PT2694074T - Uso de antagonistas de recetor de adenosina a2b para tratar insuficiência cardíaca e arritmia em pacientes pós-enfarte do miocárdio - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

USO DE ANTAGONISTAS DE RECETOR DE ADENOSINA A2B PARA TRATAR INSUFICIÊNCIA CARDÍACA e ARRITMIA EM PACIENTES PÓS-ENFARTE

DO MIOCÁRDIO

CAMPO DA REVELAÇÃO A revelação é direcionada a compostos para uso na redução de arritmia em um paciente humano que sofreu um enfarte do miocãrdio (MI).

ANTECEDENTE 0 enfarte do miocárdio agudo (AMI) é distinguido por necrose isquémica do miocárdio seguida por uma resposta inflamatória intensa. Tanto a extensão da perda inicial de miocárdio viável quanto a intensidade da resposta inflamatória são preditores independentes da remodelação cardíaca subsequente distinguida por aumento cardíaco e disfunção. A lesão miocárdica pode induzir fibrose cardíaca, de modo a levar a arritmias e insuficiência cardíaca. Todos os anos, cerca de 200.000 pessoas sofrem STEMI agudo (enfarte do miocárdio por elevação do segmento ST), que tem uma mortalidade de cerca de 200 em um ano. Em 2011, houve cerca de 7,6 milhões de pacientes pós-enfarte do miocãrdio e foi estimado que 10 a 70Õ dos mesmos progredissem para insuficiência cardíaca em 5 anos.

Entretanto, nem toda a fibrose cardíaca após enfarte do miocãrdio (MI) é prejudicial. Por exemplo, imediatamente após o AMI, os tecidos na zona de enfarte são submetidos a um reparo fibrótico compensatório da área necrótica com formação de cicatriz. Sem o reparo fibrótico e cicatriz adequados, o coração pode romper-se, o que pode ser fatal. A remodelação de LV patológica durante a fase maladaptativa, em contrapartida, pode levar a insuficiência cardíaca e arritmia. Portanto, a inibição cega de fibrose cardíaca, sem o momento ou localização corretos, não seria eficaz na restauração da função cardíaca e redução de morte de pacientes pós-MI. Em vez disso, tais tratamentos podem levar a casos adversos graves. A fibrose intersticial impede o acoplamento normal de miócitos cardíacos e cria um substrato para arritmia, que poderia levar a uma morte cardíaca repentina. A fibrose cardíaca foi associada ao processo de insuficiência cardíaca, que leva a uma variedade de doenças do coração, inclusive aquelas associadas à sobrecarga tanto de volume quanto de pressão (Weber et al., Circ., 83:1849 a 1865 (1991); Schaper et al. , Basic Res. Cardiol., 87: S1303 a S1309 (1992); Boluyt et al., Circ. Res., 75:23 a 32 (1994); e Bishop et al. , J. Mol. Cell Cardiol., 22:1157 a 1165 (1990) ) . No caso de insuficiência cardíaca, a fibrose envolve um aumento tanto na quantidade de fibroblastos quanto na deposição de matriz (Cardiovasc. Res., 30:537 a 543 (1995)), o que sugere a importância do fibroblasto no desenvolvimento dessa afeção. A adenosina (Ado) é uma molécula pequena poliatómica libertada em resposta à lesão de tecido que promove hiperemia e modula a inflamação através de interação com um de entre quatro tipos de recetores de membrana de superfície de célula. Em alguns modelos de inflamação, o bloqueio de AdoR A2B tem a intensidade limitada da resposta inflamatória e cicatrização aprimorada, enquanto em outros, a sinalização de AdoR A2B pareceu inibir a inflamação. Dessa forma, não é possível generalizar a função do AdoR A2B. 0 documento W003/105666 revela antagonistas de recetor de adenosina A2B que têm uso na prevenção, limitação ou tratamento de lesão de reperfusão de isquemia.

SUMÁRIO A presente revelação é direcionada à surpreendente e inesperada constatação de que os antagonistas de recetor de adenosina A2B inibem a remodelação de ventrículo esquerdo (VL) patológica e aumenta a fração de ejeção de LV. Em pacientes pós-enfarte do miocãrdio (MI), a inibição de remodelação de LV pode ser traduzida numa melhoria na função de LV e uma menor incidência de arritmias, que, por sua vez, pode reduzir a morte cardiovascular (CV) e hospitalização.

Foi constatado, ainda, que o recetor de adenosina (AdoR) A2B é o subtipo predominante de AdoRs expressos em fibroblastos cardíacos humanos (HCF) e a ativação desse recetor aumenta a libertação de IL-6 e a produção de colagénio, expressão de marcadores fibróticos e a libertação de biomarcadores de doenças cardiovasculares (CVD) . Em particular, foi constatado que um antagonista de recetor de adenosina A2B poderia abolir completamente tal ativação, reduzindo, assim, a resposta fibrótica em doenças do coração, de modo a levar à inibição de aumento de LV e fração de ejeção de LV aumentada.

Em vista do que foi supracitado, a revelação é direcionada aos compostos reivindicados para uso na redução da incidência de arritmia num paciente que sofreu enfarte do miocãrdio (MI) . Em algumas modalidades, a morte ou hospitalização é reduzida através do tratamento da arritmia. 0 antagonista de recetor de adenosina A2B é N- (6-amino-l-etil-2,4-dioxo-3-propil-1,2,3,4-tetrahidro-pirimidin-5-il)-1-(3-(trifluorometil)benzil)-lH-pirazol-4-carboximida, chamado, doravante, de Composto A, que tem a seguinte fórmula química:

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras IA a D mostram que os efeitos de NECA sobre a libertação de IL-β, colagénio, ST-2 e PAPPA e sobre a expressão de actina muscular a-suave (SMAcx) e pró-colagénio oí-1 (CollAi) foram completamente abolidas por um antagonista de AdoR A2B, o Composto A (Comp A) . A Figura 2 mostra que o tratamento com o Composto A (Comp A) reduziu significativamente a atividade de caspase-1 (painel esquerdo), reduziu o diâmetro diastólico final (painel intermediário esquerdo), aumentou a fração de ejeção de LV (painel intermediário direito) e reduziu o índice de desempenho do miocárdio (painel direito) em comparação com o veículo após o enfarte do miocárdio agudo em murganhos. A Figura 3 é a linha temporal para o estudo no Exemplo 4. A Figura 4 mostra que a administração do antagonista de AdoR A2B, Composto A (Comp A) , fornecida imediatamente após a ligadura da coronária (4 mg/kg, i.p., duas vezes diárias) impediu a ativação de caspase-1 no tecido do coração medido 72 horas após a cirurgia e inibiu significativamente o recrutamento de leucócito (CD45+) no coração. ™ P<0,001 vs. simulação; # P<0,01 vs. veículo. N =4-6 por grupo. A Figura 5 inclui gráficos para mostrar que o tratamento com o antagonista de AdoR A2B, Composto A, levou a uma redução significativa nos níveis de plasma de marcadores inflamatórios associados a AMI. As concentrações de plasma de IL-6, TNF-α, sEselectina, sICAM e sVCAM foram medidas com o uso de Luminex no dia 28 após a cirurgia. + P<0,05 vs. veículo; ™ P<0,001 vs. veículo. A Figura 6 apresenta imagens ecocardiográficas exemplificativas do Modo B e do Modo M de um murganho tratado com o veículo (painéis superiores) e um tratado com o antagonista de AdoR A2B, Composto A (painéis inferiores) 2 semanas após a cirurgia de enfarte do miocárdio agudo.

As Figuras 7A a F mostram que, após a cirurgia de ligadura da artéria coronária, os murganhos tratados com veículo apresentavam um aumento significativo dos ventrículos esquerdo e direito (diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo (LVEDD) (A), diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo (LVESD) (B) e área diastólica final do ventrículo direito (RVEDA)) (E) e uma redução significativa na função ventricular esquerda e direita (fração de ejeção do ventrículo esquerdo (LVEF) (C), índice de desempenho do miocárdio (MPI) (D) e excursão sistólica do plano anular tricúspide (TAPSE)) (F). 0 tratamento com o antagonista de AdoR A2B, Composto A, (4 mg, i.p., duas vezes diárias) limitou significativamente o aumento cardíaco e a disfunção. ™P<0,001 vs . linha de base (ou simulação), + P<0,001 vs. veículo.

As Figuras 8A a D mostram que a expressão de quatro biomarcadores inflamatórios, MCP-1, IL-lb, IL-2 e IL-6, foi reduzida através do tratamento com o Composto A e para dois dos mesmos, MCP-1 e IL-lb, a redução no grupo de 10 mg/kg/dia foi estatisticamente significativa.

As Figuras 9A a D mostram LVEDD (A), LVESD (B), RVEDA (C) e MPI (D) medidos com o uso de ECHO6 no Dia 28. Os valores são apresentados como média de ± SEM. n = 4 - 9. ™, p < 0,05 em comparação com o controlo de simulação; #, p < 0,05 em comparação com MI. As estatísticas foram determinadas com o uso de ANOVA seguido do teste de Bonferroni. Essas Figuras demonstram que o Composto A inibe a remodelação do miocárdio pós-MI adversa e aprimora a função do miocárdio.

As Figuras 10A a C mostram níveis de plasma de ST2 (A) IL-6 (B) e TNF-α (C) e os valores são apresentados como média de ± SEM. n = 4 - 8. ™, p< 0,05 em comparação com o controlo de simulação; #, p < 0,05 em comparação com MI. As estatísticas foram determinadas com o uso de ANOVA seguido do teste de Bonferroni. Essas Figuras mostram que o Composto A reduz os biomarcadores de citocina inflamatória de plasma num modelo de murganho de remodelação do miocãrdio pós-MI.

As Figuras 11A a C apresentam níveis de plasma de sE-selectina (A) , sICAM (B) e sVCAM (C) . Os valores são apresentados como média de ± SEM. n = 4. ™, p < 0,05 em comparação com o controlo de simulação; #, p < 0,05 em comparação com MI. As estatísticas foram determinadas com o uso de ANOVA seguido do teste de Bonferroni. Essas Figuras mostram que o Composto A reduz os níveis de plasma de moléculas de adesão solúveis num modelo de murganho de remodelação do miocãrdio põs-MI.

As Figuras 12A a B incluem gráficos para mostrar que o Composto A reduziu o volume sistólico final do ventrículo esquerdo (A) e aumentou a fração de ejeção do ventrículo esquerdo (B) . (A) volume sistólico final do ventrículo esquerdo (LVESV) no grupo de MI e MI + Composto A foi medido com o uso de ECHO na linha de base, 1 semana e 5 semanas pós-MI. Os valores são apresentados como média de ± SEM. n = 13. ™, p < 0,05 em comparação com o controlo de veículo com o uso de ANOVA seguido do teste de Bonf erroni. (B) LVEF em controlo de veículo (MI) e grupo de Composto A (MI + Composto A) foi medida com o uso de ECHO na linha de base, 1 semana e 5 semanas pós-MI. A LVEF foi calculada com o uso da fórmula: (LVEDV LVESV)/LVEDV ™ 100. Os valores são apresentados como média de ± SEM. n = 13. ™, p < 0,05 em comparação com o controlo de veículo com o uso de ANOVA seguido do teste de Bonferroni.

As Figuras 13A a B são mapas de vetor de condução de paredes anteriores de LV que mostram as Setas menores de velocidade de condução próximas às áreas de MI designadas mais notáveis no controlo de veículo (A) em comparação com a amostra do Composto A (B).

As Figuras 14A a C mostram que o Composto A aumenta as velocidades de condução em zonas de enfarte e zonas de contorno de enfarte (IBZs). CVs para zonas de (A) normais, (B), de contorno e (C) de enfarte em ratos de MI de Controlo de Placebo e tratados com Composto A em vários comprimentos de ciclo de frequência cardíaca. *, p < 0,05 em comparação com o controlo de placebo.

As Figuras 15A a B são imagens microscópicas de alta potência (1003) de IBZs manchadas com vermelho Sirius (mostrado como cinza escuro) para fibrose com mancha de contraste de verde rápido (cinza claro). A fibrose estendeu-se numa distribuição semelhante a um dedo da área de enfarte para as áreas de contorno para o controlo de veículo (A), porém, a uma extensão menor para a amostra de Composto A (B) . Essas imagens mostram que o Composto A reduz a fibrose na IBZ.

As Figuras 16A a C mostram níveis de plasma de IL-6 (A) , PAI -1 (B) e BNP (C) medidos com o uso de luminex em 5 semanas pós-MI. Os valores são apresentados como média de ± SEM. n = 4 - 9. ™, p < 0,05 em comparação com o controlo normal; #, p < 0,05 em comparação com MI. As estatísticas foram determinadas com o uso de ANOVA seguido do teste de Bonferroni. Essas Figuras mostram que o Composto A reduz os biomarcadores de plasma no modelo de rato de remodelação pós-MI. A Figura 17 é um gráfico que mostra a libertação de IL-6 de miócitos cardíacos humanos tratados com NE CA, juntamente com o Composto A, B ou C, nas doses indicadas. A Figura 18 ilustra um mecanismo proposto, através do qual o Composto A inibe a pós-MI remodelação de LV patológica e aprimora as funções cardíacas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Antes de descrever a presente revelação em maiores detalhes, os termos a seguir serão definidos primeiramente.

Deve ser entendido que a presente revelação não é limitada às modalidades particulares descritas, visto que as mesmas, obviamente, podem variar. Deve ser entendido, ainda, que a terminologia usada no presente documento tem o propósito apenas de descrever modalidades particulares e não se destina a ser limitadora, visto que o âmbito da presente revelação será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

Deve ser observado que, conforme usadas no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "a/o" incluem referentes no plural, exceto quanto o contexto afirma claramente o contrário. 1. Definições

Exceto quanto definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que é comummente entendido por um elemento de habilidade comum na técnica à qual a presente revelação pertence. Conforme usado no presente documento, os seguintes termos têm os seguintes significados.

Conforme usado no presente documento, o termo "que compreende" ou "compreende" destina-se a significar que as composições e métodos incluem os elementos mencionados, porém, sem excluir outros. "Que consiste essencialmente em", quando usado para definir composições e métodos, significa excluir outros elementos de qualquer significância essencial para a combinação para o propósito declarado. Dessa forma, uma composição que consiste essencialmente nos elementos conforme definido no presente documento não excluiria outros materiais ou etapas que não afetem materialmente a(s) característica(s) básica(s) e inovadora(s) da revelação reivindicada. "Que consiste em" significa excluir mais do que os elementos residuais de outros ingredientes e etapas de método substanciais. As modalidades definidas por cada um desses termos de transição são abrangidas pelo âmbito da presente revelação. 0 termo "cerca de", quando usado antes de uma designação numérica, por exemplo, temperatura, tempo, quantidade e concentração, inclusive faixa, indica aproximações que podem variar em (+) ou (-) 10Ó, 50 ou 1Ó. 0 termo "tratamento" significa qualquer tratamento de uma doença num paciente, que inclui: (i) impedir a doença, ou seja, fazer com que os sintomas clínicos não se desenvolvam; (ii) inibir a doença, ou seja, interromper o desenvolvimento de sintomas clínicos; e/ou (iii) aliviar a doença, ou seja, causar a regressão de sintomas clínicos. Apenas a título de exemplo, o tratamento pode incluir aprimorar a função do ventrículo direito e/ou aliviar os sintomas, que incluem, mas sem limitações, dispneia de esforço, fadiga, dor no peito e combinações das mesmas.

Conforme usado no presente documento, o termo "melhorar", quando usado em referência à gravidade de uma afeção patológica, significa que os sinais ou sintomas associados à afeção são diminuídos, ou melhora da afeção do paciente. Os sinais ou sintomas a serem monitorizados serão característicos de uma afeção patológica particular e serão bem conhecidos pelo clínico versado, assim como os métodos para monitorizar os sinais e afeções. 0 termo "paciente" tipicamente refere-se a um mamífero, como, por exemplo, um ser humano. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de um composto, como um antagonista de recetor de adenosina A2B, que é suficiente para efetuar um tratamento, conforme definido acima, quando administrada a um paciente que precisa de tal tratamento. A quantidade terapeuticamente eficaz irá variar dependendo da atividade específica ou via de entrega do agente que é usado, da gravidade do estado de doença do paciente e da idade, condição física, existência de outros estados de doença e situação nutricional do paciente. Adicionalmente, outra medicação que o paciente possa receber irá afetar a determinação da quantidade terapeuticamente eficaz do agente terapêutico a ser administrada.

Conforme usado no presente documento, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui todo e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento de absorção e similares. 0 uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto pelo facto de que, até ao presente momento, qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o ingrediente ativo, o seu uso nas composições terapêuticas é contemplado. Os ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. 2. Compostos para Uso

Conforme afirmado acima, a presente revelação refere-se a compostos para uso na redução de arritmia num paciente que sofreu enfarte do miocárdio (MI). Em uma modalidade, os métodos descritos no presente documento podem reduzir a morte ou hospitalização em pacientes tratando-se a insuficiência cardíaca ou arritmia. Ademais, tais métodos alcançam a afeção cardíaca aprimorada de pacientes pós-enfarte do miocárdio (MI).

Foi constatado, no presente documento, que o recetor de adenosina (AdoR) A23 é o subtipo predominante de AdoRs expressos em fibroblastos cardíacos humanos (HCF) e a ativação desse recetor aumenta a libertação de IL-6 e a produção de colagénio, a libertação de marcadores fibróticos e a libertação de biomarcadores de doenças cardiovasculares (CVD).

Ademais, N-etilcarboxamidoadenosina (NECA), um análogo estável de adenosina, aumentou significativamente a libertação de IL-6 de uma maneira dependente da concentração. Ademais, a NECA aumentou a expressão de actina muscular o;-suave e pró-colagénio a-1, aumentou a produção de colagénio de HCF e aumentou a libertação de dois biomarcadores inovadores de CVD, ST-2 solúvel e PAPPA (Proteína A de plasma associada à gravidez). Os efeitos de NECA em HCF, entretanto, foram completamente abolidos por um antagonista de AdoR A2B (Exemplo 2). A um nível fisiológico, os níveis de adenosina são elevados no miocárdio isquémico. Os níveis de adenosina aumentados, então, ativam os recetores A2B em macrófagos, miõcitos cardíacos e fibroblastos cardíacos, de modo a resultar na libertação de mediadores inflamatórios e fibróticos que contribuem para a disfunção de ventrículo esquerdo. A capacidade de um antagonista de AdoR A2B para inibir tal ativação, por sua vez, pode levar à inibição da libertação de tais mediadores inflamatórios e fibróticos. Além disso, um antagonista de AdoR A2B pode inibir a ativação de macrófago em tecidos cardíacos lesionados. Em suma, os antagonistas de recetor de adenosina A2b da presente revelação mostram a capacidade para reduzir a resposta fibrótica em doenças do coração, de modo a levar à função de ventrículo esquerdo aprimorada.

Consistente com essas constatações mecanicistas, foi observado agora, em modelos de enfarte do miocárdio por elevação do segmento ST (STEMI) de ratos e murganhos, que os antagonistas de recetor de adenosina A2B inibiram o aumento do ventrículo esquerdo (LV), conforme mostrado com um aumento diminuído do volume sistólico final e volume diastólico final de LV e fração de ejeção de LV aumentada. Visto que a inibição de aumento de LV leva a uma função de LV aprimorada e a inibição de fibrose na zona de contorno de enfarte (IBZ) leva a menos arritmias, os antagonistas de recetor de adenosina A2B podem reduzir a morte cardiovascular e hospitalização devido à insuficiência cardíaca ou arritmias. Nesse sentido, é contemplado que a fibrose intersticial crie um substrato para arritmia. Reduzindo-se a fibrose intersticial, portanto, os antagonistas de recetor de adenosina A2B podem reduzir a incidência de arritmia e morte cardíaca repentina.

Um aspeto inesperado dessas constatações é que as atividades dos antagonistas de recetor de adenosina A2B não interferem com a resposta fibrõtica compensatória pós-MI na zona de enfarte. Conforme ilustrado na Figura 18, durante a fase aguda de enfarte do miocãrdio (por exemplo, STEMI), as células na zona de enfarte sofrem necrose. Após a fase aguda (por exemplo, cerca de uma semana após o MI), a zona de enfarte é afinada e alongada para compensar pela perda devido à cicatriz fibrosa das células necróticas. Tal mecanismo compensatório (também chamado de dilatação do LV) é benéfico para manter a função do LV.

Ademais, o aumento do LV durante a fase maladaptativa, entretanto, pode levar a insuficiência cardíaca e arritmia. Nesse sentido, o aumento de LV nessa fase ocorre em áreas fora da zona de enfarte, de modo a resultar na dilatação ventricular esférica. Ademais, o LV aumentado leva à disfunção de LV caracterizada por fração de ejeção diminuída.

Surpreendentemente, os antagonistas de recetor de adenosina A2b da presente revelação inibem especificamente, em tecidos cardíacos fora da zona de enfarte, a libertação de mediadores inflamatórios e fibróticos, de modo a reduzir a inflamação e lesão de tecido fibroinduzida e aprimorar a fração de ejeção e a função de LV. Portanto, contrário à perceção convencional a respeito da função protetora cardíaca das adenosinas, os dados experimentais da presente revelação demonstram o efeito terapêutico da inibição de atividades de adenosinas, com antagonistas de recetor de adenosina A2B, na proteção e recuperação cardíacas pós-MI.

Portanto, quando usados em pacientes pós-MI, os antagonistas de recetor de adenosina A2B podem ser administrados ao paciente mesmo antes que a fibrose cardíaca compensatória seja finalizada, sem arriscar inibir tal resposta compensatória. Ademais, é contemplado que os pacientes pós-MI estej am hemodi nami c ament e estáveis ao receber o tratamento. Ademais, é contemplado que os antagonistas possam ser administrados tão cedo quanto durante o MI ou imediatamente após o MI.

Também é surpreendente a extensão do efeito terapêutico de antagonistas de recetor de adenosina A2B. Por exemplo, em comparação com outros fármacos anti-fibróticos, como pirfenidona, que apenas retardou a redução de LVEF, os antagonistas de recetor de adenosina A2B da presente revelação puderam interromper ou até mesmo reverter tal redução (Exemplo 6 e Figura 12B).

Em um aspeto, o MI é MI agudo. Em outro aspeto, o MI é MI por elevação de ST (STEMI). Ainda em outro aspeto, o MI é MI sem elevação de ST (NSTEMI).

Em um aspeto, o uso do antagonista de recetor de adenosina A2B começa tão cedo quanto durante o MI ou imediatamente após o MI. Em algumas modalidades, o uso ocorre quando o paciente é diagnosticado com MI. Em outro aspeto, o uso começa cerca de 1 hora ou, alternativamente cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas após o MI. Ainda em outro aspeto, o uso começa cerca de 1 dia ou, alternativamente cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias ou 1, 2, 3 ou 4 semanas após o MI. Em um aspeto particular, o uso começa assim que o paciente de MI estiver estabilizado. Em um aspeto, o uso começa em até um dia pós-MI. Em outro aspeto, o use começa entre um e cinco dias pós-MI. No caso de o uso imediato não ser viável, os dados atuais mostram que o uso que começa uma ou duas semanas pós-MI ainda é eficaz.

Em alguns aspetos, o uso começa no máximo em cerca de 3 dias ou, alternativamente, 5 dias, 7 dias, 2 semanas, 3 semanas ou 4 semanas após o MI.

Em alguns aspetos, os pacientes pós-MI estão hemodinamicamente estáveis. Os métodos e critérios para determinar a estabilidade hemodinâmica são conhecidos na técnica. 0 termo "hemodinamicamente estável" conforme usado no presente documento refere-se à restauração de um ou mais ou parâmetros hemodinâmicos todos medidos para a sua faixa normal. Os exemplos de tais faixas normais são fornecidos na tabela abaixo.

Conforme mais minuciosamente descrito abaixo, os antagonistas podem ser usados numa variedade de formas, incluindo, sistémica, oral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal e inalação.

3. Antagonistas de Recetor de Adenosina A2B 0 antagonista de recetor A2B para uso na presente invenção é um composto que tem a fórmula química:

e o nome 3-etil-l-propil-8-(1-(3-(trifluorometil) benzil)-lH-pirazol-4-il) -1H-purina-2,6 (3H, 7H) -diona ou 3-etil- 1-propil-8-(1-((3-(trifluorometil)fenil)metil)pirazol -4-il)-1,3,7-trihidropurina-2,6-diona ou um sal farmaceuticamente aceitável. Por vezes é chamado, ao logo do documento, de "Composto A" ou "CVT-6833." 0 composto é descrito no documento de Patente n2 U.S. 6,825,349. 0 antagonista de recetor A2B revelado no presente documento também se destina a representar formas não identificadas, assim como formas identificadas isotopicamente do composto. Os compostos identificados isotopicamente têm estruturas representadas pelas fórmulas fornecidas no presente documento, com a exceção de um ou mais átomos são substituídos por um átomo que tem uma massa atómica ou número atómico selecionados. Os exemplos de isótopos que podem ser incorporados em compostos da revelação incluem isótopos de hidrogénio, carbono, nitrogénio, oxigénio, fósforo, flúor e cloro, como, mas sem limitações 2H (deutério, D) , 3H (trítio) , 1:LC, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, j2P, 35S, 35C1 e 125I. Vários compostos identificados isotopicamente da presente revelação, por exemplo, aqueles em que os isótopos radioativos como 3H, 13C e 14C são incorporados. Tais compostos identificados isotopicamente podem ser úteis em estudos metabólicos, estudos cinéticos de reação, conjuntos de procedimentos de deteção ou imagiologia, como tomografia de emissão de positrão (PET) ou tomografia computadorizada de emissão de fotão único (SPECT) que inclui ensaios de distribuição de fármaco ou tecido de substrato ou no tratamento radioativo de pacientes. A revelação também inclui o composto A revelado no presente documento, em que de 1 a "n" hidrogénios fixados a um átomo de carbono é/são substituídos por deutério, em que n é a quantidade de hidrogénios na molécula. Tais compostos exibem uma resistência aumentada ao metabolismo e são, portanto, úteis para aumentar a meia-vida de qualquer composto quando administrado a um mamífero. Consulte, por exemplo, Foster, "Deuterium Isotope Effects in Studies of Drug Metabolism", Trends Pharmacol. Sci. 5(12) : 524 a 527 (1984) . Tais compostos são sintetizados por meios bem conhecidos na técnica, por exemplo, empregando-se os materiais de partida em que um ou mais hidrogénios foram substituídos por deutério.

Os compostos terapêuticos da revelação identificados ou substituídos por deutério podem ter propriedades aprimoradas de DMPK (metabolismo de fãrmaco e farmacocinética), relacionadas à distribuição, ao metabolismo e excreção (ADME). A substituição com isótopos mais pesados como deutério pode render determinadas vantagens terapêuticas resultantes de uma maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou exigências de dosagem reduzidas. Um composto identificado com 18F pode ser útil para estudos de PET ou SPECT. Os compostos identificados isotopicamente da presente revelação e pró-fármacos dos mesmos podem, geralmente, ser preparados executando-se os procedimentos revelados nos esquemas ou nos exemplos e preparações descritos abaixo substituindo-se um reagente isotopicamente identificado prontamente disponível por um reagente não isotopicamente identificado. Ademais, a substituição por isótopos mais pesados, particularmente deutério (isto é, 2H ou D) pode render determinadas vantagens terapêuticas resultantes de uma maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou exigências de dosagem reduzidas ou um aprimoramento no índice terapêutico. É entendido que deutério no presente contexto seja considerado um substituinte no composto da Fórmula I, ou qualquer Fórmula revelada no presente documento. A concentração de tal isótopo mais pesado, especificamente deutério, pode ser definida por um fator de enriquecimento isotópico. Nos compostos da presente revelação, qualquer átomo não designado especificamente como um isótopo particular destina-se a representar qualquer isótopo estável de tal átomo. Exceto quando afirmado o contrário, quando uma posição for designada especificamente como "H" ou "hidrogénio", entende-se que a posição tenha hidrogénio em sua composição isotópica de abundância natural. Consequentemente, nos compostos da presente revelação, qualquer átomo especificamente designado como um deutério (D) destina-se a representar deutério.

Em muitos casos, os compostos da presente invenção podem formar sais de ácido e/ou de base em virtude da presença de grupos amino e/ou carboxil ou grupos similares aos mesmos. 0 termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se aos sais que retêm a eficácia e propriedades biológicas dos compostos de Fórmula I, II ou III, e que não são indesejáveis biologicamente ou de outro modo. Os sais com adição de base farmaceuticamente aceitável podem ser preparados a partir de bases inorgânicas ou orgânicas. Os sais derivados de bases inorgânicas incluem, apenas a título de exemplo, sais de sódio, potássio, lítio, amónio, cálcio e magnésio. Os sais derivados de bases orgânicas incluem, mas não se limitam a, sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, como alquilaminas, dialquilaminas, trialquilaminas, alquilaminas substituídas, di(alquil)aminas substituídas, tri(alquil)aminas substituídas, alquenilaminas, dialquenilaminas, trialquenilaminas, alquenilaminas substituídas, di(alquenil)aminas substituídas, tri(alquenil)aminas substituídas, cicloalquilaminas, di(cicloalquil)aminas, tri(cicloalquil)aminas, cicloalquilaminas substituídas, cicloalquilamina dissubstituída, cicloalquilaminas trissubstituídas, cicloalquenilaminas, di(cicloalquenil)aminas, tri(cicloalquenil)aminas, cicloalquenilaminas substituídas, cicloalquenilamina dissubstituída, cicloalquenilaminas trissubstituídas, arilaminas, diarilaminas, triarilaminas, heteroarilaminas, diheteroarilaminas, triheteroarilaminas, aminas heterocíclicas, aminas diheterocíclicas, aminas triheterocíclicas, diaminas e triaminas misturadas, em que pelo menos dois de entre os substituintes na amina são diferentes e são selecionados a partir do grupo que consiste em alquil, alquil substituído, alquenil, alquenil substituído, cicloalquil, cicloalquil substituído, cicloalquenil, cicloalquenil substituído, aril, heteroaril, heterocíclicos e similares. Também são incluídas aminas em que os dois ou três substituintes, juntamente com o nitrogénio de amino, formam um grupo heterocíclico ou heteroaril.

Os exemplos específicos de aminas adequadas incluem, apenas a título de exemplo, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, tri(isopropi1)amina, tri(n-propil)amina, atanolamina, 2-dimetilaminoetanol, trometamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilenodiamina, glucosamina, N-alquilglucaminas, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, morfolina, N-etilpiperidina e similares.

Os sais com adição de ácido farmaceuticamente aceitável podem ser preparados a partir de ácidos inorgânicos e orgânicos. Os sais derivados a partir de ácidos inorgânicos incluem ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similares. Os ácidos inorgânicos derivados de ácidos orgânicos incluem ácido acético, ácido propiónio, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido p-tolueno-sulfónico, ácido salicílico e similares.

Nomenclatura

0 Composto A da invenção é denominado: 8-4-[5-(2-metoxifenil) -[1,2,4]-oxadiazol-3-ilmetoxi]-fenil}-1,3- dipropil-1,3,7-trihidropurina-2,6-diona. 4. Terapias de Combinação

As terapias de combinação também são fornecidas. Em uma modalidade, o uso compreende adicionalmente um inibidor de enzima de conversão da angiotensina (ACE). Os exemplos não limitadores de inibidores de ACE incluem captopril, enalapril, lisinopril, perindopril, ramipril e similares.

Em outra modalidade, o uso compreende adicionalmente antagonistas de recetor de angiotensina II, também conhecidos como bloqueadores de recetor de angiotensina (ARBs). Os exemplos não limitadores de ARBs incluem losartan, EXP 3174, candesartan, valsartan, irbesartan, telmisartan, eprosartan, olmesartan, azilsartan e similares.

Os antagonistas de recetor de adenosina A2B podem ser usados em combinação com outras terapias ou agentes de fibrose cardíaca, inclusive, mas sem limitações, Resveratrol (3,5,4'-trihidroxi-trans-estilbeno) (Sutra et al., J Agric Food Chem 56 (24) :11.683 a 11.687 (2008)) .

Resveratrol é um estilbenoide, um tipo de fenol natural e uma fitoalexina produzida naturalmente por várias plantas quando atacadas por patogénios como bactérias ou fungos. 0 sinergismo é contemplado entre antagonistas de recetor de adenosina A2B e outras terapias de fibrose cardíaca devido aos seus respetivos mecanismos terapêuticos diferentes. Os inibidores de ACE, por exemplo, bloqueiam a conversão de angiotensina I em angiotensina II. Os mesmos, portanto, diminuem a resistência arteriolar e aumentam a capacidade venosa; aumentem o resultado cardíaco, índice cardíaco, trabalho e volume sistólicos; diminuem a resistência renovascular; e levam à natriurese aumentada (excreção de sódio na urina). Em contrapartida, os antagonistas de recetor de adenosina A2B reduzem a inflamação e fibrose cardíacas. Em combinação, portanto, um antagonista de recetor de adenosina A2B e um inibidor de ACE podem melhorar a função cardíaca e reduzir a dose terapêutica de cada agente individual. A redução de doses terapêuticas, por sua vez, ajuda a reduzir ou impedir casos adversos potenciais.

Em termos de administração, é contemplado que os dois ou mais agentes podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente. Se os dois ou mais agentes forem administrados simultaneamente, os mesmos podem tanto ser administrados como uma dose única quanto como doses separadas. Ademais, é contemplado que o clínico presente possa determinar prontamente a dosagem necessária do agente adicional, o regime de dosagem e a via preferencial de administração. Tais composições são preparadas de uma maneira bem conhecida na técnica farmacêutica (consulte, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Co., Philadelphia, PA 17a Edição (1985) e "Modern Pharmaceutics", Marcel Dekker, Inc. 3a Edição (G.S. Banker &amp; C.T. Rhodes, Eds.). 5. Administração

As composições adequadas para administração na invenção podem ser administradas a indivíduos que precisam da mesma oral, intravitrea, tópica, sublingual, bucal, nasal, parenteralmente (por exemplo, intramuscular), injeção intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea, intracisteral, intravaginal, intraperitoneal, sublingual, bucalmente, como uma aspersão oral ou uma aspersão nasal. As composições podem ser formuladas em formas de dosagem adequada para cada via de administração.

As composições farmacêuticas podem ser administradas oral, intranasal, ocular, parenteralmente ou através de terapia de inalação, e podem assumir a forma de comprimidos, pastilhas, grânulos, cápsulas, pílulas, ampolas, supositórios ou na forma de aerossol. As mesmas também podem assumir a forma de suspensões, soluções e emulsões dos ingredientes-chave em diluentes aquosos ou não aquosos, xaropes, granulados ou pós. Além de um agente da presente invenção, as composições farmacêuticas também podem conter outros compostos farmaceuticamente ativos ou uma pluralidade de compostos.

Em algumas modalidades, a composição da invenção também é chamada, no presente documento, de o ingrediente ativo, pode ser administrada para terapia através de qualquer via adequada, inclusive oral, nasal, tópica (inclusive transdérmica, aerossol, bucal e sublingual), parenteral (inclusive subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica) e pulmonar. Será observado, ainda, que a via preferencial irá variar com a afeção e idade do recipiente e a doença que é tratada. A. Injeção

Um modo para administração é parental, particularmente através de injeção, como injeção intravenosa (IV) . As formas em que as composições da presente revelação podem ser incorporadas para administração através de injeção incluem suspensões aquosas ou em óleo ou emulsões, com óleo de gergelim, óleo de milho, óleo de semente de algodão ou óleo de amendoim, assim como elixires, manitol, dextrose ou uma solução aquosa estéril e veículos farmacêuticos similares. As soluções aquosas em solução salina também são convencionalmente usadas para injeção, porém, menos preferenciais no contexto da presente revelação. 0 etanol, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido e similares (e misturas adequadas dos mesmos), derivados de ciclodextrina e óleos vegetais também podem ser empregues. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento, como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e através do uso de tensioativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser gerada através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares.

Em um aspeto, a revelação fornece uma solução IV que compreende uma concentração selecionada do antagonista de recetor de adenosina A2B reivindicado. Especificamente, a solução IV preferencialmente compreende cerca de 1 a cerca de 5.000 mg do antagonista de recetor de adenosina A2B por mililitro de uma solução aquosa farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, a concentração do antagonista de recetor de adenosina A2B na solução IV é de cerca de 5 a cerca de 1.000 mg ou, alternativamente de cerca de 10 a cerca de 800 mg ou, alternativamente de cerca de 20 a cerca de 800 mg ou, alternativamente de cerca de 50 a cerca de 700 mg ou, alternativamente de cerca de 50 a cerca de 500 mg. Em outro aspeto, a concentração do antagonista de recetor de adenosina A2B na solução IV é de cerca de 100 a cerca de 1.000 mg ou, alternativamente de cerca de 100 a cerca de 800 mg ou, alternativamente de cerca de 100 a cerca de 500 mg ou, alternativamente de cerca de 2 00 a cerca de 500 mg ou, alternativamente de cerca de 200 a cerca de 400 mg ou, alternativamente de cerca de 200 a cerca de 300 mg. Ainda em outro aspeto, a concentração é de cerca de 250 mg. A fim de permitir o fluxo intravenoso rápido do antagonista de recetor de adenosina A2B no paciente, a solução IV preferencialmente não contém nenhum componente viscoso inclusive, a título de exemplo, propilenoglicol ou polietilenoglicol (por exemplo, polietilenoglicol 400) . É entendido que quantidades pequenas de componentes viscosos, que não alteram materialmente a viscosidade, podem ser incluídas nas formulações intravenosas da presente revelação. Em uma modalidade particularmente preferencial, a viscosidade da solução IV é preferencialmente menor do que 10 cSt (centistokes) a 20 °C, mais preferencialmente, menor do que 5 cSt a 20 °C e ainda mais preferencialmente, menor do que 2 cSt a 20 °C.

As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando-se o composto da revelação na quantidade necessária no solvente adequado com vários outros ingredientes como enumerado acima, conforme for necessário, seguido de esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando-se os vários ingredientes ativos esterilizados num veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários de entre aqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são conjuntos de procedimentos de secagem a vácuo e secagem por congelamento que rendem um põ do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução anteriormente esterilizada por filtração do mesmo. B. Administração Oral A administração oral é outra via para administração dos compostos da revelação. A administração pode ser por meio de cápsula ou comprimidos com revestimento entérico ou similares. Na produção das composições farmacêuticas que incluem pelo menos um composto da revelação, o ingrediente ativo é geralmente diluído por um excipiente e/ou envolto num tipo de transportador que possa estar na forma de uma cápsula, sache, papel ou outro recipiente. Quando o excipiente serve como um diluente, o mesmo pode ser um material sólido, semissólido ou líquido (conforme supracitado), que atue como um veículo, sachê ou meio para o ingrediente ativo. Dessa forma, as composições podem estar na forma de comprimidos, pílulas, pós, pastilhas, sachês, invólucros, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como um meio sólido ou num meio líquido), pomadas que contêm, por exemplo, até 10Ó em peso do composto ativo, cápsulas de gelatina macias e rígidas, soluções injetáveis estéreis e põs embalados estéreis.

Alguns exemplos de excipientes adequados incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma arábica, fosfato de cálcio, alginatos, adragante, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água estéril, xarope e metilcelulose. As formulações podem incluir adicionalmente: agentes lubrificantes como talco, estearato de magnésio e óleo mineral; agentes humectantes; agentes emulsificantes e de suspensão; agentes conservantes como metil-hidroxi-benzoatos e propil-hidroxi-benzoatos,· agentes adoçantes; e agentes aromatizantes.

As composições da revelação podem ser formuladas de modo a fornecer uma libertação rápida, mantida ou retardada do ingrediente ativo após a administração ao paciente empregando-se procedimentos conhecidos na técnica. Os sistemas de entrega de fármaco de libertação controlada para administração oral incluem sistemas de bomba osmótica e sistemas de dissolução que contêm reservatórios revestidos com polímeros ou formulações de matriz fármaco-polímero. Os exemplos de sistemas de libertação controlada são fornecidos nos documentos de Patente de n-9- U.S. 3,845,770; n9 U.S. 4,326,525; n9 U.S. 4,902514; e n9 U.S. 5,616,345. Outra formulação para uso nos métodos da presente revelação emprega dispositivos de entrega transdérmica ("emplastros"). Tais emplastros transdérmicos podem ser usados para fornecer infusão contínua ou descontínua dos compostos da presente revelação em quantidades controladas. A construção e o uso de emplastros transdérmicos para a entrega de agentes farmacêuticos é bem conhecida na técnica. Consulte, por exemplo, os documentos de Patente n- U.S. 5,023,252, n- U.S. 4,992,445 e n- U.S. 5,001,139. Tais emplastros podem ser construídos para entrega contínua, pulsátil ou sob procura de agentes farmacêuticos.

As composições são preferencialmente formuladas numa forma de dosagem de unidade. 0 termo "formas de dosagem de unidade" refere-se a unidades distintas fisicamente adequadas como dosagens unitárias para indivíduos humanos e outros mamíferos, em que cada unidade contém uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um excipiente farmacêutico adequado (por exemplo, um comprimido, cápsula, ampola). Os compostos da presente revelação são eficazes ao longo de uma ampla faixa de dosagem e são geralmente administrados numa quantidade farmaceuticamente eficaz.

Em alguns aspetos, para a administração oral, cada unidade de dosagem contém de 10 mg a 2 g de um composto da revelação ou, alternativamente de 10 a 200 mg, ou cerca de 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg ou 160 mg. Para a administração parenteral, a unidade de dosagem pode ser de 10 a 700 mg de um composto da revelação ou cerca de 50 a 200 mg. Ficará entendido, entretanto, que a quantidade do composto da revelação realmente administrada será determinada por um médico, em vista das circunstâncias relevantes, inclusive a afeção a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto real administrado e sua atividade relativa, a idade, o peso e a resposta do paciente individual, a gravidade dos sintomas do paciente e similares.

Para preparar composições sólidas como comprimidos, o ingrediente ativo principal é misturado com um excipiente farmacêutico para formar uma composição de pré-formulação sólida que contém uma mistura homogénea de um composto da presente revelação. A referência a essas composições de pré-formulação como homogéneas significa que o ingrediente ativo é disperso uniformemente ao longo da composição de modo que a composição possa ser prontamente subdividida em formas de dosagem de unidade igualmente eficazes, como comprimidos, pílulas e cápsulas.

Os comprimidos ou pílulas da presente revelação podem ser revestidos ou, de outro modo, compostos para fornecer uma forma de dosagem que rende uma vantagem de ação prolongada, ou para proteger contra condições ácidas do estômago. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode compreender um componente de dosagem interna e um componente de dosagem externa, em que este está sob a forma de um envelope sobre aquele. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permitir que o componente interno passe intacto para o duodeno ou tenha uma libertação retardada. Uma variedade de materiais pode ser usada para tais camadas ou revestimentos entéricos, como materiais que incluem inúmeros ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com tais materiais como goma-laca, álcool cetílico e acetato de celulose. C. Inalação e Insuflação

As composições para inalação ou insuflação incluem soluções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicos e pós farmaceuticamente aceitáveis, ou misturas dos mesmos. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados conforme descrito acima. Preferencialmente, as composições são administradas pela via respiratória oral ou nasal para efeito local ou sistémico. As composições em solventes farmaceuticamente aceitáveis preferencialmente podem ser nebulizadas através do uso de gases inertes. As soluções nebulizadas podem ser inaladas diretamente a partir do dispositivo nebulizador ou o dispositivo nebulizador pode ser fixado a uma tenda de máscara facial, ou máquina respiratória de pressão positiva intermitente. As composições de solução, suspensão ou pó podem ser administradas preferencialmente oral ou nasalmente, a partir de dispositivos que entregam a formulação de uma maneira adequada.

Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar modalidades preferenciais da revelação. Deve ser observado, por elementos versados na técnica, que os conjuntos de procedimentos revelados nos exemplos a seguir representam conjuntos de procedimentos que o inventor constatou que funcionam bem na prática da revelação e, portanto, podem ser consideradas constituintes de modos preferenciais para a sua prática. Entretanto, os elementos versados na técnica, em vista da presente revelação, devem observar que muitas alterações podem ser realizadas nas modalidades específicas, que são reveladas e ainda obtêm um resultado semelhante ou similar sem que se afastem do espírito e âmbito da revelação.

Exemplo de Formulação 1 Cápsulas de gelatina rígidas que contêm os seguintes ingredientes são preparadas:

Os ingredientes acima são misturados e preenchidos nas cápsulas de gelatina rígidas.

Exemplo de Formulação 2

Uma fórmula de comprimido é preparada com o uso dos ingredientes abaixo:

Os componentes são misturados e comprimidos para formar comprimidos.

Exemplo de Formulação 3

Uma formulação de inalador de pó seco ê preparada de modo a conter os seguintes componentes:

0 ingrediente ativo é misturado com a lactose e a mistura é adicionada a um instrumento de inalação de pó seco.

Exemplo de Formulação 4

Comprimidos, em que cada um contém 30 mg de ingrediente ativo, são preparados da seguinte forma:

0 ingrediente ativo, amido e celulose são passados através de uma peneira de malha n£ 20 U.S. e misturados minuciosamente. A solução de polivinilpirrolidona é misturada com os pós resultantes, que, então, são passados através de uma peneira de malha n2 16 U.S.. Os grânulos assim produzidos são secos de 50 °C a 60 °C e passados através de uma peneira de malha n2 16 U.S.. 0 sódiocarboximetilamido, estearato de magnésio e talco, anteriormente passados através de uma peneira de n2 30 U.S., são, então, adicionados aos grânulos que, após a mistura, são comprimidos numa máquina de comprimido para render comprimidos, em que cada um pesa 120 mg.

Exemplo de Formulação 5

Supositórios, em que cada um contém 25 mg de ingrediente ativo, são produzidos da seguinte forma:

0 ingrediente ativo é passado através de uma peneira de malha n2 60 U.S. e suspenso nos glicéridos de ácido gordo saturados anteriormente fundidos com o uso do calor mínimo necessário. A mistura, então, é despejada num molde de supositório de capacidade nominal para 2,0 g e deixado a arrefecer.

Exemplo de Formulação 6

Suspensões, em que cada uma contém 50 mg de ingrediente ativo por 5,0 naL de dose, são produzidos da seguinte forma:

0 ingrediente ativo, a sacarose e goma de xantana são misturados, passados através de uma peneira de malha n2 10 U.S. e, então, misturados com uma solução produzida anteriormente da celulose microcristalina e sódiocarboximetilcelulose em água. 0 benzoato de sódio, aroma e cor são diluídos com uma parte da água e adicionados com agitação. Em seguida, água suficiente é adicionada para produzir o volume necessário.

Exemplo de Formulação 7

Uma formulação subcutânea pode ser preparada da seguinte forma:

Exemplo de Formulação 8

Uma preparação injetável é preparada, de modo que tenha a seguinte composição:

Exemplo de Formulação 9

Uma preparação tópica ê preparada, a qual tem a seguinte composição:

Todos os ingredientes acima, com a exceção da água, são combinados e aquecidos a 60 °C com agitação. Uma quantidade suficiente de água a 60 °C é, então, adicionada com agitação vigorosa para emulsificar os ingredientes e a água, então, adicionada q.s. 100 g.

EXEMPLOS A presente revelação é adicionalmente definida com referência aos exemplos a seguir.

Abreviações

Exceto quanto afirmado de outro modo, todas as temperaturas estão em graus Celsius (°C). Além disso, nesses exemplos e em outros locais, as abreviações têm os seguintes significados:

Metodologias e Reagentes Células e reagentes 0 Composto A foi sintetizado por Gilead Sciences, Inc. (Foster City, Califórnia) conforme fornecido no documento de Patente n2 U.S. 6,825,349. Outros compostos químicos foram obtidos junto à Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri). RT-PCR em tempo real A RT-PCR em tempo real foi realizada conforme publicado com o uso do equipamento de PCR Stratagene (La Jolla, California). Zhong H., et al., "A2B adenosine receptors increase cytokine release by bronchial smooth muscle cells", American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 30(1): 118 a 125 (2004).

Exemplo 1: Ensaios de recetor de adenosina A fim de examinar os antagonistas de recetor A2B, dois tipos de ensaios são usados tipicamente: 1) ensaio de ligação de rádioligante para determinar que um determinado composto poderia ligar-se ao recetor A2E conforme descrito abaixo e 2) um ensaio funcional (ensaio de cAMP ou outros) para determinar se o composto é um agonista (ativa o recetor) ou um antagonista (inibe a ativação do recetor).

Um ensaio de ligação de rádioligante para recetor de adenosina A2B é usado para determinar a afinidade de um composto com o recetor de adenosina A2B. No entanto, os ensaios de ligação de rádioligante para ouros recetores de adenosina são conduzidos para determinar afinidades do composto com recetores de adenosina A±, A2A e A3. 0 composto deve ter uma afinidade superior (pelo menos 3 vezes) com recetor A2B do que com outros recetores de adenosina.

Um ensaio de cAMP para recetor A2B é frequentemente usado para confirmar que o composto é um antagonista e irá bloquear o aumento mediado por recetor A2B no cAMP.

Ligação de rádioligante a recetor de adenosinaA2B

Os compostos que são antagonistas putativos do recetor A2B podem ser examinados quanto à atividade necessária com base nos ensaios a seguir. 0 recetor de adenosina A2B humano cDNA é estavelmente transfectado para células HEK-2 93 (chamadas de células HEK-A2B) - A monocamada de células HEK-A2B é lavada com PBS uma vez e recolhida em um tampão que contem 10 mM de HEPES (pH 7,4), 10 mM de EDTA e inibidores de protease. Essas células são homogeneizadas em politrão durante 1 minuto na configuração 4 e centrifugadas a 29.000 g durante 15 minutos em 4 °C. Os péletes de célula são lavados uma vez com um tampão que contém 10 mM de HEPES (pH 7,4), 1 mM de EDTA e inibidores de protease e são ressuspensos no mesmo tampão suplementado com 10Ó de sacarose. As alíquotas congeladas são mantidas a - 80 °C. Os ensaios de competição são iniciados misturando-se 10 nM de 3H-ZM241385 (Tocris Cookson) com várias concentrações de compostos de teste e 50 mg de proteínas de membrana no tampão de TE (50 mM de Tris e 1 mM de EDTA) suplementado com 1 Unidade/mL de deaminase de adenosina. Os ensaios são incubados durante 90 minutos, parados pela filtração com o uso do Coletor da Packard e lavados quatro vezes com tampão de TM gelado (10 mM de Tris, 1 mM de MgCl2, pH 7,4) . A ligação não específica é determinada na presença de 10 mM de ZM241385. As afinidades de compostos (isto é, Valores de Ki) são calculadas com o uso do software GraphPad.

Ligação de rádioligante para outros recetores de adenosina Os recetores de adenosina humanos Αχ, A2A, A3 cDNAs são estavelmente transfectados tanto em CHO quanto em células HEK-293 (chamadas de CHO-Αχ HEK-A2A, CH0-A3) . As membranas são preparadas a partir dessas células com o uso do mesmo protocolo que foi descrito acima. Os ensaios de competição são iniciados misturando-se 0,5 nM de 3H-CPX (para CHO-Αχ) , 2 nM de 3H-ZM241385 (HEK-A2A) ou 0,1 nM de 125I-AB-MECA (CHO-A3) com várias concentrações de compostos de teste e as membranas em perspetiva no tampão de TE (50 mM de Tris e 1 mM de EDTA de CHO-Αχ e HEK-A2A) ou tampão de TEM (50 mM de Tris, 1 mM de EDTA e 10 mM de MgCl2 para CH0-A3) suplementado com 1 Unidade/mL deaminase de adenosina. Os ensaios são incubados durante 90 minutos, parados pela filtração com o uso do Coletor da Packard e lavados quatro vezes com tampão de TM gelado (10 mM de Tris, 1 mM de MgCl2, pH 7,4). A ligação não específica é determinada na presença de 1 μΜ de CPX (CHO-AJ , 1 μΜ de SM214385 (HEK-A2A) e 1 μΜ de IB-MECA (CH0-A3) . As afinidades de compostos (isto é, Valores de Ki) são calculadas com o uso do software GraphPad.

Medições de cAMP A monocamada de células transfectadas é recolhida em PBS que contém 5 mM de EDTA. As células são lavadas uma vez com DMEM e ressuspensas em DMEM que contém 1 Unidade/mL de deaminase de adenosina a uma densidade de 100.000 a 500.000 células/mL. 100 pL da suspensão de célula são misturados com 25 pL que contêm vários agonistas e/ou antagonistas e a reação foi mantida a 37 °C durante 15 minutos. Ao final dos 15 minutos, 125 pL de HC1 a 0,2 N são adicionados para interromper a reação. As células são centrifugadas durante 10 minutos a 1.000 rpm. 100 pL do sobrenadante são removidos e acetilados. As concentrações de cAMP nos sobrenadantes são medidas com o uso do ensaio de cAMP direto do Projeto de Ensaio.

Os recetores de adenosina A2A e A2B são acoplados às proteínas Gs e, portanto, os agonistas para recetor de adenosina A2A (como CGS21680) ou para recetor de adenosina A2B (como NECA) aumentam as acumulações de cAMP enquanto os antagonistas para esses recetores impedem o aumento nas acumulações de cAMP induzidas pelos agonistas. Os recetores de adenosina Ai e A3 são acoplados às proteínas Gi e, portanto, os agonistas para recetor de adenosina A:1 (como CPA) ou para o recetor de adenosina A3 (como IB-MECA) inibem o aumento nas acumulações de cAMP induzidas por forskolina. Os antagonistas para recetores A:L e A3 impedem a inibição nas acumulações de cAMP. É abrangido pelas habilidades de um elemento versado na técnica determinar se um composto, com base no protocolo de ensaio acima, é um antagonista do recetor A2B · Uma seletividade de 3 vezes, ou em determinados casos, uma seletividade de 10 vezes para recetor A2B contra outros recetores de adenosina, pode ser considerada para qualificar um composto como um antagonista de recetor A2B seletivo.

Exemplo 2: Recetor de Adenosina A2B Atenua Biomarcadores de Fibrose Cardíaca 0 presente exemplo demonstra que os recetores de adenosina A2E (AdoR) são o subtipo predominante de AdoRs expressos em fibroblastos cardíacos humanos primários (HCF) e sugere que o AdoR A2B medeie a resposta fibrótica nas doenças do coração. Dessa forma, um antagonista de AdoR A2B pode ser usado para tratar a fibrose cardíaca. A expressão de AdoR, actina muscular a-suave e pró-colagénio a-1 foi determinada com o uso de RT-PCR em tempo real. A concentração de IL-6, ST-2 solúvel e PAPPA (Proteína A de plasma associada à gravidez) nos sobrenadantes de célula foi medida com o uso de ELISA e a concentração de colagénio solúvel foi determinada com o uso o ensaio de colagénio Sircol™.

De entre os quatro subtipos de AdoRs, o AdoR A2B foi expresso no nível mais alto em HCF. A N-etilcarboxamidoadenosina (NECA), um análogo estável de adenosina, aumentou significativamente a libertação de IL-6 de uma maneira dependente da concentração, com um aumento máximo de 2,4 ± 0,1 vez em relação ao nível basal. Além disso, NECA (10 μΜ) aumentou a expressão de actina muscular a-suave e prõ-colagénio oí-1, e a produção de colagénio (indução de 1,8 ± 0,1 vez, 3,4 ± 0,2 a 6,0 ± 0,4 pg/mL, p < 0,05) de HCF. Ademais, NECA aumentou a libertação de dois biomarcadores inovadores de doenças cardiovasculares (CVD), ST-2 solúvel (indução de 1,7 ± 0,1 vez, de 1.5 ± 0,1 a 2,6 ± 0,1 ng/mL, p < 0,05) e PAPPA (indução de 4,4 ± 0,6 vez, de 1,4 ± 0,5 a 6,2 ± 0,8 ng/mL, p < 0,05). Os efeitos de NECA sobre a libertação de IL-6, colagénio, ST-2 e PAPPA e a expressão de actina muscular a-suave e pró-colagénio α-1 foram completamente abolidos por um antagonista de AdoR A2B seletivo, Composto A (Figuras IA a D).

Esse exemplo, portanto, indica que o AdoR A2B é o subtipo predominante de AdoRs expressos em HCF humano primário e a ativação desse recetor aumenta a libertação de IL-6 e a produção de colagénio, a expressão de marcadores fibróticos e a libertação de biomarcadores de CVD. Essas constatações sugerem que o AdoR A2B pode mediar a resposta fibrótica em doenças do coração. Portanto, os antagonistas de AdoR A2B, através da inibição da ativação do AdoR A2B, podem ser usados para tratar fibrose cardíaca.

Exemplo 3: Antagonista de A2B Melhora Remodelação Cardíaca

Esse exemplo demonstra que o bloqueio seletivo de recetor de adenosina A2B pode melhorar a remodelação cardíaca após o enfarte do miocárdio agudo no murganho. A adenosina é libertada em resposta à lesão de tecido e promove hiperemia e inflamação. Os efeitos pró-inflamatórios da adenosina através do recetor A2B provocam danos adicionais ao tecido. Esse exemplo testa se o bloqueio seletivo do recetor A2B durante o enfarte do miocárdio agudo levaria a uma remodelação cardíaca mais favorável.

Os murganhos de ICR machos foram submetidos à ligadura da artéria coronária ou cirurgia de simulação (N = 8 a 10 por grupo). Um antagonista de A2B seletivo, Composto A, 4 mg/kg numa suspensão de dosagem formulada a cada 12 horas i.p., for fornecido iniciando-se imediatamente após a cirurgia e continuou durante 14 dias. A ecocardiografia transtorácica foi realizada antes da cirurgia e, então, 7, 14 e 28 dias após. Um subgrupo de murganhos foi sacrificado 72 horas após a cirurgia e a atividade de caspase-1, um mediador pró-inflamatório principal, foi medida no tecido cardíaco.

Todos os murganhos operados por simulação estavam vivos em 4 semanas, enquanto 42Õ dos murganhos tratados com o veículo e 25Ó do Composto A morreram durante as 4 semanas pós-cirurgia. 0 tratamento com o Composto A reduziu significativamente a atividade de caspase-1, o diâmetro endiastólico e o índice de desempenho do miocárdio e aumentou a fração de ejeção de LV, em comparação com o veículo (Figura 2).

Portanto, esse exemplo demonstra que o bloqueio seletivo do recetor de adenosina A2B com um antagonista de A2B seletivo, Composto A, limita a ativação de caspase-1 no coração e leva a uma remodelação cardíaca mais favorável após o enfarte do miocárdio agudo no murganho.

Exemplo 4: Antagonista de A2B Atenua Remodelação Cardíaca Após Enfarte do Miocárdio Agudo

Esse exemplo usa um modelo de murganho in vivo para demonstrar que o bloqueio seletivo de AdoR A2B com o antagonista reduz a atividade de caspase-1 no coração, de modo a levar a uma remodelação cardíaca mais favorável após o enfarte do miocárdio agudo (AMI). Métodos

Modelo de AMI experimental

Os murganhos CD1 machos não consanguíneos adultos (8 a 12 semanas de idade) foram fornecidos pela Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN) . As experiências foram conduzidas sob linhas de guia de animais de laboratório para pesquisa biomédica publicada por National Institutes of Health (n2 85 a 23, revisto em 1996) . 0 protocolo de estudo foi aprovado pelo Virginia Commonwealth University

Institutional Animal Care and Use Committee. 0 AMI experimental foi induzido por ligadura da artéria coronária permanente a fim de induzir um grande enfarte não reperfundido que envolve aproximadamente 30Ó do ventrículo esquerdo e leva a uma cardiomiopatia dilatada isquémica (Mezzaroma et al. Proc Natl Acad Sei 2011 - em press and Abbate et al. Circulation 2008; 117:2670-83). Brevemente, os murganhos foram incubados de modo orotraqueal mediante anestesia (pentobarbital 50 a 70 mg/kg) colocado na posição de decúbito lateral direita, então, submetidos a uma toracotomia esquerda, pericardiectomia e ligadura da artéria coronária esquerda proximal. O peito foi fechado e os animais puderam recuperar-se. Os murganhos que sobreviveram à cirurgia foram aleatoriamente atribuídos aos diferentes grupos de tratamento (N = 6 a 15 por grupo) . As operações de simulação foram realizadas, em que os animais foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico sem a ligadura da artéria coronária (N = 4 a 8 por grupo) . Uma linha temporal do protocolo do estudo é mostrada na Figura 3.

Tratamento 0 antagonista de AdoR A2B, Composto A, foi obtido junto Pa Gilead Sciences, Foster City, CA. Os murganhos foram aleatoriamente atribuídos ao tratamento com Composto A (4 mg/kg) ou dose compatível de veículo administrado de modo intraperitoneal (volume final de 0,13 mL) a cada 12 horas durante 14 dias, iniciando-se imediatamente após a cirurgia de ligadura da artéria coronária. Um grupo adicional de murganhos recebeu uma dose inferior de Composto A (2 mg/kg) para explorar uma relação de dose-resposta. Dois grupos adicionais de murganhos receberam o Composto A (4 mg/kg) iniciando-se 1 hora após a cirurgia para simular um cenário clínico de atraso de tratamento. Um grupo adicional de murganhos foi tratado com 0,13 mL de NaCl de 0,9Ó como um controlo adicional, entretanto, devido ao facto de que os dados do tratamento de veículo não foram significativamente diferentes àqueles do tratamento com NaCl, apenas resultados do tratamento de veículo são incluídos no presente exemplo. Para simular um cenário clinicamente relevante em que o tratamento de fãrmaco pode ocorrer com algum atraso após o AMI, esse exemplo comparou o tratamento com o Composto A sem atraso com os grupos em que o antagonista de AdoR A2B foi fornecido com 1 hora de atraso.

Ativação de Caspase-1

Um subconjunto adicional de murganhos foi sacrificado 72 horas após a cirurgia (N = 4 a 6 por grupo de tratamento). 0 coração foi removido conforme descrito acima. A atividade de tecido de caspase-1 foi determinada por clivagem de um substrato fluorgénico (CaspACE, Promega, Madison, WI) (Abbate et al. Circulation 2008;117:2670-83). Após a homogeneização com o uso de tampão RIPA (Sigma Aldrich) que contém um coquetel de inibidores de protease (Sigma Aldrich) e centrifugação a 16.000 rpm durante 20 minutos, 75 mg de proteína de cada amostra foram usados para o ensaio de acordo com as instruções do fornecedor. A fluorescência foi medida após 60 minutos e foi expressa como unidades de fluorescência arbitrária produzidas por um micrograma de amostra por minuto (fluorescência/mg/min.) e calculada como modulação em comparação com a atividade de caspase-1 em homogeneizados dos corações de murganhos operados por simulação.

Infiltração inflamatória A fim de quantificar a infiltração inflamatória no coração durante o AMI, esse exemplo mediu a expressão de CD45 (um marcador para leucócitos) no coração com o uso de Western Blot. Os corações recolhidos em 72 horas após o AMI foram homogeneizados em tampão Ripa (Sigma Aldrich, St Louis, MO) suplementado com um coquetel de inibidor de protease (Sigma Aldrich) e centrifugados a 16.200 x g durante 20 minutos. Trinta microgramas de cada amostra foram diluídos em tampão Laemmli, desnaturado durante 10 minutos a 96°C e ressolvido com SDS/PAGE com o uso de um gel de acrilamida de 8% para permitir a separação de proteína. As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Após a saturação com 50 de leite em solução salina tamponada com fosfato, a membrana foi incubada com um anticorpo de rato anti-murganho criado contra CD45 (sistema R&amp;D, Minneapolis, MN). Para normalizar a carregamento de proteína, um anticorpo monoclonal para b-actina (Sigma Aldrich) foi usado. 0 ensaio de quimioluminesceneia (ECL) e a autorradiografia foram usados para detetar as bandas correspondentes a CD45 e à b-actina. A intensidade de banda foi determinada através de análise densiométrica com o uso do software Scion Image e os resultados foram expressos como aumento de percentagem em intensidade comparada com as amostras de simulação de controlo.

Medição de níveis de circulação de citocinas e moléculas de adesão solúveis

As concentrações de plasma de IL-Ιβ e Interleucin-1 (IL-6), Fator de Necrose de Tumor-a (TNF-a) e moléculas de adesão solúveis (E-selectina, Molécula de adesão intracelular-1 [ICAM-1] e Molécula de adesão celular vascular [VCAM]), que são induzidas por IL-Ιβ, foram determinadas no dia 2 8 após a cirurgia com o uso de kits Luminex obtidos junto à Millipore (Billerica, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Uma amostra sanguínea foi obtida por meio de uma punção cardíaca direta imediatamente antes de matar os animais.

Ecorradiografia

Todos os murganhos foram submetidos à ecocardiografia transtorácica na linha de base (antes da cirurgia) , e nos dias 7, 14 e 28 após a cirurgia (antes do sacrifício) . A ecocardiograf ia foi realizada com o uso do sistema de imagiologia Vevo770 (VisualSonics Inc, Toronto, Ontãrio, Canadá) com uma sonda de 30 a MHz. 0 coração foi visualizado no modo B a partir de vistas do eixo geométrico curto paraesternal e apical. Esse exemplo mediu as áreas diastólica final e sistólica fina do ventrículo esquerdo (LV) no Modo B e o diâmetro diastólico final do LV (LVEDD), os diâmetros sistólico final do LV (LVESD), espessura diastólica de parede anterior do LV (LVAWDT) e a espessura diastólica de parede posterior do LV (LVPWDT) no Modo M, conforme descrito anteriormente (Abbate et al. Circulation 2008;117:2670-83; Toldo et al. PloS One 2011;6:el8102) e de acordo com as recomendações da Sociedade Americana de Ecocardiografia (Gardin et al. J Am Soc Echocardiogr 2002;15:272-90). 0 encurtamento fracionai do LV (FS), a fração de ejeção de LV (EF), a massa e excentricidade do LV (razão de LVEDD/LVPWDT) foram calculados (Abbate et al. Circulation 2008;117:2670-83; Toldo et al. PloS One 2011; 6 : e 18102 ; Gardin et al. J Am Soc Echocardiogr 2002,-15:272-90). Os espectros de Doppler de trato de efluxo transmitral e do ventrículo esquerdo foram registados a partir de vistas de 4 câmaras apicais e o índice de desempenho do miocárdio (MPI ou índice de Tei) foi calculado conforme a razão entre a contração isovolumétrica e tempo de relaxamento dividida pelo tempo de ejeção (Tei et al. Am J Cardiol 1995; 26:357 a 366). O volume sistólico do LV foi calculado com o uso de Velocidade Integral-Tempo (VTI) do fluxo de trato de efluxo do LV multiplicado pela área de trato de efluxo do LV, e o resultado cardíaco foi calculado multiplicando-se o volume sistólico do LV pela frequência cardíaca (Abbate et al. Circulation 2008,- 117:2670 a 2 6 83; Toldo et al. PloS One 2011; 6:el8102; Gardin et al. J Am Soc Echocardiogr 2002,- 15:272 a 290) . 0 aumento do ventrículo direito (RV) foi avaliado medindo-se a área diastólica final do RV na secção de ventrículo intermediária da vista de eixo geométrico curto paraesternal e a função sistólica do RV foi estimada com o uso do Modo M e medindo-se a excursão sistólica do plano anular tricúspide (TAPSE) (Toldo et al. PloS One 2011,- 6: el8102; Gardin et al. J Am Soc Echocardiogr 2002; 15:272 a 290). 0 investigador que realizou e leu o ecocardiograma não teve acesso à alocação de tratamento.

Avaliação de Tamanho de Enfarte

Após o ecocardiograma do dia 28, todos os murganhos foram mortos com uma superdose pentobarbital e/ou deslocamento cervical. Os corações foram explantados e fixados em formalina a 10Ó durante pelo menos 48 horas. Um corte transversal do terço mediano do coração foi dissecado, incluído em parafina, cortado em lâminas de 5 mm e manchado com tricromo de Masson (Sigma-Aldrich) (Abbate et al. Circulation 2008; 117:2670 a 2683). As áreas de fibrose e o ventrículo esquerdo inteiro foram determinados com o uso de morfometria computadorizada com o software Image Pro Plus 6.0.

Medições hemodinâmicas

Em um subgrupo de murganhos (N = 4 por cada grupo) o ápice do LV foi punçado 1 hora após a cirurgia e um cateter de Millar ligado a um transdutor de pressão foi inserido para medir a pressão sistõlica de pico do LV e a frequência cardíaca (Toldo et al. PloS One 2011; 6:el8102).

Análise Estatística

As diferenças entre os grupos foram analisadas com o uso da ANO VA de uma via seguido pelo teste de Bonferroni. As alterações em medidas repetidas de dados ecocardiográficos foram analisadas com o uso de ANOVA de efeitos aleatórios para medidas repetidas para determinar o efeito principal de entre tempo, grupo e interação de tempo-por-grupo. A análise de sobrevivência foi realizada gerando-se uma curva de sobrevivência Kaplan-Meyer e com o uso de análise de regressão logística. Os cálculos foram concluídos com o uso do pacote SPSS 15.0 para Windows (SPSS, Chicago, IL).

Resultados

Antagonismo de AdoR A2B não apresentou efeitos hemodinâmicos durante o enfarte do miocárdio agudo

Visto que Ado é um vasodilatador e, a fim de excluir o facto de que uma diferença na remodelação foi devido às alterações hemodinâmicas secundárias ao antagonismo de AdoR A2B, esse exemplo mediu a pressão sistólica de pico de ventrículo esquerdo (LVPSP) e a frequência cardíaca (HR) em murganhos tratados com o antagonista de AdoR A2B, Composto A, e aqueles tratados com veículo. A LVPSP foi reduzida significativamente 1 hora após a ligadura da artéria coronária, porém, não afetada pelo tratamento (Tabela 1).

Tabela 1. Dados brutos e hemodinâmicos _

Os dados hemodinâmicos foram registados 1 hora após a cirurgia. Abreviações: AdoR A2B = recetor de adenosina A2B; HR = frequência cardíaca; LV = ventrículo esquerdo; LVSP = pressão sistólica de LV de pico; MI = enfarte do miocárdio ™ P < 0,001 vs. simulação

Antagonismo de AdoR A2B inibe ativação de caspase-1 e inflamação. A ativação de caspase-1 é parte de um mecanismo pró-inflamatório principal em resposta à lesão isquémica. 0 tratamento com o Composto A impediu a ativação de caspase-1 no coração durante o AMI (Figura 4) . A intensidade do infiltrado de leucócito (CD45+), medida como expressão de CD4 5 em Western blot, também foi significativamente reduzida através do tratamento com Composto A 72 horas após o AMI (Figura 4) . Os resultados de ativação caspase-1 no processamento e libertação de IL-Ιβ ativo que geralmente está presente numa concentração no tecido muito baixa e amplifica rapidamente a resposta inflamatória através da indução da expressão de citocinas secundárias e moléculas de adesão. Os níveis de plasma de IL-Ιβ foram indetetãveis em todos, exceto 2 murganhos com AMI, enquanto os níveis de plasma de citocinas secundárias, isto é IL-6, foram aumentados 28 dias após a cirurgia em AMI (Figura 5) . 0 tratamento com o Composto A reduziu significativamente os níveis de plasma de IL-6, TNF-α, E-selectina, ICAM-1 e VCAM (Figura 5).

Efeitos de antagonismo de cicatrização aprimorada de A2E sobre a sobrevivência após a cirurgia de ligadura da artéria coronária

Nenhum dos murganhos operados por simulação morreu. A metade dos murganhos tratados com veículo (50Ó) sobreviveu até 28 dias após a cirurgia de ligadura da artéria coronária (P < 0,001 vs. simulação), enquanto 75Ó dos murganhos tratados com o Composto A estavam vivos (P = 0,14).

Efeitos de antagonismo de AdoR A2B sobre a remodelação cardíaca A remodelação cardíaca foi medida de modo não invasivo com o uso de ecocardiografia transtorácica. Os exemplos de registos do Modo B e do Modo M são mostrados na Figura 6. A administração do Composto A a cada 12 horas iniciando-se no momento da cirurgia levou a uma atenuação significativa do aumento e disfunção dos ventrículos esquerdo e direito em 7 dias, o que foi mantido em 14 dias e também em 28 dias, 14 dias após a última dose de fármaco ser fornecida (Figura 7). Em 28 dias, o aumento de LV após o AMI foi reduzido em aproximadamente 40Ó pelo Composto A. A função sistólica do LV também foi significativamente maior no grupo de Composto A (diferença absoluta em LVEF média de 5Ó). A atenuação na remodelação cardíaca foi paralela à preservação de desempenho diastólico/sistólico do miocãrdio (índice de desempenho do miocãrdio) (Figuras 7A a F). Os corações de murganhos tratados com o Composto A também mostraram menos aumento e disfunção no ventrículo direito (Figuras 7A a F). A isquemia do miocãrdio e a lesão celular anexa são conhecidas por causar a libertação de conteúdos de célula que acionam uma resposta inflamatória estéril de modo a promover uma disfunção e insuficiência cardíaca adicionais. Esse estudo mostra, pela primeira vez, que a inibição de ligação de Ado ao AdoR A2B limita a resposta inflamatória e leva a uma remodelação cardíaca mais favorável. A Ado é, de facto, rapidamente libertada durante a hipoxia e isquemia de tecido, e liga-se rapidamente a recetores (AdoRs) poliatómicos acoplados à proteína G específica. Há 4 subtipos de AdoR. Os subtipos são: o AdoR Ai, principalmente expresso no coração, regula a condução elétrica; o AdoR A3 é expresso na mastocélula de roedor e regula a ativação e desgranulação no murganho,· enquanto o AdoR A2A e o AdoR A2B são ligados à tonificação vascular e inflamação. Os AdoR A2A são AdoR de alta afinidade expressos na membrana de vários tipos de célula, inclusive células endoteliais, leucócitos e cardiomicócitos. Os AdoR A2B são recetores de baixa afinidade, coexpressos, por vezes, nas mesmas células que expressam o AdoR A2A, porém, numa quantidade baixa e, portanto, considerado minimamente relevante para a sinalização de Ado nessas células, pelo menos em condições sem stresse. Embora ambos os recetores acoplados à proteína G tanto do AdoR A2A quanto do AdoR A2B possam sinalizar através de ciclase de adenil, o AdoR A2B também sinaliza através de fosfolipase C e da proteína de ligação de GTP pequena, p21ras, que está envolvida na sinalização inflamatória que envolve a fosfocinase ativada por mitogénio p38 (MAPK) e as cinases reguladas por sinal extracelular (ERK). Importantemente, a expressão do AdoR A2B é dependente da estabilização do fator-α induzível por hipoxia (HIF-oí) e, portanto, altamente sensível à hipoxia e inflamação.

Portanto, embora a Ado de condições não stressadas que sinaliza através do AdoR A2B provavelmente não é significativa, no contexto de lesão de tecido, o AdoR A2B pode desempenhar uma função significativa.

Esse exemplo mostra que o bloqueio seletivo do AdoR A2B com o uso do Composto A diminuiu a resposta inflamatória durante o enfarte conforme refletivo por uma redução aproximadamente completa na atividade de caspase-1 e uma redução significativa na infiltração de células inflamatórias no precocemente ao longo do curso do AMI e uma redução significativa na citocina de plasma e moléculas de adesão 28 dias após o AMI. A caspase-1 é o componente enzimaticamente ativo do inflassoma, uma estrutura macromolecular que funciona como um sensor de "perigo" e envolvida no processamento de morte de IL-Ιβ maduro e na célula. A formação do inflassoma e a ativação de caspase-1 no coração leva à insuficiência cardíaca. A redução significativa na atividade de caspase- 1 no coração com bloqueio seletivo de AdoR A2B está em conformidade com a sinalização pró-inflamatória do AdoR A2B. No entanto, a função de AdoR A23 na isquemia do miocãrdio é controversa. Em modelos de lesão do miocãrdio aguda devido à isquemia/reperfusão, a Ado reproduz consistentemente os efeitos benéficos do pré-condicionamento isquémico. Os efeitos semelhantes ao pré-condicionamento de Ado são eliminados quanto a sinalização através do AdoR A2B é perturbada. Entretanto, o bloqueio do AdoR A2B na ausência de pré-condicionamento isquémico não apresentou efeitos no coração em tais modelos. Isso sugere que, embora possa mediar alguns aspetos do pré-condicionamento, a sinalização do AdoR A2B não é inerentemente protetora e é improvável que seja a única mediadora do pré-condicionamento.

No modelo de murganho atual de enfarte do miocãrdio não reperfundido grande, o antagonismo de AdoR A2B limitou significativamente o aumento do ventrículo esquerdo e a disfunção sistólica e diastõlica. Os efeitos protetores do AdoR A2B foram independentes de um efeito no tamanho do enfarte. Isso mostra que no enfarte do miocárdio não reperfundido no rato, a adenosina não apresenta efeitos no tamanho do enfarte.

Nesse modelo de enfarte do miocárdio não reperfundido, a remodelação cardíaca é global e envolve o enfarte e zonas de contorno assim como o ventrículo esquerdo e o ventrículo direito remotos não afetados. 0 bloqueio do AdoR A2B pareceu não ter efeitos no tamanho de enfarte enquanto o bloqueio do AdoR A2B pareceu proteger a zona de contorno e o miocárdio remoto, conforme evidenciado por um aprimoramento tanto da dimensão ventricular esquerda quanto direita, e, de modo importante, a função de LV. A constatação de atividade de caspase-1 reduzida no coração e na remodelação cardíaca mais favorável confirma a função central da caspase-1 na resposta do miocárdio à isquemia do miocárdio. A superexpressão de caspase-1 no coração de murganho leva a áreas maiores de danos isquémicos, aumento cardíaco mais grave e uma sobrevivência reduzida após o AMI; enquanto os murganhos com deficiência de caspase-1 são protegidos após o AMI.

Esses dados sugerem que na cicatrização de enfarte após a isquemia do miocárdio, o AdoR A2B tem uma função significativa pró-inflamatória e de deleção.

Em conclusão, o bloqueio seletivo de AdoR A2B com o Composto A administrado após o início da isquemia reduz a atividade de caspase-1 no coração e leva a uma remodelação cardíaca mais favorável após o AMI num modelo de murganho de enfarte do miocárdio não reperfundido.

Exemplo 5: Efeito de Composto A num Modelo de Murganho de Enfarte do Miocárdio 0 antagonista de A2B, o Composto A (3 mg/kg/dia ou 10 mg/kg/dia), foi fornecido a murganhos de modelo ob/ob de 6 semanas de idade durante 28 dias. No final da dosagem de 28 dias, a expressão de inúmeros biomarcadores inflamatórios, MCP-1, IL-lb, IL-2 e IL-6, foi medida em tais murganhos em comparação com o controlo (veículo).

Conforme mostrado nas Figuras 8A a D, a expressão de todos os quatro biomarcadores inflamatórios sofreu uma queda, para dois dos mesmos, MCP-1 e IL-lb, a redução para o grupo de 10 mg/kg/dia foi estatisticamente significativa. Esses dados demonstram que o antagonista de A2B, o Composto A, inibe a inflamação nos animais tratados. 0 efeito do Composto A num modelo de murganho de enfarte do miocãrdio também foi determinado. Os murganhos machos foram submetidos à ligadura da artéria coronária permanente ou cirurgia de simulação. O Composto A (4 mg/kg) foi fornecido i.p. A BID foi iniciada imediatamente ou 1 hora após a cirurgia e continuada durante 14 dias. 0 ECHO transtorácico para medir o diâmetro diastólico final/sistólico final de LV (LVEDD ou LVESD), a área diastólica final do RV (RVEDA) e o índice de desempenho do miocárdio (MPI) foi realizada antes da cirurgia e após 7, 14 e 28 dias. A análise de biomarcadores de inflamação e lesão de tecido foi conduzida em 28 dias pós-MI.

Todos os murganhos operados por simulação estavam vivos em 4 semanas. 42Ó dos murganhos com MI tratados com veículo morreram durante as 4 semanas. Em contrapartida, a taxa de mortalidade dos murganhos com MI tratados com Composto A foi de apenas 25Ó.

Os murganhos com MI desenvolveram remodelação de tecido adversa e função do miocárdio prejudicada conforme demonstrado pelos aumentos significativos em LVEDD e LVESD, RVEDA e MPI em comparação com os murganhos de simulação (Figuras 9A a D). 0 tratamento com Composto A imediatamente ou 1 hora após a cirurgia reduziu significativamente as dimensões do LV/RV e reduziu o MPI, de modo a sugerir que o

Composto A tenha inibido a remodelação do miocárdio adversa e aprimorado a função do miocárdio em murganhos com MI, 0 Composto A não apresentou efeito na remodelação/função do miocárdio em murganhos de simulação.

Os biomarcadores de plasma de inflamação e lesão do miocárdio foram analisados no dia 28 pós-MI. As concentrações de plasma de IL-6, TNF-α e ST2 foram significativamente aumentadas em murganhos com MI em comparação com murganhos operados por simulação. 0 tratamento com o Composto A imediatamente após a cirurgia reduziu significativamente as concentrações de todos os biomarcadores de plasma em murganhos com MI (Figuras 10A a C). 0 Composto A não apresentou efeito nos biomarcadores de plasma em murganhos operados por simulação. As moléculas de adesão de célula solúveis (CAMs), como a sE-selectina, sICAM e sVCAM, são biomarcadores de circulação importantes para processos inflamatórios em doenças cardiovasculares. 0 tratamento com Composto A inibiu significativamente o aumento dos níveis de plasma de moléculas de adesão de célula solúveis em murganhos com MI (Figuras 11A a C).

Em suma, esses resultados indicam que o tratamento com o Composto A aprimora significativamente a função do miocárdio, reduz os biomarcadores de circulação inflamatória e, portanto, reduz a mortalidade no modelo de murganho de remodelação pós-MI.

Exemplo 6: Avaliação pré-clínica do Composto A

Esse exemplo inclui várias experiências pré-clínicas que mostram a eficácia do Composto A no cuidado de animais pós-enfarte do miocárdio (MI).

Modelo de Rato de Remodelação pôs-Enfarte do Miocárdio (MI) e Taquicardia Ventricular (VT).

Os efeitos do Composto A num modelo de rato de remodelação pós-MI e VT foram determinados. 0 MI foi causado durante a oclusão de 25 minutos na ligadura da coronária descendente anterior esquerda, seguido pela reperfusão. Uma semana depois, os ratos receberam tanto veículo quanto Composto A (100 mg/kg) uma vez diariamente por gavagem oral. Os ecocardiogramas em série (ECHOs) para medir a fração de ejeção de LV (LVEF), o volume sistólico e o volume sistólico final de LV (LVESV) foram obtidos na linha de base, 1 semana e 5 semanas pós-MI. Os estudos eletrofisiológicos, mapeamento ótico, histologia e análise de biomarcador foram conduzidos em 5 semanas pós-MI.

Os ECHOs obtidos na linha de base, 1 semana e 5 semanas pós-MI mostraram evidência de remodelação de LV progressiva que inclui uma diminuição significativa na fração de ejeção de LV e no volume sistólico e um aumento significativo no volume sistólico final de LV e em ratos de MI. Nesse modelo, foi observado consistentemente que a LVEF sofreu um declínio adicional entre 1 semana e 5 semanas pós-MI. Consistente com isso, no presente estudo, a LVEF sofre um declínio de 56,0 ± 2,1Ó em 1 semana pós-MI a 40,7 ± 2,2Ó em 5 semanas pós-MI. Em contrapartida, nos animais tratados com o Composto A, a LVEF aumentou ligeiramente de 53,1 ± 3,2Ó para 55,6 ± 2,6Ó (Figura 12B) . Ademais, o Composto A reduziu significativamente o aumento no LVESV (Figura 12Ά). Todos esses resultados sugerem que o Composto A aprimorou significativamente a função cardíaca e remodelação pós-MI no rato. Em contrapartida, a pirfenidona, que não é um antagonista de A2B, mas tem-se mostrado capaz de atenuar a fibrose do ventrículo esquerdo, não aumentou o LVESV, mas apenas inibiu ligeiramente a sua redução adicional (Figura 12B). A taquicardia ventricular (VT) é uma causa comum de mortalidade em pacientes pós-MI, mesmo com tratamento de revascularização coronária atual. Nesse modelo de rato de remodelação pós-MI, a VT foi consistentemente induzível em mais do que a metade dos animais. Dessa forma, o efeito do Composto A na capacidade de indução de VT foi determinado em 5 semanas pós-MI. Conforme mostrado na Tabela 3, a taxa de indução de VT foi de 54Ó (6 em 11) em controles de veículo, enquanto o Composto A reduziu significativamente a indução de VT para 9Ó (1 em 11).

Tabela 3. Capacidade de indução de VT em modelo de rato de _remodelação pôs-MI_

A condução de impulso elétrico anormal na zona de contorno de enfarte (IBZ) é importante na patogénese de arritmias pós-MI. Conforme mostrado nos mapas de vetor de condução (Figuras 13A a B) , o grupo de controlo de veículo tem uma velocidade de condução muito mais lenta do que os animais tratados com o Composto A. Para quantificar o impacto do Composto A em propriedades de condução, as velocidades de condução (CVs) foram medidas para as zonas de enfarte, contorno e normais zonas do miocárdio do LV. As CVs em zonas normais foram as mais rápidas de entre todas as zonas e foram similares entre os grupos de placebo e de Composto A (Figura 14Ά). Ademais, as CVs nas zonas de enfarte do grupo de controlo de placebo foram as mais lentas de entre todas as zonas e foram significativamente aprimoradas pelo Composto A (Figura 14C). Por fim, as CVs nas IBZs de ambos os grupos foram entre as zonas de não enfarte e as zonas de enfarte. Entretanto, as CVs nas IBZs do grupo de Composto A foram significativamente mais rápidas do que nas IBZs de controlo de placebo IBZs (Figura 14B) . A condução anormal nas IBZ deve-se à remodelação de tecido. A fibrose excessiva na IBZ é um substrato importante para vulnerabilidade à VT. Conforme mostrado nas

Figuras 15A a B, a análise de IBZs de controlo de veículo revelou projeções mais emplastradas e heterogéneas de fibrose das zonas de enfarte nas IBZs. As projeções fibróticas são em menor quantidade nas IBZs do grupo tratado com Composto A, de modo a sugerir que a fibrose inibida por Composto A na IBZ está associada à velocidade de condução aprimorada, o que pode explicar a capacidade de indução à VT notavelmente reduzida.

Os biomarcadores de plasma de inflamação (IL-6) e lesão de tecido (BNP e (PAI -1) foram analisados em 5 semanas pós-MI. As concentrações de plasma de IL-6 e PAI-1 foram significativamente aumentadas nos ratos pós-MI em comparação com os ratos normais. 0 tratamento do Composto A reduziu significativamente todos esses biomarcadores de plasma em ratos pós-MI. Além disso, houve uma tendência para que o Composto A inibisse o aumento de BNP (P = 0,16) em ratos pós-MI. (Figuras 16A a C)

Ademais, esse exemplo usou um plano de tratamento clinicamente relevante em que o fármaco foi administrado após a terapia de reperfusão e a disfunção de LV já terem sido estabelecidas. Ademais, os efeitos de tratamento foram medidos com o uso de pontos finais clinicamente relevantes, como volume sistólico final do ventrículo esquerdo e LVEF.

Os resultados do estudo no modelo de rato de remodelação pós-MI indicam que o tratamento do Composto A aprimora significativamente a função do miocárdio e reduz a vulnerabilidade à VT. Isso deve-se provavelmente à redução de mediadores inflamatórios e inibição de fibrose na zona de contorno de miocárdio isquémico.

Exemplo comparativo

7: Outros antagonistas do Recetor de adenosina A2B

Esse exemplo usa miócitos cardíacos humanos para testar dois outros antagonistas de recetor de adenosina A2B quanto a seu efeito sobre a libertação de IL-6 induzida por NECA.

Os miócitos cardíacos humanos (HCM) foram tratados com NECA sozinho ou em combinação com o Composto A, o Composto B (N-[5-(l-ciclopropil-2,6-dioxo-3-propil-2,3,6,7- tetrahidro-lH-purin-8-il)-piridin-2-il] -N-etil-nicotinamida, também conhecido como ATL-801) ou o Composto C (2-(4-benziloxi-fenil)-N-[5-(2,6-dioxo-l,3-dipropil- 2,3,6,7-tetrahidro-lH-purin-8-il)-l-metil-lH-pirazol-3-il]-acetamida). Conforme mostrado na Figura 17, NECA aumentou significativamente a libertação de IL-6 de miócitos cardíacos humanos (HCM). 0 efeito de NECA sobre os HCM, entretanto, foi completamente abolido por cada um de entre os antagonistas de AdoR A23 testados, o Composto A, B e C.

Esse exemplo, portanto, demonstra que esses outros antagonistas de AdoR A2B têm a capacidade para inibir a libertação de IL-6 induzida por NECA de miócitos cardíacos humanos.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição

Documentos de não patente citados na descrição • WEBER et al. Circ., 1991, vol. 83, 1849-1865 [0006] • SCHAPER et al. Basic Res. Cardiol., 1992, vol. 87, S1303-S1309 [0006] • BOLUYT et al. Circ. Res., 1994, vol. 75, 23-32 [0006] • BISHOP et al. J. Mol. Cell Cardiol., 1990, vol. 22, 1157-1165 [0006] • Cardiovasc. Res., 1995, vol. 30, 537-543 [0006] • FOSTER. Deuterium Isotope Effects in Studies of Drug Metabolism. Trends Pharmacol. Sci., 1984, vol. 5 (12), 524-527 [0041] • SUTRA et al. J Agric Food Chem, 2008, vol. 56 (24) , 11683-11687 [0051] • Remington's Pharmaceutical Sciences. Mace Publishing Co, 1985 [0053] • Modern Pharmaceutics. Marcel Dekker, Inc, [0053] • ZHONG H. et al. A2B adenosine receptors increase cytokine release by bronchial smooth muscle cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 2004, vol. 30 (1), 118-125 [0088] • guidelines of laboratory animals for biomedical research. National Institutes of Health, 1996 [0106] • MEZZAROMA et al. Proc Natl Acad Sci, 2011 [0106] • ABBATE et al. Circulation, 2008, vol. 117, 2670-83 [0106] [0108] [0112] [0113] • TOLDO et al. PloS One, 2011, vol. ;6, el8102 [0112] • GARDIN et al. J Am Soc Echocardiogr, 2002, vol. 15, 272-90 [0112] • TOLDO et al. PloS One, 2011, vol. 6, el8102 [0112] [0114] • TEI et al. Am J Cardiol, 1995, vol. 26, 357-366 [0112]

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composto caracterizado por ter a fórmula química:

   ou um sal f armaceuticamente aceitável, para uso na redução de arritmia num paciente humano que sofreu um enfarte do miocãrdio (MI).
2. 2. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o MI ser MI agudo.
3. 3. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o MI ser MI por elevação de ST (STEMI) ou MI sem elevação de ST (NSTEMI).
4. 4. Composto para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o paciente estar hemodinamicamente estável.
5. 5. Composto para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o uso compreender a administração do composto ao paciente e a administração ser iniciada durante o MI ou imediatamente após o MI.
6. 6. Composto para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o uso compreender a administração do composto ao paciente e a administração ser iniciada após pelo menos cerca de 24 horas após o MI.
7. 7. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a administração do composto ser iniciada após pelo menos cerca de 3 dias após o MI.
8. 8. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a administração do composto ser iniciada após pelo menos cerca de 5 dias após o MI.
9. 9. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a administração do composto ser iniciada após pelo menos cerca de 7 dias após o MI.
10. 10. Composto para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o uso compreender adicionalmente administrar ao paciente um inibidor de enzima de conversão da angiotensina (ACE).
11. 11. Composto para uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o inibidor de ACE ser selecionado a partir do grupo que consiste em captopril, enalapril, lisinopril, perindopril e ramipril.
12. 12. Composto para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o composto ser administrado ao paciente por meio de uma via selecionada de entre administração sistémica, oral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou administração através de inalação.