 다양한 기생충 종은 숙주 유기체 세포의 매트릭스의 상기 언급된 성분을 가수분해시키고, 이로써 기생충이 조직 차단벽올 침투하여 그것들이 성장하고 성숙되는 데 바람직한 기관에 도달할 때까지 숙주 유기체의 체내에서 이동할 수 있도록 하기 위하여 히알루로니다제를 생성시켜 사용한다.

히알루로니다제 효소 족은 상기 언급한 타입의 기질을 가수분해하는 관련된 효소를 포함한다. 이들은 히알루론산 중합체 분자의 구조내에 서로 다른 결합의 특이성에 따라 분류될 수 있다. 특히 히알루로니다제는 세개의 기초군으로 분류될 수있다: 히알루로니글루코사미니다제, 히알루로노클루쿠로니다제, 및 클루코로네이트 리아제(B. Fiszer-Szafarz, Analytical Biochemistry. vol. 143, p. 76 (1984)).

천연의 히알루로니다제 그 자체는 상당히 약한 면역성을 나타내고 반복적인 주입 후에도 가시적인 항-히알루로니다제 항체 생산을 유도하지도 못한다.

히알루로니다제는 뱀 및 꿀벌 독사, 거미의 타액, 정충의 아크로돔 과립, 다양한 세포의 리소롬 과립 그리고 박테리아 독소를 포함하는 공급원으로부터 분리되었다. 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 히알루로니다제의 예시적인 공급원은 소 및 양의 고환, 기생충, 거머리, 꿀벌과 뱀의 독액 및 박테리아이다.

히알루로니다재의 박테리아원은 하기의 것을 포함하나 이에 국한되지 않는다:

스트렙토코거스 밀러리(P.F. Unsworth, J. C1in Pathology, (London) 1989, 42(5), 506∼510); 스트렙토코커스 피오진(W. L. Hynes 및 J.J. Ferretti1, Infection and Immunity, 1989, 57(2) 533∼539); 스트랩토코커스 이퀴시밀리스(R. Sting at al., Med. Sci. Res., 1989 vol 17, No. 17, pp. 723∼725); 클로스트리디움 디피시클(S.V. Sedden et al., J. Med. Microbiol, 1990), v. 31, no. 3, pp. 169∼174); 스트렙토코커스 우베리스(P. Schaufuss et al, Zentralbl. Bakteriol. FRG, 1989, v. 271, no. 1, pp 46∼53); 및 스트렙토코커스 디스갈람티이(A Hamai et a1., Agric. Biol. Chem., 1989, v 53, No. 8, pp. 2163∼2168). 또한 칸디다균 속(屬)의 효모도 일정의 히알루로니다제를 포함하는 것으로 밝혀졌다(M.T.Shimizu, Rev Microbiol., 1998, v. 19, No. 4, pp. 442-445).

특정 종에서 히알루로니다제는 일반적으로 단량체 형태 뿐만 아니라 올리고머형태도 발견될 수 있는데, 예를 들어 종종 존재하는 것으로 동일 하부단위의 이량체 및 사량체가 있다 스트롑토코커스 피오젠 박테리오파아지에 의해 생산되는 히알루로니다제의 아미노산 서열이 결정되었고(W.L. Hynes et al., Infection and Immunity 57 (1989) 533∼539), 꿀벌 독액 히알루로니다제가 최근에 서열분석되었다(M. Gmachl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 3569-3573(1993)). 히알루로니다제를 암호화하는 유전자의 서열분석과 클로닝이 본 발밍의 실시에 사용되기 위한 히알루로니다제의 재조합 DNA에 기초한 생산에 대한 기초가 될것이라고 기대가 된다.

상업적으로 이용가능한 다양한 히알루로니다제의 조제는 본 발명의 화합물을 제조하는데 사용될 수 있는데 예를 들면 REANAL사(Catalog No. 0705)에서 구입 가능한 히알루로니다제의 소(bovine)의 조제약품을 들 수 있다. 이 공급원으로부터 얻은 히알루로니다제의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)은 대략 63 킬로달톤(KDa)의 분자량을 가지는 주요 단백질 밴드가 존재하는 것을 제시하여 주었다. 또한 Sigma Chemical 사(Catalog no. H2126)에서 판매하는 양의 고환으로부터 얻을 수 있는 물질이 있을 수도 있다. 이 공급원으로부터 얻은 히알루로니다제를 폴리아크릴로아미드 겔 전기영동을 하면 대략 39 KDa의 분자량을 가지는 주요 단백질 밴드가 나타난다. 히알루로니다제는 또한 Serva(Catalog No. 25119 및 Catalog No. 25121)로부터 구입할 수 있다.

다양한 상업적 출처에서 얻어진 히알루로니다제 조제는 PAGE에서 증명되는 우세한 단백질 종이 존재하는 것에 따라서는 서로 상이하지만 다양한 히알루로니다제의 상업적 조제는 모두 효소학적으로 활성이 있고 서로 면역학적으로 교차-반응성이 있다고 알려져 있다. 또한 실제 연구되는 모든 조제는 대략 60∼69 KDa의 분자량을 가지는 단백질 종을 미량 포함하고 PAGE 과정중 사용되는 환원 조건에 존재하는 더 짧은 폴리펩티드 사슬이 약 60∼90 KDa의 올리고머로 생리학적 조건하에서 합쳐진다는 가능성을 배제할 수가 없다.

숫양과 황소 고환에서 분리된 히알루로니다제를 사용하는 본 발명의 화합물은 특히 바람직한 면역성, 비용 효율성 및 편리성올 쟤공할 것이라고 기대된다. 그러한 히알루로니다제의 정제방법은 좀 더 발달되어 있으며 추출, 침전, 원심분리, 한외여과, 이온교환 및 겔 크로마토그래피의 공통되는 단졔를 포함한다. 양이나 소의 고환에서 분리된 히알루로니다제를 사용하는 본 발명의 화합물은 기생충 히알루로니다제의 면역 반응을 일으킨다. 양이나 소의 고환에서 분리된 히알루로니다제를 사용하는 것은 또한 기생충의 유층으로부터 분리된 히알루로니다제보다 상당히 비용면에서 효율적이 된다. 고환기관의 히알루로니다제는 히알루론산을 절단시키고 또한 콘드로이틴 황산염을 인식할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Bartolucci. et al., Int. J. Tissue React., 13 (6) (1991), p 311). 따라서 본 발밍의 특히 바람직한 화합물의 구체예는 숫양 또는 황소의 고환으로부터 얻은 히알루로니다제를 이용하여 제조된 것이다. 이런 점에서 Sigma Chemica1사에서 판매하는 양이나 소의 기관의 히알루로니다제는 본 발명의 실시에 적합한 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따라 처리를 한 동물을 제외한 출처원에서 얻은 히알루로니다제를 사용하는 본 발명의 화합물은 처리된 종에서 분리된 히알루로니다제를 이용한 화합물보다 종종 더 면역성이 있다는 사실이 관찰되었다. 예를 들어 양으로부터 분리된 히알루로니다제는 소(cattle)에서 분리된 히알루로니다제보다 소에서 더 강력한 면역반응을 유도하는 경향이 있다. 양 과 소릍 처리하는데 있어서 비용 효율성 및 편리성을 도모하기 위하여 숫양과 황소 히알루로니다제의 혼합물로부터 제조된 화합물의 사용이 고려된다.

본 발명의 범위내에 있는 화합물은 상기 언급된 바와 같이 히알루로니다제 및 면역자극성 담체의 반응 생성물을 포함한다. 여기에 사용된 용어인 "면역 자극성 담체"란 일정 항체와 결합될 때 일정 항원에 낮게 감용하는 개체를 효과적으로 면역작용하게 할 수 있는 높은 면역성을 갖는 복합체(항체-면역자극 촉진제)를 재공하는 화합물을 의미한다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 면역 자극성 담체의 예는 면역자극 촉진재로서 합성된 폴리이온을 사용하는 것을 포함하는 하기 출간물에 기재되어 있다: Khaitov, R. Annals New York Academy of Sciences, 685, 788-802,1993. 6. 23. 본 발밍에서 사용된 바와 같은 신폴과 등등한 폴리옥시도늄(Polyoxidonium)이 이 논문에 참고로 기재되어 있다.

바람직한 구체예에서 히아루로니다제와 반응하는 면역 자극성 담체는 신폴이다. 여기에 사용된 바와 같이 "신폴"이란 용어는 에틸렌피페라진 N-옥사이드 및 N-에틸아세틸에틸렌-피페라지늄 브로마이드의 공궁합체를 의미하고 제1도의 아래쪽에 나타낸 구조식에 해당하며, 여기에서 n=200-2000; q=(0.2∼0.35)n; z=(0.4∼0.65)n; m=(0-0.4)n.

대부분의 다른 담체 및 보조제과는 달리 신폴은 비-면역성이다. 신폴은 인식 가능한 항원 결정성 인자릍 가지지 않으며 면역 반응을 일으키지 않음으로써 왁친조제에서 사용되는 대부분의 다른 보조제 및 담체에서 관찰되는 바람직하지 못한 부작용을 피할 수 있다고 여겨진다.

다양한 신폴류를 용이하게 다른 것과 동정하기 위하여 "신폴"이란 용어는 상기 언급한 문자 "n", "q", "z", 및 "m" 각각의 수지를 이용하여 함께 그리고 순차적으로 사용한다. 예를 들어 n=1000, q=0.35, z=0.60, m=0.05인 에틸렌피레라진 N-옥사이드 및 N-아세틸에틸렌피페라지늄 브로마이드는 "신폴 1000-35/60"으로 언급된다.

본 발명의 왁친의 구체예에서의 면역 자극성 담체로서 성공적으로 사용되는 특정 신폴류 공중합체의 예로는 "신폴 1000-20/50"이라고 말할 수 있을 것이다. 약 15 KDa 또는 그 이상의 분자량을 가지는 신폴은 특히 바람직한 적어도 약 30KDa 보다 더 큰 분자량을 가지는 신폴을 이용하는 본 발명의 실시에 바람직하다.

본 발명의 화합물은 예를 들어 히알로니다제를 면역 자극성 담체에 공유결합시킴으로써 히알루로니다제를 면역 자극성 담체에 대한 화학결합을 효율적이게 하는 적당한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 그러한 공유결합은 히알루로니다제 및 면역 자극성 담체의 반응성 기 사이에서 직접 형성될 수 있는데 또한 하나 이상의 연결기를 통하여서도 형성될 수 있다. 하기에 기재된 실시애에서 보는 바와 같이 히알루로니다제와 본 발명의 바람직한 면역 자극성 담체, 즉 신폴의 반응생성물을 제조하기 위한 바람직한 방법은 아지드 방법을 사용하는 것에 관여된다. 이 방법은 산 또는 신폴의 에스테르 형태를 히드라진을 사용하여 히드라지드로 전환시킨 다음 히알루로니다제가 신폴에 공유결합되는 조건하에서 히드라지드를 히알루로니다제와 결합시킨다. 택일적으로 하기 실시예에 예시된 바와 같이, 히알루로니다제와 신폴의 반응 생성물을 제조하는데 다른 바람직한 방법을 숙시니미드 에테르 또는 신폴의 형성에 관여한다. 숙시니미드 에테르는 그 다음 본 발명의 실시에 사용하기 위한 화합물을 생산하는 조건하에서 히알루로니다제와 결합된다.

본 발명의 화합물은 기생충 감염으로부터 척추동물을 보호하기 위해 가장 널리 사용될 것이라고 여겨진다. 이러한 이유로 히알루로니다제와 면역 자극성 담체의 반응 생성물이 왁친의 형태로 사용되는 것이 바람직하다. 여기에서 사용되는 용어인 "왁진"은 본 발명의 화합물을 포함하고 척추동물에 투여될 수 있는 형태인 조성물을 의미한다. 일반적으로 왁친은 종래의 염수 또는 완충된 수성 용액을 포함하는데 본 발명의 화합물은 여기에 현탁되어 있거나 용해되어 있다. 이러한 형태로 본 발명의 화합물은 기생충 감염을 예방하고 개량하거나 치료하는데 용이하게 사용될 수 있다.

바람직한 형태로 본 발명의 왁친은 부가적으로 보조제를 포함할 수 있는데 이것은 본 발명의 화합물에 비하여 소량 또는 다량 비율중의 하나로 존재할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "보조제"란 단어는 면역반응의 비-특이적 촉진제를 의미하는데 본 발명의 왁친과 결합될 때 층가된 면역반옹올 제공한다. 다양한 보조제가 사용될 수 있다. 예로는 완전하고 불완전한 Freund외 보조제, 수산화 알루미늄, 및 변형된 뮤라밀디펩티드가 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 신폴은 본 발명의 화합물과 혼합하여 보조제로서 사용된다.

상기 언급된 방법에서 본 발명의 화합물은 기생충 감염으로부터 척추동물류를 보호하는 데 사용하고자 한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 척추동물의 예는 인간, 소, 양, 돼지, 개, 말, 고양이 및 염소 뿐만 아니라 다른 equidae, 물소, camelidae, 및 가금을 포함한다. 특히 본 발명의 화합물은 히알루로니다제를 사용하는 기생충 종에 노출된 동물에서의 기생적인 기생충 감염의 치료와 예방에 효율적일 것으로 기대된다.

본 발명의 화합물은 근육내, 피하내 또는 피부내 투여방법에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 일정 유기체에 대한 바람직한 투여 경로는 발명 적용의 실시예 부분에서 참고로 기재되어 있다. 바람직한 투여량 범위는 치료되어야 할 동물 및 일정 조건하에서 가장 우세한 기생충 종에 따라 변화될 수 있으나 일반적으로 동물 체중 1 ㎏당 약 0.5 ㎎ 단백질의 왁친 투여량이 효과적인 것으로 밝혀졌다. 효과적인 투여량 범위는 하기에 기재된 실시예에 의해서 더 자세히 알 수 있을 것이다.

신폴에 히알루로니다제를 공유결합시키기 위해 바람직하게 사용될 수 있는 완화된 조건이 특이한 방법으로 히알루로니다제의 항원 결정기(epitope)에 영향을 미치지 않는다는 것이 밝혀졌다. 따라서 상당한 면역성을 지닌 화합물이 얻어진다. 고체상 효소-결합 면역분석법(ELISA)는 항-히알루로니다제 항체가 신폴에 결합된 히알루로니다제의 항원 결정기를 인식할 수 있다는 것을 보여주었으며 이것을 또한 이들이 항원 결정기를 보유하고 있음을 제시하여 준다.

히알루로니다제의 효소활성 자리는 히알루로니다제가 실폴에 공유결합된 후에도 보존된다는 사실도 또한 발견되었다. 특히 히알루로니다제 그 자체의 기질 분해율이 신폴에 공유결합된 히알루로니다제의 기질 분해율과 실질적으로 동등하다는 사실이 발견되었다. 더욱이, 신폴에 결합되었을 때 히알루로니다제는 천연 형태보다 상당히 더 안정하게 된다. 이것은 열안정성 시험 및 헤파틴 매개된 저해에 대한 내성을 포함하는 히알루로니다제 효소 불활성화 시험을 사용하여 밝혀졌다.

신폴에 결합됨으로써 제공된 히알루로니다제의 증가된 안정성은 본 발명의 화합물에 광범위한 유용성을 부여한다. 기생충 감염을 저해하는 작용이외에도 본 발명의 화합물이 다른 병원균 또는 유기체, 예를 들면 특정 박테리아 및 그것들의 독소와 같은 조직을 소화시키기 위해 히알루로니다제릍 사용하는 병원균이나 유기체에 면역 반응을 일으키도록 사용될 수 있다고 기대된다. 또한 본 발명의 화합물은 히알루로니다제를 포함하는(꿀벌 및 뱀의 독액과 같은) 독액의 작용을 차단하거나 퍼지는 것을 제한하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 신폴에 공유결합된 히알루니다제를 포함하는 조성물을 투여함으로써 척추동물내의 섬유증을 치료하기 위해 신폴에 공유결합된 히알루로니다제의 사용법도 그 범위내에 포함한다.

또한 본 발명의 화합물은 크림 및 피부를 부드럽고 유연하게 하는 다른 생산품내의 활성성분으로서 미용분야에서도 사용될 수 있다. 이런 관점에서 사람의 정충을 포함하는 물질이 러시아에서 피부-보호 생성물로서 사용되고 있다는 것을 주목할 필요가 있다. 그러나 그러한 생성물의 사용은 히알루로니다제의 불안정성 때문에 매우 제한된다. 본 발명의 화합물은 안정하고, 용해되고 비-독성이기 때문에 본 기술분야에서 즉시 적용되었으며, 이런 관점에서 이것의 용도의 연구도 진행되어 오고 있다. 본 발명은 또한 조제의 효율성을 증가시키기 위한 보급인자로서 신폴에 공유결합된 히알루로니다제의 사용법도 그 범위내에 포함할 수 있다. 이것은 의약용도에서 분산을 증진시키고 흡착을 강화시키기 위해, 예를 들어 가축병 치료용에서 소의 유선염을 치료하기 위한 항체성 용액내의 성분으로서 사용될 수도 있다. 이전에는 불안정한 히알루로니다제가 이들 문헌(예를 들어 Merck Index, 8판)에서 사용되고 있었으며, 따라서 본 발명에 의해서 제공되는 안정화된 형태의 히알루로니다제가 천연 형태의 히알루로니다제를 사용하는 조성물보다 상당한 이점을 제공할 것으로 기대된다.

본 발명은 또한 그 범위내에 자유(안정화되지 않은) 히알루로니다제가 융용한 효과: 심근경색(E.J. Flint et al., The Lancet, 4. 17.(1982) pp. 871 874 및 D. MaClean et a1., Science. vol. 194, pp 199-200(1976) 참조), 망막 작용의 증진(B.S.Winkler et al., Arch. Opthalmol. 103(1985) pp. 1743-1746 참조), 암종양의 치료에 있어서 세포중식 억제제와 조합하여 사용하는 것(G. Baumgartner et al., J. Exp. Clin. Cancer Res 4 (1985) p. 3 및 W. Scheithauer et a1., Anticancer Res., vol 8, pp. 391-395(l988), 결절이 있는 척수 거미줄 막염의 치료용도(M. Gourie-Devi et al., J. Neurol. Sc1., vo1 102, pp 105-111 (1991) 참조), 매우 위독한 환자의 캡슐로 사여져 있는 뇌농양의 치료에 사용(A. Pasaoglu, Acta Neurochir., vol. 100, pp. 79-83 (1989) 참조): 용도를 가진 것으로 제시되고 있는 상기의 치료학 관련하에서 신폴에 공유결합된 히알루로니다제가 사용될 수 있느다는 내용도 포함한다. 더욱이 셀 프리(cell free) 시스템에서 히아루론산의 탈중합을 위해 그리고 eg. 세포-배양 과정에서 히알루론산 합성을 자극하기 위해 히알루로니다제가 사용되고 있다(L.H. Philipson et al. Biochemistry 24(1985) pp. 7899-7906). 본 발명은 또한 그 범위내에 이에 관련해서 신폴에 공유결합된 히알루로니다제를 포함하는 화합물의 사용을 포함한다.

또한 본 발명은 항원이 히알루로니다제에 유사한 단백질을 포함하는 신폴-항원 결합 왁친, 예를 들어 조직을 소화/분해하는 병원균에 의해 사용되는 다른 효소(콜라게나제 및 다른 특이성을 지닌 프로테나제를 포함)를 항원으로서 포함하는 왁친도 그 범위에 포함한다.

본 발명은 또한 알레르겐(allergen)과 결합된 신폴을 사용하여 숙주내의 일정 알레르겐에 대한 알레르기 반응을 제거하는 것도 포함한다. 좀더 자세히 연구하여 보면 그러한 항원-신폴 결합체를 투여하는 것이 문제의 알레르겐에 대항하는 비-알레르기성 항체의 이소형태를 우세하게 생성시킨다는 것을 알 수 있다. 이들 정상적인 비-병원균성 이소형태는 기존의 알레르겐 이소형태(즉 IgE 면역글로블린)와 경쟁하고 알레르기를 특이적으로 제거한다. 이러한 특이적 알레르기 과민성을 경감시키는 방법은 분명히 규명되었고 임상 시험의 초기 단계에 있다

본 발명은 하기 항원과 결합된 신폴을 사용하여 결합된 항원의 면역성을 향상시키고 그럼으로써 효과적인 예방적 면역 반응의 유도를 증가시키기 위해 제공하는 것도 그 범위내에 포함하고 있다. 콜레라 독소의 β-하부단위, 형태 A 및 B의 인플루엔자 바이러스의 외피로부터의 헤마클루티닌, 비. 안트라시스의 p. 90 독소, 살모넬라의 Vi 항체, 이. 콜라이 및 살모넬라의 세포벽으로부터의 포린 단백질, HIV-1의 gp 160 env-단백질의 합성 단편,(항-이디오 타입 반응을 유도하기 위한)면역글로블린의 F(ab)₂단편.

[실시예]

처음 두개의 실시예는 두종류의 신폴의 예시에 해당하고 이것은 실시예에서 동정된 바와같다.

[실시예 1 -- 신폴 1000-20/50의 제조]

에틸렌피페라진 N-옥사이드 및 N-아세틸에틸렌피페라지늄 브로마이드의 공중합체는 세단계 과정으로 합성되었다.

(1) 초기 중합체인 1,4-에틸렌피페라진올 첫단계에서 합성하였다. 이런 목적으로 1,4-디아자바이시클로[2.2.2] 옥탄의 현존(living) 사슬 중합반응을 하기 방법에 따라 수행하였다.

미리 정화된 단량체 10g과 브롬화암모늄 0.05g을 10㎖의 유리 앰플(ampule)에 넣고 봉입한다. 앰플내에서 진공의 5×10^-3mmHg 잔여압을 진공 펌프를 이용하여 생성시켰다. 앰플을 25시간 동안 200℃에서 온도 조절 장차내에 노출시켰다. 중합체 수득율은 약 100%, 분자량은 120,000이었다(LALLS-저각도 레이저 광 산란에 의해서 측정함).

(2) 두번째 단계는 폴리-1,4-에틸렌피페라진의 N-옥사이드를 제조하기 위해 수행되었다.

폴리-1,4-에틸렌피페리진(분자량 120,000, n=1000) 5g을 1% 아세트산 용액 250㎖ 내에 용해시켰다. 그런 다음 30% H₂O₂4㎖를 첨가하고 산화반응을 36시간 동안 지속시켰다. 한외여과와 동결건조시킨 후 폴리-1.4-에틸렌피페라진의 N-옥사이드(분자량 110,000, z=0.5n)를 수득하였다

(3) 상기 폴리-N-옥사이드의 알킬화 반응올 세번째 단켸동안 수행하였다

상기 제 2 단계에서 생성된 폴리 1,4-에틸렌피페라진 N-옥사이드를 125㎖의 메탄올 내에 용해시키고 16.5g의 브로모아세트산을 첨가하였다.

알킬화 반응은 25℃에서 10시간 동안 수행하였다. 용매를 진공하에서 증발시키고 침전물을 물에 용해시키고 24시간동안 물에 대하여 투석하고 동결건조방법을 이요하여 건조하였다. 결국 하기 구조식(제2도)에서와 같은 에틸렌피페라진 N-옥사이드와 N-아세틸에틸렌피페라지늄 브로마이드의 공중합체를 얻었다.

수둑율은95%였다. 산화율은 크로모메트릭(chromometric)(또는 티아노메트릭(titanometric) 적정법) 방법 및 2.5-4.5 m.d. 범위의 PMR-스펙트럼 밴드의 인테그럴 강도의 비율에 의해서 측정하였다. 크로모메트릭 또는 티아노메트릭 적정방법은 이가 크롬이나 삼가 티타늄의 염에 의해서 환원된 N-옥사이드 기의 양적 결정방법을 의미한다(Brooks, R.T. 및 P.D. Sternglanz, Anal. Chem., 1959, v. 31, N4. p. 561-565). 산화율은 z=0.5n에 달한다. 알킬화율은 IR-분광(1735 cm 밴드) 및 PMR-분광(2.5-4.5 m.d. 범위)에 의해서 결정되었고 q=0.2n에 달한다.

[실시예 2 -- 신폴 200-35/65의 제조]

에틸렌피페라진 N-옥사이드 및 분자량 25,000(n=200, q=0.35n, z=0.65n)의 N-아세틸에틸렌피페라지늄 브로마이드의 공중합체를 실시예 1과 유사한 세단계 과정을 이용하여 합성하였다.

(1) 첫번째 단계에서, 1Og의 미리 정화된 단량체와 O.11g의 암모늄 브로마이드를 1O㎖의 유리 앰플에 넣고 봉입하였다. 그런 다음 진공펌프에 의해서 앰플내에 진공(5×10^-3mmHg)을 형성하고 앰플을 200℃에서 15시간 동안 유지시켰다. 폴리 -1,4-에틸렌피페라진의 수득율은 약 100%이고 분자량은 80,000(LALLS로 측정)이었다.

(2) 두번째 단계에서, 폴리-1,4-에틸렌피페라진의 N-산화를 하기와 같이 수행하였다.

상기 처음 단계에서 얻은 5g의 폴리-1,4-에틸렌피페라진 1% 아세트산 용액 250㎖에 용해시켰다. 그런 다음 30% H₂O₂4.6㎖를 약하게 교반시키면서 2-4℃에서 첨가시켰다. 산화반응은 48시간 동안 지속하였다. 한외여과 세척 및 동결건조후에 폴리-1,4-에틸렌피페라진(분자량 50,000, z=0.65n)의 N-옥사이드를 회수하였다.

(3) 상기 단계(2)에서 생성된 폴리-1,4-에틸렌피페라진 N-옥사이드을 125㎖의 메탄올에 용해시켰고 그런 다음 16.5g의 브로모아세트산을 첨가하였다. 알킬화반응을 30℃에서 24시간 동안 수행하였다. 용매를 진공상태에서 증발시키고 그 결과 얻은 침전물을 물에 용해시키고 24시가 동안 물에 대하여 투석하고 동결건조시켰다. 하기식(제3도)을 가지는 에틸렌피페라진 N-옥사이드 및 N-아세틸에틸렌피페라지늄 브로마이드의 공중합체가 생성되었다.

수득율은 95%였다. 산화와 알킬화 비율은 실시예 1과 같이 산출되었으며 각각 z=0.65n 이고 q=0.35n이다.

하기의 4개의 실시예는 본 발명의 범위내에 속하는 화합물의 제조법을 예시적으로 나타낸 것이며, 그 화합물은 히알루로니다제 및 다양한 종류의 면역 자극성 담체, 즉 상기 실시예 1과 2의 생성물 형태의 신폴의 반응 생성물을 포함한다.

[실시예 3 --히알루로니다제(HYA)와 신폴 1000-20/50의 공유결합체 제조]

아지드 방법을 이용하는 두-단계의 과정이 HYA와 신폴 1000-20/50의 결합체를 합성하기 위해 수행되었다.

(1) 상기 과정의 첫번째 단계는 신폴 1000/20-50의 히드라지드를 제조하기 위해 사용되었다.

에틸렌피페라지늄 브로마이드(n=1000, q=0.20, z=0.5)의 공중합체를 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 합성하였고, 그 세번째 단계중 하나만 변화시켰다. 브로모아세트산의 에틸 에스테르를 브로모아세이트산 대신에 알킬화 반응을 위해 사용하였다.

500㎎의 궁합체를 25㎖ 메탄올에 용해시켰다. 그런 다음 0.2㎖의 히드라진 수화물(0.2 mmo1)을 첨가하였고 20℃에서 24시간 동안 반응을 계속하였다. 메탄올을 증발시키고 난 후 그 반응 생성물을 회수하고 물에 용해시켰다. 그런 다음 에테르 추출을 하였고 주생성물을 공동(空洞)의 섬유(Amicon)에서 한외여과에 의해서 분리시키고 동결건조하였다.

변형된 중합체내의 히드라지드기의 함량은 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산에 의한 1차 아미노기 결정방법에 대한 종래의 방법을 사용하여 측정하였다[S.L. Snyder 및 P.Z. Sobooinsky, "lmproved 2,4,6-trinitorbenzenesulfonic acid Method for determination of amine", Anal. Biochem., 1975. v 64, N1, p. 284-288].

(2) 두번째 단계에서는 단백질-중합체 공유결합체를 얻고자 신폴 1000-20/50의 히드라지드와 HYA의 축합반응을 수행하였다.

이를 얻기 위하여 신폴 1000-20/50의 히드라지드 100㎎읕 1M HC1 4㎖에 용해시켰다. 그 용액을 교반하고 0-2℃까지 냉각시키고 동시에 3% 아질산나트륨 1.15㎖(0.5 mmol)를 첨가하였다. 15분 경과 후 활성화된 신폴 1000-20/50 용액의 pH를 2M NaOH를 사용하여 8.5로 조정하였다. 그런 다음 0.05M 인산염 완충액(pH 8.5, 인산이수소칼륨, 수소인산이나트륨) 10㎖ 내에 12㎎의 HYA 용액을 활성화된 신폴 1000-20/50의 상기 언급된 용액에 첨가하였다. 그 반응 생성물을 교반하고 냉각시키고(2-4℃) 12시간 반응시간 동안 pH를 2M NaOH를 사용하여 8.5로 유지시켰다.

Biogel p-100 상의 겔-여과를 HYA-신폴 결합체를 정제하였다. 크로마토그래피 컬럼(26×900㎜)를 Biogel 사의 Biogel p-100으로 채워넣고 0.05M NaCl를 함유하는 0.05M 인산염 완충액(pH 7.5)으로 평형을 유지시켰다. 분류액은 동일한 완충액을 사용하여 용리시켰고 그 생성량을 유동 UV-광도계(226nm)에 의해서 조절하였다. 얻어진 결합체를 형광 분광법과 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 이용하여 단백질 함량을 산출하고 결합체룰 분석하였다. 1㎎의 결합체 조제가 0.10㎎의 HYA를 포함하는 것으로 밝혀졌다.

[실시예 4 -- 히알루로니다제(HYA)와 신폴 200-35/65의 공유결합체의 제조]

에틸렌피페라진 N-옥사이드 및 N-아세틸에틸렌피페라지늄 브로마이드(분자량 25,000, n=200, q=0.35, z=0.65)의 공중합체를 상기 실시예 2에 기재된 방법에 따라 합성하였다. 상기 공중합체와 HYA의 결합은 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. HYA의 중합체의 축합은 pH=8에서 5 : 1의 중합체/단백질 비율을 사용하여 수행하였다. 최종적인 결합체의 조제는 1mg의 결합체당 0.15㎎의 HYA를 포함하였다.

[실시예 5]

[활성화된 에스테르법을 이용한 히알루로니다제(HYA)의 신폴 1000-20/50과의 결합]

에틸렌피페라진 N-옥사이드 및 N-아세틸에틸렌피페라지늄 브로마이드(n=1000, q=0.2n ; z=0.5)의 공중합체를 상기 실시예 1에 따라 합성하였다. 2 단계 화학공정을 사용하여 상기 공중합체와 HYA의 공유 결합체를 얻었다.

(1) 첫번째 단계에서, 공중합체의 숙시니미드 에테르를 제조하였다. 이러한 목적하에 100㎎의 공중합체를 4㎖의 디메틸포르아미드내에 현탁시키고 교반시키는 동안에 77.2㎎(0.30 mmol)의 디시클로헥시드카르보디이미드와 36mg(0.30 mmol)의 N-히드록시숙시니이미드를 첨가하였다. 반응 혼합물이 교반되고 냉각되는(2-4℃)동안에 반응을 24시간 지속시켰다. 반응 혼합물을 디옥산, 에틸에테르 및 아세톤을 이용하여 여러번 세척하고 진공 건조기-박스내에서 건조시켰다.

n-부탄올:아세트산(4:1:1)내의 "silufol" 플레이트상에서 박막 크로마토그래피에 의해서 저분자량 혼합물이 존재하지 않음을 알 수 있었다. 그런 다음 활성화된 에테르기의 함량을 표준방법(T. Miron 및 M. Wilchek, Anal. Biochem, 1982, v. 126, N2, pp. 433-435)(pH=8.5, 259 nm 흡광계수 = 9700 1/mol x ㎝에서 0.1 M NH₃수용액)을 이용하여 산출하였다. 몰 흡광계수 "epsilon"은 Lambert-Beer식으로부터 계산하였다.

D=epilson × C × L,

여기에서,

D- 광학 밀도 값γ,

C- 실험될 용액내의 화합물의 농도, 및

L- 광학경로이다.

활성화된 에테르기의 함량은 변형된 중합체 1g당 9×1O^-4mol이다.

(2) 본 과정의 두번째 단계에서는, 상기 공중합체의 숙시니미드 에테르에 HYA를 공유결합시켰다. 이러한 목적으로 상기 단계(1)에서 생성된 1OO㎎의 활성화된 공중합체를 0.05M 인산염 완충용액(pH 6.0) 10㎖ 내에 용해시키고 냉각시킨 후 계속 교반시키는 동안 0.05M 인산염(pH 7.5) 12㎖ 내에 용해된 15㎎의 HYA의 용액을 첨가하였다. 축합반응은 18시간 동안 0℃에서 지속하였다. 그런 다음 결합체를 Biogel p-100(BioRad) 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해서 반응 혼합물로부터 분리하고 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 분석하였다. 단백질-중합체 결합체의 최종 조제는 1mg의 결합체당 HYA 0.10㎎을 포함한다.

[실시예 6 -- 결합체내에 HYA 대 신폴의 비가 2:1인 공유 결합체의 제조]

신폴 1000-20/50을 상기 실시예 3에 기재된 방법에 따라 합성하였다. HYA와 신폴의 결합은 상기 실시예 3에 기재된 바에 따라 수행하였고, 그 과정중 하나만 변화시켰다. 반응생성물내의 신폴 대 HYA의 초기 비율이 2:1이었다.

최종적인 결합체 조제는 1mg당 HYA 0.3㎎을 함유하였다.

[실시예 7 -- 왁친 조제]

본 실시예에 따라 제조된 왁친은 HYA-신폴 결합체 및 면역 보조제로 작용하는 부가적인 양의 신폴 그 자체로 구성되었다.

신폴 1000-20/50은 실시예 1에 따라 얻었다. HYA와 신폴의 결합을 실시예 3에서와 같이 초기 중합체/단백질 1:1 비율을 이용하여 수행하였다. 즉 5㎎의 HYA를 5㎎의 신폴 1000-20/50과 히드라지드법을 사용하여 결합시켰다. 그런 다음 40㎎의 신폴 1000-20/50 수용액을 첨가하여 결합체를 정제하고 혼합하고 동결 건조시켰다. 최종 복합체 조제내의 HYA 함량은 실시예 3에서와 같이 분석하였으며 1㎎의 조제당 0.1㎎의 HYA를 함유하였음을 보여주었다.

[실시예 8-- 뮤라밀디펩티드의 유도체를 면역 보조제로서 함유하는 왁친 복합체]

본 실시예에서 제조된 왁친은 HYA-신폴 결합체 및 면역 보조제로 알려진 뮤라밀디펩티드의 글리코사미닐 유도체로 이루어졌다.

신폴 1000-20/50을 실시예 1에 따라 합성하였다. HYA와 신폴의 공유 결합체는 1:1의 중합체/단백질 비율을 사용하여 실시예 3에서와 같이 얻었다. 즉, 5㎎의 HYA가 5㎎의 신폴 1000-20/50에 결합하였다. 그런 다음 10㎎의 N-아세틸글루코사미닐-N'-아세틸-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(GMDP)을 첨가하였고 복합체 혼합물을 동결건조시켰다.

[실시예 9 -- 면역 보조제로서 수산화알루미늄을 포함하는 왁친 복합체]

왁친 복합제는 HYA-신폴 결합체 및 면역 보조제로서 수산화알루미늄으로 구성되어 있다.

신폴 1000-20/50은 실시예 1에 따라 얻었다. 상기 실시예 3에 기재된 방법을 이용하여 신폴과 HTA를 공유결합시키는 동안에 궁합체/단백질 비가 1:1인 것을 사용하였다. 결합체 조제는 동물의 면역화 바로전에 즉시 수산화알루미늄의 현탁액과 완전히 혼합시켰다.

[실시예 10 -- H-Polyvac의 임상전 안정성 평가]

H-Polyvac는 기생충의 이동성 형태에 대한 중합체-항원 왁친이다. 상기 왁친은 중합체 면역자극제 신폴과 히알루로니디제(HYA)의 결합체이다. 그 단백질 항원 HYA는 많은 유충단계의 기생충 형태에서 공통적으로 존재한다. 신폴은 본 출원인에 의해서 개발되었고 철저히 연구되었다. 상기 중합체는 0.25㎎/㎏의 투여양에서도 인체 유기체에 대해 안전함을 보여주었으므로 독립성 면역 자극제로서, 그리고 보조제 및/또는 왁친의 담체로서 추천될 수 있다. 면역생물학적 약제 위원회에서 결합체 왁친의 화합물로서 신폴의 주입에 대하여 허가를 내주었다. 사육용 동물(양, 소)에 대한 H-Polyvac의 권장 투여량은 동물 1마리당 4m이며 0.5㎎의 HYA항원을 포함한다.

본 실험의 목적은 H-Polyvac 왁친의 독소의 평가를 통하여 안전성을 평가하려는 것이다. 얻어진 자료의 신빙성을 증가시키기 위하여 본 실험을 3종의 동물(마이스, 랫 및 기니아 피그)에 수행하였다. 예방접종 투여량에 근접한 투여량의 영향이 연구되었을 뿐만 아니라 예방접종 투여량보다 10-100배 높은 투여양인 과다투여시의 효과도 연구되였다. 독소 연구에서의 높은 투여량을 사용할 때 사용된 조제의 독소 특성을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 표적 기관을 확립시킬 수도 있다. 높은 투여량의 주입이 있는 동안 검출되는 병리학상의 변화는 임상시험에 금기(禁忌) 사항은 아닌 것으로 생각되나 시험된 조제의 제한에 대하여 가치있는 정보를 제공한다

얻어진 시험과 데이타의 상세한 설명읕 하기 전에 하기의 설명이 그 결과를 이해하는 데 도움이 될 것이다. 하기 표 8에서 보는 바와 같이 위약(僞藥) 대조군의 10∼20%의 랫에서 폐렴, 폐확장부전(atelectases) 및 폐종기가 발생하였다. 대부분의 실험의 동물-사육용 시설의 표준 조건하에서 유지된 대부분의 랫, 마이스 및 다른 실험용 동물이 완전히 건강치 못하다는 사시른 동물병리학의 전문가들 사이에 잘 알려져 있다. 사실상 그것들은 다양한 병리학연구에 의해서 고통을 받으나, 이런 연구는 내부 조직 및 기관의 병리형태학적 실험없이는 일반적으로 확립될 수 없다.

예를 들어 박테리아 병인학(病因學)의 잠복성 감염이 실험실용 동물에서 세심히연구되었다(K. Benirschke, 편집자 Pathology of Laboratory Animal, New York(1978). 대조군(임상학적으로 건강함)에서의 폐 질병의 빈도가 상당히 높아졌다. G. Paget와 P. Lemon에 따르면 실험실용 랫 대조군의 99% 이상이 폐에서의 잠복성병리성을 가진다(Pathology of Laboratory Animnal, 편집자 W. Ribelin 및 J. McCoy, Springfield, 1965, pp. 382-405). 유사하게 실험용 랫 대조군내에서 81% 빈도의 폐렴을 보여주었다(J. Nelson, Pathology of Laboratory Rats and Mice, E. cotchin 및 F. Oxford, 1967, p. 259). 실험용 랫내의 이른바 "잠복성 만성 호횹기 질환의 병리형태학이 J. Innes 등(Am. J. Path., 1956, v. 32, pp. 141-160, 및 Pathology of Laboratory Rats and Mice, 편집자 E. cotchin 및 F. Roe, oxford, 1967, pp 229-259) 뿐만 아니라 J. Lindsey 등(Disease of Laboratory Animals Complicating Biomedical ResearCh, Cicago, 1971, pp. 675-716)에 의해서 기재되어 있다.

J. Lindsey (op. cit), E Venzon 등(Philipp.j.vet.Med., 1979, v 18, pp. 117-124), 및 M. Van Zwieten 등(Lab.Anim.Sci., 1980. v. 30, pp. 215-221)에 따르면 랫의 폐에 잠복성의 병리학적 과정은 주로 마이코폴라즈마 폐렴, 파스터우렐라스피랄티리스 및/또는 마우스 폐렴바이러스에 의해서 주로 유도된다.

임상학적으로 정상적인 WAG, 아우구수트(August) 및 비스타(Wistar) 동종교배된 랫 및 Russian Academy of Medical Sciences의 생산성 콜로니의 동종교배되지 않은 동물을 집중적으로 조사하여 보면 40∼96% 랫이 만성 호흡기 질환에 걸려 있다는 것을 보여주었다. 호흡기관은 만성적인 간질(間質)성의 폐렴의 발생(E. AbdrashitoVa, Respiratory organs of Rats bred in Production colonies, Bull .Acad. Med.Sci. Russ, 1993, N9, 81-85)에 뿐만 아니라 상부 호횹관, 기관, 기관지의 만성적 카타르(catarrh) 또는 카타르-화농성 염층에 부분적으로 또는 전체적으로 관여한다. 만성 장염(腸炎)에 관하여 그것의 정확한 병인학은 확립되지 못하였으나 잠복성 감염 질병의 징후일 것이라고 생각된다. 이러한 질병의 대부분은 일정 종류의 상기 언급된 박테리아에 의해서 유도되는 임상학적으로 잠복성이 만성 염증이었다.

소위 "정상"인 동물도 종종 잠재성 감염에 걸리기도 한다는 것은 분명한 사실이다. 이것은 비-최적 생활 조건 때문에 일어나고 주로 대부분의 자연 동물 사육장에서 발견되었다. 이러한 상황은 화합물의 실험조사 및 동물시험에 관하여는 최적 조건이 아닌 반면 그 시험에서 동물 대조군에 관한 몇가지 긍정적인 결론을 얻을 수 있었다. 이용된 동물이 "잠재성" 감염으로 인하여 약화되기 때문에 실험결과는 건강한 동물 뿐만 아니라 약화된 동물에서 조차도 H-Polyvac(10배의 투여량으로 10번 주입)의 완전한 안정성을 보여주었다. 끝으로 정상적으로-감엄된 실험용 동물에서 얻은 실험결과는 실제 농장 조건하에서 얻은 것에 상당히 근접하였다는 사실이 추가로 발견되었다.

[1. 연구에 사용된 물질과 방법]

H-Polyvac의 임상전 안정성을 평가하기 위하여 복막내 주입되는 동안 마이스내의 급성 독소성 및 매일 H-Polyvac이 예방접종 투여량 보다 10배 더 높게 10일 동안 계속하여 주입되는 동안 만성 독성의 평가를 하였다. 이것은 주변의 혈액 분석, 간과 신장의 기능시험, 심장혈관계 및 내부기관변화의 병리형태학적 분석에 의해서 이루어 질 수 있다. 또한 알레르기, 돌연변이, 발열성 및 발암성 효과 뿐만 아니라 주입에 대한 국소적인 조사가 행하여졌다.

4㎎ 투여량(10∼15㎏ 중량의 양에 대하여 0.5mg 단백질)을 1번 투여량의 왁친으르서 투입하였다.

[2. H-Polyvac의 급성 또는 아급성(subacute)의 독성 평가]

H-Polyvac의 평균 치사 투여량은 25g의 기준 중량으로 마이스에서 속성 시험에서 확립되었다. 동물을 그들의 체중에 따라 세심히 선택하였고 각각은 1g 이하의 즉 5% 이하의 기준 중량에서부터 다양하였다. 각각의 투여량은 16일의 관찰기간 동안 6 마리의 동물로 시험되었다. 치사율 점검도 매일 수행하였다.

2주의 관찰기간 말기에 동물은 죽었으며 그것들의 기관도 형태학적으로 실험되었다. H-PolyVac 샘플을 생리적 용액에 용해시킨 후 5% 용액을 제조하고 3g/㎏, 1.5g/kg 및 0.75g/㎏의 왁친을 각각 포함하는 투여량으로 복막내로 주입하였다.

평균 치사 투여량은 Litchfield 및 Wilcockson의 프로빗(Probit) 분석 방법을 이용하여 결정하였으며 이것은 널리 사용되고 있으며 상대적으로 완전한 정보를 얻도록 해준다.

표 1의 데이타는 H-Polyvac LD-50이 1.66 + 0.04g/㎏임을 나타낸다.

[3. H-Polyvac 주입의 국소적 반응 평가 피부내 주입]

H-Polyvac 주입에 대한 국소적 반응의 평가실험은 USSR Ministry of Health의 Directive No. 31, "Unification of Immunobiological Drug Control Techniques"에 기재된 바에 따라 수행하였다.

5 마리의 기니아 피그가 이 실험에 사용되었다. 생리적 용액 및 1 : 10 그리고 1:100으로 회석시킨 H-Polyvac(0.1㎖ 내에 800㎎)을 한꺼번에 체모를 제거한 후 0.1㎖ 부피의 서로 다른 구역의 피부내로 주입시켰다

관찰기간은 1달이었다

결과 : 이 관찰기간 동안 어떠한 가사적인 피부염증이 보이지 않았다.

[4. H-Polyvac 아급성 독성 평가]

실험을 270∼320g의 기준 체중을 가지는 60마리의 숫컷의 Wistar 랫으로 수행 하였다. 동물을 3군으로 나누어 각 군이 20마리의 랫을 포함하도록 하였다. 첫번째 동물군은 0.4㎎/㎏의 H-Polyvac을 투여하고, 두번째 군은 4㎎/㎏의 H-Polyvac을 투여하고 세번째 군은 대조부로서 사용하기 위해 생리적 용액을 주입 하였다. H-Polyvac을 10일 동안 매일 근육내로 주입하였다. 몇몇 동물은 H-Polyvac 투여가 끝난 후, 즉시 그리고 다른 것은 투여가 끝난 다음 4주 후에 죽었다. 규칙적인 체중 평가외에도 생리적, 생화학적, 형액학 및 조직학적 시험을 행하였다. 그 다음 그 결과는 통계적 방법에 의해서 평가하였다.

결과 : 전체 관찰기간(6주)동안 대조군에 비하여 실험용 동물의 체중 증가에서의 상당한 차이는 보이지 않았고, 동시에 4㎎/㎏을 주입시킨 동물이 0.4㎎/㎏을 주입시킨 동물보다 더 낮은 체중증가를 나타내었다(제4도).

[4. 1간과 신장의 기능시험]

혈액 혈청 분석을 F-901 생화학 분석기(Finland) 및 LAHEMA(USSR) 진단 키트를 사용하여 수행하였다. 이 결과는 표 2에 나타나 있다. 표 2에서 보는 바와 같이 0.4㎎/㎏ 및 4㎎/㎏ 투여후에 모두 ALT 활성이 증가되었다(각각 145 및 19%). 실험된 동물의 혈액 혈청의 생화학적 범위는 시험기 종료된 4주후의 대조군의 것과 다르지 않았다.

매일 이뇨(利尿) 속도를 검사하여 신장기능을 평가하였다. 또한 사구체 여과와 정맥 재흡수도 시험하였다. 결과는 표 3 및 4에 기재되어 있다. 얻어진 데이타는 신장 여과 막-투과성, 정맥 재흡수나 사구체 여과 중 어느 것도 2주 동안의 H-polyvac의 매일 주입시킨 것에 의해 영향을 받지 않았다는 것을 보여준다.

[4. 2 혈액학적 분석]

헤모글로빈 농도, 헤마토크릿 비율, 색 지수 및 혈구(血球) 헤모글로빈 농도 뿐만 아니라 Goryaev Chamber을 사용하여 측정함으로써 주변 혈액의 상태를 평가하였다. 색지수는 다음과 같이 결정된다.

혈구 헤모글로빈 농도는 다음과 같이 결정된다.

여기에서, Ht = 헤마토크릿 이고

Hb = 헤모글로빈 이다.

결과는 표 5에 나타내었다.

상기 데이타는 헤마토크릿 비율이 대조군에 비하여 10배의 투여량인 4㎎/㎏을 주입시킨 군에서만 상당히 감소한 것으로 나타났다. 이러한 감소는 랫에서의 변수의 정상적인 생리학적 변화를 초과하는 것은 아니다. 주변의 혈액에서는 10일간 H-Polyvac 주입 후 즉시 그리고 투여가 종료되고 한달 후에 모두 다른 상당한 이상성이 발견되지 않았다.

[4. 3 중추신경계(CNS) 상태 검사]

숫컷의 Wistar 랫으로 실험하였다. H-Polyvac을 10일간 매일 근육내로 주입시켰고, 대조군은 생리적 용액만을 주입하였다. H-Polyvac의 CNS 기능상태에 대한 영향을 평가를 마지막 주입후에 실시하였고 그 다음 한달후에 반복하였다.

하기 시험을 수행하였다.

--- CNS 상태와 신경-근육 활성을 반영하는 통합적인 변수인 편향(orientation) 반응 및 운동활성,

--- 편향 반응을 특징짓는 "홀(Hole)" 반사작용,

--- 동물의 고통 인지작용을 특징짓는 "테일 플리크(tail flick)" 반사작용,

--- 근육 활성 및 이동 상호작용을 특징짓는 "스프링(spring)" 시험.

이들 시험은 CNS 상태의 완전한 검사를 구성한다(독소학 연구에서의 동물의 행동 작용을 이용하는 방법론적인 장점, Kiev, 1980).

결과는 표 6 및 7에 나타내었다. 운동 활성(경주(race))에서의 감소가 투여종료후 두 개군에서 모두 발생하였는데 0.4㎎/㎏을 투여한 군에서의 대조군과의 차이가 통계학적으로 중요하다(p ＜ 0.05). 운동 활성은 회복기간 경과 후 대조군와 유사하게 된다. 대조군 동물과 비교할 때 다른 시험에서는 상당한 차이가 나타나지 않았다.

[4. 4 병리형태학적 분석]

숫컷의 Wistar 랫을 이용하여 병리생리학적 분석을 실시하였다. H-Polyvac을 10회의 주입량으로 근육내에 투여하였는데 각각은 0.4㎎/㎏ 및 4㎎/㎏을 포함한다. 생리학적 용액은 대조군으로 사용하였다. 연구물질은 두번 투여하였다. H-Polyvac 주입 종류 후 즉시(첫번째 계, 26마리 동물) 및 최종투여 후 한달(두번째 계, 회복기, 25 마리랫). 모든 동물은 하기 시험을 하기 위해 희생되었다.

생화학적 분석을 하기 위한 혈액을 모은 후에 사체 해부를 행하였다. 그런 다음 내부 기관 무게, 색상, 혈액충진 정도, 혈액역학적 교란 정도 또는 다른 이상성의 측정 뿐만이 아니라 내부기관, 장막(serosa) 및 공동의 육안 검사도 행하였다.

하기 기관의 조직을 분석하기 위해 기관 및 조직 샘플을 36마리 동물(각 군당 6마리 랫)로부터 기관 및 조직 샘플을 취하였다. 간, 신장, 심장, 폐, 고환, 부신, 흉선, 비장, 다른 위지의 램프절, 뇌, 척수, 위, 소장, 대장, 췌장, 갑상선, 뇌하수체, 주입된 위치의 피하 세포지방 및 근육 전체 기관 및 조직과 기관의 샘플을 10% 포름알데히드 염수에 고정시키고 세척하고 에탄올로 처리하고 파라핀 내에 존재하게 하였다. 적어도 두개의 절단면이 글래스위에 위치하도록 하여 헤마톡실린-에오신으로 염색 하였다.

감염과 기생충 질병(상기 참조)이 매우 빠르게 퍼지기 때문에 대조군 동물의 기관내에서의 병리학적 및 반응성 변화를 종종 관찰하였다. 결과적으로 각 조에서 검출된 이상성의 빈도.

[4. 4. 2 육안 관찰의 결과]

H-Polyvac 투여 종료 후 바로 죽은 동물 그리고 4주 후에 죽은 동물의 표 8및 9에 나타나 있다. H-Polyvac 투여종료 바로 직후 죽은 것과 4주 후에 죽은 것의 실험용 해부시체 둘다의 색상 및 혈액충진 수준이 대조군 변수와 동일한 것으로 나타났다. 표 10은 첫번째 계와 두번째 계의 실험용 랫에서의 절대적 내부 무게의 변수를 나타낸 것이다. 0.4㎎/㎏의 H-Polyvac을 투여한 첫번째 계에서는 비장의 무게가 약간 감소되었으며 4㎎/㎏의 H-Polyvac을 투여한 계에서는 서혜부(鼠蹊部, groin)의 림프절의 중량이 약간 증가하였다. H-Polyvac의 투여 종료 직후 희생된 것 뿐만 아니라 4주 후에 죽은 것의 내부 기관 중량의 상대 지수가 대조군 동물의것과 유사한 것으로 나타났다(표 11). 여기에 사용된 "내부기관 중량의 상대 지수(relative index)"란 표현은 각각 동물의 특정 기관의 중량을 체중으로 나누고 100%릍 곱한 평균 비율을 의미한다.

H-Polyvac이 주입된 자리(피하 세포지방, 근육)를 육안으로 검사해 보면 H-Polyvac 주입 종료 바로 직후 죽은 동물(첫번째 계)에서는 어떠한 혈액역학 교란도 볼 수가 없었다. 단지 9마리의 대조군 동물 중 하나 및 0.4㎎/㎏을 투여한 군내의 8 마리 동물중 하나만이 피하 세포지방내에 세공(細孔, puncture) 출혈을 가졌다. 두번째 계(회복기)에서 피하 세포지방내의 세공 출혈이 8 마리의 대조군 동물중 하나의 랫에서 관찰되었다. 두 개의 계중 모든 군내에서 염증의 징후(홍반, 침윤 병소)기 나타나지 않았다.

[4. 4. 3 주입자리의 육안 관찰의 결과]

첫번째 계(대조군, 0.4㎎/㎏ 및 4㎎/㎏)의 랫의 피하 세포 조직 및 고관절(股關節) 근육을 조직병리학적 검사를 하는 동안에 미소순환계내에 어떠한 이상성도 발견되지 않았다. 실험용이나 대조군에서도 부종, 피하 침윤 및 생산성 반응도 없었다.

균육 섬유내에 유괴사증(necrobiotic)이나 영양장애(dystrophic) 변화도 실험용 그리고 대조군 동물에서 관찰되지 않았다.

대조군 랫의 근육 조직내의 염중의 징후도 없었다. 동시에 완화된 단핵의 침윤 병소가 0.4㎎/㎏의 투여량의 H-Polyvac를 주입시킨 6마리 중에서 3마리에서 관찰되었고, 단핵세포와 대식세포가 우세하게 되었음을 알았다. 4㎎/㎏의 H-Polyvac을 주입시킨 6 마리중 4 마리에서 단핵성 침윤 병소의 수와 크기의 증가가 있었다. 또한 림프구의 우세성 및 종종 플라즈마 세포의 검출 등의 세포변화가 있음을 쉽게 알 수 있었다.

H-Polyvac 투여종료 후 4주 뒤에 주입자리의 조직학적 연구가 진행되는 동안작은 단핵성 침윤병소가 대조군 중에서 하나의 동물 그리고 0.4㎎/㎏의 H-Polyvac을 주입한 군으로부터의 하나의 랫에서 관찰되었다. 작은 단핵성 침윤병소가 근육 조직에서 관찰되었다. 미소순환계 이상성, 유괴사증 도는 영양장애 등 변화현상은 없었다.

[내부기관. H-Polyvac 주입의 종료]

[심장]

다중의 작은 말초혈관 출혈이 6 마리의 대조군 랫중 하나의 심근 그리고 0.4㎎/㎏의 H-Polyvac을 주입한 6 마리중 하나에서 관찰되었다. 실험용이나 대조군중 어느 것에서도 미소순환계에 다른 변화는 없었다.

부종이나 간질성 부기도 없었고 염중성 침윤 또는 기질(基質) 심근의 생산성 작용도 존재하지 않았다. 근섬유의 평원형의 와해 또는 근세포 분해도 관찰되지 않았다.

혈관과 모세혈관의 출혈, 때때로 다출혈과 함께 모든 군의 폐에서 관찰되었다.

폐확장 부진(atelectases, 폐포벽의 부분적인 경축(contracture) 뿐만 아니라 작은 집중된 기종(氣腫)이 실험용 및 대조군의 몇몇 동물에서 검출되었다. 다핵 및 단핵의 침윤병소가 두 그룹 모두의 간극(interstice)에서 관찰되었다. 완화된 활성의 기관지-관련 림프성 조직이 검출되었다. H-Polyvac은 0.4㎎/㎏ 또는 4㎎/㎏을 투여한 미소순환계내의 울혈(congestion) 현상의 증가를 초래하지 않았으며 영양장애, 유괴사증 또는 염증성 과정도 존재하지 않았다. 미소순환계에서도 아무런 변화가 없었으며, 사구체 및 네프론 세관에서도 유과사증 또는 영양장애 변화가 없었고, 0.4㎎/㎏ 또는 4㎎/㎏의 투여량에도 염증성 반응의 징후를 나타내지 않았다.

모든 군에서의 간 미소순환졔에서도 어떤 이상성도 존재하지 않았다. 실험용 및 대조군 기관의 구조가 유사하였다. 간세포에서도 영양장애 변화는 보이지 않았다. 하나의 대조군 랫이 작은 괴사성 병소를 가졌으며, 실험용이나 대조군에서도 어떠한 유괴사증 징후가 없었다. 염증성 변화(망상내피세포층 세포, 다핵 및 단핵 침윤병소의 증식 및 이상발달)가 어떤 시험군에서도 발생하지 않는다. 실험된 모든 동물에서 췌장의 미소순환계내에서도 어떠한 변화가 없었다. 외분비선 부분(췌장 포도상선(腺))의 구조변화도 관찰되지 않았다. 영양장애성, 유괴사증 및 염증성 과정의 어떠한 징후도 0.4㎎/㎏ 또는 4㎎/㎏의 투여량으로 H-Polyvac을 주입한 후에 관찰되지 않았다.

[식도 및 위]

0.4㎎/㎏ 또는 4㎎/㎏의 투여량으로 H-Polyvac을 주입시킨 후 미소순환계에서 어떠한 변화도 없었다. 식도 상피세포 손상이나 위에서의 심장부, 저부(fundic) 또는 유문부의 구역의 어떠한 상피세포 손상이나 염증반응도 존재하지 않았다.

비만, 기형 및 때때로 서로에게 용모(villi)의 부착과 함께 나타나는 만성장염의 징후가 모든 대조군 동물의 소장내에서 관찰되었다. 융모 기질(基質) 침윤에 의해 수행되는 상피세포 영양장애(dystrophy) 및 박리 현상이 발견되었다. 소장의 몇몇 부분에서 소낭(crypt) 파괴로 심한 변화가 일어났다. 만성 장염의 징후는 약한 것부터 심하게 위축 성인것까지 다양하다. 대조군과 비교하여 H-Polyvac을 0.4㎎/㎏ 또는 4㎎/㎏ 투여량으로 주입한 군에서는 변화가 없었다.

[대장]

0.4㎎/㎏ 또는 4㎎/㎏의 투여량으로 H-Polyvac을 주입시킨 후 미소순환계의 변화가 없었으며 대조군에서도 변화가 없었다. 대장 점막도 손상되지 않고 평탄하고 부종이 없는 것으로 발견되었다. 융모와 소낭 상피세포의 손상, 영양 결핍성 변화나 박리현상의 징후도 없었다. 재생산되는 상피세포의 활성도 높은 것 같았다. 어떤 염증성 침윤병소도 없었다.

대조군 동물의 흉선의 미소순환계내에서도 변화가 없었다. 0.4㎎/㎏의 H-Polyvac을 투여한 6마리중 한 마리가 흉선의 피질에서 출혈을 나타내었다. 4㎎/㎏의 H-Polyvac을 투여한 6 마리 중에서 세 마리의 랫에서 혈관벽의 투과성이 증가되어 더 많은 출혈이 있는 것으로 기록되었다. 이 군은 갑작스런 흉선 퇴축(退縮)(피질구역의 감소와 연계 조직 영역의 긍가를 반영)의 징후를 나타내였다. 염증 반응은 시험된 어떤 군에서도 발견되지 않았다.

[비장]

0.4㎎/㎏ 또는 4㎎/㎏ 투여량으로 H-Polyvac을 수입시킨 후 미소순환계에는 어떠한 변화도 나타나지 않았으며 대조군도 마찬가지였다. 완화된 경향의 백색의 펄프 영역 감소 뿐만 아니라 배종(胚種) 중심부의 축소가 관찰되었다. 백색 펄프의 세포 구성 체계(배종 중심부, T-의존성 및 가장자리 영역의 비율)는 변형되지 않았다. 실험용군의 기능성 영역의 활성은 대조근의 것과 다르지 않았다. 면역 세포(immunoblast) 및 플라즈마 세포의 수는 유사분열 현상 및 피크노시스(pyknosis)에서와 같이 일정하게 낮게 유지되었다. 실험용군이나 대조군에서 영양 결핍성, 유괴사증 또는 염증성 과정의 징후가 나타나지 않았다.

[장간막 및 서혜부 림프 절]

실험용 또는 조절군에서 미소순환계에서 어떠한 변화도 없었고 영양장애성, 유괴사성 및 염증성 과정의 징후도 나타나지 않았다. 3-등급 시스템에 따라 평가된 세가지 형태의 면역성(T-, B- 및 거대세포(macrophagal)의 활성 변수는 실험용 및 대조군에서 유사하게 나타났으며 정상적인 범위내에 있었다.

[뇌]

대조군이나 0.4㎎/㎏ 또는 4㎎/㎏의 투여량으로 H-Polyvac을 주입한 군에서는 뇌단면의 조직학 연구중에 미소순환계의 변화가 없었다. 심실 또는 뇌막의 현관내에서도 변화가 없었다. 중식성 신경교(glial) 반응과 함께 회질 또는 다른 뇌 신경의 구조적 변화는 관찰되지 않았다.

[척수]

0.4㎎/㎏ 또는 4㎎/㎏의 투여량으로 H-Polyvac을 주입시킨 후 미소순환계의 변화가 없었고 대조군에서도 존재하지 않았다. 전부 및 후부 기관, 신경교 세포, 백질 조직, 또는 염증성 반응의 구조적 변화도 발견되지 않았다.

[뇌하수체]

실험용에서도 대조군에서도 미소순환계의 변화가 존재하지 않았다. 0.4㎎/㎏ 또는 4㎎/㎏의 투여량으로 H-Polyvac을 주입시킨 랫에서 뇌하수체 구성체계(선(腺) 뇌하수체, 동등(pars) 매개물, 신경 뇌하수체)가 대조군 동물과 유사 하였다. 모든 형태의 호르몬 생성 세포는 선뇌하수체의 상피세포에 존재하고 영양 장애성, 유괴사성 또는 염증성 반응은 시험된 모든 군에서 발견되지 않았다.

[갑상선]

실험된 모든 군에서 계의 변화가 관찰되지 않았다. 실험용 군에서의 갑상선 기능단위(소낭)의 구조적 조직은 대조군과 다르지 않았다. 소낭(follicle)은 비공포화된 콜로이드로 균일하게 충진된 반면 상피세포는 단일층의 입방구조를 가진다.

영양장애성 징후없이 나타난 티로사이트(tyrocyte) 및 C-세포가 성장 또는 괴사증(necrosis)을 증가시켰다.

염증성 기질(stromal) 반응은 대조군에서와 0.4㎎/㎏ 또는 4㎎/㎏의 투여량으로 H-Polyvac을 주입시킨 랫에서도 나타나지 않았다.

[부신]

0.4㎎/㎏ 또는 4㎎/㎏의 투여량으로 H-Polyvac을 주입시킨 후의 미소순환계에서나 대조군에서 어떠한 변화도 없었다. 실험용군에서의 기능 영역(피질 및 수질 구역)의 비가 대조군과 유사하게 나타났다. 시험된 모든 군에서 분비세포 또는 염증성 반응에서의 영양장애성이나 유괴사증 변화의 징후가 없었다.

[고환]

실험용에서나 대조군에서 미소순환계의 변화가 없었다. 시험된 모든 군에서 부고환(epididymal) 구조도 손상되지 않은 채로 유지되었고 영양장애성이나 유괴사증 변화가 없었고 정낭(spermatogenic), 세르톨리(sertoli) 세포의 박리현상도 없었고 비정낭형성(aspematogenesis)도 없었다. 리히디히(Leydig) 세포에서는 어떤 병리학적 변화나 간질(間質)성 염증도 일어나지 않았다.

따라서 병리형태학적 분석은 다음과 같다.

--- 0.4㎎/㎏ 및 4㎎/㎏의 투여량으로 H-Polyvac을 근육내로 지속적으로 주입 하는 것은 시험된 기관내에 영양결핍성 및 유괴사증 변화가 생기지 않는다.

--- 하기 기관의 미소순환계는 별다른 이상성이 발견되지 않았다. 0.4㎎/㎏의 H-Polyvac을 투여한 (6마리중) 한마리 및 4㎎/㎏의 H-Polyvac을 투여한(6마리중) 3마리의 흉선, (6마리중) 하나의 대조군 랫 및 0.4㎎/㎏의 H-Polyvac을 투여한 (6마리중) 하나의 실험용 랫의 심장,

--- H-Polyvac을 근육내로 주입하면 자발적인 장염의 빈도 및 강도에 영향을 미치지 않는다.

--- 실험용 군의 흉선과 비장의 선(腺) 세포조직 작동영역(흉선의 회질 구역 및 비장의 백색 펄프)에서 증가되는 경향이 있었다. 그러나 자발적인 만성 장염의 발생의 결과도 면역체졔가 불활성화되기 때문에 얻어진 결과를 해석 하기가 난해하다.

[회복기]

H-Polyvac의 투여 종료후 4주 후에 조직학적 검사를 하는 동안 시험된 모든군에서(상기 언급한 소장만 제외하고) 기관에서도 미소순환계 이상성, 영양장애성 또는 유괴사증 변화 또는 염증성 반응의 징후도 나타나지 않았다.

폐확장 부전(atelectase) 및 작은-병소의 기종(氣腫)이 실험용 및 대조군의 폐에서 관찰되었다. 모든 실험된 군의 소장에서는 자발적인 만성적 장염의 징후가 발견되었다. 상피세포 영양결핍 및 박리 현상 뿐만 아니라 융모 기질의 원형의 세포침윤이 발견되었다. 장염의 강도는 모든 시험된 군에서 약한 것부터 심한 것까지 다양하였다.

매우 낮은 회질 활성과 함께 노쇠 퇴축의 징후가 모든 군의 흉선에서 발견되었다[대조군, 0.4㎎/㎏ 및 4㎎/㎏).

비장의 기능 영역의 완화된 활성은 적색 펄프내의 저강도의 플라즈마 세포반응 및 때때로 수질 외부 혈액생성(hemopoietic) 병소와 결합된 것으로 나타났다.

결론 : H-Polyvac을 10회 근육내 주입한 동물에서 실시한 병리형태학적 분석의 결과는 H-Polyvac이 0.4㎎/㎏ 및 4㎎/㎏의 투여량으로 시험된 모든 군에서의 어떤 병리학적 변화도 일으키지 않는다는 것이었다.

5. 알레르기성에 대한 H-Polyvac의 실험 테스트

이전의 실험은 신플 감지성 활성이 존재하지 않는 것으로 나타났다. 이 실험의 목적은 신폴이 단백질 항원과 결합하여 사용되기 때문에 알레르기성에 대한 H-Polyvac 왁친의 활성을 알아보기 위한 것이다.

상기 실험은 40 마리의 기니아 피그로 수행하였고 4개의 군으로 나누고, 제 1 군--대조군, 제 2 군--단백질 항원, 제 3 군--신폴 및 제 4 군--H-Polyvac을 일주일에 1번 2㎎/㎏ 피하 주사량으로 4회 투여하였다.

피부상의 강하 시험은 2% 수(水) 단백질 및 신폴용액으로 실시하였다.

효소적 가수분해적 조제의 알레르기 효과를 평가하기 위해 P.L. Zeltser 및 V.N. Drozdov에 의해 고안된 히스타민 유발 기술을 감지성 반응을 검출하기 위해 사용하였다. 이 기술은 0.03 ㎎/㎏ 히스타민과 조합하여 시험할 항원을 복막내 및 피하내로 주입하고 1.5∼2시간 동안 과민성 반응에 관여된다. 이 기술에 따라 히스타민은 약한 알레르기원의 감지성 특성을 더 빠르고 분명하게 반영하기 위한 혈액보조제로 작용한다. 이전의 기나아 피그 실험(Dudintsava et al., 1982)을 변형한 로제트-형태 및 마이토겐-자극성 로제트-형태(MSRF)의 이중의 반응(표 12)에서 다른 림프구 분포의 양적비율 및 기능적 상태가 10마리의 실험용 및 30마리의 대조군 동물에서 평가되었는데 면역 림프구에 대한 H-Polyvac의 영향력을 결정하기 위한 것이었다.

그 결과는 2% 단백질 항원 용액의 단시 1차적인 자극성 효과를 나타내고 H-Polyvac이 위지한 후에 잠시 후 처음으로 혈관이 붓고 충혈되었음을 반영하는것이었다.

림프구의 어떠한 감지성이나 양적인 또는 기능적인 이상성이 중합체 항원성 왁친으로 인체 유기체를 처리한 후 발생된다는 것이 이들 실험에 의해 밝혀졌다. 혈관에 대한 일정 역효과는 금기(禁忌)가 확립되었다. 하더라도 고려의 대상이 되어야 한다.

[6. 우성 치사 돌연변이를 유도하는 H-Polyvac 작용력의 평가]

1981년 USSR Ministry of Health에서 채택한 "Recommendation on New Drug Mutagenic Properties Control"에 따라 실험을 실시하였다.

실험은 정자형성(spermatogenesis)의 전감수분열 및 후감수분열 단계가 진행되는 동안 5주간에 걸쳐 계속하였다. H-Polyvac을 0.6㎎/mouse 및 30㎎/mouse의 투여량으로 복강내로 주입하였고, H-Polyvac으로 처리한 숫컷을 세마리의 암컷과 함께 방치하여 두었다. 18일 후에 암컷 쥐를 해부하였고 살아있는 것과 죽어있는 것의 수도 확인하였다.

결론: H-Polyvac은 쥐의 배(胚)세포내에서 치사 돌연변이를 유도하지 않았다.

또한 30㎎/mouse(1.5g/㎏)의 투여량은 LD-50에 근접하고 1.66 + 0.04g/㎏과 동등하며, 주입 후 첫번째 날에 수컷의 치사를 초래하였다.

[7. 발암 활성에 대한 H-Polyvac의 평가]

H-Polyvac의 발암활성의 평가는 "The Committee on Carcinogenic Substances"에 기재된 바에 따라 실시하였다.

이 실험을 수행하는 이유는 중합성 화합물 신폴이 왁친내에 존재한다는 사실때문이다.

실험은 두 계의 동물로 수행하였다.

150-180g 기준 체중을 가지는 400마리의 암컷 Wistar 랫 및 암 발생에 민감한 40 마리의 마우스(C57BI/6).

생리학적 염수내의 0.1% H-Polyvac 용액 0.5㎖를 일주일에 두번, 8달 동안 그 사이에 2주 간격으로 14-15회 주입 코스로 복강내에 주입하였다. 동물은 1㎏당 1OO㎎의 단백질을 전체 투여량으로 받아들이게 된다. 생리적 염수를 대조군 동물의 복강내로 투여하였다. 일반적으로 동물이 자연적으로 죽을 때까지 관찰을 계속 하였는데, 몇 마리의 랫(지쳐있고, 병들고, 종양을 가지는 것)은 희생시켰고, 종양의 크기가 확립되고, 10% 포름알데히드 용액내에 고정시킨 후에 한 내부기관을 육안으로 관찰하였다.

실험은 2년간 그리고 1달간 지속되었다.

자발적인 종양을 가지는 네마리의 랫은 실험 개시 9달 만에 서로 다른 기간중에 대조군에서 발견되었고 실험용군에서는 3마리가 발견되었다.

첫번째 종양은 대조군에서 보다 실험용군에서 0.5년 이후에 나타났다. 종양 발달의 속도와 크기는 실험용 쥐에서 상당히 낮게 나타났다. H-Polyvac의 발암성활성을 강조하기 위해서 다른 계의 실험을 C57BI/6 마이스에서 수행하여 폐에서의 Luis 악성종양 발달에 대한 H-Polyvac의 영향력을 평가하였다.

쥐를 체중(16g)에 따라 신중하게 선택하고 4군으로 나누었고, 각 군은 10마리의 랫이 포함되도록 하였다. 외피의 Luis 폐암을 O.5㎖ 부피내에 199 용매를 가진 1:1 종양 용액의 피하 주입에 의해서 모든 동물에 전이시켰다.

제 1 군은 조절군이며, 제 2 및 3 군은 48 시간후 복강내 그리고 피하내로 5㎎/㎏의 H-Polyvac을 투여한 것이며 제 4 군은 제 2 및 3 군의 마우스에 투여한 양의 담체에 해당하는 양으로 25㎎/㎏의 담체를 피하내로 투여하였다. 처리는 5일간 매일 계속하였다.

동물의 중량 및 종양 크기는 종양이 전이된 뒤 일주일만에 즉 H-Polyvac 투여후 5일째 되는 날에 결정하였다. 마이스는 죽었고 그것의 체중을 측정하고 종양을 분리시키고 종양의 중량도 측정하였다. 결과는 표 14에 나타나 있다. 표 14에서 보는 바와 같이 H-Polyvac 및 담체 그 자체 양자 모두 43-28%의 종양 발달 감소(중량 감소)를 야기시겼다. 종양의 크기와 중량은 모든 군에서 대조군에 비하여 상당히 낮은 것으로 나타났다.

추측건대 중합체성 면역자극체 신폴은 항암 활성도 가진다. 이들 특성은 중합체-항원 결합체(표 14, 컬럼 2,4) 내에서 보존되고/또는 증가되었다.

[8. 결론]

H-Polyvac의 완전한 임상전 안전성 평가 연구가 Russian Ministry of Health의 Laboratory of Drug-Diagnostic Forms메서 수행되었다.

H-Polyvac는 중합체성 면역자극제 신폴과 단백질 항원의 결합체이다.

H-Polyvac은 동물 체중 1㎏당 0.05㎎의 단백질을 투여함으로써 기생충의 이동성 형태를 저해하는 왁친으로서 유망한데, 상기 투여량은 H-Polyvac의 0.4㎎/㎏의 두배의 근육내 주입량에 해당하는 것이다.

H-Polyvac의 안전성 평가는 USSR Ministry of Health (Directive of 31. 12. 1983)외에도 "The Veterinary Pharmacological Committee"(1974)에 따라 수행되었다.

실험은 다양한 계의 동물에서 실시하였다. 마이스(CBA 및 C57BI/6 계) 220마리, Wistar 랫, 180 마리, 기니아 피그, 85마리.

H-Polyvac은 복강내 주입되는 동안 LD-50이 1.66 + 0.4g/㎏이 되며 실질적으로 비독성 물질이다(SOST 12.1.07-76에 따른 5류의 위험).

만성적인 독성은 예방접종량(0.4㎎/㎏) 및 10배의 투여량(4㎎/㎏)으로 H-Polyvac을 다중 연속적으로 매일 주입시키는 동안 시험되었다.

혈액학적, 생리학적, 행화학적, 면역학적 분석에 따르면 동물의 체중, 행동, 중추신경계, 심장혈관계, 간 및 신장기능 또는 혈액에 H-Polyvac이 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

병리형태학적 분석에 의하여 내부 기관 및 조직에서 어떤 병리학적 변화도 결정되지 않았다.

주입자리에 자극성 활성도 없었으며 알레르기, 면역독소 및 돌연변이 활성이 부재하는 것으로 확정되었다.

H-Polyvac을 기간을 연장하여 투여(8개윌)하고 22년 동안 동물을 관찰하는 동안 어떠한 발암성 활성도 관찰되지 않았다.

그러 므로, H-Polyvac 안정성 평가 연구는 넓은 치료학 비율 영역(400이상)에서 뿐만 아니라 H-Polyvac의 안정성도 있는 것으로 나타났다. 4㎎/㎏의 치료적 투여량의 H-Polyvac이 절대적으로 안전하다고 생각될 수 있다.

[실시예 11 -- 실험적 및 실제 목장(pasture)에서의 시험]

본 발명의 구체예인 왁친의 효율성을 평가하기 위해 일련의 실험과 실제 목장 시험이 상기 언급된 USSR에서 수행되었다. 본 실시예에 사용된 "H-Polyvac"이란 단어는 본 발명의 왁친 조성물을 의미한다.

[1.에치노코커스 그래뉼로서스(Echinocollus Granulosus)를 함유하는 실험적인 병원균 투여(challenge)에 대하여 H-Polyvac에 의해 부여된 보호]

[1. 1. 개요]

에치노코커스 그레뉼로서스의 라이프 사이클은 연속적인 단계로 구성되어 있는데, 첫번째는 개, 그 다음에는 양, 돼지 또는 사람에 존재하게 된다. 이 그래뉼로서스의 상이한 두단계-특이성 형태는 상기 언급된 종에서 기생충으로서 생활한다. 두절(頭節) 촌충-유서 형태는 개의 소장에서 살고, 이 그래뉼로서스의 수천개의 알(종양구체 (oncospherae)을 포함하는 촌중의 마지막 연결부는 기생충으로부터 분리되어 있고 숙주의 exrement에서 퍼져나가게 된다. 양, 돼지 또는 인간은 이 그래뉼로서스의 알에 의해서 구강으로 침입될 수 있다. 그 다음 섬게구균(echino- cocci)의 포낭(낭) 형태는 상기 종의 동물 또는 인간의 간 및/또는 폐에 손상을 야기시켰다. 포층증(echinococcosis)에 대항하는 H-Polyvac 왁친의 유효성을 평가하기 위해서 자발적인 침투 뿐만 아니라 이 그래뉼로서스에 의한 동물의 인위적 병원균투여 양자 모두를 연구하였다. 프로토스콜리세스(protoscolices)를 이용하여 개를 인위적으로 감염시켰고 새끼양과 새끼돼지는 이 그래뉼로서스의 종양구체를 이용하여 감염시켰다.

[1. 2. 이 그래뉼로서스에 의한 실험적 병원균 투여에 대한 개의 보호]

초기에는 이 그래뉼로서스에 대항하는 H-Polyva 의 보호 효과가 있는가를 결정하고 개에 대한 효과적인 투여량의 대략적 범위를 산출할 필요가 있다.

첫번째 실험에서는 24마리의 생후 3달 강아지를 사용하였는데, 0.5㎎에서 50㎎범위의 H-Polyvac을 연구하였다. 각각 6마리를 포함하는 세개의 분리된 군은 0.5㎎, 5㎎ 또는 50㎎의 H-Polyvac을 사용하여 근육내로 두번 주입시켰다. 증폭성 면역화는 첫날 후 21일째 만들어졌다. 남은 6마리는 위약(placebo) 군으로서 0.9% NaCl 염수를 주입시켰다. 증폭성 면역화가 생성된 2 주째 되는 날에 24마리의 강아지 각각이 이 그래뉼로서스의 16,000 프로토스콜리세스에 의해 구강으로 감염되었다. 한달 후에 사용한 모든 강아치가 죽었고 이것을 해부하여 창자에 기생하는 이 그래뉼로서스 기생충의 수를 알아내었다.

그 결과는 표 15에 분명히 나타나 있으며 강아지의 1차 면역화가 이 그래뉼로서스의 침입에 대한 내성을 상당히 증가시켰음을 나타내준다. H-Polyvac에 의해서 면역화된 강아지의 소장에서 발견된 섬게구균의 수는 위약 대조군의 것보다 15-120 배 정도 적다. 더구나 보호 강도는 H-Polyvac 투여량에 명백히 의존한다. 약 5㎎ 범위의 H-Polyvac이 두번-반복된 주입에 의해서 강아지를 면역화하기에 적당한 것 같았다.

다음 실험은 섬게구균 작용에 대항하는 H-Polyvac의 보호효과 반복측정 및 5㎎ 근처의 H-Polyvac의 투여량이 최적인 것에 대한 연구를 목적으로 한다. 이들 목적을 달성하기 위하여 각각 3마리의 개를 가지는 4개의 분리된 군 즉, 전체 12마리 개를 사용하였다(표 16). 제 I 군의 개는 4㎎(i/m)의 H-polyvac을 1차 및 2차 면역화사이의 21일 기간에 2번 투여하였다. 제 Ⅱ 군의 개는 8㎎의 H-Polyvac을 2번 투여하였다. 제 Ⅲ 군의 개는 4㎎으로 시작하여 8㎎의 H-Polyvac 만큼 올려서 주입하였다. 제 Ⅳ 군의 개는 염수를 공급하였고 위약 대조군으로 제공하였다. 증폭 면역화 후 2 주일에 사용한 모든 개를 이 그래뉼로서스의 5,000 프로포스콜리세스를 경구 투여함으로써 인공적으로 감염시켰다. 한달 후에 사용한 동물은 죽고 이것을 분해하여 창자내의 이 그래뉼로서스의 수를 알아봄으로써 그 결과적인 침습 강도를 확정하였다.

얻어진 결과는 표 16에 나타나있고 이전 실험의 데이타를 확실하게 뒷받침하였다. 첫째, 이 그래뉼로서스에 의한 강력한 침습으로부터 개를 보호하는데 있어서 H-Polyvac이 높은 효율성을 가짐을 나태내주었고 두번째로 5 내지 10㎎ H-Polyvac의 투여량이 개의 근육내 면역화에 최적의 양이란 것을 나타내준다. 사실상 H-Polyvac을 투여하지 않은 제 Ⅳ군의 대조군의 개는 창자내에 약 2.000 섬게구균을 가지는 것으로 심하게 침해를 입었다. 대조적으로 4㎎의 H-Polyvac을 두번 주입시킨 제 I 군의 개는 100-300 배적은 섬게구균을 가졌다. H-Polyvac 투여량을 8㎎까지 증가시키면 섬게구균에 대항하여 보호하는데 있어서 효율성을 증진시켰다. (8㎎ + 8㎎) 또는 (4㎎ + 8㎎)을 각각 투여한 H-Polyvac에 의해 면역화된 제 Ⅱ 군 및 제 Ⅲ 군의 개의 창자내에는 작은 숫자(0 내지 3)의 섬게구균이 발견되었다(표 16).

[1. 3. 이 그래뉼로서스에 의한 돼지의 실험적 병원균 투여에 대항하는 H-Polyvac]

전체 생후 1 개월된 40 마리의 새끼돼지를 각각 10 마리씩 포함하는 4군으로 나누었다. 제 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 군의 모든 동물을 5㎎의 H-Polyvac을 두번 주입시켰다. H-Polyvac 주입을 시작한 후 증폭성 주입을 7일간(제 I 군), 14일간(제 Ⅱ 군), 또는 21일간(제 Ⅲ 군) 계속하였다. 제 Ⅳ 군의 10마리의 새끼돼지는 H-Polyvac 대신 염수를 주입하였다. 증폭성 면역화된 후 20일에 모든 동물은 경구당(per os.) 1O,OOO 종양구체의 투여량을 사용하여 이 그래뉼로서스에 의해 인위적으로 감연되도록 하였다. 몇달 뒤에 돼지를 죽였고 간내에 있는 낭 형태의 섬게구균의 수를 헤아렸다.

위약군인 제 Ⅳ 군의 모든 돼지는 섬게구균 침습을 경험하게 하였다. 큰 섬게 구균의 낭의 크기는 15-20㎜로 발전되었고 기생충의 수도 간에 대하여 8 내지 12 버블(bubble)로 다양하였다(표 17). 대조적으로 H-Polyvac을 주입시킨 대부분의 돼지에는 어떠한 섬게구균도 발견되지 않았다. 제 I, Ⅱ 및 Ⅲ 군의 모든 돼지중에서, 70%, 90% 및 80%의 동물이 각각 섬게구균이 절대적으로 존재하지 않았다. 더구나 기생충이 발견되었을 때 그것의 수는 간에 대하여 1 내지 4 섬게구균 낭으로 다양하였다. 또한 H-Polyvac으로 면역화된 돼지에서 발견되는 기생충의 유충은 크기가 매우 작았다(약 2-3㎜).

확실히 표 17에서 보여진 데이타는 제시된 H-Polyvac의 1차 및 2차 주입사이에 간격 범위중 새끼돼지의 면역화에 대하여 14-21일의 간격이 바람직하다는 것을 나타낸다.

얻어진 데이타는 돼지에서의 실험적으로 유도된 섬게구균 작용의 예방에 관한 H-Polyvac의 높은 효율성을 나타내준다. 또한 상기 언급된 결과는 H-Polyvac에 의한 새끼 돼지의 효율적인 예방접종을 위한 투여량 및 면역화 계획을 확정시켜 주었다.

[1. 4. 이. 그래뉼로서스에 의한 실험적 병원균 투여에 대한 양의 보호]

생후 2-5개월된 새끼양을 본 연구에 사용하였다. 세개의 분리된 실험이 12, 20 및 20 새끼양을 각각 포함하도록 하여 행하였다.

초기 실험은 5㎎ 및 10㎎의 H-Polyvac의 투여량을 시험하도록 하였는데 이것은 개나 새끼돼지에 대하여 유효한 투여량으로 나타났다. 각각 3-4 개윌된 12마리 새끼양을 각각 4마리씩 포함하는 3개의 군으로 나누었다(표 18). 제 I 군은 초기 주입과 증량 주입사이에 21일 간격으로하여 5㎎ H-Polyvac을 두번 근육내 주입시킴으로써 면역화시켰다. 동일한 방법으로 10㎎의 H-Polyvac이 제 Ⅱ 군에 2번 투여되었다. 나머지 4마리의 새끼양은 위약군으로 제공하였다. 그것들은 09% NaCl 염수를 주입하였다.

2차 면역화된 후 2주일째 되는 날에 모든 새끼양을 10,000 종양구체를 경구투여함으로써 이. 그래뉼로서스에 감염되게 하였다. 400일 후에 세개 군의 모든 양을 죽였고, 해부하였으며 그것들의 간과 폐에서의 낭 형태의 이. 그래뉼로서스의 수를 세었다.

얻어진 결과는 표 18에 나타내었으며 위약 군에서외 양을 강도있게 침습한 것은 분명히 주목할 만한 사실이였다. 이. 그래뉼로서스의 다수의 포충 낭포(동물 1마리당 평균=88)가 이 그룹의 양의 내부기관에서 발견되었다 H-Polyvac에 의해서 면역화된 동물은 내부기관내에 8-15배 적은 섬게구균올 가졌다. 더욱이 H-Polyvac 면역화된 양에서 발견된 섬게구균 낭의 크기는 면역화되지 않은 대조군동물에서는 크기가 4-9㎜인 점에 대조적으로 1-2.5㎜였다. 연속되는 유사실험은 3군으로 나누어진 생후 3개월된 새끼양 20마리에 관한 것이다. 8마리의 새끼양을 21일의 간격으로 5㎎의 H-Polyvac을 근육내로(i/m) 두번 주입시켜 면역화시켰다(표 19). 8마리 새끼양의 다른 군은 21일 간격으로 2번 5㎎ 투여량의 H-Polyvac을 피하내로(s/c) 주입하였다. 마지막으로 남아있는 4마리의 새끼양은 0.9% NaCl 염수를 주입하여 위약군으로 제공하였다. 증폭 면역화된 후 2주 후에 모든 동물을 이. 그래뉼로서스의 10,000 종양구체에 의해서 감염시켰다. 표 19에 나타낸 실험의 결과는 초기 실험의 것(표 18 참조)과 유사하게 나타났다.

10,000 종양구체에 의한 실험적인 병원균 투여로부터 새끼양을 보호하는 데 있어서 면역화(5㎎의 H-Polyvac의 두번 반복 주입에 의해 수행됨)의 고효율성외에도 표 19의 결과는 H-Polyvac의 i/m 및 s/c 주입 모두 예방접종 과정에서 허용될 수 있다는 것을 보여준다.

세번째의 결론적인 실험에서는 생후 4.5 개월된 20마리 새끼양을 표 20에 나타낸 방법에 따라 3군으로 나누었다. 두개의 서로 상이한 로트(1ot)의 H-Polyvac을 면역화하는데 사용하였다. 제 1 군의 8마리 새끼양은 로트 No. 1의 H-Polyvac에 의해서 2번 면역화되게 하였다. 제 2 군의 8마리 새끼양은 5㎎의 로트 No. 2의 H-Polyvac을 주입하였다. 나머지 4마리의 새끼양은 위약군으로서 제공하였다. 증폭 면역화된 후 2 주 후에 모든 20마리의 새끼양을 10,000 종양구체를 경구 투여함으로써 이. 그래뉼로서스에 감염되도록 하였다.

이런 시도 후 425일째 되는 날에 모든 동물을 죽여서 해부하였고 그것들의 간 및 폐에 있는 기생충을 수를 세어 보았다. 얻어진 결과는 많은 수의 이. 그래뉼로서스의 종양구체에 의해서 실험적인 침습으로부터 양을 보호하는 데 있어서의 H-Polyvac의 고효율성을 다시 한번 확인시켜 주었다(표 20). 사실상 위약군인 대조군의 양은 그것의 간과 폐에 다수(동물 1마리당 기생충 평균=65)의 섬게구균을 운반시켜 심하게 손상되었다. 5㎎의 투여량으로 두번 주입된(i/m) 로트 No. 1 및 로트 No. 2의 H-Polyvac 모두 이. 그래뉼로서스에 의한 도전에 대한 양의 내성을 크게 상승시켰다. 몇몇 동물(제 1 군의 8마리 양중 3마리 즉 37%)이 그것의 내부 기관에 섬게구균이 완전히 존재하지 않았다. 간과 폐에서 소수의(제 I 및 Ⅱ군 각각의 동물에 대하여 3 및 25의 평균치) 섬게구균낭이 나머지 면역화된 양에 의해 보유되고 있었다. 더구나 H-Polyvac 면역화된 양에서 발견된 기생충 포충 낭포는 대조군 동물(5-7㎜)에서 발견된 것보다 더 작은 크기(2-3㎜)를 가졌다.

[1. 5. 개, 돼지 및 양에서의 실험적 포충증(echinococcosis)을 저지하는테 있어서의 H-Polyvac의 효율성에 관한 결론]

다량의 투여량의 이. 그래뉼로서스릍 사용하여 인위적으로 감염시킨 동물에서의 항목 1.1∼1.4의 H-Polyvac 활성에서 상기 검토된 연구에 의해서 우리는 하기 결론에 도달할 수 있다. (a) 개, 양 및 돼지를 1차 면역화 시키면 이 그래뉼로서스에 의한 침습에 대한 내성에 있어서 상당한 증가가 있었다. (b) H-Polyvac에 의한 면역화는 상기 언급된 종의 동물을 섬게구균의 강하고 강도있는 부착에 대항하여서도 방어하고 수천의 침습성 기생충을 가지는 동물의 인위적인 급성 병원균 투여에 의해서 모방된다.(c) 이. 그래뉼로서스에 대한 H-Polyvac의 보호효과는 H-Polyvac 투여량에 엄격하게 의존한다. 근육내 또는 피하내로 초기 주입과 상승(증폭) 주입사이에 14-21일 기간 간격을 두고 두번 주입시킨 5-10㎎의 H-Polyvac 투여량은 어린 개, 1개월된 새끼돼지 또는 3-5개월된 새끼양을 면역화하는데 최적의 량으로 발견되었다.

[2. 딕티오카울러스 필라리아를 이용한 실험적 병원균 투여에 대항하는 H-Polyvac에 의해 부여되는 부호]

다른 기생충 종에 대해 공통적인 H-Polyvac에 포함된 히알루로니다제-항원에 대하여 섬게구균에 대해서 뿐만 아니라 다른 기생충 종에 대해서도 대항하는 H-Polyvac의 보호작용올 예견할 수 있다. 여기에서는 많은 수의 디. 필라리아(D. filaria)에 의한 인위적인 병원균 투여에 대한 저항성에 관하여 양에서의 H-Polyvac의 보호 효과를 측정하고자 하는 연구에 대한 것이다. 이 기생충은 경구에 의하여 유기체에 들어가는 침입성 단계 유충(L3)로서 동물을 감염시킨다. 기생충은 창자 내벽을 침투하여 숙주내에서 이동하며 최종적으로 폐에 도달한다. 몇주 동안 여기에서 성장하였고 성숙단계로 발생된다. 폐조직내에서 성장하면서 크기 3-10㎝의 성숙 폐충이 폐에서의 폐렴, 폐 확장 부전 및 농양이 되는 방법으로 그것의 미소환경을 파괴한다. 실험적으로 투여된 병원균인 디. 필라리아의 라이프 사이클을 고려하여, 새끼양은 50O L3-유충에 의하여 경구적으로 감염되고 그 다음 2 또는 3달 후에 폐에서의 디. 필라리아의 수를 세었다.

전체적으로 세개의 분리된 실험을 인위적으로 유도된 딕티오카울러시스(dictyocaulasis)에서 H-Polyvac을 사용하여 수행하였다. 첫번째 실험에서 생후 3-4개월된 12 마리의 새끼양이 사용되었다. 그것중의 4마리에 5㎎의 H-Polyvac(로트 No. 1)으로 두번 근육내로 주입시키는 반면 다른 4마리의 새끼양은 동일 투여량으로 로트 No. 2의 H-Polyvac을 주입시켰다. 증폭 면역화는 1차 주입후 2l일에 만들어졌다. 남아 있는 4마리의 새끼양이 위약군으로 제공되었다(표 21).

증폭 면역화된 후 2 주일 째 되는 날에 동물을 구강으로 500 딕티오카울리(dictyocaulae) 유충의 투여량을 사용하여 인위적으로 시도하였다. 두달 후에 동물을 죽였고 유기체당 디. 필라리아의 수를 세었다. H-Polyvac에 의해 새끼양의 면역화는 디. 필라리아에 의한 강력한 급성 침습(500 유충의 경구 투여)에 대항하도록 한다. 상기 병원균 투여 후 2달 뒤에 면역화된 동물의 약 15%에서는 디. 필라리아가 완전히 존재하지 않았다. 나머지 H-Polyvac 면역화된 동물은 소수(동물당 평균 약 4 또는 5의 기생충)에 의해서 침습된 반면 대응하는 대조군에서의 비면역화된 동물은 심한 정도의 딕티오카울리 침습(평균치=동물당 67 기생충)을 겪었다.

표 22에 요약된 하기 두 실험은 표 21의 것과 매우 유사한 결과를 보였다. 간단하게 5㎎(i/m, 21일 간격으로 두번)의 H-Polyvac을 사용하여 생후 2-3 개월된 새끼양의 면역화는 디. 필라리아의 500 유충에 의한 강도있는 병원균 투여에 대항하여 동물을 보호하였다.

이와 같이 H-Polyvac의 보호적인 영향은 이. 그래뉼로서스에 한정되는 것이 아니다. 여기에서 분명히 보듯이 H-Polyvac은 디. 필라리아에 의한 새끼양의 강도 있는 침습의 실험적 모델에서도 효과적이다. 동일한 H-Polyvac 투여량 및 면역화계획은 연구된 양자의 기생충병에서 효과적인 것으로 나타났다.

[3. 파시올라 헙타티카(fasciola hepatica)를 이용한 실험적 시도에 대한 H-Polyvac에 의해 부여된 보호]

생후 3-4개월 된 새끼양을 하기의 두 실험에서 사용하였다. 상기 동물을 표 23 및 24에 나타낸 방법에 따라 3-10㎎ 투여량으로 사용하는 H-Polyvac에 의해 면역화시켰다. 상승 주입시킨 후 2주 뒤에 대조군(위약처리) 뿐만 아니라 면역화된 동물이 에프. 헵타티카에 의하여 인위적으로 침입되었다. 이러한 목적으로 5 또는 1O의 메타세카리아(metacercaria)라고 명명된 침습성 유충을 경구 투여하는 방법이 사용되었다. 5 내지 7달 뒤에 상기 동물을 죽였고 간내의 파시올리(fasciolae)의 수를 세었다.

얻어진 결과는 H-Polyvac의 상당한 보호적 영향성을 나타낸다. 3 또는 5㎎의 H-Polyvac의 두번 반복된 주입은 100 메타세카리(표 23 참조)의 경구 투여와 같은 강력한 병원균 투여 후에 조차도 숙주 유기체보다 오래 생존하는 기생충의 수를 50%까지 감소시켰다.

메타세카리의 병원균 투여량이 반감되자 마자 H-Polyvac의 보호 효과는 95-96%에 이르렀다(표 24 참조).

수행된 실험은 H-Polyvac이 많은 수의 파시올리에 의한 인위적인 침습에 대항하는 면역 방어를 유도한다는 분명한 증거가 되었다. 상기 항목 1 및 2에서 상기 검토된 데이타를 숙고해 보면 세개의 다른 기생충 종, 즉 에프. 헵타티카, 디. 필라리아 및 이 그래뉼로서스에 대한 H-Polyvac의 다중 특이성 보호효과를 보여준다. 더구나 H-Polyvac 면역화는 사용된 다수의 기생충에 의한 강력한 급성 시도로부터 동물을 방어한다면 자연적 조건하에서 기생충에 의한 자발적인 침습을 겪은 동물에 서의 왁친의 보호적인 효과가 명확히 예견될 수 있다. H-Polyvac의 실제 목장(pasture) 시험은 이러한 예견이 정확하다는 것을 보여주었다.

[4. 이. 그래뉼로서스, 디. 필라리아 및 에프. 헵타티카에 의한 자발적인 침습에 대항하는 H-Polvac을 사용한 다중 특이성 예방]

일정 기생충 침습은 동물 농장 및/또는 동물 사육지역의 특성이라고 잘 알려져 있다. 몇몇 지역(또는 농장)은 틱티오카울러시스(dictyocaulasis)에 대하여는 바람직하지 못하나, 다른 지역은 유충의 촌충(cestodae) 침습, 파시올리아시스(fascioliasis) 등등에 대해서 바람직하지 못하다. 여기에서 "바람직하지 못하다"는 말은 농장/지역에서 매년 태어나는 각각의 새로운 세대의 동물은 동일한 침습(invasion)을 경험하고 침습되기 쉬운 동물의 백분율이 매우 높고(종종 50% 이상), 결국은 동물 유기체에 기생하는 특정 종의 기생충 수가 동물에서의 기생충병의 명백한 임상적 징후가 될 정도로 충분히 높다는 것을 의미한다. 이 점을 고려하여 H-Polyvac의 실제 목장 실험은 에치노코코시스, 딕티오카울러시스 또는 파시을리아시스에 대하여 바람직하지 못한 서로 다른 동물 농장 및 지역에서 수행하였다. 때때로 여러 종의 기생충(상기 언급된 것 중에서)에 의한 침습이 시험 도중에 발생하였다.

[4. 1. 실제 목장 조건하에서 이. 그래뉼로서스에 의한 양과 개의 자발적인 침습의 방지]

초기 실험은 카라간다 지방(중앙 카자흐스탄)의 "Koyadinsky"라 불리우는 USSR 지방의 양 목장 및 차디르-랑군 지역(몰도바)의 "Leninsky poot" 집단 양농장에서 수행하였다. 두개의 목장 모두 에지노코시스에 대하여 바람직하지 못하다. 사실상 이들 농장의 60% 이상의 양이 통상 에치노코시(echinococci)에 의하여 침습되었다.

표 25 및 26에 나타낸 방법에 따라 "Leninsky Poot" 농장의 11마리의 양지기게 (shepherd's dog)와 함깨 135마리의 새끼양 뿐만 아니라 "Koyadinsky" 농장에서의 생후 2-3개월 된 전체 75마리의 새끼양이 사용되었으나, 상기 동물은 5 또는 10㎎ 로트 No. 1 또는 로트 No. 2의 H-Polyvac 중 하나에 의해서 두번 면역화되었다. H-Polyvac의 면역화 기간 동안 및 중폭 면역화된 후 2주 후에 그것들이 속한 무리로부터 분리시켜 유지하였다. 그 다음 다시 무리와 모여서 정상적인 실제 목장 조건하에서 살도록 하였다. "Koyadinsky" 목장에서는 1년 뒤에, "Leninsky Poot" 목장에서는 8개월 뒤에 양을 죽이고 그것들의 간 및 폐에서의 에치노코시의 수를 세었다. 표 25 및 26에서 볼 수 있듯이 대조군인 비면역화된 양은 에치노코시에 의해서 심하게 침습되었다. 대조적으로 H-Polyvac을 사용하여 면역화된 것은 상당히 더 침습에 대하여 내성이 있었다. H-Polyvac의 보호하에서 침습된 동물의 백분율은 78%에서 26%로 경감되었고 침습된 동물당 에치노코시의 평균 수효도 "Koyadinsky"에서는 25에서 2로 감소하고 "Lenisky Poot"에서는 4.8에서 1.8로 감소되었다. H-Polyvac의 로트 No. 1 및 로트 No. 2의 보호효과의 주목할 만한 현저한 차이가 없었다.

에치노코시외에도 다른 종인 상대적 촌충(cestodae), 즉 코에누루스 세레브럴리스(coenurus cerebralis) 및 시스티세르커스 테누이콜리스(cysticercus tenuicollis)에 의한 침습이 "Leninsky Poot"에서 살해된 동물에서 발견되었다. 표 26에 나타낸 데이타는 H-Polyvac 면역화는 실제적으로 에치노코시에 의한 침습 뿐만 아니라 씨. 세레브럴리스(C. cerebralis) 및 씨. 테누이콜리스(C. tenuico11is)에 의한 침습에 대해서도 양의 저항성을 향상시켰다.

11마리의 양지기 개는 "Leninsky Poot" 농장에서 135마리의 양과 함께 목장에 있도록 하였다. 모두 성장한 개이며 촌충에 의해서 이미 침습되었기 때문에 H-Polyvac에 의해 면역화되기 전에 기생충을 제거하기 위하여 "Droncit"라고 명명된 항기생충제로 처리하였다. 이어서 10㎎의 H-Polyvac을 두번 주입하였고(i/m, 21일간격) 그것들이 속한 무리와 함깨 살도록 하였다. 매달마다 11마리 개 모두의 excrement를 시험하여 촌충에 다시 침습되었는지를 측정하였다. 결국 H-Polyvac 면역화된 후 8개월 후에 촌충에 의한 침습을 확인하기 위하여 항기생충제를 투여하였다. 전 관찰기간 중에 H-Polyvac올 주입한 개에서는 어떠한 촌충도 발견되지 않았다.

[4. 2 D. filaria의 자발적 침습으로부터 새끼양의 보호]

이들 실제목장 실험은 "Druzhba"(몰시나리마스키 지역, 동부 카자흐스탄) 집단 양 농장 및 "Maximoka"(안네니 노이 지역, 몰도바) 양농장에서 행하였는데 양지는 딕티오카울러시스에 바람직하지 못하다. "Druzhba" 및 "Maximoka" 농장의 통상 90∼100% 양이 딕티오카울리에 의해 침습되었다. 전체적으로 생후 1.5-2 개월된 220 및 68 마리의 새끼양이 "Druzhba" 및 "Maximoka"에서 시험용으로 사용되었다. 새끼양을 H-Polyvac으로 면역화하고 중폭 면역화 한 후 2주째 되는 날에 목정으로 보내졌으며 그들이 속한 무리와 같이 있게 하였다. "Druzhba" 농장에서 양을 면역화 후 7 개월째에 살해하였으며, 폐에 존재하는 dictyocaulae의 수를 세었다(표 27). "Maximoka" 농장에서의 실험에 관여된 새끼양은 죽이지 않았으며 H-Polyvac에 의한 면역화 후 5개윌째 D. filarir 침습의 정도를 배설물에서의 딕티 오카울리 유층의 분화석학적(coprological) 분석에 의해서 확인하였다(표 28).

[4. 3. 목장 조건하에서의 헵타티카(hepatica)에 의한 양의 자발적인 침습의 예방]

이들 실험은 "Poot Rybaka" (다게스탄, 러시아 연방공화국) 양농장 및 stavropol station for Veterinary Research(스태브로폴지방, 러시아 연방공화국)에 부설된 양농장에서 수행하였다. 전체적으로 다게스탄 및 스태브로폴에 위치한 농장의 각각 243 및 50 새끼양이 이 시험에 사용되었다. 더구나 세개의 서로 다른 로트의 H-Polyvac, 즉 로트 번호 IG-4, IG-8 및 IG-16이 다게스탄에 있는 양 농장의 세개의 분리된 집단에 사용하였다. 두개 로트의 H-Polyvac(No. 1 및 No. 2)이 스태브로폴에 있는 농장의 동일한 수의 집단에 사용되었다.

H-Polyvac으로 새끼양이 면역화되고 2주후에 정상적인 목장 조건하에서 그것들의 집단이 모여서 살도록 하였다. 6, 7 또는 10개윌 뒤에 새끼양을 살해하였으며 그것들의 간에 있는 파시올리의 수를 세었다. 표 29 및 30에서 나타낸 데이타를 보면 H-Po1yvac가 파시올리에 의한 침습에 대한 양의 민감성을 감소시켰다는 것을 알 수 있다.

모든 로트의 H-Polyvac가 양에서의 파시올리아시스(fascioliasis)의 예방에 있어서 효율적이었다. 5㎎ H-Polyvac을 부가적인 면역 보조제로서 20mg의 Synpol과 조합하여 사용하면 5mg의 H-Polyvac 그 자체일 때 보다 약간 더 높은 보호 효과를 나타낸다는 것도 유용하게 알려져 있는 사실이나, 후에 이러한 관찰은 광범위한 H-Polyvac의 실험동안 확인되고 이용되었다(아래 항목 5. 2 참조).

다량의 침습성 기생충(E. granulosus, D. filaria, F. hepatica)을 사용하는 속성 인위적인 병원균 투여에 의한 간염 특성이 정상적인 목장 조건하에서의 자발적인 시도의 것에 비하여 상당히 차이가 나지만 H-Polyvac의 실험 및 목장 실험은 상기-언급된 기생충병의 예방에 있어서 동일하게 높은 효율성을 나타낸다.

[5. H-Polyvac의 정부차원의 실험]

상기에서의 실험 및 목장 실험의 데이타를 검토하여 보면 State Chief Directorate for Veterinary Medicine 및 이전 USSR의 State Veterinary Inspection은 실제 목장 조건하에서의 광범위한 실험을 수행하기로 하였다(1990년 5월 11일자 훈령 제 46 호). 이 국가적인 통제하의 실험-고안은 두개 이상의 목적에서 수행되었다. 첫째, 서로 지리적 및 기후가 상이한 지역에 있는 동물 농장에서의 H-Polyvac의 효율성을 증명하는 것, 및 둘째로 넓은 분포의 동물을 사용하여 H-Polyvac의 보호효과를 측정하는 것이다.

[5. 1. 실험의 광범위한 지형 조건]

에치노코코시스, 딕티오카올러시스 또는 파시올리아시스에 대하여 바람직하지 못한 양 농장의 목록에는 우크라이나에 위치한 농장(크하르코브 및 수미 지역, 크리미아 지방), 몰도바(아네니 노이지역, 및 가라클리지역), 죠지아, 우즈베키스탄(사마칸드 지역), 중앙, 남부 및 동부 카자흐스탄, 러시아 연방공화국의 남부(다게스탄 및 스태브로몰 지방), 및 러시아 연방공화국의 중앙 지방(니즈니 노브고로드, 보로네즈. 벨고로드 및 벨라양 트세코브)이 포함된다.

표 31은 국가 통제의 실험이 진행되는 동안 사용된 동물의 수 및 지역에 대한 정보를 요약한 것이다. 모든 실험에서외 데이타는 먼저 나타내었던 초기 결과를 완전히 확신시켜주였다. 간단히 말해서 효율성 계수(EC)를 사용하여 얻어진 결과를 요약하는 것이 간편하다.

여기에서 C는 대조군에서의 유기체당 기생충의 평균 수이며, V는 H-Polyvac을 주입한 예방접종된 군의 동물에서의 동일한 변수에 해당한다.

효율성 계수를 사용하여 그 데이타는 딕티오카울러시스의 예방에서 82% 내지 90% 범위, 파시올리아시스의 예방에서는 약 90%의 H-Polyvac의 효과를 보여주었고 그리고 최종적으로 에치노코코시스는 거의 100% 방지되었다.

실험이 수행된 방법의 예로서 동부 카자흐스탄에서 실시한 수천의 양에 관련된 실험에서 얻은 데이타의 간단한 분석을 하기에서 찾아볼 수 있다.

5. 2. 실제 목장 조건하에서 있는 넓은 분포의 양에 대한 H-Polyvac의 실험]

조사되는 분포가 넓으면 넓을수록 감염으로 인한 유행병학에 대해서 얻어진 데이타가 더 정확하다는 것이 유행병학 및 가측빙학의 전문가 사이에서 일반적으로 받아들여지고 있는 사실이다. 이것으로 또한 새로운 왁친의 효과를 평가하는데 있어서도 적용되는 사실이며 수천의 새끼양에 대해서 실시한 H-Polyvac 실험 데이타는 상당히 가치가 있는 것이다. 몇몇 실시예는 하기에 나타내었다.

H-Polyvac의 보호 특성은 집단 농장 "Druzhba"(동부 카자흐스탄)에서 목장내의 11000 마리의 새끼양에 대해서 테스트하였다. 왁친은 21일 간격으로 생후 20∼30일된 새끼양에 동물 1마리당 5㎎의 투여량으로 두번 투여하였고 45일째에 목장으로 보냈다. 1년 후에 1127 마리의 새끼양이 희생되었고 동물 1마리당 3-4 코에누르스(coenures)가 6마리의 새끼양에서 발견되었는데 딕티오카울리, 파시올리, 또는 에치노코시는 발견되지 않았다. 예방접종되지 않은 양중에서 침습된 동물의 백분율은 농장에서의 서로 다른 집단에서 80 내지 100%로 다양하였다.

이듬 해에 H-Po1yvac을 목장에 있는 11700 마리의 새끼양에 대하여 "Druzhba"동일 집단 농장에서 테스트하였다. 이때 왁친은 21일 간격으로 생후 20-30일 된 새끼양에게 1마리당 5㎎의 투여량에 20㎎의 Synpol을 합하여 두번 주입하였고 45일째에 목장으로 보내졌다. 7개월 후에 500 마리의 새끼양이 살해된 후 1∼3 dictyocaulae가 25마리의 새끼양에서 발견되었고 파시올리 또는 에치노코시는 발견되지 않았다. 대조군(비예방접종된) 집단에서의 침습의 강도성은 90-100%였다.

H-Polyvac의 광범위한 실험의 두가지 예가 모두 실제 동물 농장 조건하에서의 매우 높은 효율성을 분명히 나타내준다.

[표 1]

[H-POLYVAC 속성 독소성의 평가]

[표 2]

[H-Polyvac을 근육내 주입하는 동안 숫컷 랫의 생화학적 혈액 한정요소]

[표 3]

[H-POLYVAC을 주입하는 동안 실기능의 평가]

[표 4]

[H-POLYVAC 주입 후 1달 후 실기능의 평가]

[표 5]

[H-POLYVAC을 근육내 주입한뒤 10일 후 숫컷 랫에서의 말초 혈액 분석]

[표 6]

[H-POLYVAC의 근육내 주입한 뒤 10일 후 숫컷 랫에서의 CNS 기능 상태 지수]

[표 7]

[H-POLYVAC의 근육내 주입 후 한달 뒤의 숫컷 랫의 재회복기에서의 CNS 기능적 상태 변수]

[표 8]

[투약 종료후 바로 살해된 동물에서 관찰된 병리학적 징후의 빈도]

[표 9]

[H-POLYVAC의 투여종료 4주 후 사체 부검시 병리학적 변화의 빈도]

[표 10]

[H-POLYVAC을 투여한 동물의 절대적 내부 기관 중량(1Nmg)]

[표 11]

[H-POLYVAC를 투여한 동물의 상대적 체내 내장의 중량(1Nmg)]

[표 12]

[기니아 피그에서의 H-POLYVAC으로 처리한 후 다양한 림프구 수의 양적 비율 및 기능적 상태]

[표 13]

[마이스의 배세포에서의 우성 돌연변이의 기록]

[표 14]

[마이스 C57B1/6내의 표피 LUIS 폐암의 발생에 대한 H-POLYVAC와 폴리옥시도늄의 영향]

[표 15]

[표 16]

[표 17]

[표 18]

[표 19]

[표 20]

[표 21]

[표 22]

[표 23]

[표 24]

[표 25]

["KOYADINSKY" 양 농장에서의 H-POLYVAC의 실제 목장 실험]

[표 26]

["LENINSKY POOT" 양농장에서의 H-POLYVAC의 실제 목장실험]

[표 27]

["DRUZHBA" 양농장에서의 H-POLYVAC의 실제 농장실험]

[표 28]

["MAXIMOKA" 양농장에서의 H-POLYVAC의 실제목장 실험]

[표 29]

["POOT RYBAKA" 농장에서의 H-POLYVAC의 실제 목장실험]

[표 30]

["STAVROPOL"의 양농장에서 H-POLYVAC의 실제목장 실험]

[표 31]

Claims (29)

1. 면역자극성 담체에 공유결합된 히알루로니다제를 프함하는 것을 특징으로 하는 기생충에 의한 감염으로부터 척추동물을 보호하기 위한 화합물.
2. 제1항의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 왁친 형태의 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 면역자극성 담체가 신폴인 것을 특징으로 하는 왁친.
4. 제2항에 있어서, 상기 히알루로니다제가 히알루로노글루코사미니다제, 히알루로노글루쿠로니다제 및 글루코로네이트 리아제르 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 왁친.
5. 제2항에 있어서, 상기 히알루로니다제가 PAGE에 의해서 분석된 바와 같이 약 63 킬로달톤의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
6. 제2항에 있어서, 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 왁친.
7. 제6항에 있어서, 상기 보조제가 신폴로 필수적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 왁친.
8. 제7항에 있어서, 상기 보조제가 필수적으로 수산화알루미늄으로 구성되는 것을 특징으로 하는 왁친.
9. 제7항에 있어서, 상기 보조제가 필수적으로 변형된 뮤라밀디펩티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 왁친.
10. 면역자극성 담체에 공유결합된 히알루로니다제를 포함하는 화합물을 치료학적으로 효과적인 양으로 사람을 제외한 척추동물에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 기생충 감염에 대하여 척추동물을 보호하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 화합물을 왁친의 형태로 사람을 제외한 척추 동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 면역자극성 담체가 신폴인 것을 특징으르 하는 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 히알루로니다제가 히알루로노글루코사미니다제, 히알루로노글루쿠로니다제 및 글루코로네이트 리아제로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제10항에 있어서, 상기 히알루로니다제가 PAGE에 의해서 분석된 바와 같이 약 63 킬로달톤의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제11항에 있어서, 상기 왁친이 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제l5항에 있어서, 상기 보조제가 필수적으로 신폴로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제15항에 있어서 상기 보조제가 수산화알루미늄으로 필수적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제15항에 있어서, 상기 보조제가 변형된 뮤라밀디펩티드로 필수적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제10항에 있어서, 상기 치료학적으로 효과적인 양이 상기 척추동물의 체중 1kg당 약 0.05㎎을 포함하는 깃을 특징으로 하는 방법.
20. 제10항에 있어서, 상기 척추동물이 소, 양, 돼지, 개, 말, 고양이, 염소, 물소, 카멜리대(camelidae) 및 가금으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 면역자극성 담체에 공유결합된 히알루로니다제를 포함하는 화합물을 사람을 제외한 척추동물에 경구투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 척추동물에서의 기생충에 대한 면역반응을 유도하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 화합물이 왁친 형태로 상기 척추동물에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 면역자극성 담체가 신폴인 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제22항에 있어서, 상기 히알루로니다제가 히알루로노글루코사미니다제, 히알루로노글루쿠로니다제 및 글루코로네이트 리아제로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제22항에 있어서, 상기 히알루로니다제가 PAGE에 의해서 분석된 바와 같이 약 63 킬로달톤의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제22항에 있어서, 상기 왁친이 보조제를 포함하는 깃을 특징으로 하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 보조제가 필수적으로 신폴로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제26항에 있어서, 상기 보조제가 수산화알루미늄으로 필수적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제26항에 있어서, 상기 보조제가 변형된 뮤라밀디펩티드로 필수적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.