PT705255E

PT705255E - Complexos de inclusao de sin-1a/ciclodextrina

Info

Publication number: PT705255E
Application number: PT95918104T
Authority: PT
Inventors: Joszef Szejtli; Joseph Geczy; Andrasne Vikmon; Lajos Szente; Julianna Szeman
Original assignee: Therabel Ind Sa
Priority date: 1994-04-26
Filing date: 1995-04-25
Publication date: 2001-05-31
Also published as: MD950440A; YU25995A; ATE197708T1; RU2136698C1; NO955283L; WO1995029172A1; HUT70750A; US5698535A; SI0705255T1; CZ316395A3; BG61974B1; JP3434828B2; BG100313A; LV11543B; DE69519463T2; DE69519463D1; GR3035356T3; NO955283D0; HU9401183D0; IL113491A

Description

DESCRIÇÃO "COMPLEXOS DE INCLUSÃO DE SIN-1A / CICLODEXTRINA" O invento diz respeito a agentes de libertação de óxido nítrico fisiologicamente activo, processos para a sua preparação e composições que os contêm.

Mais particularmente, o invento diz respeito a novos complexos de inclusão que são estáveis no seu estado sólido e que são formados com ciclodextrinas ou com derivados de ciclodextrina e que são libertadores de óxido nítrico à temperatura ambiente quando dissolvidos em água ou sistemas aquosos e que contêm também iões como catalisador ou estabilizador. O invento também diz respeito a processos para a sua preparação e composições que os contêm. SIN-1 São usadas as seguintes abreviaturas nesta descrição: 3-morfolino-sidnonimina SIN-1A Af-morfolino-Af-nitrosoaminoacetonitrilo SIN-1C cianometileno-amino-morfolina CDPSI polímero de β-ciclodextrina iónico solúvel DIMEB heptaquis-2,5-di-0-metil-p-ciclodextrina EDRF factor de relaxação derivado do endotélio HPpCD hidroxipropil-P-ciclodextrina Molsidomina 2,8 grupos hidroxipropilo por unidade de CD (média) N-etoxicarbonil-3-morfolino-sidonimina RAMEB PCD aleatoriamente metilada, w 12 grupos metoxilo por unidade de CD (média) TRIMEB heptaquis-2,3,6-tri-0-metil-P-ciclodextrina. É conhecido que o monóxido de azoto pode ter uma forma reduzida (NO·) que é designada por óxido nítrico e uma forma oxidada (NO+) que é chamada ião nitrosónio. O óxido nítrico (NO·) está implicado em numerosos processos biorreguladores importantes. A utilidade de um doador de libertação de NO depende quer da amplitude quer da duração do efeito de abaixamento da pressão arterial do meio. São necessários doadores de NO de actuação mais longa, que libertam o NO sem transformação metabólica dos doadores, i.e., que não sejam dependentes das funções do fígado. Além disso, um doador de NO deverá ter algum carácter lipofílico, para ser capaz de atravessar as membranas celulares para exercer a sua acção também nos órgãos e tecidos alvos. Por conseguinte, os compostos inorgânicos relativamente simples não são adequados para este propósito. O desenho do produto pode seguir três perspectivas diferentes: a. As pró-drogas doadoras de NO contêm o grupo NO, que é libertado quer directamente por um processo metabólico quer depois da remoção por hidrólise enzimática de alguns grupos de protecção. Estes processos estão largamente ligados ao fígado (e.g. Molsidomina).

As pró-drogas tipo sidnonimina (e.g. Molsidomina) dependem do fígado para removerem da molécula o grupo etoxi-carbonilo de protecção, para se produzir primeiro SIN-1 e, em seguida (num segundo processo dependente do pH catalisado por iões OH ), sendo formado o muito instável SIN-1A que,

•Ά -3-independen lemen le do pH, se decompõe espontaneamente com a libertação de NO. b. A preparação de parcelas ou complexos de óxido nítrico com vários nucleófilos.

Geralmente, a síntese de complexos de NO de amina secundária é como se segue: a amina secundária, e.g. dietilamina anidra, é dissolvida em éter anidro, o oxigénio é removido do sistema usando um banho de neve carbónica em acetona e o NO seco é borbulhado através da solução de éter a -78 °C durante 3 horas, preferivelmente a alta pressão (100 psi = 6,89· 105 Pa). A meia-vida da parcela dietilamina-óxido nítrico da técnica anterior Et2-N-NH-(ONa)-N=0 (DEANO) eleva-se a cerca de 2 minutos, enquanto o produto de adição de óxido nítrico de poliamina-espermina (SPNO) tem uma meia-vida de 39 minutos. c. A pró-droga é estabilizada pela formação do complexo de inclusão de ciclodextrina enquanto o NO é libertado espontaneamente sob condições fisiológicas. A pró-droga complexada de ciclodextrina conhecida é estável no estado sólido. É conhecido que a SIN-1 é um composto estável no estado sólido, contudo, a sua forma tautomérica de cadeia aberta SIN-1A é extremamente instável. É altamente difícil isolar o produto cristalino amarelo na forma pura e pode ser guardado apenas a -80 °C, sob azoto. A forma SIN -IA liberta rapidamente uma mole de NO no estado sólido através de fotólise, e em solução aquosa, mesmo no escuro, é convertida para cianometilenoamino-morfolina >0 ( -4- A SIN-1A é assim considerada uma pró-droga e a SIN-1C um produto de degradação biologicamente inactivo. O equilíbrio entre a SIN-1 estável e o SIN-1A activo (que é a droga real) depende de factores ambientais (pH, temperatura). Contudo, por causa da extrema instabilidade do SIN-1A -especialmente ao oxigénio - é praticamente um intermediário de vida curta no processo de decomposição de SIN-1.

Presentemente, a SIN-1 é comercializada apenas para administração intravenosa em ampolas de pó, para ser dissolvido antes da injecção. A pró-droga SIN-1 administrada oralmente é ineficaz, porque o passo hidrolítico que é necessário para a formação da forma SIN-1 A que dá origem ao NO não pode ter lugar sob condições de pH acídico, e antes da absorção é rápida e completamente decomposta para SIN-1 C ao pH mais alto do tracto gastrintestinal. É também público que a SIN-1 pode ser estabilizada por complexação CD e o equilíbrio SIN-1 -» SIN-1 A -» SIN-1C pode ser deslocado por meio da complexação com derivados de ciclodextrina (Publicação da PCT WO 91/14 681). Foi revelado que a complexação com certos derivados de CD inibem a formação de SIN-1 C. Por conseguinte, complexos mais estáveis de SIN-1 A/CDPSI, incluindo aqueles que contêm uma quantidade aumentada de SIN-1 A (mostrando actividade biológica baseada na libertação mais alta de NO), foram preparados por tratamento a quente por tempo curto do produto complexo SIN-l/CDPSI obtido por liofilização. De modo semelhante, um complexo SIN-l/DIMEB foi exemplificado. Estes derivados de CD foram propostos para serem usados em produtos farmacêuticos.

Este documento revelou complexos SIN-1/CD ou mistura de SIN-l/lactose com 4,5% numa base ponderai (p/p) de conteúdo de SIN-1 onde o i'οα.ΫΓ* -5- conteúdo de SIN-1A nos produtos obtidos foi como se segue: no complexo CDPSI 1,27% no complexo PCD 0,08% no complexo DIMF.R 0,06% no complexo HPPCD 0,115% na mistura com lactose 0,00% A conversão praticamente completa de SIN-1 para SIN-1A não foi revelada como tendo lugar mesmo quando a complexação foi realizada com CDPSI, que foi revelado ser o agente de complexação mais eficaz para este propósito.

Além disso: CDPSI e DIMEB não estão aprovados para serem usados em produtos farmacêuticos, como até ao momento. Desta maneira, a preparação de uma forma estável comercializável de SIN-1A puro é um problema não resolvido.

Devido à SIN-1 poder ser apenas aplicada intravenosamente, a sua pró-droga Molsidomina é usada para o tratamento oral de insuficiência cardíaca: Molsidomina é hidrolisada enzimaticamente no fígado para SIN-1.

Constituiu o objectivo último deste invento estabilizar o SIN-1A doador de NO, de maneira a assegurar uma formulação que pode ser administrada quer oralmente quer parentericamente, cuja inocuidade (mesmo i.v.) é suportada com completa documentação toxicológica. Presentemente, dois tipos de ciclodextrinas preenchem este requisito fundamental; yCD e HPpCD. -6-

Ainda que o efeito de estabilização da S1N-1A pelo CDPSI e pela DIMEB em soluções aquosas seja conhecido, não se deve contudo concluir que também a yCD não iónica seja eficaz para este propósito, particularmente por causa do seu diâmetro de cavidade muito mais largo. O excelente efeito de estabilização do CDPSI tem sido atribuído à sua estrutura polimérica, i.e., aos efeitos cooperativos de vários anéis de ciclodextrina ancorados na vizinhança estérica.

Os objectos deste invento são novos complexos de inclusão, que são estáveis no seu estado sólido, formados por N-morfolino-N-nitrosoaminoacetonitrilo com as ciclodextrinas PCD, yCD, hidroxipropil-β-ciclodextrina, heptaquis-2,6-di-0-metil-p-ciclodextrina, β-ciclodextrina aleatoriamente metilada ou heptaquis-2,3,6-tri-0-metil^-ciclodextrina, contendo também iões na forma de sais como catalisadores ou estabilizadores, sendo referido ião seleccionado a partir de aniões do grupo de ácidos carboxílicos do grupo acetato, formato, propionato, ascorbinato, tartarato e lactato e aniões de ácidos inorgânicos do grupo fosfato, fosfito, borato, sulfato, sulfito e/ou catiões tais como de metal alcalino ou amónio, não contendo os referidos complexos 3-morfolino-sidnonimina e contendo um máximo de 0,9% de ciano-metileno-amino-morfolina. Verificou-se ser o acetato um anião excelente para este propósito. Os catiões podem ser preferivelmente iões amónio ou alcalinos, contudo podem também ser usados outros catiões. Os complexos de inclusão de acordo com o invento libertam óxido nítricoà tamperatura ambiente depois de dissolução em água ou em sistemas aquosos.

Na forma de componente de ciclodextrina, eles contêm βΟϋ, yCD ou aCD, cspecialmente para uso farmacêutico. Eles podem também conter derivados de ciclodextrina, nomeadamente ciclodextrinas hidroxipropiladas ou metiladas, tais como HPPCD, DIMEB, RAMEB, TRIMEB ou CDPSI.

Um outro aspecto do invento são as composições biologicamente activas que contêm como seu ingrediente activo os novos complexos de SIN-lA/ciclodextrina em conjunto com ingredientes auxiliares e aditivos que facilitam o seu uso. As composições incluem, mas sem limitação, composições farmacêuticas que contêm como ingrediente activo complexos de inclusão de SIN-1A facultativamente com materiais auxiliares e adicionais usados em produtos farmacêuticos, para utilização oral, parentérica ou outra utilização médica. As formulações são preferivelmente pós dissolvidos directamente antes da medicação se realizar. Por conseguinte, as formulações são preferivelmente pós dissolvidos antes da injecção.

As composições farmacêuticas de preferência são aquelas que contêm como ingrediente activo complexos de inclusão de SIN-1A de acordo com o invento que são formados com pCD ou yCD. O acetato de amónio é o sal preferido para ser utilizado como catalisador ou estabilizador, nos complexos de inclusão de acordo com o invento.

Outros objectos do presente invento são conjuntos para serem usados como padrões de libertação de NO para libertarem NO numa quantidade e velocidade previsíveis quando dissolvidos em meio aquoso que contém como ingrediente activo complexos de inclusão de SIN-1A de acordo com o presente invento.

Isto é possível porque o presente invento diz respeito à preparação e estabilização do extremamente lábil SIN-1 A, o qual quando libertado da cavidade da ciclodextrina - mesmo após dissolução simples em água destilada - gera imediatamente NO numa quantidade e velocidade previsíveis sem a necessidade de qualquer outro enzima ou reagente. O presente invento inclui processos para a preparação de novos complexos de inclusão de SIN-1A de acordo com o invento, em que se faz reagir, a um pH adequado, a SIN-1 com um sal como catalisador, em que o sal contém iões seleccionados a partir do grupo de aniões de ácidos carboxílicos do grupo acetato, formato, propionato, ascorbinato, tartarato e lactato e aniões de ácidos inorgânicos do grupo fosfato, fosfito, borato, carbonato, hidrogenocarbonato, sulfato,sulfito e/ou catiões tais como de metal alcalino ou amónio, para deslocar o equilíbrio para a formação de SIN-1A, na presença de ciclodextrinas PCD ou yCD ou seus derivados hidroxipropilados ou metilados, em que o SIN-1A formado é imediatamente complexado e estabilizado pela formação de complexos de inclusão de SIN-lA/ciclodextrina. O processo inclui o isolamento no estado sólido dos complexos de SIN-1A/CD obtidos, contendo facultativamente os iões utuilizados como catalisadores na forma dos seus sais. É um processo preferido de acordo com o invento fazer-se reagir a SIN-1 com uma ciclodextrina PCD ou yCD ou seus derivados hidroxipropilados ou metilados no estado sólido, na presença de iões, preferivelmente na forma do seus sais como catalisadores, e misturando ou moendo completamente os componentes em conjunto. Uma outra via de acordo com o invento, segue a secagem por congelação de uma solução aquosa isenta de oxigénio contendo os componentes, seguido preferivelmente por uma "segunda secagem" em vácuo. É preferida a utilização de sais de amónio ou alcalinos formados com aniões de ácido carboxílico tais como os aniões acetato, formato, propionato, ascorbinato, tartarato e/ou lactato e/ou aniões de ácido inorgânico tais como borato, carbonato, hidrogenocarbonato, fosfato, fosfito, sulfato e/ou sulfito como -9- C*—t,± catalisador do processo. Os sais usados podem conter aniões ou caliões voláteis que são eliminados parcialmente ou totalmente durante o processo, tais como iões amónio ou carbonato.

Quando se realiza o que se descreveu acima, é vantajoso levar a cabo a reacção a valores de pH entre 6 e 10 e - quando for usada a água como meio de reacção - aplicando a "segunda secagem" a uma temperatura desde 40 até 100 °C, preferivelmente desde 50 até 70 °C.

Como se vê a partir dos testes de libertação de NO, os complexos de SIN-lA/ciclodextfina produzem imediatamente óxido nítrico após dissolução dos complexos sólidos em sistemas aquosos. Desta maneira, um caminho para se obter um complexo de SIN-lA/ciclodextrina de composição controlada (tendo o conteúdo de SIN-1C mais baixo) consiste na tautomerização de SIN-1 e na complexação simultânea do SIN-1A formado no estado sólido. A situação é semelhante quando a preparação do complexo é realizada por secagem por congelação. Neste caso, o segundo passo dé secagem (seguindo a liofilização) é capaz de assegurar as condições para a formação do complexo catalítico no estado sólido.

Os complexos de inclusão e composições farmacêuticas de acordo com o podem ser utilizados no tratamento com óxido nítrico de células vivas. Isto inclui, mas sem limitação, o tratamento de sintomas dependentes de óxido nítrico em humanos ou animais como insuficiências cardíacas angínica e isquémica, controlo fisiológico da pressão sanguínea, agregação de plaquetas, mediação da relaxação do peristaltismo, erecção peniana e outros. Isto é realizado pela administração, preferivelmente por aplicação oral ou parentérica, aos pacientes com necessidade de tal tratamento de uma quantidade eficaz de um novo complexo de inclusão de SIN-1A de acordo com o invento. -10- -10-

Αχ

Preferivelmente, são administrados os complexos de SIN-1A formados com pCD ou yCD e contendo facultativamente na forma dos seus sais de amónio ou alcalinos aniões de ácidos carboxílicos tais como acetato, formato, propionato, ascorbinato, tartarato e/ou lactato e/ou aniões de ácidos inorgânicos tais como fosfato, fosfito, borato, carbonato, hidrogenocarbonato, sulfato e/ou sulfito.

As maiores vantagens dos complexos SIN-1A/CD, comparadas com SIN-1A ou outros doadores de NO conhecidos até aqui, são assim as seguintes: - estabilidade a longo prazo, - rapidez de acção, - meia-vida aumentada, - independência do fígado, - independência do pH, - eventualmente uma maior capacidade de alcançar os seus alvos (tecidos).

Dispondo da composição estável toma-se possível abrir uma nova fase para os tratamentos com óxido nítrico que é chamada por alguns autores "uma inesperada nova super-estrela da bioquímica" (Chem. Ing. News, Dez. 1993, pág. 26-38).

Os Exemplos seguintes servem de ilustração, mas não de limitação, do invento.

-11- I. EXEMPLOS QUÍMICOS EXEMPLO 1.1.

Preparação do complexo SIN-lA/yCD 2 g de yCD e 0,8 g de acetato de amónio foram dissolvidos em 25 mL de água destilada por sujeição a ultra-sons. A solução foi desoxigenada borbulhando-a com gás hélio, e depois foram dissolvidos 200 mg de substância SIN-1. A solução foi imediatamente seca por congelação para o isolamento do complexo sólido. Uma segunda secagem a 40-50 °C durante 2 horas foi aplicada para se remover o conteúdo de água do complexo quase por completo. Quer a solução quer a substância foram protegidas da luz. O complexo é um pó amarelo claro. Rendimento: 2,6 ± 0,1 g A perda na secagem é inferior a 1%.

Análise HPLC: conteúdo de SIN-1: não detectável conteúdo de SIN-1 A: 11,7 ± 0,2% conteúdo de SIN-1C: 0,36 ± 0,1 %

Em todos os exemplos deste documento foi usado o método seguinte para a determinação simultânea de SIN-1, SIN-1 A e SIN-1C por HPLC: Coluna: coluna analítica Ultrasphere I.P. (Beckman-Astec) 4,6 ± 250 mm, diâmetro de partícula de 5 pm.

Fase móvel: tampão fosfato 0,01 M de pH=6,0 800 mL

tetra-hidrofurano 200 mL 1-dodecanossulfonato de sódio 0,405 g/dm3.

Força iónica: 0,05 ião g/dm3 (corrigida com sulfato de sódio).

Velocidade de fluxo: 1 mL/min; p=190 bar (1,90· 107 Pa).

Tamanho da amostra: 20 pL.

Comprimento de onda de detecção: - 230 nm BW: 6 (ref. 350 nm BW: 80) para SIN-1 A e SIN-1 C entre 0-8 minutos - 292 ran BW: 6 (ref. 400 nm BW: 80) para SIN-1 após 8 minutos. Tempos de retenção: SIN-1 9,6 min SIN-1C 4,5 min SIN-1A 4,8 min. A calibração foi realizada com soluções de SIN-1 e SIN-1 C preparadas recentemente, o conteúdo de SIN-1A foi expresso em equivalente de SIN-1C. EXEMPLO 1.2.

Preparação do complexo SIN-1 Α/βCD 16 g de PCD (conteúdo de água de 14%) e 7 g de acetato de amónio foram dissolvidos em 1000 mL de água destilada por sujeição a ultra-sons. A solução foi desoxigenada borbulhando-a com gás hélio, e depois foram dissolvidos 3 g de substância SIN-1. O complexo sólido foi isolado por imediata secagem por congelação e o conteúdo de água foi removido a 40-50 °C. Quer a solução quer a substância foram protegidas da luz. O complexo é um pó amarelado muito claro. Rendimento: 20 ± 1 g.

Perda na secagem <1%.

Análise HPLC: conteúdo de SIN-1: não detectável conteúdo de SIN-1 A: 12 ± 1% conteúdo de SIN-1C: 0,30 ± 0,2%. EXEMPLO 1.3.

Preparação do complexo SIN-lA/ffli^CD 2 g de HPpCD (DS=2,8) e 0,8 g de acetato de amónio foram dissolvidos em 25 mL de água destilada por sujeição a ultra-sons. A solução foi desoxigenada borbulhando-a com gás hélio, e depois foram dissolvidos 200 mg de SIN-1. A solução de complexo sólido foi isolada por imediata secagem por

- 13-congelação. O conteúdo de água foi removido a 40-50 °C. Quer a solução quer a substância foram protegidas da luz.

Foram obtidos 2,8 ± 0,1 g de complexo SIN-lA/HPpCD na forma de um pó amarelo claro. Perda na secagem <1%.

Análise HPLC: conteúdo de SIN-1: não detectável conteúdo de SIN-IA: 11,6±0,2% conteúdo de SIN-1C: 0,36 + 0,1%. EXEMPLO 1.4.

Preparação do complexo SIN-1A/RAMEB 2 g de RAMEB (DS=1,8) e 0,8 g de acetato de amónio foram dissolvidos em 25 mL de água destilada por sujeição a ultra-sons. A solução foi desoxigenada borbulhando-a com gás hélio, e depois foram dissolvidos 200 mg de SIN-1; a solução foi seca por congelação e o complexo sólido isolado foi seco a 40-50 °C durante 2 horas. Quer a solução quer a substância foram protegidas da luz.

Foram obtidos 2,8 ±0,1 g de complexo SIN-1A/RAMEB na forma de um pó amarelo claro. Perda na secagem <1%.

Análise HPLC: conteúdo de SIN-1: não detectável conteúdo de SIN-1 A: 12,0 ± 0,2% conteúdo de SIN-1C: 0,6 ± 0,1 %. EXEMPLO 1.5.

Preparação do complexo SIN-1 A/pCD em solução tampão fosfato 1 g de PCD (conteúdo de água: 14%) foi dissolvido em 55 mL de uma solução tampão fosfato de pH = 8,0 de acordo com USP XXII por sujeição a -14-

ultra-sons. A solução foi desoxigenada com gás hélio e então foram dissolvidos 100 mg de SIN-1. A solução foi imediatamente seca por congelação. A solução e a substância foram protegidas da luz.

Foram obtidos 1 ± 0,1 g de complexo SIN-1 A/pCD na forma de um pó colorido amarelo muito claro. Perda na secagem <1%.

Análise HPLC: conteúdo de SIN-1: não detectável conteúdo de SIN-1 A: 8,3% conteúdo de SIN-1 C: 0,24%. EXEMPLO 1.6. 1 g de PCD (conteúdo de água: 14%), 100 mg de hidrocloreto de SIN-1 e 100 mg de acetato de amónio foram completamente misturados num almofariz durante 15 minutos. Após um curto intervalo de tempo de fricção a mistura ficou visivelmente amarela. Depois de dois dias de armazenamento num contentor fechado protegido da luz, a análise por HPLC de acordo com o Exemplo 1.1., foi realizada para dar os seguintes resultados:

Análise HPLC: conteúdo de SIN-1: não detectável conteúdo de SIN-1 A: 7,9 ± 0,2% conteúdo de SIN-1C: 0,41 ± 0,1%. EXEMPLO 1.7.

Usando o processo do Exemplo 1.6. mas operando com 50 mg de acetato de amónio, a formação visível de SIN-1 A (coloração amarela) é mais lenta, levando várias horas.

Análise HPLC do SIN-lA/pCD depois de 2 dias de armazenamento: SIN-1:0,5 ± 0,1% SIN-1 A: 6,9 ±0,2% SIN-1C: 0,6 ±0,1%. -15- A*· EXEMPLO 1.8.

Seguindo o processo conforme descrito no Exemplo 1.6. mas aplicando 300 mg de acetato de amónio, a coloração amarela da mistura ocorre praticamente imediatamente após a mistura dos componentes.

Análise HPLC do complexo de PCD no mesmo dia após a preparação: SIN-l:não detectável

SIN-1A: 6,9 + 0,2% SIN-1C: 0,5 ±0,1%. EXEMPLO 1.9. 1 g de PCD (conteúdo de água: 14%), 100 mg de hidrocloreto de SIN-1 e 100 mg de acetato de sódio-3H20 foram completamente misturados num almofariz durante 15 minutos, seguido por tratamento a quente da mistura a 70 °C durante 1 hora.

Análise HPLC da amostra tratada a quente:

SIN-l:não detectável SIN-1A: 7,1 ±0,2% SIN-1C: 0,8 + 0,1%. Π. EXEMPLOS COMPARATIVOS EXEMPLO Π.Ι.

Preparação tentada do complexo SIN-1 A/pCD com ácido acético A preparação foi levada a cabo como no Exemplo I.2., mas em vez -16-de água e acetato de amónio a pCD foi dissolvida numa solução de 0,1 mol de ácido acético.

Análise HPLC do produto: conteúdo de SIN-1: 8,4% conteúdo de SIN-1 A: 0,28% conteúdo de SIN-1C: não detectável.

Por conseguinte, o complexo SIN-1 A/pCD sólido não foi isolado. EXEMPLO II. 2.

Preparação tentada do complexo SIN-1 A/pCD com hidróxido de sódio A complexação foi levada a cabo como no Exemplo I.5., mas neste caso a pCD foi dissolvida em 55 mL de hidróxido de sódio aquoso a pH 8,4 em vez de se usar acetato de amónio.

Análise HPLC do produto sólido obtido: SIN-1: 10,5% SIN-1A: 0,40% SIN-1C: não detectável. O complexo SIN-1 A/pCD sólido não foi isolado.

II. EXEMPLOS ANALÍTICOS E BIOLÓGICOS EXEMPLO ΠΙ. 1. A eficácia da conversão e estabilidade dos complexos de SIN-1 A são ilustradas no Quadro 1. As amostras foram guardadas à temperatura ambiente durante 11 meses em contentores de vidro sob uma atmosfera de ar, protegidas da luz. O conteúdo de SIN-1 A é dado em equivalente de SIN-1C. -17-

QUADRO 1

Conteúdo de SIN-1 (%) Conteúdo de SIN-1A (%) Conteúdo de SIN-1C (%) após a preparação após armazenamento durante 11 meses após a preparação após armazenamento durante 11 meses após a preparação após armazenamento durante 11 meses SIN-1A/ aCD 3,59 Ϊ 2,46 0,68 SIN-1A/ PCD 0 0 10,66 9,59 0,68 0,50 SIN-1A/ yCD 0 0 11,71 7,23 0,32 0,49 SIN-1A/ HPpCD 0,03 0 11,61 7,53 0,36 0,39 SIN-1A/ RAMEB 0 0 12,11 9,43 0,68 0,87 EXEMPLO III. 2.

Uma amostra de SIN-lA/pCD continha imediatamente após a preparação 11,47% de SIN-1A. Quando armazenada à temperatura ambiente durante 12 meses continha 8,36% de SIN-1A e, depois de 23 meses, continha 6,59% de SIN-1A. Os conteúdos de SIN-1C foram 0,18, 1,31 e 1,57%, respectivamente.

Os complexos continham aproximadamente 5-8% de água de inclusão, principalmente ligada à cavidade de ciclodextrina. EXEMPLO III. 3 O efeito melhorador da estabilidade do tratamento a quente ("segunda secagem") após secagem por congelação é ilustrado no Quadro 2. -18-At

Kl QUADRO 2 SIN-lA/p CD Conteúdo de SIN-1 (%) Conteúdo de SIN-1A(%) Conteúdo de SIN-1C (%) após a preparação após armazenamento durante 11 meses após a preparação após armazenamento durante 11 meses após a preparação após armazenamento durante 11 meses SIN-1A/ PCD 0 0 12,7 10,89 0,40 0,79 SIN-1A/ PCD tratado a quente 0 0 12,7 12,50 0,40 0,56 após a preparação após armazenamento durante 19 meses após a preparação após armazenamento durante 19 meses após a preparação após armazenamento durante 19 meses SIN-1A/ PCD 0,04 0 14,81 7,41 0,29 1,75 SIN-1A7 PCD tratado a quente 0,04 0 14,81 12,41 0,29 1,15 EXEMPLO ΠΙ. 4.

Velocidade e extensão da libertação de NO do complexo SIN-lA/pCD A libertação de NO em soluções de SIN-1A/CD foi examinada por métodos químicos e biológicos. 250 mg de complexo (corresponde a aproximadamente 25 mg de SIN-1A) foram dissolvidos em 100 mL de água destilada. Logo a seguir à dissolução a libertação de NO foi detectada indirectamente medindo simultaneamente a diminuição de conteúdo de SIN-1A e a formação do metabolito SIN-1C por HPLC como função do tempo. As medições foram - 19-repetidas em intervalos de tempo diferentes, sempre sob a protecçâo da luz. O Quadro 3 ilustra a cinética da decomposição de SIN-1A em água destilada à temperatura ambiente na presença de pCD, yCD e HPpCD. QUADRO 3 tempo, complexo de complexo de complexo de min PCD yCD HPPCD SIN-1A SIN-1C SIN-1A SIN-1C SIN-1A SIN-1C pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL Pg/mL pg/mL 0 213 13 270 7 240 8 20 152 39 - - - - 40 116 53 - - - - 50 104 59 165 46 135 52 70 86 65 - - - - 100 55 75 140 58 92 70 130 40 86 - - 80 140 180 19 95 95 75 - -

As T1/2 (meias-vidas) estimadas dos complexos calculadas a partir da diminuição do conteúdo de SIN-1A são de 53 min para PCD, de 24 min para yCD e de 70 min para HPPCD. EXEMPLO ΠΙ. 5. A libertação de NO numa solução de SIN-lA/pCD mais diluída (100 pg/mL de complexo SIN-lA/pCD corresponde a 10 pg/mL de SIN-1A) foi detectada por espectrofotometria de UV medindo a formação de metabolito SIN-1C como função do tempo. A transição SIN-1A -> SIN-1C é acompanhada -20-por uma mudança do espectro de UY muito característica, na medida em que SIN-1A tem um máximo de UV a 230 ± 1 nm e não mostra absorvência em SIN-1C a 277 ± 1 nm. 10 mg do complexo SIN-lA/pCD (corresponde a aproximadamente 1 mg de SIN-1A) foram dissolvidos em 100 mL de água destilada. O espectro de UV da solução foi registado entre 200-350 nm sem diluição imediatamente depois da dissolução e o registo foi repetido em diferentes intervalos de tempo, sob a protecção da luz. A quantidade de SIN-1C formada foi calculada a partir dos valores de absorvência a 277 ± 1 nm usando a curva de calibração tirada com um padrão de SIN-1C. A concentração de SIN-1C foi menor que 0,7 pg/mL logo após a dissolução e cerca de 7,8 pg/mL após 270 minutos. Presumivelmente, a quantidade equivalente de NO foi libertada. Meia-vida estimada do complexo: 90-100 minutos.

Figura 1. ilustra como os espectros de UV mudam como função do tempo: os espectros de UV de um complexo SIN-lA/pCD em intervalos de tempo de 10 minutos até 160 minutos depois da dissolução de 10 mg do complexo em 100 mL de água destilada são mostrados. A absorvência é registada contra o comprimento de onda. EXEMPLO III. 6. A formação de NO foi directamente determinada, usando detecção por microssensor porfirínico específico de NO. O método (Nature, Vol. 358. p. 675, 1992) é capaz de monitorizar a libertação de NO até IO'20 moles, numa célula isolada em microssistemas biológicos no modo amperométrico ou voltamétrico.

Num tampão fosfato de pH = 7,4 a 37 °C, SIN-lA/pCD 1 mM libertou NO a uma velocidade de 2,37 pmol/min nos primeiros 5 minutos e entre o 10° e o 30° minutos a uma velocidade de 0,17 μιηοΐ/min. Dissolvendo 0,1 mmol de substância os valores relevantes foram 0,42 pmol e 0,07 pmol, respectivamente. > EXEMPLO III. 7.

Inibição da agregação de plaquetas pelo complexo SIN-ΙΑ/β-

CD O óxido nítrico foi identificado como uma molécula mensageira natural na inibição da agregação de plaquetas via sistema guanilato-ciclase/GMP cíclico (Blood, 57. 946, 1981). Nós estudamos os efeitos biológicos de SIN-1 e complexo SIN-1 A/pCD comparando os seus efeitos de inibição da agregação de plaquetas. A agregação de plaquetas foi estudada no plasma rico em plaquetas do coelho e humano (J. Cardiovasc. Pharmacol., 14 supl. 11, pág. 120, 1989). Em cada lote de plasma rico em plaquetas do coelho e humano 8 curvas de resposta a dose foram registadas com o mimético de tromboxano U-46619 (0,25-4,0 μΜ) na presença de 0, 10‘7, IO'6 ou 10'5 moles de complexo SIN-lA/pCD. As curvas de resposta a dose foram realizadas em sequência aleatória. Depois disso, uma concentração fixada de U46619 (4 μΜ) foi usada para fazer curvas de inibição de concentração cheias para SIN-1 e para SIN-1 A/pCD. U46619 induziu uma agregação relacionada com a concentração. O efeito de inibição da agregação do complexo SIN-1 A/pCD a concentração molar idêntica em todos os casos foi significativamente mais alto do que o da SIN-1. O valores pD2 (logaritmo negativo da concentração que produz inibição de 50%) foram 5,57 ± 0,11 (n=7) para SIN-1 e 6,36 ± 0,07 (n=7) para o complexo SIN-lA/pCD, indicando que o complexo foi cerca de 6 vezes mais potente do que a SIN-1 neste teste.

Nalgumas experiências semelhantes verificou-se que o complexo SIN-lA/pCD era cerca de 10 vezes mais potente que a SIN-1. EXEMPLO ΠΙ. 8.

As experiências descritas no Exemplo III.7. foram repetidas usando plasma rico em plaquetas de citrato humano com SIN-1, complexo SIN-lA/pCD preparado recentemente (14,8% de conteúdo de SIN-1A) e com um complexo SIN-1 A/pCD, que tinha sido guardado à temperatura ambiente durante 23 meses (originalmente o conteúdo de SIN-1 A era 11,47%, após 23 meses era de 6,59%). O Quadro 4 ilustra os resultados que mostram logaritmos negativos da concentração (pD^ de SIN-1 e complexo SIN-1 Α/βΟϋ causando 50% de inibição da agregação induzida por U46619 em plasma rico em plaquetas humano.

Quer a amplitude quer o declive da curva de agregação foram avaliados. A diferença nos valores de pD2 indicam que o SIN-1 A/pCD recentemente preparado foi cerca de 8 vezes mais potente que a SIN-1. Verificou-se que o complexo armazenado durante 23 meses era 3 vezes menos activo do que o complexo recentemente preparado, mas 3 vezes mais potente do que a própria SIN-1. -23- Íja. Κ QUADRO 3

Substância agrega ç ã o n amplitude declive SIN-1 10 4,8 ± 0,05 4,85 ±0,13 SIN-1 A/pCD recentemente preparado (conteúdo de SIN-1 A: 14,81%) 10 5,5410,10 5,8510,11 SIN-1 A/pCD armazenado por 23 meses (conteúdo de SIN-1 A: 6,59%) 3 5,80 + 0,16 5,4210,06*

Os resultados dos testes in vivo sugerem que os complexos SIN-1A/ PCD aqui revelados são inibidores úteis da agregação de plaquetas in vivo.

Como é reflectido pelos valores das meias-vidas, os complexos SIN-lA/ciclodextrina são capazes de continuamente originarem óxido nítrico a uma velocidade mais aproximadamente constante ao longo de um período de tempo muito mais longo após a administração. EXEMPLO ΙΠ.9. A SIN-1 comercialmente disponível (CORVASAL) foi comparada com o complexo SIN-lA/pCD na artéria carótida de coelhos. A artéria carótida de coelhos anestesiados com nembutal foi dissecada para uma situação livre e anéis de 3 mm de comprimento foram imobilizados num grampo e colocados nos banhos de órgão. A contracção foi induzida com fenilefrina 3 x IO"7 M três vezes com lavagem subsequente. As curvas de resposta a dose foram registadas para CORVASAL 3 χ 10'9 M a 3 x 10*5 M (referido ao conteúdo de SIN-1) e para 3 x 10'9 a 3 x IO*5 moles de SIN-lA/pCD (referido ao conteúdo de SIN-1).

Figura 2. mostra a curva contracção versus concentração da droga. Como se vê, a droga SIN-1A complexada por PCD foi cerca de 6 vezes inais eficaz que a SIN-1 livre. Os pontos ilustrados representam a média de 6 medições.

Lisboa, 21 de Fevereiro de 2001 C—ΛχΛ

ALBERTO CANELAS Agente Oficia! da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Complexos de inclusão sólidos, que são estáveis no seu estado sólido, formados por N-morfolino-N-nitrosoaminoacetonitrilo com as ciclodextrinas PCD, yCD, hidroxipropil-p-ciclodextrina, heptaquis-2,6-di-0-metil-p-ciclodextrina, β-ciclodextrina aleatoriamente metilada ou heptaquis-2,3,6-tri-0-metil-p-ciclodextrina, contendo também iões na forma de sais como catalisadores ou estabilizadores, sendo referido ião seleccionado a partir de aniões do grupo de ácidos carboxílicos do grupo acetato, formato, propionato, ascorbinato, tartarato e lactato e aniões de ácidos inorgânicos do grupo fosfato, fosfito, borato, sulfato, sulfito e/ou catiões tais como de metal alcalino ou amónio, não contendo os referidos complexos 3-morfolinç>- 1 sidnonimina e contendo um máximo de 0,9% de ciano-metileno-amino-morfolina..
2. Composições farmacêuticas que contêm como ingrediente activo complexos de inclusão de acordo com a reivindicação 1, com materiais auxiliares e adicionais usados em produtos farmacêuticos, para utilização oral, parentérica ou outra utilização médica, em que as formulações são preferivelmente pós dissolvidos directamente antes da medicação se realizar.
3. Composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 2, contendo como ingrediente activo sólido complexos de inclusão de N-morfolino-N-nitrosoaminoacetoni- trilo formados com PCD e yCD.
4. Estojos para serem utilizados como padrões de libertação de NO para libertarem NO numa quantidade e velocidade previsíveis quando dissolvidos em meio aquoso contendo como ingrediente activo complexos de inclusão de N-morfolino-N-nitrosoaminoacetonitrilo sólidos de ..acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 5.
5. Processo para a preparação de complexos de inclusão de N-morfolino-N-nitrosoaminoacetonitrilo sólidos, caracterizado por se fazer reagir, a um pH adequado, a 3-morfolino-sidnonimina com um sal como catalisador, em que o sal contém iões seleccionados a partir do grupo de aniões de ácidos carboxílicos do grupo acetato, formato, propionato, ascorbinato, tartarato e lactato e aniões de ácidos inorgânicos do grupo fosfato, fosfito, borato, carbonato, hidrogenocarbonato, sulfato,sulfito e/ou catiões tais como de metal alcalino ou amónio, para deslocar o equilíbrio para a formação de N-morfolino-N-nitrosoamino-acetonitrilo, na presença de ciclodextrinas PCD ou yCD ou seus derivados hidroxipropilados ou metilados, em que o N-morfolino-N-nitrosoaminoacetonitrilo formado é imediatamente complexado e estabilizado pela formação de complexos de inclusão de N-morfolino-N-nitrosoaminoacetonitrilo/ci-clodextrina e se isolar no estado sólido os complexos de N-morfolino-N-nitrosoaminoacetonitrilo/CD obtidos, contendo facultativamente os iões utilizados como catalisadores na forma dos seus sais.
6. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se fazer reagir 3-morfolino-sidnonimina com uma PCD ou yCD ou seus derivados hidroxipropilados ou metilados, no estado sólido, na presença de iões na forma do seus sais como catalisadores, misturando ou moendo completamente os componentes em conjunto ou secando por congelação uma solução aquosa isenta de' oxigénio contendo os componentes, seguido preferivelmente por uma "segunda secagem" em vácuo.
7. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se usarem como catalisadores ou estabilizadores sais de amónio ou alcalinos formados com aniões de ácidos carboxílicos tais como acetato, formato, propionato, ascorbinato, tartarato e lactato e aniões de ácidos inorgânicos tais como borato, carbonato, hidrogenocar-bonato, fosfato, fosfito, sulfato e sulfito.
8. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se levar a cabo a reacção a um valor de pH entre 6 e 10 e - quando for usada a água como meio de reacção - aplicação de "segunda secagem" a uma temperatura desde 40 até 100 °C, preferivelmente desde 50 até 70 °C. Lisboa, 21 de Fevereiro de 2001