PT590530E - Proteinas de fusao para a activacao de pro-medicamentos - Google Patents

Description

5<}0S30 Γ

DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS DE FUSÃO PARA A ACTIVAÇÃO DE PRÓ-MEDICAMENTOS" A invenção refere-se a compostos que contêm uma região de ligação de antigénio que está ligada pelo menos a uma enzima, que pode metabolizar um composto não ou pouco citotóxico (pró-medicamento) num composto citotóxico (medicamento) , em que esta região de ligação a antigénio consiste de uma cadeia polipeptídica simples. Com vantagem, estão ligados de forma covalente à cadeia polipeptídica, hidratos de carbono. A combinação do pró-medicamento e conjugado anticorpo--enzima para aplicação como um meio terapêutico, encontra-se descrita na literatura da especialidade. De acordo com esta, injectam-se anticorpos contra um determinado tecido, nos quais está ligada uma enzima que cinde um pró-medicamento, e em seguida administra-se uma composição do pró-medicamento activável pela enzima. Por acção do conjugado anticorpo--enzima ligado ao tecido alvo, o composto de pró-medicamento deverá ser convertido num composto que exerce um efeito citotóxico contra o tecido ligado. Além disso, verificou-se, em trabalhos com conjugados de anticorpo-enzima, que estes conjugados químicos possuem uma farmacocinética desfavorável, resultando daí que a cisão do pró-medicamento de forma selectiva para o tumor e específica do local apenas ocorre de forma insuficiente. Alguns autores tentaram ultrapassar estas falhas evidentes através da injecção adicional de um anti--anticorpo enzimático que deveria resultar numa eliminação rápida do conjugado anticorpo-enzima pelo plasma (Sharma et 1

r al., Brit. J. Câncer, 61, 659, 1990). Um outro problema dos conjugados anticorpo-enzima é a possibilidade limitada de se produzirem quantidades reproductíveis e homogéneas. O objectivo da presente invenção era assim, encontrar proteínas de fusão que pudessem ser produzidas em grande quantidade a nível industrial e que, com base nas suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas sejam adequadas para aplicações terapêuticas.

Verificou-se assim que os compostos que contêm uma região de ligação a antigénio, que consiste de uma única cadeia polipeptídica, para a produção e utilização de proteínas de fusão, que, com vantagem, estão guarnecidas com hidratos de carbono, possuem vantagens inesperadas na activação do pró-medicamento. 0 objecto da invenção são portanto compostos, que contêm uma região de ligação a antigénio, que está ligada a pelo menos uma enzima, em que a região de ligação ao antigénio consiste de uma única cadeia polipeptídica e a proteína de fusão está guarnecida, com vantagem, com carbohidratos.

Por região de ligação a antigénio entende-se, no âmbito da invenção, uma região, que contém pelo menos dois domínios variáveis de um anticorpo, de preferência um domínio variável de uma cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável de uma cadeia leve de anticorpo (fragmento sFv). A região de ligação ao antigénio pode, contudo, ser de constituição bi-ou multivalente, isto é pode consistir de duas ou mais regiões de ligação, como está descrito, por exemplo, na patente EP-A-0 404 097. Especialmente preferido é, contudo, um fragmento sFv humano ou humanizado, especialmente um fragmento sFv humanizado. 2 Γ L-Cj t

De preferência, a região de ligação a um antigénio liga-se a um antigénio associado a tumor (TAA), preferindo-se, em particular, os seguintes TAAs: molécula de adesão a células neurais (N-CAM)("neural cell adhesion molecule") mucino epitelial polimórfico (PEM) ("polymorphic epithelial mucin") receptor do factor de crescimento epidérmico (EGF-R) ("epidermal growth factor receptor") antigénio β de Thomsen Friedenreich (TFP) ("Thomsen

Friedenreich antigen β") antigénio de carcinoma do tracto gastrointestinal (GICA)("gastrointestinal tract carcinoma antigen") gangliósido GD3 (GD3) ("GD3 ganglioside") gangliósido GD2 (GD2) ("GD2 ganglioside") sialilo-Lea, sialilo-Lex TAG72 glicoproteína com 24-25 kDa definida através de MAk L6, CA 125 e em particular o antigénio carcinoembriónico (CEA) ("carcinoembrionic antigen")

Como enzimas preferem-se as enzimas que podem metabolisar um composto não citotóxico ou pouco citotóxico, num composto citotóxico. Exemplos são a β-lactamase, piroglutamato-aminopeptidase, galactosidase ou D- 3 aminopeptidase, como descrito, por exemplo, na EP-A2-0 382 411 ou EP-A2-0 3 92 74 5, uma oxidase como por exemplo, a etanoloxidase, galactoseoxidase, D-aminoácido-oxidase ou a--Gly-ceril-fosfatoxidase, como descrito, por exemplo, na WO 91/00108, uma peroxidase de acordo por exemplo, com a EP-A2-0 361 908, uma fosfatase, como descrito por exemplo na EP-A1-0 302 473, uma idroxinitrilase ou glicosidase, de acordo, por exemplo, com a WO 91/11201, uma carboxipeptidase, como por exemplo a carboxipeptidase G2 (WO 88/07378), uma amidase, como por exemplo a penicilina-5-amidase), Kerr, D.E. et al. , Câncer Immunol. Immunther. 1990, 3_1) , uma protease, esterase ou glicosidase, como a galactosidase já referida, glucosidase ou uma glucuronidase, como descrito, por exemplo, na WO 91/08770. Prefere-se uma β-glucoronidase, de preferência de Kobayasia nipponica ou Secale cereale e especialmente preferida a de E. coli ou uma β-glucoronidase humana. Os substractos de cada enzima são abrangidos nos referidos direitos de protecção das patentes acima referidas e devem também considerar-se abrangidos como fazendo parte do conteúdo da descrição do presente requerimento. Substractos preferidos da β-glucoronidase são o N-(D-glicopiranosil)-benziloxicarbonil-antraciclina e em especial a N-(4-hidroxi-3-nitro-benziloxicarbonil)doxorubicina ou daunorubicina-β-Ο-glucoronido (J.C. Florent et al. (1992) Int. Carbohydr. Symp. Paris, A262, 297 ou S. Andrianomenjanahary et al. (1992) Int. Carbohydr. Symp. Paris, A 264, 299).

Um outro objecto da invenção são ácidos nucleicos que codificam para os compostos de acordo com a invenção. Em especial, prefere-se um ácido nucleico, bem como as suas variantes e mutantes, que codifica para um fragmento sFv contra CEA (antigénio carcinoembriónico) humanizado, ligado a uma β-glucoronidase humana (sFv-h^-gluc) , de preferência com a sequência apresentada na Tabela 1. 4 Γ L-Cj A produção dos compostos de acordo com a invenção é realizada por meio de técnicas genéticas convencionais, através de processos convencionais conhecidos do perito na arte, em que a região de ligação ao antigénio pode ser ligada a uma ou mais enzimas, directamente, ou através de um ligante, de preferência um ligante peptídico. Como ligante peptídico pode-se utilizar por exemplo, uma região--"dobradiça" ("Hinge-region") de um anticorpo ou uma sequência de aminoácido semelhante à "dobradiça". A enzima é assim de preferência ligada através do terminal-N na região de ligação ao antigénio, directamente ou através de um ligante peptídico. A, ou as enzimas, podem também, no entanto, estar quimicamente ligadas, como se descreve por exemplo na patente WO 91/00108.

Os ácidos nucleicos que codificam para as sequências de aminoácidos dos compostos de acordo com a invenção, são, em geral, clonados num vector de expressão, introduzidos e expressos em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, como por exemplo, células BHK, CHO, COS, HeLa, de insecto, de planta de tabaco, levedura ou de E. coli. O composto assim produzido pode ser em seguida isolado e utilizado para diagnóstico ou terapia. Um outro processo conhecido para a produção do composto de acordo com a invenção, é a expressão dos ácidos nucleicos que o codificam em mamíferos transgénicos, com excepção do homem, de preferência em cabras transgénicas.

As células BHK transfectadas com os ácidos nucleicos de acordo com a invenção, exprimem uma proteína de fusão (sFv--huP-Gluc) , que não só é específica para CEA como possui a actividade total da β-glucoronidase (veja-se exemplo 5).

Esta proteína de fusão foi purificada por cromatografia de afinidade anti-idiotipo correspondente ao método descrito na EP 0 501 215 A2 (exemplo M) . A proteína de fusão assim 5 purificada possui um peso molecular de 100 kDa, por SDS-PAGE em condições reductoras e apresenta um peso molecular de 100 ou 200 kDa, sob condições não reductoras.

Por cromatografia gel sob condições nativas (cromatografia gel TSK-3000) observou-se um pico de proteína (Ex. 6, Fig. I) , que se correlaciona com o pico de actividade num teste de actividade enzimática específica (EP 0 501 215 A2). A posição dos picos em comparação com marcadores de peso molecular padrão, indica um peso molecular de »200 kDa. Este resultado, em conjunção com os dados da SDS-PAGE, sugere que a proteína de fusão sFv-huP-Gluc enzimaticamente activa, funcional, existe na forma de "molécula bivalente", isto é, com duas regiões ligantes e 2 moléculas de enzima. Experiências aqui não descritas mostram que a proteína de fusão também poderá existir como tetrâmero, com 4 regiões ligantes e 4 moléculas de enzima, sob condições de cultura determinadas. Após a purificação da proteína de fusão sFv--huP~gluc e sua caracterização funcional in vitro, determinou-se a farmacocinética e localização tumoral da proteína de fusão em ratinhos "nus", onde foi enxertado carcinoma de estômago humano. As quantidades de proteína de fusão activa, funcional, foram determinadas, tanto nos orgãos, como no tumor, a diferentes pontos de tempo por meio da preparação adequada dos órgãos (exemplo 7) , bem como por determinação imunológica (teste do determinante triplo, exemplo 8) . Os resultados de experiências representativas estão resumidos na tabela 4.

De forma espantosa, consegue-se obter após 48 horas uma razão tumor/plasma de 5/1. A pontos de tempo mais tardios, esta razão é ainda mais favorável e conseguem-se valores > 2 00/1 (dia 5) . A razão para este comportamento farmacocinético favorável, da proteína de fusão sFv-huP-gluc reside no facto de a proteína de fusão não ligada ao tumor ser removida essencialmente através de receptores para a 6 φ> ^^ manose-6-fosfato e galactose do plasma e em seguida nos tecidos normais por internaiização. (Esta afirmação pode ser comprovada pelo facto de o valor da β-glucoronidase intracelular, por exemplo no fígado, aumentar).

Tal como se mostra na tabela 5, a sFv-huP-Gluc contém grandes quantidades de galactose e, em especial, manose, que são responsáveis essencialmente pela ligação aos respectivos receptores. O complexo proteína de fusão-receptor que assim surge, ligado ao resíduo de hidrato de carbono da proteína de fusão, é em seguida removido do compartimento extracelular por internalização.

Este mecanismo de internalização rápido, em que intervêm essencialmente a galactose e a manose é responsável em grande medida pela farmacocinética vantajosa da proteína de fusão de acordo com a invenção. Esta farmacocinética vantajosa das proteínas de fusão guarnecidas com galactose e, em especial, manose, permite a aplicação i.v. de um pró-medicamento hidrófilo que se divide extracelularmente, num ponto de tempo relativamente cedo, sem provocar uma activação não específica do pró-medicamento. Aqui não é necessário nenhum passo de eliminação, como descrito em Sharma et al. (Brit. J. Câncer, 61, 659, 1990) . Com base nos dados da tabela 4, é possível a injecção de um pró-medicamento adequado (S.

Adrianomenjanahari et al., 1992, Int. Carbohydrate Symp,

Parts A264, 299) mesmo a 3 dias após a injecção da proteína de fusão sFv-huP-Gluc sem se produzirem efeitos secundários significativos (dados não apresentados).

Uma outra guarnição vantajosa de proteínas de fusão com hidratos de carbono pode-se obter, por exemplo, através da expressão secretora da proteína de fusão sFv-hup-Gluc em estirpes de levedura determinadas, como Saccharomyces cerevisiae ou Hansenula polumorpha. Estes organismos são capazes de manosilar proteínas de fusão que possuem os locais 7 ' L-Cj ^ de N-glicosilação correspondentes, de forma bastante eficaz. (Goochee et al., Biotechnology, 9, 1347-1354, 1991). As proteínas de fusão assim expressas de forma secretória em células de levedura apresentam um grau de manosilação elevado uma farmacocinética favorável, comparável à das proteínas de fusão sFv-huP-Gluc expressas em células BHK (dados não apresentados). A ausência de galactose é assim compensada pelo grau mais elevado de manosilação da proteína de fusão (tabela 6). A proteína de fusão sFv-huP-Gluc acima descrita é construída por meio de técnicas genéticas e expressa em leveduras, como descrito em maior pormenor no exemplo 9.

Em vez da β-glucoronidase humana pode-se, no entanto, utilizar outra glucoronidase com propriedades vantajosas. Por exemplo, a β-Glucoronidase de E. coli tem em especial a vantagem de a sua actividade catalítica a pH 7,4 ser significativamente maior do que a da β-Glucoronidase humana. No exemplo 10, produz-se uma construção sFv-p-Gluc de E. coli por meio de métodos de técnicas genéticas e esta é expressa de forma secretória em Sacaromyces cerevisiae como uma proteína de fusão manosilada, activa, funcional. Os dados farmacocinéticos são comparáveis aos da molécula sFv-huP-Gluc que seria expressa em levedura, ou em células BHK (tabela 4).

As glucoronidases do fungo Kobayasia nipponica e da planta Secale cereale têm, por exemplo, a vantagem de serem também activas como monómeros. No exemplo 11 produz-se uma construção por meio de métodos de técnicas genéticas, que, por expressão em Sacharomyces cerevisiae segrega, uma proteína de fusão sFv^-lactamase II de B. cereus, de preferência na forma manosilada.

Esta proteína de fusão tem igualmente, tal como a proteína de fusão de acordo com a invenção, uma farmacocinética favorável para a activação do pró-medicamento, baseado na β-Glucoronidase (Tabela 4). 8 <* p U ^—ç·

Além disso, os compostos de acordo com a invenção podem ser utilizados não só em combinação com um pró-medicamento, mas também no contexto da quimioterapia corrente, em que metabolisados como glucorónidos e portanto citoestáticos inactivados, podem continuar a ser trnasformados na sua forma tóxica através dos compostos aplicados.

Os exemplos que se seguem descrevem agora a síntese por meio de técnicas genéticas, da proteína de fusão sFv-huP-Gluc, bem como a comprovação da sua funcionalidade.

Os materiais de partida foram os plasmídeo pABstop 431/26 hum Vjj e pABstop431/26 hum VHl- Estes plasmídeos contêm a versão humanizada do gene Vjj ou Vl do anti CEA MAK BW 431/26 (Gussow e Seemann, 1991, Meth. Enzymology, 203, 99-121). Como outro material de partida utilizou-se também o plasmídeo pABstop 431/26 Vjj-huP-Gluc 1H (EP A2-0 501 215) , que contém um exão-Vjj, incluindo a sequência sinal do próprio-VH, seguido de um exão CHI, a região "dobradiça" de um gene de IgG3 C humana e o ADNc completo da β-Glucoronidase humana.

Exemplo 1:

Amplificação do gene Vjj e Vl de MAk hum 431/26

Com os oligonucleótidos pAB-Back e Linker-Anti (tabela 2) o gene-V^, incluindo a sequência sinal do próprio gene-Vfj, é amplificado no pABstop 431Vjj hum, (Vjj 431/26) (Gússow e Seemann, 1991, Meth. Enzymology, 203, 99-121). Com os oligonucleótidos linker-sense e VL(Mut)“For (Tab. 3) o gene Vl é amplificado a partir do pABstop 431Vl (Vl 431/26). 9 p LCi ^-Ç»

Hindlll

Hindlll

PCR ▼

Hindlll Pstl BstEil L

Pvull

BamHI VH 431/26 VL 431/26

Exemplo 2

União dos fragmentos de gene de Vjj 431/26 e Vj^ 431/26

Os oligonucleótidos "linker-anti" e "linker-sense" são parcialmente complementares um ao outro e codificam para um ligante polipeptídico, que deverá conectar os domínios Vfj e Vl num fragmento sFv. A fim de fundir o amplificado com os fragmentos Vl, estes são purificados e utilizados numa reacção de 10 ciclos, como se segue: 10 3t H20: 37,5 μΐ dNTPs (2,5 mM): 5,0 μΐ tampão-PCR (10 x) : 5,0 μΐ polimerase-Taq (Perkin Elmer Corp.,

Emmeryville, CA) (2,5 U/μΙ): 0,5 μΐ 0,5 μ9/μ1 de ADN do Frag. Vl: 1,0 μΐ 0,5 μ9/μ1 de ADN do Frag. V^: 1,0 μΐ

Tampão PCR (10 x) : Tris 100 mM, pH 8,3, KCl 500 mM, MgCl2 15 mM, 0,1% (p/v) de gelatina. A superfície da mistura reaccional é selada com parafina e em seguida a reacção de 10 ciclos é realizada num aparelho de PCR com o programa de 94 °C, 1 min; 55 °C, 1 min; 72 °C, 2 min. Em seguida, são adicionadas 2,5 pM do iniciador de síntese ("primer") flanqueador pAB-back e Vl(Mut)"For e realizam-se mais 20 ciclos. Obtém-se um fragmento de PCR que consiste no gene-Vjj, o qual está ligado ao gene-VL por meio de um ligante. Antes do gene-VH encontra-se ainda a sequência sinal do próprio gene Vh- Através do oligonucleótido VL(Mut)-For a última base nucleotídica do gene Vl, uma C, é, de igual modo, substituída por uma G. Este fragmento de PCR codifica para um Fv de cadeia simples humanizado (sFv 431/26) 11 V Γ

f

BamHI

Hindlll PstlI-1-Jl

BstEIIΜρι

Pvull

Exemplo 3

Clonagem dos fragmentos sFv 431/26 no vector de expressão que contém o gene da huP-Glucoronidase 0 fragmento sFv de (2) é clivado com Hindlll e BamHI e ligado no vector pAB 431Vjj hum/CHl + lh/pGlc, clivado totalmente com Hindlll e parcialmente com BglII. O vector pABstop 43l/2 6VfjhuPGluclH contém um exão Vg, incluindo a sequência sinal do próprio Vjj, seguido de um exão CHI, do exão-"dobradiça" de um gene de IgG3. C humana e do ADNc completo da p-Glucuronidase humana. Isola-se o clone plasmídeo pMCG-El, que contém o sFv 431/26 humanizado, um exão-"dobradiça" e o gene para a p-Glucuronidase humana (pMCG-El) 12 Γ u,

Hindlll

„ , BstEII

HindUI Pstl |Pvull BarnHI sFv 431/26

Hindlll

Exemplo 4:

Expressão da proteína de fusão sFv-huP-Gluc em células BHK O clone pMCG-El é transfectado em células BHK, juntamente com o plasmídeo pRMH 14 0, que transporta um gene de resistência à neomicina e o plasmídeo pSV2, que transporta um gene de resistência ao metotrexato. Em seguida, as células BHK expressam uma proteína de fusão, que possui tanto as propriedades de ligação ao antigénio da MAK BW 43l/26hum, como a actividade enzimática da β-Glucuronidase humana 13

14 r L-Cj ϋ

Exemplo 5:

Comprovação das propriedades de ligação ao antigénio e da actividade enzimátia da proteína de fusão sFv-huP-Gluc A capacidade da proteína de fusão sFv-huP-Gluc se ligar de forma específica ao epítopo de CEA, definido através do 431/26 e, simultaneamente, exercer a actividade enzimática da β-Glucuronidase humana, é verificada por meio de um teste de actividade enzimática específica (EP-A2-0501215). O teste determina a libertação de 4-metil-umbeliferão a partir de 4-metil-umbelif eril^-Glucuronido através da porção β-Glucuronidase da proteína de fusão, após a proteína de fusão estar ligada a um antigénio pela porção sFv. Os valores de fluorescência obtidos são fornecidos como unidades de fluorescência (FE) relativa. 0 teste mostra uma libertação significativa de metil-umbeliferão através da proteína de fusão, nas placas revestidas com CEA. Pelo contrário, através da proteína de fusão não se liberta metil-umbeliferão em nenhuma placa controlo revestida com PEM ("polymorphic epithelial mucin").

Exemplo 6

Cromatografia gel TSK-3000

A partir da proteína de fusão sFv-hr^-Gluc purificada por cromatografia de afinidade anti-idiotipo, faz-se a cromatografia de 200 ng em 25 μΐ de uma coluna de TSK gel G 3000 SW XL (TOSO HAAS Best. Nr. 3, e Wx N3211, 7,8 mm x 300 mm) numa fase móvel adequada (PBS 7,2, contendo maltose 5 g/1 e arginina 4,2 g/1) com um caudal de 0,5 ml/min. A aparelhagem de HPLC Hitachi, da Merck (Detector-UV L-4000, L-6210 Intelligent Pump, D-2500 Chromato-Integrator) é operada a «20 bar, a densidade óptica dos eluatos é determinada a 280 nm e recolhem-se fracções de 0,5 ml, por meio de um colector 15 i* de fracções Multisac LKB 2111, que em seguida são analisadas num teste de actividade enzimática específica (SEAT) (EP 0501215 A2, Exemplo J) . 0 resultado destas experiências é apresentado na Figura 1. Vê-se claramente que a posição dos picos detectáveis por medição da densidade óptica a 280 nm estão de acordo com o pico que determina a especificidade e actividade enzimática (SEAT) do eluato. Com base nas posições de peso molecular de proteínas padrão indicadas por meio de setas, pode-se concluir que a proteína de fusão sFv-huP-Gluc activa, funcional, tem um peso molecular próximo de «200 kDa, sob condições nativas.

Exemplo 7

Preparação de órgãos/tumores para determinação da proteína de fusão

Realizaram-se os seguintes passos sequenciais: - ratinhos "nús" (CD1) tratados com proteína de fusão ou conjugado anticorpo-enzima são sangrados retro- orbitalmente e em seguida mortos - o sangue é colocado de imediato num tubo Eppendorf, no qual já se encontram 10 μΐ de Liquemin 25000 (Fa. Hoffman-LaRoche AG) - em seguida, centrifuga-se durante 10 min a 2500 rpm numa centrífuga (Megafuge 1.0, Fa. Heraeus) - em seguida o plasma é recolhido e congelado até ser testado - os orgãos ou tumores são removidos e pesados - em seguida são totalmente homogeneizados com 2 ml de BSA a 1% em PBS, pH 7,2 16 t - Os homogenatos de tumor são ajustados a pH 4,2 com HCl 0,1 N (a amostra não pode ser sobretitulada, dado que a β-Glucuronidase é inactivada a pH < 3,8!) - todos os homogenatos são centrifugados durante 30 min a 16000 g - O sobrenadante límpido é removido

- os sobrenadantes de tumor são neutralizados com NaOH 0,1 N - o sobrenadante e o plasma podem então ser quantificados por testes imunológicos.

Exemplo 8

Teste do determinante triplo O teste é realizado como se segue: - em cada poço de uma placa de microtítulo (Polystyrol forma-U, Tipo B, Fa. Nunc, Best.Nr. 4-60445) colocam-se 75 μΐ de um anticorpo de ratino anti-huP-Gluc diluído a 2 μg/ml em PBS, pH 7,2 (MAk 2118/157 da Behringwerke) - as placas de microtítulo são cobertas e incubadas durante a noite à temperatura ambiente - em seguida, as placas de microtítulo são lavadas 3x com 250 μΐ de tampão Tris-citrato 0,05 M, pH 7,4, por poço - as placas de microtítulo recobertas são incubadas com 250 μΐ de solução bloqueadora por poço (caseína a 1% em PBS, pH 7,2) durante 30', à temperatura ambiente (bloqueio dos locais de ligação não específicos) (as placas de microtítulo recobertas não necessárias são secas durante 24 17

V L-i ^>·— horas à temperatura ambiente e em seguida, são colocadas, juntamente com padrões secos, em sacos de alumínio recobertos, soldados, para armazenamento prolongado durante o bloqueamento fazem-se diluições 1:2 sucessivas, em 8 níveis, de 10 amostras + 2 controlos positivos + 1 controlo negativo (partindo de 150 μΐ de amostra pipetam-se 75 μΐ de amostra em 75 μΐ de padrão de caseína, e assim sucessivamente) numa placa de microtítulo de 96 poços de fundo em U (Polystyrol, Fa. Renner, Best. Nr. 12058). a solução bloqueadora é aspirada das placas de microtítulo revestidas com anticorpo anti-huP-Gluc, 50 μΐ da amostra diluída por poço da placa de diluição são colocados na placa teste e incubados durante 30 min à temperatura ambiente. durante a incubação das amostras junta-se o reagente ABC-AP (Fa. Vectastain, Best. Nr. AK-5000): 2 gotas de reagente A (Avidina DH) em 10 ml de caseína a 1% em PBS, pH 7,2, misturar bem e adicionar 2 gotas de reagente B (fosfatase alcalina biotinilada), misturar bem. (A solução ABC-AP deve ser junta pelo menos 30' antes de utilização). A placa teste é lavada 3 vezes com tampão de lavagem ELISA (Behringwerke, Best. Nr. OSEW 96). em cada poço, adicionam-se 50 μΐ de uma mistura de anticorpos teste marcados com biotina (mistura 1 + 1 de anticorpo anti 431/26 de ratinho (MAk 2064/353, Behringwerke) e anticorpo anti CEA de ratinho (MAK 250/183, Behringwerke) com uma concentração de cada de 5 μg/ml diluída em caseína a 1% em PBS, pH 7,2, concentração final de 2,5 μg/ml de cada anticorpo

a placa teste é lavada 3 vezes com tampão de lavagem ELISA 18 L-i ^ - por poço, adicionam-se 50 μΐ da solução ABC-AP preparada e incuba-se durante 30 min à temperatura ambiente - durante a incubação de ABC-AP junta-se substrato (para cada teste substrato fresco: fosfato de 4-metilumbeliferilo, Best. Nr. M-8883, Fa. Sigma em Tris 0,5M + MgCl 0,01%, pH 9,6)

- a placa teste é lavada 7 vezes com tampão de lavagem ELISA

- por poço, adicionam-se 50 μΐ de substrato, a placa teste é coberta e incubada durante 2 ha 37 °C - em seguida adicionam-se a cada poço 150 μΐ de solução de stop (0,2 M de glicina + SDS a 0,2%, pH 11,7) - a medição fluorimétrica é realizada num Fluoroscan II (ICN Biomedicals, Kat. Nr. 78-611-00) com um comprimento de onda de excitação de 355 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm - tendo em conta os valores de fluorescência de controlos positivos utilizados em experiências idênticas (curva de calibração a partir de diluições em série com sFv-huP-Gluc purificado, misturado com CEA 5 μg/ml) determina-se a concentração desconhecida da proteína de fusão na amostra.

Exemplo 9

Expressão da proteína de fusão sFv-huP~Glucuronidase em leveduras 0 Fv de cadeia simples (sFv) do exemplo 2 é amplificado com os oligos 2577 e 2561 (tabela 7) e clonado no vector pUC19 digerido com XBal/HindIII (Figura 2). 19 p ^-Ç. Ο gene da β-Glucuronidase humana é amplificado com os oligos 2562 e 2540 (tabela 8) no plasmídeo pAB 431/26 Vjjhum/CHl + lH/huP-Gluc (exemplo 3) e ligado (Figura 3) ao plasmídeo sFv 431/26 cortado com BglII/HindIII, em pUC19 (Figura 2).

Um fragmento Kpnl/Ncol é amplificado com os oligos 2587 e 2627 (Tabela 9) em sFv 431/26 e clonado no vector de expressão de levedura pIXY 120 digerido com Kpnl/Ncol (Figura 4) 0 fragmento BstEIl/HindIII do plasmídeo sFv 431/26 Ιηαβ-Gluc em pUC19 (Figura 3) é ligado no vector pIXY 120 digerido com BstEIl/HindIII parcialmente, que transporta o gene-Vjj, o ligante, bem como uma parte do gene Vl (parte Vg/ligante/VK em pIXY 120) (Figura 5) 0 plasmídeo sFv 431/26 huP~Gluc que surge em pIXY 120 é transformado em Saccharomyces cerevisiae e a proteína de fusão é expressa.

Exemplo 10:

Expressão da proteína de fusão sFv-β-Glucuronidase de E. coli em leveduras O gene da β-Glucuronidase de E. coli é amplificado em pRAJ 275 (Jefferson et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83: 8447-8451, 1986) com os oligos 2638 e 2639 (tabela 10) e ligado (Figura 6) em pUC19 com sFv431/26 cortado com BglII/HindiII (Exemplo 9 figura 2)

Faz-se a clonagem (Figura 7) de um fragmento

BstEIl/HindIII de sFv 431/26 β-Gluc de E. coli em pUC19 no vector digerido com BstEIl/HindIII parcialmente, Vjj/ligação/parte Vr; em pIXY 12 0 (exemplo 9, Figura 4) . 20 r

Li

O plasmídeo sFv 431/26 β-Gluc de E. coli em pIXY 120 é transformado em Saccharomyces cerevisiae e a proteína de fusão é expressa

Exemplo 11

Expressão da proteína de fusão sFv-P-lactamase 0 Fv de cadeia simples (sFv) do exemplo 2 é amplificado com os oligos 2578 e 2669 (tabela 1) e ligado no vector pUC19, digerido com KpNI/HindIII (Figura 8). 0 gene de β-lactamase II (Hussain et al. , J. Bacteriol. 164: 223-229, 1985) é amplificado com os oligos 2673 e 2674 (Tabela 11) em ADN total de Bacillus cereus e ligado no vector pUC19 digerido com EcoRI/HindI11 (Figura 9) . Faz-se a ligação de um fragmento Bcll/HindIII do gene de β-lactamase no sFv 431/26 em pUC19, cortado com BgLII/HindiII (Figura 10) 0 fragmento Kpnl/HindIII da sFv^-lactamase é ligado no pIXY 120 digerido com Kpnl/HindIII parcialmente (Figura 11) . 0 plasmídeo é transformado em Saccharomyces cerevisiae e expressa uma proteína de fusão, que trnasporta tanto as prorpiedades de ligação ao antigénio do MAk 431/26, como a actividade enzimática da β-lactamase de Bacillus cereus. 21

L-C t

Tabela 1 CCAAGCTTAT GAATATGCAA ATCCTGCTCA TGAATATGCA AATCCTCTGA 50 ATCTACATGG TAAATATAGG TTTGTCTATA CCACAAACAG AAAAACATGA 100 GATCACAGTT CTCTCTACAG TTACTGAGCA CACAGGACCT CACC ATG GGA TGG 153

Met Gly Trp AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGTAAGGGGC 199

Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr -10 TCACAGTAGC AGGCTTGAGG TCTGGACATA TATATGGGTG ACAATGACAT 249 CCACTTTGCC TTTCTCTCCA CA GGT GTC CAC TCC CAG GTC CAA CTG CAG 298

Gly Vai His Ser Gin Vai Gin Leu Gin 1 GAG AGC GGT CCA GGT CTT GTG AGA CCT AGC CAG ACC CTG AGC CTG 343 Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Arg Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu 10 20 ACC TGC ACC GTG TCT GGC TTC ACC ATC AGC AGT GGT TAT AGC TGG 388 Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Gly Tyr Ser Trp 30 CAC TGG GTG AGA CAG CCA CCT GGA CGA GGT CTT GAG TGG ATT GGA 433 His Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly 40 50 TAC ATA CAG TAC AGT GGT ATC ACT AAC TAC AAC CCC TCT CTC AAA 478 Tyr Ile Gin Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 60 AGT AGA GTG ACA ATG CTG GTA GAC ACC AGC AAG AAC CAG TTC AGC 523 Ser Arg Vai Thr Met Leu Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser 70 80 CTG AGA CTC AGC AGC GTG ACA GCC GCC GAC ACC GCG GTC TAT TAT 568 Leu Arg Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 90 TGT GCA AGA GAA GAC TAT GAT TAC CAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG 613 Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Tyr His Trp Tyr Phe Asp Vai Trp 100 110 22 658 p u,

Tabela 1 (Continuação):

GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGA GGC GGT GGA TCG

Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 120

GGC GGT GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATC CAG CTG ACC

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gin Leu Thr 130 140

CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC

Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr 150

ATC ACC TGT AGT ACC AGC TCG AGT GTA AGT TAC ATG CAC TGG TAC

Ile Thr Cys Ser Thr Ser Ser Ser Vai Ser Tyr Met His Trp Tyr 160 170

CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC AGC ACA

Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr 180

TCC AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT

Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 190 200

AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu 210

GAC ATC GCC ACC TAC TAC TGC CAT CAG TGG AGT AGT TAT CCC ACG

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Thr 220 230 TTC GGC CAA GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA GGTGAGTAGA ATTTAAACTT Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 240

TGCTTCCTCA GTTGGATCTG AGTAACTCCC AATCTTCTCT CTGCA GAG CTC AAA

Glu Leu Lys

ACC CCA CTT GGT GAC ACA ACT CAC ACA TGC CCA CGG TGC CCA

Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro 250

GGTAAGCCAG CCCAGGACTC GCCCTCCAGC TCAAGGCGGG ACAAGAGCCC TAGAGTGGCC TGAGTCCAGG GACAGGCCCC AGCAGGGTGC TGACGCATCC t 703 748 793 838 883 928 973 1023 1077 1119 1169 23 1219 p Lc- ^ ~t

Tabela 1 (Continuação): ACCTCCATCC CAGATCCCCG TAACTCCCAA TCTTCTCTCT GCA GCG GCG GCG 1271

Ala Ala Ala 260 GCG GTG CAG GGC GGG ATG CTG TAC CCC CAG GAG AGC CCG TCG CGG 1316 Ala Vai Gin Gly Gly Met Leu Tyr Pro Gin Glu Ser Pro Ser Arg 270 GAG TGC AAG GAG CTG GAC GGC CTC TGG AGC TTC CGC GCC GAC TTC 1361 Glu Cys Lys Glu Leu Asp Gly Leu Trp Ser Phe Arg Ala Asp Phe 280 290 TCT GAC AAC CGA CGC CGG GGC TTC GAG GAG CAG TGG TAC CGG CGG 1406 Ser Asp Asn Arg Arg Arg Gly Phe Glu Glu Gin Trp Tyr Arg Arg 300 CCG CTG TGG GAG TCA GGC CCC ACC GTG GAC ATG CCA GTT CCC TCC 1451 Pro Leu Trp Glu Ser Gly Pro Thr Vai Asp Met Pro Vai Pro Ser 310 320 AGC TTC AAT GAC ATC AGC CAG GAC TGG CGT CTG CGG CAT TTT GTC 1496 Ser Phe Asn Asp Ile Ser Gin Asp Trp Arg Leu Arg His Phe Vai 330 GGC TGG GTG TGG TAC GAA CGG GAG GTG ATC CTG CCG GAG CGA TGG 1541 Gly Trp Vai Trp Tyr Glu Arg Glu Vai Ile Leu Pro Glu Arg Trp 340 350 ACC CAG GAC CTG CGC ACA AGA GTG GTG CTG AGG ATT GGC AGT GCC 1586 Thr Gin Asp Leu Arg Thr Arg Vai Vai Leu Arg Ile Gly Ser Ala 360 CAT TCC TAT GCC ATC GTG TGG GTG AAT GGG GTC GAC ACG CTA GAG 1631 His Ser Tyr Ala Ile Vai Trp Vai Asn Gly Vai Asp Thr Leu Glu 370 380 CAT GAG GGG GGC TAC CTC CCC TTC GAG GCC GAC ATC AGC AAC CTG 1676 His Glu Gly Gly Tyr Leu Pro Phe Glu Ala Asp Ile Ser Asn Leu 390 GTC CAG GTG GGG CCC CTG CCC TCC CGG CTC CGA ATC ACT ATC GCC 1721 Vai Gin Vai Gly pro Leu Pro Ser Arg Leu Arg Ile Thr Ile Ala 400 410 24 p Lc, ^

Tabela 1 (Continuação): ATC AAC AAC ACA CTC ACC ccc ACC ACC CTG CCA CCA GGG ACC ATC 1766 Ile Asn Asn Thr Leu Thr Pro Thr Thr Leu Pro Pro Gly Thr Ile 420 CAA TAC CTG ACT GAC ACC TCC AAG TAT CCC AAG GGT TAC TTT GTC 1811 Gin Tyr Leu Thr Asp Thr Ser Lys Tyr Pro Lys Gly Tyr Phe Vai 430 440 CAG AAC ACA TAT TTT GAC TTT TTC AAC TAC GCT GGA CTG CAG CGG 1856 Gin Asn Thr Tyr Phe Asp Phe Phe Asn Tyr Ala Gly Leu Gin Arg 450 TCT GTA CTT CTG TAC ACG ACA CCC ACC ACC TAC ATC GAT GAC ATC 1901 Ser Vai Leu Leu Tyr Thr Thr Pro Thr Thr Tyr Ile Asp Asp Ile 460 470 ACC GTC ACC ACC AGC GTG GAG CAA GAC AGT GGG CTG GTG AAT TAC 1946 Thr Vai Thr Thr Ser Vai Glu Gin Asp Ser Gly Leu Vai Asn Tyr 480 CAG ATC TCT GTC AAG GGC AGT AAC CTG TTC AAG TTG GAA GTG CGT 1991 Gin Ile Ser Vai Lys Gly Ser Asn Leu Phe Lys Leu Glu Vai Arg 490 500 CTT TTG GAT GCA GAA AAC AAA GTC GTG GCG AAT GGG ACT GGG ACC 2036 Leu Leu Asp Ala Glu Asn Lys Vai Vai Ala Asn Gly Thr Gly Thr 510 CAG GGC CAA CTT AAG GTG CCA GGT GTC AGC CTC TGG TGG CCG TAC 2081 Gin Gly Gin Leu Lys Vai Pro Gly Vai Ser Leu Trp Trp Pro Tyr 520 530 CTG ATG CAC GAA CGC CCT GCC TAT CTG TAT TCA TTG GAG GTG CAG 2126 Leu Met His Glu Arg Pro Ala Tyr Leu Tyr Ser Leu Glu Vai Gin 540 CTG ACT GCA CAG ACG TCA CTG GGG CCT GTG TCT GAC TTC TAC ACA 2171 Leu Thr Ala Gin Thr Ser Leu Gly Pro Vai Ser Asp Phe Tyr Thr • 550 560 CTC CCT GTG GGG ATC CGC ACT GTG GCT GTC ACC AAG AGC CAG TTC 2216 Leu Pro Vai Gly Ile Arg Thr Vai Ala Vai Thr Lys Ser Gin Phe 25 570

V

Tabela 1 (Continuação): CTC ATC AAT GGG AAA CCT TTC TAT TTC Leu Ile Asn Gly Lys Pro Phe Tyr Phe 580 GAG GAT GCG GAC ATC CGA GGG AAG GGC Glu Asp Ala Asp Ile Arg Gly Lys Gly GTG AAG GAC TTC AAC CTG CTT CGC TGG Vai Lys Asp Phe Asn Leu Leu Arg Trp 610 CGT ACC AGC CAC TAC CCC TAT GCA GAG Arg Thr Ser His Tyr Pro Tyr Ala Glu GAC CGC TAT GGG ATT GTG GTC ATC GAT Asp Arg Tyr Gly Ile Vai Vai Ile Asp 640 CTG GCG CTG CCG CAG TTC TTC AAC AAC Leu Ala Leu Pro Gin Phe Phe Asn Asn ATG CAG GTG ATG GAA GAA GTG GTG CGT Met Gin Vai Met Glu Glu Vai Vai Arg 670 GCG GTC GTG ATG TGG TCT GTG GCC AAC Ala Vai Vai Met Trp Ser Vai Ala Asn GAA TCT GCT GGC TAC TAC TTG AAG ATG Glu Ser Ala Gly Tyr Tyr Leu Lys Met 700 TCC TTG GAC CCC TCC CGG CCT GTG ACC Ser Leu Asp Pro Ser Arg Pro Vai Thr TAT GCA GCA GAC AAG GGG GCT CCG TAT Tyr Ala Ala Asp Lys Gly Ala Pro Tyr 730 Γ - U CAC GGT GTC AAC AAG CAT 2261 His Gly Vai Asn Lys His 590 TTC GAC TGG CCG CTG CTG 2306 Phe Asp Trp Pro Leu Leu 600 CTT GGT GCC AAC GCT TTC 2351 Leu Gly Ala Asn Ala Phe 620 GAA GTG ATG CAG ATG TGT 2396 Glu Vai Met Gin Met Cys 630 GAG TGT CCC GGC GTG GGC 2441 Glu Cys Pro Gly Vai Gly 650 GTT TCT CTG CAT CAC CAC 2486 Vai Ser Leu His His His 660 AGG GAC AAG AAC CAC CCC 2531 Arg Asp Lys Asn His Pro 680 GAG CCT GCG TCC CAC CTA 2576 Glu Pro Ala Ser His Leu 690 GTG ATC GCT CAC ACC AAA 2621 Vai Ile Ala His Thr Lys 710 TTT GTG AGC AAC TCT AAC 2666 Phe Vai Ser Asn Ser Asn 720 GTG GAT GTG ATC TGT TTG 2711 Vai Asp Vai Ile Cys Leu 740 26 Γ ^ t

Tabela 1 (Continuação): AAC AGC TAC TAC TCT TGG TAT CAC GAC TAC GGG CAC CTG GAG TTG 2756 Asn Ser Tyr Tyr Ser Trp Tyr His Asp Tyr Gly His Leu Glu Leu 750 ATT CAG CTG CAG CTG GCC ACC CAG TTT GAG AAC TGG TAT AAG AAG 2801 Ile Gin Leu Gin Leu Ala Thr Gin Phe Glu Asn Trp Tyr Lys Lys 760 770 TAT CAG AAG CCC ATT ATT CAG AGC GAG TAT GGA GCA GAA ACG ATT 2846 Tyr Gin Lys Pro Ile Ile Gin Ser Glu Tyr Gly Ala Glu Thr Ile 780 GCA GGG TTT CAC CAG GAT CCA CCT CTG ATG TTC ACT GAA GAG TAC 2891 Ala Gly Phe His Gin Asp Pro Pro Leu Met Phe Thr Glu Glu Tyr 790 800 CAG AAA AGT CTG CTA GAG CAG TAC CAT CTG GGT CTG GAT CAA AAA 2936 Gin Lys Ser Leu Leu Glu Gin Tyr His Leu Gly Leu Asp Gin Lys 810 CGC AGA AAA TAT GTG GTT GGA GAG CTC ATT TGG AAT TTT GCC GAT 2981 Arg Arg Lys Tyr Vai Vai Gly Glu Leu Ile Trp Asn Phe Ala Asp 820 830 TTC ATG ACT GAA CAG TCA CCG ACG AGA GTG CTG GGG ATT AAA AAG 3026 Phe Met Thr Glu Gin Ser Pro Thr Arg Vai Leu Gly Asn Lys Lys 840 GGG ATC TTC ACT CGG CAG AGA CAA CCA AAA AGT GCA GCG TTC CTT 3071 Gly Ile Phe Thr Arg Gin Arg Gin Pro Lys Ser Ala Ala Phe Leu 850 860 TTG CGA GAG AGA TAC TGG AAG ATT GCC AAT GAA ACC AGG TAT CCC 3116 Leu Arg Glu Arg Tyr Trp Lys Ile Ala Asn Glu Thr Arg Tyr Pro 870 CAC TCA GTA GCC AAG TCA CAA TGT TTG GAA AAC AGC CCG TTT ACT 3161 His Ser Vai Ala Lys Ser Gin Cys Leu Glu Asn Ser Pro Phe Thr 880 890 TGA GCAAGACTGA TACCACCTGC GTGTCCCTTC CTCCCCGAGT CAGGGCGACT 3214 TCCACAGCAG CAGAACAAGT GCCTCCTGGA CTGTTCACGG CAGACCAGAA 3264 CGTTTCTGGC CTGGGTTTTG TGGTCATCTA TTCTAGCAGG GAACACTAAA 3314 27 f u ^f

Tabela 2 pAB-Back 5 ' 3 ' ACC AGA AGC TTA TGA ATA TGC AAA TC' "linker-anti": 5 '

GCC ACC CGA CCC ACC ACC GCC CGA TCC ACC GCC TCC TGA 3 ' GGA GAC GGT GAC CGT GGT C Tabela 3 "linker-sense" (ligante-sentido directo) 5 '

GGT GGA TCG GGC GGT GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT 3 ' GAC ATC CAG CTG ACC CAG AGC VL(Mut)-For: 5 ' TGC AGG ATC CAA CTG AGG AAG CAA AGT TTA AAT TCT ACT 3 '

CAC CTT TGA TC 28 vnS I—I Q)XI (1)

29 >·

Análise dos componentes monosacãrideos da fracção de hidrato de carbono da proteína de fusão a X m CQ d 'CU υ (U Ti u d i—I 0 1 Cd_ d I > á cq 0) τ) o u d d Ti (D Ti O !d ο υ d d 4-C d d CQ 'd o 4-> d d dtn d Ό d ω -H i—I d d d CQ d d CQo T) d r—I o CQ -H CQ <L> 4-) d CU d o a £ O o CQ CD 4-> d -Hd cn cu CQ 0 o d cq cao d (U CQ *H i—I '0 d Ti

> pLi CQ O £

£ B 05 U tí 0 tí rH 0 •H 0 T> -U υ rH 0 •rH υ U tí 05 NrH

O ε i OMS \J CQ cu d »

0 cn O tí 05 S

0 CQ o υ tí rH O

<L) CQ O 4-> υ ίΰ r—i Π3 O CQ d d d 4-> d d 4-) CQ (D CU d 4J d cu d d 4-) a 0 cu CQ 1 (D Ti o a (D CQ 0 4-> U d 1 -I d tn (D a >1 -U X cu i—I aε o u d cu 4-) d cuε i—I d d 4-> d cu > cu

o 4-> d M-4 CQ O CQ cu d rd υ a u -η d o d d tn o O co d o d '0 -Hd d o a •H 4-> <u co O o Ή o d Ό 'dε CQ d d d 4-) d d 4J CQ (U (U Ti d d d cu d 4-) <u u d a mo cri σι

Ou H d'd

d 4Jdε d 0)a (UTi d •H '<u rd d Ti '0 od 2 rd

d o -H d d d Ή 4-) (U T) O a CQ 4J h d X d cu τ) o d r~I 0 1 OQ. d rd I > Pl4 CQ O id CQ d Ή CU CQ I £ d d d o -H M-4 *r-i d ω > £ CQ CQ d <; (D Ti d Ή 0) 4-) O da CQ d Ti d υ Ή Ti d -H CO d) Π5 i—I Oε CQ d) o d o rd !0 d d o N rd

(d tí *H B rò CQ O 4J υ o5 rH 05 O 0 CQ O U 2 oJ tí -H B cti CQ O υ tí r—I Dl 0) υ 05 υ 2 i—I 0 1 C£X 3 43 > ω O Ti O -H Ti u d 'd d d *H ε d CQ o u d o d ω CQ O 4-1 O d 0)a rH >1 d tn 4-) tn

cu CQo d dεcu Ti dε d O μ-ι d d d -H 4-) 0) -H xcu 0) Ti oaε 'CU 4-) d Ti •H <u cn r^j

cud -H 4->dcuε dcu X o Tid dtncu CQ d Ti d N d d cq d tn O o 4J dε 3 o d CU d Ti = nj « od Λ cu o CQ -H <U 2 d εa

ddcu CQ d Oa cu CQ o d d <u Ti CQ cu d d i—\ oε CQ CU (O N d d CQ d Ti d •H 4-> d d a <

Ti -H d rd id d o cu cu a id E-* CU CQ O d d dε cu CQ O d d d 4-> cu CQ o d d dcud '<U oυ -rC d Ή

'0 d o Ti -Η o rd -H Ti CU '0 Ti CQ d -Hε

o 4-) d d 4J d Oaε o tn d d CQ d o T5 d cu Ti oa rdtn o •H x

oa •H 4J cd CQ d i—! u d o u dd -rHε d CQ O υd i—Itn d d (U d o tJ -H υ 'd o •d o id d o a d d H LT> ω ti o o tí m -η X CQ '0 Ό d a tí d ή — rdco ε co o η υ Im o CO !d Η O d tn n 4-) CU u d CQ o Tio 4-4 'd 2 <u 4-> Q) T) CUε d I—I o > d d 4-) d cu d CQ '0a d 30 j- a pH-elevado com detecção amperométrica por pulso ("high-pH anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection" (HPAE-PAD) cd ο- α <u cqcuμa aSd X ί· 0) ri ω cq '0μri Ή x m '0 a cd

ri td N H

(d CUμ 'CU ω O a) •d Ή U <d υ <d m o a o m d) jj d a> a o & o α CQ ori o !(do (d d Ή B d 0) u d)ri < μ o acu 4J d <u B I—i cdd cn Ή U cd >ri cu cua co Bdd cdμdu cu CQμ oa o ?<d t> cdμ ηd <u od ou cu u o o o t—j rd s CN O o Ή U '(Uo cd oμ od r—I 4-1 Ήμ -Uοri Η ο 'cd α>ri

>·. μ 4-) ra Ήε α> η u ο *Η PQ

cd ο *Η 4J cdd οο co CTv cd 4-) 0) !>Ίπμ cd x Bcu O 4-> *Hμ u CQ CUri o CQ CQ (U o oμa 0dcu CQ cd Λεο υ § a 1 W <C a wcuri o rd ω £

CMI LD vo (0

O Γ- t—I

<D Λ (0 H O i<6 CQ d CW CU ri cd d c—1 cu 0 4-í ε 0 μ 1-1 a 0 ε cd r) 0 d 0 Λ μ cd o cu ri cu CQ 0 0 4J d O cd cd LO μ ri -H S \—1 Λ <u r) 0 *rd a o cd cu μ 4-1 CQ 0 da u d 1—1 CM cu o j—( CQ (6 o Ή 0) CQ ri *H Ή > μ μ cd cu o u (6 CQ CQ fd 0 cu d o 0 >1 b cd CQ 0 u d ε CQ CU 4-) ε 0 μ cd -d d cu o υ cd ϋ VD ά o co a cu ri ε 0 o CQ u u d d 0 i—1 i—1 T3 O O 1 1 i—1 cu CQ. ca 0 CQ d d b rd Λ i—1 1 1 i—1 '(6 > > o d a a b C CQ ω "—'

t 31 .1’ Γ

t

Tabela 7 oligos para a clonaqem de sFv-huB-Gluc em pUC19 sFv para (2561) 5' TTT TTA AGC TTA GAT CTC CAC CTT GGT C 3' sFv back (2577) 5' AAA AAT CTA GAA TGC AGG TCC AAC TGC AGG AGA G 3'

Tabela 8: oligos para a clonaqem de hum.B-Gluc em sFv pUC19 oligo Hum.β-gluc. back (2562) 5' AAA AAA GTG. ATC AAA GCG TCT GGG CCA CAG GGC GGG ATC CTG TAC 3' oligo hum.p-Gluc for (2540) 5' TTT TAA GCT TCA AGT AAA CGG GCT GTT 3'

Tabela 9:

oligos para a clonaqem de sFv/hum-B-Gluc em pIXY120 oligo VHpIXY back (2587) de PCR

51 TTT TGG TAC CTT TGG ATA AAA GAC AGG TCC AAC TGC AGG AGA G 3' oligo VKpIXY for (2627) de PCR 5' A AAA CCA TGG GAA TTC AAG CTT CGA GCT GGT ACT ACA GGT 3' Tabela 10 oligos para a clonaqem de β-Gluc de E. coli em sFv pUC19 β-gluc. for (2639) de E. coli 32 5' ΤΤΤ ΤΑΑ GCT TCC ATG GCG GCC GCT CAT TGT TTG CCT CCC TGC TG 3' β-Gluc. back (2638) de Ε. coli 5' ΑΑΑ AAG ATC TCC GCG TCT GGC GGG CCA CAG TTA CGT GTA GAA ACC CCA 3'

Tabela 11:

oligos para a clonaqem de sFv/B-lactamase em pIXY120 oligo VHpIXY back (2587) de PCR 51 TTT TGG TAC CTT TGG ATA AAA GAC AGG TCC AAC TGC AGG AGA G 3'

oligo νΚρΙΧΥ/β-lactamase for (2669) de PCR 5' AAA AAG CTT AGA TCT CCA GCT TGG TCC C 3'

oligo link/^-lactamase back (2673) de PCR 5' AAA GAA TTC TGA TCA AAT CCT CGA GCT CAG GTT CAC AAA AGG TAG AGA AAA CAG T 3' ligante

oligo β-lactamase for (2674) de PCR 5' TTT AAG CTT ATT TTA ATA AAT CCA ATG T 3'

Lisboa, 30 de Maio de 2000

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

33

Claims (26)

1. j~v Ll ^^ REIVINDICAÇÕES 1. Composto que contém uma região de ligação a um antigénio, que está ligada pelo menos a uma enzima activadora de um pró-medicamento, caracterizado por a região de ligação ao antigénio consistir de uma única cadeia polipeptídica.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto ter ligado, de forma covalente, um hidrato de carbono.
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado por a região de ligação ao antigénio conter um domínio variável de uma cadeia pesada de anticorpo e um domínio variável de uma cadeia leve de anticorpo (fragmento sFv)
4. 4. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a região de ligação ao antigénio estar ligada a um antigénio associado a tumor (TAA)
5. 5. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o TAA ser N-CAM, PEM, EGF-R, sialilo-Lea, sialilo--Lex, TFP, GICA, GD3, GD2, TAG72, CA125, a glicoproteína de 24-25 kDa definida através de MAk L6 ou CEA, de preferência CEA.
6. 6. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a enzima ser uma lactamase, de preferência uma β-lactamase de Bacillus cereus II, piroglutamato-aminopeptidase, D-aminopeptidase, oxidase, peroxidase, fosfatase, hidroxinitrilase, protease, esterase, carboxipeptidase, de preferência uma carboxipeptidase G2 de Pseudomonas ou glicosidase. 1 y | ~ L-Cj ^-ξ».
7. 7. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a enzima ser uma β-glucoronidase, de preferência uma β-glucuronidase de E. coli, Kobayasia nipponica, Secale cereale ou humana.
8. 8. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por a região de ligação ao antigénio estar ligada à enzima por meio de um ligante peptídico.
9. 9. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a glicosilação ser realizada ou por meio de métodos químicos ou através da escolha de um sistema de expressão adequado.
10. 10. Composto de acordo com a reivindicação 1-9, caracterizado por ser expresso de forma secretória em Saccharomyces cerevisiae ou com vantagem em Hansenula polymorpha.
11. 11. Composto de acordo com a reivindicação 1-9, caracterizado por ser expresso em E. coli e em seguida glicosilado quimicamente, de preferência galactosilado e/ou manosilado.
12. 12. Composto de acordo com a reivindicação 1-9, caracterizado por a proteína de fusão sFv β-lactamase, que é expressa no periplasma de E. coli, ser glicosilada quimicamente, de preferência galactosilada e/ou manosilada.
13. 13. Composto de acordo com a reivindicação 1-9, caracterizado por a proteína de fusão sFv β-lactamase ser expressa de forma secretória em Saccharomyces cerevisiae ou Hansenula polymorpha.
14. 14. Ácido nucleico que codifica para um composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 8. 2 } fl· Lz ^—ç.
15. 15. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 14, que codifica para um fragmento sFv humanizado contra CEA e uma β-glucuronidase humana.
16. 16. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 14 com a sequência de acordo com a tabela 1.
17. 17. Vector que contém um ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações 14 a 16.
18. 18. Célula hospedeira que contém um ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações 14 a 16 ou um vector de acordo com a reivindicação 17.
19. 19. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por ser uma célula BHK-, CHO-, COS-, HeLa-, de insecto, de planta de tabaco, de levedura ou de E. coli.
20. 20. Animal mamífero transgénico, com excepção do homem, que contém um ADN de acordo com uma das reivindicações 14 a 16, ou um vector de acordo com a reivindicação 17.
21. 21. Processo para a produção de um composto de acordo com a reivindicação 1 a 8, caracterizado por a) um ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações 14 a 16 ou um vector de acordo com a reivindicação 17 ser inserido numa célula hospedeira, b) a célula hospedeira ser cultivada e c) o composto ser isolado.
22. 22. Processo para a produção de um composto de acordo com a reivindicação 1 a 8, caracterizado por a) se fazer a cultura de uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 18 ou 19 e b) o composto ser isolado. 3
23. 23. Utilização do composto de acordo com a reivindicação 1 a 13, para a produção de um medicamento ou meio de diagnóstico.
24. 24. Utilização do composto de acordo com a reivindicação 1 a 13, para a produção de um medicamento para o tratamento do cancro.
25. 25. Medicamento que contém um composto de acordo com a reivindicação 1 a 13.
26. 26. Meio de diagnóstico que contém um composto de acordo com a reivindicação 1 a 13. Lisboa, 30 de Maio de 2000 0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

    4