HU222189B1 - Készítmények bélféregfertőzések megelőzésére és kezelésére - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya egy vegyület gerincesek bélféregfertőzésénekkivédésére, melyben a hialuronidáz kovalens kötéssel kapcsolódik egyimmunstimuláns hordozóhoz. Előnyös módon a találmány szerintivegyületet vakcina formájában adják be a gerincesnek. Azimmunstimuláns hordozó, melyhez a hialuronidáz kovalensen kötődik, egyetilén-piperazin-N-oxid-N-etil-acetil-etilén-pipera- zinium-bromid-kopolimer (továbbiakban „synpol"). A találmány tárgya továbbá eljárásgerincesek bélféregfertőzéseinek kivédésére, melyre jellemző, hogy agerincesnek terápiásan hatékony mennyiségben beadnak egy vegyületet,mely egy immunstimuláns hordozóhoz, elő- nyösen synpolhoz kovalensenkötött hialuronidázt tartalmaz. Előnyös módon a vegyületet agerincesnek vakcina formájában adják be, mely a vegyülethez kevervesynpolt tartalmaz. A következő gerincesek kezelhetők a találmányszerint: ember, szarvasmarha, juh, sertés, kutya, ló, macska, kecske,bivaly, tevefajták és szárnyasok. ŕ

Description

A találmány tárgyát olyan készítmények képezik, melyek gerincesekben immunválaszt váltanak ki bélféregfertőzésekkel szemben. A találmány különösen olyan vakcinákra vonatkozik, melyek gerincesek parazita bélféregfertőzésekkel szembeni védelmére alkalmazhatók.

A bélféregfertőzés a megbetegedések és az elhalálozás jelentős okának tekinthető mind háziállatokban, mind emberi populációkban. Általában a bélféreg alatt olyan parazita és nem parazita fajtákat értünk, melyek a platyhelminthes (métely, galandféreg és más laposférgek) vagy a nematahelminthes (orsógiliszta és rokonai) törzsbe tartoznak. A bélféregfertőzés a következőképpen megy végbe: a bélféreg tojás vagy invazív lárva formájában behatol a gazdaszervezetbe, például oly módon, hogy a gazdaszervezet tojás- vagy lárvatartalmú táplálékot fogyaszt; lassan végigvándorolva a különböző szöveteken, a vérben és/vagy a nyirokrendszeren, a bélféreg fejlődésnek indul, végül eléri a „megcélzott” szervet, ahol végbemegy a növekedés és kifejlődés. A szerv, ahova befészkeli magát, végül károsodik.

A bélférgek ellen foganatosított rendszabályok főként a higiénia javítására, a vektorpopuláció csökkentésére és kemoterápiára irányulnak. A higiénia javítására és a vektorpopuláció csökkentésére irányuló rendszabályok végrehajtása azonban problematikusnak bizonyult, különösen a fejlődő országokban, ahol igen elterjedtek az ilyen fertőzések, és a rendszabályok betartatása is igen nehéz. Az összes jelenleg alkalmazott kemoterápiás gyógyszerelés hátránya a nagy toxicitás és immunszupresszív mellékhatás, valamint az ismételt kezelések szükségessége. Sőt, ezen készítmények alkalmazása sokszor azt eredményezi, hogy a parazitákban rezisztencia fejlődik ki a kemoterápiás szerrel szemben. Ténylegesen majdnem minden országban dokumentáltak már bélféregellenes szerek elleni rezisztenciaeseteket. Ezen okok, valamint a kemoterápiás szerek ismételt beadásának költsége miatt intenzív kutatás indult olyan vegyületek iránt, melyek mentesek ezektől a hátrányoktól.

Mivel a fertőzött populációban a legkülönbözőbb bélféregfajták fordulhatnak elő, célszerű lenne széles spektrumú megelőző aktivitással rendelkező vakcinát előállítani. Jelenleg a bélféregfertőzést követően a gazdaszervezetben kialakuló erős védőimmunitás nem tekinthető általánosnak. A paraziták hosszú evolúciós tapasztalata a gazdaszervezetekben olyan szintű alkalmazkodó gazda-parazita viszonyt fejlesztett ki, melynek eredményeként inkább krónikus és maradandó állapot jön létre, és nem az akut fertőzéseknél jellegzetesen indukált erős és specifikus immunitás. Ezért ellentétben az állatok legtöbb mikrobiális megbetegedésével, kevés vakcina áll rendelkezésre a bélféregfertőzések kivédésére, és azok, melyek rendelkezésre állnak, jelentős hátrányokkal járnak.

Az ismert módon előállított bélféregvakcinák közül az inaktivált és élő vakcinák hátránya, hogy munkaigényesek és csak gyengén immunogének, továbbá olyan mellékhatásokat okoznak, mint a helyi gyulladás, allergia és láz, ezenkívül a vakcinákban használt legyengített forma gyakran a virulens, azaz a vad parazita által előidézetthez hasonló megbetegedést okoz. Továbbá a vakcinakészítményekben használt makromolekuláris hordozófehéqék számos immunpatológiai mellékhatást okoznak a beoltott szervezetben.

A vakcinák egy másik rendelkezésre álló osztálya a géntechnológiával előállított antigének, azonban ezek is még csak gyengén immunogének.

Összefoglalóan, a rendelkezésre álló vakcinatípusok általában hatástalanok és specificitásuk szűk, mivel egyetlen parazita ellen irányulnak.

A bélférgek részletes leírását, mely szerint életciklusukban fontos szerepet játszik a szöveteken belüli vándorlás, és az általuk okozott patologikus állapotok leírását megtalálhatjuk például E. J. Soulsby: Helminth, Anthropods and Protozoa of Domesticated Animals, 7th Edition, Lea and Fabiger, Philadelphia (1982) és G. M. Urquhart, Veterinary Parasitology, Longman Scientific and Technical, United Kingdom (1987) c. könyvekben.

Minden parazita kivált immunválaszt, ugyanakkor azonban több okból kifolyólag olyan mozgó és néha láthatatlan célpontot nyújtanak a gazdaszervezet immunválasza elé, és ráadásul olyan mértékben jelentkeznek, hogy a normál szabályozómechanizmus csődöt mond, és immunitás helyett gyakran immunológiai károsodás lép fel. Ez gyakran oda vezet, hogy a gazdaszervezet kikapcsolja a hatástalan és gyakran káros immunválaszt, ami durva, kóros elváltozásokat és immunszuppressziót eredményez.

A parazita bélférgek szerkezeti és antigenitási változatossága visszatükröződik a kiváltott specifikus immunválaszok heterogén jellegében. A parazita bélférgek gyakran úgy kerülik ki az immunrendszert, hogy maszkírozzák és levetik felületi antigénjeiket, valamint módosítják antigénjeiket, mikor a gerinces gazdaszervezetben tartózkodnak. Az a képességük, hogy maszkírozni, levetni és módosítani tudják felületi antigénjeiket, jelentette eddig a legnagyobb kihívást, mikor hatékony vakcinát kíséreltek meg előállítani bélféregfertőzéssel szemben.

A parazitamegbetegedések kezelésére alkalmazott modem vakcinákat J. H. L. Playfair és társai: The Láncét 335, 1263-1266 (1990) cikk foglalja össze, míg a gazdaszervezetek parazita bélférgekkel előidézett immunválaszainak természetét S. Lloyd és E. J. L. Soulsby; Parasitology in Focus: Facts and Trends, Ed.

H. Mehlhom, Springer-Verlag, 619-650 (1988) mű tárgyalja. Mint Playfair és társai összefoglaló cikkében és a fentiekben mi is említettük, a jelenleg rendelkezésre álló bélféregellenes rendszabályok költségesek és széles körben nehezen kivitelezhetőek, így nagy szükség van olyan vakcinákra, melyek csökkenteni tudják a gazdapopulációban a bélféregfertőzés intenzitását és dominanciáját.

Tekintettel a fenti nehézségekre, melyek már akkor felléptek, mikor egy specifikus fajtával szemben kívántak hatékony bélféregellenes vakcinát előállítani, jelen találmány előtt nem tartották valószínűnek, hogy egy vakcina egyedül kielégítő védelmet tud nyújtani a bélféregfertőzések széles körével szemben. A bélférgekkel kapcsolatos orvosi és tudományos problémákat a követ2

HU 222 189 Bl kező átfogó összefoglalókban találhatjuk: A. A. F. Mahmoud, Science 246: 1015-1021 (1989), valamint

D. J. Mclaren: Parasites, Escape front Immunity és F.

E. G. Cox: Parasites, Immunity to fejezetei az Encyclopedia of Immunityben (szerkesztők: I. M. Roitt and P. J. Delves, Academic Press, 1992).

Tehát a találmány tárgya egy vegyület gerincesek bélféregfertőzésének kivédésére, melyben a hialuronidáz kovalens kötéssel kapcsolódik egy immunstimuláns hordozóhoz. Előnyös módon a találmány szerinti vegyületet vakcina formájában adjuk be a gerincesnek és az immunstimuláns hordozó, melyhez a hialuronidáz kovalensen kötődik, egy etilén-piperazin-N-oxid-Netil-acetil-etilén-piperazinium-bromid-kopolimer (továbbiakban „synpol”).

A találmány alapja részben az a felismerés, hogy a bélféreglárva hialuronidázenzimet termel abból a célból, hogy a megfertőzött gazdaszervezetben át tudjon hatolni a szövetgáton. Gyakorlatilag a találmány szerinti vegyület immunválaszt tud kiváltani a bélféreg által termelt hialuronidázzal szemben, s ezzel, ha nem is tudja megszüntetni, de drámaian csökkenteni tudja a bélférgek azon képességét, hogy át tudjanak hatolni a szövetgáton s meg tudják fertőzni az állatot.

A találmány tárgya továbbá eljárás gerincesek bélféregfertőzéseinek kivédésére, oly módon, hogy a gerincesnek terápiásán hatékony mennyiségben beadunk egy vegyületet, mely immunstimuláns hordozóhoz, előnyösen synpolhoz kovalensen kötött hialuronidázt tartalmaz. Előnyös módon a vegyületet a gerincesnek vakcina formájában adjuk be, mely a vegyülethez keverve synpolt tartalmaz. A következő gerincesek kezelhetők a találmány szerint: ember, szarvasmarha, juh, sertés, kutya, ló, macska, kecske, bivaly, tevefélék és szárnyasok.

A találmány tárgya továbbá eljárás, melyre jellemző, hogy a hialuronidázt és az immunstimuláns hordozót idő és hőfok tekintetében olyan körülmények között reagáltatjuk, melynek során kovalens kötés jön létre a hialuronidáz és az immunogén hordozó között.

Az eddig használatos módszerekkel szemben a találmány számos előnyt biztosít a gerincesek bélfertőzésének kivédésére. A találmány szerinti vegyület olyan bélféregfajtákkal szemben nyújt védelmet, melyek hialuronidázt használnak gazdaszervezeten belüli vándorlásuk megkönnyítésére. így a találmány szerinti vegyület a bélféregfajták széles spektruma ellen hatásos. Ez jelentős előnyt jelent az eddig használatos vakcinákkal szemben, melyek védőhatása a gazdaszervezetben gyakran egyetlen bélféregfajtára korlátozódik.

A találmány szerinti vakcinák további előnye, hogy erősen immunogének. Az eddig használatos bélféregellenes vakcinák gyakran csak enyhén immunogének és nemkívánatos mellékhatásokat okoznak, így helyi gyulladást, allergiát és lázat. Ezen túlmenően az eddig használatos vakcinák gyakran makromolekuláris fehétjehordozót alkalmaznak, melyek a beoltott szervezetben számos immunpatológiai mellékhatást idéznek elő.

A találmány szerinti vegyület annyiban tudja kiküszöbölni az előző bélféregellenes vakcinák ezen és különböző egyéb hátrányait, hogy erős immunogén választ tud kiváltani a korábbi bélféregellenes vakcinák mellékhatásai nélkül. Ezenkívül a találmány szerinti vegyület eddigi tapasztalatunk szerint nincs hatással a fejlődésre vagy a szaporodásra.

A találmány szerinti vakcina azon képessége, hogy erős immunogén választ tud kiváltani és széles spektrumú védelmet tud nyújtani a legkülönbözőbb bélféregfajták ellen, olyan előnyöket biztosít, ami eddig ismeretlen volt a bélféregellenes vakcinák területén.

A találmány tárgya egy alapanyag, mely a hialuronidáz és egy immunstimuláns hordozó közötti reakció terméke.

A hialuronidáz - a jelen használat szerint - egy enzimcsalád, mely hidrolizálni tudja a természetben előforduló poliszacharidokat, különösen a hialuronsavat és a glükózamino-glükánokat, így a kondroitin-szulfátot (4-, 6-, D és E). Ezek a polimerek az extracelluláris mátrix félig szilárd, gélszerű szerkezetének nélkülözhetetlen alkotóelemei. A hialuronidáz elhasítja ezeket a polimereket, és így le tudja bontani az extracelluláris mátrixot. A legkülönbözőbb bélféregfajták termelnek és használnak hialuronidázt az előbb említett alkotóelemek hidrolizálására a gazdaszervezet extracelluláris mátrixaiban. Ezzel válik lehetővé, hogy a bélféreg át tudjon hatolni a gazdaszervezet szövetgátján és vándorolni tudjon a szervezetben, míg el nem éri a megcélzott szervet, ahol növekedésnek és fejlődésnek indul.

A híaluronidázcsalád tartalmaz rokon enzimeket is, melyek hidrolizálni tudják az előbb említett szubsztráttípusokat. Ezek a hialuronsav polimer molekulaszerkezet különböző kötéseivel szembeni specificitásuk szerint csoportosíthatók. így a hialuronidázok három főcsoportba sorolhatók: hialurono-glükózaminidázok, hialurono-glükuronidázok és -glükuronát-liázok (B. FiszerSzafarz, Analytical Biochemistry, Vol. 143, p. 76,1984).

A natív hialuronidáz egyedül igen gyenge immunogén hatást fejt ki, nem indukál - még ismételt injekciók hatására sem - látható antihialuronidázantitest-termelést.

Hialuronidázt a legkülönbözőbb forrásokból izoláltak már, így kígyó- és méhméregből, piócanyálból, spermatozoák acrosomális granulájából, különböző sejtek lysosomagranulájából és bakteriális toxinokból. A találmány szempontjából a gyakorlatban használható hialuronidázfonás a szarvasmarha- és juhhere, bélféreg, pióca, méh- és kígyóméreg, valamint baktériumok.

Bakteriális hialuronidázforrások lehetnek - nem korlátozó jelleggel - a következők: Streptococcus millery [P. F. Unsworth, J. Clin. Pathology, London, 42(5), 506-510, 1989], Streptococcus pyogenes [W. L. Hynes és J. J. Ferretti, Infection and Immunity, 57(2), 533-539, 1989], Streptococcus equisimilis (R. String és társai, Med. Sei. Rés., Vol. 17, No. 17, 723-725, 1989), Clostridium difficile (S. V. Seddon és társai, J. Med. Microbiol., Vol. 31, No. 3,169-174,1990), Streptococcus uberis (P. Schaufuss és társai, Zentralbl. Bakteriol. FRG, Vol. 271, No. 1, 46-53,1989) és Streptococcus dysgalactiae (A. Hamai és társai, Agric. Bioi. Chem., Vol. 53, No. 8, 2163-2168, 1989). Ezenkívül a Candida genus élesztői is tartalmaznak hialuronidázt

HU 222 189 BI (Μ. T. Shimizu, Rév. Microbiol., Vol. 19, No. 4, 442-445,1988).

Általában egy adott speciesben a hialuronidáz mind monomer, mind oligomer formában lehet jelen, így például ugyanabban az alegységben dimer és tetramer is előfordulhat. A Streptococcus pyogenes bakteriofág által termelt hialuronidáz aminosavszekvenciáját W. L. Hynes és társai (Infection and Immunity 57, 533-539, 1989), a méhméreg hialuronidázét pedig M. Gmachtl és társai, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 3569-3573, 1993) határozták meg. Várható, hogy a hialuronidázt kódoló gén szekvenciájának meghatározása és klónozása alapját képezheti a hialuronidáz rekombináns DNS-alapú termelésének, ami a találmány egy gyakorlati alkalmazását jelentené.

A találmány szerinti vegyület előállítására számos kereskedelemben beszerezhető hialuronidázkészítmény felhasználható, így a REANAL Co. (katalógusszám 0705) marha-hialuronidázkészítménye is. Az ebből a forrásból nyert hialuronidáz poliakrilamid-gélelektroforézise (PAGE) egy fő fehéijesávot mutatott ki, melynek körülbelüli molekulatömege 63 kilodalton (kDa). Felhasználható a Sigma Chemical Co. (katalógusszám H2126) juhheréből nyert készítménye is. Az ebből a forrásból nyert hialuronidáz poliakrilamid-gélelektroforézise (PAGE) egy fő fehéijesávot mutatott ki, melynek körülbelüli molekulatömege 39 kilodalton (kDa). Felhasználható a Serva cég hialuronidázkészítménye is (katalógusszám 25 119 és 25 121).

Bár a különböző kereskedelmi forrásból beszerzett hialuronidázkészítmények a PAGE-vizsgálat szerint különböző fő fehéijekomponenst tartalmaznak, úgy találták, hogy az összes kereskedelmi készítménynek van enzimatikus aktivitása, és egymással immunológiai keresztrezisztenciát mutatnak. Ezenkívül gyakorlatilag az összes vizsgált készítmény tartalmaz egy közelítőleg 60-69 kDa molekulatömegű fehéqét, és nem zárható ki a lehetőség, hogy a PAGE-eljárás redukáló körülményei között jelen levő rövidebb peptidláncok fiziológiai körülmények között 60-90 kDa-os oligomerekké állnak össze.

Várható, hogy a találmány szerinti készítményben használt, kos- és bikaheréből izolált hialuronidáz különösen előnyös immungenicitást, költséghatékonyságot és könnyű megvalósíthatóságot ígér. Az ilyen hialuronidázok tisztítási módszerei igen jól kidolgozottak, és olyan általános lépéseket tartalmaznak, mint az extrakció, kicsapás, centrifugálás, ultraszűrés, ioncsere és gélkromatográfia. A találmány szerinti készítmények, melyek kos- és bikaheréből izolált hialuronidázt tartalmaznak, immunválaszt váltanak ki a bélféreg-hialuronidázzal szemben. A kos- és bikaheréből izolált hialuronidáznak ezenkívül sokkal jobb a költséghatékonysága, mint a bélféreglárvákból izolált hialuronidázé. A hereeredetű hialuronidáz elhasítja a hialuronsavat és felismeri a kondroitin-szulfátot is (Bartolucci és társai, Int. J. Tissue React., 13(6), p 311, 1991). így a találmány szerinti legelőnyösebb vegyületben kos- és bikaheréből nyert hialuronidázt használunk. Ebben a vonatkozásban úgy találtuk, hogy a Sigma Chemical Co. által forgalmazott kos- és bikahere-eredetű hialuronidáz alkalmas a találmány szerinti használatra.

Megfigyeltük, hogy azok a készítmények, melyek más forrásból származó hialuronidázt tartalmaznak, mint az állat, melyet a találmány szerinti készítménnyel kezelünk, gyakran immunogénebbek, mint azok a készítmények, melyek a kezelt állatból származó hialuronidázt tartalmaznak. így a juhokból izolált hialuronidáz általában erősebb immunválaszt idéz elő szarvasmarhában, mint a szarvasmarhából izolált hialuronidáz. Költséghatékonyság és kényelmes megvalósíthatóság szempontjából juhok és szarvasmarhák kezelésénél mérlegelni kell, hogy olyan készítményt használjunk, mely kosés bikaeredetű hialuronidázkeverékből készült.

A találmány megvalósítását képező készítmények a fent említett hialuronidáz és egy immunstimuláns hordozó reakciótermékei. Az itt használt „immunstimuláns hordozó” olyan vegyület, mely adott antigénnel kombinálva erősen immunogén komplexet képez (antigén-immunstimuláns), mely még gyenge immunválaszt adó egyéneket is immunizálni tud egy adott antigénnel szemben. A következő közlemény, mely a szintetikus poliionok, mint immunstimulátorok használatát tárgyalja, felsorolja az immunstimuláns hordozókat, melyek a jelen találmány gyakorlatában használhatók: Khaitov, R., Annals of the New York Academy of Sciences 685, 788-802, 1993. június 23. A közlemény említést tesz a polioxodoniumról, mely azonos a synpollal, melyet a találmányban is használunk.

A találmány előnyös megvalósítását képező készítményben a hialuronidázzal reagáltatok immunstimuláns hordozó a synpol. A leírás használatában a „synpol” egy etilén-piperazin-N-oxid-N-etil-acetil-etilén-piperazinium-bromid-kopolimer, melynek szerkezete az (I) általános képlettel jellemezhető, ahol n=200-2000, q=(0,2-0,35)n, z=(0,4-0,65) és m=(0-0,4)n.

Az (A) képlet az 1. példa szerint előállított synpol szerkezetét adja meg.

A (B) képlet a 2. példa szerint előállított synpol szerkezetét adja meg.

Az 1. ábra a találmány szerinti hialuronidázt tartalmazó készítmény hatására a vizsgált patkányok tömegében beállt változást ábrázolja.

Más hordozóval és kísérőanyaggal ellentétben a synpol nem immunogén. Feltételezhető, hogy a synpolnak nincs felismerhető antigéndeterminánsa, ezért nem idéz elő immunválaszt, így nem okoz nemkívánatos mellékhatást sem, ami a vakcinakészítményben használt többi kísérőanyag és hordozóanyag jellegzetes tulajdonsága.

A különböző synpolfajták azonosítására és egymástól való megkülönböztetésére a „synpol” szóval együtt, azt követően az előzőleg használt „n”, „q”,és ,4η” betűk helyére azok értékét újuk. így az N-etil-piperazinN-oxid-N-acetil-etilén-piperazinium-bromid-kopolimer esetén, ahol n=1000, q=0,35, z=0,05 és m=0,05, a „synpol 1000-35/60” megjelölést használjuk.

A találmány vakcina formájában történő megvalósításánál a sikeres immunstimuláns hordozóként használt speciális synpolkopolimer-fajtát a továbbiakban „synpol

HU 222 189 Bl

1000-20/50”-nel jelöljük. A találmány előnyös megvalósításánál a synpol molekulatömege legalább 15 kDa vagy több, különösen előnyös, ha a molekulatömeg 30 kDa.

A találmány szerinti vegyület bármely módszerrel előállítható, mely alkalmas kémiai kötés létesítésére a hialuronidáz és az immunstimuláns hordozó között, így például amely kovalensen kapcsolja össze a hialuronidázt és az immunstimuláns hordozót. Ilyen kovalens kötés vagy közvetlenül létesíthető a hialuronidáz és az immunstimuláns hordozó reakcióképes csoportjai között, vagy egy vagy több kapcsolócsoport segítségével. A következő példákon bemutatjuk a találmány előnyös kivitelezési módja szerint hialuronidázból és az előnyős immunstimuláns hordozóból, synpolból azidmódszerrel előállított reakcióterméket. Eszerint a sav vagy észter formában levő synpolt hidrazin segítségével hidraziddá alakítjuk, majd összekapcsoljuk a hialuronidázzal. A reakcióhoz olyan körülményeket használunk, melyek biztosítják, hogy a reakciótermékben a hialuronidáz kovalensen kötődjön a synpolhoz. A találmány egy másik előnyös kivitelezési módja szerint - melyet szintén bemutatunk a következő példákon - a hialuronidáz és synpol reakciójához előállítjuk a synpol szukcinimid-éterét, majd összekapcsoljuk a hialuronidázzal. A kapcsoláshoz olyan körülményeket használunk, mely biztosítja, hogy a találmány szerinti termék keletkezzen.

A találmány szerinti vegyület széleskörűen alkalmazható gerincesek bélféregfertőzésének kivédésére. Erre a célra a hialuronidáz és az immunstimuláns hordozó reakciótermékét előnyösen vakcina formájában használjuk. Az itt használt „vakcina” fogalom olyan készítmény, mely tartalmazza a találmány szerinti vegyületet, és olyan formában van, mely beadható egy gerincesnek. A tipikus vakcinában a találmány szerinti vegyület só- vagy vizes pufferoldatban van oldva vagy szuszpendálva. A találmány szerinti vegyület ebben a formában jól alkalmazható bélféregfertőzések megakadályozására, a fertőzött állapotjavítására és kezelésére.

Az egyik előnyös megvalósítás szerint a találmány szerinti vakcina - a találmány szerinti vegyülethez viszonyítva kisebb vagy nagyobb arányban - adjuvánst is tartalmaz. Az itteni szóhasználat szerint „adjuváns” az immunrendszer olyan nemspecifikus stimulátora, mely a találmány szerinti vakcinával kombinálva felerősíti az immunválaszt. Számos adjuváns használható, így a teljes és nem teljes Freund-adjuváns, alumíniumhidroxid és módosított muramil-dipeptid. A találmány előnyös megvalósítását képező készítmény a találmány szerinti vegyülethez keverve adjuvánsként synpolt tartalmaz.

A találmány szerinti vegyületeket gerincesek bélféregfertőzésének kivédésére kívánjuk alkalmazni. A találmány szerint a vegyületek emberek és háziállatok, így szarvasmarha, juh, sertés, kutya, ló, macska és kecske, valamint más patás állatok, bivalyok, tevék és szárnyasok kezelésére használhatók. A találmány szerinti vegyületek feltételezhetően különösen olyan parazita bélféregfertőzések megelőzésére és kezelésére lesznek alkalmasak, ahol az állatok hialuronidázt hasznosító bélféregfajta fertőzésének vannak kitéve.

A találmány szerinti vegyületek parenterálisan, intramuszkulárisan, szubkután és intradermálisan adhatók be. A beadás legelőnyösebb módját adott species esetén a példáknál soroltuk fel. Az előnyös dózishatárok a kezelt állatfajta és a régióban domináns bélféregfajta szerint változnak, általában azonban 0,05 mg fehérje/állat testtömeg bizonyult hatásosnak. A dózishatárok kiválasztására alkalmazható további irányelvek a példáknál találhatók.

Úgy találtuk, hogy a hialuronidáz és synpol kovalens kapcsolására előnyösen alkalmazható enyhe körülmények nincsenek jelentős hatással a hialuronidáz antigén epitópjaira, így erősen immunogén vegyület képződik. Szilárd fázisú, enzimhez kötött immunmeghatározások (ELISA) kimutatták, hogy az antihialuronidáz antitestek felismerik a synpolhoz kötött hialuronidáz epitópokat, ezzel kimutatva, hogy azok megmaradtak.

Kimutattuk, hogy a hialuronidázban az enzimaktivitásért felelős rész megmarad a kovalens hialuronidázsynpol kötés kialakítása után is, sőt, a szubsztrátlebontás sebessége lényegében azonos maradt, akár hialuronidázzal egyedül, akár synpolhoz kovalensen kötött hialuronidázzal végeztük. Ezenkívül a synpolhoz kötött hialuronidáz lényegesen stabilabb, mint a natív enzim. Ezt hialuronidázenzim-inaktiválási kísérletekkel igazoltuk, így hőstabilitási vizsgálatokban és heparinnal közvetített gátlással szembeni rezisztenciavizsgálatokban.

A synpolhoz kapcsolt hialuronidáz megnövekedett stabilitása a találmány szerinti vegyület előtt széles körű, új felhasználási lehetőséget nyit meg. A bélféregfertőzések gátlásán túlmenően a találmány szerinti vegyületek várhatóan alkalmazhatók egyéb patogénekkel vagy szervezetekkel szembeni immunválasz kiváltására is, így olyan patogénekkel vagy szervezetekkel szemben, melyek hialuronidázt használnak a szövetemésztésre, például egyes baktériumok és toxinjaik. Ezenkívül a találmány szerinti vegyülettel gátolható vagy lokalizálható a hialuronidáztartalmú mérgek terjedése (méhvagy kígyóméreg).

A találmány oltalmi körébe tartoznak még módszerek, melyek synpolhoz kovalensen kötött hialuronidázt használnak gerincesek fibrózisának kezelésére, melyeknél synpolhoz kovalensen kötött hialuronidázt tartalmazó készítményt adagolnak be.

A találmány szerinti vegyület használható még a kozmetikában olyan krémek és egyéb termékek hatóanyagaként, melyek a bőrt simábbá és puhábbá teszik. E tekintetben meg kell jegyezni, hogy Oroszországban használtak olyan bőrápoló szereket, melyek humán spermát tartalmaztak. Azonban az ilyen termékek használata a hialuronidáz nagy bomlékonysága miatt igen korlátozott. Mivel azonban a találmány szerinti vegyület stabil, oldékony és nem toxikus, azonnal felhasználást nyerhet ezen a területen, így ténylegesen vizsgálatokat is végeztünk ilyen jellegű hasznosíthatóságának irányában. A találmány oltalmi körébe tartozik még a synpolhoz kötött hialuronidáz alkalmazása kenőanyagként, mikor is segítségével megnövelhető egyes gyógyszerek

HU 222 189 Bl hatékonysága. Gyógyászati alkalmazása során javíthatja a diffúziót és gyorsíthatja a felszívódást, így például az állatgyógyászatban antibiotikumoldat alkotóelemeként használható tehénmastitis kezelésére. A múltban stabilizálatlan hialuronidázt alkalmaztak ilyen célra (Merck Index, 8th Edition), tehát a hialuronidáz találmány szerinti stabilizált formája várhatóan lényegesen előnyösebb, mint a natív hialuronidázt tartalmazó készítmények.

A találmány oltalmi körébe tartozik még a synpolhoz kovalensen kötött hialuronidáz felhasználása olyan terápiás területen, ahol a szabad (stabilizálatlan) hialuronidáz előnyös hatásúnak bizonyult, mint például szívinfarktus (E. J. Fiint és társai, The Láncét, 871-874,1982. április 17. és D. Maclean és társai, Science Vol. 194, 199-200, 1976), retinafúnkció javítása (B. S. Winkler és társai, Arch. Ophthalmol. 103, 1743-1746, 1985), citosztatikumokkal kombinálva rákos daganatok kezelése (G. Baumgartner és társai, J. Exp. Clin. Cancer Rés, 4, 3, 1985 és Scheithauer és társai Anticancer Rés. Vol. 8, 391-395, 1988), tuberkulotikus gerincarachnoiditis kezelése (M. Gouri-Devi és társai, J. Neurol. Sci., Vol. 102, 105-111, 1991) és életveszélyes állapotban levő betegek betokozódott agytályogának kezelése (A. Pasaoglu, Acta Neurochir., Vol. 100. 79-83,1989) területén. Ezenkívül a hialuronidáz in vitro alkalmazást nyert még sejtmentes rendszerekben a hialuronsav depolimerizálására, továbbá sejttenyészetekben a hialuronsav-szintetáz stimulálására (L. H. Philipson és társai, Biochemistry 24, 7899- 7906, 1985). A találmány oltalmi körébe tartozik még a synpolhoz kovalensen kötött hialuronidázt tartalmazó készítmény alkalmazása ezen a területen.

A találmány oltalmi körébe tartoznak még synpolantigén konjugátumtartalmú vakcinák, melyekben az antigén a hialuronidázhoz hasonló fehéqéket tartalmaz, például vakcinák, melyek olyan egyéb enzimeket tartalmaznak, amelyet a patogének szövetek emésztésére/lebontására használnak (például különböző specificitású kollagének és proteinázok).

A találmány oltalmi körébe tartozik még a synpolhoz kapcsolt allergént tartalmazó készítmény alkalmazása gazdaszervezetek allergiás reakcióinak kiküszöbölésére az adott allergénnel szemben. Széles körű vizsgálatok kimutatták, hogy az ilyen antigén-synpol konjugátumok kitüntetett módon indukálnak adott allergénnel szemben nem allergiás antitest izotípus termelést. Ezek a normális, nem patogén izotípusok versenyeznek a korábbtól jelen levő allergén izotípusokkal (például IgE immunglobulinokkal) és specifikus módon megszüntetik az allergiát. Ezt a specifikus deszenzibilizálási módszert egyértelműen bemutattuk, és jelenleg a klinikai kipróbálás első fázisában van.

A találmány oltalmi körébe tartozik még a következő antigének synpolhoz kapcsolásával kapott készítmények alkalmazása a kapcsolt antigének immunogenitásának növelésére, mellyel előmozdítható hatékony megelőző immunválasz kiváltása: kolera toxin béta-alegység, A és B típusú influenzavírus burok-hemagglutinin, B. anthracis p. 90 toxin, salmonella Vi antigén, E. coli és salmonella sejtfal porin fehéqe, HIV-1 gplóO burokfehéije szintetikus fragmensei és immunglobulin F(ab)2 fragmensek (antiidiotípusú válasz kiváltása céljából).

A találmány nem korlátozó jelleggel a következő példákkal jellemezhető. Az 1. és 2. példa kétfajta synpol előállítását ismerteti.

1. példa

A synpol 1000-20/50 előállítása

Az etilén-piperazin-N-oxid-N-acetil-etilén-piperazinium-bromid-kopolimer szintéziséhez háromlépéses eljárást alkalmaztunk.

(1) Első lépésben a kiindulási polimert, az 1,4-etilén-piperazint szintetizáltuk. Ebből a célból a következő előirat szerint elvégeztük az 1,4-diaza-biciklo[2.2.2]oktán láncpolimerizációját.

ml-es üvegampullába 10 g előzetesen szublimált monomert és 0,05 g ammónium-bromidot zártunk be. Vákuumszivattyú segítségével 50xl0~³ Hgmm-es vákuumot hoztunk létre és az ampullát 25 óra hosszat 200 °C-on tartottuk egy termosztátban. A polimerhozam 100% volt, molekulatömeg 120 000 (LALLS-szal - kisszögű lézerfényszóródással becsült).

(2) A második lépésben előállítottuk a poli-l,4-etilén-piperazin-N-oxidot.

g poli-l,4-etilén-piperazint (molekulatömeg 120 000, n=1000) feloldottunk 250 ml 1%-os ecetsavoldatban, majd hozzáadtunk 4 ml 30%-os H₂O₂-ot. Az oxidáció 36 óra hosszat tartott. Ultraszűrés és liofilizálás után nyertük a poli-l,4-etilén-piperazin-N-oxidot (molekulatömeg 110 000, z=0,5n).

(3) A fenti N-oxid alkilezését a harmadik lépésben végeztük.

A 2. lépésben előállított poli-l,4-etilén-piperazinN-oxidot feloldottuk 125 ml metanolban és hozzáadtunk 16,5 g bróm-ecetsavat. Az alkilezési reakciót 10 óra hosszat folytattuk 25 °C-on. Az oldószert vákuumban elpárologtattuk, a maradékot feloldottuk vízben, 24 óra hosszat dializáltuk vízzel szemben és liofilizálással szárítottuk. Végül az (A) képletnek megfelelő etilén-piperazin-N-oxid-N-acetil-etilén-piperazinium-bromid-kopolimert nyertük.

A hozam 95% volt. Az oxidáció fokát kromometriásan (vagy titanometriás titrálással) és a PMR-spektrumsávok 2,5-4,5 m. d. régiójában integrálszámítás alapján becsültük meg. A kromometriás vagy titanometriás mennyiségi módszer alapja, hogy a kétértékű króm- vagy háromértékű titánsó redukálja az N-oxidcsoportokat (R. T. Brooks és P. D. Stemglanz, Anal. Chem. Vol. 31, N4, 561-565, 1959). Az oxidáció foka z=0,5n volt. Az alkilezés fokát az infravörös spektrum (1735 cm-es sáv) és a PMR-spektrum (2,5 c-4,5 m. d. régió) alapján határoztuk meg, ami q=0,2n volt.

2. példa

A synpol 200-35/65 előállítása

A 25 000 molekulatömeg (n=200, q=0,35n, z=0,65n) etilén-piperazin-N-oxid-N-acetil-etilén-piperazinium-bromid-kopolimer szintéziséhez az 1. példában ismertetett háromlépéses eljárást alkalmaztuk.

HU 222 189 Β1 (1) Első lépésben 10 ml-es üvegampullába 10 g előzetesen szublimált monomert és 0,11 g ammónium-bromidot zártunk be. Vákuumszivattyú segítségével 50 χ 10^-3 Hgmm-es vákuumot hoztunk létre és az ampullát 15 óra hosszat 200 °C-on tartottuk. A hozam közel 100% poli-l,4-etilén-piperazin volt; molekulatömeg 80 000 (LALLS-szal - mérve).

(2) A második lépésben előállítottuk a poli-l,4-etilén-piperazin-N-oxidot.

g első lépésben nyert poli-l,4-etilén-piperazint feloldottunk 250 ml 1%-os ecetsavoldatban, majd 2-4 °C-on, gyenge keverés mellett hozzáadtunk 4,6 ml 30%-os H₂O₂-ot. Az oxidáció 48 óra hosszat tartott. Ultraszűrés és liofilizálás után nyertük a poli-l,4-etilén-piperazin-N-oxidot (molekulatömeg 50 000, z=0,65n).

(3) A 2. lépésben előállított poli-l,4-etilén-piperazinN-oxidot feloldottuk 125 ml metanolban és hozzáadtunk 16,5 g bróm-ecetsavat. Az alkilezési reakciót 24 óra hosszat folytattuk 30 °C-on. Az oldószert vákuumban elpárologtattuk, a maradékot feloldottuk vízben, 24 óra hosszat dializáltuk vízzel szemben és liofílizálással szárítottuk. Végül a (B) képletnek megfelelő etilén-piperazinN-oxid-N-acetil-etilén-piperazinium-bromid-kopolimert nyertük.

A hozam 95% volt. Az 1. példában leírt módszer szerint megbecsülve az oxidáció, illetve alkilezés mértéke z=0,65n, illetve q=0,35n volt.

A következő négy példa ismerteti a találmány oltalmi körébe tartozó vegyületek előállítását, melyek hialuronidáz és különböző immunstimuláns hordozók - így az 1. és 2. példában előállított synpolok - konjugát urnái.

3. példa

Kovalens synpol 1000-20/50-hialuronidáz (HYA) konjugátum előállítása

Kovalens synpol 1000-20/50-hialuronidáz (HYA) konjugátum előállítására kétlépcsős azidmódszert alkalmaztunk.

(1) Első lépésben előállítottuk a synpol (100020/50)-hidrazidot.

Az etilén-piperazin-N-oxid-N-(etil-acetil)-etilén-piperazinium-bromid (n=1000, q=0,20, z=0,5) -kopolimert az 1. példában leírt eljárással szintetizáltuk, azzal az egyetlen különbséggel, hogy a 3. lépésben az alkilezéshez bróm-ecetsav helyett a bróm-ecetsav etil-észterét használtuk.

500 mg kopolimert feloldottunk 25 ml metanolban, hozzáadtunk 0,2 ml hidrazin-hidrátot (0,2 mmol), majd 20 °C-on 24 óra hosszat folytattuk a reakciót. A metanol lepárlása után kinyert reakcióterméket feloldottuk vízben, éterrel extraháltuk és a főterméket üreges szálon (Amicon) végzett ultraszűréssel izoláltuk és liofilizáltuk.

A módosított polimer hidrazidcsoport tartalmát a primer aminocsoportok meghatározásához használt hagyományos módszerrel, 2,3,6-trinitro-fenil-szulfonsav segítségével becsültük meg (S. L. Snyder and P. Z. Sobooinsky, Improved 2,4,6-trinitro-benzenesulfonic acid method fór determination of amine, Anal. Biochem., Vol. 64, NI, 284-288,1975).

(2) A második lépésben a kovalensen kapcsolt fehérje-polimer konjugátum előállítására kondenzáltuk a hialuronidázt a synpol (1000-20/50) hidrazidjával.

Ebből a célból feloldottunk 100 mg synpol (100020/50)-hidrazidot 4 ml 1 mol/1 HCl-ban. Az oldatot keverés mellett lehűtöttük 0-2 °C-ra és egyidejűleg 1,15 ml 3%-os nátrium-nitrit- (0,5 mmol) oldatot adagoltunk hozzá. 15 perc alatt az aktivált synpol 100020/50 oldat pH-ját 2 mol/1 NaOH-dal 8,5-re állítottuk be. Ezt követően az aktivált synpol 1000-20/50 oldathoz 12 mg HYA 10 ml 0,05 mol/1 foszfátpufferben (pH 8,5, kálium-dihidrogén-foszfát, dinátrium-hidrogénfoszfát) készült oldatát adtuk. A reakciókeveréket kevertettük, hűtöttük (2-4 °C) és a pH-t 2 mol/1 NaOH segítségével 8,5-en tartottuk a 12 órás reakció ideje alatt.

A reakcióelegy alkotóelemeinek frakcionálására és a HYA-synpol konjugátum tisztítására gélszűrést végeztünk Biogel Ρ-100-οη. A kromatográfiás oszlopot (26 x 900 mm) a Biorad Inc.-től beszerezhető Biogel Ρ-100-zal töltöttük meg és 0,05 mol/1 NaCl-ot tartalmazó 0,05 mol/1 foszfátpufferrel (pH=7,5) hoztuk egyensúlyba. A frakciókat ugyanezzel a puffeirel eluáltuk és tartalmukat átfolyó ultraibolya fotométerrel (226 nm) ellenőriztük. A fehérjetartalom megbecsülése és a konjugátum analízise céljából a kinyert konjugátumot fluoreszcenciaspektroszkópiával és poliakrilamid-gélelektroforézissel (PAGE) vizsgáltuk. Eszerint 1 mg konjugátumkészítmény 0,10 mg HYA-t tartalmazott.

4. példa

Kovalens synpol 200-35/65-hialuronidáz (HYA) konjugátum előállítása

Az etilén-piperazin-N-oxid-N-acetil-etilén-piperazinium-bromid-kopolimert (molekulatömeg 25 000, n=200, q=0,35, z=0,65) a 2. példában ismertetett eljárással szintetizáltuk. A HYA-t a 3. példában leírt módszer szerint kapcsoltuk a kopolimerhez. A polimer és a HYA kondenzációjánál 5:1 polimer-fehérje arányt használtunk pH 8-on. 1 mg konjugátum-végtermék 0,15 mg HYA-t tartalmazott.

5. példa

Hialuronidáz (HYA) kapcsolása synpol 100020/50-hez aktiváltéter-módszerrel

Az etilén-piperazin-N-oxid-N-acetil-etilén-piperazinium-bromid-kopolimert (n=1000, q=0,2n, z=0,5) az 1. példában ismertetett eljárással szintetizáltuk. A HYA-kopolimer kovalensen kapcsolt konjugátumát kétlépcsős kémiai eljárással nyertük.

(1) Az első lépésben előállítottuk a kopolimer szukcinimid éterét. Ebből a célból 100 mg kopolimert felszuszpendáltunk 4 ml dimetil-formamidban és keverés mellett hozzáadtunk 77,2 mg (0,30 mmol) diciklohexilkarbodiimidet és 3,6 mg (0,30 mmol) N-hidroxi-szukcinimidet. A reakciót a reakcióelegy keverése és hűtése (2-4 °C) mellett 24 óra hosszat folytattuk. Ezután a reakcióelegyet többször mostuk dioxánnal, etil-éterrel és acetonnal, majd vákuum-szárítószekrényben szárí7

HU 222 189 BI tottuk. A tennék kis molekulatömegű alkotóelemtől való mentességét „Silufol” lemezeken n-butanol-vízecetsav (4:1:1) rendszerben végzett vékonyréteg-kromatográfiával igazoltuk. Az aktivált étercsoport-tartalmat standard módszerrel (T. Miron and M. Wilchek, Anal. Biochem., Vol. 126, N2, 433-435, 1982) becsültük meg (0,1 mol/1 NH₃ vizes oldata, pH=8,5, 259 nm, extinkciós együttható 9700 I/molxcm). A moláris extinkciós együtthatót, az „epszilont”, Lambert-Beer törvénye szerint számítottuk ki:

D=epszilonxCxL, ahol

D az optikai sűrűség,

C a vegyület koncentrációja a vizsgált oldatban és

L a fény által megtett út.

g módosított kopolimer 9x l0~⁴ mól aktivált étercsoportot tartalmazott.

(2) Az eljárás második lépésében kovalens kötést képeztünk a HYA és a fenti kopolimer-szukcinimidéter között. Ebből a célból 100 mg (1) lépésben előállított aktivált kopolimert feloldottunk 10 ml 0,05 mol/1 foszfátpufferoldatban (pH 6,0), lehűtöttük és állandó keverés mellett hozzáadtuk 15 mg HYA 12 ml 0,05 mol/1 foszfátpufferben (pH 7,5) készült oldatát. A kondenzációs reakció 0 °C-on 18 óra hosszat tartott. Ezután Biogel P-100 (BioRAD) oszlopkromatográfiával izoláltuk a reakciókeverékből a konjugátumot és a 3. példában leírtak szerint analizáltuk. 1 mg fehétje-polimerkonjugátum-végtermék 0,10 mg HYA-t tartalmazott.

6. példa

2:1 arányú kovalens HYA-synpol konjugátum előállítása

A synpol 1000-20/50-et az 1. példában ismertetett eljárással állítottuk elő. A HYA-t a 3. példában leírtak szerint kapcsoltuk a synpolhoz azzal a különbséggel, hogy a reakciókeverékben az eredeti synpol-HYA arány 2:1 volt. 1 mg konjugátum-végtermék 0,3 mg HYA-t tartalmazott.

7. példa

Vakcina előállítása

Az előállított vakcina HYA-synpol konjugátumot és immunadjuvánsként további synpolt tartalmazott.

A synpol 1000-20/50-et az 1. példában leírtak szerint állítottuk elő. A HYA és synpol kapcsolását - az eredeti polimer/fehéije (1:1) arány alkalmazásával - a 3. példa szerint végeztük: 5 mg HYA-t hidrazidmódszerrel kapcsoltunk 5 mg synpol 1000-20/50-nel. Utána 40 mg synpol 1000-20/50 vizes oldatát adtuk a tisztított konjugátumhoz, az elegyet összekevertük és liofilizáltuk. A komplex végtermék HYA-tartalmát a 3. példa szerint analizáltuk, 1 mg készítmény 0,1 mg HYA-t tartalmazott.

8. példa

Immunadjuvánsként muramil-dipeptid-származékot tartalmazó vakcinakomplex

Az előállított vakcinakomplex HYA-synpol konjugátumot és egy ismert immunadjuváns, a muramil-dipeptid glükózaminil-származékát tartalmazta.

A synpol 1000-20/50-et az 1. példában leírtak szerint állítottuk elő. A HYA és synpol kovalens kapcsolását az eredeti polimer/fehérje (1:1) arány alkalmazásával a 3. példa szerint végeztük: 5 mg HYA-t kapcsoltunk 5 mg synpol 1000-20/50-nel. Utána 10 mg N-acetil-glükózaminil-N’-acetil-muramil-L-alanil-D-izoglutamint (GMDP) adtunk az elegyhez és a komplex keveréket liofilizáltuk.

9. példa

Immunadjuvánsként alumínium-hidroxidot tartalmazó vakcinakomplex

Az előállított vakcinakomplex HYA-synpol konjugátumot és immunadjuvánsként alumínium-hidroxidot tartalmazott.

A synpol 1000-20/50-et az 1. példában leírtak szerint állítottuk elő. A HYA és synpol kovalens kapcsolását - az eredeti polimer/fehéije (1:1) arány alkalmazásával - a 3. példa szerint végeztük. A konjugátumkészítményt közvetlenül az állatok beoltása előtt kevertük össze alaposan az alumínium-hidroxid-szuszpenzióval.

10. példa

A H-Polyvac preklinikai biztonsági vizsgálata

A H-Polyvac egy polimer-antigén vakcina, mely a bélférgek vándorló formái ellen hatásos. A vakcina a hialuronidáz (HYA) és egy polimer immunstimuláns, a synpol konjugátuma. A HYA fehéijeantigén a bélféreglárva számos formájában előfordul. A synpolt a jelen találmány feltalálói fejlesztették ki és vizsgálták be. 0,25 mg/kg dózisban a polimer biztonságosnak bizonyult az emberi szervezetre, így ajánlható akár egyedül immunstimulánsnak, akár adjuvánsnak és/vagy vakcinahordozónak. Az Immunbiológiai Gyógyszerbizottság engedélyezte, hogy a synpolt mint vakcinakonjugátumok alkotóelemét injekció formájában beadjuk. Haszonállatok (juh, borjú) részére a javasolt H-Polyvacdózis 4 mg/állat, mely 0,5 mg HYA-antigént tartalmaz.

A vizsgálat célja a H-Polyvac vakcina toxikológiai értékelése biztonságosságának meghatározására. Az adatok megbízhatóságának növelésére a vizsgálatot három állatfajon (egér, patkány és tengerimalac) végeztük. Nemcsak a beoltási dózis közelében levő dózisok hatását vizsgáltuk, hanem a túladagolás hatását is, az oltási dózis 10-100-szoros mennyiségével. A toxikológiai vizsgálatban alkalmazott nagy dózisok lehetővé teszik a célszervek felderítését, valamint a készítmény toxikológiai jellemzőinek meghatározását. A nagy dózisok beoltása után tapasztalt kóros elváltozások még nem jelentik a klinikai vizsgálat ellenjavallatát, csak értékes információt szolgáltatnak a vizsgált készítmény korlátáiról.

A vizsgálat részleteinek és adatainak felsorolása előtt a következő megjegyzésekkel szeretnénk megkönnyíteni az eredmények értékelését. A 8. táblázatból látható, hogy tüdőgyulladás, atelectasia és tüdőtályog alakult ki a patkányok 10-20%-ában a placebo-kontrollcsoportban. Az állatpatológiában jártas szakértők előtt jól ismert, hogy a legtöbb nagy laboratórium állatházában szabványos körülmények között tartott patkány, egér és egyéb

HU 222 189 Bl laboratóriumi állat nem teljesen egészséges. Valójában különböző betegségeik vannak, melyek azonban csak belső szöveteik és szerveik patomorfológiai vizsgálatával deríthetők fel.

Ezért gondosan tanulmányozták laboratóriumi állatok bakteriális etiológiájú, rejtett fertőzéseit (K. Benirschke, editor, Pathology of Laboratory Animals, New York, 1978). Kontroll- (klinikailag egészséges) patkányokban igen gyakoriak a kóros tüdőelváltozások. G. Paget és P. Lemon szerint a laboratóriumi kontrollpatkányok 99%-ának van rejtett kóros tüdőelváltozása (Pathology of Laboratory Animals, szerkesztők: W. Ribelin and J. McCoy, Springfield, 1965, 382-405). Hasonló módon Nelson J. a laboratóriumi kontrollpatkányok 81%-ában talált tüdőgyulladást (Pathology of Laboratory Rats and Mice, szerkesztők: E. Cotchin and F. Roe, Oxford, 1967,259). J. Innes és társai, (Am.

J. Path. Vol. 32, 141-160, 1956 és Pathology of Laboratory Rats and Mice, szerkesztők: E. Cotchin és F. Roe, Oxford, 1967, 229-259), és J. Lindsay és társai (Disease of Laboratory Animals Complicating Biomedical Research, Chicago, 1971,675-716) leírta az úgynevezett „rejtett krónikus légúti megbetegedés” patomorfológiáját.

J. Lindsay (fenti idézet), E. Venzon et al. (Phili J. Vet. Med., Vol. 18,117-124,1979) és M. Van Zwieten és társai (Láb. Anim. Sci., Vol. 30, 215-221,1980) szerint a patkányok tüdejében végbemenő káros folyamatokat Mycoplasma pneumoniae, Pasteurella spirális és/vagy egér-pneumoniavírus okozza.

Klinikailag normál WAG, August és Wistar beltenyésztésű, valamint az Orosz Orvosi Akadémia nem beltenyésztésű patkányainak 40-96%-ban lehetett alapos vizsgálattal krónikus légzőszervi megbetegedést kimutatni. A felső légutak, légcső és hörgők krónikusan hurutos vagy gennyes-hurutos elváltozása, valamint a krónikus szövetközi gócos tüdőgyulladás a légzőszerveket részben vagy teljesen megtámadta (E. Abdrashitova, Respiratory organs of rats bred in the production colonies, Bull. Acad. Med. Sci. Russ., 1993, N9, 81-85). A krónikus enteritisszel kapcsolatban meg kell jegyezni, hogy pontos etiológiája ugyan ismeretlen, de valószínű, hogy szimptómái rejtett fertőző betegséget jeleznek. Lehet, hogy a fentiekhez hasonlóan ezekben az esetekben is bizonyos baktériumok okozzák a klinikailag rejtett, krónikus fertőzést.

Világos tehát, hogy az úgynevezett „normál” állatok gyakran szenvednek rejtett fertőzéstől. Általánosan elfogadott vélemény, hogy ez többnyire a legtöbb állattartásnál található nem optimális körülményekre vezethető vissza. Bár ez a körülmény a kutatás és az állatkísérletek szempontjából nem optimális, a vizsgálat kontrollállataival kapcsolatban mégis pozitív következtetéseket lehetett levonni: mivel a használt állatok legyengültek a „rejtett” fertőzések miatt, a vizsgálat eredményei bebizonyították, hogy a H-Polyvac (10 dózis tízszer befecskendezve) teljesen biztonságos nemcsak egészséges, hanem legyengült állatokban is. Végül megjegyezhetjük, hogy a normálisan fertőzött laboratóriumi állatokkal kapott vizsgálati eredmények lényegesen közelebb állnak a valódi tenyésztési körülmények között kapott eredményekhez.

1. A vizsgálatban használt anyagok és módszerek

A H-Polyvac preklinikai biztonsági vizsgálatának programjához tartozott az akut toxicitás vizsgálata egéren, intraperitoneális infúzió mellett és a krónikus toxicitás vizsgálata 10 napon keresztül adott napi H-Polyvac-injekciókkal, melyek a vakcinában használt dózis 10-szeres mennyiségét tartalmazták. A vizsgálatokat perifériás véranalízissel, máj- és vesefúnkciós tesztekkel, a szív-ér rendszer vizsgálatával és a belső szervekben végbement patomorfológiai elváltozások analízisével követtük nyomon. Ezenkívül vizsgáltuk az injekció helyén a helyi reakciókat, valamint az allergiás, muragén, pirogén és rákkeltő hatásokat.

mg-os dózist (0,5 mg fehérje 10-15 kg-os juh esetében) tekintettünk 1 vakcinadózisnak.

2. A H-Polyvac akut és szubakut toxicitásának értékelése

A H-Polyvac átlagos halálos dózisát egéren 25 mgos alaptesttömeg mellett, akut kísérletben határoztuk meg. Az egereket testtömegük alapján gondosan választottuk ki, testtömegük az alaptesttömegtől kevesebb, mint 1 g-mal, vagyis 5%-nál kisebb mértékben tért el. Minden dózist 6 állaton próbáltunk ki, 16 napos megfigyelési időtartam mellett. Az elhalálozást naponta ellenőriztük.

A 2 hetes megfigyelési időszak végén az állatokat leöltük és szerveiket morfológiailag vizsgáltuk. Miután a H-Polyvac-mintákat feloldottuk fiziológiai sóoldatban, 5%-os oldatot készítettünk, melyet 3 g/kg, 1,5 g/kg és 0,75 g/kg dózisban, intraperitoneálisan fecskendeztünk be.

Az átlagos halálos dózist probit-analízissel, Litchfield és Wilcoxon módszerével határoztuk meg, mely széleskörűen alkalmazható és viszonylag a legtöbb információt nyújtja.

Az 1. táblázat mutatja, hogy a H-Polyvac esetében az LD₅₀=1,66 ±0,04 g/kg.

3. A H-Polyvac-injekció helyi hatása

Intrakután injekciók. A H-Polyvac-injekciók helyi hatásának vizsgálatát a Szovjetunió Egészségügyi Minisztériumának 31. számú rendelete - „Immunbiológiai Gyógyszer-ellenőrzési Technikák Egységesítése” - alapján végeztük.

A kísérletben 5 tengerimalacot használtunk. 1:10 és 1:100-ra hígított H-Polyvac és fiziológiai sóoldatot (800 mg 0,1 ml-ben) 0,1 ml térfogatban intrakután fecskendeztünk be különböző szőrtelenített helyekre.

A megfigyelést 1 hónapig folytattuk.

Eredmény: a megfigyelés időtartama alatt nem látható bőrgyulladás.

4. A H-Polyvac szubakut toxicitásának értékelése

A vizsgálatot 60 hím Wistar-patkányon végeztük,

270-320 g alaptömeg mellett. Az állatokat 3 csoportra osztottuk, csoportonként 20-20 patkánnyal. Az állatok első csoportja 0,4 mg/kg H-Polyvacot, második csoportja 4 mg/kg H-Polyvacot, míg a harmadik, a kontrollcsoport, fiziológiai sóoldatot kapott. A H-Polyvacot na9

HU 222 189 Bl ponta, intramuszkulárisan fecskendeztük be 10 napon keresztül. Egyes állatokat a H-Polyvac beadása után azonnal leöltünk, a többieket 4 héttel az adagolás befejezése után. Fiziológiai, biokémiai, hematológiai és szövettani vizsgálatokat végeztünk és rendszeresen mértük a testtömeget. Az eredményeket statisztikai módszerekkel értékeltük.

Eredmények. A teljes megfigyelési időtartam alatt (6 hét) a kontrollal összehasonlítva nem tapasztaltunk jelentős különbséget a kísérleti állatok testtömeg-növekedésében, ugyanakkor a 4 mg/kg-mal kezelt állatok testtömegének növekedése kisebb volt, mint a 0,4 mg/kg-mal kezelt állatoké (1. ábra).

4.1 Máj- és vesefunkciós tesztek

A vérszérum analíziséhez F-901 Biochemical Analyzert (Finnország) és LAHEMA (Szovjetunió) diagnosztikus kitet használtunk. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaltuk össze. A táblázatból látható, hogy mind a 0,4 mg/kg, mind a 4 mg/kg dózis után kissé megnövekedett az ALT-aktivitás (14,5, illetve 19%). 4 héttel a vizsgálat befejezése után a kísérleti állatokban a vérszérum biokémiai tartománya azonos volt a kontrollokéval.

A vesefunkció értékelése céljából vizsgáltuk a napi dluresist és a dluretikus sebességet. Ezenkívül tanulmányoztuk a glomeruláris szűrést és a húgyvezeték-reabszorpciót. Az eredményeket a 3. és 4. táblázatban foglaltuk össze. Az adatok analízise azt mutatta, hogy a 2 hétig tartó napi H-Polyvac-befecskendezés nem volt hatással sem a vese szűrőmembrán permeabilitására, sem a húgyvezeték-reabszorpcióra vagy a glomeruláris szűrésre.

4.2 Hematológiai analízis

A perifériás vér státusának értékelésére Goryaevkamra alkalmazásával mértük a vörösvérsejtszámot és a teljes fehérvérsejtszámot, valamint a hemoglobinkoncentrációt, hematokritarányt, a színindexet és a korpuszkuláris hemoglobinkoncentrációt. A színindexet a következőképpen határoztuk meg:

Hb(g/l)x3H

Eryth.(10/l)

A korpuszkuláris színindexet a következő képlettel számítottuk ki:

Ht (1/1) ahol Ht=hematokrit és Hb=hemoglobin.

Az eredményeket az 5. táblázatban foglaltuk össze. Az adatok azt mutatják, hogy a kontrollcsoporttal összehasonlítva a hematokritarány csak a 10-szeres, azaz 4 mg/kg-os dózissal kezelt állatok esetében csökkent jelentősen. A csökkenés nem haladta meg a patkányokban előforduló normál fiziológiai ingadozást. Mind közvetlenül a tíz H-Polyvac-injekció beadása után, mind egy hónappal a kezelés befejezése után nem találtunk jelentős egyéb elváltozást a perifériás vérben.

4,3 A központi idegrendszer státusának vizsgálata A vizsgálatokat hím Wistar-patkányokon végeztük.

A H-Polyvacot naponta intramuszkulárisan fecskendeztük be 10 napon keresztül, a kontrollcsoport fiziológiai sóoldatot kapott. A H-Polyvac hatását a központi idegrendszer funkcionális helyzetére az utolsó injekció napján és egy hónappal később értékeltük.

A következő teszteket végeztük:

- tájékozódási reakciók és mozgási aktivitás, mely paraméterek visszatükrözik a központi idegrendszer státusát és a neuromuszkuláris aktivitást,

- „Hole” reflex, mely szintén a tájékozódási reakciójellemzője,

- gerinc „tail flick” reflex, mely jellemzi az állatok fájdalomérzetét,

- „string” teszt, mely jellemzi az izomtónust és a mozgáskoordinációt.

Ezek a tesztek képezik a központi idegrendszeri státus teljes vizsgálatát (Methodical recommendations in use of behavioral reactions of animals in toxicology studies, Kiev, 1980).

Az eredményeket a 6. és 7. táblázatban foglaltuk össze.

A mozgási aktivitás (verseny) csökkenése mindkét csoportban bekövetkezett a gyógyszerbeadás után, a kontrollal összehasonlítva a különbség jelentős a 0,4 mg/kg-os dóziscsoportban (p<0,05). A gyógyulási időszakban a mozgási aktivitás azonos a kontroliokéval. A kontrollállatokkal összehasonlítva nem találtunk jelentős eltérést a többi tesztben.

4.4 Patomorfológiai analízis

A patomorfológiai analízist hím Wistar-patkányokon végeztük. A H-Polyvacot intramuszkulárisan fecskendeztük be, 10 injekció formájában, melyek 0,4 mg/kg és 4 mg/kg H-Polyvacot tartalmaztak. Kontrollként fiziológiai sóoldatot használtunk. Kétszer vettünk mintát, közvetlenül az utolsó H-Polyvac-injekció beadása után (1. sorozat, 26 állat) és egy hónappal az utolsó injekció beadása után (2. sorozat, gyógyulási időszak, 25 patkány). Az összes állatot lefejezéssel öltük meg.

A boncolást biokémiai analízis céljára történő vérvétel után végeztük, makroszkopikusan megvizsgáltuk a belső szerveket, serosát és testüregeket, valamint megmértük a szervek tömegét, a vérrel való feltöltődés szintjét, a hemodinamikus és egyéb rendellenességeket.

Szövettani vizsgálatra a következő szerveket, szervés szövetmintákat vettük ki 36 állatból (minden csoportból 6 patkány): máj, vese, szív, tüdő, here, mellékvese, csecsemőmirigy, lép, különböző helyről származó nyirokcsomók, agy, gerinc, gyomor, bél, vastagbél, hasnyálmirigy, pajzsmirigy, hipofízis, szubkután celluláris zsír és izom az injekcióbeadás helyéről. A teljes szervet, szerv- és szövetmintákat 10%-os formaldehidsó-oldatban fixáltuk, mostuk, etanollal kezeltük és paraffinba helyeztük. Legalább két metszetet helyeztünk üveglemezre és befestettük hematoxylin-eosinnal.

A fertőzések és parazitamegbetegedések (lásd fent) drámai elterjedése miatt gyakran figyeltünk meg kóros és reaktív elváltozásokat a kontrollállatok szerveiben, innen ered a rendellenességek gyakorisága minden csoportban.

4.4.2 A makroszkopikus vizsgálat eredményei

A 8. és 9. táblázatban foglaltuk össze közvetlenül az utolsó H-Polyvac-kezelés és 4 héttel az utolsó kezelés után leölt állatokban a külső vizsgálat és a boncolás

HU 222 189 Bl után megfigyelt elváltozásokat. Közvetlenül az utolsó H-Polyvac-kezelés és a 4 hét után leölt kísérleti alanyok színe és vérfeltöltődési szintje azonos volt a kontrollokéval. A 10. táblázat mutatja a kísérletek 1. és 2. sorozatában a patkányok belső szerveinek abszolút tömegét. A 0,4 mg/kg-mal kezelt csoport 1. sorozatában nem jelentős mértékben, de csökkent a lép tömege, míg a 4 mg/kg-mal kezelt csoportban nem jelentős módon megnőtt a lágyéknyirokcsomó tömege. Az utolsó HPolyvac-kezelés után és a 4 héttel az utolsó kezelés után leölt állatok belső szerveinek relatív tömegindexe azonos volt a kontrollállatokéval (11. táblázat). A „belső szervek relatív tömegindexe” kifejezés az itteni használat szerint minden állat adott belső szervének tömege osztva a testtömeggel, majd a kapott arányok átlaga szorozva 100%-kal.

A H-Polyvac-injekció helyének (szubkután celluláris zsír, izom) makroszkópos vizsgálata nem mutatott hemodinamikus elváltozást közvetlenül a H-Polyvackezelés befejezése után leölt állatokban (1. sorozat). Csak 9-ből egy kontrollállatnál és 8-ból egy 0,4 mg/kgmal kezelt állatnál mutatkozott pontszerű bevérzés a szubkután celluláris zsírban. A 2. sorozatban (gyógyulási periódus) 8-ból egy kontrollpatkányon látszott pontszerű bevérződés a szubkután celluláris zsírban. A két sorozat egyetlen csoportjában sem látszott gyulladásra utaló jel (vörösödés, beszűrődés).

4.4.3 Mikroszkópos vizsgálatok

Az injekció helye

Az első sorozat (kontroll, 0,4 mg/kg és 4 mg/kg) patkányainak szubkután celluláris szöveteiben és csípőizmában a hisztopatológiai vizsgálat során nem találtunk elváltozásokat a mikrokeringési rendszerben. Sem a kísérleti, sem a kontrollcsoportban nem találtunk ödémát, szubkután beszűrődést vagy produktív reakciót.

Sem a kísérleti, sem a kontrollállatokban nem találtunk nekrobiotikus vagy dystrophiás elváltozásokat.

A kontrollpatkányok izomszöveteiben nem látszott gyulladásra utaló jel. Ugyanakkor a 0,4 mg/kg H-Polyvackal kezelt csoportban 6-ból 3 patkányban figyeltünk meg mérsékelt mononukleáris beszűrődést. A 4 mg/kg H-Polyvackal kezelt csoportban 6-ból 4 patkányban megnövekedett - mind számban, mind méretben - a mononukleáris beszűrődések száma. A sejtekben, főként a lymphocytákban és gyakran a plazmasejtekben, elváltozások következtek be.

Az injekció helyének szövettani vizsgálata során 4 héttel az utolsó H-Polyvac-kezelés után a kontrollcsoportban egy állatban és a 0,4 mg/kg-os dóziscsoportban is csak egy patkányban figyeltünk meg kis mononukleáris beszűrődéseket: az izomszövetben kis mononukleáris beszűrődések voltak. Nem találtunk mikrokeringési rendellenességet, dystrophiás vagy nekrobiotikus elváltozásokat.

Belső szervek. A H-Polyvac-kezelés befejezése.

Szív. 6-ból egy kontrollpatkányban és a 0,4 mg/kg-os dóziscsoportban is 6-ból egy patkányban több kis perivascularis bevérzést figyeltünk meg a myocardiumban. Sem a kísérleti, sem a kontrollcsoport mikrokeringési rendszerében nem találtunk egyéb elváltozást.

Nem találtunk ödémát, szövetközi duzzadást, sem gyulladásos beszűrődést vagy myocardiumvázat érintő hatást. Nem figyeltünk meg az izomrostban korongszerű szétesést vagy myocytolysist.

Minden csoport tüdejében kifejlődött az erek és hajszálerek vérbősége, esetenként bevérzés kíséretében. Mind a kísérleti, mind a kontrollcsoport egyes állataiban ki lehetett mutatni atelectasiát (alveolus falak részleges összehúzódása), valamint kis helyi emphysemát. Mindkét csoportban megfigyeltünk poli- és mononukleáris szövetközi beszűrődést. A hörgőkhöz kapcsolódó nyirokszövet esetében enyhe érintettséget mutattunk ki. A H-Polyvac 0,4 mg/kg és 4 mg/kg dózisban nem növelte meg a mikrokeringési elzáródások számát és nem lehetett dystrophia, nekrobiotikus vagy gyulladásos folyamatok jeleit megfigyelni.

A 0,4 mg/kg-os és 4 mg/kg-os dózis nem okozott elváltozást a mikrokeringési rendszerben, sem dystrophiás vagy nekrobiotikus elváltozást a nephron glomerulákban és tubulusokban, vagy gyulladásos reakciókat.

Egyetlen csoportban sem találtunk elváltozást a máj mikrokeringési rendszerében. A kísérleti és kontrollcsoportokban a szervek szerkezete azonos maradt. Nem tudtunk dystrophiás elváltozást kimutatni a hepatocytákban. A kontrollcsoportban egy patkányon volt egy kis nekrotikus góc, egyébként sem a kísérleti, sem a kontrollcsoportban nem figyeltünk meg nekrobiotikus tüneteket. Egyetlen kísérleti csoportban sem lépett fel gyulladásos elváltozás (reticulo-endothelialis sejtek szaporodása és hypertrophiája, poli- és mononukleáris beszűrődés).

Egyetlen vizsgált állatban sem lehetett elváltozást kimutatni a hasnyálmirigy mikrokeringési rendszerében. Nem figyeltünk meg szerkezeti elváltozást a külső elválasztású részben (pancreas acinus). A 0,4 mg/kg-os és 4 mg/kg-os dózisok befecskendezése után nem voltak dystrophiára, nekrobiotikus és gyulladásos folyamatra utaló jelek.

Nyelőcső és gyomor. A 0,4 mg/kg-os és 4 mg/kg-os H-Polyvac-injekciók nem okoztak elváltozást a mikrokeringési rendszerben. Nem voltak nyelőcső-epithelium-károsodásra, sem egyéb, a gyomor cardialis-, fúndus- vagy pylorusrészén levő epithelium károsodására utaló jelek, sem gyulladásos reakciók.

Az összes kontrollállat vékonybelében megtaláltuk a krónikus enteritis jeleit, a megvastagodott, deformálódott, néha összetapadt bélbolyhokat. Kimutattunk epithelialis dystrophiát és hámlást, a bolyhok vázának beszűrődését. Alapvető elváltozások, így tüszőüreg-elpusztulás a vékonybél számos területén bekövetkezett. A krónikus enteritis kifejezés az enyhétől a súlyosan atrophiás esetig mindent felölel. A kontrollcsoporttal összehasonlítva nem lehetett a 0,4 mg/kg-os és a 4 mg/kg-os dóziscsoportokban elváltozásokat kimutatni.

Vastagbél. Sem a 0,4 mg/kg-os, sem a 4 mg/kg-os H-Polyvac-dóziscsoportban, sem a kontrollcsoportban nem ment végbe változás a mikrokeringési rendszerben. A vastagbél-nyálkahártya sértetlen, sima és ödémamentes maradt. Nem találtunk bélboholy- vagy tüszőüreg-károsodásra, dystrophiára vagy hámlásra utaló je11

HU 222 189 Bl let. A regeneráló epithelialis aktivitás nagy volt. Nem voltak gyulladásos beszűrődések.

A kontrollállatokban nem volt elváltozás a csecsemőmirigy mikrokeringésében. A 0,4 mg/kg-os H-Polyvac-dóziscsoportban 6-ból egy patkánynál találtunk bevérzést a csecsemőmirigy-kéreg területén. A 4 mg/kgos H-Polyvac-dóziscsoportban 6-ból 3 patkánynál megnövekedett az érfal áteresztőképessége, és további bevérzések léptek fel. A csoportban véletlen csecsemőmirigy-visszafejlődés fordult elő (csökkent kéregfelület és megnövekedett kötőszöveti terület). Egyetlen csoportban sem láttunk gyulladásos reakciót.

Lép. Sem a 0,4 mg/kg-os vagy 4 mg/kg-os dóziscsoportban, sem a kontrollcsoportban nem volt elváltozás a mikrokeringési rendszerben. A kísérleti csoportokban enyhén csökkent a léptüsző területe, és kisebbek lettek a germinális központok. Nem változott a léptüsző cytoarchitektonikája (germinális központok, T-függő és szélső területek aránya). A kontrollokkal összehasonlítva a kísérleti csoportokban azonos volt a funkcionális területek aktivitása: tartósan alacsony maradt az immunblastés plazmasejtszám, csakúgy, mint a mitosis és sejtzsugorodási szám. Sem a kísérleti, sem a kontrollcsoportban nem lehetett dystrophiás, nekrobiotikus vagy gyulladásos folyamatokra utaló jeleket megfigyelni.

Mesenterialis és lágyéki nyirokcsomók. Sem a kísérleti, sem a kontrollcsoportban nem volt változás a mikrokeringési rendszerben és nem voltak dystrophiára, nekrobiotikus vagy gyulladásos folyamatokra utaló jelek. A hárompontos rendszer szerint értékelt három immunitástípus (T-, B- és makrofág) paraméterei azonosak és a normáltartományon belül voltak mind a kísérleti, mind a kontrollcsoportokban.

Agy. Sem a 0,4 mg/kg-os vagy 4 mg/kg-os HPolyvac-injekcióval kezelt csoportokban, sem a kontrollcsoportban nem lehetett az agymetszetek szövettani vizsgálata során elváltozást megfigyelni a mikrokeringési rendszerben. Nem tapasztaltunk elváltozást a kamra vagy az agyhártya ereiben sem. Nem figyeltünk meg szerkezeti elváltozásokat, sem buijánzó reakciókat a kérgi vagy egyéb neuronokbán.

Gerincagy. Sem a 0,4 mg/kg-os vagy 4 mg/kg-os H-Polyvac-injekcióval kezelt csoportokban, sem a kontrollcsoportban nem lehetett elváltozást megfigyelni a mikrokeringési rendszerben. Nem láttunk szerkezeti elváltozást vagy gyulladásos reakciókat az elülső vagy hátsó gerincvelőszarvakban, gliasejtekben, fehérállomány-szövetben.

Hipofízis. Sem a kísérleti, sem a kontrollcsoport mikrokeringési rendszerében nem lehetett elváltozást megfigyelni. A 0,4 mg/kg és 4 mg/kg H-Polyvac-injekcióval kezelt patkányok hipofízis cytoarchitectonikája (adenohipofizis, pars intermedia, neurohipofizis) azonos volt a kontrollpatkányokéval. Az adenohipofizis epitheliumban a hormontermelő sejtek minden típusa jelen volt, és nem voltak dystrophiára, nekrobiotikus vagy gyulladásos reakcióra utaló jelek egyetlen csoportban sem.

Pajzsmirigy. Egyetlen vizsgált csoportban sem mutatkoztak elváltozások. A kísérleti csoportban a pajzsmirigy funkcionális egységének (tüszők) szerkezeti felépítése nem különbözött a kontrollcsoportétól. A tüszőket egyformán nem vakuolizált kolloid töltötte meg, míg az epitheliumsejteknek egységes egyrétegű kocka szerkezete volt. Dystrophiára utaló jelek, fokozott növekedés vagy nekrózis nem látszott a thyrocytákon és Csejteken. Sem a 0,4 mg/kg-os vagy 4 mg/kg-os HPolyvac-injekcióval kezelt csoportokban, sem a kontrollcsoportban nem találtunk gyulladásos támasztószöveti reakciót.

Mellékvese. Sem a 0,4 mg/kg-os vagy 4 mg/kg-os H-Polyvac-injekcióval kezelt csoportokban, sem a kontrollcsoportban nem mutatkozott elváltozás a mikrokeringési rendszerben. A funkciós területek aránya (kéreg és velő) mindkét kísérleti csoportban azonos maradt a kontroliéval. A vizsgált csoportok egyikében sem mutatkozott a kiválasztó sejtekben dystrophia, nekrobiotikus elváltozás vagy gyulladásos reakció.

Here. Sem a kísérleti, sem a kontrollcsoport mikrokeringési rendszerében nem lehetett elváltozást megfigyelni. Egyetlen vizsgált csoportban sem károsodott a mellékhere szerkezete, nem voltak dystrophiás vagy nekrobiotikus elváltozások, a spermatogén epithelium hámlása, Sertoli-sejtek vagy aspermatogenesis. A Leydig-sejtekben nem következett be kóros elváltozás vagy szövetközi gyulladás.

Tehát a patomorfológiai analízis kimutatta, hogy

- a krónikusan, intramuszkulárisan alkalmazott 0,4 mg/kg és 4 mg/kg-os H-Polyvac-injekciók az állatok egyetlen vizsgált szervében sem okoztak dystrophiás vagy nekrobiotikus elváltozásokat,

- a következő szervek mikrokeringési rendszerében mutatkoztak nem jelentős elváltozások: csecsemőmirigy: a 0,4 mg/kg H-Polyvac-dózissal kezelt 6 patkányból egynél és a 4 mg/kg H-Polyvacdózissal kezelt 6 patkányból 3-nál, szív: 6-ból egy kontrollpatkányban és 6-ból egy 0,4 mg/kg HPolyvackal kezelt patkányban,

- az intramuszkuláris H-Polyvac-injekció nem volt hatással a spontán enteritis gyakoriságára vagy súlyosságára,

- mindkét kísérleti csoportban tendencia mutatkozott a parenchymalis működő területek (csecsemőmirigy-kéregterület és lépfehérállomány) csökkenésére, azonban az eredményeket a spontán kifejlődő krónikus enteritis eredményeként aktiválódó immunrendszer miatt nehéz értékelni.

Gyógyulási időszak.

Négy héttel a H-Polyvac-kezelés befejezése után végzett szövettani vizsgálat során a vizsgált csoportoknál egyetlen szervben sem (kivéve a fent említett vékonybélben) találtunk mikrokeringési zavarokat, dystrophiás, nekrobiotikus elváltozásokat vagy gyulladásos reakciót. A kísérleti és kontrollcsoportok tüdejében megfigyeltünk atelectasiát és kis gócú emphysemát (6ból 2 patkánynál).

A spontán krónikus enteritis jeleit minden vizsgált csoport vékonybelében megtaláltuk. Epithelium dystrophiát és hámlást, valamint a boholyváz kerek celluláris beszűrődését egyaránt megfigyeltük. Az enteritis min12

HU 222 189 Β1 den vizsgált csoportban enyhétől a súlyos esetig változott.

Minden csoportban (kontroll, 0,4 mg/kg és 4 mg/kg) megtalálhatók voltak a csecsemőmirigy korral összefüggő visszafejlődésének jelei, amit igen alacsony kérgi aktivitás kísért.

A lép funkcionális területei közepes aktivitásúak voltak, ehhez járult a vörös pulpán belül a plazmasejtreakció kis intenzitása, amit esetenként extramedulláris hemopoietikus gócok kísértek.

Következtetések: A 10 intramuszkuláris H-Polyvac-injekcióval kezelt állat patomorfológiai analízise megmutatta, hogy 0,4 mg/kg és 4 mg/kg dózisban a HPolyvac egyetlen vizsgált szervben sem okozott kóros elváltozást.

5. A H-Polyvac allergiakeltó hatásának vizsgálata

Az előző kísérletekben igazolást nyert, hogy a synpolnak nincs szenzitizáló aktivitása. Jelen kísérlet célja a H-Polyvac vakcina allergiakeltő hatásának vizsgálata, mivel itt a synpol fehéqeantigénnel együtt kerül felhasználásra.

A vizsgálatot 40 tengerimalacon végeztük, 4 csoportban: 1. - kontrollcsoport, 2. - fehéqeantigén-csoport, 3. - synpolcsoport és 4. - H-Polyvac-csoport. Hetente egyszer 4 szubkután injekciót adtunk 2 mg/kg dózisban.

A bőrön a csepptesztet a fehérje és a synpol 2%-os vizes oldatával végeztük.

A szenzitizáló reakció kimutatására P. L. Zeltser és V. N. Drozdov hisztaminprovokációs módszerét alkalmaztuk, melyet enzimatikus hidrolízissel előállított készítmények allergén hatásának értékelésére fejlesztettek ki 1980-ban. A módszer szerint a vizsgálandó antigént 0,03 mg/kg hisztaminnal kombinálva intraperitoneálisan és intrakután fecskendeztük be, ezt követte a 1,5-2 órás anaphylactikus reakció. A módszer alapja, hogy a hisztamin vaszkuláris adjuvánsként gyorsabban és kifejezettebben kihozza a gyenge allergén szenzitizálási jellegzetességeit. A H-Polyvac immunlymphocytákra gyakorolt hatásának meghatározására a különböző lymphocytapopulációk kvantitatív arányát és funkcionális státusát az - előzetesen tengerimalac-kísérletre adaptált (Dudintsava és társai, 1982) - kettős rozettaképzési és mitogénnel stimulált rozettaképzési (MSRF) reakcióban (12. táblázat) 10 kísérleti és 30 kontrollállaton vizsgáltuk.

A 2%-os fehéqeantigén-oldatnak csak kezdeti irritáló hatása volt, ami az erek kitágulásában és vérbőségében jelentkezett a H-Polyvac-rácseppentést követő első percekben. Nem fejlődött ki sem azonnali, sem késleltetett szenzitizálási reakció.

A vizsgálatok megmutatták, hogy sem szenzitizálás, sem kvantitatív vagy funkcionális lymphocytaelváltozás nem fejlődik ki, ha az emberi szervezetet a polimer-antigén vakcinával kezeljük. Az erekre gyakorolt bizonyos nemkívánatos hatásokat azonban tekintetbe kell venni, amikor megállapítjuk az ellenjavallatokat.

6. A H-Polyvac domináns halálos mutációt okozó képességének értékelése

A kísérleteket a Szovjetunió Egészségügyi Minisztériumának 1981-ben kiadott ajánlása: „Új gyógyszerek mutagén tulajdonságainak ellenőrzése” alapján végeztük.

A kísérleteket 5 héten keresztül végeztük a spermaképződés mind pre-, mind postmeiotikus szakaszában. A H-Polyvacot 0,6 és 30 mg/egér dózisban, intraperitoneálisan fecskendeztük be, majd 3 szűz nőstényt helyeztünk a H-Polyvackal kezelt hímekhez. 18 nappal később a nőstény egereket felboncoltuk és meghatároztuk az élók és a holtak számát.

Következtetések: a H-Polyvac nem okozott letális mutációt az egerek embriósejtjeiben. Ugyanakkor a 30 mg/egér (1,5 g/kg) dózis közel áll az LD₅₀-hez ami l,66±0,04 g/kg-nak felel meg - ez egy nappal a beadás után a hímek elhullását okozta.

7. A H-Polyvac rákkeltő hatásának értékelése

A rákkeltő hatás értékelését a „Rákkeltő Vegyületek Bizottságának” ajánlásai alapján végeztük.

A vizsgálatot azért tartottuk szükségesnek, mert a vakcina egy polimer anyagot, synpolt tartalmazott.

A kísérletet két állatfajon végeztük, 150-180 g alaptesttömegű 400 nőstény Wistar-patkányon és 40 daganatfejlődésre érzékeny egéren (C57BI/6).

14-15 injekcióból álló kúrát alkalmazva, 2 hetes intervallum közbeiktatásával, 8 hónapon keresztül, hetente kétszer fecskendeztünk be intraperitoneálisan 0,5 ml 0,1 %-os fiziológiai sóoldatban oldott H-Polyvacot. A teljes dózis 100 mg fehéije/kg volt. A kontrollállatoknak fiziológiai sóoldatot adtunk intraperitoneálisan. A megfigyeléseket általában az állatok természetes elpusztulásáig folytattuk, egyes patkányokat azonban (kimerült, beteg, daganatos) leöltünk, meghatároztuk a daganat méretét és 10%-os formaldehidoldatban való fixálás után felvettük a belső szervek makroszkopikus képét.

A kísérleteket 2 évig és egy hónapig folytattuk. A kísérlet kezdetétől számított 9 hónapon belül, különböző időszakokban négy patkányon fejlődött ki spontán daganat a kontrollcsoportban és három patkányon a kísérleti csoportban.

A kísérleti patkányoknál fél évvel később jelentek meg az első daganatok, mint a kontrollcsoportban. A tumor mérete és kifejlődésének sebessége szintén lényegesen kisebb volt a kísérleti patkányokban. A H-Polyvac rákkeltő hatásának kiemelésére további kísérletsorozatot végeztünk C57B1/6 egereken, hogy meghatározzuk a H-Polyvac hatását a Lewis-karcinóma kifejlődésére a tüdőben.

Az egereket testtömegük alapján (16 g) gondosan választottuk ki és 4 csoportra osztottuk, csoportonként 10 állattal. Az epidermális Lewis-karcinómát 0,5 ml térfogatban - 1:1 daganat oldat 199-es táptalajban szubkután fecskendeztük be az összes állatba.

Az 1. csoport volt a kontrollcsoport, 48 óra elteltével a 2. és a 3. csoport 5 mg/kg dózisban kapott HPolyvacot intraperitoneálisan és szubkután, míg a 4. csoport 2,5 mg/kg hordozót kapott, ami megfelelt a 2. és 3. csoportban adagolt hordozó mennyiségének. A kezelést naponta végeztük 5 napon keresztül.

Az állatok tömegét és a daganat méretét egy héttel a daganatátvitel után határoztuk meg, tehát a H-Polyvackezelés 5. napján. Az egereket leöltük, meghatároztuk

HU 222 189 Β1 testtömegüket és a daganatok méretét, a daganatokat leválasztottuk és megmértük tömegüket. Az eredményeket a 14. táblázatban foglaltuk össze. A táblázat megmutatja, hogy mind a H-Polyvac, mind egyedül a hordozó 43-28 t%-kal csökkentette a daganat kifejlődését. A kontrollcsoporttal összehasonlítva a daganatok mérete és tömege lényegesen kisebb volt az összes csoportban.

Feltételezhető, hogy a polimer immunstimuláns synpolnak daganatellenes hatása van. Ezek a tulajdonságok fennmaradnak és/vagy fokozódnak a polimer-antigén konjugátumban (14. táblázat, 2. és 4. oszlop).

8. Következtetések

A H-Polyvac teljes preklinikai biztonsági vizsgálatát az Orosz Egészségügyi Minisztérium „Gyógyszerdiagnosztikai Formák Laboratóriumá”-ban végeztük.

A H-Polyvac egy fehéijeantigén konjugátuma a synpollal, egy polimer immunstimulátorral. A H-Polyvacot 0,05 mg fehéije/kg állattömeg dózisban - ami 2x0,4 mg/kg intramuszkuláris H-Polyvac-kezelésnek felel meg - vakcinaként ajánljuk bélférgek vándorló formái ellen.

A H-Polyvac biztonsági vizsgálatát a Szovjetunió Egészségügyi Minisztériuma Farmakológiai Bizottságának (1983.12.31-i rendelet), valamint az .Állatgyógyászati Farmakológiai Bizottság” (1974) előírásai szerint végeztük.

A vizsgálatot különböző állatfajokon folytattuk le: 220 egéren (CBA és C57BI/6 vonal), 180 Wistar-patkányon és 85 tengerimalacon.

Az eredmények igazolták, hogy a H-Polyvac gyakorlatilag nem toxikus anyag (5. veszélyességi osztály SÓST 12.1.07-76 szerint). Intraperitoneális infúzióban az LD₅₀ l,66±0,4 g/kg volt.

A krónikus toxicitást sokszériás, napi H-Polyvackezeléssel vizsgáltuk, 0,4 mg/kg-os és tízszeres, 4 mg/kg-os vakcinálási dózisban.

A hematológiai, fiziológiai, biokémiai és immunológiai analízis szerint a H-Polyvac nem gyakorolt negatív hatást az állatok tömegére, magatartására, központi idegrendszerére, szív-ér rendszerére, máj- és vesefunkciójára vagy vérére.

A patomorfológiai vizsgálatokkal semmilyen kóros elváltozást sem lehetett a belső szervekben vagy szövetekben kimutatni.

Az injekció helyén nem tapasztaltunk irritációt és nem tudtunk allergiás, immuntoxikus és mutagén hatást kimutatni.

Nem tapasztaltunk rákkeltő hatást a H-Polyvac hosszan tartó beadása alatt (8 hónap), sem az állatok

2,2 éves megfigyelése alatt.

Tehát a H-Polyvac biztonsági vizsgálata bebizonyította a H-Polyvac-kezelés biztonságát és a széles terápiás indexet (nagyobb, mint 400). A 4 mg/kg-os terápiás H-Polyvac-dózis teljesen biztonságosnak tekinthető.

11. példa

Kísérleti és szabadföldi vizsgálatok

A találmány vakcina formájú készítményeinek értékelésére egy sorozat kísérletet és szabadföldi vizsgálatot végeztünk a volt Szovjetunió területén. Ezen rész példáiban a H-Polyvac elnevezés a találmány szerinti vakcinakészítményt jelenti.

A H-Polyvac védőhatása kísérleti Echinococcus granulosus fertőzéssel szemben

1.1 Bevezetés

Az Echinococcus granulosus életciklusa egymást követő állapotokból áll, az első kutyában van, utána következik a juh, a sertés vagy az ember. Az említett fajokban az E. granulosus két különböző állapotspecifikus formában fordul elő, a scolex szalagszerű forma a kutyák belében él, a szalag utolsó eleme, mély közel 1000 E. granulosus-tojást tartalmaz (oncosphera), leválik a bélféregről és szétteqed a gazda székletében. Juhok, sertések és emberek szájon át fertőződhetnek meg E. granulosus-tojásokkal. Az E. granulosus cysta (hólyag) formája ezután károsítja a fenti állatfajok vagy az ember máját és/vagy tüdejét. A H-Polyvac vakcina echinococcosis elleni hatékonyságának értékelésére vizsgáltuk a H-Polyvac hatását mind a természetes, mind a kísérleti úton E. granulosusszal fertőzött állatokban. A kutyákat kísérleti úton E. granulosus protoscolexekkel, a bárányokat és malacokat E. granulosus oncospherákkal fertőztük meg.

1.2 Kutyák kísérleti E. granulosus fertőzésének kivédése

A kísérlet kezdetén megvizsgáltuk, van-e a H-Polyvacnak védőhatása E. granulosusszal szemben, és megbecsültük a kutyák esetében hatásos dózistartományt.

Az első kísérletben 24 db 3 hónapos kutyán 0,5-50 mg-os dózistartományban vizsgáltuk a H-Polyvac hatását. Három, egyenként 6 kutyát tartalmazó külön csoportot kezeltünk intramuszkulárisan kétszer 0,5 mgos, 5 mg-os vagy 50 mg-os injekcióval. Az emlékeztető immunizálást 21 nappal az első injekció után végeztük. A placebocsoport 6 kutyája 0,9%-os NaCl-oldat-injekciót kapott. Az emlékeztető immunizálás után 2 héttel mind a 24 kutyát szájon keresztül megfertőztük 16 000 E. granulosus protoscolexszel. Egy hónappal később az összes kutyát leöltük, felboncoltuk és megszámoltuk a beleket elárasztó E. granulosus bélféreg-paraziták számát.

A15. táblázatban összegyűjtött adatok egyértelműen igazolják, hogy a kutyák előzetes immunizálása jelentősen növeli ellenálló képességüket az E. granulosus fertőzéssel szemben. A H-Polyvackal immunizált kutyák beleiben talált Echinococcusok száma 15-120-szor kevesebb volt, mint a placebo-kontrollcsoporté. Ezenkívül, a védőhatás erőssége a H-Polyvac-dózis függvénye volt. A kutyák immunizálására alkalmazott, kétszer ismételt, 5 mg-os H-Polyvac-injekció látszik optimálisnak.

A következő kísérletben meg kívántuk ismételni a H-Polyvac védőhatásának mérését Echinococcusokkal szemben, és meg kívántuk határozni az 5 mg közelében levő optimális dózist. Erre a célra 4, egyenként 3 kutyát tartalmazó csoportot - összesen 12 kutyát - használtunk fel (16. táblázat). A kutyák 1. csoportja 2 χ 4 mg intramuszkuláris H-Polyvacot kapott, 21 nap intervallummal a primer és a szekunder immunizálás között. A kutyák II. csoportja 2x8 mg H-Polyvacot kapott, míg a kutyák III. csoportja először 4 mg-ot, majd az emlékeztető injekcióban 8 mg H-Polyvacot kapott. A IV. placebo14

HU 222 189 Bl kontrollcsoport kutyái sóoldatot kaptak. Az emlékeztető immunizálás után 2 héttel az összes kutyát kísérletileg, szájon át megfertőztük 5000 E. granulosus protoscolexszel. Egy hónappal később az állatokat leöltük, felboncoltuk és a bél E. granulosus-tartalmának megszámlálásával meghatároztuk a fertőzés erősségét.

Az eredményeket, melyek megerősítik az előző kísérlet adatait, a 16. táblázatban foglaltuk össze. Az adatok igazolják a H-Polyvac nagy hatékonyságát az erős E. granulosus fertőzés kivédésében és azt, hogy a kutyák intramuszkuláris immunizálásának optimális HPolyvac-dózisa 5-10 mg. Ténylegesen a kezeletlen IV. csoport kontrollkutyái erősen fertőzöttek lettek, közel 2000 Echinococcust tartalmaztak a bélben. Ezzel szemben az 1. csoport kutyái, melyek 2x4 mg H-Polyvacot kaptak, 100-300-szor kevesebb Echinococcust tartalmaztak. A H-Polyvac-dózis 8 mg-ra történő emelése megnövelte az Echinococcusok elleni védőhatást. A (8 mg+8 mg) vagy (4 mg+8 mg) H-Polyvackal immunizált II. és III. kutyacsoport beleiben csak kevés (0-3) Echinococcust találtunk (16. táblázat).

1.3 Sertések kísérleti E. granulosus fertőzésének kivédése H-Polyvackal

Összesen 40 egy hónapos malacból 4, egyenként 10 malacot tartalmazó csoportot képeztünk. Minden I., II. és III. csoportba tartozó állatot 2 χ 5 mg H-Polyvackal kezeltünk. Az emlékeztető injekciót 7 nappal (I. csoport), 14 nappal (II. csoport) vagy 21 nappal (III. csoport) az első injekció után adtuk be. AIV. csoportba tartozó 10 malac H-Polyvac helyett sóoldatot kapott. Az emlékeztető injekció után 20 nappal az összes állatot kísérletileg, szájon keresztül, 10 000 oncosphera dózisban megfertőztünk E. granulosusszal. Hét hónap után a sertéseket leöltük és megszámoltuk a májban az Echinococcus-hólyagokat.

AIV. placebocsoportban az összes sertést megfertőzték az Echinococcusok. Nagy, 15-20 mm-es Echinococcus-hólyagokat találtunk, számuk 8-12 hólyag volt májanként (17. táblázat). Ezzel szemben a legtöbb HPolyvackal kezelt sertésben nem találtunk Echinococcust. Az I., II. és III. csoport állatainak 70,90, illetve 80%-a teljesen Echinococcus-mentes volt. Ha találtunk is bélférget, számuk 1-4 volt egy-egy májban. Ezenkívül a H-Polyvackal immunizált sertésekben a talált bélféreglárvák mérete igen kicsi volt (2-3 mm körül).

A 17. táblázat adatai minden kétséget kizáróan igazolják, hogy a primer és szekunder H-Polyvac-immunizálás közötti intervallumok közül a malacok számára a 14-21 napos intervallum az előnyös.

A kapott eredmények világosan megmutatják, hogy a H-Polyvac nagy hatékonysággal ki tudja védeni sertésekben a kísérletileg előidézett echinococcosist. Ezenkívül az adatok világosan meghatározzák a malacok HPolyvac vakcinálására alkalmazandó hatékony dózist és immunizálási protokollt.

1.4 Juhok kísérleti E. granulosus fertőzésének kivédése

A vizsgálatokban 2-5 hónapos bárányokat használtunk. Három külön kísérletet végeztünk 12, 20, illetve 20 báránnyal.

Az első kísérletben két, kutyákban és malacokban hatásosnak talált H-Polyvac-dózist - 5 mg-ot és 10 mgot - alkalmaztunk. 12 db 3-4 hónapos bárányt 3, egyenként 4 állatot tartalmazó csoportba osztottunk be (18. táblázat). Az I. csoport bárányait 2x5 mg H-Polyvackal kezeltük intramuszkulárisan, úgy, hogy 21 napos intervallum volt az első és az emlékeztető injekció között. A II. csoportot hasonló módon kezeltük 2x10 mg HPolyvackal. Az utolsó 4 bárány képezte a placebokontrollt, ők 0,9%-os NaCl-oldatot kaptak.

Két héttel a második immunizálás után az összes bárányt 10 000 oncosphera szájon át történő beadásával megfertőztük E. granulosusszal. 400 nappal később mindhárom csoport juhait leöltük, felboncoltuk és megszámoltuk a májban és a tüdőben az E. granulosushólyagokat.

A kapott eredményeket a 18. táblázatban foglaltuk össze. Világosan látható, milyen erőteljesen elhatalmasodott a fertőzés a placebocsoport bárányaiban. Ebben a csoportban a juhok belső szerveiben nagyszámú hydatid E. granulosus-hólyagot találtunk (állatonként átlag 88). A H-Polyvackal immunizált állatok belső szervei 8-15ször kevesebb Echinococcust tartalmaztak. Sőt, a H-Polyvackal immunizált juhokban az Echinococcus-hólyagok mérete 1-2,5 mm volt, szemben a nem immunizált kontrollállatokéval, ahol a méret 4-9 mm-t tett ki.

Az ezt követő hasonló kísérletben húsz 3 hónapos bárányból képeztünk 3 csoportot. 8 bárányt immunizáltunk intramuszkulárisan, 2x5 mg H-Polyvackal, 21 nap intervallummal a 2 injekció között (19 táblázat). A másik csoport 8 bárányát szubkután kezeltük 2x5 mg HPolyvackal, szintén 21 nap intervallummal a két injekció között. A placebo-kontrollcsoportba sorolt utolsó 4 bárány 0,9%-os NaCl-oldatot kapott. Az emlékeztető immunizálás után 2 héttel az összes állatot megfertőztük 10 000 E. granulosus oncospherával. A 19. táblázatban közölt eredmények igen hasonlítanak az első kísérlet eredményeihez (18. táblázat).

A 19. táblázat eredményei, azonkívül, hogy bizonyítják a H-Polyvac nagy immunizációs hatékonyságát (kétszer ismételt 5 mg H-Polyvac-injekció), amikor kivédi bárányok kísérleti fertőzését 10 000 oncospherával szemben, egyúttal megmutatják, hogy mind az intramuszkuláris, mind a szubkután befecskendezés elfogadható vakcinálási eljárás.

A harmadik, befejező kísérletben húsz 4-5 hónapos bárányból képeztünk 3 csoportot a 20. táblázatban leírt protokoll szerint. Az immunizáláshoz két különböző sarzshoz tartozó H-Polyvacot használtunk. Az I. csoport 8 bárányát 2x5 mg 1. sarzsszámú H-Polyvackal, a II. csoport 8 bárányát 2 χ 5 mg 2. sarzsszámú H-Polyvackal kezeltük. Az utolsó 4 bárány képezte a placebokontrollcsoportot. Két héttel az emlékeztető immunizálás után mind a 20 bárányt szájon keresztül fertőztünk 10 000 E. granulosus oncospherával (20. táblázat).

A fertőzés után 425 nappal az összes állatot leöltük, felboncoltuk, és megszámoltuk a tüdőben és a májban a bélférgek számát. A kapott eredmények ismét bizonyítják a H-Polyvac nagy immunizációs hatékonyságát a nagyszámú E. granulosus oncosphera kísérleti fertő15

HU 222 189 Bl zésével szemben (20. táblázat). A placebokontroll juhai erősen fertőzöttek voltak és májukban, valamint tüdejükben sok Echinococcust találtunk (átlag 65 bélféreg állatonként). A kétszer intramuszkulárisan befecskendezett 5 mg H-Polyvac mind az 1., mind a 2. sarzs esetén erősen megnövelte a bárányok ellenálló képességét E. granulosusszal szemben. Egyes állatok (az I. csoportban 8-ból 3 bárány, vagyis 37,5%) belső szervei teljesen Echinococcus-mentesek voltak. A többi immunizált juh májában és tüdejében kisszámú Echinococcushólyagot találtunk (átlagértékek: 3 és 2,5 állatonként az I. és II. csoportban). Sőt a hydatid bélféreghólyagok az immunizált állatokban kisebb méretűek voltak (23 mm), mint a kontrollállatokéi (5-7 mm).

1.5 Következtetések

A H-Polyvac hatékonysága kísérleti kutya-, juh- és sertés-echinococcosis kivédésében

A H-Polyvac aktivitását nagy E. granulosus-dózisokkal kísérletileg fertőzött állatokban 1.1-1.4 pontok szerint vizsgálva, a következő következtetéseket lehetett levonni:

(a) kutyák, juhok és sertések megelőző immunizálása jelentős mértékben megnövelte ellenálló képességüket E. granulosus fertőzéssel szemben, (b) a H-Polyvackal végzett immunizálás megvédte az említett állatfajokat még az erős és intenzív Echinococcus-támadással szemben is, melyet kísérletileg idéztünk elő az állatokban több ezer invazív bélféreg akut bevitelével, (c) a H-Polyvac védőhatása E. granulosus ellen szigorúan H-Polyvac-dózisfuggő. Kétszer intramuszkulárisan vagy szubkután beoltott 5-10 mg H-Polyvac 14-21 napos intervallummal a két injekció között - bizonyult optimálisnak fiatal kutyák, 1 hónapos malacok vagy 3-5 hónapos bárányok immunizálására.

2. A H-Polyvac védőhatása kísérleti Dictyocaulus filaria fertőzéssel szemben

Mivel a H-Polyvac hialuronidáz antigént tartalmaz, mely közös alkotóeleme a különböző bélféregfajoknak, várható, hogy a H-Polyvac védőhatása nemcsak Echinococcusok, hanem egyéb bélféregfajokkal szemben is érvényesül. Ebben a fejezetben ismertetjük azokat a vizsgálatokat, melyekben tanulmányoztuk a H-Polyvac védőhatását juhok intenzív kísérleti D. filaria fertőzésével szemben. Ez a bélféreg szájon át fertőzi meg a szervezetet invazív 3. stádiumú lárva formájában (L3). A parazita ezután áthatol a bélfalon, és addig vándorol a gazdaszervezetben, míg végül eléri a tüdőt. Itt hetekig növekszik és érett egyeddé fejlődik. A tüdőszöveten belül növekedve az érett, 3-10 cm-es tüdőférgek elpusztítják mikrokömyezetüket, melynek eredményeként tüdőgyulladás, atelectasia és fekélyek fejlődnek ki a tüdőben. A D. filaria életciklusát tekintetbe véve a bárányok kísérleti fertőzését szájon át, 500 L3 lárvával hajtottuk végre, majd 2 vagy 3 hónap elteltével megszámoltuk a D. filariák számát a tüdőben.

Összesen 3 különálló kísérletben vizsgáltuk a HPolyvac hatását kísérleti dictyocaulasisban. Az első kísérletben tizenkét 3-4 hónapos bárányt használtunk: közülük 4-be kétszer fecskendeztünk be intramuszkulárisan 5 mg H-Polyvacot (1. sarzs), míg a többi 4-be ugyanezt a dózist a 2. sarzs H-Polyvacból. Az emlékeztető immunizálást 21 nappal az első immunizálás után végeztük. A maradék 4 bárány volt a placebokontroll (21. táblázat).

Az emlékeztető immunizálás után két héttel az állatokat szájon át kísérletileg megfertőztük 500 dictyocaula lárvával. Két hónappal később az állatokat leöltük és meghatároztuk a szervezetben a D. filariák számát. A bárányok H-Polyvackal végzett immunizálása ellenállóvá tette őket az erőteljes D. filaria fertőzéssel szemben (500 lárva szájon át történő beadása). A fertőzés után 2 hónappal az immunizált állatok közel 15%-a teljesen D. filaria-mentes volt. A maradék H-Polyvackal immunizált állat kisebb számban fertőződött meg (átlag 4 vagy 5 bélféreg állatonként), míg a kontrollcsoport nem immunizált állatai erősen fertőződtek dictyocaulákkal (átlag 67 bélféreg állatonként).

A következő két kísérlet, melyet a 22. táblázatban foglaltunk össze, a 21. táblázathoz igen hasonló adatokat eredményezett. Vagyis a 2-3 hónapos bárányok 5 mg H-Polyvackal való immunizálása (intramuszkulárisan, két alkalommal, 21 napos intervallummal a két injekció között) kivédte az állatok erős, 500 D. filaria lárvával előidézett kísérleti fertőzését.

Tehát a H-Polyvac védőhatása nem korlátozódik E. granulosusra. Ebben a fejezetben világosan igazoltuk, hogy a H-Polyvac hatásosan kivédi bárányok kísérleti D. filaria fertőzését. Ugyanazok a H-Polyvac-dózisok és immunizálási séma bizonyult hatásosnak mindkét vizsgált helminthiasisban.

3. A H-Polyvac védőhatása kísérleti Fasciola hepaticával szemben

Két kísérletben 3-4 hónapos bárányokat használtunk fel az alábbiak szerint. Az állatokat a 23. és 24. táblázat protokollja szerint 3-10 mg dózisban immunizáltuk H-Polyvackal. Két héttel az emlékeztető injekció után mind az immunizált, mind a kontroll- (placebo-) állatokat kísérletileg fertőztük F. hepaticával. Ebből a célból szájon át beadtunk 50 vagy 100 invazív metacercaria lárvát. 5-7 hónap elteltével az állatokat leöltük, felboncoltuk és meghatároztuk a májban a fasciolák számát.

A kapott eredmények igazolják a H-Polyvac jelentős védőhatását. A kétszer megismételt 3 vagy 5 mg HPolyvac-injekció 50%-kal csökkentette a gazdaszervezetben túlélő bélférgek számát még 100 metacercaria szájon át történő adagolásával végzett erős fertőzés esetén is (23. táblázat).

Amikor a kísérleti metacercaria dózist felére csökkentettük, a H-Polyvac védőhatása 95-96%-ot ért el (24. táblázat).

A kísérletek világosan igazolják, hogy a H-Polyvac immunvédelmet indukál nagyszámú fasciola kísérleti fertőzésével szemben. Az 1. és 2. pontban közölt adatokkal együtt megmutatják, hogy a H-Polyvacnak polispecifikus védőhatása van három különböző bélféregfajtával (F. hepatica, D. filaria és E. granulosus) szemben. Sőt, ha a H-Polyvac-immunizáció megvédte az állatokat a használt erős, akut, kísérleti bélféregfertőzéssel szemben, kifejezetten várható, hogy a vakcinának

HU 222 189 Β1 védőhatása lesz azokban az állatokban, melyek természetes körülmények között spontán fertőződnek meg bélférgekkel. A H-Polyvackal végzett szabadföldi kísérletek igazolták ezt a feltételezést.

4. A H-Polyvac polispecifikus védőhatása spontán E. granulosus, D. filaria és F. hepatica fertőzéssel szemben

Ismert tény, hogy egyes bélféregfertőzések jellemzőek az állattenyésztő gazdaságokra és/vagy állattenyésztő régiókra. Egyes területek (vagy gazdaságok) veszélyeztetettek a dictyocaulasis, mások a cestoda lárva fertőzés, fascioliasis stb. szempontjából. Itt a „veszélyeztetett” szó azt jelenti, hogy évről évre a gazdaságban/régióban született minden új generáció ugyanúgy fertőződik és a fertőzött állatok aránya igen magas (sokszor több, mint 50%), végül az állatban parazitaként élő specifikus bélféregfajta száma elég magas ahhoz, hogy az állaton megjelenjenek a helminthiasis klinikai tünetei. Ezt tekintetbe véve a H-Polyvac szabadföldi kísérleteit különböző olyan állattenyésztő gazdaságokban és régiókban végeztük, melyek veszélyeztetettek az állatokra az echinococcosis, dictyocaulasis és fascioliasis szempontjából. A kísérlet ideje alatt esetenként több bélféregfaj (az említettekből) is okozott fertőzést.

4.1 Juhok és kutyák spontán E. granulosus fertőződésének kivédése szabadföldi körülmények között

Az eredeti kísérleteket Karaganda megye (KözépKazakisztán) „Koyadinsky” nevű állami juhgazdaságában és a Chadyr-Langoon régió (Moldova) „Leninsky Poot” nevű juhtenyésztő kolhozában, a Szovjetunióban végeztük. Mindkét gazdaság igen veszélyeztetett volt echinococcosis szempontjából. Ténylegesen a juhok több mint 60%-a fertőzött normál körülmények között Echinococcusokkal.

A 25. és 26. táblázatban ismertetett protokoll szerint összesen 75 2-3 hónapos bárányt használtunk a „Koyadinsky” gazdaságból és 135 bárányt és 11 juhászkutyát a „Leninsky Poot” gazdaságból. Az állatokat kétszer immunizáltuk 5 vagy 10 mg 1. számú vagy 2. számú sarzsból származó H-Polyvackal. A H-Polyvackal történő immunizálás ideje alatt, valamint két hétig az emlékeztető immunizálás után az állatokat különválasztottuk a nyájtól. Utána ismét a nyájjal együtt, normál szabadföldi körülmények között éltek az Echinococcusokkal fertőzött állatok társaságában. Egy évvel később a „Koyadinsky” gazdaságban és 8 hónappal később a „Leninsky Poot” gazdaságban a juhokat leöltük, és meghatároztuk a májban és a tüdőben az Echinococcusok számát. A 25. és 26. táblázatból látható, hogy az immunizálatlan kontrollállatok erősen fertőzöttek voltak Echinococcusokkal, ezzel szemben a H-Polyvackal immunizáltak jelentős rezisztenciát fejtettek ki a fertőzéssel szemben. A H-Polyvac védőhatása alatt a fertőzött állatok százalékos aránya 78%-ról 26%-ra csökkent és az átlag Echinococcus-szám a „Koyadinsky” gazdaságban 25-ről 2-re és a „Leninsky Poot”-ban 4,8ról 1,8-ra csökkent. Az 1. számú és a 2. számú HPolyvac sarzs hatása között nem találtunk lényeges különbséget.

A „Leninsky Poot”-ban leölt állatokban az Echinococcusokon kívül más fajok rokon cestodáit is megtaláltuk (Coenurus cerebralis és Cysticercus tenuicollis). A 26. táblázatban felsorolt adatok mutatják, hogy a HPolyvackal végzett immunizálás lényegesen megnövelte a juhok ellenálló képességét nemcsak az Echinococcus, hanem a C. cerebralis és C. tenuicollis fertőzéssel szemben is.

All juhászkutyát a „Leninsky Poot”-ban a szabadföldön együtt tartottuk a 135 juhhal. Mivel felnőtt kutyák voltak, már fertőzöttek voltak cestodákkal, melyek eltávolítására féregűző „Droncit”-tal kezeltük őket a H-Polyvac-immunizálás előtt. Ezt követően két 10 mg-os intramuszkuláris H-Polyvac-injekciót kaptak, 21 napos intervallummal a két injekció között és továbbra is együtt éltek a nyájjal, melyet szokás szerint ellenőriztünk. Mind all kutya ürülékét havonta ellenőriztük annak eldöntésére, hogy a kutyák ismét fertőződtek-e cestodákkal. Végül 8 hónappal a H-Polyvacimmunizálás után a kutyák bélféregűző szert kaptak a cestoda fertőzés kimutatására. A megfigyelési időszak alatt nem találtunk cestodákat a H-Polyvackal kezelt kutyákban.

4.2 Spontán D. filaria fertőzés kivédése bárányokban

Ezeket a szabadföldi kísérleteket a „Druzhba” (Bolshenarymsky régió, Kelet-Kazahsztán) kolhozban és a „Maximoka” (Anneny Noy régió, Moldova) juhtenyésztő gazdaságban végeztük. Mindkettő igen veszélyeztetett volt dictyocaulasis szempontjából. Általában mind a „Druzhbá”-ban, mind a „Maximoká”-ban a juhok 90-100%-a dictyocaula-fertőzött volt. Összesen 220, illetve 68 1,5-2 éves bárányt használtunk a „Druzhbá”-ban és a „Maximoká”-ban lefolytatott vizsgálatokban. A bárányokat immunizáltuk H-Polyvackal, majd két héttel az emlékeztető immunizálás után ismét szabadföldön, a szokott juhnyájjal együtt tartottuk őket. A „Druzhba” gazdaság juhait 7 hónappal az immunizálás után leöltük és a tüdőben meghatároztuk a dictyocaula számot (27. táblázat). A ,Maxioka” gazdaság vizsgálatba bevont juhait nem öltük le, hanem 5 hónappal a H-Polyvac-immunizálás után a D. filaria fertőzés fokát az ürülékből határoztuk meg a dictyolcaula lárvák coprologiai analízisével (28. táblázat).

4.3 Juhok spontán F. hepatica fertőzésének kivédése szabadföldi körülmények között

Ezeket a vizsgálatokat a „Poot Rybaka” (Dagestan, FÁK) juhgazdaságban és az Állatgyógyászati Kutató Stavropol Állomásához (Stavropol megye, FÁK) tartozó juhgazdaságában végeztük. Összesen 243, illetve 50 báránnyal végeztünk kísérleteket a dagestani, illetve stavropoli telepeken. Ezenkívül a dagestani gazdaságban 3 különböző H-Polyvac sarzsot - IG-4, IG-8 és IG-16 - használtunk 3 különböző nyájon, a stavropoli gazdaságban ugyanakkor két különböző H-Polyvac sarzsot (1. és 2. számú) alkalmaztunk ugyanazon a nyájon belül.

A bárányokat immunizáltuk H-Polyvackal és 2 hét múlva visszaküldtük nyájaikhoz, ahol normál szabad17

HU 222 189 Bl földi viszonyok között éltek. 6, 7 és 10 hónappal később a bárányokat leöltük és májukban meghatároztuk a fasciolák számát. A 29 és 30. táblázatban közölt adatok mutatják, hogy a H-Polyvac-immunizálás jelentősen csökkenti a bárányok fasciola fertőzésre való hajlamát.

Az összes használt H-Polyvac sarzs hatékony védőhatást nyújtott fascioliasissal szemben bárányokban. Érdemes tudni, hogy 5 mg H-Polyvac 20 mg synpollal mint immunadjuvánssal kombinálva valamivel jobb védőhatást nyújtott, mint az 5 mg H-Polyvac egyedül. Ez a megfigyelés később igazolást nyert, és hasznosítottuk is a nagy volumenű H-Polyvac-vizsgálatokban (lásd a következőkben 5.2-ben).

Bár a nagy mennyiségű bélféreggel (E. granulosus, D. filaria, F. hepatica) végzett akut, kísérleti fertőzés jellege lényegesen különbözött a normál, szabadföldi spontán fertőzés jellegétől, a H-Polyvac-készítmény mind a kísérleti, mind a szabadföldi vizsgálatban ugyanolyan nagy hatékonysággal védte ki a fent említett helminthiasisokat.

5. A H-Polyvac állami vizsgálata

A kísérleti és szabadföldi vizsgálatokat áttanulmányozva a volt Szovjetunió Állatgyógyászati és Állatgyógyászati Ellenőrzési Állami Főigazgatósága elrendelte a H-Polyvac széles körű vizsgálatát szabadföldi körülmények között (46. számú rendelet, 1990. május 11.). Az állami ellenőrzés mellett folyó vizsgálatnak két célja volt: először igazolni a H-Polyvac hatékonyságát az ország különböző földrajzi és éghajlati adottságú állattenyésztő gazdaságaiban, másodszor nagy állatpopulációk esetén megbecsülni a H-Polyvac védőhatását.

5.1 Vizsgálóhelyek földrajzi elhelyezkedése

Az echinococcosis, dictyocaulasis és fascioliasis szempontjából veszélyeztetett juhgazdaságok területi elhelyezkedése: Ukrajna (Kharkov és Soomi régiók, Krím megye), Moldova (Anneny Noy régió és Garakly régió), Grúzia, Üzbegisztán (Samarkand régió), Közép-, Dél- és Kelet-Kazahsztán, a FÁK déli része (Dagestan és Stavropol megye) és a FÁK középső része (Nyzhny Novgorod, Voronezh, Belgorod és Belaya Tserkov).

Az állami vizsgálatok helyét és a használt állatszámot a 31. táblázat tartalmazza. A vizsgálatok adatai minden tekintetben igazolták a korábban közölt adatokat. Röviden, célszerű, ha a kapott adatokat a hatékonysági együtthatóval fejezzük ki (EC):

C-V

EC=-χ 100%

C ahol C az egy állatra eső átlag bélféregszám a kontrollcsoportban és V ugyanez a paraméter a H-Polyvackal beoltott állatcsoportban.

A hatékonysági együtthatóval kifejezve, az adatokból kitűnik, hogy a H-Polyvac hatékonysága a dictyocaulasis kivédésében 82-90%, a fascioliasis kivédésében 90% és végül az echinococcosis kivédésében közel 100%. Példaként a kísérletek kivitelezésének módjára röviden közöljük a Kelet-Kazahsztánban több ezer juhon végzett vizsgálatok eredményeit.

5.2 H-Polyvac vizsgálata nagy juhállományon, szabadföldi körülmények között

Epidemiológusok és epizootiológusok körében általánosan elfogadott nézet, hogy minél nagyobb a vizsgált állatállomány, annál pontosabbak a fertőzés epidemiológiájára vonatkozó adatok. Ez egy új vakcina hatékonyságának értékelésére is igaz, így a több ezer bárányon végzett H-Polyvac-vizsgálat eredményei igen értékesek. Az alábbiakban közlünk néhány példát.

A H-Polyvac védőhatását a „Druzhba” (Kelet-Kazahsztán) kolhozban 11 000 szabadföldi bárányon vizsgáltuk. A vakcinát állatonként 5 mg dózisban, kétszer adtuk be - 21 napos intervallum közbeiktatásával - 20-30 napos bárányoknak, 45 nappal a bárányok legelőre küldése előtt. Egy évvel később, az 1127 leölt bárányban 3-4 coenurát találtunk állatonként 6 bárányban, nem találtunk viszont sem dictyocaulát, fasciolát vagy Echinococcust. A gazdaság különböző nyájaiban a beoltatlan juhok fertőzöttségi foka 80-100% volt.

A következő évben a H-Polyvac védőhatását ugyanabban a „Druzhba” (Kelet-Kazahsztán) kolhozban 11 700 szabadföldi bárányon vizsgáltuk. Most a vakcinát állatonként 5 mg+20 mg synpol dózisban, kétszer adtuk be - 21 napos intervallum közbeiktatásával - 20-30 napos bárányoknak, 45 nappal a bárányok legelőre küldése előtt. Hét hónappal később, az 5000 leölt bárányban 1-3 dictiocaulát találtunk 25 bárányban, nem találtunk viszont sem fasciolát vagy Echinococcust. A beoltatlan kontrolljuhok fertőzöttségi foka 90-100% volt.

Mindkét nagy méretben végzett kísérlet példája egyértelműen bizonyítja a H-Polyvac nagy hatékonyságát a valódi szabadföldi állattenyésztésben.

1. táblázat

A H-Polyvac akut toxicitása

Vakcinadózis g/kg	Élők száma	Élők/holtak száma	Mortalitás %
3	6	5/1	83,1
1,5	6	3/3	50,0
0,75	6	0/6	0

HU 222 189 Bl

2. táblázat

Hím patkányok biokémiai vérszérum-paraméterei intramuszkuláris H-Polyvac-injekció után

Paraméter	Egység	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
10 injekció után
Májtömeg	arány	4,15±0,ll	3,87±0,10	3,85 ±0,10
Teljes fehéije	g/1	36,59±0,56	36,34±1,15	35,07±l,04
Glükóz	mM/1	8,90±0,24	8,65±7,28	9,28±0,27
Koleszterin	mM/l	45,88±3,37	78,90±3,51	53,17±4,05
Karbamid	mM/1	6,58±0,32	6,44±0,30	7,17 ±0,27
Kreatinin	mcM/1	74,4±3,11	72,4±4,37	77,90±2,66
Kloridok	mM/1	101,5±0,84	101,0±0,72	102,2± 1,43
ALT	U/l	62,90±3,65	72,0±2,57+	74,9±3,97+
AST	U/l	391,1 ±41,87	386,5±19,70	398,4±32,12
AP	U/l	363,9±71,62	825,3 ±125,9	837,1 ±70,38
4 héttel a kezelés befejezése után
Májtömeg	arány	3,71±0,18	3,74±0,12	3,31 ±0,09
Teljes fehéije	g/1	38,70±l,28	41,00±0,76	41,62 ±1,49
Glükóz	mM/1	8,76±3,20	8,16±4,09	8,73±3,57
Koleszterin	mM/1	54,15±5,39	50,01 ±3,21	46,49±5,73
Karbamid	mM/1	7,36±0,24	6,52±0,36	6,90±0,39
Kreatinin	mcM/1	98,88±3,13	91,33 ±5,98	102,48±4,78
Kloridok	mM/1	99,1 ±0,26	100,0±l,53	100,3±0,83
ALT	U/l	75,8±7,90	78,2±6,08	69,4±4,26
AST	U/l	343,7±21,47	376,6±28,51	355,9± 18,50
| AP	U/l	491,0±35,9	461,9±33,4	518,3±31,3

3. táblázat

H-Polyvac-injekció hatása a vesefiinkcióra

Paraméter	Szubsztrát	Egység	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
1 Májtömegarány			0,67±0,02	0,70±0,02	0,66±0,01
Dieresis		ml	9,26±0,72	9,10±0,71	8,60±0,72
Diuretikus sebesség		ml/mi	0,0064±0,0005	0,0063 ±0,00049	0,006±0,00049
Fehéije	szérum	g/i	36,59±0,66	36,34±1,15	35,07±1,04
	vizelet	g/i	6,16±0,12	6,20±0,24	6,8 ±0,37
	vizelet	g/24h	0,057±0,004	0,056±0,005	0,057 ±0,003
Karbamid	szérum	mm/1	6,58±0,32	6,44±0,30	7,17±0,27
	vizelet	mm/1	893,7±26,9	386,9±77,6	941,0±72,6
	vizelet	mm/24h	8,19±0,45	7,99±0,75	7,97±0,57
	clearance	ml/mi	0,87±0,04	0,82±0,05	0,78±0,5
Kreatinin	szérum	mcm/1	74,4±3,11	72,4±4,37	77,9±2,66
	vizelet	mcm/1	24 025±998	22 782±1 399	23 102±l 388
	vizelet	mcm/24h	219,7±12,1	206,8±21,7	194,6±11,1
	clearance	ml/mi	2,07±0,18	l,92±0,19	l,77±0,ll

HU 222 189 Β1

3. táblázat (folytatás)

Paraméter	Szubsztrát	Egység	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
Kloridok	szérum	mM/1	101,5±0,84	101,0±0,72	102,2± 1,43
	vizelet	mM/1	51,6±17,2	67,2±8,16	65,0±7,8
	vizelet	mm/24h	0,54±0,07	0,60±0,07	0,55 ±0,08

4. táblázat

H-Polyvac hatása a vesefunkcióra 1 hónappal az injekció beadása után

Paraméter	Szubsztrát	Egység	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
Májtömegarány			0,68±0,02	0,69±0,01	0,67±0,03
Dieresis		ml	11,3±1,5	ll,0±0,6	10,9±0,5
Diuretikus sebesség		ml/mi	0,0078±0,001	0,0076±0,0004	0,0076±0,0005
Fehéije	szérum	g/i	38,70±l,28	41,00±0,76	41,62±1,49
	vizelet	g/i	5,48±0,39	5,66±0,28	5,30±0,53
	vizelet	g/24h	0,0078±0,001	0,062±0,003	0,057±0,005
Karbamid	szérum	mm/l	7,38±0,24	6,52±0,36	6,90±0,39
	vizelet	mm/1	806,8±49,9	852,0±90,3	859,2±64,8
	vizelet	mm/24h	9,20±l,05	9,40±0,98	9,50±0,73
	clearance	ml/mi	0,85±0,09	0,96±0,09	0,98±0,10
Kreatinin	szérum	mcm/1	98,38±3,13	91,33±5,98	102,48±4,78
	vizelet	mcm/1	21 637±217	23 871±241	20 748± 139,5
	vizelet	mcm/24h	245,5±20,6	259,5 ±30,5	226,1 ±22,9
	clearance	ml/mi	l,70±0,24	l,98±0,22	l,59±0,20
Kloridok	szérum	mm/1	99,1 ±0,26	100,0± 1,53	100,63±0,83
	vizelet	mm/1	61,3±8,3	53,8±2,9	67,8±4,12
	vizelet	mm/24h	0,68±0,08	0,60±0,03	0,75±0,073

5. táblázat

Perifériás véranalízis 10 napig tartó intramuszkuláris H-Polyvac-injekció után hím patkányokban

Paraméter	Egység	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
Leukociták	10/1	13,75±0,94 (11,7:17,0)	12,19±0,99 (9,44:15,6)	12,84+1,22 (9,0:15,5)
Vörösvértest	10/1	5,39±0,57 (3,75:7,00)	4,84+0,12 (4,60:5,15)	5,03±0,14 (4,65:5,50)
| Hematokriiarany %		47,56+0,60 (45:51)	49,50±l,07 (44:53)	44,67±1,11 (p<0,05) (40:50)
Hemoglobin	g/i	204,3 ±3,0 (186:217)	206,6+2,4 (198:217)	198,6±5,1 (166:213)
Színparaméter		l,17±0,12 (0,90:1,58)	l,27±0,04 (1,18:1,38)	1,21 ±0,04 (1,08:1,30)

HU 222 189 Β1

5. táblázat (folytatás)

Paraméter	Egység	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
Korpuszkuláris Hbkoncentráció %		43,02+0,87	41,87+0,99	44,54+1,06
		(38,82:46,30)	(38,65:48,18)	(40,00:48,50)

6. táblázat

Központi idegrendszeri funkciós státusparaméterek hím patkányokban 10 napig tartó intramuszkuláris H-Polyvac-injekciós kezelés után

Paraméter	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
N-9	N-8	N-9
Tájékozódó-exploratív magatartás (U)
- verseny	72,8+6,3	43,0+8,0 (p<0,01)	55,2+7,5
- szettek	25,2+4,7	25,5+7,5	26,0+7,9
- „holes” reflex	3,1+0,7	2,0+0,5	5,1+0,8
Fájdalomküszöb (c)	6,76+0,42	7,04+0,42	6,57+0,23
„String” teszt (mm)	56,7+3,0	54,4+4,1	51,1+3,9

7. táblázat

Központi idegrendszeri funkciós státusparaméterek hím patkányokban intramuszkuláris H-Polyvac-injekciós kezelés utáni egy hónapos gyógyulási periódus végén

Paraméter	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
N-9	N-8	N-9
Tájékozódó-exploratív magatartás (U)
- verseny	40,6+5,1	40,6+8,4	33,9+5,7
- szettek	14,6+4,2	28,4+7,9	18,7+6,4
- „holes” reflex	3,7+0,8	2,6+0,6	3,6+0,4
Fájdalomküszöb (c)	6,76+0,42	7,04+0,42	6,57+0,23
„String” teszt (mm)	56,7+3,0	54,4+4,1	51,1+3,9

8. táblázat

Kóros elváltozások gyakorisága közvetlenül a gyógyszerbeadás után leölt állatokban

Elváltozás	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
N-9	N-8	N-9
Tüdőgyulladás	2	1	2
Tüdőlebeny-athelectasia	1	1	1
Tüdőtályog	1	1	2

HU 222 189 Bl

8. táblázat (folytatás)

Elváltozás	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
	N-9	N-8	N-9
Pontszerű bevérződés a csecsemőmirigyben	1	1	2
Pontszerű bevérződés a lágyéknyirokcsomóban	3	5	5
1 Pontszerű bevérződés a szívizomban	0	1	2
Pontszerű bevérződés az injekció helyén	1	1	0
Pontszerű bevérződés a májban	1	0	0

9. táblázat

Kóros elváltozások gyakorisága 4 héttel a H-Polyvac-beadást követő boncolásnál

Ι Elváltozás	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
N-9	N-8	N-9
1 Tüdőgyulladás	1	1	2
J Pontszerű tüdőbevérzés	0	1	0
| Pontszerű bevérzés a csecsemőmirigyben	1	2	2
| Pontszerű bevérzés a lágyéknyirokcsomóban	3	2	2
Pontszerű bevérzés az injekció helyén	1	0	0

10. táblázat

Belső szervek abszolút tömege (IN mg) H-Polyvackal kezelt állatokban

Csoport	Kezelés befejezése
Szervek	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
N-9	N-8	N-9
Máj	I3,99±0,49	12,70±0,65	12,59±0,53
Vese	2,25±0,08	2,28±0,07	2,16±0,05
Szív	l,07±0,04	l,07±0,04	l,04±0,03
| Tüdő	l,63±0,05	l,57±0,07	l,53±0,04
Csecsemőmirigy	0,38±0,04	0,35±0,05	0,34±0,03
Lép	1,81 ±0,09	l,53±0,08+	l,83±0,09
Mellékvese	0,06±0,002	0,057±0,002	0,056±0,002
Here	3,20±0,09	3,45 ±0,09	3,27±0,10
Lágyéknyirokcsomó	0,08±0,007	0,07±0,006	0,09±0,002
Testtömeg (g)	317,7±11,2	327,4± 10,7	326,4±7,9

HU 222 189 Bl

10. táblázat (folytatás)

Csoport	Gyógyulási periódus
1 Szervek	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
N-8	N-8	N-9
Máj	13,69±0,41	13,87+0,48	12,00+0,70
Vese	2,54+0,06	2,57+0,09	2,43+0,08
Szív	1,15+0,04	1,12+0,04	1,17+0,05
Tüdő	1,64+0,05	1,76+0,08	1,67+0,06
Csecsemőmirigy	0,25+0,02	0,24+0,02	0,24+0,02
1 Lép	1,27+0,08	1,49+0,09	1,48+0,13
Mellékvese	0,064+0,002	0,064+0,001	0,06+0,001
Here	3,38+0,11	3,36+0,12	3,44+0,09
Lágyéknyirokcsomó	0,048+0,006	0,063 ±0,008	0,071 ±0,03+
Testtömeg (g)	370,3+7,1	373,0± 15,4	367,8+ 12,3

- kontrolihoz képest jelentős különbség (p<0,05)

11. táblázat

Belső szervek viszonylagos tömege (IN mg) H-Polyvackal kezelt állatokban

Csoport	Kezelés befejezése
Szervek	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
N-9	N-8	N-9
Máj	4,16+0,11	3,87+0,09	3,85+0,10
Vese	0,67+0,01	0,70+0,02	0,69+0,02
Szív	0,32+0,01	0,33+0,01	0,32+0,01
Tüdő	0,48+0,02	0,48+0,02	0,47+0,02
Csecsemőmirigy	0,11+0,009	0,11+0,01	0,11+0,01
Lép	0,54+0,03	0,47+0,02	0,56+0,02
Mellékvese	0,02+0,0007	0,02+0,0008	0,02+0,0009
Here	0,96+0,04	1,06+0,03	1,00+0,08
Lágyéknyirokcsomó	0,02+0,002	0,02+0,002	0,03 +0,001
Testtömeg (g)	337,7+11,2	327,4+10,7	326,4+7,9

11. táblázat (folytatás)

Csoport	Gyógyulási periódus
Szervek	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
N-8	N-8	N-9
Máj	3,72+0,16	3,74+0,11	3,31+0,12
Vese	0,69+0,02	0,69+0,02	0,68+0,03

HU 222 189 Bl

11. táblázat (folytatás)

Csoport	Gyógyulási periódus
Szervek	Kontroll	H-Polyvac
0,4 mg/kg	4 mg/kg
	N-8	N-8	N-9
Szív	0,31 ±0,008	0,30±0,ll	0,33 ±0,008
Tüdő	0,44±0,009	0,47±0,02	0,46±0,012
Csecsemőmirigy	0,07±0,007	0,07±0,006	0,07±0,016
Lép	0,34±0,02	0,40±0,02	0,42±0,03
Mellékvese	0,02±0,0005	0,02±0,0006	0,02±0,0005
Here	0,91±0,02	0,91 ±0,03	0,94±0,03
Lágyéknyirokcsomó	0,011 ±0,001	0,02±0,002	0,02±0,002
Testtömeg (g)	370,0±7,l	373,0± 15,4	367,8± 12,4

12. táblázat

Különböző lymphocytapopulációk kvantitatív aránya és funkciós státusa tengerimalacokban H-Polyvac-kezelés után

	Szám	Kettős rozettaképzési reakció lymphocyták száma	MSRF-reakció Con A-val
T	B	D	O	B	D
1. 2 mg/kg H-Polyvac	10	49±1,9	7±0,9	5±0,7	39±2,4	l,0±0,6	2,2±0,3
2. Intakt kontroll	6	47±3,5	8±1,2	5 ±0,9	40±4,6	0,9±0,7	l,7±0,l
3. 1 mg/kg H-Polyvac	8	56±4,2	5±0,9	4±0,9	31±2,5	0,9±0,07	2,l±0,3
4. Intakt kontroll	6	41 ±3,7	6±1,4	4±0,9	40±4,6	l,l±0,14	2,03±0,3

13. táblázat

Egérembriósejtek domináns mutációi

I SpermatogeI nesis stádiuma	Infúzióban adott anyag	Terhes állatok száma	Termékenyek %	Poszt- implantáció	Elhalálozás	Mutagén hatás	Mutagén aktivitási arány
1. hét	H-Polyvac 6 mg/egér	29	96,6	2,3	0	0	0
	Kontroll	28	93,3	2,0	0	0	0
1 2. hét	H-Polyvac 0,6 mg/egér	29	96,6	2,0	0	0	0
	Kontroll	29	96,6	4,0	0	0	0
3. hét	H-Polyvac 0,6 mg/egér	30	100,0	3,2	0	0	0
	Kontroll	28	93,3	4,2	0	0	0
4. hét	H-Polyvac 0,6 mg/egér	30	100,0	0,3	0	0	0
	Kontroll	30	100,0	2,4	0	0	0
5. hét	H-Polyvac 0,6 mg/egér	29	96,6	3,5	0	0	0
	Kontroll	29	96,6	0,2	0	0	0

Megjegyzés: mind a vizsgálatban, mind a kontroliban 10-10 hímet használtunk.

HU 222 189 Bl

14. táblázat

A H-Polyvac és Polyoxidonium hatása epidermális Lewis-tüdőkarcinóma kialakulására C57BI/6 egerekben

Gyógyszerdózis (mg/kg)	Adagolás módja	Megfigyelési periódus (nap)	Halálozás %	Daganattérfogat (mm)	Kontrolihoz viszonyított %	Daganat súlya (g)	Kontrolihoz viszonyított %
| Kontroll	SC	14	30	6080,25	100	3,23	100
I H-Polyvac 5 mg/kg	SC	14	10	3621,75+	59,6	1,85+	57,0
H-Polyvac 5 mg/kg	Φ	14	10	2869,82+	47,2	2,33+	72,2
Polyoxidonium 2,5 mg/kg	SC	14	10	3679,50+	60,6	2,18+	67,5

+p<0,014

75. táblázat

Állatok	H-Polyvac- immunizálás	Kísérleti E. granulosus fertőzés	Bélférgek száma a bélben kutyánként (átlag)
1. injekció	intervallum (nap)	2. injekció
6 kutya	0,5 mg im	21	0,5 mg im	16 000 protoscolex	400
6 kutya	0,5 mg im	21	0,5 mg im	16 000 protoscolex	400
6 kutya	0,5 mg im	21	0,5 mg im	16 000 protoscolex	400
6 kutya	0,5 mg im	21	0,5 mg im	16 000 protoscolex	400

16. táblázat

1 Csoport száma	Csoportot alkotó állatok	H-Polyvac-immunizálási séma	Ál latonként! bélférgek száma egy hónappal 5000 protoscolcxszcl történt fertőzés után
Szám	Kor (hónap)	1. injekció	intervallum (nap)	2. injekció
I.	3 kutya	3	4 mg im	21	4 mg im	8,16,12
1 n	3 kutya	3	8mgim	21	8mgim	2,0,1
I III.	3 kutya	3	4 mg im	21	8mgim	3,2,2
1 Ιν·	3 kutya	3	sóoldat	21	sóoldat	2475,2500,1573

17. táblázat

I Csoport száma	Csoportot alkotó állatok száma	H-Polyvac-immunizálási séma	Bélféreg hydatid tályogok a májban
1. injekció	intervallum (nap)	2. injekció	EI+ %	11++
1 1	10 malac	5 mg	7	5 mg	30	3, 3,4
II.	10 malac	5 mg	14	5 mg	10	1
III.	10 malac	5 mg	21	5 mg	20	1,2
IV.	10 malac	sóoldat	21	sóoldat	100	10,10, 9, 12, 8,12,12, 11,8,9

EI+: fertőzöttség foka (fertőzött állatok százaléka)

II + +: fertőzöttség intenzitása (bélférgek száma állatonként)

HU 222 189 Bl

18. táblázat

Csoport bárányainak	H-Polyvac-immunizálás	Bélférgek a májban és tüdőben 400 nappal a fertőzés után
száma	kora (hónap)	1.injekció	intervallum (nap)	2. injekció	Echinococcusszám per állat	Hydatid tályogok közelitőleges mérete (mm)
4	3-4	5 mg im	21	5 mg im	3, 6, 4,11 (átlag 6)	1-2-5
4	3-4	10 mg im	21	10 mg im	9,13, 8,12 (átlag 88)	1-2-5
4	3-4	sóoldat	21	sóoldat	52, 78, 77,146 (átlag 6)	4-9

19. táblázat

Csoport bárányainak	H-Polyvac-immunizálás	Bélférgek a májban és tüdőben
száma	kora (hónap)	dózis	beadás módja	intervallum (nap)	Echinococcusszám per állat (átlag +SD)	Hydatid tályogok közelítőleges mérete (mm)
8	3	5 mgx2	im	21	6+4	1-3
8	3	5 mgx2	im	21	5+4	1-4
4	3	sóoldat	se	21	63+23	1-9

20. táblázat

Két különböző H-Polyvac vakcinasarzs védőhatásának összehasonlítása 10 000 E. granulosus oncospherával kísérletileg fertőzött bárányokban

Csoport száma	Csoport bárányainak	H-Polyvac-immunizálás	Bélféreghólyagok a májban és a tüdőben 425 nappal az E. granulosus fertőzés után
száma	kora (hónap)	Sarzs	Dózis	Intervallum (nap)
I. _	8	4,5	1. számú	5 mgx2 im	21	1, 0, 3, 8, 0, 0, 9,4 (átlag 3)	2-3
II.	8	4,5	2. számú	5 mgx2 im	21	2,2, 3,2, 3,2, 3,3 (átlag 65)	2-3
III. L=	4	4,5	sóoldat	im	21	49,64,81,65 (átlag 65)	5-7

21. táblázat

Csoport bárányainak	H-Polyvac-immunizálás	Bélférgek a tüdőben 2 hónappal a fertőzés után
száma	kora (hónap)	Sarzs	Dózis	Kísérleti D. filaria fertőzés (per os)	Bélférgek száma per állat (átlag+SD)	Dictyocaulával fertőzött állatok %
4	3-4	1. számú	5 mgx2	500 lárva	4+2	85
4	3-4	2. számú	5 mgx2	500 lárva	5+1	85
4	3-4	sóoldat	2 ml	500 lárva	67+9	100

HU 222 189 Bl

22. táblázat

Kísérlet száma	Csoport bárányainak	H-Polyvac-immunizálás	D. filaria a tüdőben 1-2 hónappal a fertőzés után
száma	kora (hónap)	1. injekció	Intervallum (nap)	2. injekció	Bélféreg per állat (átlag)	Fertőzött állatok %
2	5	2,5-3	sóoldat	21	sóoldat	30	100
	18	2,5-3	5 mgim	21	5 mg im	4	89
3	10	2-3	sóoldat	21	sóoldat	30	100
	10	2-3	5 mgim	21	5 mg im	4	60

23. táblázat

Csoport bárányai	H-Polyvac-immunizálás	Kísérleti F. hepatica fertőzés	Fasciolák a májban 5 hónappal a fertőzés után (átlag+SD)
Szám	Kor (hó)	1. injekció	intervallum (nap)	2. injekció
4	3	3 mg	21	3 mg	100 metacercariae	12+4
4	3	3 mg	21	5 mg	100 metacercariae	10+3
4	3	sóoldat	21	sóoldat	100 metacercariae	20+8

24. táblázat

Csoport bárányai	H-Polyvac-immunizálás	Kísérleti F. hepatica fertőzés	Fasciolák a májban 7 hónappal a fertőzés után (átlag+SD)
Szám	Kor (hó)	1. injekció (im)	intervallum (nap)	2. injekció (im)
10	3-4	5 mg	21	5 mg	50 metacercariae	1-3
10	3-4	10 mg	21	10 mg	50 metacercariae	1-2
	3-4	sóoldat	21	sóoldat	50 metacercariae	28-37

25. táblázat

A H-Polyvac szabadföldi vizsgálata a „Koyadinsky” juhgazdaságban

Csoport bárányaink	H-Polyvac-immunizálás	Bélférgek a májban és tüdőben 12 hónappal az immunizálás után
száma	kora (hónap)	Sarzs	1. injekció (im)	intervallum (nap)	2.injekció (im)	Echinococcus per állat átlag+SD	Közelítő méret (mm)
25	2-3	1. számú	5 mg	21	5 mg	3+2	3+4
25	2-3	2. számú	5 mg	21	5 mg	2+1	2,5-3
25	2-3	sóoldat	sóoldat	21	sóoldat	25+10	6-9

HU 222 189 Β1

26. táblázat

H-Polyvac szabadföldi vizsgálata a „Leninsky Poot” juhgazdaságban

| Csoport bárányainak	H-Polyvac- immunizálás (im)	Cestodák a belső szervekben 8 hónappal az immunizálás után
száma	kora (hónap)	E. granulosus	C. tenuicollis	C. cerebralis
			EI+	11++	El	II	El	II
45	2,5-3	10 mgx2	26%	1,8	13%	2,5	0	0
45	2,5-3	5 mgx2	40%	3,1	46%	1,5	7%	1,0
45	2,5-3	sóoldat	78%	4,8	89%	4,0	11%	1,0

EI+: fertőzöttség foka

11+ +: fertőzöttség intenzitása (1. 3. táblázat)

27. táblázat

A H-Polyvac szabadföldi vizsgálata a „Druzhba” juhgazdaságban

Csoport bárányainak	H-Polyvac-immunizálás	Bélférgek a tüdőben 7 hónappal az immunizálás után
száma	kora (hónap)	1. injekció (im)	intervallum (nap)	2. injekció (im)	D. filaria per állat (átlag+SD)	Fertőzött állatok %
100	1,5-2	5 mg (1. sarzs)	21	5 mg (1. sarzs)	2+1	12
100	1,5-2	5 mg (1. sarzs)	21	5 mg (1. sarzs)	2+1	13
20	1,5-2	sóoldat	21	sóoldat	13,3+3	100

28. táblázat

A H-Polyvac szabadföldi vizsgálata a „Maximoka” juhgazdaságban

1 Csoport bárányainak	H-Polyvac-immunizálás	Szabadföldi tartózkodás	D. fílariával+ fertőzött állatok
I száma	kora (hónap)	1. injekció (se.)	intervallum (nap)	2. injekció (se.)	(hónap)	%
I 28	1,5-2	5 mg	21	5 mg	6	25
1 25	1,5-2	5 mg	21	10 mg	6	16
I 15	1,5-2	sóoldat	21	sóoldat	6	100

+: koprológia

29. táblázat

A H-Polyvac szabadföldi vizsgálata a „Poot Rybaka” juhgazdaságban

| Nyáj	Csoport bárányainak	H-Polyvac-immunizálás	Szabadföldön töltött idő (hónap)	F. hepatica per máj (átlag+SD)
száma	kora (hónap)	Sarzs	Dózis (im)
1 A	40	2-3	1G4 (IG4+PO)	5mgx2	7	2+1
	40 20	2-3 2-3	sóoldat	(5+20 mg)x2	7 7	0 13+4
B	13 10	3 3	IG-8 sóoldat	5mgx2	7 7	4+3 91+39
C	100 20	2-2,5 2-2,5	IG-8 sóoldat	5mgx2	10 10	8+3 24+14

HU 222 189 Bl

30. táblázat

A H-Polyvac szabadföldi vizsgálata a „Stavropol” juhgazdaságban

Csoport bárányainak	H-Polyvac-immunizálás	Szabadföldön töltött idő (hónap)	F. hepatica szám per máj
száma	kora (hónap)	sarzs	1. injekció	intervallum (nap)	2.injekció
20	2-3	1. számú	5 mg, im	21	5 mg, im	6	0
20	2-3	2. számú	5 mg, im	21	5 mg, im	6	0
iö	2-3	-	sóoldat	21	sóoldat	6	7-32

31. táblázat

Megye	H-Polyvackal vakcináit állatok	Régióban honos helminthiasis
Kelet-Kazakisztán	580 bárány	Dictyocaulasis
Szamarkand régió, Üzbegisztán	600 bárány	Echinococcosis
Szamarkand régió, Üzbegisztán	80 malac	Echinococcosis
Moldova	1000 bárány	Echinococcosis
Belgorod régió	70 bárány	Fascioliasis
Közép-FÁK, Stavropol régió	500 bárány	Fascioliasis
Dél-FÁK, Dagesztán	120 bárány	Fascioliasis
Dél-FÁK Nyzhny-Novgorod reg.	50 bárány	Fascioliasis
Közép-FÁK Krím régió Ukrajna	1000 bárány	Dictyocaulasis
Grúzia	50 bárány	Fascioliasis
Karaganda régió	75 bárány	Echinococcosis
Közép-Kazahsztán, Tselinograd régió	30 bárány	Dictyocaulasis
Közép-Kazahsztán, Dzhambul régió	500 bárány	Echinococcosis
Dél-Kazahsztán, Kharkov régió	50 bárány
Ukrajna, Soomy régió	100 bárány	Dictyocaulasis
Kelet-Kazakisztán	7500 bárány	Echinococcosis
Kelet-Kazakisztán	11 000 bárány és	Echinococcosis
200 kutya	Echinococcosis
Kelet-Kazakisztán	1500 bárány	Dictyocaulasis
Kelet-Kazakisztán	11 700 bárány és	Echinococcosis
68 kutya	Echinococcosis

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (13)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Polimer, amely etilén-piperazin-N-oxid és N-(karboxi-metil)-etilén-piperazinium kopolimerje.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti polimer az (I) általános képlettel jellemezve, ahol a képletben n jelentése 200-2000, q jelentése (0,2-0,35)n, z jelentése (0,4-0,65)n és m jelentése (0-0,4)n.
3. 3. A 2. igénypont szerinti vegyületek közül az (A) képletű polimer.
4. 4. A 2. igénypont szerinti vegyületek közül a (B) képletű polimer.
5. 5. Az 1 vagy 2. igénypont szerinti polimer, amelynek molekulatömege legalább 15 kD.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti polimer, amelynek molekulatömege legalább 30 kD.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti polimer, amely immunostimuláns szerként terápiás célra alkalmas.
8. 8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti polimer, amely immunostimuláns adjuvánsként terápiás célra alkalmas.
9. 9. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti polimer, amely immunostimuláns hordozóként terápiás célra alkalmas.
10. 10. Kombináció, amely egy 1-6. igénypontok bármelyike szerinti polimert és egy antigént tartalmaz.
11. 11. Konjugátum, amely egy 1-6. igénypontok bármelyike szerinti polimert és egy antigént tartalmaz.
12. 12. Vakcinakészítmény, amely egy 10. igénypont szerinti kombinációt vagy egy 11. igénypont szerinti konjugátumot tartalmaz.
13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti polimer, kombináció, konjugátum és vakcina alkalmazása olyan gyógyszer előállítására, mely az immunválaszt stimulálja.