PT3000324T

PT3000324T - Massas para bolos melhoradas

Info

Publication number: PT3000324T
Application number: PT151873080T
Authority: PT
Inventors: Van Haesendonck Ingrid; Østdal Henrik; Nguyen Fanny; Van Der Biest Goedele
Original assignee: Puratos Nv
Priority date: 2014-09-29
Filing date: 2015-09-29
Publication date: 2017-03-31
Also published as: PL3000324T3; EP3000324A1; MX2017003633A; US10631547B2; AU2015327021B2; US20170280733A1; WO2016050746A1; AU2015327021A1; BE1022042B1; DK3000324T3; CA2959938A1; ES2622442T3; EP3000324B1; CA2959938C

Description

DESCRIÇÃO "MASSAS PARA BOLOS MELHORADAS"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A invenção diz respeito a novo métodos de produzir bolos com melhores parâmetros de textura e melhor sensação na boca.

ESTADO DA TÉCNICA ANTERIOR À INVENÇÃO

Os bolos são produtos cozinhados baseados em massas que são preparados com três ingredientes principais presentes em diferentes razões consoante o tipo de bolo: farinha, açúcar e ovos (ovos inteiros e/ou clara de ovo e/ou gema de ovo) . Podem ser ingredientes adicionais por exemplo gorduras e/ou lípidos, agentes fermentantes, emulsionantes, proteínas de leite, hidrocolóides, amido (nativo, quimicamente ou fisicamente modificado), cacau em pó, chocolate, agentes corantes, sabores, etc. Os bolos podem ser fermentados devido à adição de ingredientes (por exemplo fermento em pó, ovo, emulsionante, proteína,...) e/ou devido ao processo de preparação do bolo (por exemplo modo de bater a massa) . São tipos de bolos habituais os bolos enformados, os bolos com natas, os pudins, os bolos esponjosos, os biscoitos, as rosquinhas, as bolachas com chocolate, etc. 0 envelhecimento dos bolos é um fenómeno que acontece durante a armazenagem. Este fenómeno também é referido como endurecimento ou perda de frescura, e é uma combinação da deterioração dos diferentes parâmetros de textura do bolo entre os quais a perda da suavidade, a perda da humidade, a perda da coesividade, um aumento da gomosidade e uma perda da resiliência. A suavidade de um bolo é a sensação relacionada com a força que é necessária para comprimir e morder o corpo do bolo. A humidade do bolo é a sensação de humidade (oposta à secura) que se tem quando se toca e se come o bolo. Tocar num bolo húmido com os lábios e/ou com as mãos proporciona uma sensação mais fria nos lábios e/ou a que se compara com a de um bolo seco. Na boca, sente-se um bolo húmido como sendo húmido e suculento. Quando se come um bolo húmido, não existe nenhuma sensação de que ele esteja a absorver água de dentro da boca. A suavidade e a humidade dos bolos são parâmetros diferentes. Por exemplo, os bolos esponjosos tradicionais são muito suaves, embora sejam apercebidos como não sendo húmidos (muito secos). Por outro lado, alguns biscoitos podem dar uma sensação de serem muito húmidos e, no entanto, serem duros e densos. A migração de humidade do interior para a crosta e a retrogradação da amilopectina são identificadas como as causas principais do endurecimento dos bolos e da secagem dos bolos durante a armazenagem.

Foram propostas diversas soluções para tornar mais lenta a evolução negativa da textura dos bolos durante uma armazenagem prolongada. Entre estes tipos especiais de emulsionantes, gorduras, açúcares, gomas e hidrocolóides. Também se descreveram enzimas tais como as alfa-amilases. Aa amilases hidrolisam a fracção de amido no bolo e diminuem a retrogradação da amilopectina durante a armazenagem. No entanto, uma hidrólise extensa demais do amido utilizando amilases não especificas ou agressivas demais pode influenciar negativamente o volume e a forma do bolo resultando, por exemplo, no colapso do bolo e/ou num bolo com propriedades de textura inferiores. 0 WO 2006/032.281 descreve o efeito de manter a frescura no bolo de uma alfa-amilase maltogénica activa a concentrações elevadas de açúcar. Além disto, tentaram-se métodos de produzir bolos em que a massa do bolo inclui um enzima lipolitico e uma amilase, para não endurecer, tal como é descrito por exemplo no WO 2013/160.370. Todos estes enzimas ou combinações de enzimas têm principalmente um efeito sobre a suavidade dos bolos. Tentativas de aumentar ainda mais a frescura por adição de maiores quantidades de enzimas levaram a bolos com uma tendência para serem apercebidos como mais mastigáveis ou duros. Além disto, para produtos de panificação foram adicionados diferentes tipos de enzimas para tentar aumentar a suavidade dos produtos de panificação. No entanto, existe uma diferença importante entre as receitas de produtos de panificação e receitas de produtos para bolos. As massas de panificação são tipicamente fermentadas com leveduras (e podem compreender ovos, açúcar e/ou gordura em pequenas quantidades) ou ser quimicamente fermentados (tipicamente com compreendendo ovos, açúcar e/ou gordura), enquanto as massas para bolos incluem ovos, açúcar e gordura em maiores quantidades e compreendem opcionalmente agentes de fermentação químicos. Devido às diferenças de receitas e aos processos químicos, entre massas para panificação e massas para bolos, os efeitos obtidos com receitas de massas de panificação não são em geral válidos para receitas de massas para bolos.

Hoje em dia os consumidores procuram bolos com uma melhor frescura e/ou uma frescura prolongada, que tenham em simultâneo uma melhor textura ou pelo menos propriedades de textura conservada/mantida (coesividade e resiliência) para resistir a manipulações e embalagem, corte e decoração. Existe, portanto, uma necessidade de novas e melhores receitas para bolos. A invenção presente resolve os problemas indicados acima proporcionando produtos para bolos com frescura melhor e/ou prolongada, enquanto vão mantendo a qualidade e as propriedades organolépticas do produto em bolos, incluindo a textura.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

Num primeiro objeto da invenção presente proporciona-se um método para preparar uma massa para bolos ou um produto de bolos preparado da massa, compreendendo adicionar-se por uma ordem qualquer um ou mais alfa-amilases que degradem amido cru, uma ou mais fosfolipases, e opcionalmente uma ou mais amilases contra o endurecimento, aos ingredientes da massa para bolos, e preparar-se a massa para bolos. Preferivelmente, a humidade do referido produto de bolos é melhorada, sendo a humidade determinada preferivelmente por um painel de peritos em bolos. Mais preferivelmente, a humidade do produto de bolos é melhorada em pelo menos 0,5 unidades quando é avaliada entre 1 e 9 e comparada com uma referência possuindo um valor fixo.

Numa concretização particular, a alfa-amilase que degrada amido cru é uma alfa-amilase com uma homologia de sequência de pelo menos 85 %, preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % com a SEQ ID NO 1.

Numa concretização específica, a fosfolipase é uma fosfolipase com uma homologia de sequência de pelo menos 85 %, preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 %, com a SEQ ID NO 2.

Numa concretização específica, a amílase contra o endurecimento mantém mais do que 20 % da sua actividade na presença de 10 % de sacarose. A invenção presente proporciona adicionalmente um método consoante a invenção no qual a massa para bolos ou o produto de bolos é quimicamente fermentado. Mais especificamente, a referida massa compreende: • 15-30 % em peso, de farinha e/ou amido, tal como amido não tratado, amido termicamente tratado, farinha clorada, amido modificado e/ou amido nativo; • 15-30 % em peso, de açúcar; • 10-25 % em peso, de ovos, tal como ovos inteiros, clara de ovo e/ou gema de ovo; • 0-2% em peso, de emulsionante, tal como monoacilgliceróis e diacilgliceróis de ácidos gordos, ésteres de propilenoglicol com ácidos gordos, ésteres de ácido láctico e monoacilgliceróis e diacilgliceróis de ácidos gordos, e/ou estearoí1-2-lactilato de sódio; • 0,3-1% em peso, de fermento em pó, tal como contendo soda e ácido ou sais ácidos; • 0-1% em peso, de hidrocolóides, tais como goma de semente de alfarroba, goma de guar, goma de tara, goma xantana, carragenana, goma-arábica, celulose, celulose modificada, e/ou pectina; • 10-25% em peso, de manteiga ou de uma gordura vegetal, tal como por exemplo óleo, margarina, misturas de gorduras, pasta gorda, ou gordura em pó; e; • 0-15% em peso, de água; em que as % em peso comparam com o peso total da massa para bolos.

Num aspecto adicional, a invenção presente proporciona uma massa para bolos ou produto de bolos compreendendo uma ou mais alfa-amilases degradantes de amido cru, uma ou mais fosfolipases, e opcionalmente uma ou mais amilases contra o endurecimento.

Numa concretização especifica, a massa para bolos ou produto de bolos consoante a invenção compreende um alfa-amilase que degrade amido cru que seja uma alfa-amilase com uma homologia de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% com a SEQ ID NO 1 (veja-se a Tabela A).

Numa concretização especifica, a massa para bolos ou produto de bolos consoante a invenção compreende uma fosfolipase que seja uma fosfolipase com uma homologia de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% com a SEQ ID NO 2 (veja-se a Tabela B).

Numa concretização específica, a massa para bolos ou produto de bolos consoante a invenção compreende uma amílase contra o endurecimento que mantém mais do que 20% da sua actividade na presença de 10% de sacarose.

Mais especificamente, a massa para bolos consoante a invenção é uma massa para bolos em creme.

Mais especificamente, o produto de bolos consoante a invenção é um produto de bolos em creme.

Num aspecto adicional, a invenção presente proporciona a utilização de uma ou mais alfa-amilases que degradam amido cru, uma ou mais fosfolipases, e opcionalmente uma ou mais amilases contra o endurecimento para melhorar a humidade, em que a humidade seja preferivelmente determinada por um painel de peritos em bolos.

Mais especificamente a utilização consoante a invenção proporciona que a sensação de humidade do produto de bolos seja melhorada em pelo menos 0,5 unidades quando é avaliada numa escala de 1 a 9 e comparada com a de uma referência com um valor fixado.

Estes aspectos e concretizações e outros adicionais são descritos nas secções seguintes e nas reivindicações.

DESCRIÇÃO PORENORIZADA DA INVENÇÃO

Antes de se descreverem o método e os produtos presentes consoante a invenção, deve entender-se que esta invenção não se limita aos métodos, produtos ou dispositivos específicos descritos, uma vez que estes métodos, produtos e dispositivos podem, evidentemente, variar. Deve também entender-se que a terminologia utilizada neste documento não pretende ser limitativa, porque o âmbito da invenção presente apenas será limitado pelas reivindicações apensas. A não ser quando se apresentar uma definição diferente, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado que é habitualmente entendido na técnica na qual esta invenção de insere. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser utilizados na prática ou em testes da invenção presente, serão em seguida descritos os métodos e os materiais preferidos.

Nesta especificação e nas reivindicações apensas, as formas singulares

Incluem referências plurais a não ser aonde o contexto ditar claramente o contrário.

Os termos "compreendendo", "compreende" e "constituído por", tal como se utilizam neste documento são sinónimos de "incluindo", "inclui" ou "contendo", "contém", e são inclusivos ou com extremas abertas, não excluindo membros, elementos ou passos processuais adicionais, não listados. Os termos "compreendendo", "compreende" e "constituido por", quando se referem aos membros, elementos ou passos processuais listados, também incluem concretizações "constituidas pelos" referidos membros, elementos ou passos metodológicos.

Adicionalmente, os termos primeiro, segundo, terceiro e outros semelhantes na descrição e nas reivindicações, são utilizados para distinguir entre elementos semelhantes e não necessariamente para descrever uma ordem sequencial ou cronológica, a não ser que tal seja especificado. Deve entender-se que os termos utilizados deste modo são intercambiáveis em circunstâncias apropriadas e que as concretizações da invenção que se descrevem neste documento são capazes de ser utilizadas noutras sequências para além das descritas ou ilustradas neste documento. 0 termo "cerca de", tal como se utiliza neste documento quando se refere um valor mensurável tal como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal, e outros semelhantes, pretende incluir variações de +/-10% ou menos, preferivelmente +/-5% ou menos, mais preferivelmente +/-1% ou menos, e ainda mais preferivelmente +/-0,1% ou menos, em relação ao valor apresentado, na medida em que essas variações sejam apropriadas para o desempenho na invenção descrita. Deve entender-se que o valor ao qual o qualificador "cerca de" se refere é ele próprio também especificamente, e preferivelmente, descrito. A enumeração das alterações numéricas através de pontos terminais inclui todos os números e as fracções adentro das gamas respectivas, bem coo os pontos terminais listados. A não ser quando se definir algo em contrário, todos os termos utilizados na descrição da invenção, incluindo os termos técnicos e científicos, têm os significados que são habitualmente entendidos por indivíduos com conhecimentos médios da técnica à qual esta invenção pertence. A título de uma instrução complementar, as definições dos termos utilizados na descrição são incluídas para se entenderem melhor os ensinamentos da invenção presente. Os termos ou definições utilizadas neste documento são proporcionados apenas para ajudar à compreensão da invenção.

Qualquer referência ao longo da especificação presente a "uma concretização" ou "a concretização" significa que uma característica, estrutura ou aspecto descritos em relação à concretização estão incluídos em pelo menos uma concretização da invenção presente. Assim, quando aparecem as frases "em uma concretização" ou "numa concretização" em diversos locais ao longo desta especificação, nem sempre todos eles se referem à mesma especificação, mas podem fazê-lo. Adicionalmente, os aspectos, estruturas ou caracteristicas especificas podem ser combinados de qualquer modo adequado, tal como seria aparente a uma pessoa com conhecimentos da técnica ao tomar conhecimento com esta descrição, numa ou mais concretizações. Além disto, enquanto determinadas concretizações descritas neste documento incluem alguns, mas não outros aspectos incluídos noutras concretizações, as combinações de aspectos de diferentes concretizações devem entender-se com integrando o âmbito da invenção, e formando diferentes concretizações, tal como seria entendido pelos técnicos desta área. Por exemplo, nas reivindicações que se seguem, qualquer das concretizações reivindicada pode ser utilizada em qualquer combinação.

Os inventores verificaram de um modo surpreendente que, adicionando uma combinação específica de enzimas a uma massa para bolos, era possível melhorar alguns dos parâmetros de textura e sensoriais do bolo, em especial a sua humidade, sem ter nenhum efeito negativo sobre os outros parâmetros.

Quando se adicionam amílases que degradam amido cru (RSD) a uma receita de bolos a concentrações suficientemente grandes para diminuir a dureza do produto de bolos resultante, observou-se que isto compromete a forma do bolo (isto é, há um colapso da superfície superior). Observa-se um efeito negativo adicional nas propriedades da textura tais como a coesividade na estrutura do bolo.

Verificou-se agora surpreendentemente que combinando uma amílase que degrada um amido cru com uma fosfolipase melhora-se significativamente a humidade dos produtos de bolo obtidos e isto sem influência negativa sobre a coesividade do produto de bolo, quando se compara com um produto de bolo contendo apenas a fosfolipase. Este efeito melhorava ainda mais quando se combinavam as amilases RSD e as fosfolipases com amilases maltogénicas contra o endurecimento. É, portanto, um primeiro objecto da invenção presente proporcionar um método de preparar uma massa para bolo ou um produto de bolos preparado da massa, compreendendo adicionar-se por qualquer ordem uma ou mais alf a-amilases que degradem amido cru com uma ou mais fosfolipases aos ingredientes da massa para bolos, e preparar-se a massa para bolos. Deve entender-se que a ordem pela qual os diferentes ingredientes, incluindo enzimas, são adicionados, não tem importância. Deste modo pode em primeiro ugar preparar-se uma massa para bolos a partir dos ingredientes de massa para bolos, e em seguida adicionarem-se por uma ordem qualquer uma ou mais alfa-amilases que degradem amido cru e uma ou mais fosfolipases à massa para bolos, misturando-se em seguida os ingredientes da massa para bolos.

Para se preparar melhor o referido produto de bolos, coze-se a referida massa para bolos de modo a obter-se um produto de bolos. Portanto, o método inclui tipicamente o passo de se cozer a massa para bolos a um produto de bolos.

Numa concretização adicional, o método consoante a invenção presente proporciona um método para preparar uma massa para bolos ou um produto de bolos preparado a partir da massa, compreendendo adicionarem-se por uma ordem qualquer uma ou mais alfa-amilases degradando amido cru, uma ou mais fosfolipases, e uma ou mais amilases contra o endurecimento, à massa para bolos, e preparar a massa para bolos. Deve entender-se que a ordem de adição dos diversos ingredientes diferentes, incluindo os enzimas, é indiferente. Deste modo em primeiro lugar há que preparar uma massa para bolos a partir dos ingredientes para a massa para bolos, seguindo-se a adição por qualquer ordem de uma ou mais alfa amilases que degradam amido cru, uma ou mais fosfolipases, e uma ou mais amilases contra o endurecimento, à massa para bolos.

De acordo com uma concretização especifica, o método consoante a invenção presente proporciona um método para preparar um produto de bolos, em que o produto de bolos seja preferivelmente um produto de bolos quimicamente fermentado obtido a partir do cozimento de uma massa para bolos, compreendendo a referida massa para bolos preferivelmente a titulo de ingredientes principais farinha, ovos e açúcar. Nas concretizações preferidas a referida massa para bolos compreende adicionalmente um ou mais agentes fermentativos e/ou gordura.

Em aplicações especificas o método consoante a invenção presente proporciona um produto de bolos fermentado de modo não microbiológico compreendendo farinha, ovos, açúcar e opcionalmente um ou mais agentes fermentantes e/ou gordura.

Tal como se faz referência neste documento, o termo "agente fermentante" refere-se a qualquer uma de uma pluralidade de substâncias utilizadas em massas que provoca o aligeiramento e a maior suavidade do produto acabado. A formação de dióxido de carbono é induzida pelos agentes químicos que reagem com a humidade, ao calor, acidez, ou com outros despoletantes. Uma alternativa ou suplemento aos agentes fermentantes é a fermentação mecânica da massa durante a qual se incorpora ar na massa utilizando meios mecânicos. Os agentes fermentantes tal como se referem neste documento são compostos químicos tais como fermento em pó. 0 fermento em pó compreende tipicamente um portador de dióxido de carbono (tipicamente um sal bicarbonato) e um agente fermentante (tipicamente um ácido orgânico com pequena massa molecular). Os agentes fermentantes reconhecidos em geral podem incluir fosfato monocálcico (Ca (H2P04) 2) , sulfato de alumínio e sódio (NaAl (SO4) 2 · 12H20) , pirofosfato dissódico (Na2H2P207) , e fosfatos de alumínio e sódio (NaHi4Al3 (P04) 8 · 4H20 e Na3Hi5Al2 (P04) s) · Combinam-se estes compostos com bicarbonato de sódio para se obter dióxido de carbono de um modo previsível.

Podem seleccionar-se ingredientes adicionais de entre uma lista de gorduras, lípidos, emulsionantes, proteínas (lácteas), hidrocolóides, gomas, amidos (nativo, química ou fisicamente modificado), cacau em pó, chocolate, agentes corantes, sabores, etc. 0 especialista sabe como combinar estes ingredientes para obter o produto de bolo do tipo desejado. A massa para bolos pode incluir por exemplo os seguintes ingredientes, tipicamente nas seguintes quantidades (em % em peso, da massa): • Farinha (por exemplo não tratada, termicamente tratada, clorada, peneirada ao ar, ... e combinações destas) e/ou amido (modificado/nativo), numa quantidade de entre 15 e 30%; • Açúcar numa quantidade de entre 15 e 30%; • Ovos (ovos inteiros e/ou clara de ovo e/ou gema de ovo) numa quantidade de entre 10 e 25% (calculado como ovos inteiros descascados); • Emulsionante (por exemplo monoacilgliceróis e diacilgliceróis de ácidos gordos, ésteres de propilenoglicol de ácidos gordos, ésteres de ácido láctico de monoacilgliceróis e diacilgliceróis de ácidos gordos, estearoíl-2- lactilato de sódio), numa quantidade de entre 0 e 2%; • Fermento em pó (compreendendo bicarbonato de sódio e ácido ou sais de ácidos) numa quantidade de entre 0,3 e 1% • Hidrocolóides (por exemplo goma de sementes de alfarroba, goma de guar, goma de tara, goma xantana, carragenana, goma-arábica, celulose, celulose modificada, pectina), numa quantidade de entre 0 e 1 %; • Gordura vegetal (por exemplo óleo, margarina, mistura de gorduras, pasta de gordura, gordura em pó) ou manteiga numa quantidade de entre 10 e 25%; e • Água numa quantidade de entre 0 e 15%.

Uma concretização especifica da referida massa para bolos é uma massa para bolos em creme compreendendo por exemplo os seguintes ingredientes, tipicamente nas seguintes quantidades (em % em peso, da massa): • Farinha (não tratada, termicamente tratada, clorada) numa quantidade de entre 15 e 30%; • Açúcar numa quantidade de entre 20 e 30%; • Ovos (ovos inteiros e/ou clara de ovo e/ou gema de ovo) numa quantidade de entre 15 e 2 0% (calculado como ovos inteiros descascados); • Amido (modificado, nativo) numa quantidade de entre 0 e 10%; • Emulsionante (por exemplo monoacilgliceróis e diacilgliceróis de ácidos gordos, ésteres de propilenoglicol de ácidos gordos, ésteres de ácido láctico de monoacilgliceróis e diacilgliceróis de ácidos gordos, estearoil-2-lactilato de sódio), numa quantidade de entre 0,5 e 1 % ; • Fermento em pó (compreendendo bicarbonato de sódio e ácido ou sais de ácidos) numa quantidade de entre 0,5 e 1% • Hidrocolóides (por exemplo goma de sementes de alfarroba, goma de guar, goma de tara, goma xantana, carragenana, goma-arábica, celulose, celulose modificada, pectina), numa quantidade de entre 0 e 0,5%; • Gordura vegetal (por exemplo óleo) numa quantidade de entre 15 e 2o%; e • Água numa quantidade de entre 10 e 15%.

De acordo com a invenção presente o termo "alfa amilase degradante do amido cru" ou "alfa-amilase RSD", também conhecida como "alfa-amilase que hidrolisa amido cru" ou uma "alfa-amilase hidrolisando grânulos de amido", refere-se a um enzima (ou em alguns casos a uma combinação de enzimas) que consegue degradar directamente grânulos de amido cru a uma temperatura inferior à de gelatinização do amido, uma propriedade que as alfa-amilases "clássicas" não possuem. A temperatura de gelatinização do amido depende da fonte do amido (por exemplo amido de trigo, milho, cevada, centeio ou arroz). A temperatura de gelatinização do amido pode variar entre 51°C e 78°C e a temperatura do inicio da gelatinização pode variar entre cerca de 51°C e 68°C. Uma alfa-amilase degradando amido cru é um enzima que consegue degradar directamente grânulos de amido cru nas seguintes condições: • Quando se utiliza farinha de trigo para fazer a massa, a alfa-amilase que degrada amido cru pode degradar directamente amido cru quando a temperatura de gelatinização for de 52°C a 75 °C. • Quando se utiliza farinha de milho para fazer a massa, a alfa-amilase que degrada amido cru pode degradar directamente amido cru quando a temperatura de gelatinização for de 62°C a 7 4 0 C . • Quando se utiliza farinha de centeio para fazer a massa, a alfa-amilase que degrada amido cru pode degradar directamente amido cru quando a temperatura de gelatinização for de 55°C a 7 0 0 C . • Quando se utiliza farinha de cevada para fazer a massa, a alfa-amilase que degrada amido cru pode degradar directamente amido cru quando a temperatura de gelatinização for de 53°C a 63 °C. • Quando se utiliza farinha de aveia para fazer a massa, a alfa-amilase que degrada amido cru pode degradar directamente amido cru quando a temperatura de gelatinização for de 55°C a 62 °C. • Quando se utiliza farinha de arroz para fazer a massa, a alfa-amilase que degrada amido cru pode degradar directamente amido cru quando a temperatura de gelatinização for de 65°C a 7 5 0 C . • Quando se utiliza farinha de sorgo para fazer a massa, a alfa-amilase que degrada amido cru pode degradar directamente amido cru quando a temperatura de gelatinização for de 70°C a 78 °C. • Quando se utiliza amido de batata para fazer a massa, a alfa-amilase que degrada amido cru pode degradar directamente amido cru quando a temperatura de gelatinização for de 56°C a 69 °C.

Numa concretização especifica, a alfa-amilase que degrada amido cru é definida como um enzima que tem um índice de degradação de amido cru de pelo menos 0,2, pelo menos 0,3, pelo menos 0,4, pelo menos 0,5, pelo menos 0,6, pelo menos 0,7, pelo menos 0,8, pelo menos 0,9, pelo menos 1, pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, pelo menos 1,8, pelo menos 1,9, pelo menos 2, em que o índice de degradação em cru seja uma razão da actividade de degradação de amido em cru em relação à actividade de degradação de amido gelatinizado (Ra/Ga). Preferivelmente, a alfa-amilase que degrada amido cru é definida como um enzima com um indice de degradação de amido em cru maior do que 1. A actividade sobre o amido gelatinizado é medida quantificando a libertação de glucose pelo enzima actuando sobre uma mistura reaccional com 2% de amido gelatinizado (por exemplo, de milho). Mede-se a actividade através da libertação de açúcares redutores produzida em relação a 4 mol por hora por mg de enzima puro activo. Pode utilizar-se o mesmo ensaio com amido cru, mas substituindo o amido gelatinizado a 2 % (por exemplo, de milho) por amido a 2 % cru (por exemplo, de milho). Em ambos os ensaios, a temperatura é de 40°C, o pH é o mesmo e a mesma solução tampão é utilizada, sendo o período de tempo de incubação de 6 horas.

Em concretizações específicas as alfa-amilases que degradam amido cru estão sempre presentes e são produzidas por plantas, animais, e micro-organismos, tal como, alfa-amilases que degradam amido cru provenientes de fungos, bactérias e leveduras. Em concretizações específicas as alfa-amilases que degradam amido cru que se utilizam na invenção presente podem ser obtidas por modificação genética de enzimas conhecidos.

Em concretizações específicas as alfa-amilases que degradam amido cru podem ser preferivelmente uma alfa-amilase compreendendo um domínio que a liga a amido (SBD) e um domínio catalítico de alfa-amilase (CD). Incluem-se nos exemplos destas alfa-amilases as descritas no WO 2005/003.311, no US 2005/0 054.071, na US 7.326.548, no WO 2010/124.206 e no WO 2011/154.529. Também se incluem nos exemplos os enzimas descritos nas Tabelas 1 a 5 dos exemplos na US 7.326.548, na Tabela 3 da página 15 do US 2005/0 054.071, bem como os enzimas descritos no WO 2004/020.499 e no WO 2006/06.929 e os enzimas descritos no WO 2006/066.579 como SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, ou SEQ ID NO:4. Um enzima alfa-amilase ácido preferido degradando amido cru é a alfa-amilase híbrida constituída por alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com um agente de ligação de glucoamilase de Aspergillus niger e SBD, descrito como V039 na Tabela 5 do WO 2006/069.290.

Numa concretização especifica a alfa-amilase que degrada amido cru pode ser uma das alfa-amilases comerciais que degradam amido cru, tal como SP288 (Novozymes A/S).

Mais especificamente, a alfa-amilase que degrada amido cru é uma alfa-amilase com uma identidade de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, com a SEQ ID NO 1 (veja-se a Tabela A). Numa concretização específica a alfa-amilase que degrada amido cru é a alfa-amilase com a SEQ ID NO 1.

Pode adicionar-se uma alfa-amilase que degrade amido cru numa quantidade de entre 0,6 e 8,0 unidades FAU-F por kg de massa, preferivelmente numa quantidade de 2 a 6 FAU-F por kg de massa, mais preferivelmente numa quantidade de 3,5 a 5.

Um método adequado para testar a actividade da a alfa-amilase que degrada amido cru é utilizando um estojo contendo o substrato (4,6-etilideno(G7)-p-nitrofenil(G1) -a,D-maltoheptaósido (etilideno-G7PNP) e o enzima a-glucosidase. A presença de uma alfa-amilase numa amostra transforma o substrato em glucose e no p-nitrofenol de cor amarela que se pode detectar e quantificar espectrofotometricamente a 405 nm. As condições reaccionais são 37°C, pH 7,15 e a concentração do substrato é de 1,86 mM. Expressa-se a actividade da alfa-amilase em Unidades de alfa-Amilase Fúngicas FAU(F) e mede-se em relação a um padrão de enzima com uma intensidade conhecida. Um exemplo de um padrão de enzima é o Fungamyl 4.000 BG (Novozymes A/S) que contém 4.000 FAU(F)/g de produto.

Tabela A

Tal como se utiliza neste documento, o termo "identidade de sequência" ou "homologia de sequência" denota pelo a semelhança entre as estruturas primárias entre duas macromoléculas, em especial entre dois polipéptidos ou dois polinucleótidos, do mesmo taxão ou de taxões diferentes, em que a semelhança referida é devida a antepassados comuns. Preferivelmente, os péptidos homólogos também apresentarão semelhança entre as estruturas secundária ou terciária. Portanto, o termo 'homólogas' denota as assim relacionadas macromoléculas com as referidas estruturas primárias e opcionalmente, para macromoléculas proteiginosas, semelhanças entre as estruturas secundárias ou terciárias. Para comparar duas ou mais sequências polipeptídicas, a ' (percentagem de) identidade de sequência' entre uma primeira sequência polipeptídica e uma segunda sequência polipeptidica pode ser calculada recorrendo a métodos conhecidos do indivíduo especializado na técnica, por exemplo dividindo o número de polipéptidos na primeira sequência polipeptídica que são idênticos aos polipétidos nas posições correspondentes da segunda sequência polipeptídica pelo número total de polipéptidos na primeira sequência polipeptídica e multiplicando por 100%, ou utilizando um algoritmo computacional conhecido para alinhamento de sequências tal como o NCBI Blast. Na determinação do grau de identidade de sequências entre dois polipéptidos, a pessoa com conhecimentos pode levar em conta as assim denominadas substituições 'conservadoras' de aminoácidos, que podem em geral ser descritas como substituições de aminoácidos nas quais um resíduo de aminoácido seja substituído por outro resíduo de aminoácido com uma estrutura química semelhante, e que tem pouca ou essencialmente nenhuma influência sobre a função, actividade ou outras propriedades biológicas do polipéptido. 0 especialista da técnica conhece bem as possíveis substituições conservadoras de aminoácidos. Diz-se que dois ou mais polipéptidos são 'exactamente o mesmo' quando apresentam uma identidade de sequências de 100% ao longo de todo o seu comprimento.

Segundo a invenção presente o termo "fosfolipase" refere-se a um enzima (ou em alguns casos uma combinação de enzimas) que catalisa a libertação de grupos acilo gordo a partir de um fosfolípido. Em concretizações específicas, a referida fosfolipase é uma fosfolipase A2 (PLA2, EC 3.1.1.4) ou uma fosfolipase AI (EC 3.1.1.32). Em concretizações específicas adicionais a referida fosfolipase pode apesentar ou não outras actividades, tal como a de uma triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3) e/ou a de uma galactolipase (EC 3.1.1.26).

Em concretizações específicas, a fosfolipase pode ser um enzima nativo derivado de fontes mamíferas ou microbianas. Um exemplo específico de uma fosfolipase de mamífero é a PLA2 pancreática, por exemplo PLA2 bovina ou porcina, tal como o produto comercial Lecitase® 10L (PLA2 porcina, um produto da Novozymes A/S).

Em concretizações específicas, as fosfolipases microbianas podem ser derivadas de Fusarium, por exemplo a fosfolipase AI de F. oxysporum (WO 1998/026.057), a fosfolipase A2 de F. venenatum (uma fosfolipase A2 denominada FvPLA2 descrita no WO 2004/097.012), de Tuber, por exemplo a fosfolipase A2 de Γ. (referida como TbPLA2 no WO 2004/097.012).

Em concretizações específicas as fosfolipases microbianas encontram-se comercialmente disponíveis como Lipopan F BG ou Lipopan Xtra (Novozymes A/S).

Em concretizações específicas a fosfolipase também pode ser uma variante de enzima lipolítico com actividade de fosfolipase, por exemplo tal como descrito no W02000/032.758 ou no WO 2003/060.112 (ambos os quais se incorporam neste documento por referência).

Em concretizações específicas a fosfolipase também pode catalisar a libertação de grupos acilo gordos a partir de outros lípidos presentes na massa, em especial lípidos de trigo. Deste modo, a fosfolipase pode ter actividade de triacilglicerol lipase (EC 3.1.1.3) e/ou actividade de galactolipase (EC 3.1.1.26).

Mais especificamente a fosfolipase é uma lipase com uma identidade de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, com a SEQ ID NO 2 (veja-se a Tabela B) . Numa concretização específica, a fosfolipase é a fosfolipase com a SEQ ID NO 2.

Em concretizações específicas, a fosfolipase pode ser adicionada numa quantidade de 100-3.000 unidades LU por kg de massa, preferivelmente numa quantidade de entre 150 e 2.000 unidades LU por kg de massa, mais preferivelmente numa quantidade de 200 a 800 unidades LU por kg de massa.

Pode determinar-se a actividade da lipase utilizando tributirina como substrato. Este método baseia-se na hidrólise da tributirina pelo enzima, e regista-se o consumo de base para se manter o pH constante durante a hidrólise, em função do tempo. Uma Unidade de Lipase (LU) é definida como a quantidade de enzima que, nas condições padrão (isto é, a 30°C; pH 7,0; com 0,1 % em peso por volume de goma-arábica como emulsionante e tributirina 0,16 M como substrato), liberta 1 pmol de ácido butírico titulável por minuto. Um especialista da técnica entenderá que se podem utilizar outros métodos para determinar a actividade da fosfolipase, por exemplo utilizando lecitina como substrato. Neste caso, a lecitina é hidrolisada a pH e temperatura constantes, e determina-se a actividade da fosfolipase pela velocidade do consumo do titulante (NaOH 0,1 N) durante a neutralização do ácido gordo libertado.

Tabe1 a R

De acordo com a invenção presente o termo "amílase contra do endurecimento", refere-se a um enzima capaz de atrasar o endurecimento do material do bolo quando é utilizado numa quantidade eficaz nos ingredientes da massa para bolos. Preferivelmente a amilase contra o endurecimento é uma alfa-amilase contra o endurecimento. Segundo uma concretização especifica da invenção presente seleciona-se a alfa-amilase contra o endurecimento de entre o conjunto de alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento e alfa-amilase contra o endurecimento formando maltotetraose. As alfa-amilases maltogénicas contra o endurecimento e alfa-amilases contra o endurecimento formando maltotetraose são capazes de diminuir o endurecimento do bolo por evitarem a perda da suavidade durante períodos de tempo de armazenagem prolongados.

Preferivelmente a alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento é um enzima classificado como EC 3.2.1.133. A actividade enzimática principal da alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento é a catálise da libertação de maltose a partir de amilopectina e de amilose. A alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento também consegue hidrolisar maltotriose e ciclodextrinas.

Podem obter-se as alfa-amilases contra o endurecimento tal como se definem neste documento a partir de uma fonte adequada, em especial a partir de um micro-organismo adequado, e podem também obter-se por modificação genética de enzimas conhecidos.

As alfa-amilases maltogénicas contra o endurecimento preferidas são as descritas nos WO 91/04.669, WO 99/43.793, WO 99/43.793, WO 2006/032.281, WO 2008/148.845 ou na EP 2.486.799.

Em concretizações específicas, as alfa-amilases maltogénicas contra o endurecimento toleram elevadas concentrações em sacarose. Em concretizações específicas, as referidas alfa-amilases maltogénicas contra o endurecimento têm uma tolerância especificada ao açúcar. Comparada com a actividade das alfa-amilases maltogénicas contra o endurecimento na ausência de sacarose, as alfa-amilases maltogénicas contra o endurecimento podem ter mais do que 20% de actividade a 10% de sacarose, mais do que 10% de actividade a 20% de sacarose, ou mais do que 4% de actividade a 40% de sacarose. A tolerância ao açúcar pode ser determinada como descrito nos exemplos do WO 2006/032.281.

Em concretizações específicas as alfa-amilases maltogénicas contra o endurecimento estão comercialmente disponíveis como Novamyl®, Opticake® 50 BG, Opticake® Fresh da Novozymes A/S.

Uma alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento, preferivelmente uma alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento tolerante a elevadas concentrações de sacarose, pode ser adicionada por exemplo numa guantidade de entre 10 e 60 SDMU/kg de massa, preferivelmente numa guantidade de 15 a 50 SDMU/kg de massa, mais preferivelmente numa quantidade de entre 20 e 40 SDMU/kg de massa.

Um método adequado para testar a actividade da alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento é a utilização de maltotriose como substrato. A alfa-amilase maltogénica catalisa a hidrólise de ligações (1-4)-alfa-D-glucosídicas na maltotriose de modo a libertar maltose e glucose. A reacção de hidrólise é levada a cabo a 37°C na seguinte solução: maltotriose a 10 mg/mL, CaCl2.2H20 4 mM, Brij 35 de 112,5 mg/L, citrato de sódio 50 mM, pH 5,0. A glucose libertada é transformada em 6 fosfogluconato e NADH utilizando hexoquinase e glucose-6-P-desidrogenase. O NADH é medido espectrofotometricamente a 340 nm. A quantidade de NADH formada é proporcional à glucose formada consoante a actividade do enzima presente na amostra. Pode vantajosamente determinar-se a glucose utilizando um estojo comercialmente disponível que contém todos os reagentes necessários tais como o Estojo de Ensaio de Glucose (HK) da Sigma-Aldrich. Expressa-se a actividade da alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento em SDMU (Unidade Maltogénica de Massa Doce) e mede-se em relação a um padrão enzimático com potência conhecida. Um exemplo do padrão de enzima é o Opticake 50BG (Novozymes A/S) que contém 50 SDMU/g de produto.

Preferivelmente a alfa-amilase contra o endurecimento que forma maltotetraose é um enzima classificado como EC 3.2.1.60. A actividade enzimática principal do enzima contra o endurecimento que forma maltotetraose é a catálise da libertação de maltotetraose a partir de amilopectina e de amilose. As alfa-amilases contra o endurecimento que formam maltotetraose tal como se definem neste documento podem ser obtidas a partir de qualquer fonte adequada, em especial a partir de qualquer micro-organismo adequado, e também podem ser obtidas por modificação genética de enzimas conhecidos.

Em concretizações especificas as alfa-amilases contra o endurecimento que formam maltotetraose são as descritas no WO 99/50.399.

Em concretizações especificas as alfa-amilases contra o endurecimento formando maltotetraose estão comercialmente disponíveis como enzima para bolos POWERSoft® junto da DuPont Industrial Biosciences. Em concretizações específicas as alfa-amilases contra o endurecimento formando maltotetraose podem ser adicionadas em concentrações de entre 20 e 500 SKB por kg de massa, preferivelmente numa quantidade de entre 50 e 400 SKB por kg de massa, mais preferivelmente numa quantidade de 100 a 300 SKB por kg de massa.

Pode medir-se a actividade da alfa-amilase contra o endurecimento formando maltotetraose utilizando o Teste Phadebas® para Amilase (Magle AB, Suécia). O protocolo do estojo é modificado para se levar a cabo o ensaio a 45°C em acetato de sódio 100 mM, 20 mM em CaCl2.2H20, em tampão de pH 5,5. Transformam-se as unidades dadas pela curva padrão do estojo em unidades SKB multiplicando o valor por 1,43. Pode também medir-se a actividade de alfa-amilase contra o endurecimento formando maltotetraose tal como se descreveu no WO 99/50.399. Define-se uma unidade como a quantidade de enzima que liberta produtos de hidrólise equivalentes a 1 pmol de açúcar redutor por minuto, quando incubado a 50°C num tubo de ensaio com 4 mL de amido ceroso de milho a 10 mg/mL em tampão MES 50 mM, com cloreto de cálcio 2 mM, a pH 6, 0.

Numa concretização especifica, o método consoante a invenção presente proporciona um método para preparar uma massa para bolos ou um produto de bolos a partir da massa para bolos, em que a massa para bolos compreenda uma alfa-amilase que degrada amido cru e uma fosfolipase, tendo a referida alfa-amilase uma homologia de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, com a SEQ ID NO 1, e a referida fosfolipase uma homologia de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, com a SEQ ID NO 2. Numa concretização especifica a alfa-amilase que degrada amido cru é a alfa-amilase com a SEQ ID NO 1 e a fosfolipase é a fosfolipase com a SEQ ID NO 2.

Numa concretização especifica, o método consoante a invenção presente proporciona um método para preparar uma massa para bolos ou um produto de bolos preparado da massa para bolos, em que a massa para bolos compreenda uma alfa-amilase que degrada amido cru, uma fosfolipase e uma amilase contra o endurecimento, apresentando a amílase referida uma homologia de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, com a SEQ ID NO 1, tendo a referida fosfolipase uma homologia de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, com a SEQ ID NO 2, e sendo a referida amilase contra o endurecimento uma alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento ou uma alfa-amilase contra o endurecimento formando maltotetraose, preferivelmente uma alfa-amilase contra o endurecimento caracterizada por manter mais do que 20% da sua actividade na presença de 10% de sacarose. Numa concretização especifica a alfa-amilase que degrada amido cru é a alfa-amilase com a SEQ ID NO 1, a fosfolipase é a fosfolipase com a SEQ ID NO 2 e a referida alfa-amilase contra o endurecimento é uma alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento ou uma alfa-amilase contra o endurecimento formando maltotetraose, preferivelmente uma alfa-amilase contra o endurecimento caracterizada por manter mais do que 20% da sua actividade na presença de 10% de sacarose.

Na invenção presente a dureza (como termo oposto da suavidade) e a coesividade de um bolo (em especial da parte interior do bolo) pode ser avaliada utilizando um analisador de textura. Neste método calculam-se os parâmetros de textura a partir da curva registada quando se leva a cabo uma Análise do Perfil Textural (TPA) de uma amostra de bolo utilizando um analisador de textura. Levam-se a cabo duas deformações consecutivas de uma amostra cilíndrica da parte interior do bolo (diâmetro = 45 mm) com uma sonda cilíndrica (diâmetro = 100 mm) com uma deformação máxima de 50% da altura inicial do produto a uma velocidade de deformação de 2 mm/s, com um período de espera entre as duas deformações de 3 s. A força necessária para deformar a amostra é registada em função do tempo. A dureza é a força máxima necessária para aplicar uma deformação fixa de 50% da altura inicial da amostra de bolo. A coesividade é calculada como a razão (expressa em percentagem) entre a superfície sob a segunda deformação (para baixo+para cima) e a razão sob a primeira curva de deformação (para baixo+para cima). Utiliza-se um valor de referência de 100 para os parâmetros de textura respectivos do bolo que se utiliza como referência num determinado teste. Todos os outros valores sao expressos em relação a esta referência.

Também se podem avaliar os parâmetros de textura de bolos levando a cabo uma análise sensorial recorrendo a um painel de peritos. Os peritos em bolos são consumidores de bolos que foram treinados para descrever e classificar as diferentes propriedades de textura que descrevem a frescura do bolo: suavidade, humidade e coesividade, todas estas individualmente e independentemente. Os peritos em bolos utilizam uma tabela com classificações com valores de 1 a 9 para cada parâmetro. Quanto à suavidade, uma classificação de 1 indica um bolo extremamente duro, difícil de morder, e uma classificação de 9 indica um bolo extremamente mole, sendo necessária muito menos força para o morder. Para a humidade, uma classificação de 1 indica um bolo extremamente seco e uma classificação de 9 indica um bolo extremamente húmido. Para a coesividade uma classificação de 1 indica um bolo que facilmente se desfaz e uma classificação de 9 indica um bolo extremamente coeso que tende a ficar numa só peça. Os membros do painel recebem um bolo de referência com uma classificação fixa do ou dos parâmetros de frescura que haverá que avaliar e solicita-se-lhes que classifiquem os bolos em teste em relação ao bolo de referência. As análises sensoriais tais como descritas são calibradas e considera-se como significativa uma diferença de 0,5.

Numa concretização específica o método consoante a invenção presente proporciona um produto de bolos com uma melhor humidade, sendo a humidade determinada preferivelmente por um painel de peritos em bolos. Numa concretização específica a humidade do produto de bolos é melhor em pelo menos 0,5 unidades, quando avaliado numa escala de 1 a 9 em comparação com uma referência a que se atribuiu um valor fixo. Mais especificamente a humidade do referido produto de bolos é melhor em pelo menos 1 unidade, quando avaliado numa escala de 1 a 9 em comparação com uma referência a que se atribuiu um valor fixo.

Para a coesividade e a suavidade, pode existir uma boa correlação entre os resultados da análise textural e os da análise sensorial. No entanto, não existe hoje em dia nenhum método físico de confiança para avaliar a humidade de bolos de um modo tal que ela se correlacione com as sensações de um consumidor de bolos.

Os parâmetros de textura podem ser adicionalmente avaliados por um painel de indivíduos não treinados em avaliação sensorial. Tipicamente solicita-se a um grupo de lambda consumidores para comparar duas ou mais amostras de bolo, e para indicarem qual é o mais suave, o mais húmido e/ou o mais coeso, ou então para os por ordem numa escala de mais mole/húmido/coeso ao mais duro/húmido/coeso.

Segundo mais um aspecto adicional, a invenção presente proporciona uma massa para bolos ou um produto de bolos compreendendo uma ou mais alfa-amilases que degradam amido cru, uma ou mais fosfolipases, e opcionalmente ma ou mais alfa-amilases contra o endurecimento.

Mais especificamente, a massa para bolos ou produto de bolos consoante a invenção presente proporciona uma massa para bolos ou produto de bolos preparado da referida massa para bolos em que a massa para bolos compreende uma alfa-amilase que degrada amido cru e uma fosfolipase, tendo a referida alfa-amilase uma homologia de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, com a SEQ ID NO 1, tendo a referida fosfolipase uma homologia de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, com a SEQ ID NO 2.

Mais especificamente, a massa para bolos ou produto de bolos consoante a invenção presente proporciona uma massa para bolos ou produto de bolos preparado da referida massa para bolos em que a massa para bolos inclua uma alfa-amilase degradando amido cru, uma fosfolipase e uma amilase contra o endurecimento, tendo a referida alfa-amilase uma homologia de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% com a SEQ ID NO 1, a referida fosfolipase uma homologia de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% com a SEQ ID NO 2, sendo a referida amilase contra o endurecimento uma alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento ou uma alfa-amilase contra o endurecimento formando maltotetraose.

Em concretizações especificas a massa para bolos ou o produto de bolos consoante a invenção presente proporcionam uma amilase contra o endurecimento mantendo mais do que 20% da sua actividade na presença de 10% de sacarose.

Em concretizações especificas a massa para bolos ou o produto de bolos consoante a invenção presente proporcionam uma massa para bolos em creme ou um produto de bolos em creme. A invenção presente também diz respeito a misturas para bolos e misturas prévias para bolos compreendendo uma fosfolipase e uma alfa-amilase que degrade amido cru, preferivelmente em combinação com uma alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento. Tipicamente uma mistura para bolos compreenderá todos os ingredientes para uma receita de bolos com excepção da água, gordura (óleo, manteiga, margarina) e ovos. Tipicamente uma mistura prévia para bolos na qual a totalidade ou uma parte da farinha e do açúcar hajam sido removidos.

Num aspecto adicional, a invenção presente proporciona a utilização de uma ou mais alfa-amilases degradando amido cru, uma ou mais fosfolipases, e opcionalmente uma ou mais amilases contra o endurecimento para melhorar a humidade, em que a humidade seja preferivelmente determinada por um painel de peritos em bolos. Em especial a humidade do produto de bolos melhora em pelo menos 0,5 unidades quando avaliada numa escala de 1 a 9 e comparada com uma referência possuindo um valor fixo. A invenção presente também diz respeito à utilização de misturas para bolos e de misturas prévias para bolos tais como se descreveram acima, para preparar produto de bolos e em especial produto de bolos em creme.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Efeito de alfa-amilase que degrada amido cru na textura de bolo.

Produziram-se bolos creme individuais utilizando uma receita de massa típica para bolos com os ingredientes listados na Tabela 1. Τλ

Ί λ 1

Adicionam-se maiores doses (veja-se a Tabela 2) de uma alfa-amilase degradando amido cru contendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO 1 (referida neste e nos seguintes exemplos como RSDE) a outras massas, em separado.

Pesam-se todos os ingredientes para dentro de uma tigela de mistura, a começar pelos ingredientes líquidos: água, ovos pasteurizados e óleo. Misturam-se primeiro os ingredientes todos manualmente com uma espátula e subsequentemente com um misturador planetário (Hobart tipo N50) durante 2 minutos à velocidade 1 e 2 minutos à velocidade 2. Pesam-se porções de 300 g de massa para dentro de tigelas em alumínio para ir ao forno, colocam-se numa bandeja de ir ao forno e cozem-se num forno de bancada (MIWE Condo) a 180°C durante 45 minutos. Depois de cozidos, arrefecem-se os bolos (nas tigelas) ao ar durante duas horas à temperatura ambiente).

Duas horas depois de retirados do forno examina-se visualmente a forma dos bolos, embalam-se os bolos sob uma atmosfera modificada e armazenam-se numa despensa a 20 °C até serem feitas as suas avaliações. Medem-se as propriedades de textura utilizando um analisador de textura da Stable Micro Systems (Tipo TAXT plus) utilizando o método TPA tal como se descreveu acima, respectivamente um dia e 21 dias depois de cozidos. Apresentam-se os resultados na Tabela 2.

Tabela 2: Propriedades dos bolos

A alfa-amilase que degrada amido cru tem um efeito negativo sobre a forma e a coesividade dos bolos. A dosagens às quais os bolos não sofrem um colapso, não existe nenhum efeito significativo sobre a dureza. EXEMPLO 2: A humidade e a suavidade (dureza) não são o mesmo parâmetro.

Bolos de massa com creme foram feitos uma receita de massa de bolos com creme e os ingredientes listados na Tabela 3. Os enzimas utilizados são RSDE (veja-se o exemplo 1), Lipopan F (fosfolipase - Novozymes A/S - actividade 25.000 LU/g) e Opticake 50BG (amilase maltogénica contra o endurecimento - Novozymes A/S - actividade 50 SDMU / g).

Tnlonl -o Q

Mede-se a dureza dos bolos um dia depois de os cozer tal como se descreveu no exemplo 1 (Tabela 4). Faz-se a análise sensorial um dia depois de cozer os bolos, tal como descrito no exemplo 3 (Tabela 5).

A humidade dos bolinhos preparados com a adição de uma alfa-amilase que degrada amido cru em conjunto com uma fosfolipase e uma alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento é significativamente maior do que a humidade dos bolinhos preparados apenas com a adição de uma fosfolipase e de uma alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento. A dureza (suavidade) de ambos os tipos de bolinhos é idêntica. EXEMPLO 3: O enzima que degrada amido cru e a fosfolipase actuam de modo sinergistico.

Fabricaram-se bolos creme individuais utilizando a mesma receita e o mesmo processo que no exemplo 1. Os enzimas utilizados às dosagens indicadas na Tabela 6 foram RSDE (veja-se o exemplo 1) e Lipopan F (fosfolipase Novozymes A/S). T-1 —. "Pv /—N ~\

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Duas horas depois de cozidos confirmou-se visualmente a forma dos bolos, embalam-se os bolos sob atmosfera modificada e armazenaram-se num local com atmosfera a 20 °C até serem avaliados. Medem-se as propriedades de textura utilizando um analisador de textura da Stable Micro Systems (Tipo TAXT plus) utilizando o método TPA tal como descrito acima, respectivamente um dia e 28 dias após a sua preparação. Apresentam-se os resultados na Tabela 7.

Ao fim de 4 semanas de armazenagem conduz-se uma análise sensorial dos bolos, recorrendo a um painel de 13 juízes qualificados a quem se solicita que classifiquem a humidade dos bolos atribuindo uma classificação 1 a 9, comparada com a do bolo de referência para o qual se atribui uma classificação de humidade de 5.

Tabela 7: Propriedades dos bolos 4 semanas depois de cozidos:

EXEMPLO 4: Bolinhos creme individuais

Fizeram-se bolinhos creme utilizando uma receta típica de massa para bolos com os ingredientes listados na Tabela 8.

Tabela 8

Utilizaram-se os enzimas nas dosagens indicadas na Tabela 9, que são RSDE (veja-se o exemplo 1), Lipopan F (fosfolipase - Novozymes A/S) e Opticake 50BG (amilase maltogénica contra o endurecimento - Novozymes A/S).

Mede-se a textura dos bolos tal como se descreveu no exemplo 1, respectivamente ao fim de um dia e um, dois, quatro e cinco meses depois de os cozer (Tabela 10).

Uma análise sensorial dos bolos é conduzida por um painel de juízes qualificados ao fim de um, dois, quatro e cinco meses. Os juizes foram treinados na avaliação da textura e da humidade dos bolos. Cada juiz recebe um prato com duas amostras de bolo e é-lhe solicitado que classifique as amostras numa escala 1-9 consoante a humidade de que se apercebe. Calibram-se os testes fixando um valor para o bolo de referência. Uma diferença de classificação de 0,5 pontos é apercebida pelos juizes treinados e é significativa (Tabela 11).

Tabela 10

Tabela 11

Ao fim de uma armazenagem prolongada, os bolos preparados com adição de uma combinação de uma alfa-amilase que degradava amido cru, uma fosfolipase e uma alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento são menos duros, mais coesos e dão a sensação de serem mais húmidos do que os bolos preparados com adição de fosfolipase e amilase maltogénica contra o endurecimento. EXEMPLO 5: Avaliação em grande escala.

Prepararam-se bolinhos creme individuais tal como no exemplo 3. Utilizaram-se os mesmos enzimas nas dosagens indicadas na Tabela 12.

Tabela 12

Mede-se a textura dos bolos tal como se descreveu no exemplo 1 respectivamente ao fim de um dia e de dois meses após o cozimento (Tabela 13).

Tabela 13

Uma avaliação sensorial dos bolos ao fim de 2 meses de período de tempo de armazenagem foi conduzida com 115 consumidores do Reino Unido. 66 % dos que responderam estimaram que os bolos marcados como PM5 eram mais húmidos. Este valor tem significado estatístico (Teste de Friedman: valor de p: <0,0001, risco alfa: 5%). EXEMPLO 6 : Bolinhos creme.

Prepara-se massa para bolos tal como descrita no exemplo 4 com os mesmos enzimas nas dosagens indicadas na Tabela 14.

Pesam-se manualmente porções de 40 g da massa para bolos em recipientes em papel para bolos, e cozem-se durante 23 minutos num forno de bancada (MIWE Condo) a 180°C. Passadas 2 horas de arrefecimento à temperatura ambiente, embalam-se os bolos individuais sob atmosfera modificada e armazenam-se a 20°C. A textura dos bolos individuais é medida tal como descrito no exemplo 1 um dia, um, dois, quatro e cinco meses depois do cozimento adaptando-se a preparação dos bolos individuais para a medição: removem-se as embalagens em papel bem como a superfície dos bolos individuais com uma faca para alisar este tipo de bolos, resultando amostras de bolos com uma altura de 2,5 cm. Apresentam-se os resultados na Tabela 15.

Uma análise sensorial dos bolos foi conduzida por um painel de peritos qualificados ao fim de um, dois, quatro e cinco meses. Os juizes haviam sido treinados na avaliação de textura e de humidade de bolos. Cada juiz recebeu u prato com duas amostras de bolo e foi-lhe solicitado que classificasse as amostras numa escala de 1-9 consoante a humidade apercebida. Calibram-se os testes definindo um valor fixo para o bolo de referência. Uma diferença de classificações de 0,5 pontos na percepção dos juizes treinados é significativa. Apresentam-se os resultados na Tabela 16.

Tabela 15

Tabela 16

Após uma armazenagem prolongada, os bolos individuais preparados com adição de uma combinação da alfa-amilase que degrada amido cru, uma fosfolipase e uma alfa-amilase maltogénica contra o endurecimento são menos duros e apercebidos de modo significativamente diferente como mais húmidos do que os bolos preparados com adição da fosfolipase e da amilase maltogénica contra o endurecimento. EXEMPLO 7: Outra amilase contra o endurecimento.

Preparam-se massas para bolos creme e processaram-se tal como no Exemplo 3. Os enzimas são utilizados às dosagens indicadas na Tabela 17: RSDE (veja-se o exemplo 1), Lipopan F (fosfolipase - Novozymes A/S) e Enzima para Bolos POWERSoft® (amilase contra o endurecimento formando maltotetraose - DuPont Industrial Biosciences).

Tabela 17

Mede-se a textura dos bolos um e 21 dias após o cozimento tal como descrito no Exemplo 1 (Tabela 18) . A analise sensorial é levada a cabo um e 21 dias após o cozimento tal como descrito no Exemplo 3 (Tabela 19).

Tabela 18

Tabela 19

Após 21 dias de armazenagem, os bolos preparados com adição de uma combinação de alfa-amilase degradando amido cru, uma fosfolipase e uma alfa-amilase contra o endurecimento formando maltotetraose são menos duros e são apercebidos como mais húmidos do que os bolos preparados com adição de fosfolipase e de alfa-amilase contra o endurecimento e formando maltotetraose.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Puratos NV

<120> MASSAS PARA BOLOS MELHORADAS <130> PURA-509-EP <150> BE 2014/5.000 <151> 2014-09-29 <160> 2 <170> Patente Na versão 3.5

<210> 1 <211> 583 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> alfa-amilase <4 0 0> 1

Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Gly Lys Ala Ile Tyr Gin Leu Leu Thr 15 10 15

Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn Leu 20 25 30

Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu Asp 35 40 45

Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro 50 55 60

Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe Tyr 65 70 75 80

Gin Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gin Leu Lys Ala Leu Ile 85 90 95

Gin Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Vai Met Leu Asp Vai Vai Ala 100 105 110

Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Asp 115 120 125

Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asn Gin 130 135 140

Thr Ser Ile Glu Gin Cys Trp Vai Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile Asp 145 150 155 160

Thr Glu Asn Ser Asp Asn Vai Ala Ile Leu Asn Asp Ile Vai Ser Gly 165 170 175

Trp Vai Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Vai Lys 180 185 190

His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Vai 195 200 205

Phe Ala Thr Gly Glu Vai Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Vai Gly Pro 210 215 220

Tyr Gin Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ala 225 230 235 240

Leu Asn Asp Vai Phe Vai Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile Ser 245 250 255

Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Vai Leu 260 265 270

Thr Thr Phe vai Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser Gin 275 280 285

Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Vai Leu Leu Gly 290 295 300

Glu Gly Ile Pro Ile Vai Tyr Tyr Gly Ser Glu Gin Gly Phe Ser Gly 305 310 315 320

Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Vai Leu Trp Thr Thr Asn Tyr Asp 325 330 335

Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gin Phe Ile Lys Thr Vai Asn Ser Vai Arg 340 345 350

Met Lys Ser Asn Lys Ala Vai Tyr Met Asp Ile Tyr Vai Gly Asp Asn 355 360 365

Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Vai Vai Leu Asn Asn Tyr 370 375 380

Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gin Vai Ser Phe Ser Vai Ser Gly Lys Phe 385 390 395 400

Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Vai Ser Asn Ile Thr Thr Thr 405 410 415

Vai Ser Ser Asp Gly Thr Vai Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu Pro 420 425 430

Ala Ile Phe Thr Ser Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro 435 440 445

Thr Gly Ser Gly Ser Vai Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala 450 455 460

Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr 465 470 475 480

Ala Vai Ala Vai Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu 485 490 495

Asn Ile Tyr Leu Vai Gly Ser Ile Ser Gin Leu Gly Asp Trp Glu Thr 500 505 510

Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro 515 520 525

Leu Trp Tyr Vai Thr Vai Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr 530 535 540

Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Vai Glu Trp Glu Ser Asp 545 550 555 560

Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Vai Pro Gin Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala 565 570 575

Thr Vai Thr Asp Thr Trp Arg 580

<210> 2 <211> 345 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> fosfolipase <400> 2

Met Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Ala Ile Thr Leu Ala Vai Ala Ser 15 10 15

Pro Vai Ala Leu Asp Asp Tyr Vai Asn Ser Leu Glu Glu Arg Ala Vai 20 25 30

Gly Vai Thr Thr Thr Asp Phe Gly Asn Phe Lys Phe Tyr Ile Gin His 35 40 45

Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ser Lys Ile 50 55 60

Thr Cys Ser Asn Asn Gly Cys Pro Thr Vai Gin Gly Asn Gly Ala Thr 65 70 75 80

Ile Vai Thr Ser Phe Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly Tyr Vai Ala 85 90 95

Thr Asp Ser Ala Arg Lys Glu Ile Vai Vai Ser Phe Arg Gly Ser Ile 100 105 110

Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Gly Gin Glu Asp Cys 115 120 125

Ser Leu Vai Ser Gly Cys Gly Vai His Ser Gly Phe Gin Arg Ala Trp 130 135 140

Asn Glu ile Ser Ser Gin Ala Thr Ala Ala Vai Ala Ser Ala Arg Lys 145 150 155 160

Ala Asn Pro Ser Phe Lys Vai Ile Ser Thr Gly His Ser Leu Gly Gly 165 170 175

Ala Vai Ala Vai Leu Ala Ala Ala Asn Leu Arg Vai Gly Gly Thr Pro 180 185 190

Vai Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Vai Gly Asn Vai Gin Leu 195 200 205

Ser Ala Phe Vai Ser Asn Gin Ala Gly Gly Glu Tyr Arg Vai Thr His 210 215 220

Ala Asp Asp Pro Vai Pro Arg Leu Pro Pro Leu Ile Phe Gly Tyr Arg 225 230 235 240

His Thr Thr Pro Glu Phe Trp Leu Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Vai 245 250 255

Asp Tyr Thr Ile Ser Asp Vai Lys Vai Cys Glu Gly Ala Ala Asn Leu 260 265 270

Gly Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu Asp Ile Ala Ala His Leu His 275 280 285

Tyr Phe Gin Ala Thr Asp Ala Cys Asn Ala Gly Gly Phe Ser Trp Arg 290 295 300

Arg Tyr Arg Ser Ala Glu Ser Vai Asp Lys Arg Ala Thr Met Thr Asp 305 310 315 320

Ala Glu Leu Glu Lys Lys Leu Asn Ser Tyr Vai Gin Met Asp Lys Glu 325 330 335

Tyr Vai Lys Asn Asn Gin Ala Arg Ser 340 345

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um método para preparar uma massa para bolos ou um produto de bolos preparado a partir da massa, compreendendo adicionarem-se por uma ordem qualquer uma ou mais alf a-amilases que degradem amido cru, uma ou mais fosfolipases, e opcionalmente uma ou mais amilases contra o endurecimento aos ingredientes da massa para bolos, e preparar-se a massa para bolos.

2. 0 método consoante a reivindicação 1, em que a humidade do referido produto de bolos é melhorada, sendo a humidade preferivelmente determinada por um painel de peritos em bolos.

3. 0 método consoante a reivindicação 2, em que a humidade do produto de bolos seja melhorada em pelo menos 0,5 unidades quando avaliada numa escala de 1 a 9 e comparada com uma referência com um valor fixo.

4. O método consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a alfa-amilase que degrada amido cru seja uma alfa-amilase com uma homologia de sequência de pelo menos 85 %, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% com a SEQ ID NO 1.

5. O método consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a fosfolipase seja uma fosfolipase com uma homologia de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% com a SEQ ID NO 2.

6. O método consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a amilase contra o endurecimento mantenha mais do que 20% da sua actividade na presença de 10% de sacarose.

7. O método consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a referida massa para bolos ou produto de bolos seja fermentada quimicamente.

8. 0 método consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a referida massa para bolos compreenda: • 15-30% em peso de farinha e/ou amido, tal como farinha não tratada, farinha termicamente tratada, farinha clorada, amido modificado e/ou amido nativo; • 15-30% em peso de açúcar; • 10-25% em peso de ovos, tal como ovos inteiros, clara de ovo e/ou gema de ovo; • 0-2% em peso de emulsionante, tais como monoacilgliceróis e diacilgliceróis de ácidos gordos, ésteres de propilenoglicol de ácidos gordos, ésteres de ácido láctico de monoacilgliceróis e diacilgliceróis de ácidos gordos, e/ou estearoí1-2-lactilato de sódio; • 0,3-1% em peso de fermento em pó, tal como contendo soda e ácido ou sais de ácido; • 0-1% em peso de hidrocolóides, tais como goma de alfarroba, goma de guar, goma de tara, goma xantana, carragenana, goma-arábica, celulose, celulose modificada, e/ou pectina; • 10-25% em peso de manteiga ou de gordura vegetal tal como por exemplo óleo, margarina, mistura de gorduras, pasta de gordura, ou gordura em pó; e • 0-15% em peso de água; Com a % em peso comparada com o peso total da massa para bolos.

9. Uma massa para bolos ou um produto de bolos compreendendo alfa-amilases que degradem amido cru, uma ou mais fosfolipases, e opcionalmente uma ou mais amilases contra o endurecimento.

10. A massa para bolos ou o produto de bolos consoante a reivindicação 9, em que a alfa-amilase que degrada amido cru seja uma alfa-amilase com uma homologia de sequência de pelo menos 85 %, preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95%, com a SEQ ID NO 1.

11. A massa para bolos ou o produto de bolos consoante a reivindicação 9 ou a 10, em que a fosfolipase seja uma fosfolipase com uma homolgia de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, com a SEQ ID NO 2.

12. A massa para bolos ou o produto de bolos consoante a reivindicação 10 ou a 11, em que a amilase contra o endurecimento mantenha pelo menos 20% da sua actividade na presença de 10% de sacarose.

13. A massa para bolos ou o produto de bolos consoante qualquer uma das reivindicações 10 a 12, em que a referida massa para bolos ou o referido produto de bolos seja um produto p+ara bolos em creme.

14. A utilização de uma ou mais alf a-amilases que degradem amido cru, uma ou mais fosfolipases e opcionalmente uma ou mais amilases contra o endurecimento, para melhorar a humidade de um produto de bolos, em que a humidade seja prefrivelmente determinada por um painel de peritos em bolos.

15. A utilização consoante a reivindicação 14, em que a humidade do produto de bolos seja melhorada em pelo menos 0,5 unidades quando avaliada numa escala de 1 a 9, e comparada com uma referência comum valor fixo.