NO314634B1

NO314634B1 - Stabile, flytende enzympreparater og anvendelse derav for rengjöring av kontaktlinser, samt anvendelse derav til samtidig rengjöring ogdesinfeksjon av kontaktlinser

Info

Publication number: NO314634B1
Application number: NO19970544A
Authority: NO
Inventors: Masood A Chowhan; Ronald P Quintana; Bahram Asgharian; Bor-Shyue Hong; Thierry Bilbault; Ruth Ann Rosenthal
Original assignee: Alcon Lab Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1997-02-06
Publication date: 2003-04-22
Also published as: CA2189572C; PT771347E; FI970501A0; US5723421A; GR3033551T3; TW434437B; DK0771347T3; HK1014029A1; ATE191000T1; NO970544D0; KR970704866A; DE69607283T2; US5939369A; JP2001083471A; CN1074456C; JPH09507929A; ES2144250T3; BR9606420A; US5948738A; CN1155900A

Description

O ppfinnelsens bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse vedrører området kontaktlinserengjøring og -desinfeksjon. Denne oppfinnelsen vedrører nærmere bestemt stabile, flytende enzympreparater og anvendelse derav for rengjøring av menneskebårne kontaktlinser. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av enzympreparatene til samtidig rengjøring og desinfeksjon av kontaktlinser ved å kombinere de flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse med et kjemisk desinfeksjonsmiddel.

Forskjellige preparater og fremgangsmåter for rengjøring av kontaktlinser er blitt beskrevet i patentlitteraturen og i den vitenskapelige litteratur. Ved noen av disse fremgangsmåtene har det vært anvendt preparater som inneholder overflateaktive midler eller enzymer for å lette rengjøringen av linser. Den første omtale av anvendelse av proteolytiske enzymer for å rengjøre kontaktlinser, var i en artikkel av Lo, et al. i Journal of the American Optometric Association, volum 40, s. 1106-1109

(1969). Fremgangsmåter for fjerning av proteinavsetninger fra kontaktlinser ved hjelp av proteolytiske enzymer er blitt beskrevet i mange publikasjoner etter den første artikkelen av Lo et al., inkludert i US patentskrift nr. 3.910.296 (Karageozian et al.)

Et stort antall preparater og fremgangsmåter for desinfeksjon av kontaktlinser er også blitt beskrevet. Disse fremgangsmåtene kan generelt karakteriseres som å involvere bruken av varme og/eller kjemiske midler. Representative kjemiske midler for dette formål omfatter organiske antimikrobielle midler, slik som benzalkonium-klorid og klorheksidin, og uorganiske antimikrobielle midler, slik som hydrogenperoksid og peroksidgenererende forbindelser. I US patentskrifter nr. 4.407.791 og 4.525.346 (Stark) beskrives anvendelsen av polymere kvaternære ammoniumforbindelser for å desinfisere kontaktlinser og for å preservere kontaktlinsepleieprodukter. I US patentskrift nr. 4.758.595 og 4.836.986 (Ogunbiyi) beskrives bruken av polymere biguanider for det samme formål.

Det er blitt foreslått forskjellige fremgangsmåter for rengjøring og desinfeksjon av kontaktlinser samtidig. Fremgangsmåter som omfatter den kombinerte anvendelse av proteolytiske enzymer og peroksider for å rengjøre og desinfisere kontaktlinser samtidig, er beskrevet i US patentskrift nr. Re 32.672 (Huth et al.). En representativ fremgangsmåte for samtidig rengjøring og desinfeksjon av kontaktlinser omfatter bruken av proteolytiske enzymer og kvaternære ammoniumforbindelser, som beskrevet i japansk patentpublikasjon 57-24526 (Boghosian et al.). Den kombinerte anvendelse av et biguanid (det vil si klorheksidin) og flytende enzympreparater for samtidig å rengjøre og desinfisere kontaktlinser er beskrevet i kanadisk patentskrift nr. 1.150.907 (Ludwig et al.). Fremgangsmåtene omfatter den kombinerte anvendelse av oppløste proteolytiske enzymer for å rengjøre, og oppvarming for desinfeksjon som er beskrevet i US patentskrift nr. 4.614.549 (Ogunbiyi). Den kombinerte anvendelse av proteolytiske enzymer og polymere biguanider eller polymere kvaternære ammoniumforbindelser er beskrevet i den samtidig overdratte US patentsøknad nr. 08/156.043 og i den tilsvarende europeiske patentsøknad med publikasjonsnr. 0 456 467 A2 (Rosenthal et al) samt i US patentskrift nr. 5.096.607 (Mowrey-Mckee et al).

Den kommersielle levedyktighet til de fleste tidligere enzymatiske ren-gjøringsprodukter har vært avhengig av bruken av stabile enzymtabletter. Nærmere bestemt har bruken av faste enzymatiske rengjøringspreparater vært nødvendig for å sikre enzymenes stabilitet før bruk. For å bruke slike preparater må en separat pakning som inneholder en tablett åpnes, tabletten må plasseres i et separat glass som inneholder en oppløsning og tabletten må oppløses for å frigjøre enzymet i oppløsningen. Denne praksisen utføres vanligvis bare en gang i uken på grunn av den brysomme og langsomme fremgangsmåte, og med mulighet for irritasjon og toksisitet. Dessuten inneholder de enzymatiske rengjøringstabletter en stor mengde eksipienser, slik som brusende midler (f eks bikarbonat) og volumøkningsmidler (natriumklorid). Slik det er forklart nedenunder kan slike eksipienser påvirke både rengjøring og desinfeksjon av kontaktlinsene på ugunstig måte.

Det har vært tidligere forsøk på å bruke flytende enzympreparater for å rengjøre kontaktlinser. Disse forsøkene har imidlertid vært vanskeliggjort av det faktum at vandige, flytende enzympreparater er iboende ustabile. Når et proteolytisk enzym plasseres i en vandig oppløsning i et langvarig tidsrom (f. eks. flere måneder eller mer), kan enzymet tape hele den vesentlige del av sin proteolytiske aktivitet. Det kan gjøres tiltak for å stabilisere preparatene, men bruken av stabiliseirngsmidler kan ha en ugunstig virkning på aktiviteten til enzymer. F eks kan stabiliseringsmidler beskytte enzymer mot kjemiske ustabilitetsproblemer ved lagring i en vandig væske ved å plassere en væske i en hvilende fysikalsk konformasjon. Denne konformasjonen henvises her til som "delvis denaturert". Slike midler kan imidlertid også inhibere evnen til enzymene når det gjelder å bli aktive igjen (det vil si "bli renaturert") på brukstidspunktet. Endelig, og i tillegg til de generelle problemene som det er henvist til ovenfor, må et kommersielt levedyktig, flytende preparat for behandling av kontaktlinser være forholdsvis ikke-toksisk, og må være forenlig med andre kjemiske midler som brukes ved behandling av kontaktlinser, særlig antimikrobielle midler som benyttes for å desinfisere linsene.

Følgende patentskrifter henvises det til som ytterligere bakgrunnsstoff vedrørende tidligere forsøk på å stabilisere flytende enzympreparater: US patentskrifter nr. 4.462.922 (Boskamp); 4.537.706 (Severson) og 5.089.163 (Aron-son). Disse patentene beskriver detergentpreparater som inneholder enzymer. Detergentpreparatene kan brukes til å behandle tøyvask, og også til andre industrielle anvendelser. Slike detergenter er ikke passende for behandling av kontaktlinser. Preparatene i foreliggende oppfinnelse inneholder ikke noen detergent eller andre midler som potensielt kan skade eller irritere øyet.

I US patentskrift nr. 5.281.277 (Nakagawa) og japansk Kokai patent-søknader nr. 92-370197, 92.143718 og 92-243215 beskrives flytende enzympreparater for behandling av kontaktlinser. Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse menes å gi betydelige forbedringer i forhold til preparatene beskrevet i disse publikasjonene.

DK-B-146 910 beskriver et vandig, enzymholdig og flytende detergent-produkt. Det er beskrevet et system som skal bedre oppbevaringsstabiliteten til flytende enzymholdige detergentprodukter. Dette systemet består av en eller flere poly-hydroksyforbindelser, som kun inneholder C-, H-, og O-atomer og 2-6 hydroksy-grupper og borsyre, bortrioksid eller et alkalimetallborat. Polyhydroksyforbindelsene kan bl.a. være 1,2-propandiol, etylenglykol eller glyserol. De innkorporerte enzymer kan være proteolytiske, amylolytiske og cellulolytiske enzymer eller blandinger derav. Eksempler på egnede enzymer er proteaser og deriblant subtilisin. Konsentrasjonsområdene som er angitt, er imidlertid fjernere beslektet med de som anvendes ifølge oppfinnelsen, enn konsentrasjonsområdene som anvendes ifølge det ovenfor nevnte US patentskrift nr. 5.281.277.

WO-A-94/06479 beskriver også en metode for samtidig rengjøring og desinfeksjon av kontaktlinser. Metoden omfatter følgende trinn: først lages en desinfiserende løsning med effektiv mengde av desinfiserende middel, deretter tilsettes en effektiv mengde av et proteolytisk enzym og linsen bløtlegges i den resulterende løsning i et tidsrom som er tilstrekkelig til å rengjøre og desinfisere linsen. Det desinfiserende middel som benyttes velges fra gruppen bestående av kvaternære ammoniumsalter, biguanider, vannløselige kationiske polymerer og blandinger av disse. Løsningen inneholder fra 0,00001 til 0,005 % (w/v) av det desinfiserende middel. Eksempler på egnede enzymer er pankreatin, trypsin og subtilisin. Det tilveiebringes ikke noen lære vedrørende verken: (1) hvordan man skal oppnå et stabilt, kommersielt levedyktig flytende enzympreparat, eller (2) fordelene ved å benytte én eller to dråper av et flytende enzympreparat i kombinasjon med en desinfeksjonsoppløsning, i stedet for å kombinere en stor enzymtablett med en desinfiserende oppløsning.

O ppsummering av oppfinnelsen

De flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder avgjørende mengder av utvalgte stabiliseirngsmidler. Stabiliseringsmidlene som benyttes er kombinasjoner av en borat- eller borsyreforbindelse og propylenglykol. Mengden av stabiliseringsmidler som benyttes er blitt avbalansert, slik at den maksi-male stabilitet oppnås, mens maksimal aktivitet senere oppnås når preparatet tas i bruk. Dessuten bevarer borat- og/eller borsyreforbindelsen de flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse mot mikrobiell forurensning når preparatene emballeres i flerbruksbeholdere.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt et stabilt flytende enzympreparat for rengjøring av en kontaktlinse, kjennetegnet ved at det omfatter: 0,05-5,0 % (w/v) av et enzym, 50-70 % (v/v) propylenglykol, 4-8 % (w/v) av en borat- eller borsyreforbindelse, og vann. For å rengjøre en tilsmusset linse plasseres linsen i noen få milliliter av en vandig oppløsning og en liten mengde, generelt en til to dråper av enzympreparatet tilsettes til oppløsningen. Linsen bløtlegges så i den resulterende rengjøringsoppløsning i et tilstrekkelig tidsrom til å rengjøre linsen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således videre tilveiebrakt en anvendelse av et enzympreparat ifølge krav 1 til rengjøring av en kontaktlinse, idet det dannes en vandig enzymatisk rengjøringsoppløsning ved å dispergere en liten mengde av det flytende enzympreparat ifølge krav 1 i et vandig oppløsningsmiddel, og linsen bløtlegges i den enzymatiske rengjøringsoppløsning i et tilstrekkelig tidsrom til å rengjøre linsen.

De flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse kombineres ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen med en vandig desinfeksjonsoppløsning for samtidig å rengjøre og desinfisere kontaktlinser. Som det vil forstås av fagfolk innen teknikken må desinfeksjonsløsningen formuleres slik at den er forenlig med kontaktlinser. Den antimikrobielle aktivitet av mange kjemiske desinfeksjonsmidler påvirkes ugunstig av ioniske oppløste stoffer (f eks natriumklorid). Slik det er forklart nedenunder er de flytende enzympreparatene ifølge foreliggende oppfinnelse vesentlig ikke-ioniske, og de påvirker derfor ikke på ugunstig måte den antimikrobielle aktivitet til slike desinfeksjonsmidler. Dette anses for å være en hovedfordel ved foreliggende oppfinnelse.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således også tilveiebrakt en anvendelse av enzympreparatet ifølge krav 1 til samtidig rengjøring og desinfeksjon av en kontaktlinse, idet linsen plasseres i en vandig desinfiserende oppløsning som inneholder en tilstrekkelig mengde av et antimikrobielt middel til å desinfisere linsen, det dannes en vandig oppløsning av desinfeksjonsmiddel og enzym ved å dispergere en liten mengde av det flytende enzymholdige rengjøringspreparat ifølge krav 1 i den desinfiserende oppløsning, og linsen bløtlegges i den vandige oppløsning av desinfeksjonsmiddel og enzym i et tidsrom som er tilstrekkelig til å rengjøre og desinfisere linsen.

Enzympreparatene ifølge foreliggende oppfinnelse formuleres som konsentrerte flerdosevæsker og inneholder følgelig ikke vanlige enzymtabletteksipi-enser, slik som natriumklorid (volumøkningsmiddel) og bikarbonat (brusemiddel). De flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse gjør bruk av en vandig bærer. Primærkomponentene i bæreren er en eller flere polyoler og vann. Begge disse komponentene er ikke-ioniske. De flytende enzympreparatene ifølge foreliggende oppfinnelse er således i det vesentlige ikke-ioniske og har derfor svært liten innvirkning på ionestyrken til en desinfeksjonsoppløsning, og liten eller ingen effekt på den antimikrobielle aktivitet av desinfeksjonsoppløsninger.

Preparatene og anvendelsene ifølge foreliggende oppfinnelse gir større brukervennlighet. Denne brukervennligheten gjør det mulig for kontaktlinsebrukere å rengjøre sine linser 2 til 3 ganger ukentlig og mer foretrukket, hver dag. Det er blitt funnet at daglig bruk av de flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse resulterer i dramatisk bedret rengjøring og sikkerhet sammenlignet med de enzymren-gjøringsregimer beregnet på bruk en gang i uken som nå benyttes.

Kort beskrivelse av tegningen

Figur 1 er et histogram som viser effektene av et flytende enzympreparat ifølge foreliggende oppfinnelse på linseavsetninger av type III og type IV når det brukes daglig i løpet av en klinisk studie som varer i 135 dager. Figur 2 illustrerer

hyppigheten av og grunnene for linseerstatninger under den studien. Figur 3 illustrerer sikkerheten ved flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse i forhold til tidligere enzymrengjøringspreparater basert på forekomsten av signifikante spaltelam-pefunn under den kliniske studie.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Det er blitt funnet at bruken av propylenglykol i kombinasjon med en borat- eller borsyreforbindelse oppnår den stabilitet og vedvarende aktivitet som er påkrevet i de flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse. Det menes at stabiliteten til enzymene som benyttes i foreliggende oppfinnelse, forbedres gjennom delvis denaturering av proteinene. Enzymene denatureres delvis ved dannelse av et kompleks med stabiliseringsmidlene. Enzymene denatureres inntil et punkt hvor enzymene inaktiveres, men hvor renaturering lett oppnås ved fortynning av det denaturerte kompleks av enzym og stabiliseringsmiddel i et vandig medium. Det menes at stabiliseringsmidlene konkurrerer med vann om hydrogenbindingsseter på proteinene. En viss prosentdel av disse midlene vil således effektivt erstatte en viss prosentandel av vannmolekyler. Som et resultat av dette vil proteinene endre konformasjon (delvis denaturere) inntil en inaktiv og kompleksert (med stabiliseringsmidlene) form. Når enzymet er i en inaktiv form, beskyttes det mot selvnedbrytning og andre spontane og kjemisk irreversible hendelser. På den annen side resulterer for-trengning av for mange vannmolekyler i konformasjonelle proteinendringer som er irreversible. For å oppnå et stabilt flytende enzympreparat med betydelig holdbarhetstid og således kommersiell levedyktighet, må det sikres et nøye balansepunkt mellom maksimal stabilitet og maksimal reversibel renaturering. Et slikt punkt er nå blitt oppdaget.

Borat- eller borsyreforbindelsene som kan benyttes ved foreliggende oppfinnelse, omfatter alkalimetallsalter av borat, borsyre og boraks. Den mest foretrukne borat- eller borsyreforbindelse er natriumborat. Slik det er nevnt ovenfor bidrar borat- eller borsyreforbindelsen også til den antimikrobielle konservering av de flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse inntil et nivå som er effektivt for flerbruksdispensering.

Det er blitt funnet at visse mengder av propylenglykol og en borat- eller borsyreforbindelse er avgjørende for å oppnå den stabilitet og langvarige aktivitet som er påkrevet i de flytende enzympreparatene ifølge foreliggende oppfinnelse. Det er blitt oppdaget at kombinasjonen av 50-70 % volum/volum ("% v/v") av propylenglykol og 4-8 % vekt/volum ("% w/v") av en borat- eller borsyreforbindelse er påkrevet for å oppnå de nødvendige kriterier for virkningsfulle og kommersielt levedyktige flytende enzympreparater, som beskrevet ovenfor. Kombinasjonen av 50 % v/v propylenglykol og 7,6 % w/v natriumborat er mest foretrukket. Eksempel 1, 2 og 3 nedenunder illustrerer passende og upassende konsentrasjoner av disse stabiliseringsmidlene ytterligere.

Enzymene som kan benyttes i preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter alle enzymer som: (1) kan anvendes ved fjerning av avsetninger fra kontaktlinser; (2) forårsaker i det minste bare litt øyeirritasjon i tilfelle en liten mengde enzym kommer i kontakt med øyet som et resultat av utilstrekkelig skylling av en kontaktlinse; (3) er forholdsvis kjemisk stabile og effektive i nærvær av de antimikrobielle midlene som er beskrevet nedenunder; og (4) påvirker ikke på ugunstig måte de fysikalske eller kjemiske egenskapene til linsen som behandles. De proteolytiske enzymene som brukes må ha minst en delvis evne til å hydrolysere peptidamider for å redusere proteinmaterialet som finnes i linseavsetningen til små vannoppløselige underenheter. Vanligvis vil slike enzymer utvise en viss lipolytisk, amylolytisk eller beslektede aktiviteter forbundet med den proteolytiske aktivitet, og kan være nøytrale, sure eller alkaliske. I tillegg kan separate lipaser eller karbo-hydrater brukes i kombinasjon med de proteolytiske enzymene. For formål ifølge foreliggende beskrivelse henvises enzymer som tilfredsstiller de ovenfor nevnte krav, til som "oftalmisk akseptable".

Eksempler på oftalmisk akseptable proteolytiske enzymer som kan benyttes ved foreliggende oppfinnelse, omfatter pankreatin, trypsin, subtilisin, kdllagenase, kreatinase, karboksypeptidase, papain, bromelin, aminopeptidase, elastase, Aspergillo peptidase, pronase E (fra S. griseus), dispase (fra Bacillus polymyxa) og blandinger derav. Dersom papain brukes, kan det være påkrevet med et reduksjonsmiddel, slik som N-acetylcystein.

Mikrobielt avledede enzymer, slik som de som er avledet fra Bacillus-, Streptomyces- og Aspergillus-mikroorganismer, representerer en foretrukket type av et enzym som kan benyttes ved foreliggende oppfinnelse. Av denne undergruppen av enzymer er de mest foretrukne Bacillus-avledede alkaliske proteaser som generisk kalles "subtilisin"-enzymer.

Identifikasjonen, separasjonen og rensingen av enzymer er kjent innen teknikken. Mange identifikasjons- og isolasjonsteknikker foreligger i den generelle vitenskapelige litteratur for isolering av enzymer, inkludert enzymer som har proteolytiske og blandet proteolytisk/lipolytisk/amylolytisk aktivitet. Enzymene som det er tenkt på ved denne oppfinnelsen, kan lett fås ved hjelp av kjente teknikker fra plante-, dyre- eller mikrobielle kilder.

Pankreatin og subtilisin er foretrukne enzymer og trypsin er det mest foretrukne enzym for bruk ved foreliggende oppfinnelse. Pankreatin ekstraheres fra pat-tedyrspyttkjertel og er kommersielt tilgjengelig fra forskjellige kilder, inkludert Scientific Protein Laboratories (Waunakee, Wisconsin, USA), Novo Industries (Bagsværd, Danmark), Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA) og Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana, USA). Pankreatin USP er en blanding av proteaser, lipaser og amylaser og er definert i United States Pharmacopeia ("USP"). Den mest foretrukne form av pankreatin er Pankreatin 9X. Slik det her er benyttet betyr uttrykket "pankreatin 9X" et filtrert (0,2 fi) pankreatin som inneholder ni ganger USP-proteaseenhetsinnholdet. Subtilisin avledes fra Bacillus-bakterier og er kommersielt tilgjengelig fra forskjellige kommersielle kilder inkludert Novo Industries (Bagsværd, Danmark), Fluka Biochemika (Buchs, (Sveits), og Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana, USA). Trypsin renses fra forskjellige dyrekilder og er kommersielt tilgjengelig fra Sigma Chemical Co. and Boehringer Mannheim.

De flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse vil ha en enzymkonsentrasjon som er tilstrekkelig til å gi en effektiv enzymmengde for å fjerne i det vesentlige, eller betydelig redusere avsetninger av proteiner, lipider, muko-polysakkarider og andre materialer som vanligvis finnes på menneskebårne kontaktlinser når en liten mengde av et preparat tilsettes til et fortynningsmiddel. Slik det her er brukt henvises en slik konsentrasjon til som "en effektiv mengde til rengjøring av linsen". Mengden av enzym som brukes i de flytende enzympreparatene som brukes ifølge foreliggende oppfinnelse, vil generelt variere fra 0,05 til 5 % w/v. Utvelgelsen vil avhenge av flere forskjellige faktorer, slik som enzymet eller blandingen av enzymer som velges; renheten, spesifisiteten og virkningsfullheten av det utvalgte enzym eller de utvalgte enzymer; typen av linser som skal rengjøres; den påtenkte hyppighet av rengjøring (f eks daglig eller ukentlig); og den påtenkte varighet av hver rengjøring.

Under lagring vil noe av enzymets aktivitet kunne gå tapt, avhengig av lagringsvarighet og temperaturbetingelser. De flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan således fremstilles med initielle mengder med enzym som overskrider konsentrasjonsområdene som her er beskrevet. De foretrukne preparater ifølge foreliggende oppfinnelse vil generelt inneholde ett eller flere enzymer i en mengde på 300-6000 PAU/ml. Preparatene vil mest foretrukket inneholde 900-2200 PAU/ml, noe som tilsvarer pankreatin i området 1-2 % /vekt/volum; subtilisin i et område på 0,1-0,3 % vekt/volum; og trypsin i området 0,1-0,3 % vekt/volum. For denne beskrivelsens formål defineres en "proteolytisk aktivitetsenhet" eller "PAU" som den mengde enzymaktivitet som er nødvendig for å frembringe et mikrogram ( fig) tyrosin per minutt ("/ig/tyr/min"), slik den bestemmes ved hjelp av den kolorimetriske kaseinfordøyelsesanalyse som er beskrevet nedenunder.

Kaseinfordøyelsesanalyse

En 5,0 ml stor porsjon av kaseinsubstrat (0,65 % kasein (w/v) ekvilibreres i 10 minutter (min) ± 5 sekunder (sek) ved 37 °C. En 1,0 ml porsjon enzymoppløsning (0,2 mg/ml) tilsettes til kaseinsubstratet og blandingen vortexbehandles og det inkuberes så i 10 minutter ± 5 sek ved 37 °C. Etter inkubasjon tilsettes 5,0 ml 14 % trikloreddiksyre og den resulterende blandingen vortexbehandles umiddelbart. Blandingen inkuberes i minst 30 min, vortexbehandles så og sentri-fugeres så i 15-20 min (ca 2000 rpm). Supematanten fra den sentrifugerte prøve filtreres over i en serumfilterprøveoppsamler og 2,0 ml stor aliquot fjernes. Til den 2,0 ml store prøve tilsettes 5,0 ml 5,3 % Na2C03. Prøven vortexbehandles, 1,0 ml 0,67 N Folins fenolreagens tilsettes og prøven vortexbehandles på nytt med en gang og det inkuberes så i 60 min ved 37 °C. Prøven avleses så på et spektrofotometer for synlig lys ved 660 nanometer (nm) mot rent vann som referanse. Prøvekonsentrasjonen bestemmes så ved sammenligning med en standardkurve for tyrosin.

Rengjøringen med de flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse er en funksjon av tiden. Nedsenkingstidene som benyttes vil generelt variere fra ca 1 time til over natten. Dersom det skal anvendes mer langvarige nedsenkings-perioder (f eks 24 timer), kan det imidlertid benyttes lavere konsentrasjoner enn de som er beskrevet ovenfor.

Rengjøringsfremgangsmåtene involverer bruken av en liten mengde av de ovenfor beskrevne flytende preparater for å lette fjerningen av proteiner og andre avsetninger fra kontaktlinser. Mengden av enzympreparat som benyttes i bestemte utførelsesformer, kan variere, avhengig av forskjellige faktorer, slik som renheten til enzymet som benyttes, den foreslåtte varighet av eksponering av linser for preparatene, typen av linsepleieregimet (f eks hyppigheten av linsedesinfeksjon- og ren-gjøring), typen av linser som behandles, og bruken av tilleggsrengjøringsmidler (f eks overflateaktive midler). Det vil imidlertid generelt gjøres bruk av en mengde av de ovenfor beskrevne flytende preparater som er tilstrekkelig til å gi den endelige enzymkonsentrasjon på ca 5-75 PAU/ml oppløsning, etter dispersjon av de flytende enzympreparater i en desinfiserende oppløsning eller annet vandig oppløsningsmiddel. En sluttkonsentrasjon på 5-25 PAU/ml er foretrukket.

Som angitt ovenfor inneholder de flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse forholdsvis små mengder av ioniske oppløste stoffer. Nærmere bestemt inneholder preparatene ikke volumøkningsmidler, brusemidler eller andre ioniske oppløste stoffer som vanligvis finnes i tidligere kjente enzymtabletter. De foreliggende preparater inneholder de ioniske oppløste stoffer av borat- eller borsyreforbindelser som saltsyre og/eller natriumhydroksid, men konsentrasjonen av disse oppløste stoffer i de foreliggende preparater er forholdsvis lav. Preparatene er derfor i det vesentlige ikke-ioniske. Som et resultat av det faktum at preparatene formuleres som konsentrerte flerdosevæsker, er det dessuten påkrevet med bare en liten mengde av preparatene, generelt en eller to dråper, for å rengjøre kontaktlinser. De foreliggende preparater har derfor svært liten innvirkning på ionestyrken til desinfiserende oppløsninger. Slik det er forklart nedenunder, er dette trekket ved foreliggende oppfinnelse særlig viktig når de flytende enzympreparater kombineres med desinfiserende oppløsninger som inneholder ioniske antimikrobielle midler, slik som polyquaternium-1.

Den antimikrobielle aktivitet av desinfiserende midler, særlig polymere kvaternære ammoniumforbindelser, slik som polyquaternium-1, påvirkes ugunstig av konsentrasjoner av natriumklorid eller andre ioniske oppløste stoffer. Nærmere bestemt taper polymere kvaternære ammoniumforbindelser, og særlig de med formel (1) nedenunder, antimikrobiell aktivitet når konsentrasjonen av ionisk oppløste stoffer i den desinfiserende oppløsning økes. Bruken av oppløsninger med lave ionestyrker (dvs lave konsentrasjoner av ionisk oppløste stoffer, slik som natriumklorid) er derfor foretrukket. Ettersom både ioniske oppløste (f eks natriumklorid) og ikke-ioniske stoffer (f eks glyserol) påvirker osmolaliteten og tonisiteten til en oppløsning, er osmolalitet og tonisitet indirekte mål på ionestyrke. De lave ionestyrkene som fortrinnsvis benyttes, tilsvarer imidlertid generelt tonisiteter/osmolaliteter i området hypoton til isoton, og mer foretrukket i området 150-350 milliOsmol per kilogram (mOs/kg). Et område på 200-300 mOs/kg er særlig foretrukket, og en osmolalitet på ca 220 mOs/kg er mest foretrukket.

De flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse oppviser effektiv rengjørende virkningsfullhet samtidig som de utviser minimale ugunstige effekter, eller mer foretrukket, forsterkede effekter på den antimikrobielle aktivitet av desinfiserende oppløsninger. Det er uventet blitt oppdaget at de flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse øker den antimikrobielle aktivitet av desinfiserende oppløsninger som inneholder polyquaternium-1, et polymert desinfeksjonsmiddel av kvaternær ammoniumtype. Det er også blitt oppdaget at blandinger av de flytende enzympreparater og polyquaternium-1-holdige desinfek-sjonsoppløsninger blir enda mer effektive enn de polyquaternium-1-holdige desin-feksjonsoppløsninger alene når linser behandles i langvarige tidsrom på omtrent en time til over natten, idet 4 til 8 timer er foretrukket. Ettersom kontaktlinser av be-kvemmelighetshensyn vanligvis bløtlegges over natten for å bli rengjort med enzymer eller rengjort med kjemiske midler, har dette funnet praktisk betydning. Det antas at den ovenfor beskrevne økningen av antimikrobiell aktivitet skyldes oppbrytningen eller lysen av mikrobielle membraner ved hjelp av enzymet over tid.

Ved anvendelse av preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes et vandig oppløsningsmiddel. Det vandige oppløsningsmiddelet kan inneholde forskjellige salter, slik som natriumklorid og kaliumklorid, buffermidler, slik som borsyre og natriumborat, og andre midler, slik som chelateringsmidler og preserverings-midler. Et eksempel på et egnet vandig oppløsningsmiddel er en saltoppløsning, slik som "Unisol Plus"-oppløsning (Alcon Laboratories).

Ved anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes en desinfiserende oppløsning som inneholder «t antimikrobielt middel. Antimikrobielle midler kan være oksidative, slik som hydrogenperoksid, eller ikke-oksidative, polymere mikrobielle midler som avleder sin antimikrobielle aktivitet gjennom en kjemisk eller fysiokjemisk interaksjon med organismene. Slik det brukes i foreliggende beskrivelse henviser uttrykket "polymert antimikrobielt middel" til hvilken som helst nitrogen-holdig polymer eller kopolymer som har antimikrobiell aktivitet. Foretrukne polymere antimikrobielle midler omfatter: polyquaternium-1 som er en polymer kvaternær ammoniumforbindelse, og polyheksametylen biguanid ("PHMB") eller polyamino-propyl biguanid ("PAPB"), som er et polymert biguanid. Disse foretrukne antimikrobielle midler er beskrevet i US patentskrifter nr 4 407 791 og 4 525 346 (Stark) og 4 758 595 og 4 836 986 (Ogunbiy). Andre antimikrobielle midler som er egnet ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter: andre kvaternære ammoniumforbindelser, slik som benzalkoniumhalogenider, og andre biguanider, slik som klorhexidin. De antimikrobielle midlene som brukes her, anvendes fortrinnsvis i fravær av kvikksølvholdige forbindelser slik som timerosal.

De mest foretrukne antimikrobielle midler er polymere kvaternære ammoniumforbindelser med formelen

hvor:

R] og R2 kan være like eller forskjellige og er valgt fra:

N<+>(CH2CH2OH)3X\

N(CH3)2 eller OH;

X" er et farmasøytisk akseptabelt anion, fortrinnsvis et klorid, og

n = er et helt tall fra 1 til 50.

De mest foretrukne forbindelser med denne formelen er polyquaterium-1 som også er kjent som Onamer M (Onyx Chemical Corporation) eller som Polyquad (Alcon Laboratory, Inc.). Polyquatemium-l er en blanding av de ovenfor nevnte forbindelser hvor X" er klorid og R(, R2 og n er som definert ovenfor.

De ovenfor beskrevne antimikrobielle midler benyttes ved anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse i en effektiv mengde til å eliminere i det vesentlige eller redusere signifikant antallet av levedyktige mikroorganismer som finnes på kontaktlinser i overensstemmelse med kravene til offentlige godkjennelses-myndigheter, slik som US Food and Drug Administration. For foreliggende beskrivelsesformål henvises den mengden til som "en effektiv mengde for å desinfisere" eller "en antimikrobiell effektiv mengde". Mengden av antimikrobielt middel som anvendes vil variere avhengig av slike faktorer som typen av linsepleie-regime hvor fremgangsmåten benyttes. F eks vil bruken av et virkningsfullt daglig rengjøringsmiddel i linsepleieregimet i det vesentlige redusere mengden av materiale avsatt på linsen, inkludert mikroorganismer, og dermed minske mengden av mikrobielt middel som er påkrevet for å desinfisere linsene. Typen av linse som behandles (f eks "harde" i forhold til "myke" linser) kan også være en faktor. Generelt vil en konsentrasjon i området fra 0,000001 % til 0,01 vekt% av et eller flere av de ovenfor beskrevne antimikrobielle midler bli anvendt. Den mest foretrukne konsentrasjon av polymere kvaternære ammoniumforbindelser med formel (I) er 0,001 vekt %.

Oksidative desinfeksjonsmidler kan også anvendes ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike oksidative desinfeksjonsmidler omfatter forskjellige peroksider som gir aktivt oksygen i oppløsning. Ved foretrukne fremgangsmåter vil det gjøres bruk av hydrogenperoksid i området 0,3 - 3,0 % for å desinfisere linsen. Fremgangsmåter hvor det benyttes et oksidativt desinfeksjonssystem er beskrevet i US patentskrift nr Re 32 672 (Huth et al.)

Som det vil forstås av fagfolk innen teknikken, kan de desinfiserende oppløsninger som benyttes ved foreliggende oppfinnelse, inneholde forskjellige kom-ponenter i tillegg til de ovenfor beskrevne antimikrobielle midler, slik som egnede buffermidler, chelaterings- og/eller sekvestreringsmidler, og tonisitetsregulerende midler. De desinfiserende oppløsninger kan også inneholde overflateaktive midler.

Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse vil vanligvis involvere tilsetning av en liten mengde av et flytende enzympreparat ifølge foreliggende oppfinnelse til ca 2-10 ml av et vandig oppløsningsmiddel eller en desinfiserende opp-løsning, plassering av den tilsmussede linse i enzym/oppløsnings-eller enzym/desin-feksjonsmiddeloppløsningen, og bløtlegging av linsen i et tilstrekkelig tidsrom til å rengjøre eller rengjøre og desinfisere linsen. Mengden av flytende enzympreparat som benyttes, kan variere basert på slike faktorer som mengden av vandig oppløsningsmid-del eller desinfeksjonsoppløsning som brukes, men generelt er den 1-2 dråper. Foretrukne fremgangsmåter involverer tilsetning av 1 dråpe (30 fil) til 5 ml vandig opp-løsningsmiddel eller desinfiserende oppløsning. Den tilsmussede linse kan plasseres i det vandige oppløsningsmiddel eller den desinfiserende oppløsning enten før eller etter tilsetningen av det flytende enzympreparat. Eventuelt gnis kontaktlinsene først med et ikke-enzymatisk, overflateaktivt daglig rengjøringsmiddel før nedsenkingen i enzym/oppløsningsmiddel- eller enzym/desinfeksjonsmiddeloppløsning. Linsen vil vanligvis være bløtlagt over natten, men kortere eller lengre varigheter er omfattet av fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse. En bløtleggingstid på 4-8 timer er foretrukket. Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse muliggjør utførelse av det ovenfor beskrevne regime med en gang pr uke, men mer foretrukket hver dag. De følgende eksempler er gitt for ytterligere å illustrere forskjellige aspekter av foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Et foretrukket flytende enzympreparat ifølge oppfinnelsen og en egnet desinfiserende oppløsning for bruk i kombinasjon med det preparatet, er beskrevet nedenunder:

A. Flytende pankreatinpreparat

Det følgende flytende enzympreparat utgjør en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse:

<*> tilsvarer en mengde for å regulere pH til 6,0 ;Anmerkning: (w/v) betyr vekt/volum, (v/v) betyr volum/volum; ;og QS betyr tilstrekkelig mengde. ;Det ovenfor nevnte preparat ble fremstilt ved først å blande sammen etter hverandre propylenglykol og renset vann, saltsyre og natriumborat. Oppløsningen ble hurtigfiltrert (1,2 fim filter) over i en steril mottaksbeholder og så sterilfiltrert (0,2 fim filter). Den nødvendige mengde pankreatin (ca 1-2 % w/v) ble så oppløst i en passende mengde vann og oppløsningen ble hurtigfiltrert (0,6 fim filter). Denne enzymopp-løsningen ble så sterilfiltrert (0,2 fim filter) over i den sterile mottaksbeholder som inneholder den steriliserte propylenglykol/natriumboratoppløsning. Mens det ble blandet ble så innholdet i mottakingsbeholderen brakt til korrekt volum med en passende mengde vann. Den optimale pH i preparatet ovenfor er i området 6-7, en pH på 6 er mest foretrukket. ;B. Desinfiserende oppløsning ;Det følgende preparat utgjør en foretrukket desinfiserende oppløsning: ;For å fremstille preparatet ovenfor ble natriumsitratdihydratet, sitron-syremonohydratet, dinatriumedetatet, natriumklorid og polyquaternium-1 i de relative konsentrasjoner som er angitt ovenfor, behandlet med renset vann og komponentene fikk oppløses ved å omrøre med mikser. Renset vann ble tilsatt for å bringe oppløsningen til nesten 100 %. pH ble målt ved 6,3 og regulert til 7,0 med NaOH. Renset vann ble tilsatt for å bringe oppløsningen til 100 %. Oppløsningen ble omrørt og en pH-avlesning på 7,0 ble gjort. Oppløsningen ble så filtrert over i sterile flasker og det ble satt på korker. ;Eksempel 2 ;Foretrukne flytende subtilisin- og flytende trypsinpreparater ifølge foreliggende oppfinnelse for bruk i kombinasjon med en egnet desinfiserende oppløsning, f eks ifølge Eksempel IB, er beskrevet nedenunder: ;De ovenfor nevnte flytende subtilisin- og trypsinpreparater lages på samme måte som det flytende pankreatinpreparat beskrevet i Eksempel 1. ;Eksempel 3 ;En sammenligningsundersøkelse av effektene av varierende mengder av borat og propylenglykol i flytende preparater ble utført. Aliquoter av preparatene ble lagret i et rom med regulert temperatur (26,7 ± 2 °C). Etter 6 og 12 uker ble aliquoter analysert med hensyn på enzymaktivitet ved hjelp av den ovenfor beskrevne kasein-fordøyelsesmetode. Aktivitetsnivået ble sammenlignet med startnivåer og uttrykt som prosent gjenværende aktivitet. Data som viser hvor avgjørende mengdene av natriumborat og propylenglykol som brukes i flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse versus alternative prosentvise mengder er, som funksjon av enzym-stabilitet er angitt i Tabell I nedenfor: ;Preparat 6 demonstrerer en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse. Preparatene 2, 3 og 4 inneholder propylenglykol i en mengde som kreves ifølge foreliggende oppfinnelse, men inneholder ikke den boratmengde (natriumborat og borsyre) som kreves ifølge foreliggende oppfinnelse. Preparatene 1 og 5 inneholder mengder av propylenglykol og borat utenfor områdene som kreves ifølge foreliggende oppfinnelse. ;Aktivitetsmålinger oppnådd for preparatene 2-4 inneholdende 50-70 % ;propylenglykol, viste at lignende stabilitet (86,6-92,9 % ved romtemperatur) ble oppnådd etter 6 ukers inkubasjon, mens preparatene 1 og 5 som inneholder 40 eller 90 % propylenglykol, var betydelig mindre stabile (henholdsvis 71,9 % og et upåvisbart ni-vå). Preparatene 1-5 var mindre stabile (71,9-92,9 %) enn preparat 6 (97,7 %) gjennom 6 ukers inkubasjon. Dessuten oppviste preparat 6 en større stabilitetsvarighet, 98,4 % etter 12 uker, sammenlignet med et område på 44-74 % for preparatene 1-5. ;Eksempel 4 ;Data som viser stabilitet til det flytende enzympreparatet ifølge Eksempel 1 ved temperaturer for vanlig lagring, ble fastslått. Aliquoter av preparatet ble lagret i et rom med regulert temperatur (26,7 ± 2 °C, RT), eller i et kammer holdt ved 35 °C. På de utpekte tidspunkter ble aliquoter testet med hensyn på enzymaktivitet ved hjelp av den ovenfor beskrevne kaseinfordøyelsesmetode. Aktivitetsnivået ble sammenlignet med startnivåer og uttrykt som prosent gjenværende aktivitet. Resultatene er vist i Tabell II nedenunder: ;Dataene vist i Tabell II bekrefter stabiliteten til flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse. Dataene er basert på en sammenstilling av 4 separate mengder og forsøk. Dataene viser praktisk talt ingen skadelig effekt på enzymaktivitet gjennom 12 uker ved romtemperatur, idet sluttmålingene er 98,4 %. Det flytende enzympreparatet ifølge Eksempel 1 var også effektivt når det gjelder å opprettholde aktivitet ved forhøyet temperatur på 35 °C i 12 uker, idet det oppviste ca et 20 % tap i aktivitet. ;Eksempel 5 ;Det er blitt funnet at en av proteasekomponentene i pankreatin, trypsin, er signifikant mer stabil enn en av de øvrige proteasekomponentene, chymotrypsin. Dette funn ble bekreftet ved hjelp av en undersøkelse hvor den relative stabilitet til flytende enzympreparater som inneholder 0,3 % w/v av henholdsvis trypsin og chymotrypsin, ble sammenlignet. Preparatene var identiske med preparatet beskrevet i Eksempel 1 ovenfor, bortsett fra enzymkomponenten. Aliquoter av preparatene ble lagret i et kammer som ble holdt ved 35 °C. På det utpekte tidspunkt ble aliquoter testet med hensyn på enzymaktivitet ved hjelp av azokaseinfordøyelsesmetoden beskrevet nedenunder. Aktivitetsnivåer ble sammenlignet med startnivåer og uttrykt som prosent gjenværende aktivitet. Resultatene av undersøkelsen er vist i Tabell III. ;Azokaseinfremgangsmåte: ;Følgende oppløsninger anvendes ved denne analysen: ;1) Bufferoppløsning: 0,05 M natriumfosfatbuffer ;inneholdende 0,9 natriumklorid, pH 7,6. ;2) Substratoppløsning: 2 mg/ml azokasein i ;bufferoppløsningen nevnt ovenfor. ;Analysen startes opp ved å blande 1 ml av et passende fortynnet (slik at enzymaktiviteten er i området til standardkurven) enzympreparat i fosfatbuffer med 2 ml azokaseinsubstratoppløsning (2 mg/ml). Etter inkubasjon ved 37 °C i 20 minutter fjernes blandingen fra inkubatoren og 1 ml trikloreddiksyre (14 % w/v) tilsettes for å stanse enzymreaksjonen. Blandingen vortexbehandles godt og får stå ved romtemperatur i 20 minutter. Etter sentrifugering med 2500 rpm (med en Beckman GS-6R-sentrifuge) i 15 minutter filtreres supernatanten med en serumprøvetaker. 2 ml av det klare gule filtrat reguleres til en nøytral pH med 0,4 ml 0,1 N natriumhydroksid og absorbansen ved 440 nm bølgelengde lys måles med et spektrofotometer. Mengden av hydrolysert azokasein beregnes basert på en standardkurve med kjente konsentrasjoner av azokaseinoppløsning utviklet under identiske forhold. En enzymaktivitets-enhet ("AZ U") defineres som den mengde enzym som hydrolyserer 1 fig azokasein-substrat/minutt ved 37 °C. ;Trypsinpreparatet utviste en utmerket stabilitetsprofil ved 35 °C, i motsetning til chymotrypsinpreparatet, et alternativt preparat som ikke er en del av foreliggende oppfinnelse. Som sådan er flytende enzympreparater som inneholder trypsin alene, de mest foretrukne preparater ifølge foreliggende oppfinnelse. ;Eksempel 6 ;Data som viser stabiliteten til det flytende trypsinpreparatet ifølge Eksempel 2 ved forskjellige temperaturer ble fastslått. Aliquoter av preparatet ble lagret ved romtemperatur ("RT") eller ved 35 °C, 40 eller 45 °C. Ved utpekte tidspunkter ble aliquoter testet med hensyn på enzymaktivitet ved hjelp av azokasein-metoden beskrevet ovenfor. Aktivitetsnivåer ble sammenlignet med startnivåer og uttrykt som prosent gjenværende aktivitet. Resultatene er vist i Tabell IV nedenunder: ;Eksempel 7 ;Den desinfiserende virkningsfullhet av foreliggende oppfinnelse ble evaluert ved å bestemme hastigheten ved og omfanget av utryddelse som ble oppnådd ved et vandig system formet ved å blande det flytende enzympreparat og den desinfiserende oppløsning beskrevet i Eksempel 1 ovenfor. Systemet ble testet mot seks mikroorganismer: Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Candida albicans, Aspergillus fumigatus og Herpes simplex. Testfremgangsmåtene og resultatene er beskrevet nedenfor. ;For testing mot Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Candida albicans og Aspergillus fumigatus ble den følgende fremgangsmåte brukt: Et 0,1 ml volum inokulum (IO<8> kolonidannende enheter/ml) ble først tilsatt til et 10 ml volum av den desinfiserende oppløsning ifølge Eksempel 1, etterfulgt av tilsetning av 2 dråper av det flytende enzympreparat ifølge Eksempel 1. Et likeens inokulert 10 ml volum av den desinfiserende oppløsning ifølge Eksempel 1 ble brukt som en kontroll. Oppløsningene ble holdt ved romtemperatur gjennom testen. Hver mikroorganisme og testoppløsning testet individuelt. Sett av fire replikerte (n=8) prøver ble testet for hver organisme. ;Ved utvalgte tidsintervaller på 1, 2, 3,4, 6, 8 og 24 timer ble et 1 ml volum av den inokulerte testoppløsning inneholdende Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Candida albicans eller Aspergillus fumigatus fjernet og passende seriefortynninger ble gjort i sterile fortynningsstandarder av 0,9 % natriumkloridoppløsning. Det ble oppstilt helleplater med soyabønnekaseinfordøyd agar inneholdende 0,07 % asolectin og 0,5 % polysorbat 80. På tidspunkt 0 ble et 1,0 ml volum av saltoppløsningskontrollen fjernet og seriefortynningshelleplater ble fremstilt ved å bruke det samme gjenvinningsmedium og de samme fortynningsstandarder. Saltoppløsningskontrolluttellingen på tidspunkt 0 ble brukt som starttelling. Helleplatene ble inkubert ved 30-35 °C i passende inkuba-sjonstider. Antallet overlevende organismer ved hvert tidsintervall ble så bestemt. Resultatene er oppsummert i Tabellene V-IX nedenunder. ;For testing mot Herpes simplex ble den følgende fremgangsmåte brukt: ;5 ml av den desinfiserende oppløsning ifølge Eksempel 1 inneholdende en dråpe av det flytende enzympreparat ifølge Eksempel 1, og en kontrolloppløsning inneholdende 5 ml av den desinfiserende oppløsning ble inkubert med 125 mikroliter Herpes simplex hvorved man fikk en vevskulturinfeksjonsdose-50 (TCID50) på omtrent 1 x IO<5>. Ved tidsintervaller på 1,2, 3, 4, 6 og 8 timer ble en aliquot av test- eller kontrolloppløsningen fjernet og nøytralisert ved å blande i forholdet 1:1 med AOAC-nøytraliseirngsmiddel (40 g asolectin og 280 ml polysorbat 80 i 1 liter 0,25 M fosfatbuffer ved pH 7,2) og fortynnet 10 ganger i minimalt essensielt medium (MEM). En ml aliquoter ble platet ut i VERO-monolag, 4 replikater per fortynning, og fikk absor-bere i 30 minutter ved 37 °C ± 1 °C i 5 ± 1 % C02 i luft. Prøven fra hvert tidspunkt ble kjørt in duplo. Resultatene er oppsummert i Tabell X nedenunder. ;Som illustrert i Tabellene V-X var de oppnådde log-reduksjoner med det flytende preparat av enzym/desinfiserende ;oppløsning generelt større enn log-reduksjonene oppnådd med den desinfiserende oppløsningskontroll. Denne forskjellen var statistisk signifikant for S. epidermidis, P. aeruginosa, S. marcescens og H. simplex. Den antimikrobielle aktivitet mot C. albicans og A. fumigatus var omtrent lik. ;Eksempel 8 ;Den desinfiserende virkningsfullhet av en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse ble evaluert ved å bestemme hastigheten til og omfanget av ut-rydding oppnådd med et vandig system dannet ved å blande det flytende subtilisinen-zympreparat ifølge Eksempel 2 og den desinfiserende oppløsning ifølge Eksempel 1. Systemet ble testet mot Serratia marcescens. Testfremgangsmåten i Eksempel 7 ble fulgt. Prøvetidene var 2,4, 24 timer og 7 dager, og log-reduksjonene ble beregnet for 4 og 24 timer. Testresultatene, uttrykt som log-reduksjoner, er vist i Tabell XI nedenunder. ;Som illustrert i Tabell XI hadde det flytende enzympreparat som inneholder subtilisin, en økende effekt på den antimikrobielle aktivitet av den desinfiserende oppløsning ifølge Eksempel 1 ved 4 timer. ;Eksempel 9 ;Den desinfiserende virkningsfullhet av en ytterligere utførelsesform av foreliggende oppfinnelse ble evaluert ved å bestemme hastigheten ved og omfanget av utryddelse oppnådd med et vandig system dannet ved å blande det flytende trypsinpre-parat ifølge Eksempel 2 og den desinfiserende oppløsning beskrevet i Eksempel 1. Systemet ble testet mot Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans og Fusarium solani. Testfremgangsmåten ifølge Eksempel 7 ble fulgt. Prøvetidene var 4, 6 og 24 timer. Testresultatene uttrykt som log-reduksjoner er vist i Tabell XII nedenfor. ;Eksempel 10 ;Det følgende sammenligningseksempel viser effektiviteten av de flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse med forskjellige desinfeksjonsmidler. Effekten av de flytende enzympreparater ifølge foreliggende oppfinnelse, særlig det flytende enzympreparat ifølge Eksempel 1 (nedenunder henvist til som "flytende enzym" eller "LE") på den antimikrobielle aktivitet av en flerformålsoppløsning av polyquaternium-1 (preparat ifølge Eksempel IB) og en polymer flerformålsoppløsning av biguanid (ReNu flerformålsoppløsning) ble evaluert. ;To dråper flytende enzym ble tilsatt til 10 ml av enten den desinfiserende polyquaternium-1-oppløsning eller den polymere desinfiserende biguanidoppløsning. De respektive desinfiserende oppløsninger ble også testet som kontroller. Fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 7 ble fulgt. Mikrobiologiske data i form av log-reduksjoner oppnådd mot Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Candida albicans og Aspergillus fumigatus ble fastslått etter 4 timer. Resultatene er vist i Tabell XIII nedenunder. ;Resultatene viser ingen skadelige effekter av flytende enzym på den desinfiserende polyquaternium-1-oppløsning og en økning av utryddelsen av S. marcescens, P. aeruginosa og S. epidermidis etter 4 timer. Omvendt hadde det flytende enzympreparat en negativ effekt på den antimikrobielle aktivitet av den * desinfiserende oppløsning av polymert biguanid. Disse resultatene illustrerer de uventede resultater som ble oppnådd med en foretrukket fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor en desinfiserende polyquaternium-1-oppløsning blandes med et flytende enzympreparat ifølge foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 11

Det ble utført en 135 dagers undersøkelse hvor virkningsfullheten av preparatene og anvendelsene ifølge foreliggende oppfinnelse ble sammenlignet med andre preparater og anvendelser. Tre forskjellige kliniske observasjoner ble gjort: 1) hyppigheten av linseavsetninger av type III og type IV (Rudko graderingssystem); 2) hyppighet og grunner for linsebytting; og 3) hyppighet av betydelige spaltelyktfunn. "Type III" og "Type IV" linseavsetninger anses som linser med store avsetninger. Et "spaltelyktfunn" defineres som en unormalitet som observeres på hornhinnen av en lege som bruker en optikers spaltelyktapparat.

Tre forskjellige rengjøringspreparater og deres ledsagende anvendelser ble sammenlignet med en anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse ("LE"): 1) "historisk kontroll" - et datasett bestående av 5 forskjellige studier hvor linsen ble rengjort daglig med et overflateaktivt rengjøringsmiddel etterfulgt av en 8 timers nedsenking i en desinfeksjonsoppløsning kombinert med en 8 timers en gang per uke nedsenking av linsene i en desinfeksjonsoppløsning som inneholder en oppløst pankreatintablett; 2) "anvendelse 1" - en anvendelse hvor det benyttes en desinfiserende polyquaternium-1-oppløsning som inneholder sitrat (preparat ifølge Eksempel IB) hvor linsen gnis daglig i flere sekunder med denne oppløsningen og så legges i 8 timer i denne oppløsningen, kombinert med en 8 timers nedsenking av linsen per uke i en desinfiserende polyquaternium-1-oppløsning (preparat ifølge Eksempel IB) som inneholder en oppløst pankreatintablett; 3) "anvendelse 2" - en anvendelse hvor det benyttes en desinfiserende oppløsning av et polymert biguanid som inneholder et overflateaktivt middel, hvor linsen gnis daglig i flere sekunder og så senkes ned i denne oppløsningen i 8 timer, kombinert med en nedsenking av linsen en gang per uke i en desinfiserende oppløsning av polymert biguanid som inneholder et overflateaktivt middel og en oppløst subtilisintablett, i minst 15 minutter, etterfulgt av fjerning av linsen og plassering av den i en ny polymert biguanidoppløsning som inneholder et overflateaktivt aktivt middel, og nedsenking i 8 timer; og 4) "LE" - en anvendelse og et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse hvor linsen gnis daglig med et overflateaktivt rengjøringsmiddel etterfulgt av en 8 timers nedsenking i 5 mt av en polyquaternium-1-oppløsning (preparat ifølge Eksempel IB) og en dråpe av det flytende enzympreparat ifølge Eksempel 1 ("flytende enzym"). Tabell XIV nedenunder gir en sammenligning i tabellformat om preparatene og anvendelsene ifølge denne undersøkelsen.

Resultatene er vist grafisk i Figurene 1-3. Anvendelsen som omfatter det flytende enzympreparat ifølge foreliggende oppfinnelse ("LE"), oppviste utmerket virkningsfullhet når det gjelder å holde linser frie for avsetninger av Type III og Type IV, sammenlignet med de øvrige kjente anvendelser og preparater. Som vist i Figur 1 eliminerte foreliggende oppfinnelse linseavsetninger av Type III og Type IV (0,0 % hyppighet), mens de øvrige anvendelsene oppviste en 6,5-8,4 % linseavsetningshyppighet.

Figur 2 viser videre den rengjørende virkningsfullhet av preparatene og anvendelsene ifølge foreliggende oppfinnelse. Linser rengjort med LE-preparatet trengte erstatning på grunn av linseavsetninger, med en hyppighet på 0,3 % med et område på 1,4-8,5 % for de øvrige preparater og anvendelser som ble undersøkt. LE-preparatet oppviste også lavere spaltelyktfunn sammenlignet med de tre øvrige preparatene og anvendelsene (Figur 3).

Claims

1. Stabilt flytende enzympreparat for rengjøring av en kontaktlinse, karakterisert ved at det omfatter: 0,05-5,0 % (w/v) av et enzym, 50-70 % (v/v) propylenglykol, 4-8 % (w/v) av en borat- eller borsyreforbindelse, og vann.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at preparatet inneholder natriumborat i en mengde på 6-8 % (w/v) eller borsyre i en mengde på 4-5,5 % (w/v).

3. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at preparatet omfatter propylenglykol i en mengde på 50 % (v/v) og natriumborat i en mengde på 7,6 % (w/v).

4. Preparat ifølge kravene 1-3, karakterisert ved at enzymet er valgt fra gruppen bestående av pankreatin, subtilisin og trypsin.

5. Preparat ifølge krav 4, karakterisert ved at enzymet er pankreatin i en mengde på minst 900 PAU/ml.

6. Preparat ifølge krav 4, karakterisert ved at enzymet er trypsin i en mengde på minst 900 PAU/ml.

7. Anvendelse av enzympreparatet ifølge krav 1 til samtidig rengjøring og desinfeksjon av en kontaktlinse, idet linsen plasseres i en vandig desinfiserende oppløsning som inneholder en tilstrekkelig mengde av et antimikrobielt middel til å desinfisere linsen, det dannes en vandig oppløsning av desinfeksjonsmiddel og enzym ved å dispergere en liten mengde av det flytende enzymholdige rengjøringspreparat ifølge krav 1 i den desinfiserende oppløsning, og linsen bløtlegges i den vandige oppløsning av desinfeksjonsmiddel og enzym i et tidsrom som er tilstrekkelig til å rengjøre og desinfisere linsen.

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvor rengjøringspreparatet omfatter pankreatin i en mengde på minst 900 PAU/ml, propylenglykol i en mengde på 50 % (v/v) og natriumborat i en mengde på 7,6 % (w/v).

9. Anvendelse ifølge krav 7, hvor rengjøringspreparatet omfatter trypsin i en mengde på minst 900 PAU/ml, propylenglykol i en mengde på 50 % (v/v) og natriumborat i en mengde på 7,6 % (w/v).

10. Anvendelse ifølge kravene 7-9, hvor det antimikrobielle middel omfatter 0,00001-0,05 % (w/v) polyquaternium-1.

11. Anvendelse ifølge krav 7, hvor den desinfiserende oppløsning omfatter: ca 0,5 % (w/v) natriumklorid, ca 0,05 % (w/v) dinatriumedetat, ca 0,02 % (w/v) sitronsyremonohydrat, ca 0,6 % (w/v) natriumsitratdihydrat, ca 0,001 % (w/v) polyquaternium-1 og vann, og har en pH på 7,0.

12. Anvendelse ifølge krav 7, hvor oppløsningen av desinfeksjonsmiddel og enzym har en osmolaritet fra 150 til 350 mOsmol/kg.

13. Anvendelse av et enzympreparat ifølge krav 1 til rengjøring av en kontaktlinse, idet det dannes en vandig enzymatisk rengjøringsoppløsning ved å dispergere en liten mengde av det flytende enzympreparat ifølge krav 1 i et vandig oppløsningsmiddel, og linsen bløtlegges i den enzymatiske rengjøringsoppløsning i et tilstrekkelig tidsrom til å rengjøre linsen.

14. Anvendelse ifølge krav 13, hvor enzymet er valgt fra gruppen bestående av pankreatin, subtilisin og trypsin.

15. Anvendelse ifølge krav 13, hvor preparatet inneholder natriumborat i en mengde på 6-8 % (w/v) eller borsyre i en mengde på 4-5,5 % (w/v).

16. Anvendelse ifølge krav 13, hvor preparatet har en pH på 6,0, preparatet omfatter propylenglykol i en mengde på 50 % (v/v) og boratforbindelsen er natriumborat i en mengde på 7,6 % (w/v).

17. Anvendelse ifølge krav 16, hvor enzymet er pankreatin i en mengde på minst 900 PAU/ml.

18. Anvendelse ifølge krav 16, hvor enzymet er trypsin i en mengde på minst 900 PAU/ml.