PT771347E - Composicoes de enzimas liquidas estaveis e metodos de utilizacao em sistemas de limpeza e desinfeccao de lentes de contacto - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO 1

“COMPOSIÇÕES DE ENZIMAS LÍQUIDAS ESTÁVEIS E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO EM SISTEMAS DE LIMPEZA E DESINFECÇÃO DE LENTES DE CONTACTO” A presente invenção relaciona-se com a área da limpeza e desinfecção de lentes de contacto. Em particular, esta invenção relaciona-se com composições de enzimas líquidas e métodos para limpar lentes de contacto usadas por humanos com aquelas composições. A invenção relaciona-se também com métodos para limpar e desinfectar simultaneamente lentes de contacto, combinando as composições de enzimas líquidas da presente invenção com um agente desinfectante químico. Têm sido descritas várias composições e métodos para limpar lentes de contacto na literatura de patentes e científica. Alguns destes métodos têm empregado composições contendo surfactantes ou enzimas para facilitar a limpeza de lentes. A primeira discussão sobre o uso de enzimas proteolíticas para limpar lentes de contacto foi apresentada num artigo da autoria de Lo, et al. no Journal of The American Optometric Association, volume 40, páginas 1106- 1109 (1969). Métodos para remover depósitos de proteínas das lentes de contacto através de enzimas proteolíticas têm sido descritos em muitas publicações desde o artigo inicial de Lo, et al. incluindo a patente U.S. n° 3,910,296 (Karageosian, et al). Têm também sido descritas numerosas composições e métodos para desinfectar lentes de contacto. Estes métodos podem geralmente ser caracterizados como envolvendo o uso de agentes químicos e/ ou a quente. Agentes químicos representativos para este fim incluem anti-microbianos orgânicos tais como cloreto de benzalcónio e clorhexidina, e anti-microbianos inorgânicos tais como peróxido de hidrogénio e compostos geradores de peróxido. As patentes U.S. nos. 4,407,791 e 4,525,346 (Stark) descrevem o uso de compostos poliméricos de amónio quaternário para desinfectar lentes de contacto e preservar produtos para cuidar das lentes de contacto. As patentes U.S. nos. 4,758,595 e 4,836,986 (Ogunbiyi) descrevem o uso de biguanidas poliméricas para o mesmo fim. Têm sido propostos vários métodos para limpar e desinfectar ao mesmo tempo lentes de contacto. Métodos envolvendo o uso combinado de enzimas proteolíticas e peróxidos para limpar e desinfectar simultaneamente lentes de contacto, são descritos na patente U.S. n° Re 32,672 (Huth, et al). Um método representativo de simultaneamente limpar e desinfectar lentes de contacto envolvendo o uso de enzimas proteolíticas e compostos de amónio quaternário é descrito na publicação de patente japonesa 57-24526 (Bogoshian, et al). O uso combinado de biguanida (isto é, clorhexidina) e composições de enzimas líquidas para limpar e simultaneamente desinfectar lentes de contacto é descrito na patente canadiana n° 1,150,907 (Ludwig, et al). Métodos envolvendo o uso combinado de enzimas proteolíticas dissolvidas para limpar e calor para desinfectar são descritas na patente U.S. n° 4,614,549 (Ogunbiyi). O uso combinado de enzimas proteolíticas e biguanidas poliméricas ou compostos poliméricos de amónio quaternário é descrito na publicação de pedido de patente europeia n° 0456467A2 (Rosenthal, et al.), bem como na patente U.S. n° 5,096,607 (Mowrey-McKee, et al). A viabilidade comercial da maior parte dos anteriores produtos enzimáticos de limpeza tem dependido do uso de comprimidos enzimáticos estáveis. Mais especificamente, o uso de composições enzimáticas de limpeza sólidas tem sido necessário para assegurar a estabilidade das enzimas antes do uso. Para que se possa usar tais composições, tem de se abrir um pacote contendo um comprimido separado, o comprimido tem de ser colocado numa embalagem separada contendo uma solução, e o comprimido tem de se

I dissolver de forma a libertar a enzima para a solução. Esta prática é geralmente realizada apenas uma vez por semana, devido ao incómodo e fastidioso procedimento e seu potencial para a irritação e toxicidade. Além disso, os comprimidos de limpeza enzimáticos contêm uma grande quantidade de excipientes, tais como agentes efervescentes (por exemplo, bicarbonato) e agentes massificantes (por exemplo, cloreto de sódio). Tal como é explicado abaixo, tais excipientes podem afectar de forma adversa tanto a limpeza como a desinfecção das lentes de contacto. Têm sido feitas tentativas para usar composições de enzimas líquidas para limpar lentes de contacto. Contudo, essas tentativas têm sido goradas pelo facto de que as composições de enzimas líquidas aquosas são intrinsecamente instáveis. Quando uma enzima proteolítica é colocada numa solução aquosa por um período prolongado (por exemplo, vários meses ou mais), a enzima pode perder toda ou uma porção substancial da sua actividade proteolítica. Podem ser levados a cabo passos para estabilizar as composições, mas o uso de agentes estabilizadores pode ter um efeito adverso na actividade da enzima. Por exemplo, agentes estabilizadores podem proteger enzimas contra problemas de instabilidade química durante o armazenamento num líquido aquoso, colocando as enzimas numa conformação física dormente. Esta conformação é aqui referida como sendo “parcialmentè desnaturada”. Contudo, tais agentes podem também inibir a capacidade das enzimas para se tornarem de novo activas (isto é, de se tornarem “renaturadas”) no momento de serem usadas. Finalmente, além dos problemas gerais referidos acima, uma preparação enzimática líquida comercialmente viável para tratar lentes de contacto deve ser relativamente não-tóxica, e deve ser compatível com outros agentes químicos usados no tratamento de lentes de contacto, particularmente agentes anti-microbianos utilizados para desinfectar as lentes.

Pode-se fazer referência às patentes seguintes para ter mais informação sobre o que diz respeito a tentativas anteriores para estabilizar formulações enzimáticas líquidas: as patentes U.S. nos. 4,462,922 (Boskamp); 4,537,706 (Severson); e 5,089,163 (Aronson). Estas patentes descrevem composições de detergentes contendo enzimas. As composições de detergente podem ser utilizadas no tratamento de roupa, bem como em outros usos industriais. Tais detergentes não são apropriados para tratar lentes de contacto. As composições da presente invenção não contêm um detergente, nem outros agentes potencialmente prejudiciais ou irritantes para os olhos. A patente EP-A-0586741 descreve o uso de soluções contendo protease de serina para limpar lentes de contacto, sendo que as soluções incluem um surfactante aniónico e não maiis do que 5 % em peso de glicerol. A patente U.S. n° 5,281,277 (Nakagawa) e os pedidos de patentes Japonesas Kokai nos. 92-370197; 92-143718; e 92-243215 descrevem composições de enzimas líquidas para tratar lentes de contacto. Considera-se que as composições da presente invenção fornecem melhoramentos significativos no que diz respeito às composições descritas

ί naquelas publicações. Na patente U.S. n° 5,281,277, é descrita uma composição de enzima líquida estável para limpar lentes de contacto, compreendendo a composição uma enzima numa quantidade eficaz para limpar a lente; pelo menos 4 % p/ v de um composto de borato ou ácido bórico; água; e de 5 a 40% p/ v de glicerol, sendo a proporção em peso de ácido bórico e/ ou borato para glicerol de 10 a 100 partes de ácido bórico e/ ou borato por 100 partes de glicerol.

Projectámos agora algumas composições de enzimas líquidas para limpar lentes de contacto, cujas composições contêm quantidades críticas de agentes estabilizadores seleccionados. Os agentes estabilizadores utilizados são combinações de um composto de borato ou ácido bórico e um ou mais polióis de carbono 2-3. As quantidades de agentes estabilizadores utilizadas foram cuidadosamente equilibradas, de maneira a atingir uma estabilidade máxima, enquanto uma actividade máxima é obtida mais tarde, quando a composição é posta em uso. Além disso, o composto de borato ou ácido bórico também protege as composições de enzimas líquidas da presente invenção de contaminação microbiana quando as composições são empacotadas em contentores de múltiplas utilizações.

De acordo com a presente invenção, é fornecida uma composição de enzima líquida estável para limpar lentes de contacto, cuja composição compreende: uma enzima numa quantidade eficaz para limpar a lente; pelo menos 4 % p/ v de um composto de borato ou ácido bórico; e água; caracterizada por a composição compreender também 50-70 % v/ v de um poliol de carbono 2 ou 3, e na qual a quantidade de composto de borato ou ácido bórico é de 4 a 8 % p/ v, e na qual o poliol é 1,2-propano diol, 1,3-propano diol ou etileno glicol. A presente invenção fornece também métodos para limpar lentes de contacto com as composições de enzimas líquidas acima descritas. A fím de limpar uma lente suja, a lente é colocada em poucos mililitros de uma solução aquosa e uma pequena quantidade, geralmente uma ou duas gotas, da composição enzimática é adicionada à solução. A lente é então mergulhada na solução de limpeza resultante por um tempo suficiente para limpar a lente. -1 .* 5

As composições de enzimas líquidas da presente invenção são preferencialmente combinadas com uma solução aquosa desinfectante para simultaneamente limpar e desinfectar lentes de contacto. Como será verificado pelos especialistas na matéria, a solução desinfectante deve ser formulada de maneira a ser compatível com as lentes de contacto. A actividade anti-microbiana de muitos agentes desinfectantes é afectada adversamente por solutos iónicos (por exemplo, cloreto de sódio). Como é explicado abaixo, as composições de enzimas líquidas da presente invenção são substancialmente não iónicas, e como tal não afectam adversamente a actividade anti-microbiana de tais agentes desinfectantes. Este facto é considerado uma vantagem principal da presente invenção.

Por conseguinte, a presente invenção fornece um método de limpeza e desinfecção de lentes de contacto, método esse que compreende dispersar uma composição de enzima líquida de limpeza substancialmente como é descrito aqui numa solução aquosa desinfectante contendo uma quantidade de um agente anti-microbiano eficaz para desinfectar as lentes, cujo agente anti-microbiano é substancialmente como descrito aqui para formar uma solução enzimática/ desinfectante aquosa, contactando a lente tanto com a solução desinfectante antes da dispersão da composição de limpeza nela contida, como com a solução enzimática/ desinfectante aquosa, mergulhando a lente na solução enzimática/ desinfectante aquosa por um período de tempo suficiente para limpar e desinfectar a lente.

Tal como será descrito com mais detalhe, um agente anti-microbiano preferido compreende de 0,0001 % a 0,05 % p/ v de poliquatérnio-1, e a presente invenção fornece ainda uma composição de enzima líquida estável para limpar lentes de contacto em combinação com uma solução desinfectante aquosa contendo um agente anti-microbiano, cuja composição enzimática compreende uma enzima numa quantidade eficaz para limpar as lentes, pelo menos 4 % p/ v da composição enzimática compreendendo um composto de borato ou ácido bórico, e água; caracterizada por a. composição enzimática conter também de 50-70 % v/ v de um poliol de carbono 2 ou 3, e em que a quantidade de composto de borato ou ácido bórico é de 4 a 8 % p/ v da composição enzimática, e caracterizada por o agente anti-microbiano compreender de 0,00001 % a 0,05 % p/ v de poliquatérnio-1. Um método correspondente de acordo com a presente invenção para limpar e desinfectar lentes de contacto compreende dispersar uma pequena quantidade de uma composição de enzima líquida de limpeza numa solução desinfectante aquosa contendo uma quantidade de um agente anti-microbiano eficaz para desinfectar as lentes, para formar uma solução enzimática/ desinfectante aquosa, contactando as lentes tanto com a solução desinfectante antes da dispersão da composição de limpeza nela contida, como com a solução enzimática/ desinfectante aquosa, e mergulhando as lentes na solução enzimática/ desinfectante aquosa por um período de tempo suficiente para limpar e desinfectar as lentes, em que o agente anti-microbiano compreende de 0,00001 % a 0,05 % p/ v de poliquatérnio-1, e a composição líquida de limpeza compreende: uma enzima numa quantidade eficaz para limpar as lentes; de 4 a 8 % p/ v da composição enzimática compreendendo um composto de borato ou ácido bórico; de 50-70 % v/ v da composição enzimática compreendendo um poliol de carbono 2 ou 3, e água.

As composições enzimáticas da presente invenção são formuladas como líquidos multi-dose concentrados, e consequentemente não contêm excipientes de comprimidos de enzimas, tais como cloreto de sódio (agente massificante) e bicarbonato (agente efervescente).. As composições de enzimas líquidas da presente invenção utilizam um veículo aquoso. Os componentes primários do veículo são um ou mais polióis e água. Qualquer destes componentes é não iónico. As composições de enzimas líquidas da presente invenção são, assim, substancialmente não iónicas e têm, por conseguinte, muito pouco impacto na potência iónica de uma solução desinfectante, e pouco ou nenhum efeito na actividade anti-microbiana das soluções desinfectantes.

As composições e métodos da presente invenção fornecem maior facilidade de uso. Esta facilidade de uso permite aos utilizadores de lentes de contacto limpar as suas lentes 2 ou 3 vezes por semana, ou mais preferencialmente, todos os dias. Foi descoberto que o uso diário das composições de enzimas líquidas da presente invenção resulta numa limpeza e segurança dramaticamente melhor, por comparação com os regimes semanais de limpeza com enzimas que estão a ser utilizados correntemente.

De modo a que a invenção possa ser mais bem compreendida, será feita referência aos desenhos em anexo, nos quais: A Figura 1 é um histograma que especifica os efeitos de uma composição de enzima líquida da presente invenção em depósitos de lentes do Tipo III e Tipo IV, quando usada diariamente durante um estudo clínico de 135 dias; a Figura 2 ilustra a frequência e as razões da substituição de lentes durante esse estudo; e a Figura 3 ilustra a segurança das composições de enzimas líquidas da presente invenção com relação a composições enzimáíicas de limpeza anteriores, com base na incidência das descobertas significativas feitas com lâmpada de fenda durante o estudo clínico.

Foi descoberto que o uso de um poliol em combinação com um composto de borato ou ácido bórico atinge a estabilidade e actividade sustentável requerida nas composições de enzimas líquidas da presente invenção. Apesar de os Requerentes do Pedido de Patente não quererem ficar ligados a nenhuma teoria, acredita-se que a estabilidade das enzimas utilizadas na presente invenção é aumentada desnaturando parcialmente as proteínas. As enzimas são parcialmente desnaturadas formando um complexo com os agentes estabilizadores. As enzimas são desnaturadas até um ponto em que as enzimas são desactivadas, mas em que a renaturação é facilmente alcançada por diluição do complexo enzima desnaturada/ agente estabilizador num meio aquoso. Acredita-se que os agentes estabilizadores competem com a água por locais de ligação com hidrogénio nas proteínas. Assim, uma certa percentagem destes agentes irá efectivamente tirar o lugar a uma certa percentagem de moléculas de água. Como resultado, as proteínas irão mudar a sua conformação (parcialmente desnaturadas) para uma forma inactiva e complexa (com os agentes estabilizantes). Quando a enzima está numa forma inactiva, está protegida contra uma auto-degradação e outros eventos espontâneos e quimicamente irreversíveis. Por outro lado, a deslocação de demasiadas moléculas de água resulta em mudanças de conformação das proteínas que são irreversíveis. A fim de obter uma composição de enzima líquida estável com prazo de validade significativo e deste modo comercialmente viável, é preciso encontrar um delicado ponto de equilíbrio de máxima estabilidade e máxima renaturação reversível. Tal ponto foi agora descoberto. 8

Os polióis utilizados na presente invenção são polióis de carbono 2-3. Tal como é usadqí aqui, o termo “poliol de carbono 2-3” refere-se a um composto com 2 ou 3 átomos de carbono e pelo menos dois grupos hidroxi. No caso de uma composição enzimática de acordo com a presente invenção o poliol é 1,2-propano diol (propileno glicol), 1,3-propano diol ou etileno glicol. No caso em que a composição enzimática é usada em combinação com uma solução desinfectante, no entanto, exemplos de polióis de carbono 2-3 são glicerol, 1,2-propano diol (propileno glicol), 1,3-propano diol e etileno glicol. O propileno glicol é o poliol de carbono 2-3 preferido empregue na presente invenção.

Os compostos de borato ou ácido bórico que podem ser utilizados na presente invenção incluem sais de metal alcalino de borato, ácido bórico e bórax. O composto de borato ou ácido bórico mais preferido é borato de sódio. Tal como mencionado acima, o composto de borato ou ácido bórico também contribui para a preservação anti-microbiana das composições de enzimas líquidas da presente invenção, a um nível que é eficaz para múltiplas utilizações.

Foi descoberto que certas quantidades de um poliol de carbono 2-3 e um composto de borato ou ácido bórico são cruciais para obter a estabilidade e actividade sustentável requerida nas composições de enzimas líquidas da presente invenção. Foi descoberto que a combinação de 50-70 % volume/ volume (“% v/ v”) de um poliol de carbono 2-3 e de 4-8 % (peso/ volume (“% p/ v”) de um composto de borato ou ácido bórico é requerida para alcançar os critérios necessários para composições de enzimas líquidas eficazes e comercialmente viáveis, como descrito acima. A combinação de cerca de 50 % v/ v de um poliol de carbono 2-3 e cerca de 7,6 % p/ v de borato de sódio é preferida acima de tudo. Os exemplos 1, 2 e 3 abaixo ilustram mais detalhadamente concentrações adequadas e inadequadas destes agentes estabilizadores.

As enzimas que podem ser utilizadas nas composições e métodos da presente invenção incluem todas as enzimas que: (1) sejam úteis para remover depósitos das lentes de contacto; (2) causem, quando muito, apenas irritações oculares menores no caso de que uma pequena quantidade de enzima entrar em contacto com o olho como resultado de

enxaguamento inadequado de uma lente de contacto; (3) sejam rèlativamente estáveis quimicamente e eficazes na presença dos agentes anti-microbianos descritos abaixo; e (4) não afectem adversamente as propriedades físicas ou químicas das lentes que estão a ser tratadas. As enzimas proteolíticas usadas aqui devem ter pelo menos uma capacidade parcial de hidrolizar ligações de peptídeos-amidas a fim de reduzir o material proteinoso encontrado em depósitos presentes nas lentes a sub-unidades solúveis em água. Tipicamente, tais enzimas exibirão alguma actividade lipolítica, amilolítica ou actividades relacionadas associadas à actividade proteolítica e podem ser neutras, acídicas ou alcalinas. Além disso, podem ser usadas lipases ou carbohidrases separadas, em combinação com as enzimas proteolíticas. Para efeitos da presente especificação, as enzimas que satisfazem os requisitos anteriormente mencionados são referidas como sendo “oftalmicamente aceitáveis”.

Exemplos de enzimas proteolíticas oftalmicamente aceitáveis que podem ser utilizadas na presente invenção incluem mas não se limitam a pancreatina, tripsina, subtilisina, colagenase, queratinase, carboxipeptidase, papaína, bromelaína, aminopeptidase, elastase, Aspergi 11o peptidase, pronase E (de ÍT griseus), dispase (de Bacillus polymyxa) e misturas destes. Se é usada papaína, pode ser necessário um agente redutor, tal como N-acetilcisteína.

Enzimas microbiologicamente derivadas, tais como as derivadas dos microorganismos Bacillus, Streptomyces, e Aspergillus, representam um tipo preferido de enzima que pode ser utilizada na presente invenção. Deste sub-grupo de enzimas, as mais preferidas são as proteases alcalinas derivadas de Bacillus, genericamente chamadas enzimas de “subtilisina”. A identificação, separação e purificação de enzimas é conhecida da técnica. Muitas técnicas de identificação e isolamento existem na literatura científica em geral para o isolamento de enzimas, incluindo aquelas enzimas que têm actividade proteolítica e proteolítica/ lipolítica/ amilolítica. As enzimas contempladas por esta invenção podem ser prontamente obtidas, através de técnicas conhecidas, de fontes vegetais, animais e microbianas.

Com o advento das técnicas de ADN recombinantes, prevê-se que novas fontes e tipos de enzimas proteolíticas estáveis venham a tornar-se disponíveis. Tais enzimas devem ser consideradas como fazendo parte do âmbito desta invenção, a partir do momento em que vão ao encontro dos critérios aqui estabelecidos. A pancreatina e subtilisina são enzimas preferidas, e a tripsina é a enzima mais preferida para uso na presente invenção. A pancreatina é extraída do pâncreas dos mamíferos, e está disponível comercialmente através de várias fontes, incluindo os Scientific Protein Laboratories (Waunakee, Wisconsin, Estados Unidos da América), Novo Industries (Bagsvaerd, Dinamarca), Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, E.U.A.) e Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana, E.U.A.). A Pancreatina USP é uma mistura de roteases, lipases e amilases, e é definida pela United States Pharmacopeia (“USP”). A forma mais preferida de pancreatina é a Pancreatina 9X. Tal como é utilizado aqui, o termo “Pancreatina 9X” significa uma pancreatina filtrada (0,2 microns) contendo nove vezes o conteúdo de uma unidade de protease USP. A subtilisina é derivada da bactéria Bacillus e está disponível comercialmente através de várias fontes comerciais incluindo a Novo Industries (Bagsvaerd, Dinamarca), Fluka Biochemika (Buchs, Suiça) e Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana, E.U.A.). A tripsina é purificada a partir de várias fontes animais e está disponível comercialmente através da Sigma Chemical Co. e Boehringer Mannheim.

As composições de enzimas líquidas da presente invenção terão uma concentração de enzimas suficiente para fornecer uma quantidade eficaz de enzimas para remover substancialmente ou reduzir significativamente depósitos de proteínas, lípidos, mucopolissacáridos e outros materiais tipicamente encontrados em lentes de contacto usadas por humanos quando uma pequena quantidade de uma composição é adicionada a um diluente. Tal como é usada aqui, uma tal concentração é referida como “uma quantidade eficaz para limpar a lente”. A quantidade de enzima usada nas composições de enzimas líquidas da presente invenção variará, de um modo geral, de cerca de 0,05 a 5 % p/ v. A selecção de uma concentração específica dependerá de vários factores, tais como: a enzima ou combinação de enzimas seleccionada; a pureza, especificidade e eficácia da(s) enzima(s) seleccionada(s); o tipo de lentes >a serem limpas; a frequência de limpeza pretendida (por exemplo, diariamente ou semanalmente); e duração pretendida para cada acto de limpeza.

Durante o armazenamento, alguma da actividade da enzima pode perder-se, dependendo do tempo de armazenamento e condições de temperatura. Deste modo, as composições de enzimas líquidas da presente invenção podem ser preparadas com quantidades iniciais de enzima que excedem as variações de concentração aqui descritas. As composições preferidas da presente invenção conterão geralmente uma ou mais enzimas numa quantidade de cerca de 300-6000 UAP/ mL. As composições conterão mais preferencialmente cerca de 900-2200 UAP/ mL, o que corresponde a pancreatina na variação de cerca de I a 2 % p/ v; subtilisina numa variação de cerca de 0,1 a 0,3 % p! v; e tripsina na variação de cerca de 0,1 a 0,3 % p/ v. Para efeitos desta especificação, uma “unidade de actividade proteolítica” ou “UAP” é definida como a quantidade de actividade enzimática necessária para gerar um micrograma (mcg) de tirosina por minuto (“mcg/ Tir/ min”), como é definido pelo teste colorimétrico de digestão de caseína descrito abaixo.

Teste de digestão de caseína

Uma porção de 5,0 mL de substrato de caseína (0,65 % de caseína p/ v) é equilibrada por 10 minutos (min) e ± 5 segundos (seg) a 37° C. Uma porção de solução de enzimas (0,2 mg/ ml) é então acrescentada ao substrato de caseína e a mistura é vorticizada, depois incubada durante 10 minutos e ± 5 seg a 37° C. Após a incubação, 5,0 mL de ácido tricloroacético a 14 % são adicionados e a mistura resultante é imediatamente vorticizada. A mistura é incubada por pelo menos outros 30 min, e depois vorticizada e centrifugada por 15-20 min (aprox. 2000 rpm). O material flutuante da amostra centrifugada é filtrado para um classificador de filtro de soro e é removida uma alíquota de 2,0 mL. À amostra de 2,0 mL são adicionados 5,0 mL de Na2Cos a 5,3 %. A amostra é vorticizada, são adicionados 1,0 mL de reagente Fenol de Folin 0,67 N, e a amostra é imediatamente vorticizada de novo, depois incubada durante 60 min a 37° C. A amostra é então lida num espectrofotómetro de luz visível a 660 nanómetros (nm) versus água purificada como referência. A concentração de amostra é então determinada por comparação com uma curva padrão de tirosina.

A limpeza obtida com as composições de enzimas líquidas da presente invenção é uma função do tempo. Os tempos de imersão utilizados variarão, geralmente, de cerca de 1 hora a de um dia para o outro. No entanto, se se der o caso de haver períodos de imersão mais longos a ser utilizados, (por exemplo, 24 horas), podem ser utilizadas concentrações mais baixas do que as descritas acima.

Os métodos de limpeza da presente invenção envolvem o uso de uma pequena quantidade das composições de enzimas líquidas acima descritas para facilitar a remoção de proteínas e outros depósitos presentes nas lentes de contacto. A quantidade de composição enzimática a utilizar em formas de realização específicas da presente invenção pode variar, dependendo de vários factores, tais como a pureza da enzima utilizada, a duração proposta de exposição das lentes às composições, a natureza do regime de manutenção das lentes (por exemplo, a frequência de desinfecção e limpeza das lentes), o tipo de lentes a ser tratadas, e o uso de agentes de limpeza adicionais (por exemplo, surfactantes). No entanto, os métodos de limpeza da presente invenção empregarão geralmente uma quantidade das composições de enzimas líquidas acima mencionadas suficiente para fornecer uma concentração de enzimas final de cerca de 5— 75 UAP/ mL de solução, seguindo-se a dispersão das composições enzimáticas numa solução desinfectante ou outro solvente aquoso. E preferida uma concentração final de cerca de 5-25 UAP/ mL.

Tal como é indicado acima, as composições de enzimas líquidas da presente invenção contêm quantidades relativamente menores de solutos iónicos. Mais especificamente, as composições não contêm agentes massificantes, agentes efervescentes ou outros solutos iónicos vulgarmente contidos em comprimidos enzimáticos anteriores. As composições presentes contêm, sim, os solutos iónicos de compostos de borato ou ácido bórico e ácido clorídrico e/ ou hidróxido de sódio, mas a concentração destes solutos nas presentes composições é relativamente baixa. As composições são, por conseguinte, substancialmente não iónicas. Além disso, como resultado do facto de as composições serem formuladas como líquidos concentrados de doses múltiplas, apenas uma pequena quantidade das composições, geralmente uma ou duas gotas, é necessária para limpar uma lente de contacto. As composições presentes têm, portanto, muito pouco impacto

na potência iónica das soluções desinfectantes. Como é explicado abaixo, esta característica da presente invenção é particularmente importante quando as composições de enzimas líquidas são combinadas com soluções desinfectantes que contêm agentes anti-microbianos iónicos, tais como poliquatérnio-1. A actividade anti-microbiana dos agentes desinfectantes, em particular dos compostos poliméricos de amónio quaternário tais como poliquatémio-1, é adversamente afectada por altas concentrações de cloreto de sódio ou outros solutos iónicos. Mais especifícamente, os compostos poliméricos de amónio quaternário, e em particular os de Fórmula (I), abaixo, perdem actividade anti-microbiana quando é aumentada a concentração de solutos iónicos na solução desinfectante. O uso de soluções tendo baixas potências iónicas (isto é, baixas concentrações de solutos iónicos tais como cloreto de sódio) é, portanto, preferido. Uma vez que tanto os solutos iónicos (por exemplo, cloreto de sódio) como os solutos não iónicos (por exemplo, glicerol) afectam a osmolalidade e tonicidade de uma solução, a osmolalidade e a tonicidade são medidas indirectas de potência iónica. No entanto, as baixas potências iónicas preferencialmente utilizadas nos métodos de limpeza e desinfecção da presente invenção correspondem geralmente a tonicidades/ osmolalidades na variação de hipotónicas a isotónicas, e mais preferencialmente na variação de 150 a 350 miliOsmoles por quilograma (mOs/ kg). Uma variação de 200 a 300 mOs/ kg é particularmente preferida, e uma osmolalidade de cerca de 220 mOs/ kg é a mais preferida.

As composições de enzimas líquidas da presente invenção demonstram eficácia de limpeza efectiva enquanto exibem efeitos adversos mínimos ou, mais preferencialmente, efeitos aumentados na actividade anti-microbiana das soluções desinfectantes. Foi inesperadamente descoberto que as composições de enzimas líquidas da presente invenção aumentam a actividade anti-microbiana das soluções desinfectantes que contêm poliquatérnio-1, um agente desinfectante polimérico de amónio quaternário. Foi também descoberto que combinações das composições de enzimas líquidas e soluções desinfectantes de poliquatérnio-1 tornam-se ainda mais eficazes do que as soluções desinfectantes de poliquatérnio-1 por si sós, quando as lentes são tratadas por períodos de tempo longos de aproximadamente uma hora a de •4

um dia para o outro, com preferência pelas quatro a oito horas. Uma vez que, porV questões de conveniência, as lentes de contacto são tipicamente imersas de um dia para o outro a fim de serem limpas com enzimas ou desinfectadas com agentes químicos, esta descoberta tem um significado prático. Embora os Requerentes do Pedido de Patente não desejem ficar ligados a nenhuma teoria, acredita-se que o aumento da actividade anti-microbiana acima descrito se deva a ruptura ou destruição de membranas microbianas pela enzima ao longo do tempo.

Os métodos de limpeza da presente invenção utilizam um solvente aquoso. O solvente aquoso pode conter vários sais tais como cloreto de sódio e cloreto de potássio, agentes tamponizantes tais como ácido bórico e borato de sódio, e outros agentes tais como agentes quelantes e conservantes. Um exemplo de um solvente aquoso adequado é uma solução salina, tal como Unisol® Plus Solution (marca registada da Alcon Laboratories).

Os métodos de limpeza e desinfecção da presente invenção utilizam uma solução desinfectante que contém um agente anti-microbiano. Os agentes anti-microbianos podem ser oxidativos, tais como peróxido de hidrogénio, ou agentes anti-microbianos poliméricos não oxidativos que derivam a sua actividade anti-microbiana através de interacção química ou físico-química com os organismos. Tal como é usado na presente especificação, o termo “agente anti-microbiano polimérico” refere-se a qualquer polímero ou co-polímero contendo nitrogénio que tenha actividade anti-microbiana. Os. agentes anti-microbianos poliméricos preferidos incluem: poliquatérnio-1, que é um composto polimérico de amónio quaternário; e biguanida de polihexametileno (“PHMB”) ou biguanida de poliaminopropil (“PAPB”), que é uma biguanida polimérica. Estes agentes anti-microbianos preferidos são revelados nas Patentes U.S. Nos. 4,407,791 e 4,525,346, atribuídas a Stark, e 4,758,595 e 4,836,986, atribuídas a Ogunbiyi, respectivamente. Os conteúdos completos das publicações anteriores são aqui incorporados na presente especificação a título de referência. Outros agentes anti-microbianos adequados aos métodos da presente invenção incluem: outros compostos de amónio quaternário, tais como haletos de benzalcónio, e outras biguanidas, tais como 15 * clorhexidina. Os agentes, anti-microbianos usados aqui são preferencialmente^ empregues na ausência de compostos que contenham mercúrio, tais como timerosal.

Os agentes anti-microbianos mais preferidos são compostos poliméricos de amónio quaternário da estrutura:

em que:

Ri e R.2 podem ser os mesmos ou diferentes e seleccionados a partir de: N+(CH2CH2OH)3X-, N(CH3)2 ou OH; X' é um anião farmaceuticamente aceitável, preferencialmente cloreto; e n = número inteiro de 1 a 50.

Os compostos mais preferidos desta estrutura são poliquatémio-1, que é também conhecido como Onamer M™ (marca registada da Onyx Chemical Corporation) ou como (Polyquad® (marca registada da Alcon Laboratories, Inc.). O poliquatémio-1 é uma mistura dos compostos acima referenciados, em que X" é cloreto e R1, R2 e n são como definidos acima. Este componente é preferencialmente usado numa concentração de 0,00001 % a 0,05 % p/ v da solução desinfectante.

Os agentes anti-microbianos acima descritos são utilizados nos métodos da presente invenção numa quantidade eficaz para eliminar substancialmente ou reduzir significativamente o número de microorganismos viáveis encontrados nas lentes de contacto, de acordo com os requisitos das agências reguladoras governamentais, tais como o United States Food and Drug Administration (Administração de Alimentos e Fármacos dos Estados Unidos). Para efeitos da presente especificação, essa quantidade é referida como sendo “uma quantidade suficiente para desinfectar” ou “uma quantidade anti-microbianamente eficaz”. A quantidade de agente anti-microbiano empregue variará, dependendo de factores tais como o tipo de regime de manutenção das lentes no qual o método está a ser utilizado. Por exemplo, o uso de um produto de limpeza diária

eficaz no regime de manutenção das lentes pode reduzir substancial mente a quantidade de material depositado nas lentes, incluindo microorganismos, e desse modo reduzir a quantidade de agente anti-microbiano necessário para desinfectar as lentes. O tipo de lentes a ser tratadas (por exemplo, lentes “duras” versus “moles”) pode também ser um factor a considerar. De um modo geral, será empregue uma concentração na variação de cerca de 0.000001 '% a cerca de 0,01 % em peso de um ou mais dos agentes anti-microbianos acima mencionados. A concentração mais preferida dos compostos poliméricos de amónio quaternário de Fórmula (I) é de cerca de 0,001 % em peso.

Nos métodos da presente invenção podem também ser empregues agentes desinfectantes oxidativos. Tais agentes desinfectantes oxidativos incluem vários peróxidos que fornecem oxigénio activo em solução. Os métodos preferidos empregarão peróxido de hidrogénio na variação de 0,3 a 3,0 % para desinfectar as lentes. Na Patente U.S. N° Re 32,672 (Huth, et al.) são descritos métodos que utilizam um sistema de desinfecção oxidativo.

Como será verificado pelos especialistas na matéria, as soluções desinfectantes utilizadas na presente invenção podem conter vários componentes além dos agentes anti-microbianos acima descritos, tais como agentes tamponizantes adequados, agentes quelantes e/ ou isoladores e agentes de ajustamento de tonicidade. As soluções desinfectantes podem também conter surfactantes.

Os métodos da presente invenção irão tipicamente envolver a adição de uma pequena quantidade de uma composição de enzima líquida da presente invenção a cerca de 2 a 10 mL de um solvente aquoso ou solução desinfectante, colocando as lentes sujas na solução de enzima/ solvente ou enzima/ desinfectante, e mergulhando as lentes por um período de tempo eficaz para limpar ou limpar e desinfectar as lentes. A quantidade de composição de enzima líquida utilizada pode variar com base em factores tais como a quantidade de solvente aquoso ou solução desinfectante usada, mas geralmente é de cerca de 1 a 2 gotas. Os métodos preferidos envolvem adicionar 1 gota (aproximadamente 30 pL) a 5 mL de solvente aquoso ou solução desinfectante. As lentes sujas podem ser colocadas no solvente aquoso ou solução desinfectante quer antes, quer depois da adição da composição de enzima líquida. Opcionalmente, as lentés de contacto são primeiro esfregadas com um produto de limpeza diária surfactante não enzimático, antes de serem mergulhadas na solução enzima/ solvente ou enzima/ desinfectante. As lentes serão tipicamente mergulhadas de um dia para o outro, mas durações mais curtas ou mais longas são contempladas pelos métodos da presente invenção. É preferido um tempo de imersão de 4 a 8 horas. Os métodos da presente invenção permitem que o regime acima descrito seja levado a cabo uma vez por semana, mas, mais preferencialmente, todos os dias.

Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar melhor vários aspectos da presente invenção, mas não se pretende que estes limitem o âmbito da invenção seja a que respeito for.

Exemplo 1 São descritas abaixo uma composição de enzima líquida preferida da presente invenção, e uma solução desinfectante para uso em combinação com aquela composição: A. Composição de Pancreatina Líquida A composição de enzima líquida seguinte representa uma forma de realização preferida da presente invenção:

Ingrediente Quantidade Pancreatina (9X) 2200 U AP/ mL Borato de sódio 7,62 % (p/ v) Propileno glicol 50 % (v/ v) Água QS Ácido clorídrico/ hidróxido de sódio QS** ** corresponde a uma quantidade para ajustar o pH para 6,0 Nota: (p/ v) significa peso/ volume; (v/v) significa volume/ volume; e QS significa quantidade suficiente. A formulação acima foi preparada misturando primeiro sequencialmente propileno glicol, água purificada, ácido clorídrico e borato de sódio. A solução foi filtrada com polimento (filtro de 1,2 pm) para um tanque receptor estéril, e depois filtrada com esterilização (filtro de 0,2 pm). A quantidade de pancreatina requerida (cerca de 1-2 % p/ v) foi então dissolvida numa quantidade apropriada de água e a solução foi filtrada por polimento (filtro de 0,6 pm). Esta solução de enzima foi então filtrada por esterilização (filtro de 0,2 pm) para um tanque receptor estéril contendo a solução esterilizada de propileno glicol/ borato de sódio. Enquanto decorria a mistura, os conteúdos do tanque receptor foram então levados a volume com uma quantidade apropriada de água. O pH óptimo da formulação acima está na variação de 6-7; um pH de 6 é o mais preferido. B. Solução Desinfectante A formulação seguinte representa uma solução desinfectante preferida:

Ingrediente % (p/ v) Poliquatérnio-1 0,001 + excesso de 10% Cloreto de sódio 0,48 Edetato de Dissódio 0,05 Monohidrato de ácido cítrico 0,021 Dihidrato de citrato de sódio 0,56 Água purificada QS

Para preparar a formulação acima, dihidrato de citrato de sódio, monohidrato de ácido cítrico, edetato de dissódio, cloreto de sódio e poliquatémio-1, nas concentrações relativas indicadas acima, foram misturados com água purificada e os componentes foram dissolvidos mexendo com um misturador. Foi adicionada água purificada para levar a solução a quase 100 %. O pH foi registado a 6,3 e ajustado para 7,0 com NaOH. Foi adicionada água purificada para levar a solução a 100 %. A solução foi mexida e foi feita uma leitura do pH a 7,0. A solução foi então filtrada para garrafas estéreis e tapada.

Exemplo 2 São descritas abaixo composições de subtilisina líquida e tripsina líquida preferidas da presente invenção para uso em combinação com uma solução desinfectante adequada, por exemplo Exemplo 1B.: I. Composição de Tripsina Líquida ingrediente quantidade Tripsina 2200 UAP/ mL Borato de sódio 7,62 % (p/ v) Propileno glicol 50 % (v/ v) Agua QS Ácido clorídrico/ hidróxido de sódio QS** ** corresponde a uma quantidade para ajustar o pH para 6,0 II. Composição de Subtilisina Líquida ingrediente quantidade Subtilisina 900 UAP/ mL Boratò de sódio 7,62 % (p/ v) Propileno glicol 50 % (v/ v) Água QS Ácido clorídrico/ hidróxido de sódio QS** ** corresponde a uma quantidade para ajustar o pH para 6,0

As composições de subtilisina e tripsina líquidas acima descritas são feitas da mesma maneira que a composição de pancreatina líquida, descrita no Exemplo 1.

Exemplo 3

Foi realizado um estudo comparativo dos efeitos dê várias quantidades de borato e propileno glicol em composições de enzimas líquidas. Alíquotas das compsições foram armazenadas numa sala de temperatura controlada (26,7° ± 2o C). Ao fim de 6 e 12 semanas, as alíquotas foram testadas para avaliação da actividade enzimática pelo método de digestão de caseína descrito acima. Os níveis de actividade foram

comparados com os níveis iniciais e expressos como actividade percentual reminescente. São fornecidos na Tabela 1 abaixo dados demonstrando a crucialidade das quantidades de borato de sódio e propileno glicol usadas nas composições de enzimas líquidas da presente invenção versus quantidades percentuais alternativas como uma função da estabilidade enzimática.

TABELA I: COMPARAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS COMPOSIÇÕES DE ENZIMAS LÍQUIDAS ALTERNATIVAS VERSUS UMA COMPOSIÇÃO DA

PRESENTE INVENÇÃO

Composição 1 2 3 4 5 6 Pancreatina 9X % (p/ v) 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 Acido Bórico % (p/ v) 0,155 0,155 0,155 0,155 0,155 — Borato de Sódio % (p/ v) 0,035 0,035 0,035 0,035 0,035 7,62 Agua Purificada (qs) 60 50 40 30 10 50 Propileno Glicol % (v/ v) 40 50 60 70 90 50 Actividade ao fim de 6 semanas 71,9 86,6 88,2 92,9 * 97,7 (% da activ. inicial) Actividade ao fim de 12 44 66 65 74 * 98,4 semanas (% da activ. inicial) * Valores iniciais mostraram actividade baixa A composição 6 ilustra uma forma de realização preferida da presente invenção. As composições 2, 3 e 4 contêm propileno glicol numa quantidade requerida pela presente invenção, mas não contêm uma quantidade de borato (borato de sódio e ácido bórico) requerida pela presente invenção. As composições 1 e 5 contêm quantidades de propileno glicol for a das variações requeridas pela presente invenção.

Medições das actividades obtidas para as composições 2-4, contendo de 50-70 % de propileno glicol, mostraram que uma estabilidade semelhante (86,6 - 92,9 % à temperatura ambiente) foi obtida depois de 6 semanas de incubação, ao passo que as composições 1 e 5, contendo 40 ou 90% de propileno glicol, eram significativamente menos estáveis (71,9 % e um nível indetectável, respectivamente). As composições 1 -

/ 5 eram menos estáveis (71,9 - 92,9 %) do que a composição 6 (97,9 %) ao longo dè 6 semanas de incubação. Além disso, a composição 6 exibiu uma maior duração de estabilidade, 98,4 %, ao fim de 12 semanas, quando comparada com uma variação de 44-74 % para as composições 1-5.

Exemplo 4

Foram determinados dados demonstrando a estabilidade da composição de enzima líquida do Exemplo 1 a temperaturas de armazenamento típico. Alíquotas da composição foram armazenadas numa sala de temperatura controlada (26,7° ± 2o C, TA), ou numa câmara mantida a 35° C. No tempo marcado, as alíquotas foram testadas para avaliação da actividade enzimática pelo método de digestão de caseína acima descrito. Os níveis de actividade foram comparados com os níveis iniciais e expressos como actividade percentual reminescente. Os resultados estão apresentados na Tabela II abaixo.

TABELA II: EFEITO DO TEMPO DE ARMAZENAMENTO NUMA COMPOSIÇÃO DE PANCREATINA LÍQUIDA À TEMPERATURA AMBIENTE (TA) E A 35° C / % de Actividade Reminescente Tempo (Semanas) TA 35° C 2 94,4 83,0 4 94,0 76,5 6 97,7 81,1 8 99,0 80,2 12 98,4 78,3

Os dados apresentados na Tabela 2 confirmam a estabilidade das composições enzimáticas da presente invenção. Os dados são baseados numa compilação de 4 lotes e experiências separados. Os dados não demonstram virtualmente nenhum efeito nocivo na actividade das enzimas ao longo de 12 semanas à temperatura ambiente, sendo a medição final de 98,4%. A composição de enzima líquida do Exemplo 1 foi também eficaz em manter a actividade à elevada temperatura de 35° C durante 12 semanas, mostrando uma perda da actividade de aproximadamente 20 %.

Exemplo 5

Descobriu-se que um dos componentes de protease da pancreatina, tripsina, é significativamente mais estável que um dos outros componentes de protease, a quimotripsina. Esta descoberta foi confirmada por um estudo que comparou a estabilidade relativa das composições de enzimas líquidas contendo 0,3 % p/ v da tripsina e quimotripsina, respectivamente. As composições eram idênticas à composição descrita no Exemplo 1 acima, excepto no que diz respeito ao componente enzimático. Alíquotas das composições foram armazenadas numa câmara mantida a 35° C. No tempo marcado; as alíquotas foram testadas para avaliação da actividade enzimática pelo método de digestão de azocaseína acima descrito. Os níveis de actividade foram comparados com os níveis iniciais e expressos como actividade percentual reminescente. Os resultados estão apresentados na Tabela III abaixo. Método de Azocaseína:

As seguintes soluções são usadas neste teste: 1. Solução tamponizante: 0,05 M de tamponizante de fosfato de sódio contendo 0,9 % de cloreto de sódio, pH 7,6. 2. Solução de substrato: 2 mg/ ml de azocaseína na solução tamponizante mencionada acima. O teste é iniciado misturando 1 ml de uma composição enzimática diluída apropriadamente em tamponizante de fosfato (de maneira a que a actividade enzimática esteja na variação da curva padrão) com 2 ml de solução de substrato de azocaseína (2 mg/ ml). Depois de uma incubação a 37° C por 20 minutos, a mistura é removida do incubador e é adicionado 1 ml de ácido tricloroacético (14 % p/ v) para parar a reacção enzimática. A mistura é bem vorticizada e deixada a repousar à temperatura ambiente durante 20 minutos . Depois de centrifugar a 2500 rpm (com um centrifugador Beckman GS-6R) durante 15 minutos, o material flutuante é filtrado com um classificador de soro. 2 ml do filtrado amarelo límpido são então ajustados para um pH neutro com 0,4 ml de hidróxido de sódio 0,1 N e a absorvência de luz de comprimento de onda de 440 nm é medida com um espectrofotómetro. A quantidade de azocaseína hidrolizada é calculada com base numa curva padrão de concentrações conhecidas de

solução de azocaseína desenvolvida sob condições idênticas. Uma unidade de actividade enzimática (“U AZ”) é definida como aquela quantidade de enzima que hidroliza 1 qg de substrato de azocaseína/ minuto a 37° C.

TABELA III: COMPARAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS COMPOSIÇÕES DE ENZIMAS’LÍQUIDAS CONTENDO TRIPSINA OU QUIMOTRIPSINA ARMAZENADAS A 35° C % de Actividade Reminescente Tempo Tripsina Quimotripsina 24 horas 100 79,8 1 semana 100 7,3 2 semanas 96,0 — 3 semanas 93,2 * 4 semanas 93,2 * *não foram tomadas medições depois do ponto de 2 semanas, quando toda a actividade se tinha perdido. A composição de tripsina demonstrou um excelente perfil de estabilidade a 35° C, em contraste com a composição de quimotripsina, uma composição alternativa que não faz parte da presente invenção. Como tal, composições de enzimas líquidas contendo apenas tripsina são as composições mais preferidas da presente invenção.

Exemplo 6

Foram determinados dados demonstrando a estabilidade da composição de tripsina líquida do Exemplo 2 a várias temperaturas. Alíquotas da composição foram armazenadas à temperatura ambiente (“TA”), ou a 35°, 40° ou 45° C. No tempo marcado, as alíquotas foram testadas para avaliação da actividade enzimática pelo método de azocaseína acima descrito. Os níveis de actividade foram comparados com os níveis iniciais e expressos como actividade percentual reminescente. Os resultados estão apresentados na Tabela IV abaixo.

TABELA IV: ESTABILIDADE DE UMA COMPOSIÇÃO DE TRIPSINA LÍQUIDA ARMAZENADA A VÁRIAS TEMPERATURAS % de Actividade Reminescente Temperatura (° C) Semanas TA 35 40 45 0 100,0 100,0 100,0 100,0 1 98,4 97,8 98,4 61,1 2 100,0 99,4 100,0 56,3 4 100,0 93,2 96,0 42,5 8 100,0 97,8 95,6 12 100,0 95,9 93,8

Exemplo 7 A eficácia desinfectante da presente invenção foi avaliada determinando a taxa e a extensão da mortalidade alcançada com um sistema aquoso formado pela combinação da composição de enzima líquida e solução desinfectante descrita no Exemplo 1 acima. O sistema foi testado contra seis microorganismos: Staphylococcus edipermidis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Candida albicans, Arpergillus fumigatus, e Herpes simplex. Os procedimentos e resultados do teste são descritos abaixo.

Para testar contra Staphylococcus edipermidis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Candida albicans, e Arpergillus fumigatus, foi usado o seguinte procedimento: o

Um volume de 0,1 mL de inoculado (10 unidades de formação de colónia/ mL) foi primeiramente adicionado a um volume de 10 mL da solução desinfectante do Exemplo 1, seguida pela adição de 2 gotas da composição de enzima líquida do Exemplo 1. Um volume de 10 mL da solução desinfectante do Exemplo 1 inoculada de forma semelhante foi usado como controle. As soluções foram mantidas à temperatura ambiente ao longo do teste. Cada microorganismo e solução de teste foi testado <25. « V; <25. « V;

individualmente. Conjuntos de quatro amostras de réplica (n = 8) foram testados para cada organismo. Herpes simplex A intervalos de tempo seleccionados de 1, 2, 3, 4, 6, 8 e 24 horas, foi removido um volume de 1 mL da solução de teste inoculada contendo Staphylococcus edipermidis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Candida albicans, ou Arpergillus fumigatus, e foram feitas diluições em série apropriadas em alvos estéreis de 0,9 % de diluição de solução de cloreto de sódio. Foram preparados pratos de verter com agar concentrado de soja-caseína contendo 0,07 % de Asolectin e 0,5 % de Polysorbate 80. No Tempo 0, foi removido um volume de 1,0 mL do controle de salino e foram preparados pratos de verter de diluição em série usando o mesmo meio de recuperação e alvos de diluição. A contagem do controle de solina do Tempo 0 foi usada como a contagem inicial. Os pratos de verter foram incubados a de 30° - 35° C por períodos de incubação apropriados. O número de organismos sobreviventes a cada intervalo de tempo foi então determinado. Os resultados estão resumidos nas Tabelas V - IX abaixo.

Foi usado o seguinte procedimento para teste contra Herpes simplex: 5 mL da solução desinfectante do Exemplo 1 contendo uma gota da composição de enzima líquida do Exemplo 1, e uma solução de controle contendo 5 mL da solução desinfectante, foram inoculados com 125 microlitros de Herpes simplex para render uma Dose Infecciosa de Tecido de Cultura - 50 (DITC50) de aproximadamente 1 x 105. A intervalos de tempo de 1, 2, 3, 4, 6 e 8 horas, uma alíqupta do teste ou solução de controle foi removida e neutralizada misturando 1:1 com neutralizador AOAC (40 g de Asolectin e 280 mL de polysorbate 80 em 1 litro de tamponizante de fosfato 0,25 M a um pH de 7,2) e diluindo 10 vezes em Minimum Essential Médium (MEM). Alíquotas de um mL foram colocadas em monocamadas de VERO, 4 réplicas por diluição, e deixadas a absorver ao ar durante 30 minutos a 37° ± Io C em 5 ± 1 % de CO2. A amostra de cada ponto de tempo foi levada a cabo em duplicado. Os resultados estão resumidos na Tabela X abaixo.

TABELA V: ACTIVIDADE ANTI-MICROBIANA: S. EPIDERMIDIS AMOSTRA TEMPO (HR) REDUÇÃO DE LOG Composição de pancreatina líquida/e. solução desinfectante do Exemplo 1 1 2,7 ± 0,2 2 3,3 ±0,1 3 3,6 ±0,2 4 4,2 ± 0,2 6 4,8 ± 0,2 8 4,9 ± 0,1 24 4,8 ±0,1 Controle (solução desinfectante do Exemplo 1) 1 2,2 ±0,1 2 2,7 ±0,1 3 3,1 ±0,1 4 3,3 ±0,1 6 3,7 ±0,1 8 4,1 ±0,3 24 4,9 ±0,1

TABELA VI: ACTIVIDADE ANTI-MICROBIANA: P. AERUGINOSA AMOSTRA TEMPO (HR) REDUÇÃO DE LOG Composição de pancreatina líquida e solução desinfectante do Exemplo 1 1 2,2 ±0,1 2 2,7 ±0,1 3 3,1 ±0,2 4 3,1 ±0,2 6 3,6 ± 0,1 8 3,9 ± 0,2 24 5,0 ± 0,2 Controle (solução desinfectante do Exemplo 1) 1 1,7 ±0,1 2 2,1 ±0,1 3 2,4 ±0,1 4 2,6 ±0,1 6 3,1 ±0,2 8 3,5 ±0,1 24 4,8 ± 0,4 vy . „28 :

X

TABELA VII: ACTIVIDADE ANTI-MICROBIANA: S. MARCESCENS AMOSTRA TEMPO (HR) REDUÇÃO DE LOG Composição de pancreatina líquida e solução desinfectante do Eixemplo 1 1 0,8 ±0,1 2 1,2 ±0,1 3 1,5 ±0,1 4 1,9 ±0,0 6 2,6 ±0,1 8 3,0 ±0,1 24 4,8 ± 0,6 Controle (solução desinfectante do Exemplo 1) 1 0,1 ±0,1 2· 0,4 ±0,1 3 .0,6 ±0,1 4 0,9 ±0,1 6 1,1 ±0,1 8 1,4 ± 0,1 24 3,3 ±0,1 9 s

•4

TABELA VIII: ACTIVIDADE ANTI-MICROBIANA: C. ÀLBICANS AMOSTRA TEMPO (HR) REDUÇÃO DE LOG Composição de pancreatina líquida e solução desinfectante do Exemplo 1 1 0,1 ±0,1 2 0,1 ±0,1 3 0,1 ±0,1 4 0,1 ±0,0 6 0,1 ±0,0 8 0,2 ±0,1 24 0,2 ± 0,0 Controle (solução desinfectante do Exemplo 1) 1 0,1 ±0,1 2 0,0 ±0,1 3 0,1 ±0,0 4 0,1 ±0,0 6 0,1 ±0,0 8 0,1 ±0,1 24 0,r±0,l

TABELA IX: ACTIVIDADE ANTI-MICROBIANA: FUMIGATUS AMOSTRA TEMPO (HR) REDUÇÃO DE LOG Composição de pancreatina líquida e solução desinfectante do Exemplo 1 1 0,1 ±0,1 / 2 0,1 ±0,0 3 0,1 ±0,0 4 0,2 ±0,1 6 0,3 ±0,1 8 0,3 ±0,1 24 0,5 ±0,1 j Controle (solução desinfectante do Exemplo O 1 0,1 ±0,1 2 0,1 ±0,1 3 0,1 ±0,0 4 0,1 ±0,1 6 0,2 ±0,1 8 0,3 ±0,1 24 0,5 ±0,1

TABELA X: ACTIVIDADE ANTI-MICROBIANA: HERPES SIMPLEX AMOSTRA TEMPO (HR) REDUÇÃO DE LOG Composição de pancreatina líquida e solução desinfectante do Exemplo 1 1 0,9 ± 0,7 2 0,7 ±0,5 -» 1,4 ± 1,8 4 3,7 ±0,4 6 3,7 ±0,3 8 3,9 ±0,1 Controle (solução desinfectante do Exemplo 1) 1 0,2 ± 0,2 2 0,2 ± 0,3 3 0,2 ± 0,2 4 0,3 ± 0,2 6 0,2 ± 0,2 8 0,3 ± 0,4

Tal como é ilustrado nas Tabelas V - X, as reduções de log alcançadas com a combinação enzima líquida/ solução desinfectante eram geralmente maiores do que as reduções de log alcançadas com o controle de solução desinfectante. Esta diferença foi estatisticamente significativa para: S. edipermidis, P. aeruginosa, S. marcescens, e H. simplex. A actividade anti-microbiana contra C. albicans e A. fumigatus foi praticamente igual.

Exemplo 8 A eficácia desinfectante de uma outra forma de realização da presente invenção foi avaliada determinando a taxa e a extensão da mortalidade alcançada com um sistema aquoso formado pela combinação da composição de tripsina líquida do Exemplo2 com a solução desinfectante descrita no Exemplo 1. O sistema foi testado contra: Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, e

Fusarium solam. Foi seguido o procedimento de teste do Exemplo 7. Os tempos de amostra foram 4, 6 e 24 horas. Os resultados do teste, expressos como reduções de log, são apresentados na Tabela XII abaixo: TABELA XII: EFEITOS DE UMA COMPOSIÇÃO DE ENZIMA LÍQUIDA CONTENDO TRTPSINA NA ACTIVIDADE ANTI-MICROBIANA DE UMA SOLUÇÃO DESINFECTANTE DE POLIQUATERNIO-1 REDUÇÃO DE LOG Microorganismo Tempo (Horas) Composição de Tripsina Líquida e solução desinfectante Solução desinfectante apenas S. marcescem 4 1,9 ±0,1 1,3 ±0,1 6 2,0 ± 0,6 1,5 ±0,1 24 4,4 ± 0,8 3,4 ±0,5 S. aureus 4 3,1 ±0,2 2,6 ± 0,2 6 3,5 ± 0,3 3,0 ± 0,0 24 4,9 ± 0,0 4,6 ± 0,3 P. aeruginosa 4 3,8 ±1,0 2,3 ±0,9 . 6 4,2 ± 0,7 2,9 ± 1,0 24 4,9 ± 0,0 4,4 ± 0,5 C. albicans 4 0,1 ±0,1 0,1 ±0,2 6 0,1 ± 0,2 0,1 ±0,2 24 0,1 ±0,2 0,2 ± 0,3 F. solani 4' 3,8 ±0,6 3,4 ± 1,3 6 4,5 ± 0,4 3,6 ± 0,3 24 4,6 ± 0,2 4,3 ± 0,5

Exemplo 10 O exemplo comparativo seguinte demonstra a eficácia das composições de enzimas líquidas da presente invenção com diferentes agentes desinfectantes. Foi avaliado o efeito das composições de enzimas líquidas da presente invenção, em particular as composições de enzimas líquidas do Exemplo 1 (ao qual se faz referência abaixo como “Enzima Líquida” ou “EL”), na actividade anti-microbiana de uma solução de múltiplas utilizações de poliquatérnio-1 (formulação do Exemplo 1B) e uma solução de múltiplas utilizações de biguanida polimérica (Solução de Múltiplas Utilizações ReNu®).

Duas gotas de Enzima Líquida foram adicionadas a 10 mL tanto de solução desinfectante de poliquatérnio-1 como da solução desinfectante de biguanida polilmérica. As soluções desinfectantes respectivas por si sós foram também testadas como controles. O protocolo descrito no Exemplo 7 foi seguido. Dados micro-biológicos, na forma de reduções de log alcançadas contra: Staphylococcus edipermidis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Candida albicans, e Arpergillus fumigatus, foram determinadas às 4 horas. Os resultados são apresentados na Tabela XIII abaixo.

TABELA XIII: ACTIVIDADE ANTI-MICROB1ANA DE UMA SOLUÇÃO DE MÚLTIPLAS UTILIZAÇÕES DE POLIQUATÉRNIO-1 E UMA SOLUÇÃO DE MÚLTIPLAS UTILIZAÇÕES DE BIGUANIDA POLIMÉRICA COM ENZIMA LÍQUIDA*

Organismo solução de solução de solução de múltiplas solução de múltiplas múltiplas utilizações de múltiplas utilizações de utilizações de biguanida utilizações de poliquatérnio poliquatérnio polimérica ReNu® biguanida -1 + EL** -1 . + el** polimérica ReNu® A. fumigatus 0,2 0,1 0,1 0,2 C. albicans 0,1 0,1 0,2 1,3 S, 1,9 0,9 1,1 3,2 marcescens R 3,1 2,6 3,3 4,0 aeruginosa 4,2 3,3 L8 2,3 *o tempo de desinfecção é de 4 horas **EL = a composição de pancreatina líquida do Exemplo 1 \

Os resultados não demonstram nenhum efeito nocivo da Enzima Líquida na solução desinfectante de poliquatémio-1, e um aumento da mortalidade dos S. marcescens, P. aeruginosa e S. epidermidis após 4 horas. Inversamente, a composição de Enzima Líquida teve um efeito negativo na actividade anti-microbiana da solução desinfectante de biguanida polimérica. Estes resultados ilustram os resultados inesperados obtidos com um método preferido da presente invenção, em que uma solução desinfectante de poliiquatérnio-1 é combinada com uma composição de enzima líquida da presente invenção. s Exemplo 11

Foi levado a cabo um estudo de 135 dias comparando a eficácia das composições e métodos da presente invenção com outras composições e métodos conhecidos. Foram feitas três observações clínicas diferentes: 1) depósitos de lentes de frequência do Tipo III e Tipo IV (sistema de graduação Rudko); 2) frequência e razões para a substituição de lentes; e 3) frequência de descobertas de lâmpada de fenda significativas. Os depósitos de lentes de “Tipo III” e “Tipo IV” são considerados lentes altamente carregadas de depósitos. Uma “descoberta de lâmpada de fenda” é definida como uma anormalidade observada na cómea, por um clínico usando um aparelho de lâmpada de fenda de um optometrista.

Três formulações de limpeza diferentes e os seus métodos associados foram comparadas com um método da presente invenção (“EL”): 1) “Controle histórico” - um conjunto de dados constituído por 5 estudos diferentes em que a lente foi limpa diariamente com um produto de limpeza surfactante seguido de uma imersão de 8 horas numa solução desinfectante combinada com uma imersão de 8 horas uma vez por semana numa solução desinfectante contendo um comprimido dissolvido de pancreatina; 2) “Protocolo 1” - um protocolo utilizando uma solução desinfectante de poliquatérnio-1 contendo citrato (formulação do Exemplo 1B) em que a lente é esfregada diariamente durante vários segundos com esta solução e depois mergulhada durante 8 horas nesta solução, combinado com uma imersão da lente de 8 horas uma vez por semana numa solução desinfectante de poliquatérnio-1 (formulação do Exemplo 1B) contendo um comprimido dissolvido de pancreatina; 3) “Protocolo 2” - um protocolo utilizando uma

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35.

i solução desinfectante de biguanida polimérica contendo um surfactante, em que a lente é esfregada diariamente durante vários segundos, depois mergulhada durante 8 horas nesta solução, combinado com uma imersão da lente uma vez por semana numa solução desinfectante de biguanida polimérica contendo um surfactante e um comprimido dissolvido de subtilisina durante um mínimo de 15 minutos, seguido pela remoção da lente e colocação desta numa nova solução de biguanida polimérica contendo um surfactante e imersão durante 8 horas; e 4) “EL” - um método e composição da presente invenção em que a lente é esfrega diariamente com um produto de limpeza surfactante, seguido por uma imersão de 8 horas em 5 mL de uma solução de poliquatérnio-1 (formulação do Exemplo 1B) e uma gota da composição de enzima líquida do Exemplo 1 (“Enzima Líquida”). A Tabela XIV, abaixo, fornece uma comparação tabulada das composições e protocolos deste estudo.

TABELA XIV: COMPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES E PROTOCOLOS DE

LIMPEZA E DESINFECÇÃO fflSTORICO PROTOCOLO 1 PROTOCOLO 2 EL LIMPEZA Diariamente, com um produto de limpeza surfactante Diariamente, com solução de poliquatérnio-1 Diariamente, com solução de biguanida polimérica ReNu® Diariamente, com um produto de limpeza surfactante DESINFECÇÃO Diariamente (8 horas) com uma solução desinfectante \ Diariamente (8 horas) com solução de poliquatémio-1 Diariamente (8 horas) com solução de biguanida polimérica ReNu® Diariamente (8 horas) com solução de poliquatérnio -1 PRODUTO DE LIMPEZA ENZIMÁTICO Semanalmente (8 horas) com uma solução desinfectante contendo um comprimido dissolvido de pacreatina Semanalmente (8 horas) com solução de poliquatérnio-1 contendo um comprimido dissolvido de pacreatina, nenhum passo de desinfecção separado Semanalmente (mínimo de 15 minutos) com solução de biguanida polimérica ReNu® contendo um comprimido dissolvido de subtilisina, seguido por passo de desinfecção Diariamente (8 horas) com solução de poliquatérnio -1 contendo uma gota de Enzima Líquida /

Os resultados são apresentado graficamente nas Figuras 1-3.0 protocolo incluindo a composição de enzima líquida da presente invenção (“EL”) demonstrou uma eficácia superior na manutenção das lentes livres de depósitos do Tipo III e Tipo IV, quando comparada com os outros métodos e composições conhecidos. Como é mostrado na Figura 1, a presente invenção eliminou os depósitos de lentes do Tipo III e Tipo IV

(frequência de 0,0 %) enquanto os outros protocolos exibiram uma frequência de depósitos de lentes de 6,5 - 8,4 %. A Figura 2 demonstra ainda a eficácia de limpeza das composições e métodos da presente invenção. Lentes limpas com a composição de EL necessitaram de substituição, devida a depósitos nas lentes, numa frequência de 0,3 % quando comparada com uma variação de 1,4 - 8,5 % para as outras composições e métodos estudados. A composição de EL demonstrou também descobertas de lâmpada de fenda mais baixas quando comparadas com as outras três composições e métodos (Figura 3).

Lisboa, c. 0 3 ÀBR- 2000

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Maria Silvina Ferreira

Ageíiío Oficial tis Proaiiadcds Industrial

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lUiJ R. Casliihc, 2C;-3.? £ — 1070 LISBOA Teleís. 3351339-385 46 13

Claims (23)

1 1

REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição de enzima líquida para limpar uma lente de contacto, cuja composição compreende: uma enzima numa quantidade eficaz para limpar a lente; pelo menos 4 % p/ v de um composto de borato ou ácido bórico; e água, caracterizada por a composição compreender também de 50 - 70 % v/ v de um poliol de carbono 2 ou 3, em que a quantidade de composto de borato ou ácido bórico é de 4 a 8 % p/ v, e em que o poliol é 1,2-propano diol, 1,3-propano diol, ou etileno glicol.

2. Uma composição de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima é pancreatina, sibtilisina ou tripsina.

3. Uma composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a composição contém borato de sódio na quantidade de 6 - 8 % p/ v, ou ácido bórico na quantidade de 4-5,5 % p/ v.

4. Uma composição de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 3, em que a concentração da enzima é de 0,05 a 5,0 % p/ v.

5. Uma composição de acordo com qualquer das reivindicações precedentes que compreende 1,2-propano diol na quantidade de 50 % v/ v, e borato de sódio na quantidade de 7,6 % p/ v.

6. Uma composição de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 5, em que a enzima é pancreatina ou tripcina numa quantidade de pelo menos 900 UAP/ mL. t

7. Um método de limpeza e desinfecção de uma lente de contacto, cujo método compreende dispersar uma pequena quantidade de uma composição de limpeza de enzima líquida como reivindicado em qualquer das reivindicações de 1 a 6 numa solução desinfectante aquosa contendo uma quantidade de uma gente anti-microbiano eficaz para desinfectar a lente para formar um desinfectante aquoso/ solução de enzima, contactando a lente tanto com a solução desinfectante antes da dispersão da composição , ...2 y \JU de limpeza nela contida, como com o desinfectante aquoso/ solução de enzima, e mergulhando a lente no desinfectante aquoso/ solução de enzima por um período de tempo suficiente para limpar e desinfectar a lente.

8. Um método de acordo com a reivindicação 7, em que o agente anti-microbiano compreende de 0,00001 % a 0,05 p/ v de poliquatérnio-1.

9. Um método de acordo com a reivindicação 8, em que a solução desinfectante compreende cerca de 0,5 % p/ v de cloreto de sódio; cerca de 0,05 % p/ v de edetato de dissódio; cerca de 0,02 % p/ v de monohidrato de ácido cítrico; cerca de 0,6 % p/ v de dihidrato de citrato de sódio; cerca de 0,001 % p/ v de poliquatérnio-1; e água, e tem um pH de 7,0.

10. Um método de acordo com as reivindicações 7, 8 ou 9, em que a solução desinfectante/ enzima tem uma osmolalidade de a partir de 150 até 350 mOsmoles/ kg.

11. Um método de acordo com as reivindicações, 7, 8 ,9 ou 10, em que aproximadamente 30 a 60 microlitros da composição de limpeza de enzima líquida são dispersados em de 2 a 10 mL da solução desinfectante aquosa.

12. Um método de limpeza de uma lente de contacto, cujo método compreende dispersar uma pequena quantidade de composição de enzima líquida com reivindicado em qualquer das reivindicações de 1 a 6, num solvente aquoso, e mergulhar a lente na solução de limpeza enzimática por um período de tempo suficiente para a limpar. i

13. Uma combinação de uma composição de enzima líquida estável para limpar uma lente de contacto com uma solução desinfectante aquosa contendo um agente anti- \ microbiano, cuja composição de enzima compreende uma enzima numa quantidade eficaz para limpar a lente, pelo menos 4 % p/ v da composição de enzima compreendendo um composto de borato ou ácido bórico, e água; caracterizada por a composição de enzima compreender também de 50-70 % v/ v de poliol de carbono 2 ou 3, e em que a quantidade de composto de borato ou ácido bórico é de 4 a 8 % p/ v da

composição de enzima, e caracterizado por o agente anti-microbiano compreender 0,00001 % a 0.05 % p/ v de poliquatémio-1.

14. Uma combinação de acordo com a reivindicação 13, em que a enzima é pacreatina, subtilisina ou tripsina.

15. Uma combinação de acordo com as reivindicações 13 ou 14, em que o poliol é glicerol, 1,2-propano diol, 1,3-propano diol, ou etileno glicol.

16. Uma combinação de acordo com as reivindicações 13, 14 ou 15, em que a composição de enzima contém borato de sódio numa quantidade de 6 - 8 % p/ v, ou ácido bórico na quantidade de 4 - 5,5 % p/ v.

17. Uma combinação de acordo com qualquer das reivindicações de 13 a 16, em que a concentração da enzima é de 0,05 a 5,0 % p/ v.

18. Uma combinação de acordo com as reivindicações 13, 14 ou 17 em que a composição de enzima compreende 1,2-propano diol na quantidade de 50 % v/ v, e borato de sódio na quantidade de 7,6 % p/ v.

19. Uma combinação de acordo com qualquer das reivindicações de 13 a 18, em que a enzima é pancreatina ou tripsina numa quantidade de pelo menos 900 UAP/ mL.

20. Um método de limpeza e desinfecção de uma lente de contacto, cujo método compreende dispersar uma pequena quantidade de uma composição de limpeza de enzima líquida numa solução desinfectante aquosa contendo uma quantidade de um agente anti-microbiano eficaz para desinfectar a lente para formar um desinfectante aquoso/ solução de enzima, contactando a lente tanto com a solução desinfectante antes da dispersão da composição de limpeza nela contida como com o desinfectante aquoso/ solução de enzima, e mergulhando a lente no desinfectante aquoso/ solução de enzima por um período de tempo suficiente para limpar e desinfectar a lente, em que o agente anti-microbiano compreende de 0,00001 % a 0,05 % p/ v de poliquatérnio-1, e a 4' 4'

t composição de limpeza líquida compreende: uma enzima numa quantidade eficaz para limpar a lente; de 4 a 8 % p/ v da composição de enzima compreendendo um composto de borato ou ácido bórico; de 50 - 70 % v/ v da com posição de enzima compreendendo um poliol de carbono 2 ou 3, e água.

21. Um método de acordo com a reivindicação 20, em que a solução desinfectante compreende 0,5 % p/ v de cloreto de sódio; cerca de 0,05 % p/ v de edetato de dissódio; cerca de 0,02 % p/ v de monohidrato de ácido cítrico; cerca de 0,6 % p/ v de dihidrato de citrato de sódio; cerca de 0,001 % p/ v de poliquatérnio-1; e água, e tem um pH de 7,0.

22. Um método de acordo com as reivindicações 20 ou 21, em que a solução desinfectante/ enzima tem uma osmolalidade de a partir de 150 até 350 mOsmoles/ kg.

23. Um método de acordo com qualquer das reivindicações de 20 a 22, em que aproximadamente 30 a 60 microlitros da composição de limpeza de enzima líquida são dispersos em de 2 a 10 mililitros da solução desinfectante aquosa. Lisboa, 0 3 ABR, 2000

Maria Silvina Ferreira

letais. 3861335-3364613 \