BR112018077255B1 - Composição compreendendo uma serina protease termofílica e lipase, uso da referida composição, melhorador de pão, método para melhorar a mordida curta de um produto assado e produto assado - Google Patents

Abstract

Verificou-se que a combinação de enzimas, em particular, a combinação de uma serina protease termofílica e de uma lipase, é capaz de melhorar a mordida curta em produtos de panificação. São aqui fornecidas composições compreendendo estas enzimas, o uso desta combinação de enzimas e métodos para preparar produtos de panificação usando a combinação de uma serina protease termofílica e de uma lipase.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à melhoria de mordida curta dos produtos de panificação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Ao comprar produtos de panificação, os consumidores levam em conta uma série de parâmetros, como aparência, maciez, umidade ou aroma. A maneira como o produto de panificação pode ser comido também é um fator determinante; por exemplo, o produto de panificação deve ser facilmente mordido sem ter que mastigá-lo por muito tempo, porque esse aspecto particular é considerado uma característica do frescor do produto. Os consumidores também preferem comprar pães com a menor quantidade de aditivos (no rótulo) possível.

[003] Durante o envelhecimento, as características de um produto de panificação mudam. Em particular, o perfil do aroma muda, o produto torna-se mais duro, mais seco e mais difícil de mastigar, e como resultado, o produto de panificação é considerado “menos fresco”.

[004] A mordida curta de um produto de panificação pode ser definida como a facilidade de morder ou rasgar um pedaço do produto de panificação. Ela é refletida pela força necessária para quebrar uma amostra e o número de mastigações para mastigar uma amostra até assumir uma consistência pronta para ser engolida. De certa forma, a mordida curta é o oposto da mastigabilidade. Além disso, a mordida curta é muito diferente da maciez. Na verdade, a maciez de um pão é refletida pela força necessária para comprimir uma amostra até um determinado grau de deformação. A maciez também é o oposto da dureza. Portanto, um pão pode ser macio sem ter uma mordida curta e vice-versa.

[005] Atualmente já existem alguns métodos propostos para melhorar a mordida curta de um produto de panificação. O documento EP 0776604 descreve a utilização de monoglicerídeos insaturados para produzir pães crocantes para micro-ondas que tem uma mordida curta. O documento WO2009138447 descreve o uso de uma serina ou metaloprotease termoestável ou termoestável intermediária para melhorar a mordida curta dos produtos de panificação.

[006] No entanto, foi observado que esses métodos têm limitações. Na Europa, a adição de monoglicerídeos ou de outros emulsificantes exige uma rotulagem específica dos produtos de padaria com um número E, algo que impede alguns consumidores de comprar o produto.

[007] O uso de uma serina ou metaloprotease intermediária termoestável ou termoestável intermediária melhora a mordida curta dos produtos de panificação em certa medida, mas esta melhoria da mordida curta é limitada, pois altas quantidades de enzima tendem a prejudicar outras propriedades do produto de panificação, como a crocância e a resistência.

[008] Há, portanto, a necessidade de novos métodos e produtos para melhorar ainda mais a mordida curta.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Os inventores verificaram que o uso da combinação de uma serina protease termofílica com uma atividade ideal a uma temperatura superior a 70 °C e uma lipase em aplicações de panificação, e em particular, na produção de pão, tem um efeito sinérgico sobre a mordida curta.

[0010] Por conseguinte, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende: - pelo menos uma primeira enzima, em que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica com uma atividade ideal a uma temperatura maior do que 7 0 °C, de preferência a uma temperatura maior do que 80 °C; e - pelo menos uma segunda enzima, em que a dita segunda enzima é uma lipase.

[0011] Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica em que a razão entre a atividade da protease a uma temperatura ideal e a atividade da protease a 25 °C é maior do que 10, e preferencialmente mais alta do que 15.

[0012] Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica neutra ou alcalina.

[0013] Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima é uma Taq protease, preferencialmente isolada de Thermus aquaticus, preferivelmente aqualisina I ou aqualisina II, e mais preferencialmente aqualisina I, sendo ainda mais preferencialmente aqualisina I isolada de Thermus aquaticus LMG8924.

[0014] Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima está presente em uma quantidade de 100 a 1200 unidades/100 kg de farinha, preferivelmente de 200 a 900 unidades/100 kg de farinha, e mais preferencialmente de 350 a 700 unidades/100 kg de farinha.

[0015] Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, dispõe que a dita segunda enzima é uma triacilglicerol lipase ou uma triacilglicerol acil-hidrolase, como definido pela enzima EC 3.1.1.3, preferencialmente selecionada de lipases obtidas de Thermomyces lanuginosus, Rhizopus oryzae e Rhizomucor miehei.

[0016] Em uma concretização particular, a composição divulgada nesse documento dispõe que a dita segunda enzima está presente em uma quantidade de 5 a 100 LU/100 kg de farinha de lipase de Thermomyces lanuginosus; 0,023 a 0,360 LU/100 kg de farinha de lipase de Rhizopus oryzae; e 50 a 200 LU/100 kg de farinha de lipase de Rhizomucor miehei.

[0017] Por conseguinte, em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de uma composição, como aqui divulgada em aplicações de panificação.

[0018] Em uma concretização particular, a composição, como aqui divulgada, é utilizada em melhoradores de pão.

[0019] Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, é usada em produtos de confeitaria macios e em produtos de panificação crocantes, de preferência em pães, pães macios, donuts, pães doces, pães doces para micro-ondas, bolos dinamarqueses, croissants, pães de hambúrguer, pizza, pão pita e torta.

[0020] Por conseguinte, em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um melhorador de pão que compreende a composição, tal como é divulgada nesse documento.

[0021] Por conseguinte, em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para preparar um produto assado, compreendendo as etapas de adicionar à massa ou à pasta, antes da fornada: - pelo menos uma primeira enzima, em que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica com uma atividade ideal a uma temperatura maior do que 7 0 °C, de preferência a uma temperatura maior do que 80 °C; e - pelo menos uma segunda enzima, em que a dita segunda enzima é uma lipase.

[0022] Em uma concretização particular, o método, tal como divulgado nesse documento, dispõe que o dito produto assado apresenta uma mordida curta aprimorada, preferivelmente em que a força máxima necessária para quebrar um produto assado, preparado usando pelo menos uma primeira enzima sendo uma serina protease termofílica e tendo uma atividade ideal a uma temperatura superior a 70 °C, preferivelmente a uma temperatura superior a 80 °C, e usando pelo menos uma segunda enzima, sendo uma lipase; é reduzida em pelo menos 15% em comparação com um produto assado de referência preparado sem usar nem a dita primeira enzima e nem a segunda enzima.

[0023] Por conseguinte, em uma concretização particular, a composição, como aqui divulgada, é usada na preparação de um produto assado com uma mordida curta aprimorada, em que, preferencialmente, a força máxima necessária para quebrar o produto assado preparado é reduzida em pelo menos 15% em comparação com um produto assado de referência preparado sem usar nem a dita primeira enzima e nem a segunda enzima.

[0024] Em uma concretização particular, o método, tal como é divulgado nesse documento, dispõe que nenhum efeito adverso sobre a reologia da massa, sobre a estrutura do miolo e sobre o volume do produto de panificação resultante é observado.

[0025] Por conseguinte, em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um produto assado preparado a partir de uma massa ou pasta que compreende a composição, tal como ela é divulgada nesse documento. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 (A a C) representa diferentes aspectos da avaliação da mordida curta com o auxílio de um analisador de textura. A Figura 1A representa um analisador de textura equipado com um dispositivo extensor de pizza (2 sondas com pinos. A figura 1B representa a configuração de medição real, em que um pão doce é preso ao dispositivo extensor de pizza e em que a sonda superior se move para cima a uma velocidade constante até o pão doce partir. A figura 1C mostra um gráfico típico da medição em que a força necessária expressa em gramas (g) é medida em função do tempo (s).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0026] Antes dos presentes produtos, composições, utilizações e métodos da invenção serem descritos, deve ser compreendido que essa invenção não está limitada a produtos, composições, usos e métodos ou combinações particulares descritos, uma vez que tais produtos, composições, usos e métodos e combinações podem, naturalmente, variar. Também deve ser compreendido que a terminologia usada nesse documento não tem o propósito de ser limitadora, uma vez que o escopo da presente revelação será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[0027] Conforme utilizado na presente invenção, as formas singulares “um”, “uma” e "o/a" incluem as referências no singular e no plural, a menos que o contexto claramente estabeleça de outra forma.

[0028] Os termos "compreendendo", "compreende" e "compreendido por", conforme utilizados na presente invenção, são sinônimos de "incluindo", "inclui" ou "contendo", "contém" e são inclusivos ou abertos e não excluem outros membros, elementos ou etapas de método não mencionados. Será estimado que os termos "compreendendo", "compreende" e "compreendido por", conforme utilizados na presente invenção, compreendem os termos "consistindo em", "consiste" e "consiste em".

[0029] A citação de intervalos numéricos pelos extremos inclui todos os números e frações incluídos nos respectivos intervalos, bem como os parâmetros citados.

[0030] O termo "cerca de" ou "aproximadamente", conforme utilizado na presente invenção, quando se refere a um valor mensurável, tal como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal e similares, tem o propósito de abranger variações de +/- 10% ou menos, de preferência de +/- 5% ou menos, e mais preferivelmente de +/- 1% ou menos, e ainda mais preferivelmente +/- 0,1% ou menos do valor especificado, na medida em que tais variações sejam apropriadas para realizar a invenção divulgada. Deve ser compreendido que o valor ao qual o modificador "cerca de" ou "aproximadamente" se refere é ele próprio, também especificamente e, de preferência, divulgado.

[0031] Considerando que os termos “um ou mais” ou “pelo menos um”, como um ou mais ou de pelo menos um membro(s) de um grupo de membros, é claro por si, por meio de outras exemplificações, o termo abrange, entre outras coisas, uma referência a qualquer um dos referidos membros, ou a quaisquer dois ou mais dos referidos membros, tais como, por exemplo, qualquer um dentre ≥ 3, ≥ 4, ≥ 5, ≥ 6 ou ≥ 7, etc. dos referidos membros, e até todos os membros mencionados.

[0032] Todas as referências citadas no presente relatório descritivo estão aqui incorporadas a título de referência em suas totalidades. Em particular, os ensinamentos de todas as referências referidas nesse documento são incorporadas por referência.

[0033] Salvo indicação em contrário, todos os termos usados na divulgação da invenção, incluindo os termos técnicos e científicos, têm o mesmo significado conforme é comumente compreendido pelo versado na técnica à qual a invenção pertence. A título de orientação adicional, as definições de termos são incluídas para melhor compreender o ensino da presente invenção.

[0034] Nos trechos a seguir, diferentes aspectos da invenção são definidos em mais detalhes. Cada aspecto assim definido pode ser combinado com qualquer outro aspecto ou aspectos, a menos que seja claramente indicado de outra forma. Em particular, qualquer característica indicada como sendo preferencial ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica ou características indicadas como sendo preferenciais ou vantajosas.

[0035] A referência ao longo deste relatório descritivo a "uma concretização" significa que uma característica, estrutura ou aspecto particular descrito em relação à concretização está incluída em pelo menos uma concretização da presente invenção. Assim, os termos “em uma concretização”, em vários trechos ao longo desse relatório descritivo, podem ou não se referir à mesma concretização. Além disso, as características, estruturas ou aspectos particulares podem ser combinados de qualquer maneira adequada, como seria evidente para um técnico versado no assunto a partir dessa divulgação, em uma ou mais concretizações. Além disso, enquanto algumas concretizações aqui descritas incluem algumas, mas não outras características incluídas em outras concretizações, as combinações de características de diferentes concretizações têm o propósito de estar dentro do escopo da invenção e formam diferentes concretizações, tal como seria compreendido pelos técnicos versados no assunto. Por exemplo, nas reivindicações em anexo, qualquer uma das concretizações reivindicadas pode ser usada em qualquer combinação.

[0036] Os inventores verificaram surpreendentemente que usando uma nova combinação de enzimas, em particular, da combinação de uma serina protease termofílica e de uma lipase, foi possível obter uma melhoria da mordida curta que foi, de longe, mais significativa em comparação com a melhoria da mordida curta esperada pela adição das enzimas isoladamente.

[0037] Mordida curta, também às vezes referida como oposta à mastigabilidade e/ou resistência, é usada para designar a força necessária para quebrar uma amostra de um produto de panificação e/ou o número de mastigações necessárias para mastigar uma amostra de produto de panificação até atingir uma consistência que o torna pronto para engolir. A mordida curta pode ser facilmente medida por um painel de pessoas treinadas e pode ser razoavelmente quantificada usando uma escala arbitrária de mordida curta. Essas técnicas são bem conhecidas na indústria alimentícia e são geralmente referidas como testes organolépticos. Em um método como esse, uma sessão de treinamento inicial é organizada para familiarizar os integrantes do painel com a gama de produtos que serão testados. Nessa sessão, os padrões de referência são apresentados para treinar os membros do painel para reconhecer as diferenças entre os atributos do produto que devem ser medidos. Em uma segunda etapa, os membros do painel recebem um número ou produtos que precisam pontuar com uma mordida curta, em uma escala de 0 a 10.

[0038] A mordida curta também pode ser avaliada com o auxílio de um analisador de textura. Nesse método, um pão doce é preso a um dispositivo extensor de pizza (2 sondas com pinos (consulte a figura 1A)). A sonda superior irá mover-se a uma velocidade constante e, dessa forma, romper o pão doce (consulte a figura 1B). A força necessária expressa em gramas (g) é medida pelo analisador de textura. Ao longo desse processo, a força necessária aumentará até que o pão doce se rompa e a força diminua. Um gráfico típico dessa medida é mostrado na figura 1C. A força máxima (Fmax) medida é um parâmetro comum para avaliar a mordida curta.

[0039] Os inventores averiguaram surpreendentemente que o uso simultâneo de uma quantidade suficiente de serina protease termofílica e de uma quantidade suficiente de uma lipase em uma massa antes da fornada apresenta um efeito sinérgico inesperado na melhoria da mordida curta no produto assado.

[0040] Na verdade, a mordida curta dada pela combinação dos dois tipos de enzimas é maior do que a soma dos efeitos das enzimas individualmente. Há uma sinergia quando o efeito proporcionado pela quantidade x da serina protease termofílica combinada com a quantidade y da lipase é maior do que a soma do efeito dado pela quantidade x da serina protease termofílica e o efeito dado pela quantidade y da lipase.

[0041] Por conseguinte, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende: - pelo menos uma primeira enzima, em que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica, e - pelo menos uma segunda enzima, em que a dita segunda enzima é uma lipase.

[0042] Em uma concretização particular, a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica que tem uma atividade ideal a uma temperatura maior do que 7 0 °C, preferencialmente a uma temperatura maior do que 75 °C e, mais preferencialmente a uma temperatura maior do que 80 °C.

[0043] Verificou-se ainda que o efeito sinérgico que é referido nesse documento está particularmente presente quando a serina protease termofílica, como aqui referida, tem uma atividade ideal a uma temperatura maior do que 70 °C, preferencialmente a uma temperatura maior do que 75 °C e, mais preferencialmente, a uma temperatura maior do que 80 °C.

[0044] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “protease” refere-se geralmente a enzimas (também referidas como peptidases ou proteinases) que hidrolisam as ligações peptídicas que unem os aminoácidos em uma cadeia polipeptídica preferencialmente como definido pela enzima EC 3.4. Elas são classificadas em várias classes de acordo com seus resíduos catalíticos. Entre estas classes, as serina proteases (ou serina endopeptidases) são proteases que clivam ligações peptídicas em proteínas, nas quais a serina serve como o aminoácido nucleofílico no sítio ativo. As serina proteases são definidas pelo código da enzima EC 3.4.21. As serina proteases podem ser adicionalmente subclassificadas de acordo com a sua especificidade de substrato, como sendo semelhantes a tripsina, semelhantes a quimiotripsina, semelhantes a trombina, semelhantes a elastase ou semelhantes a subtilisina.

[0045] No contexto da presente invenção, a atividade da protease é medida utilizando caseína reticulada com azurina (AZCL-caseína) como substrato. A hidrólise por proteases produz fragmentos tingidos solúveis em água, e a taxa de liberação deles (por exemplo, aumento na absorbância a 590 nm) pode estar diretamente relacionado com a atividade enzimática (Protazyme AK Tablets, Megazyme, Irlanda). Mais detalhes sobre a medição da atividade da protease são fornecidos nos exemplos. A atividade da protease também pode ser medida com outros ensaios para a atividade da protease conhecidos pelos técnicos versados no assunto. Entre ela está o método calorimétrico, utilizando caseína como substrato, seguido pela detecção dos aminoácidos liberados com o reagente de fenol segundo Folin e Ciocalteu.

[0046] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “termofílico” e, em particular, “protease termofílica”, conforme utilizados na presente invenção, refere-se às proteases ativas em temperaturas elevadas. Em particular, a(s) protease(s) termofílica(s) tem/têm uma atividade ideal a uma temperatura maior do que 70 °C, de preferência a uma temperatura maior do que 75 °C e, mais preferencialmente, a uma temperatura maior do que 80 °C.

[0047] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “lipase” refere-se geralmente a triacilglicerol lipases ou à triacilglicerol acil-hidrolase, conforme definido pelo código da enzima EC 3.1.1.3. As lipases são definidas nesse documento como enzimas que catalisam a hidrólise dos triacilgliceróis para produzir ácidos graxos livres, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol. A lipase usada nas composições desse documento podem compreender atividades secundárias enzimáticas como, por exemplo, a atividade fosfolipase.

[0048] No contexto da presente invenção, a atividade da lipase medida utilizando palmitato de p-nitrofenila (pNPP) como substrato e de acordo com o modo descrito nesse documento. A atividade enzimática também pode ser medida com outros ensaios para a atividade da lipase conhecida pelos técnicos versados no assunto (consulte, para ver uma revisão, Stoytcheva M. & al, 2012, Current Analytical Chemistry, vol 8, página 400).

[0049] Em particular, a atividade da lipase é medida utilizando palmitato de p-nitrofenila (pNPP) como substrato. A liberação de p-nitrofenol amarelo devido à hidrólise do palmitato de p-nitrofenila pela lipase é medida por espectrofotometria a 414 nm. Uma miliunidade de lipase (LmU) é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar um nanomol (nmol) por minuto de p-nitrofenol a partir do palmitato de p-nitrofenila a 45 °C e em pH 7,5. Mais detalhes sobre a medição da atividade da lipase são fornecidos nos exemplos. A atividade enzimática também pode ser medida com outros ensaios para a atividade da lipase conhecida pelos técnicos versados no assunto (consulte, para ver uma revisão, Stoytcheva M. & al, 2012, Current Analytical Chemistry, vol 8, página 400).

[0050] Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica em que a razão entre a atividade da protease a uma temperatura ideal e a atividade da protease a 25 °C é maior do que 10, e preferencialmente mais alta do que 15. Ao assumir que a dita razão é maior do que 10, a serina protease termofílica, conforme utilizada na presente invenção, proporciona efeitos aprimorados sobre a mordida curta.

[0051] Em uma concretização particular, a composição, conforme é divulgada nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima é obtida pela extração de organismos eucarióticos ou procarióticos que ocorrem na natureza, por síntese ou por engenharia genética. Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica neutra ou alcalina. Embora as proteases fúngicas sejam sensíveis a altas temperaturas, as proteases bacterianas neutras e alcalinas são mais resistentes a tratamentos térmicos a temperaturas mais elevadas. Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima é uma Taq protease, preferencialmente isolada de Thermus aquaticus, preferivelmente aqualisina I ou aqualisina II, e mais preferencialmente aqualisina I, sendo ainda mais preferencialmente aqualisina I isolada de Thermus aquaticus LMG8924.

[0052] Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima, de preferência aqualisina I, está presente em uma quantidade de 100 a 1200 unidades/100 kg de farinha, preferivelmente de 200 a 900 unidades/100 kg de farinha, e mais preferencialmente de 350 a 700 unidades/100 kg de farinha. A aqualisina I é vantajosamente adicionada à massa/pasta a 100 a 1.200 unidades/100 kg de farinha, preferencialmente a 200 a 900 unidades/100 kg de farinha e mais preferivelmente a 350 a 700 unidades/100 kg de farinha, sendo a atividade enzimática obtida usando o método descrito nesse documento.

[0053] Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, dispõe que a dita segunda enzima é uma triacilglicerol lipase ou uma triacilglicerol acil-hidrolase, como definido pela enzima EC 3.1.1.3, preferencialmente selecionada de lipases obtidas de Thermomyces lanuginosus, Rhizopus oryzae e Rhizomucor miehei.

[0054] Em uma concretização particular, a composição, tal como é divulgada nesse documento, dispõe que a dita segunda enzima está presente em uma quantidade de 5 a 100 LU, preferivelmente de 15 a 75 LU, mais preferencialmente de 20 a 60 LU de lipase de Thermomyces lanuginosus/100 kg de farinha; a 0,023 a 0,360 LU, preferivelmente de 0,09 a 0,18 LU de lipase de Rhizopus oryzae/100 kg de farinha; e de 50 a 200 LU, preferencialmente, de 90 a 160 LU, e mais preferencialmente a cerca de 138 LU de lipase de Rhizomucor miehei /100 kg de farinha, sendo a atividade enzimática obtida utilizando o modo descrito nesse documento.

[0055] Em uma concretização particular, a composição, tal como é divulgada nesse documento, dispõe que a razão das quantidades das unidades da dita primeira enzima versus as quantidades das unidades da dita segunda enzima varia entre 5 e 35 (para a Taq protease e a lipase de Thermomyces lanuginosus), entre 1950 e 7800 (para a Taq protease e a lipase de Rhizopus oryzae) e/ou entre 2 e 8 (para a Taq protease e a lipase de Rhizomucor miehei).

[0056] Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, é um melhorador de pão, uma mistura de pastelaria ou uma pré-mistura de pastelaria, preferencialmente, um melhorador de pão.

[0057] Os "melhoradores de pão" (também conhecidos como "condicionadores de massa", "melhoradores de massa", "agente de melhoria" ou "agente de tratamento de farinha") são tipicamente adicionados à massa durante a fornada para melhorar a textura, o volume, o sabor e o frescor do produto assado, bem como para melhorar a maquinabilidade e a estabilidade da massa. Tipicamente, um melhorador de pão compreende ou consiste em: uma ou mais enzimas (como por exemplo, amilases, xilanases, fosfolipases, oxidases, lipoxigenases, desidrogenases e lacases), um ou mais agentes oxidantes ou redutores (tais como, por exemplo, ácido ascórbico, glutationa, cisteína), um ou mais emulsificantes (tais como, por exemplo, monoglicerídeos (ou misturas de monoglicerídeos e diglicerídeos), derivados de monoglicerídeos (como por exemplo, monoglicerídeos succinilados, lactilados ou acetilados, ésteres do ácido diacetiltartárico dos monoglicerídeos (DATEM), monoestearato de glicerol (GMS), monoéster de propilenoglicol,...), emulsificantes de sorbitano (monoestarato de sorbitano), polissorbatos, estearoil-lactilato de sódio (SSL), ésteres de poliglicerol, ésteres de sacarose e lecitina), um ou mais materiais lipídicos (tais como, por exemplo, margarina, manteiga, óleo, gordura), uma ou mais vitaminas (por exemplo, ácido pantotênico e vitamina E), uma ou mais gomas e/ou uma ou mais fontes de fibras (como, por exemplo, fibra de aveia). Misturas de pastelaria tipicamente compreendem todos os ingredientes de uma receita de produto de pastelaria, com exceção de água, gordura (óleo, manteiga, margarina) e ovos. As pré-misturas de pastelaria são tipicamente misturas de pastelaria onde toda ou parte da farinha e do açúcar foi removida.

[0058] Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, é uma massa ou pasta que compreende farinha e pelo menos uma primeira enzima, em que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica, preferencialmente com uma atividade ideal a uma temperatura maior do que 70 °C, preferencialmente a uma temperatura maior do que 75 °C e, mais preferencialmente, a uma temperatura maior do que 80 °C; e pelo menos uma segunda enzima, em que a dita segunda enzima é uma lipase.

[0059] Em particular, a dita segunda enzima está presente em uma quantidade de 5 a 100 LU, preferivelmente de 15 a 75 LU, mais preferencialmente de 20 a 60 LU/100 kg de farinha de lipase de Thermomyces lanuginosus; a 0,023 a 0,360 LU, preferivelmente de 0,09 a 0,18 LU/100 kg de farinha de lipase de Rhizopus oryzae; e de 50 a 200 LU, preferencialmente de 90 a 160 LU, e mais preferencialmente a cerca de 138 LU/100 kg de farinha de lipase de Rhizomucor miehei, sendo a atividade enzimática obtida utilizando o modo descrito nesse documento.

[0060] Em uma concretização adicional, a composição, como aqui revelada, por compreender adicionalmente quantidades adequadas de uma ou mais enzimas (tais como, por exemplo, amilases, xilanases, fosfolipases, oxidases, lipoxigenases, desidrogenases e lacases), um ou mais agentes oxidantes ou redutores (tais como, por exemplo, ácido ascórbico, glutationa, cisteína), um ou mais emulsificantes (tais como, por exemplo, monoglicerídeos (ou misturas de monoglicerídeos e diglicerídeos), derivados de monoglicerídeos (como por exemplo, monoglicerídeos succinilados, lactilados ou acetilados, ésteres do ácido diacetiltartárico dos monoglicerídeos (DATEM), monoestearato de glicerol (GMS), monoéster de propilenoglicol,...), emulsificantes de sorbitano (monoestarato de sorbitano), polissorbatos, estearoil-lactilato de sódio (SSL), ésteres de poliglicerol, ésteres de sacarose e lecitina), um ou mais materiais lipídicos (tais como, por exemplo, margarina, manteiga, óleo, gordura), uma ou mais vitaminas (por exemplo, ácido pantotênico e vitamina E), uma ou mais gomas e/ou uma ou mais fontes de fibras (como, por exemplo, fibra de aveia).

[0061] Em uma concretização adicional, a composição como aqui revelada compreende: - pelo menos uma primeira enzima, em que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica que tem, preferencialmente, uma atividade ideal a uma temperatura maior do que 70 °C, preferencialmente a uma temperatura maior do que 75 °C e, mais preferencialmente, a uma temperatura maior do que 80 °C; - um ou mais monoglicerídeos; e - pelo menos uma segunda enzima, em que a dita segunda enzima é uma lipase.

[0062] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “monoglicerídeos” refere-se em geral, a uma classe de glicerídeos que são compostos por uma molécula de glicerol ligada a um ácido graxo através de uma ligação éster.

[0063] Os monoglicerídeos são um dos muitos tipos de emulsificantes utilizados em aplicações de panificação: entre estes estão os monoglicerídeos (ou misturas de monoglicerídeos e diglicerídeos; referidos como E471 pelo Sistema Internacional de Numeração de Aditivos Alimentares (INS) ou como 184.1505 pela Agência Americana Reguladora de Alimentos e Medicamentos), derivados de monoglicerídeos (como, por exemplo, monoglicerídeos succinilados, lactilados ou acetilados, ésteres do ácido diacetiltartárico dos monoglicerídeos (DATEM), monoestearato de glicerol (GMS), monoéster de propilenoglicol,...), emulsificantes de sorbitano (monoestarato de sorbitano), polissorbatos, estearoil- lactilato de sódio (SSL), ésteres de poliglicerol, ésteres de sacarose e lecitina.

[0064] Além disso, em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de uma composição, como aqui revelada, em aplicações de panificação. No contexto da presente invenção, as aplicações de panificação referem-se a aplicações relacionadas aos produtos de pão e pastelaria. Em particular, os ditos produtos de panificação são produtos de panificação macios e/ou produtos de panificação crocantes, de preferência pães, pães macios, donuts, pães doces, pães doces para micro-ondas, bolos dinamarqueses, croissants, pães de hambúrguer, pizza, pão pita e torta.

[0065] Em uma concretização particular, o uso da composição, como divulgada nesse documento, é fornecido em melhoradores de pão, em misturas de pastelaria ou em pré- misturas de pastelaria.

[0066] É, dessa forma, um objetivo da presente invenção proporcionar o uso das composições de acordo com a presente invenção para melhorar a mordida curta de produtos de panificação que compreendem a etapa de adicionar à massa, antes da fornada, uma quantidade suficiente de uma ou mais serina proteases termofílicas e de uma quantidade suficiente de uma ou mais lipase(s), tal como é divulgado nesse documento.

[0067] Em uma concretização particular, a composição, como aqui divulgada, é usada para melhorar a mordida curta em produtos assados.

[0068] Em um aspecto adicional, é aqui divulgado um método para preparar um produto assado, compreendendo as etapas de adicionar à massa ou à pasta, antes da fornada: - pelo menos uma primeira enzima, em que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica, e - pelo menos uma segunda enzima, em que a dita segunda enzima é uma lipase.

[0069] Em particular, a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica que tem uma atividade ideal a uma temperatura maior do que 70 °C, preferencialmente a uma temperatura maior do que 75 °C e, preferencialmente, a uma temperatura maior do que 80 °C.

[0070] No contexto da presente invenção, a atividade da protease é medida utilizando caseína reticulada com azurina (AZCL-caseína) como substrato. A hidrólise por proteases produz fragmentos tingidos solúveis em água, e a taxa de liberação deles (por exemplo, aumento na absorbância a 590 nm) pode estar diretamente relacionado com a atividade enzimática (Protazyme AK Tablets, Megazyme, Irlanda). Mais detalhes sobre a medição da atividade da protease são fornecidos nos exemplos. A atividade da protease também pode ser medida com outros ensaios para a atividade da protease conhecidos pelos técnicos versados no assunto. Entre ela está o método calorimétrico, utilizando caseína como substrato, seguido pela detecção dos aminoácidos liberados com o reagente de fenol segundo Folin e Ciocalteu.

[0071] No contexto da presente invenção, a atividade da lipase medida utilizando palmitato de p-nitrofenila (pNPP) como substrato e de acordo com o modo descrito nesse documento. A atividade enzimática também pode ser medida com outros ensaios para a atividade da lipase conhecida pelos técnicos versados no assunto (consulte, para ver uma revisão, Stoytcheva M. & al, 2012, Current Analytical Chemistry, vol 8, página 400).

[0072] Em uma concretização particular, o método, como divulgado nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica em que a razão entre a atividade da protease a uma temperatura ideal e a atividade da protease a 25 °C é maior do que 10, e preferencialmente, mais alta do que 15. Ao assumir que a dita razão é maior do que 10, a serina protease termofílica, conforme utilizada na presente invenção, proporciona efeitos aprimorados sobre a mordida curta.

[0073] Em uma concretização particular, a composição, conforme é divulgada nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima é obtida pela extração de organismos eucarióticos ou procarióticos que ocorrem na natureza, por síntese ou por engenharia genética. Em uma concretização particular, a composição, como divulgada nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica neutra ou alcalina.

[0074] Em uma concretização particular, o método, como divulgado nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima é uma Taq protease, preferencialmente isolada de Thermus aquaticus, preferivelmente aqualisina I ou aqualisina II, e mais preferencialmente aqualisina I, sendo ainda mais preferencialmente aqualisina I isolada de Thermus aquaticus LMG8924.

[0075] Em uma concretização particular no método, como divulgado nesse documento, dispõe que a dita primeira enzima, de preferência aqualisina I, é adicionada à massa ou pasta em uma quantidade de 100 a 1200 unidades/100 kg de farinha, preferivelmente de 200 a 900 unidades/100 kg de farinha, e mais preferencialmente de 350 a 700 unidades/100 kg de farinha. A aqualisina I é vantajosamente adicionada à massa/pasta a 100 a 1.200 unidades/100 kg de farinha, preferencialmente a 200 a 900 unidades/100 kg de farinha e mais preferivelmente a 350 a 700 unidades/100 kg de farinha, sendo a atividade enzimática obtida usando o método descrito nesse documento.

[0076] Em uma concretização particular, o método, como divulgado nesse documento, dispõe que a dita segunda enzima é uma triacilglicerol lipase ou uma triacilglicerol acil-hidrolase, como definido pela enzima EC 3.1.1.3, preferencialmente selecionada de lipases obtidas de Thermomyces lanuginosus, Rhizopus oryzae e Rhizomucor miehei.

[0077] Em uma concretização particular, o método, tal como é divulgado nesse documento, dispõe que a dita segunda enzima é adicionada à massa ou pasta em uma quantidade de 5 a 100 U, preferivelmente de 15 a 75 U, mais preferencialmente de 20 a 60 U/100 kg de farinha de lipase de Thermomyces lanuginosus; a 0,023 a 0,360 U, preferivelmente de 0,09 a 0,18 U/100 kg de farinha de lipase de Rhizopus oryzae; e de 50 a 200 U, preferencialmente de 90 a 160 U, e mais preferencialmente a cerca de 138 U/100 kg de farinha de lipase de Rhizomucor miehei, sendo a atividade enzimática obtida utilizando o modo descrito nesse documento.

[0078] Em uma concretização particular do método, como aqui divulgado, podem ser adicionadas quantidades apropriadas de enzimas diretamente na massa ou na pasta durante a sua preparação ou antes da mistura dos ingredientes. Em outras concretizações, as enzimas podem ser adicionadas como parte de um melhorador (de pão), uma mistura ou pré-mistura de pastelaria, de preferência como parte de um melhorador de pão. Em particular, as enzimas ou o melhorador de pão são adicionados antes da prova.

[0079] É aqui revelado, em uma concretização particular, um método para preparar um produto assado, compreendendo as etapas de adicionar à massa ou farinha, antes da fornada: - pelo menos uma primeira enzima, em que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica que tem, preferencialmente, uma atividade ideal a uma temperatura maior do que 70 °C, preferencialmente a uma temperatura maior do que 75 °C e, mais preferencialmente, a uma temperatura maior do que 80 °C; - pelo menos uma segunda enzima, em que a dita segunda enzima é uma lipase; e - um ou mais monoglicerídeos.

[0080] Em uma concretização particular, o método, tal como divulgado nesse documento, dispõe que o dito produto assado apresenta uma mordida curta aprimorada, preferivelmente em que a força máxima necessária para quebrar um produto assado, preparado usando pelo menos uma primeira enzima sendo uma serina protease termofílica e tendo uma atividade ideal a uma temperatura superior a 70 °C, preferivelmente a uma temperatura superior a 75 °C e preferivelmente a uma temperatura superior a 80 °C, e usando pelo menos uma segunda enzima, sendo uma lipase; é reduzida em pelo menos 15% em comparação com um produto assado de referência preparado sem usar nem a dita primeira enzima e nem a dita segunda enzima. Em concretizações particulares, a força máxima necessária para quebrar um produto assado utilizando a dita primeira e segunda enzima é reduzida em pelo menos 20% em comparação com um produto assado de referência preparado utilizando nenhuma das ditas primeira ou segunda enzimas. Em concretizações particulares, a mordida curta é medida no dia após a fornada.

[0081] Em uma concretização particular, o método, tal como divulgado nesse documento, dispõe que o dito produto assado apresenta uma mordida curta aprimorada, preferivelmente em que a força máxima necessária para quebrar um produto assado, preparado usando pelo menos uma primeira enzima sendo uma serina protease termofílica e tendo uma atividade ideal a uma temperatura superior a 70 °C, preferivelmente a uma temperatura superior a 75 °C e preferivelmente a uma temperatura superior a 80 °C, e usando pelo menos uma segunda enzima, sendo uma lipase; é reduzida em pelo menos 15% em comparação com um produto assado de referência preparado usando a dita primeira enzima ou a dita segunda enzima. Em concretizações particulares, a força máxima necessária para quebrar um produto assado utilizando a dita primeira e segunda enzimas é reduzida em pelo menos 20% em comparação com um produto assado de referência preparado utilizando a dita primeira ou a dita segunda enzima. Isso mostra que a combinação das ditas primeira e segunda enzimas proporciona uma ação sinérgica que proporciona uma mordida curta melhor do que a esperada. Em concretizações particulares, a mordida curta é medida no dia após a fornada.

[0082] Em uma concretização particular, o método, tal como é divulgado nesse documento, dispõe que nenhum efeito adverso sobre a reologia da massa, sobre a estrutura do miolo e sobre o volume do produto de panificação resultante é observado.

[0083] Além disso, em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um produto assado preparado a partir de uma massa ou pasta que compreende a composição, tal como ela é divulgada nesse documento.

[0084] No contexto da presente invenção, um produto assado é um produto de panificação ou pastelaria conhecido na técnica, tal como, por exemplo, aqueles selecionados do grupo compreendendo pão, pães macios, roscas (bagels), donuts, bolos dinamarqueses, pães de hambúrguer, pizza, pão pita, ciabatta, pães-de-ló, bolos de nata, bolos de libra, bolinhos, cupcakes, bolos cozidos, waffles, brownies, bolos de donuts, donuts levedados por leveduras, baguetes, pães, bolachas, biscoitos, cookies, crostas de torta, roscas (rusks) e outros produtos assados. Mais preferencialmente, a presente invenção refere-se aos pães, baguetes e pãezinhos. Em particular, o dito produto assado compreende produtos de panificação macios e produtos de panificação crocantes, de preferência pães, pães macios, donuts, pães doces, pães doces para micro-ondas, bolos dinamarqueses, croissants, pães de hambúrguer, pizza, pão pita e torta. EXEMPLOS Exemplo 1: Determinação das atividades enzimáticas A atividade da protease é medida em caseína reticulada com azurina (AZCL-caseína). Ela é preparada por coloração e reticulação da caseína para produzir um material que hidrata em água, mas é insolúvel em água. A hidrólise pelas proteases produz fragmentos tingidos solúveis em água e a taxa de liberação destes (aumento da absorbância a 590 nm) pode estar diretamente relacionada com a atividade enzimática (Protazyme AK Tablets, Megazyme, Irlanda). Um tablete de protazime AK é incubado em Na2HPO4.2H2O 100 mM; pH 7,0 a 60 °C durante 5 min. Adiciona-se uma alíquota de enzima (1,0 ml) e a reação é deixada continuar durante exatos 10 min. A reação é terminada pela adição de fosfato trissódico (10 ml, 2% p/v, pH 12,3). O tubo fica em repouso durante cerca de 2 min à temperatura ambiente e o seu conteúdo é filtrado. A absorbância do filtrado é medida a 590 nm contra um branco de substrato.

[0085] A atividade é expressa como: mU (miliunidades)/mL = (34,2 * (Abs590 enzima - Abs590 branco) + 0,6)/diluição. Uma unidade corresponde a 1000 mU. A atividade da lipase é medida utilizando palmitato de p- nitrofenila (pNPP) como substrato. A liberação de p- nitrofenol amarelo devido à hidrólise do palmitato de p- nitrofenila pela lipase é medida por espectrofotometria a 414 nm. Uma miliunidade de lipase (LmU) é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar um nanomol (nmol) por minuto de p-nitrofenol a partir do palmitato de p-nitrofenoíla a 45 °C e em pH 7,5. Para realizar o teste, 120 uL de uma solução de pNPP 1 mM (tampão de fosfato de sódio a 0,05 M em pH 7,5 contendo 0,69 M de acetona e 0,0049 M de Triton X-100) são misturados com 60 μl de amostra de enzima e incubados a 45 °C durante 30 min.

[0086] A absorbância é medida a 414 nm contra um branco de substrato em microplacas de microtitulação de 96 poços.

[0087] A atividade é expressa como: LmU/ml = (((Abs enzima - Abs branco) / 30) x 0,18)) / (13380 x 0,06)) x diluição da amostra x 1000000 [30 = tempo reacional em minutos; 0,18 = volume reacional em ml; 13380 = coeficiente de extinção molar a 414 nm (M-1 cm-1); 0,06 = volume de amostra de enzima em ml; 1000000 para converter em LmU/ml] Uma unidade de lipase (LU) corresponde a 1000 miliunidades de lipase (LmU) Exemplo 2: pães doces macios Pães doces macios foram preparados usando as composições de massa da tabela 1. As enzimas utilizadas foram as seguintes: - TlLip: lipase de Thermomyces lanuginosus expressa em Aspergillus oryzae (Noopazyme - Novozymes, Dinamarca). - TaProt: Taq1 protease de Thermus aquaticus. (aqualisina I), como descrito no documento WO2009138447A1. A enzima tem uma atividade de temperatura ideal a 80 °C. Tabela 1 *contém farinha, ésteres mono e diacetiltartáricos de mono e diglicerídeos dos ácidos graxos (E472e), dextrose, ácido ascórbico e enzimas (alfa-amilase, xilanase)

[0088] Os ingredientes são misturados durante 2 min em baixa velocidade e durante 6 min em alta velocidade em um misturador espiral tipo Diosna (SP24). A temperatura final da massa é 27 °C. Após uma prova em massa de 5 min, uma massa de 1500 g é arredondada e impermeabilizada durante 10 min na temperatura (25 °C) e umidade (50 a 55%) da padaria. Pedaços de massa de 50 g são formados usando um molde Eberhardt. Esses pedaços de massa são impermeabilizados a 35 °C por 85 min a 95% de umidade relativa em uma caixa de prova Koma. Os pães doces são, em seguida, assados a 250 °C durante 9 min em um forno Miwe Condo sem vapor. É evidente para um técnico versado no assunto que os mesmos resultados finais podem ser obtidos utilizando equipamento de outros fornecedores.

[0089] A mordida curta dos pães doces foi avaliada no dia seguinte à fornada com um analisador de textura TA- XT2™ equipado com um dispositivo extensor de pizza usado a uma velocidade de 20 mm/seg. Isso possibilitou a medição da força (força máxima necessária para quebrar o pão doce expressa em gramas (g)). Como fatores como o lote da farinha, temperatura ambiente e umidade, e o tempo entre a fornada e o teste podem afetar os referidos parâmetros, as medidas são comparadas a uma referência usando os mesmos ingredientes, assados e testados em paralelo. Para cada teste, 10 pães doces são avaliados. O desvio padrão da medição foi igual a 33. O intervalo de confiança foi calculado multiplicando-se o desvio padrão pelo coeficiente da lei de Student obtido por meio de um valor de risco α de 5% e um número de graus de liberdade igual a 5. O intervalo de confiança foi igual a 85.

[0090] Dois ingredientes atuam sinergicamente se o efeito do uso simultâneo dos dois ingredientes for maior do que a soma dos efeitos dos ingredientes tomados individualmente, levando em consideração um intervalo de confiança de 95%. Em outras palavras, existe uma sinergia quando o efeito de (x g enzima A + y g enzima B) é maior do que a soma do efeito de x g de enzima A e o efeito de y g de enzima B.

[0091] Os resultados das medições de mordida curta com o analisador de textura TA-XT2™ estão listados na tabela 2. Tabela 2

[0092] Os resultados mostram que a redução real da força obtida quando as enzimas são combinadas é menor do que o limite inferior do intervalo de confiança do valor teórico (efeito aditivo), demonstrando um efeito sinérgico na mordida curta. A mordida curta dos pães doces também foi avaliada no dia após a fornada por um painel treinado de especialistas em panificação. Eles foram solicitados a marcar os produtos de acordo com uma referência em uma escala de 0 a 10 pontos, com 0 sendo o valor mínimo (mastigável) e 10 sendo o valor máximo (com textura de borracha). O desvio padrão da medida sensorial da mordida curta é igual a 0,3. O intervalo de confiança foi calculado multiplicando-se o desvio padrão pelo coeficiente da lei de Student obtido por meio de um valor de risco α de 5% e um número de graus de liberdade igual a 5. O intervalo de confiança foi igual a 0.5.

[0093] Os resultados estão listados na tabela 3. Tabela 3

[0094] Os resultados mostram que o aumento real da mordida curta obtida quando as enzimas são combinadas é maior do que o limite superior do intervalo de confiança do valor teórico (efeito aditivo), demonstrando um efeito sinérgico na mordida curta.

Exemplo 3a: Outra lipase (1)

[0095] Pães doces macios foram preparados de acordo com a receita e o processo do exemplo 2 usando as combinações de enzimas listadas na tabela 4. As enzimas utilizadas foram as seguintes: - RmLip: lipase de Rhizomucor miehei expressa em Aspergillus oryzae (Palatase 2000L - Novozymes, Dinamarca). - TaProt: como no exemplo 1 Tabela 4

[0096] A mordida curta dos pães doces foi avaliada com os mesmos métodos do exemplo 1. O desvio padrão e o intervalo de confiança para a análise de textura foram iguais a 38 e 97, respectivamente. O desvio padrão e o intervalo de confiança para a análise sensorial foram iguais a 0,2 e 0,5, respectivamente.

[0097] Os resultados são apresentados na tabela 5 (análise de textura) e na tabela 6 (análise sensorial) Tabela 5 Tabela 6

[0098] É observado um efeito sinérgico da combinação de enzimas

Exemplo 3b: Outra lipase (2)

[0099] Pães doces macios foram preparados de acordo com a receita e o processo do exemplo 1 usando as combinações de enzimas listadas na tabela 7. As enzimas utilizadas foram as seguintes: - RoLip: lipase de Rhizopus oryzae (Bakezyme L 80000 B - DSM) - TaProt como no exemplo 1 Tabela 7

[00100] A mordida curta dos pães doces foi avaliada com os mesmos métodos do exemplo 1. Os resultados são apresentados na tabela 8 Tabela 8

[00101] O efeito sinérgico é observado com uma terceira lipase.

Exemplo 4: Outras proteases

[00102] Pães doces macios foram preparados de acordo com a receita e o processo do exemplo 1 usando as combinações de enzimas listadas nas tabelas 9 e 10. As enzimas utilizadas foram as seguintes: - TlLip: lipase de Thermomyces lanuginosus expressa em Aspergillus oryzae (Noopazyme - Novozymes). - SuProt: serina protease de Bacillus licheniformis (subtilisina - P5380-1G, Sigma Aldrich). A enzima tem uma atividade de temperatura ótima a 60 °C. - ThProt: metaloprotease de Geobacillus stearothermophilus (termolisina - P1512-1G, Sigma Aldrich) Tabela 9 Tabela 10

[00103] A mordida curta dos pães doces foi avaliada com o método de análise de textura como no exemplo 1. Os resultados são apresentados nas tabelas 11 e 12 Tabela 11 Tabela 12

[00104] Nenhum efeito sinérgico é observado com uma protease tendo uma atividade de temperatura ideal de 65 °C e com uma metaloprotease.

Claims (7)

1. Composição caracterizada pelo fato de compreender: - pelo menos uma primeira enzima, em que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica que tem uma atividade ideal a uma temperatura maior do que 7 0 °C, preferencialmente, a uma temperatura maior do que 75 °C, e, mais preferencialmente, a uma temperatura maior do que 80 °C; e, em que a razão entre a atividade da protease na temperatura ótima e a atividade da protease a 25°C é superior a 10, preferencialmente, superior a 15; e - pelo menos uma segunda enzima, em que a dita segunda enzima é triacilglicerol lipase ou triacilglicerol acilhidrolase conforme definido pela enzima EC 3.1.1.3; em que a referida primeira enzima é uma Tag protease, preferencialmente isolada de Thermus aquaticus, preferivelmente aqualisina I ou aqualisina II, e mais preferencialmente aqualisina I, sendo ainda mais preferencialmente aqualisina I isolada de Thermus aquaticus LMG8924; e em que a dita segunda enzima é selecionada de lipases obtidas de Thermomyces lanuginosus, Rhizopus oryzae e Rhizomucor miehei.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida primeira enzima está presente em uma quantidade de 100 a 1200 unidades/100 kg de farinha, preferencialmente, de 200 a 900 unidades/100 kg de farinha, mais preferencialmente, a 350 a 700 unidades/100 kg de farinha e/ou, em que a referida segunda enzima está presente numa quantidade de 5 a 100 LU de lipase de Thermomyces lanuginosus /100 kg de farinha; na quantidade de 0,023 a 0,360 UL de lipase de Rhizopus oryzae /100 kg de farinha; ou na quantidade de 50 a 200 LU de lipase de Rhizomucor miehei / 100 kg de farinha.

3. Uso de uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2 para melhorar a mordida curta de produtos assados caracterizado pelo fato de ser em melhoradores de pão.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de ser em produtos de panificação macios e em produtos de panificação crocantes, de preferência, pães, pães macios, donuts, pães doces, pães doces para micro-ondas, bolos dinamarqueses, croissants, pães de hambúrguer, pizza, pão pita e torta.

5. Melhorador de pão caracterizado pelo fato de compreender a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2.

6. Método para melhorar a mordida curta de um produto assado caracterizado pelo fato de compreender as etapas de adicionar à massa ou farinha, antes da fornada: - pelo menos uma primeira enzima, em que a dita primeira enzima é uma serina protease termofílica com uma atividade ideal a uma temperatura maior do que 7 0 °C, de preferência a uma temperatura maior do que 80 °C, e, em que a referida primeira enzima é uma serina protease termofílica, em que a razão entre a atividade da protease na temperatura ótima e a atividade da protease a 25°C é superior a 10, preferencialmente, superior a 15; e - pelo menos uma segunda enzima, em que a dita segunda enzima é uma triacilglicerol lipase ou triacilglicerol acilhidrolase conforme definido pela enzima EC 3.1.1.3; em que a referida primeira enzima está presente em uma quantidade de 100 a 1200 unidades/100 kg de farinha, preferencialmente, em 200 a 900 unidades/100 kg de farinha, mais preferencialmente, em 350 a 700 unidades/100 kg de farinha de uma Tag protease, preferencialmente de Thermus aquaticus, preferencialmente, aqualisina I ou aqualisina II, mais preferencialmente, aqualisina I, ainda mais preferencialmente, aqualisina I de Thermus aquaticus LMG8924, e/ou, em que a referida a segunda enzima está presente em uma quantidade de 5 a 100 LU de lipase de Thermomyces lanuginosus /100 kg de farinha; de 0,023 a 0,360 UL de lipase de Rhizopus oryzae /100 kg de farinha; ou de 50 a 200 LU de lipase de Rhizomucor miehei / 100 kg de farinha.

7. Produto assado preparado a partir de uma massa ou pasta caracterizado pelo fato de compreender a composição conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2.