NO313884B1

NO313884B1 - Fusjonsproteiner for promedikament-aktivering

Info

Publication number: NO313884B1
Application number: NO19933520A
Authority: NO
Inventors: Mathias Gehrmann; Gerhard Seemann; Klaus Bosslet; Joerg Czech
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1992-10-02
Filing date: 1993-10-01
Publication date: 2002-12-16
Also published as: JPH06228195A; US20020068329A1; NZ248818A; UY23660A1; GR3033417T3; CA2107513C; IL107154A; PT590530E; DK0590530T3; CA2107513A1; ATE192193T1; EP0590530A2; NO933520D0; AU672431B2; ES2147189T3; KR100321012B1; DE59310018D1; US20060292139A1; EP0590530A3; ZA937299B

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører forbindelser som inneholder en antigenMndende region hvor det minst er bundet et enzym som kan metabolisere en ikke eller lite cytotoksisk forbindelse (promedikament) til en cytotoksisk forbindelse (medikament), hvor den antigenbindende regionen består av en eneste polypeptidkjede. På polypeptidkjeden befinner det seg fortrinnsvis kovalent bundede karbohydrater.

Kombinasjonen av promedikament og antistoff-enzym-konjugater for anvendelse som terapeutisk middel er allerede beskrevet i faglitteraturen. Her injiseres et antistoff rettet mot et bestemt vev i en organisme hvor det er bundet et promedikament-spaltende enzym og deretter administreres en enzym-aktiverbar promedikament-forbindelse. Under innvirkning av det på målvevet bundede antistoff-enzym-konjugatet skal promedikament-forbindelsen omdannes til en forbindelse som utøver en cytotoksisk virkning mot det bundede vevet. Derimot har det ved arbeidet med antistoff-enzym-konjugater vist seg at disse kjemiske konjugatene har en ugunstig farmakokinetikk slik at en stedsspesifikk tumorselektiv spaltning av promedikamentet bare foregår utilstrekkelig. Mange forfattere har forsøkt å løse denne åpenbare mangelen ved ytterligere injeksjon av et anti-enzym-antistoff som skal bevirke en hurtig eliminering av antistoff-enzym-konjugatet fra plasmaet (Sharma et al., Brit. J. Cancer, 61, 659, 1990). Et ytterligere problem med antistoff-enzym-konjugater er den begrensede muligheten til reproduserbart og homogent å fremstille store mengder.

Gjenstand for foreliggende oppfinnelse var derfor å finne fusjonsproteiner som kunne bli fremstilt i en stor teknisk målestokk og som på grunn av deres farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaper kan være egnet for terapeutiske anvendelser.

Det ble oppdaget at forbindelser som inneholder en antigenbindende region som består av en enkelt polypeptidkjede, for fremstilling og anvendelse av fusjonsproteiner som fordelaktig er utstyrt med karbohydrater, har uventede fordeler ved promedikament-aktivering.

Gjenstand for oppfinnelsen er dermed forbindelser som inneholder en antigenbindende region, hvor det minst er bundet et enzym, i det den antigenbindende regionen består av en enkelt polypeptidkjede og fusjonsproteinet er fordelaktig utstyrt med karbohydrater.

Med antigenbindende region forstår man i foreliggende oppfinnelse en region som minst inneholder to variable domener av et antistoff, fortrinnsvis en variabel domene av en tung antistof fkjede og en variabel domene av en lett antistoffkjede (sFv-fragment). Den antigenbindende regionen kan også være oppbygget bi- eller multivalent, dvs. ha to eller flere bindingsregioner som eksempelvis beskrevet i EP-A-0 404 097. Spesielt foretrukket er derimot et humant eller humanisert sFv-fragment, spesielt et humanisert sFv-fragment.

Fortrinnsvis bindes den antigenbindende regionen til et tumorassosiert antigen (TAA), hvor spesielt følgende TAA er f oretrukket:

neuralt celleadhesjonsmolekyl (N-CAM),

polymorfisk epithelisk mucin (PEM),

epidermal vekstfaktorreseptor (EGF-R),

Thomson Frieden reich antigen p (TFp),

gastrointestinal tract carcinoma antigen (GICA),

gangliosid GD3(GD3),

gangliosid GD2(GD2),

Sialyl-Le<a>, Silalyl-Lex,

TAG72,

det med MAk L6 definerte glykoproteinet med 24-25 KDa,

CA 125 og fremfor alt carcinoembryonisk antigen (CEA).

Som enzym er de enzymer foretrukket som kan metabolisere en ikke eller lite cytotoksisk forbindelse til en cytotoksisk forbindelse. Eksempler er p<->lactamase, pyroglutamat-aminopeptidase, galactosidase eller D-aminopeptidase som for eksempel beskrevet i EP-A2-0 382 411 eller EP-A2 0 392 745, en oksydase som for eksempel etanoloksydase, galaktose-oksydase, D-aminosyreoksydase eller a-Gly-ceryl-fosfat-oksidase, som for eksempel beskrevet i WO 91/00108, en peroksidase ifølge for eksempel AP-A2 0 361 908, en fosfatase, som for eksempel beskrevet i EP-A1 0 302 473, en hydroksynitrillyase eller glukosidase ifølge for eksempel WO 91/11201, en karboksypeptidase, som for eksempel karboksypeptidase G2 (W0 88/07378), en amidase, som for eksempel penicillin-5-amidase (Kerr, D. E. et al. Cancer Immunol. Immunther. 1990, 31) en protease, esterase eller glycosidase, som allerede nevnt (Galactosidase, glucosidase eller en glucuronidase, som for eksempel beskrevet i WO 91/08770. Foretrukket er en p<->glucuronidase, fortrinnsvis fra Kobayasya nipponica eller Secale cereale og spesielt foretrukket fra E. coli eller en human p<->glucuronidase. Substratene til enkeltenzymene er angitt i de nevnte beskyttelsene og hører også til i foreliggende søknad som beskrivelser. Foretrukne substrater til p<->glucuronidase er N-(D-glycopyranosyl )-benzyloksykarbonyl-anthrasyklin og spesielt N-(4hydroksy-3-nitro-benzyloksykarbonyl)-doksorubicin for eksempel dauno-rubicin-p-D-glucuronid (J.C. Florent et al. (1992) Int. CArbohydr. Symp. Paris, A262, 297 eller S. Andrianomen-janahary et al. ( 1992 ) Int. Carbohydr. Symp. Paris, A 264, 299 ).

En ytterligere gjenstand ifølge oppfinnelsen er nukleinsyrer som koder for forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Spesielt foretrukket er en nukleinsyre samt variantene og mutantene derav som koder for et humanisert sFv-f ragment mot CEA (carcinoembryonalt antigen) bundet med en human p<->glucuronidase (sFv-hu<p->Gluc), fortrinnsvis med sekvensen ifølge tabell 1.

Fremstillingen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen foregår generelt genteknisk og med for fagmannen generelt kjente fremgangsmåter, hvor den antigenbindende regionen kan være bundet med et eller flere enzymer enten direkte eller over en linker, fortrinnsvis en peptidlinker. Som peptidlinker kan eksempelvis anvendes en hengsel-region til et antistoff eller en hengsel-lignende aminosyresekvens. Enzymet er dermed bundet fortrinnsvis med dem N-termiale ende til den antigenbindende regionen direkte eller over en peptidlinker. Enzymet eller enzymene kan derimot også være kjemisk bundet til den antigenbindende regionen som for eksempel vist i WO 91/00108.

Nukleinsyren som koder for aminosyresekvensen til forbindelsene ifølge oppfinnelsen blir generelt klonet i en ekspressjonsvektor, innført i prokaryote eller eukaryote vertsceller, som for eksemper BHK- CHO-, COS-, HeLa-, insekt-, tobakkplante-, gjær- eller E. coli-celler og uttrykt. Forbindelsene fremstilt på denne måten kan til slutt bli isolert og anvendt som et diagnostisk eller terapeutisk middel. En ytterligere generelt kjent fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen ifølge oppfinnelsen er eks-press j onen av nukleinsyrene som koder for disse i transgene pattedyr med unntak av mennesker, fortrinnsvis i en transgen geit.

En ytterligere gjenstand ifølge oppfinnelsen er således en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsene ifølge oppfinnelsen og anvendelse av disse for fremstilling av et diagnostisk eller terapeutisk middel.

Nukleinsyretransformerte BHK-cellene ifølge oppfinnelsen uttrykker et fusjonsprotein (sFv-hu<p->Gluc), som både er spesifikt for CEA og har fullstendig p<->glucuronidase aktivitet (se eks. 5).

Dette fusjonsproteinet ble renset over anti-idiotype affinitetskromatografi tilsvarende metoden beskrevet i EP 0 501 215 A2 (eksempel M). Fusjonsproteinet renset på denne måten har under reduserende betingelser i SDS-PAGE en molekylvekt på 100 kDa og under ikke-reduserende betingelser fremkommer et molekyl på 100 henholdsvis 200 kDa. Gelkromatografi under native betingelser (TSK-3000 gelkromatografi) viser en protein-topp (eksp. 6, Abb. I) som er korrelert med aktivitetstoppen i spesifisitets enzym-aktivitetstesten (EP 0 501 215 A2). Posisjonen til toppen sammenlignet med standard-molekylvektsmarkører tyder på en molekylvekt på~200 kDa. Dette funnet ble suggerert med dataene fra SDS-PAGE til at det funksjonelle, enzymatisk aktive sFv-hu<p->Gluc fusjonsproteinet foreligger som "bio-valent molekyl", dvs. med to bindingsregioner og to enzymmolekyler. Forsøk som ikke er beskrevet her tyder på at fusjonsproteinet under bestemte dyrkningsbetingelser også kan foreligge som tetramer med fire binderegioner og fire enzymmolekyler. Etter at sFv-hu<p->Gluc-fusjonsproteinet var blitt renset og in vitro funksjoneltkarakterisertble farmakokinetikken og tumorlokalisasjonen av fusjonsproteinet bestemt i nakne mus og som var påført menneskelige mage-carcinomer. Mengden av funksjonelt aktivt fusjonsprotein ble bestemt i orgnanene samt tumoren til bestemte tidspunkter etter adekvat opparbeiding av organene (eksempel 7) samt immunologisk bestemmelse (trippel-determinant-test, eksempel 8). Resultatene til et representativt forsøk er vist i tabell 4.

Det er overraskende at det allerede etter 48 timer oppnås et tumor/plasma forhold på 5/1. Ved senere tidspunkter blir dette forholdet enda mer gunstig og oppnår verdier > 200/1 (dag 5). Årsaken til dette gunstige farmakokinetiske forholdet til sFv-hug-Gluc-fusjonsproteinene er at fusjonsproteiner som ikke er bundet til tumorer hovedsakelig over reseptor for mannose-6-fosfat og galaktose blir fjernet ved internalisering fra plasma og normalvev. (Dette utsagnet er underbygget ved at de p<->glucurohidaseverdiene økes intra-cellulært, for eksempel i leveren.

Som vist i tabell 5 underholder sFv-hug-Gluc større mengder galaktose og fremfor alt mannose som hovedsakelig er ansvarlig for kobling til reseptorene. Det på denne måten oppståtte fusjonsprotein-reseptor-komplekset dannet ved binding av fusjonsproteinenes karbohydratrester blir deretter fjernet gjennom internalisering av det ekstracellulære: rommet.

Denne hurtige interalisasjonsmekanismen hovedsakelig formidlet via galaktose og mannose er bestemmende for den fordelaktige farmakokinetikken til fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen. Denne fordelaktige farmakokinetikken til de med galaktose- og fremfor alt mannoseutstyrte fusjonsproteiner muliggjør i.v. applikasjon av et ekstracellulært distribuert, hydrofilt promedikament til et realtivt tidligere tidspunkt uten å kreve en uspesifikk promedikament aktivering. Her er et elimineringstrinn som beskrevet av Sharma et al. (Brit. J. CAncer, 61, 659, 1990) ikke nødvendig. Basert på dataene ifølge tabell 4 er injeksjonen av et egnet promedikament (S. Adrlanomenjanahari et al. 1992, Int. Carbohydrate Symp., Parts A264, 299) allerede mulig 3 dager etter injeksjon av sFv-hup-Gluc-fusjonsproteinet uten å frembringe signifikante bivirkninger (data ikke vist).

En lignende fordelaktig karbohydrat-besetning på fusjonsproteiner er for eksempel også å oppnå gjennom sekretorisk ekspressjon av sFv-huP-Gluc-fusjonsproteiner i bestemte gjærstammer som saccharomyces cerevisiae eller Hansenula polymorfa. Disse organismene er i stand til å mannosylere meget virkningsfullt fusjonsproteinet som har de tilsvarende N-glykosyleringsstedene (Goochee et al., Biotechnology, 9, 1347-1354, 1991). Slike sekretoriske gjærcelleuttrykte fusjonsproteiner utviser en høy mannosyleringsgrad og en i BHK-celler uttrykt sFv-hu<p->Gluc-fusjonsprotein sammenlignbar gunstig farmakokinetikk (data ikke vist). Her blir nærværet av galaktose utjevnet ved den enda høyere mannosylerings-graden til fusjonsproteinet (tabell 6). Ovenfor beskrevne sFv-hu<p->Gluc-fusjonsproteinet ble som beskrevet nærmere i eksempel 9 konstruert genteknisk og uttrykt i gjær.

I stedenfor human p<->glucuronidase kan man derimot også tilsette en annen glucuronidase med fordelaktige egenskaper. Eksempelvis har E. coli p-glucuronidase spesielt den fordelen at den katalytiske aktiviteten ved pH 7,4 er signifikant høyere enn den til human p<->glucuronidase. I eksempel 10 ble ved hjelp av gentekniske metoder fremstilt en sFv-E.coli P-Gluc-konstruksjon og uttrykt sekretorisk i saccharomyces cerevisiae som funksjonelt aktivt mannosylert fusjonsprotein. De farmakokinetiske dataene er sammenlignbare med de til sFv-hu<p->Gluc-molekylet som ble uttrykt i gjær henholdsvis i BHK-celler (tabell 4).

Glucuronidasene fra soppen Kobayasia nipponica og fra planten Secale cereale har for eksempel den fordelen at de også er aktive som monomerer. I eksempel 11 er det ved hjelp av gentekniske metoder fremstilt en konstruksjon som etter ekspressjon i saccharomyces cerevisiae utskiller et sFv-B.cereus p<->laktamase II-fusjonsprotein i fortrinnsvis monosylert form.

Dette fusjonsproteinet har likeledes, som fusjonsproteinene ifølge<oppf>innelsen, en farmakokinetikk gunstig for promedikamentaktivering på basis av p-glucuronidase. (tabéll 4)

Videre kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse ikke bare anvendes i kombinasjon med et promedikament, men også innenfor rammen av kjemoterapi, hvor de som glucuronid-metaboliserte og dermed inaktiverte cytostatika gjennom de appliserte forbindelsene igjen kan bli omdannet til deres toksiske form.

Eksemplene nedenfor beskriver den gentekniske syntesen av cFv-hup-Gluc-fusjonsproteiner samt bevis for funksjonalitet.

Utgangsmaterialet var plasmidene pABstop 431/26 hum Vg og pABstop 431/26 hum VHl. Disse plasmidene inneholder den humaniserte versjonen av vjj-henholdsvis v^-genet til anti CEA MAK BW 431/26 (Giissoow og Seemann, 1991, Meth. Enzymology, 203, 99-121). Som ytterligere utgangsmateriale anvendes plasmidet pABstop 431/26 VH-hu<p->Gluc 1H (EP-A2-0 501 215) som inneholder en Vg-Exon, inkludert Vg-egen signalsekvens, etterfulgt av et CHl-Exon, Hinge-Exon til et humant IgG3 C-gen og fullstendig cDNA til human p<->glucuronidase.

Eksempel 1:

Amplifikasjon av Vg og VLgenet til MAk hum 431/26

Med oligonukleotidene pAB-Back og Linker-Anti (tab. 2)

blir det fra pABstop 431Vg hum amplifisert ut Vg genet inklusivt Vg-gen egen signalsekvens (Vg 431/26) (Giissow og Seemann, 1991, Meth. Enzymology, 203, 99-121). Med oligonukleotidene linker-sens og Vl(mu-(- )-For (tab. 3) blir det fra pABstop 431VLhum amplifisert ut VL-genet (VL431/26).

Eksempel 2:

Kobling av Vg 431/26 og V^431/26 genfragmentenene 01igonukleotidene linker-anti og linker-sens er delvis komplementære i forhold til hverandre og koder for en polypeptid-linker som skal koble Vg- og Vj^-domenene til et sFv-fragment. For å fusjonere de amplifiserte Vg- med Vl~fragmentene blir de renset og tilsatt i en 10 syklusreaksjon som følger: Taq-polymerase (perkin-Elmer Corp., Emeryville, CA)

PCR-buffer (10x): lOOmM Tris, pH8,3, 500 mM KC1, 15 mM MgCl2, 0,1% (v/v) gelatin.

Overflaten til reaksjonsblandingen blir forseglet med parafin og deretter blir 10 syklus reaksjonen gjennomført i en PCR-apparatur med programmet 94°C, 1 min, 55°C, 1 min, 72°C, 2 min. Deretter blir det tilsatt 2,5 pM av den flankerende primeren pAB-Back og VL(Mu-f- )-For og ytterligere 20 sykluser blir gjennomført. Man opptår et PCR-fragment som består av Vg-genet som over en linker er koblet til Vj^-genet. Foran Vg-genet befinner det seg fortsatt egne Vg-gen signal sekvensen. Gjennom oligonukleotidet Vl(Mut)~For blir samtidig den siste nukleotidbasen til Vågenet, et C, utbyttet med en G. Dette PCR-fragmentet koder for en humanisert enkelt-kjede-Fv (sFv 431/26 ).

Eksempel 3:

Kloning av sFv 431/26 fragmentet i ekspressjonsvektoren som inneholder hu<p->glucuronidasegenet. sFv-fragmentet fra (2) blir spaltet med Hindlll og BamHI og ligert i den med Hindlll fullstendige og med Bglll delvis spaltede vektoren pAB 431Vg hum/CHl + lh/<p>Glc. Vektoren pABstop 431/26VghupGluclH inneholder en Vg-exon, inkludert Vg-egen signal sekvens, etterfulgt av CHl-Exon, Hinge-Exonet til et humant IgG3 C-gen og fullstendig cDNA til human P-glucuronidase. Plasmidklon pMCG-El blir isolert og som inneholder humanisert sFv 431/26, et Hinge-Exon og genet for human p<->glucuronidase (pMCG-El).

Eksempel 4:

Ekspressjon av sFv-hu<p->Gluc fusjonsproteinet i BHK celler.

Klon pMCG-El blir transformert i BHK-celler sammen med plasmid pRMH 140 som inneholder et neomycin-resistensgen og plasmidet pSV2 som inneholder et Methotrexat-resistens gen. Fra BHK-celler blir et fusjonsprotein utpreget som både har antigenbindingsegenskapen til MAK BW 321/26hum og den enzymatiske aktiviteten til human e-glucuronidase.

Eksempel 5:

Bevis for antigen bindingsegenskapene og den enzymatiske aktiviteten til sFv-hup-Gluc fusjonsproteiner.

Evnen som sFv-hu<p->Gluc fusjonsproteinet har til spesifikt å bli bundet til CEA av den 431/26 definerte epitopen og samtidig å utøve den enzymatiske aktiviteten til human P-glucuronidase ble vist i en spesifisitets-enzymaktivitetstest (EP-A2-0501215 ). Testen bestemmer frigjøring av 4-metyl-umbelliferon fra 4-metyl-umbelliferyl-P-glucuronid gjenom P-glucuronidase andelen til fusjonsproteinet etter at fusjonsproteinet er bundet over sFv-andelen på et antigen. De oppnådde fluorescensverdiene blir angitt som relative fluorescensenheter (FE). Testen viser en signifikant metyl-umbelliferonfrigjøring gjennom fusjonsproteinet i de med CEA utsådde platene. Derimot blir det gjennom fusjonsproteinet ikke frigjort metyl-umbelliferon med PEM (polymorfisk epithelial mucin) belagte kontrollplater.

Eksempel 6:

TSK-3000 gelkromatografi

Fra de over anti-idiotype affinitetskromatografi rensede sFv-hu<p->Gluc fusjonsproteiner ble 200 ng i 25 jjI kromatografert på en TSK gel G 3000 SW XL kolonne (T0S0 HAAS best.nr. 3,5Wx N3211, 7,8 mm x 300 mm) i et egnet løpemiddel (PBS, pH 7,2, inneholdende 5 g/l maltose og 4,2 g/l arginin) med en strømningsrate på 0,5 ml/min. Merck Hitachi HPLC-apparaturen (L-4000 UV-detektor, L-6210 intelligentpumpe, D-2500 kromato-integrator) ble drevet med~20 bar, optisk tetthet til eluatet ble bestemt ved 280 nm og ved hjelp av en LKB 2111 Multisac fraksjonssamler ble 0,5 ml fraksjoner oppsamlet og som deretter ble analysert i spesifisitetsenzymaktivitets-testen (SEAT= (EP 0501215 A2, eksempel J). Resultatet fra dette eksperimentet er vist i Abb. 1. Det fremgår klart at posisjonen til de gjennom optisk tetthetsmåling ved 280 nm detekterbare toppene stemmer overens med toppen som bestemmer spesifisiteten og enzymaktiviteten (SEAT) til eluatet. Basert på de ved hjelp av piler angitte molekylvektsposisjonene til standardproteinene fremgår det at det funksjonelt aktive sFv-hup-Gluc fusjonsproteinet under native betingelser har en omtrentlig molekylvekt på~200 kDa.

Eksempel 7:

Opparbeiding av organisk/tumorer for fusjonsprotein-bestemmelse

Følgende sekvensielle trinn ble utført:

med fusjonsprotein henholdsvis antistoff enzymkonjugat behandlede nakne mus (CD1) som har en subkutan tumor blir

retroorbital blodtappet og deretter drept

blodet blir med en gang ført inn i et Eppendorfrør hvor det allerede befinner seg 10 pl Liquemin 25000 (Fa.

Hoffman-LaRoche AG)

deretter blir det i 10 min. sentrifugert ved 2500 U/min. i

en sentrifuge (Megafuge 1,0, Fa. Heraeus)

deretter blir plasmaet isolert og frosset frem til testing organene henholdsvis tumorene blir tatt ut og veid deretter blir dette fullstendige homogenisert med 2 ml %

BSA i PBS, pH 7,2

tumorhomogenatene blir innstilt på pH 4,2 med 0,1 N HC1

(proben må ikke bli overtitrert i det p<->glucuronidase blir

inaktivert ved pH < 3,7)

alle homogenatene blir sentrifugert i 30 min. ved 16000 g den klare supernatanten blir tatt ut

tumorsupernatantene blir nøtralisert med 0,1 N NaOH supernatantene og plasma kan nå bli kvantifisert i immunologiske tester.

Eksempel 8:

Trippel-determinant-test

Testingen foregår som følger:

til hvert hull i en mikrotitreringsplate (Polystyrol U- form, Typ B, Fa. Nunc, Best.Nr. 4-60445) blir det tilsatt 75 pl av en med 2 pg/ml i PBS, pH 7,2, fortynnet muse-anti-hue-Gluc antistoff (MAk 2118/157 Behringwerke)

mikrotitreringsskålen blir deretter avdekket og inkubert

ved R.T. over natt

til slutt blir mikrotitreringsskålen vasket 3x med 250 pl

0,05 M Tris-sitrat-buffer, pH 7,4, pr. hull

disse mikrotitreringsskålene blir deretter inkubert med 250 pl blokkoppløsning ( 1% casein i PBS, pH 7,2) i hvert hull i 30' (blokkering av uspesifikke bindingsseter) ikke nødvendig belagte mikrotitreringsskåler blir tørket i 24 timer ved R.T. og deretter tilsatt sammen med tørkpatroner

for langtidslagring i belagt aluminiumspose)

i løpet av blokkeringen blir i en ubehandlet 96 hull U-bundet mikrotiterskål (Polystyrol, Fa. Renner, best.nr. 12058) 10 prober + 2 positive kontroller + 1 negativ kontroll fortynnet i 1% casein i PBS, pH 7,2, 1:2 i 8 trinn (utgående fra 150 pl probe blir 70 pl probe

pipettert i 75 pl casein mengde osv.)

blokkløsningen blir sugd fra den med anti-hu<p->Gluc antistoffbelagte mikrotitreringsskålen 50 pl av den fortynnede proben blir pr. hull i fortynningsskålen overført til testskålen og inkubert ved R.T. i 30

minutter.

i løpet av probeinkubasjonen blir ABC-AP reagenset (Fa.

Vectastain, best.nr. AK-5000) tilsatt: 2 dråper reagens A (Avidin DH) i 10 ml 1% casein i pBS, pH 7,2, blandet godt og 2 dråper reagens B (biotinylert alkalisk fosfatase) tilsatt og blandet godt. (ABC-AP oppløsningen må tilsettes minst 30' før bruk.

Testskålen blir vasket 3 ganger med ELISA vaskebuffer

(Behringwerke, best.nr. OSEW 96)

pr. lokk blir det tilsatt 50 pl Biotinmerket bevis-antistoffblanding (1+1 blanding fra muse anti 431/26 antistoff (MAk 2064/353, Behringwerke) og muse anti CEA antistoff (MAK 250/183, Behringwerke) med en konsentrasjon på 5 pg/ml fortynnet i 1% casein i PBS, pH 7,2, slutt-konsentrasjon 2,5 pg/ml pr. antistoff)

testskålen blir vasket 3 ganger med ELISA vaskebuffer pr. hull blir det tilsatt 50 pl av den forberedede ABC-AP

oppløsningen og inkubert i 30 minutter ved R.T.

I løpet av ABC-AP inkubasjonen blir substratet tilsatt (for hver test frisk substrat: 1 mM 4-metylumbelliferyl-fosfat, best.nr. M-8883, Fa. Sigma, i 0,5 M Tris + 0,01 #

MgCl, pH 9,6).

Testskålen blir vasket 7 ganger med ELISA vaskebuffer Pr. hull blir det tilsatt 50 pl substrat, testskålen blir

tildekket og inkubert i 2 timer ved 37°C

Deretter blir det til hvert hull tilsatt 150 pl stopp-oppløsning (0,2 M glycin +0,2% SDS, pH 11,7)

den fluorometrikse vurderingen foregår i fluoroscan II

(ICN Biomedicals, kat.nr. 78-611-00) ved en stimulerings-bølgelengde på 355 nm under en utstrålingsbølgelengde op

460 nm

ved hjelp av fluorescensverdiene og de i det identiske eksperimentet medfølgende positive kontroller (for-tynningsrekke med renset sFv-hu<g->GLuc blandet med CEA 5 pg/ml som målekurve) blir den ukjente konsentrasjonen til fusjonsproteinet i proben bestemt.

Eksempel 9:

Ekspressjon av sFv-hup-glucuronidase fusjonsproteiner i gjær.

Enkelt-kjede-Fv (sFv) fra eksempel 2 blir amplifisert med oligoene 2577 og 2561 (tabell 7) og klonet i den med Xbal/Hindlll splatede pUC19 vektoren (Abb. 2).

Det humane p<->glucuronidasegenet blir amplifisert med oligoene 2562 og 2540 (tabell 8) fra plasmid pAB 431/26 VHhum/CHl + lH/hu<p->Gluc (eksempel 3) og ligert (Abb. 3) i det med Bgll/Hindlll spaltede plasmidet sFv 431/26 i pUC19 (Abb. 2).

En Kpnl/NcoI-fragment blir amplifisert med oligonene 2587 og 2627 (tabell 9) fra sFv 431/26 og klonet i den med Kpnl/Ncol spaltede gjær-ekspressjonsvektoren pIX 120 (Abb. 4).

Det BstEII/Hindlll fragmentet fra plasmid sFv 431/26 hu<p->Gluc i pUC19 (Abb. 3) blir ligert i den med BstEII/del Hindlll spaltede vektoren pIX 120 som inneholder Vg-genet, linkeren samt en del av VL-genet (VH/link/VKpart. i pIXY 120) (Abb. 5).

Det dannede plasmidet sFv 431/26 hu<p->Gluc i pIX 120 blir transformert i Saccharomyces cerevisiae og fusjonsproteinet blir utpreget.

Eksempel 10:

Ekspressjon av sFv-E. coli-p-Glucuronidase fusjonsproteinet i gjær.

E. coli p<->Glucuronidasegenet blir amplifisert fra pRAJ 25 (Jefferson et al. Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 83: 8447-8451, 1986) med oligoene 2638 og 2369 (tabell 10) og ligert i den med Bglll/Hindlll spaltede sFv 431/26 i pUC19 (eksempel 9, Abb. 2) (Abb. 6).

Et BstEII/Hindlll fragment fra sFv 431/26 E. coli (3-Gluc i pUC19 blir klonet (Abb. 7) i den med BstEII/Hindlll del-fordøyde vektoren Vg/1ink/Vgpart. i pIX 120 (eksempel 9, Abb. 4).

Plasmidet sFv 431/26 E. coli p-Gluc i pIX 120 blir transformert i Saccharomyces cerevisiae og fusjonsproteinet blir utpreget.

Eksempel 11:

Ekspressjon av sFv-p<->lactamase fusjonsproteinet i gjær.

Enkel-kjede-Fv (sFv) fra eksempel 2 blir amplifisert med oligoene 2587 og 2669 (tabell 11) og ligert i den med KpNI/Hindlll spaltede pUC19 vektoren (Abb. 8).

Det p<->lacyamase II genet (Hussain et al., J. Bacteriol. 164: 223-229, 1985) blir amplifisert med oligoene 2673 og 2674 (tabell 11) fra total-DNA fra Bacillus cereus og ligert i den med EcoRI/Hindlll spaltede pUC19 vektoren (Abb. 9). Et Bcll/Hindlll fragment av p<->lactamasegenet blir ligert i den med Bglll/Hindlll spaltede sFv 431/26 i pUC19 (Abb. 10).

Det Kpnl/Hindlll sFv-p-lactamase fragmentet blir ligert med Kpnl/del Hindlll spaltet pIXY 120 (Abb. 11). Plasmidet blir transformert i Saccharomyces cerevisiae og danner et fusjonsprotein som har antigenbindingsegenskapene til MAk 431/26 og den enzymatiske aktiviteten til e-lactamase fra bacillus cereus.

Claims

1. Forbindelse, inneholdende en antigenbindende region hvor det minst er bundet et promedikament-aktiverende enzym,karakterisert vedat den antigenbindende regionen består av en eneste polypeptidkjede.

2. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisertved at forbindelsen bærer kovalent bundede karbohydrater .

Forbindelse ifølge krav 1 og 2,karakterisertved at den antigenbindende regionen inneholder en variabel domene fra en tung antistoffkjede og en variabel domene fra en lett antistoffkjede (sFv-fragment).

4 . Forbindelse ifølge et av kravene 1 eller 2,karakterisert vedat den antigenbindende regionen har bundet til et tumor-assosiert antigen (TAA).

5. Forbindelse ifølge krav 3,karakterisertved at TAA er en N-CAM, PEM, EGF-R, sialyl-Le<a>, sialyl-Lex, TF<p>, CICA, GD3, GD2, TAG72, CA125, som gjennom MAk L6 definert 24-25 kDA glykoprotein eller CEA fortrinnsvis er CEA.

6. Forbindelse ifølge et av kravene 1 til 5,karakterisert vedat enzymet er en lactamase, fortrinnsvis en Bacillus cereus II B-lactamse, pyroglutamat-aminopeptidase, D-aminopeptidase, oksidase, peroksidase, fosfatase, hydroksynitrillyase, protease, esterase, karboksy peptidase, fortrinnsvis en karboksypeptidase G2 fra pseudo-monas eller glycosidase.

7 . Forbindelse ifølge krav 6,karakterisertved at enzymet er en p<->glucuronidase, fortrinnsvis en E. coli, Kobayasia nipponica, Secale cereale eller human p-glucuronidase.

8. Forbindelse ifølge et av kravene 1 til 7,karakterisert vedat den antigenbindende regionen er forbundet over en peptidlinker med enzymet.

9 . Forbindelse ifølge et av kravene 1 til 8,karakterisert vedat glycosyleringen foregår enten ved hjelp av kjemiske metoder eller ved valg av egnede ekspressjons-systemer.

10. Forbindelse ifølge kravene 1-9,karakterisertved at de blir uttrykt sekretorisk saccharomyces cerevisiae henholdsvis fortrinnsvis i Hansenula polymorfa.

11. Forbindelse ifølge krav 1-9,karakterisertved at de blir uttrykt i E. coli og deretter kjemisk glycosylert, fortrinnsvis galaktosylert og/eller mannosylert.

12. Forbindelse ifølge krav 1-9,karakterisertved at sFv-p<->lactamase-fusjonsproteinet, som uttrykkes periplasmatisk i E.coli, blir kjemisk glycosylert, fortrinnsvis galactosylert og/eller mannosylert.

13. Forbindelse ifølge kravene 1-9,karakterisertved at sFv-p<->lactamse fusjonsproteinet blir uttrykt sekretorisk i saccharomyces cerevisiae henholdsvis Hansenula polymorfa.

14. Nukleinsyre,karakterisert vedat den koder for en forbindelse ifølge et av kravene 1 til 8.

15 . Nukleinsyre ifølge 14,karakterisert vedat den koder for et humanisert sFv-fragment mot CEA og en human p<->glucuronidase.

16. Nukleinsyre ifølge krav 14,karakterisertved at den har sekvensen ifølge tab. 1.

17 . Vektor,karakterisert vedat den inneholder en nukleinsyre ifølge et av kravene 14 til 16.

18. Vertscelle,karakterisert vedat den inneholder en nukleinsyre ifølge et av kravene 14 til 16 eller en vektor ifølge krav 17.

19. Vertscelle ifølge krav 18,karakterisertved at den er en BHK-, CHO-, COS-, HeLa-, insekt-, tobakkplante-, gjær- eller E. coli-celle.

20. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge krav 1 til 8,karakterisert vedat a) en nukleinsyre ifølge et av kravene 14 til 16 eller en vektor ifølge krav 17 blir bragt inn i en vertscelle, b) vertscellen blir dyrket og c) forbindelsen blir isolert.

21. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge krav 1 til 8,karakterisert vedat a) en vertscelle ifølge krav 18 eller 19 dyrkes og b) forbindelsen blir isolert.

22. Anvendelse av forbindelsen ifølge kravene 1 til 13 for fremstilling av et legemiddel eller et diagnostisk middel.

23. Anvendelse av forbindelsen ifølge kravene 1 til 13 for fremstilling av et legemiddel for behandling av kreft.

24 . Legemiddel,karakterisert vedat det inneholder en forbindelse ifølge kravene 1 til 13.

25 . Diagnostikum,karakterisert vedat det inneholder en forbindelse ifølge kravene 1 til 13.