ES2599659T3 - Uso de antagonistas del receptor de la adenosina A2B para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca y la arritmia en pacientes después de un infarto de miocardio - Google Patents

Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula química:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable, para su uso en la reducción de una arritmia en un paciente humano que ha sufrido un infarto de miocardio (IM).

Description

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DESCRIPCION

Uso de antagonistas del receptor de la adenosina A2B para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca y la arritmia en pacientes despues de un infarto de miocardio

Campo de la invencion

La divulgacion se dirige a compuestos para su uso en la reduccion de la arritmia en un paciente humano que ha sufrido un infarto de miocardio (IM).

Antecedentes

El infarto agudo de miocardio (IAM) se caracteriza por la necrosis isquemica del miocardio seguida de una respuesta inflamatoria intensa. El alcance de la perdida inicial de miocardio viable y la intensidad de la respuesta inflamatoria son ambos predictores independientes de la remodelacion cardiaca subsiguiente caracterizada por la dilatacion y la disfuncion cardiacas. La lesion miocardica puede inducir fibrosis cardiaca que conduce a arritmias e insuficiencia cardiaca. Cada ano, aproximadamente 200.000 personas sufren IMCEST agudo (infarto de miocardio con elevacion del segmento ST), que tiene aproximadamente un 20 % de mortalidad en un ano. En 2011, hubo aproximadamente 7,6 millones de pacientes de infarto de miocardio, y se estimo que el 10-70 % de ellos progresarla a insuficiencia cardiaca en un plazo de 5 anos.

Sin embargo, no todas las fibrosis cardiacas producidas despues de un infarto de miocardio (IM) son perjudiciales. Por ejemplo, inmediatamente despues de un IAM, los tejidos de la zona infartada se someten a una reparacion fibrotica compensatoria de la zona necrotica con la formation de cicatrices. Sin la reparacion fibrotica adecuada y la cicatrization, el corazon se puede romper, lo que podrla ser letal.

Por el contrario, la remodelacion patologica del VI durante la fase de mala adaptation puede conducir a insuficiencia cardiaca y arritmia. Por lo tanto, la inhibition ciega de la fibrosis cardiaca, en momentos o ubicaciones incorrectos, no serla eficaz en el restablecimiento de la funcion cardiaca y la reduccion de la muerte de los pacientes despues de un IM. Mas bien, estos tratamientos pueden dar lugar a graves efectos adversos.

La fibrosis intersticial impide el acoplamiento normal de los miocitos cardiacos y crea un sustrato para la arritmia, que podrla conducir a la muerte cardiaca repentina.

La fibrosis cardiaca se ha asociado con el proceso de insuficiencia cardiaca que conduce a varias enfermedades del corazon, incluyendo aquellas asociadas con la sobrecarga de volumen y presion (Weber et al., Circ., 83:1849-1865 (1991); Schaper et al., Basic Res. Cardiol., 87:S1303-S1309 (1992); Boluyt et al., Circ. Res., 75:23-32 (1994); y Bishop et al., J. Mol. Cell Cardiol., 22:1157-1165 (1990)). En el caso de la insuficiencia cardiaca, la fibrosis implica un aumento tanto en el numero de fibroblastos como en la deposition matricial (Cardiovasc. Res., 30: 537-543 (1995)), lo que sugiere la importancia de los fibroblastos en el desarrollo de dicha afeccion.

La adenosina (Ado) es una pequena molecula ubicua liberada en respuesta a la lesion tisular que potencia la hiperemia y modula la inflamacion a traves de la interaction con uno de los cuatro tipos de receptores de la membrana de la superficie celular. En algunos modelos de bloqueo de la inflamacion de la A2B, el AdoR ha limitado la intensidad de la respuesta inflamatoria y ha mejorado la cicatrizacion, mientras que en otros, la serialization de AdoR de A2B parecio inhibir la inflamacion. Por lo tanto, no se puede generalizar el papel de AdoR de A2B. El documento WO03/105666 desvela antagonistas del receptor de la adenosina A2B que tienen uso en la prevention, la limitation o el tratamiento de la lesion de isquemia y reperfusion.

Sumario

La presente divulgacion se dirige al descubrimiento sorprendente e inesperado de que los antagonistas del receptor de adenosina A2B inhiben la remodelacion patologica del ventrlculo izquierdo (VI) y aumentan la fraction de eyeccion del VI. En los pacientes que han sufrido un infarto de miocardio (IM), la inhibicion de la remodelacion del VI puede traducirse en una mejora de la funcion del VI y una menor incidencia de arritmias, lo que, a su vez, puede reducir la muerte cardiovascular (VC) y la hospitalization.

Tambien se ha descubierto que el receptor de la adenosina A2B (AdoR) es el subtipo predominante de AdoR expresado en los fibroblastos cardiacos humanos (FCH), y la activation de este receptor aumenta la liberation de IL- 6 y la production de colageno, la expresion de marcadores fibroticos y la liberacion de biomarcadores de enfermedades cardiovasculares (ECV). En particular, se ha descubierto que un antagonista del receptor de la adenosina A2B podrla abolir completamente dicha activacion, reduciendo as! la respuesta fibrotica en las enfermedades del corazon, lo que conducirla a la inhibicion de la dilatacion del VI y al aumento de la fraccion de eyeccion del VI.

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En vista de lo anterior, la divulgacion se dirige a los compuestos reivindicados para su uso en la reduction de la incidencia de la arritmia en un paciente que ha sufrido infarto de miocardio (IM). En algunas realizaciones, se reduce la muerte u hospitalization mediante el tratamiento de la arritmia.

El antagonista del receptor de la adenosina A2B es N-(6-amino-1-etil-2,4-dioxo-3-propil-1,2,3,4-tetrahidro-pirimidin-5- il)-1-(3-(trifluorometil)bencil)-1H-pirazol-4-carboxamida, denominado a lo largo del documento Compuesto A, que tiene la siguiente formula quimica:

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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

Breve descripcion de las figuras

Las FIG. 1A-D muestran que los efectos de NECA sobre la liberation de IL-6, colageno, ST-2 y PAPPA, y sobre la expresion de a-actina del musculo liso (SMAa) y procolageno a-1 (Col1A1) se suprimieron por completo mediante una antagonista selectivo del AdoR de A2B, el Compuesto A (Comp A).

La FIG. 2 muestra que el tratamiento con el Compuesto A (Comp A) redujo significativamente la actividad de la caspasa-1 (panel izquierdo), redujo el diametro telediastolico (panel central izquierdo), aumento la fraction de eyeccion del VI (panel central derecho) y redujo el Indice de funcion miocardica (panel derecho) en comparacion con el vehlculo tras un infarto agudo de miocardio en ratones.

La FIG. 3 es la llnea de tiempo para el estudio del Ejemplo 4.

La FIG. 4 muestra que la administration del antagonista del AdoR de A2B, el Compuesto A (Comp A), realizada inmediatamente despues de la ligadura coronaria (4 mg/kg i.p. dos veces al dla) previno la activation de la caspasa-1 en el tejido cardiaco, medida 72 horas despues de la cirugla, e inhibio significativamente el reclutamiento leucocitario (CD45+) en el corazon. *P < 0,001 frente a simulada; #P < 0,01 frente al vehlculo. N = 4-6 por grupo.

La FIG. 5 incluye graficos para mostrar que el tratamiento con el antagonista del AdoR de A2B, el Compuesto A, condujo a una reduccion significativa de los niveles en plasma de marcadores inflamatorios asociados con el IAM. Las concentraciones en plasma de IL-6, TNF-a, sE-selectina, sICAM y sVCAM se midieron usando Luminex el dla 28 despues de la cirugla. +P < 0,05 frente al vehlculo; *P < 0,001 frente al vehlculo.

La FIG. 6 presenta imagenes ecocardiograficas ilustrativas en modo B y modo M de un raton tratado con vehlculo (paneles superiores) y de uno tratado con el antagonista del AdoR de A2B, Compuesto A (paneles inferiores) 2 semanas despues de la cirugla de infarto agudo de miocardio.

Las FIG. 7A-F muestran que, despues de la cirugla de ligadura de la arteria coronaria, los ratones tratados con vehlculo resultaron tener una importante dilatation de los ventrlculos izquierdo y derecho (diametro telediastolico ventricular izquierdo (DTDVI) (A), diametro telesistolico ventricular izquierdo (DTSVI) (B) y la superfine telediastolica ventricular derecha (STDVD)) (E) y una reduccion significativa de la funcion ventricular izquierda y derecha (fraccion de eyeccion ventricular izquierda (FEVI) (C), Indice de funcion miocardica (IFM) (D) y desplazamiento sistolico del plano del anillo tricuspldeo (DSPAT)) (F). El tratamiento con el antagonista del AdoR de A2B, el Compuesto A (4 mg por via i.p. dos veces al dla) limito significativamente la dilatacion y la disfuncion del corazon. *P < 0,001 frente al valor basal (o simulado), + P < 0,001 frente al vehlculo.

Las FIG. 8A-D muestran que la expresion de cuatro biomarcadores inflamatorios, MCP-1, IL-1b, IL-2 e IL-6, se redujo mediante el tratamiento con el Compuesto A, y para dos de ellos, MCP-1 e IL-1b, la reduccion en el grupo de 10 mg/kg/dla fue estadlsticamente significativa.

Las FIG. 9A-D muestran el DTDVI (A), (DTSVI) (B), STDVD (C) y IFM (D) medidos usando ECHO6 el Dla 28. Los valores se presentan como la media ± ETM. n = 4-9. *, p < 0,05 en comparacion con el control simulado; #, p < 0,05 en comparacion con IM. Las estadlsticas se determinaron usando ANOVA seguido de la prueba de Bonferroni. Estas cifras demuestran que el Compuesto A inhibe la remodelacion adversa del miocardio tras un IM y mejora la funcion miocardica.

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Las FIG. 10A-C muestran niveles en plasma de ST2 (A) IL-6 (B) y TNF-a (C) y los valores se presentan como la media ± ETM. n = 4-8. *, p < 0,05 en comparacion con el control simulado; #, p < 0,05 en comparacion con IM. Las estadlsticas se determinaron usando ANOVA seguido de la prueba de Bonferroni. Estas cifras demuestran que el Compuesto A reduce los biomarcadores en plasma de las citocinas inflamatorias en un modelo de raton de remodelacion miocardica tras un IM.

Las FIG. 11A-C presentan niveles en plasma de sE-selectina (A), sICAM (B) y sVCAM (C). Los valores se presentan como la media ± ETM. n = 4. *, p < 0,05 en comparacion con el control simulado; #, p < 0,05 en comparacion con IM. Las estadlsticas se determinaron usando ANOVA seguido de la prueba de Bonferroni. Estas cifras demuestran que el Compuesto A reduce los niveles en plasma de las moleculas de adhesion solubles en un modelo de raton de remodelacion miocardica tras un IM.

Las FIG. 12A-B incluye graficos que muestran que el Compuesto A redujo el volumen telesistolico ventricular izquierdo (A) y aumento la fraccion de eyeccion del ventrlculo izquierdo (B). El volumen telesistolico ventricular izquierdo (A) (VTSVI) en el grupo de IM e IM + Compuesto A se midio usando ECHO al inicio del estudio, de 1 semana y 5 semanas despues del IM. Los valores se presentan como la media ± ETM. n = 13. *, p < 0,05 en comparacion con el control de vehlculo usando ANOVA seguido de la prueba de Bonferroni. (B) la FEVI en el control del vehlculo (IM) y el compuesto de un grupo (IM + Compuesto A) se midio usando ECHO al inicio del estudio, 1 semana y 5 semanas tras un IM. El FEVI se calculo usando la formula: (VDFVI-VTSVI)/VDFVI x 100. Los valores se presentan como la media ± ETM. n = 13. *, p < 0,05 en comparacion con el control del vehlculo usando ANOVA seguido de la prueba de Bonferroni.

Las FIG. 13A-B son mapas de vectores de conduccion de las paredes anteriores del VI que muestran flechas mas pequenas de velocidad de conduccion cerca de las zonas de IM designadas mas notables en el control del vehlculo (A) en comparacion con la muestra de Compuesto A (B).

Las FIG. 14A-C muestran que el Compuesto A aumenta las velocidades de conduccion en las zonas de infarto y las zonas limltrofes del infarto (ZLI). La VC para las zonas normal (A), limltrofe (B) y del infarto (C) en las ratas con IM tratadas con control de placebo y Compuesto A en varias duraciones del ciclo de estimulacion. *, p < 0,05 en comparacion con el control de placebo.

Las FIG. 15A-B son imagenes de microscopla de alta potencia (x 100) de ZLI tenidas con rojo sirio (que se muestra como gris oscuro) para la fibrosis con tincion de contraste rapida con verde (gris claro). La fibrosis se extendio en una distribution en forma de dedo de la zona infartada a las zonas limltrofes para el control del vehlculo (A), pero en menor grado para la muestra de Compuesto A (B). Estas imagenes demuestran que el Compuesto A reduce la fibrosis en la ZLI.

Las FIG. 16A-C muestran niveles en plasma de IL-6 (A), PAI-1 (B) y BNP (C) medidos usando Luminex a las 5 semanas del IM. Los valores se presentan como la media ± ETM. n = 4-8. *, p < 0,05 en comparacion con el control normal; #, p < 0,05 en comparacion con el IM. Las estadlsticas se determinaron usando ANOVA seguido de la prueba de Bonferroni. Estas cifras demuestran que el Compuesto A reduce los biomarcadores en plasma en el modelo de rata de remodelacion tras un IM.

La FIG. 17 es un diagrama que muestra la liberation de IL-6 de los miocitos cardiacos humanos tratados con NECA, junto con el Compuesto A, B o C, a las dosis indicadas.

La FIG. 18 ilustra un mecanismo propuesto mediante el que el Compuesto A inhibe la remodelacion VI patologica tras un IM y mejora las funciones cardiacas.

Descripcion detallada

Antes de describir la presente divulgation con mayor detalle, se definiran los siguientes terminos y expresiones.

Se ha de entender que la presente divulgacion no se limita a las realizaciones descritas en particular, y que como tal, puede, por supuesto, variar. Se ha de entender tambien que la terminologla usada en el presente documento tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente divulgacion solo estara limitado por las reivindicaciones adjuntas.

Cabe senalar que, como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y “ella” incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

1. Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en el presente documento tienen el mismo significado comunmente entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente

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divulgacion. Como se usan en el presente documento, los siguientes terminos y expresiones tienen los siguientes significados.

Como se usa en el presente documento, la expresion "que comprende" o el termino "comprende/n" pretende significar que las composiciones y los metodos incluyen los elementos citados, pero no excluyen otros. "Que consiste esencialmente en”, cuando se usa para definir composiciones y metodos, significara que excluye otros elementos de cualquier significado esencial para la combinacion con el fin indicado. Por lo tanto, una composition que consiste esencialmente en los elementos segun lo definido en el presente documento no excluirla otros materiales ni etapas que no afectaran materialmente a la/s caracterlstica/s basica/s y nueva/s de la divulgacion reivindicada. "Que consiste en” significara que excluye mas de los elementos traza de otros ingredientes y etapas sustanciales de los metodos. Las realizaciones definidas por cada uno de estos terminos de transition estan dentro del alcance de la presente divulgacion.

El termino "aproximadamente", cuando se usa antes de una designation numerica, por ejemplo, temperatura, tiempo, cantidad y concentration, incluyendo intervalos, indica aproximaciones que pueden variar en (+) o (-) un 10 %, 5 % o 1 %.

El termino "tratamiento" significa cualquier tratamiento de una enfermedad en un paciente, que incluye: (i) prevenir la enfermedad, es decir, hacer que los slntomas cllnicos no se desarrollen; (ii) inhibir la enfermedad, es decir, detener el desarrollo de los slntomas cllnicos; y/o (iii) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresion de los slntomas cllnicos. A modo de meramente ilustrativo, el tratamiento puede incluir la mejora de la funcion ventricular derecha y/o el alivio de los slntomas, incluyendo, pero sin limitation, disnea de esfuerzo, fatiga, dolor en el pecho y combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, el termino "mejorar", cuando se usa en referencia a la gravedad de una afeccion patologica, significa que se reducen los signos o slntomas asociados con la afeccion, o la mejora del estado del sujeto. Los signos o slntomas que han de controlarse seran caracterlsticos de una determinada afeccion patologica y seran bien conocidos por el medico experto, al igual que los metodos de control de los signos y de las condiciones.

El termino "paciente" se refiere normalmente a un mamlfero, tal como, por ejemplo, un ser humano.

La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a aquella cantidad de un compuesto, tal como un antagonista del receptor de la adenosina A2B, que es suficiente para efectuar el tratamiento, como se ha definido anteriormente, cuando se administra a un paciente en necesidad de dicho tratamiento. La cantidad terapeuticamente eficaz variara dependiendo de la actividad o de la via de administration especlficas del agente que se este usando, la gravedad del estado patologico del paciente y la edad, el estado flsico, la existencia de otros estados patologicos y el estado nutricional del paciente. Ademas, otra medication que el paciente pueda estar recibiendo afectara a la determination de la cantidad terapeuticamente eficaz del agente terapeutico que se vaya a administrar.

Como se usa en el presente documento, "vehlculo farmaceuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapeuticas. Tambien se pueden incorporar principios activos suplementarios a las composiciones.

2. Compuestos para su uso

Como se ha indicado anteriormente, la presente divulgacion se refiere a compuestos para su uso en la reduction de la arritmia en un paciente que ha sufrido un infarto de miocardio (IM). En una realization, los metodos descritos en el presente documento pueden reducir la muerte u hospitalization en los pacientes mediante el tratamiento de la insuficiencia cardiaca o la arritmia. Ademas, dichos metodos mejoran el estado cardiaco de los pacientes que han sufrido infarto de miocardio (IM).

Se ha descubierto en el presente documento que el receptor de la adenosina A2B (AdoR) es el subtipo predominante de los AdoR expresados en los fibroblastos cardiacos humanos (FCH), y la activation de este receptor aumenta la liberation de IL-6 y la production de colageno, la liberation de marcadores fibroticos y la liberation de biomarcadores de enfermedades cardiovasculares (ECV).

Ademas, la N-etilcarboxamida-adenosina (NECA), un analogo estable de la adenosina, aumento significativamente la liberacion de IL-6 de una manera dependiente de la concentracion. Por otra parte, la NECA aumento la expresion de la a-actina del musculo liso y del procolageno a-1, aumento la produccion de colageno de FCH y aumento la liberacion de dos nuevos biomarcadores de ECV, ST-2 soluble y PAPPA (protelna A plasmatica asociada al embarazo). Los efectos de NECA sobre los FCH, sin embargo, fueron inhibidos por completo por un antagonista del AdoR de A2B (Ejemplo 2).

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A nivel fisiologico, se elevan los niveles de adenosina en el miocardio isquemico. El aumento de los niveles de adenosina activa luego los receptores de A2B en los macrofagos, los miocitos cardiacos y los fibroblastos cardiacos, lo que resulta en la liberacion de mediadores inflamatorios y fibroticos que contribuyen a la disfuncion ventricular izquierda. La capacidad de un antagonista de AdoR de A2B para inhibir dicha activacion, a su vez, puede dar lugar a la inhibicion de la liberacion de dichos mediadores inflamatorios y fibroticos. Ademas, un antagonista de AdoR de A2B puede inhibir la activacion de los macrofagos en los tejidos cardiacos danados. En resumen, los antagonistas del receptor de la adenosina A2B de la presente divulgacion muestran ser capaces de reducir la respuesta fibrotica en las enfermedades del corazon, conduciendo a la mejora de la funcion ventricular izquierda.

De acuerdo con estos hallazgos mecanicistas, ahora se ha observado, en modelos de rata y de raton de infarto de miocardio con elevacion del segmento ST (IMEST), que los antagonistas del receptor de la adenosina A2B inhibieron la dilatacion del ventrlculo izquierdo (VI), como se muestra con una reduccion de la ampliacion del volumen telesistolico y del volumen telediastolico del VI, y el aumento de la fraccion de eyeccion del VI. Como la inhibicion de la dilatacion del VI produce una mejorla en la funcion del VI, y la inhibicion de la fibrosis en la zona limltrofe del infarto (ZLI) conduce a un menor numero de arritmias, los antagonistas del receptor de la adenosina A2B pueden reducir la muerte cardiovascular y la hospitalizacion por insuficiencia cardiaca o arritmias. En este sentido, se contempla que la fibrosis intersticial crea un sustrato para la arritmia. Al reducir la fibrosis intersticial, por lo tanto, los antagonistas del receptor de la adenosina A2B pueden reducir la incidencia de las arritmias y muerte cardiaca subita.

Un aspecto inesperado de estos hallazgos es que las actividades de los antagonistas del receptor de la adenosina A2B no interfieren con la respuesta fibrotica compensatoria tras un IM en la zona del infarto. Como se ilustra en la FIG. 18, durante la fase aguda del infarto de miocardio (por ejemplo, IMEST), las celulas de la zona del infarto sufren necrosis. Tras la fase aguda (por ejemplo, aproximadamente una semana despues del IM), la zona del infarto se estrecha y se alarga para compensar la perdida debida a la cicatriz fibrosa de las celulas necroticas. Dicho mecanismo de compensacion (tambien conocido como dilatacion VI) es beneficioso para el mantenimiento de la funcion del VI.

Sin embargo, la posterior dilatacion del VI durante la fase de mala adaptation puede conducir a insuficiencia cardiaca y arritmia. En este sentido, la dilatacion del VI en esta fase se produce en zonas exteriores a la zona del infarto, produciendo una dilatacion ventricular esferica. Ademas, el VI agrandado conduce a la disfuncion del VI caracterizada con una reduccion de la fraccion de eyeccion.

Sorprendentemente, los antagonistas del receptor de la adenosina A2B de la presente divulgacion inhiben en concreto, en los tejidos cardiacos de fuera de la zona del infarto, la liberacion de mediadores inflamatorios y fibroticos, reduciendo la inflamacion y lesion de los tejidos inducida por la fibrosis, y mejorando la fraccion de eyeccion y la funcion del VI. Por lo tanto, en contra de la perception convencional relativa al papel protector cardiaco de las adenosinas, los datos experimentales de la presente divulgacion demuestran el efecto terapeutico de la inhibicion de las actividades de las adenosinas, con antagonistas del receptor de la adenosina A2B, en la protection y la recuperation cardiaca tras un IM.

Por lo tanto, cuando se usan en pacientes que han sufrido un IM, los antagonistas del receptor de la adenosina A2B se pueden administrar al paciente incluso antes de que haya finalizado la fibrosis cardiaca compensatoria, sin arriesgar la inhibicion de dicha respuesta compensatoria. Ademas, se contempla que los pacientes que han sufrido un IM son hemodinamicamente estables cuando reciben el tratamiento. Es mas, se contempla que los antagonistas se pueden administrar tan pronto como durante el IM o inmediatamente despues del IM.

Tambien es sorprendente el grado del efecto terapeutico de los antagonistas del receptor de la adenosina A2B. Por ejemplo, en comparacion con otros farmacos antifibroticos tales como la pirfenidona, que solo retardaron la reduccion de la FEVI, los antagonistas del receptor de la adenosina A2B de la presente divulgacion fueron capaces de detener o incluso de invertir dicha reduccion (Ejemplo 6 y Fig. 12B).

En un aspecto, el IM es IM agudo. En otro aspecto, el IM es IM con elevacion del segmento ST (IMEST). En otro aspecto mas, el IM es IM sin elevacion del ST (IMSEST).

En un aspecto, el uso del antagonista del receptor de adenosina A2B se inicia tan pronto como durante el IM o inmediatamente despues del IM. En algunas realizaciones, el uso se produce cuando el paciente es diagnosticado de IM. En otro aspecto, el uso comienza aproximadamente 1 hora, o, como alternativa, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas despues del IM. En otro aspecto mas, el uso se inicia aproximadamente 1 dla, o como alternativa, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 dlas, o 1, 2, 3 o 4 semanas despues del IM. En un aspecto particular, el uso se inicia tan pronto como el paciente de IM es estabilizado. En un aspecto, el uso se inicia en el plazo de un dla despues del IM. En otro aspecto, el uso comienza entre uno y cinco dlas despues de un IM. En el caso de que no sea posible un uso inmediato, los datos actuales muestran que el uso que comienza una o dos semanas despues del IM sigue siendo eficaz.

En algunos aspectos, el uso comienza a mas tardar aproximadamente 3 dlas, o como alternativa, 5 dlas, 7 dlas, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas despues del IM.

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En algunos aspectos, los pacientes que han sufrido un IM son hemodinamicamente estables. Los metodos y los criterios para la determinacion de la estabilidad hemodinamica se conocen en la tecnica. La expresion "estabilidad hemodinamica", como se usa en el presente documento, se refiere al restablecimiento de uno o mas, o todos, los parametros hemodinamicos medidos en su intervalo normal. Los ejemplos de dichos intervalos normales se proporcionan en la siguiente tabla.

Valor tfpico Intervalo normal

Volumen telediastolico

120 ml 65 - 240 ml

Volumen telesistolico

50 ml 16 - 143 ml

Volumen de impulso

70 ml 55 - 100 ml

Fraccion de eyeccion

0,58 55 % - 70 %

Frecuencia cardiaca

75 ppm 60 - 100 ppm

Gasto cardiaco

5,25 l/min 4 - 8 l/min

Como se describe mas a fondo a continuacion, los antagonistas se pueden usar de varias vlas, incluyendo, la via sistemica, oral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal y por inhalacion.

3. Antagonistas del receptor de la adenosina A2B

El antagonista del receptor de A2B para su uso en la presente invencion es un compuesto que tiene la siguiente formula:

imagen2

y el nombre 3-etil-1-propil-8-(1-(3-(trifluorometil)bencil)-1H-pirazol-4-ol)-1H-purin-2,6(3H,7H)-diona o 3-etil-1-propil-8- (1-((3-(trifluorometil)fenil)metil)pirazol-4-il)-1,3,7-trihidropurin-2,6-diona o una sal farmaceuticamente aceptable. A lo largo del presente documento, a veces se denomina "Compuesto A" o "CVT-6833". El compuesto se describe en la patente de EE.UU. n.° 6.825.349.

Tambien se pretende que el antagonista del receptor de A2B desvelado en el presente documento represente formas no marcadas, as! como formas marcadas isotopicamente del compuesto. Los compuestos marcados isotopicamente tienen las estructuras representadas por las formulas dadas en la presente memoria, excepto que uno o mas atomos estan reemplazados por un atomo que tiene una masa atomica o un numero masico seleccionado. Los ejemplos de isotopos que pueden incorporarse a los compuestos de la divulgacion incluyen isotopos de hidrogeno, carbono, nitrogeno, oxlgeno, fosforo, fluor y cloro, tales como, pero sin limitacion, 2H (deuterio, D), 3H (tritio), 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 36Cl y 125I. Diversos compuestos marcados isotopicamente de la presente divulgacion, por ejemplo, aquellos en los que se incorporan isotopos radiactivos tales como 3H, 13C y 14C. Dichos compuestos marcados isotopicamente pueden ser utiles en estudios metabolicos, estudios cineticos de reaccion, tecnicas de deteccion o de formacion de imagenes tales como la tomografla por emision de positrones (PET) o tomografla computarizada por emision de un solo foton (SPECT), incluyendo ensayos de distribucion tisular de farmacos o sustratos, o en el tratamiento radiactivo de pacientes.

La divulgacion tambien incluye el Compuesto A desvelado en el presente documento, en el que de 1 a "n" hidrogenos unidos a un atomo de carbono esta/n reemplazado/s por deuterio, en el que n es el numero de atomos de hidrogeno de la molecula. Dichos compuestos muestran una mayor resistencia al metabolismo y, por tanto, son utiles para aumentar la semivida de cualquier compuesto cuando se administra a un mamlfero. Vease, por ejemplo, Foster, "Deuterium Isotope Effects in Studies of Drug Metabolism", Trends Pharmacol. Sci. 5(12):524-527 (1984). Dichos compuestos se sintetizan mediante medios bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, empleando materiales de partida en los que uno o mas atomos de hidrogeno se han reemplazado por deuterio.

Los compuestos terapeuticos marcados o sustituidos con deuterio de la divulgacion pueden tener mejores propiedades DMPK (metabolismo y farmacocinetica de farmacos), relativas a la distribucion, al metabolismo y a la excrecion (ADME). La sustitucion con isotopos mas pesados tales como el deuterio puede proporcionar ciertas ventajas terapeuticas resultantes de una mayor estabilidad metabolica, por ejemplo, una mayor semivida in vivo o

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menores necesidades de dosis. Un compuesto marcado con 18F puede ser util para los estudios de PET o SPECT. Los compuestos marcados isotopicamente de la presente divulgacion y los profarmacos de los mismos pueden prepararse, en general, llevando a cabo los metodos desvelados en los esquemas o en los ejemplos y las preparaciones descritos mas adelante, sustituyendo un reactivo marcado isotopicamente facilmente disponible por un reactivo no marcado isotopicamente. Ademas, la sustitucion con isotopos mas pesados, en particular, de deuterio (es decir, 2H o D) puede proporcionar ciertas ventajas terapeuticas como consecuencia de una mayor estabilidad metabolica, por ejemplo, una mayor semivida in vivo o menores necesidades de dosis o una mejora del Indice terapeutico. Se entiende que el deuterio, en el presente contexto, se considera un sustituyente en el compuesto de Formula I, o cualquier formula desvelada en el presente documento.

La concentracion de dicho isotopo mas pesado, en concreto, del deuterio, puede estar definida por un factor de enriquecimiento isotopico. En los compuestos de la presente divulgacion, cualquier atomo no designado especlficamente como un isotopo particular, pretende representar cualquier isotopo estable de ese atomo. A menos que se indique otra cosa, cuando una posicion se designa especlficamente como "H" o "hidrogeno", se entendera que la posicion tiene hidrogeno en su composicion isotopica de abundancia natural. Por consiguiente, en los compuestos de la presente divulgacion, cualquier atomo designado especlficamente como deuterio (D) pretende representar deuterio.

En muchos casos, los compuestos de la presente invencion son capaces de formar sales de acido y/o de base en virtud de la presencia de grupos amino y/o carboxilo o grupos similares a los mismos. La expresion "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a sales que conservan la eficacia biologica y las propiedades de los compuestos de Formula I, II o III, y que no son biologicamente indeseables o no deseados por otra causa. Las sales de adicion de base farmaceuticamente aceptables se pueden preparar a partir de bases inorganicas y organicas. Las sales derivadas de bases inorganicas incluyen, solamente a modo de ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases organicas incluyen, pero sin limitacion, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, tales como alquilaminas, dialquilaminas, trialquilaminas, alquilaminas sustituidas, di(alquil)aminas sustituidas, tri(alquil)aminas sustituidas, alquenilaminas, dialquenilaminas, trialquenilaminas, alquenilaminas sustituidas, di(alquenil)aminas sustituidas, tri(alquenilaminas) sustituidas, cicloalquilaminas, di(cicloalquil)aminas, tri(cicloalquil)aminas, cicloalquilaminas sustituidas, cicloalquilamina disustituida, cicloalquilamina trisustituida, cicloalquenilaminas, di(cicloalquenil)aminas, tri(cicloalquenil)aminas, cicloalquenilaminas sustituidas, cicloalquenilaminas disustituidas, cicloalquenilaminas trisustituidas, arilaminas, diarilaminas, triarilaminas, heteroarilaminas, diheteroarilaminas, triheteroarilaminas, aminas heteroclclicas, aminas diheteroclclicas, aminas triheteroclclicas, di- y tri-aminas mixtas en las que al menos dos de los sustituyentes de la amina son diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, heteroarilo, heteroclclico, y similares. Tambien se incluyen aminas en las que dos o tres sustituyentes, junto con el nitrogeno de amino, forman un grupo heteroclclico o heteroarilo.

Los ejemplos especlficos de aminas adecuadas incluyen, solamente a modo de ejemplo, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, tri(iso-propil)amina, tri(n-propil)amina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, trometamina, lisina, arginina, histidina, cafelna, procalna, hidrabamina, colina, betalna, etilendiamina, glucosamina, N- alquilglucaminas, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, morfolina, N-etilpiperidina, y similares.

Las sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables se pueden preparar a partir de acidos inorganicos y organicos. Las sales derivadas de acidos inorganicos incluyen acido clorhldrico, acido bromhldrico, acido sulfurico, acido nltrico, acido fosforico, y similares. Las sales derivadas de acidos organicos incluyen acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido piruvico, acido oxalico, acido malico, acido malonico, acido succlnico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido cltrico, acido benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido p-tolueno-sulfonico, acido salicllico, y similares.

Nomenclatura

imagen3

El Compuesto A de la invencion se denomina: 8-4-[5-(2-metoxifenil)-[1,2,4]-oxadiazol-3-ilmetoxi]-fenil}-1,3-dipropil- 1,3,7-trihidropurin-2,6-diona.

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4. Terapias de combinacion

Tambien se proporcionan terapias de combinacion. En una realizacion, el uso comprende ademas un inhibidor de la enzima conversora de la angiotensina (ACE). Los ejemplos no limitantes de inhibidores de la ACE incluyen captopril, enalapril, lisinopril, perindopril, ramipril y similares.

En otra realizacion, el uso comprende ademas un antagonista del receptor de la angiotensina II, tambien conocido como bloqueadores de los receptores de la angiotensina (ARB). Los ejemplos no limitantes de los ARB incluyen losartan, EXP 3174, candesartan, valsartan, irbesartan, telmisartan, eprosartan, olmesartan, azilsartan y similares.

Los antagonistas del receptor de la adenosina A2B se pueden usar en combinacion con otras terapias o agentes para la fibrosis cardiaca, incluyendo, pero sin limitacion, Resveratrol (3,5,4'-trihidroxi-trans-estilbeno) Sutra et al., J Agric Food Chem 56(24):11683-11687 (2008)). El Resveratrol es un estilbenoide, un tipo de fenol natural y una fitoalexina producidos de manera natural por varias plantas cuando sufren el ataque de patogenos tales como las bacterias o los hongos.

Se contempla el sinergismo entre los antagonistas del receptor de la adenosina A2B y otras terapias para la fibrosis cardiaca debido a sus respectivos mecanismos terapeuticos diferentes. Los inhibidores de la ACE, por ejemplo, bloquean la conversion de la angiotensina I en la angiotensina II. Por lo tanto, reducen la resistencia arteriolar y aumentan la capacidad venosa; aumentan el gasto cardiaco, el Indice cardiaco, el trabajo y el volumen de impulso del corazon; reducen la resistencia vascular renal; y conducen a un aumento de la natriuresis (excrecion de sodio en la orina). Por el contrario, los antagonistas del receptor de la adenosina A2B reducen la inflamacion y la fibrosis cardiacas. En combinacion, por lo tanto, un antagonista del receptor de la adenosina A2B y un inhibidor de ACE pueden mejorar la funcion cardiaca y reducir la dosis terapeutica de cada agente individual. La reduccion de las dosis terapeuticas, a su vez, ayuda a reducir o a prevenir los posibles eventos adversos.

En terminos de administracion, se contempla que los dos o mas agentes pueden administrarse simultanea o secuencialmente. Si los dos o mas agentes se administran de forma simultanea, bien se pueden administrar como una sola dosis o como dosis separadas. Ademas, se contempla que el medico a cargo sera capaz de determinar facilmente la dosis requerida del agente adicional, la pauta posologica y la via de administracion preferida. Dichas composiciones se preparan de una manera bien conocida en la tecnica farmaceutica (vease, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mace Publishing Co., Filadelfia, PA 17a Ed. (1985) y "Modern Pharmaceutics", Marcel Dekker, Inc. 3a Ed. (G.S. Banker & C.T. Rhodes, Eds.).

5. Administracion

Las composiciones adecuadas para la administracion en la invencion se pueden administrar a individuos en necesidad de las mismas por via oral, intravltrea, topica, sublingual, bucal, nasal, parenteral (por ejemplo, intramuscular), intraperitoneal, inyeccion intravenosa o subcutanea, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, sublingual, bucal, como un pulverizado oral o un pulverizado nasal. Las composiciones se pueden formular en formas de dosificacion apropiadas para cada via de administracion.

Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar por via oral, intranasal, ocular, parenteral o mediante terapia de inhalacion, y pueden adoptar la forma de comprimidos, grageas, granulos, capsulas, plldoras, ampollas, supositorios o forma de aerosol. Tambien pueden adoptar la forma de suspensiones, soluciones y emulsiones de los ingredientes clave en diluyentes acuosos o no acuosos, jarabes, granulados o polvos. Ademas de un agente de la presente invencion, las composiciones farmaceuticas tambien pueden contener otros compuestos

farmaceuticamente activos o una pluralidad de compuestos.

En algunas realizaciones, la composicion de la invencion tambien denominad en el presente documento principio activo, se puede administrar para la terapia por cualquier via adecuada incluyendo la via oral, nasal, topica (incluyendo transdermica, aerosol, bucal y sublingual), parenteral (incluyendo subcutanea, intramuscular, intravenosa e intradermica) y pulmonar. Tambien se apreciara que la via preferida variara con el estado y la edad del receptor, y con la enfermedad que se este tratando.

A. Inyeccion

Un modo de administracion es el parenteral, en particular, por inyeccion tal como inyeccion intravenosa (IV). Las formas en las que las composiciones de la presente divulgacion pueden incorporarse para la administracion por inyeccion incluyen suspensiones o emulsiones acuosas u oleosas, con aceite de sesamo, aceite de malz, aceite de semilla de algodon o aceite de cacahuete, as! como elixires, manitol, dextrosa, o una solucion acuosa esteril, y vehlculos farmaceuticos similares. Las soluciones acuosas en solucion salina tambien se usan convencionalmente para la inyeccion, pero se prefieren menos en el contexto de la presente divulgacion. Tambien se pueden emplear etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol llquido y similares (y mezclas adecuadas de los mismos), derivados de ciclodextrina y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de la

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dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de los microorganismos se puede obtener mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal, y similares.

En un aspecto, la divulgacion proporciona una solucion IV que comprende una concentracion seleccionada de un antagonista del receptor de la adenosina A2B. En concreto, la solucion IV comprende preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 mg del antagonista del receptor de la adenosina A2B por mililitro de una solucion acuosa farmaceuticamente aceptable. Como alternativa, la concentracion del antagonista del receptor de la adenosina A2B en la solucion IV es de aproximadamente 5 a aproximadamente 1.000 mg, o de forma alternativa, de aproximadamente 10 a aproximadamente 800 mg, o de forma alternativa, de aproximadamente 20 a aproximadamente 800 mg, o de forma alternativa, de aproximadamente 50 a aproximadamente 700 mg, o de forma alternativa, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mg. En otro aspecto, la concentracion del antagonista del receptor de la adenosina A2B en la solucion IV es de aproximadamente 100 a aproximadamente 1.000 mg, o de forma alternativa, de aproximadamente 100 a aproximadamente 800 mg, o de forma alternativa, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg, o de forma alternativa de aproximadamente 200 a aproximadamente 500 mg, o de forma alternativa, de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 mg, o de forma alternativa, de aproximadamente 200 a aproximadamente 300 mg. En otro aspecto mas, la concentracion es de aproximadamente 250 mg. Con el fin de permitir el flujo intravenoso rapido del antagonista del receptor de la adenosina A2B en el paciente, la solucion IV contiene preferentemente componentes no viscosos, incluyendo, a modo de ejemplo, propilenglicol o polietilenglicol (por ejemplo, polietilenglicol 400). Se entiende que se pueden incluir pequenas cantidades de componentes viscosos que no alteran materialmente la viscosidad en las formulaciones intravenosas de la presente divulgacion. En una realizacion particularmente preferida, la viscosidad de la solucion IV es preferentemente menos de 1 x 10-5 m2/s (10 cSt) a 20 °C, mas preferentemente inferior a 5 x 10-6 m2/s (5 cSt) a 20 °C e incluso mas preferentemente inferior a 2 x 10-6 m2/s (2 cSt) a 20 °C.

Las soluciones inyectables esteriles se preparan incorporando el compuesto de la divulgacion en la cantidad requerida al disolvente apropiado con otros diversos ingredientes como se ha especificado anteriormente, segun sea necesario, seguido de la esterilizacion por filtracion. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados a un vehlculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son tecnicas de secado al vaclo y de liofilizacion que producen un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solucion previamente esterilizada por filtracion del mismo.

B. Administration oral

La administracion oral es otra via de administracion de los compuestos de la divulgacion. La administracion puede ser mediante capsulas o comprimidos con recubrimiento enterico, o similares. Al preparar las composiciones farmaceuticas que incluyen al menos un compuesto de la divulgacion, el principio activo normalmente se diluye mediante un excipiente y/o se encierra dentro de un vehlculo que puede estar en forma de una capsula, una bolsita, un papel u otro recipiente. Cuando el excipiente sirve como diluyente, puede ser en un material solido, semisolido o llquido (como antes), que actue como un vehlculo, portador o medio para el principio activo. Por lo tanto, las composiciones pueden estar en forma de comprimidos, plldoras, polvos, grageas, sobres, sellos, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un solido o en un medio llquido), pomadas que contienen, por ejemplo, hasta el 10 % en peso del compuesto activo, capsulas de gelatina blandas y duras, soluciones inyectables esteriles y polvos envasados esteriles.

Algunos ejemplos de excipientes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arabiga, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua esteril, jarabe y metilcelulosa. Las formulaciones pueden incluir ademas: agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; emulsionantes y agentes de suspension; agentes conservantes tales como metil- y propilhidroxi-benzoatos; agentes edulcorantes; y agentes aromatizantes.

Las composiciones de la divulgacion se pueden formular de modo que proporcionen una liberacion rapida, sostenida o retardada del principio activo tras la administracion al paciente empleando procedimientos conocidos en la tecnica. Los sistemas de administracion de farmacos de liberacion controlada para la administracion oral incluyen sistemas de bomba osmotica y sistemas de disolucion que contienen depositos recubiertos de pollmero o formulaciones de matriz de farmaco-pollmero. Los ejemplos de sistemas de liberacion controlada se dan en las patentes de EE.UU. n.° 3.845.770.; 4.326.525; 4.902.514; y 5.616.345. Otra formulacion para su uso en los metodos de la presente divulgacion emplea dispositivos de administracion transdermica ("parches"). Dichos parches transdermicos se pueden usar para proporcionar infusion continua o discontinua de los compuestos de la presente divulgacion en cantidades controladas. La construccion y el uso de parches transdermicos para la administracion de agentes farmaceuticos es bien conocida en la tecnica. Veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 5.023.252, 4.992.445 y 5.001.139. Dichos parches se pueden construir para la administracion continua, pulsatil o a demanda de agentes farmaceuticos.

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Las composiciones se formulan preferentemente en una forma de dosificacion unitaria. La expresion "formas de dosificacion unitaria" se refiere a unidades fisicamente diferenciadas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y otros mamiferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado, en asociacion con un excipiente farmaceutico adecuado (por ejemplo, un comprimido, una capsula, una ampolla). Los compuestos de la presente divulgacion son eficaces en un amplio intervalo de dosificacion y se administran en general en una cantidad farmaceuticamente eficaz.

En algunos aspectos, para la administracion oral, cada unidad de dosificacion contiene de 10 mg a 2 g de un compuesto de la divulgacion, o como alternativa, de 10 a 200 mg, o aproximadamente 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg o 160 mg. Para la administracion parenteral, la unidad de dosificacion puede ser de 10 a 700 mg de un compuesto de la divulgacion, o de aproximadamente 50 a 200 mg. Se entendera, sin embargo, que la cantidad del compuesto de la divulgacion realmente administrada sera determinada por un medico, a la luz de las circunstancias relevantes, incluyendo la afeccion que se vaya a tratar, la via de administracion seleccionada, el compuesto real administrado y su actividad relativa, la edad, el peso y la respuesta de cada paciente, la gravedad de los sintomas del paciente, y similares.

Para preparar composiciones solidas tales como comprimidos, el principio activo principal se mezcla con un excipiente farmaceutico para formar una composicion de preformulacion solida que contenga una mezcla homogenea de un compuesto de la presente divulgacion. Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulacion como homogeneas, se quiere decir que el principio activo esta dispersado uniformemente por toda la composicion de manera que la composicion puede subdividirse facilmente en formas de dosificacion unitarias igualmente eficaces tales como comprimidos, pildoras y capsulas.

Los comprimidos o las pildoras de la presente divulgacion se pueden recubrir o componerse de otra manera para proporcionar una forma de dosificacion que proporcione la ventaja de la accion prolongada, o para proteger de las condiciones acidas del estomago. Por ejemplo, el comprimido o la pildora pueden comprender un componente de dosificacion interno y un componente de dosificacion externo, estando este ultimo en forma de una envoltura sobre el primero. Los dos componentes pueden estar separados por una capa enterica que sirva para resistir la desintegracion en el estomago y permitir que el componente interno pase intacto al duodeno o que se retrase su liberacion. Se pueden usar varios materiales para dichas capas entericas o recubrimientos, incluyendo dichos materiales una serie de acidos polimericos y mezclas de acidos polimericos con materiales tales como goma laca, alcohol cetilico y acetato de celulosa.

C. Inhalacion e insuflacion

Las composiciones para inhalacion o insuflacion incluyen soluciones y suspensiones en disolventes farmaceuticamente aceptables, acuosos u organicos, o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones liquidas o solidas pueden contener excipientes farmaceuticamente aceptables adecuados como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, las composiciones se administran por via respiratoria oral o nasal para un efecto local o sistemico. Las composiciones en disolventes preferentemente farmaceuticamente aceptables se pueden nebulizar mediante el uso de gases inertes. Las soluciones nebulizadas pueden inhalarse directamente desde el dispositivo de nebulizacion, o el dispositivo de nebulizacion puede fijarse a una cubierta protectora de mascara facial o una maquina de respiracion de presion positiva intermitente. Las composiciones en solucion, suspension o en polvo se pueden administrar, preferentemente, por via oral o nasal, desde dispositivos que administran la formulacion de una manera apropiada.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la divulgacion. Los expertos en la materia han de apreciar que las tecnicas desveladas en los siguientes ejemplos representan tecnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la practica de la divulgacion, y por lo tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su practica. Sin embargo, los expertos en la materia deberian apreciar, a la luz de la presente divulgacion, que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones especificas que se desvelan, y seguir obteniendose un resultado parecido o similar sin apartarse del espiritu ni del alcance de la divulgacion.

Ejemplo de formulacion 1

Se preparan capsulas de gelatina dura que contienen los siguientes ingredientes:

Ingrediente (mg/capsula)

Principio activo 30,0

Almidon 305,0

Estearato de magnesio 5,0

Los ingredientes anteriores se mezclan y se introducen en capsulas de gelatina dura.

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Ejemplo de formulacion 2

Se prepara una formula en comprimidos usando los siguientes ingredientes:

Ingrediente

Principio activo Celulosa, microcristalina Dioxido de silicio coloidal Acido estearico

(mg/comprimidos)

25.0

200.0 10,0 5,0

Los componentes se mezclan y se comprimen para formar comprimidos.

Ejemplo de formulacion 3

Se prepara una formulacion de inhalador de polvo seco que contiene los siguientes componentes:

Ingrediente % en peso

Principio activo 5 Lactosa 95

Se mezcla el principio activo con la lactosa y se anade la mezcla a un aparato de inhalacion de polvo seco.

Ejemplo de formulacion 4

Se preparan comprimidos, conteniendo cada uno 30 mg de principio activo, de la siguiente manera:

Ingrediente (mg/comprimido)

Principio activo 30,0 mg

Almidon 45,0 mg

Celulosa microcristalina 35,0 mg

Polivinilpirrolidona

(como solucion al 10 % en agua esteril) 4,0 mg

Almidon de carboximetilo sodico 4,5 mg

Estearato de magnesio 0,5 mg

Talco 1,0 mg

Total 120 mg

A traves de un tamiz estadounidense de malla n.° 20 se pasan el principio activo, el almidon y la celulosa y se mezclan a fondo. La solucion de polivinilpirrolidona se mezcla con los polvos resultantes, que se pasan despues a traves de un tamiz estadounidense de malla 16. Se secan los granulos as! producidos a una temperatura de 50 °C a 60 °C y se pasan a traves de un tamiz estadounidense de malla 16. Despues, se anade el almidon de carboximetilo sodico, el estearato de magnesio y el talco, previamente pasados a traves de un tamiz estadounidense de malla 30, a los granulos que, despues de mezclar, se comprimen en una compresora, produciendo comprimidos con un peso unitario de 120 mg.

Ejemplo de formulacion 5

Se fabrican supositorios, conteniendo cada uno 25 mg de principio activo de la siguiente manera:

Ingrediente Cantidad

Principio activo 25 mg

Gliceridos de acidos grasos saturados hasta 2.000 mg

A traves de un tamiz estadounidense de malla 60 se pasa el principio activo y se suspende en los gliceridos de acidos grasos saturados previamente fundidos usando el mlnimo calor necesario. A continuacion, se vierte la mezcla en un molde de supositorios de capacidad nominal de 2,0 g y se deja enfriar.

Ejemplo de formulacion 6

Se preparan suspensiones, conteniendo cada una de ellas 50 mg de principio activo por dosis de 5,0 ml de la siguiente manera:

Ingrediente Cantidad

Principio activo 50,0 mg

Goma de xantano 4,0 mg

Carboximetilcelulosa sodica (11 %)

Celulosa microcristalina (89 %)

50,0 mg

Sacarosa

1,75 g

Benzoato de sodio

10,0 mg

Aroma y color

c.v.

Agua purificada hasta

5,0 ml

Se combinan el principio activo, la sacarosa y la goma de xantano, se pasan a traves de un tamiz de malla estadounidense n.° 10, y luego se mezclan con una solucion previamente preparada de la celulosa microcristalina y la carboximetilcelulosa sodica en agua. Se diluyen el benzoato de sodio, aroma y color con algo de agua, y se 5 anaden con agitacion. A continuacion se anade suficiente agua para producir el volumen requerido.

Ejemplo de formulacion 7

Se puede preparar una formulacion subcutanea se la siguiente manera:

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Ingrediente Cantidad

Principio activo 5,0 mg Aceite de malz 1,0 ml

Ejemplo de formulacion 8

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Se prepara un preparado inyectable que tiene la siguiente composicion:

Ingredientes

Principio activo Manitol, USP Acido gluconico, USP Agua (destilada, esteril) Gas de nitrogeno, NF

Cantidad

2,0 mg/ml 50 mg/ml c.s. (pH 5-6) c.s. hasta 1,0 ml c.s.

Ejemplo de formulacion 9

20 Se prepara un preparado topico que tiene la siguiente composicion:

Ingredientes

Principio activo

Span 60

Tween 60

Aceite mineral

Vaselina

Metilparabeno

Propilparabeno

BHA (hidroxianisol butilado)

Agua

gramos

0,2-10 mg/ml 2,0 2,0 5,0 0,10 0,15 0,05 0,01

c.s. hasta 100

Se combinan todos los ingredientes anteriores, a excepcion del agua, y se calientan hasta 60 °C con agitacion. A continuacion, se anade una cantidad suficiente de agua a 60 °C con agitacion vigorosa para emulsionar los 25 ingredientes, y despues se anade agua c.s. hasta 100 g.

Ejemplos

La presente divulgacion se define ademas por referencia a los siguientes ejemplos.

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Abreviaturas

A menos que se indique lo contrario, todas las temperaturas estan en grados centlgrados (°C). Ademas, en estos ejemplos y en otras partes, las abreviaturas tienen los siguientes significados:

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mg

= Microgramo

ml

= Microlitro

mM

= Micromolar

Ado

= Adenosina

AdoR

= Receptor de adenosina

IAM

= Infarto agudo de miocardio

ppm

= Pulsaciones por minuto

VC

= Cardiovascular

ECV

= Enfermedad cardiovascular

FE

= Fraccion de eyeccion

ELISA

= Ensayo de inmunoabsorcion ligada a enzima

g

= Gramo

FCH

= Fibroblastos cardiacos humanos

ZLI

= Zona limitrofe del infarto

h

= Hora

ip o i.p.

= Intraperitoneal

VI

= Ventriculo izquierdo

DTDVI

= Diametro telediastolico del ventriculo izquierdo

FEVI

= Fraccion de eyeccion del ventriculo izquierdo

DTSVI

= Diametro telesistolico del ventriculo izquierdo

VTSVI

= Volumen telesistolico del ventriculo izquierdo

EDPPVI

= Espesor diastolico de la pared posterior del VI

mg

= Miligramo

ml

= Mililitro

mM

= Milimolar

IM

= Infarto de miocardio

IFM

= Indice de funcion miocardica

NECA

= N-etilcarboxamida-adenosina

nM

= Nanomolar

STDVD

= Superficie telediastolica del ventriculo derecho

RT-PCR

= Reaccion en cadena de la polimerasa de transcripcion inversa

IMESST

= Infarto de miocardio con elevacion del segmento ST

SV

= Volumen de impulso del corazon

DSPAT

= desplazamiento sistolico del plano del anillo tricuspideo

Metodologfas y reactivos

Celulas y reactivos

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El Compuesto A fue sintetizado por Gilead Sciences, Inc. (Foster City, California) de conformidad en la patente de EE.UU. n.° 6.825.349. Otros compuestos quimicos se obtuvieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri).

RT-PCR en tiempo real

La RT-PCR en tiempo real se realizo como se ha publicado usando el equipo de PCR de Stratagene (La Jolla, California). Zhong H., et al., "A2B adenosine receptors increase cytokine release by bronchial smooth muscle cells", American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 30(1): 118-125 (2004).

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Ejemplo 1: Ensayos de receptores de adenosina

Para seleccionar antagonistas del receptor de A2B, normalmente se usan dos tipos de ensayos: 1) ensayo de union de radioligando para determinar si un compuesto dado pueda unirse al receptor de A2B como se describe a continuacion; y 2) un ensayo funcional (ensayo de AMPc u otros) para determinar si el compuesto es un agonista (activa el receptor) o un antagonista (inhibe la activacion del receptor).

Se usa un ensayo de union de radioligando para el receptor de la adenosina A2B para determinar la afinidad de un compuesto por el receptor de la adenosina A2B. Entretanto, se realizan los ensayos de union de radioligando para otros receptores de adenosina para determinar las afinidades del compuesto por los receptores de la adenosina Ai, A2A y A3. El compuesto deberla tener una mayor afinidad (de al menos el triple) por el receptor de A2B que por otros receptores de adenosina.

Se suele usar un ensayo de AMPc para el receptor de A2B para confirmar que el compuesto es un antagonista y que bloqueara el aumento mediado por el receptor de A2B en AMPc.

Union del radioligando para el receptor de adenosina A2B

Los compuestos que son antagonistas putativos del receptor de A2B se pueden examinar para determinar la actividad requerida basandose en los siguientes ensayos. Se transfectan de forma estable ADNc humanos del receptor de la adenosina A2B en celulas HEK-293 (denominadas celulas HEK-A2B). Se lava la monocapa de celulas HEK-A2B con PBS una vez y se recoge en un tampon que contiene HEPES 10 mM (pH 7,4), EDTA 10 mM e inhibidores de la proteasa. Se homogenizan estas celulas en un homogenizador Polytron durante 1 minuto en la posicion 4, y se centrifugan a 29.000 g durante 15 minutos a 4 °C. Se lavan los sedimentos celulares una vez con un tampon que contiene HEPES 10 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM e inhibidores de la proteasa, y se vuelven a suspender en el mismo tampon suplementado con sacarosa al 10 %. Se mantienen las allcuotas congeladas a -80 °C. Los ensayos de competition se inician mezclando 3H-ZM241385 10 nM (Tocris Cookson) con diversas concentraciones de compuestos de ensayo y 50 mg de protelnas de la membrana en tampon TE (Tris 50 mM y EDTA 1 mM) suplementado con 1 unidad/ml de adenosina desaminasa. Se incuban los ensayos durante 90 minutos, se detienen por filtration usando el cosechador de Packard y se lavan cuatro veces con tampon TM enfriado con hielo (Tris 10 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,4). La union inespeclfica se determina en presencia de ZM241385 10 pM. Las afinidades de los compuestos (es decir, los valores de Ki) se calculan usando el software GraphPad.

Union del radioligando para otros receptores de adenosina

Se transfectan de forma estable ADNc humanos del receptor de la adenosina A1, A2A y A3 bien en celulas CHO o celulas HEK-293 (denominadas CHO-A1 HEK-A2A, CHO-A3). Se preparan las membranas a partir de estas celulas usando el mismo protocolo que se ha descrito anteriormente. Los ensayos de competicion se inician mediante la mezcla de 3H-CPX 0,5 nM (para CHO-A1), 3H-ZM241385 2 nM (HEK-A2A) o 125I-AB-MECA 0,1 nM (CHO-A3) con diversas concentraciones de compuestos de ensayo y las respectivas membranas en el tampon TE (Tris 50 mM y EDTA 1 mM de CHO-A1 y HEK-A2A) o tampon TEM (Tris 50 mM, EDTA 1 mM y MgCh 10 mM para CHO-A3) suplementado con 1 unidad/ml de adenosina desaminasa. Los ensayos se incuban durante 90 minutos, se detienen por filtracion usando el cosechador Packard y se lavan cuatro veces con tampon TM enfriado con hielo (Tris 10 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,4). La union inespeclfica se determina en presencia de CpX 1 pM (CHO-A1), ZM214385 1 pM (HEK-A2A) e IB-MECA 1 pM (CHO-A3). Las afinidades de los compuestos (es decir, los valores de Ki) se calculan usando el software GraphPad.

Mediciones de AMPc

Se recoge la monocapa de celulas transfectadas en PBS que contiene EDTA 5 mM. Se lavan las celulas una vez con DMEM y se vuelven a suspender en DMEM que contiene 1 unidad/ml de adenosina desaminasa a una densidad de 100.000, 500.000 celulas/ml. Se mezclan 100 pl de la suspension de celulas con 25 pl que contienen diversos agonistas y/o antagonistas, y se mantiene la reaction a 37 °C durante 15 minutos. Al final de los 15 minutos, se anaden 125 pl de HCl 0,2 N para detener la reaccion. Se centrifugan las celulas durante 10 minutos a 1.000 rpm. Se retiran 100 pl del sobrenadante y se acetilan. Se miden las concentraciones de AMPc en los sobrenadantes usando el ensayo de AMPc directo de Assay Design.

Se acoplan los receptores de la adenosina A2A y A2B a las protelnas G y, por lo tanto, los agonistas del receptor de la adenosina A2A (tales como CGS21680) o del receptor de la adenosina A2B (tales como NECA) aumentan las acumulaciones de AMPc, mientras que los antagonistas de estos receptores evitan el aumento de las acumulaciones de AMPc inducidas por los agonistas. Se acoplan los receptores de la adenosina A1 y A3 a protelnas Gi y, por lo tanto, los agonistas del receptor de la adenosina A1 (tales como CPA) o del receptor de la adenosina A3 (tales como IB-MECA) inhiben el aumento de las acumulaciones de AMPc inducidas por la forskolina. Los antagonistas de los receptores A1 y A3 previenen la inhibition de las acumulaciones de AMPc.

Es competencia del experto en la materia determinar si un compuesto, basandose en el protocolo de ensayo

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anterior, es un antagonista del receptor de A2B. Una selectividad del triple, o en ciertos casos, 10 veces superior, por el agonista del receptor de A2B frente a otros receptores de la adenosina, se puede considerar que cualifica a un compuesto como un antagonista selectivo del receptor de A2B.

Ejemplo 2: Atenuacion de los biomarcadores de la fibrosis cardiaca por el receptor de la adenosina A2B

El presente ejemplo demuestra que los receptores de la adenosina A2B (AdoR) son el subtipo predominante de AdoR expresados en fibroblastos cardiacos humanos primarios (FCH), y sugiere que el AdoR de A2B media la respuesta fibrotica en enfermedades del corazon. Por lo tanto, se puede usar un antagonista del AdoR de A2B para el tratamiento de la fibrosis cardiaca.

Se determino la expresion de AdoR, a-actina del musculo liso y procolageno a-1 usando RT-PCR en tiempo real. Se midio la concentracion de IL-6, ST-2 soluble y PAPPA (protelna A plasmatica asociada al embarazo) en los sobrenadantes celulares usando ELISA, y se determino la concentracion del colageno soluble usando el ensayo de colageno Sircol™.

Entre los cuatro subtipos de AdoR, el AdoR de A2B se expreso al nivel mas alto de FCH. La N-etilcarboxamida- adenosina (NECA), un analogo estable de la adenosina, aumento significativamente la liberacion de IL-6 de una manera dependiente de la concentracion, con un aumento maximo de 2,4 ± 0,1 veces sobre el nivel basal. Ademas, la NECA (10 gM) aumento la expresion de la a-actina de musculo liso y del procolageno a-1, y la produccion de colageno (induction de 1,8 ± 0,1 veces, de 3,4 ± 0,2 a 6,0 ± 0,4 mg/ml, p < 0,05) de los FCH. Por otra parte, la NECA aumento la liberacion de dos nuevos biomarcadores de enfermedades cardiovasculares (ECV), ST-2 soluble (induccion de 1,7 ± 0,1, de 1,5 ± 0,1 a 2,6 ± 0,1 ng/ml, p < 0,05) y PAPPA (induccion de 4,4 ± 0,6 veces, de 1,4 ± 0,5 a 6,2 ± 0,8 ng/ml, p < 0,05). Los efectos de NECA sobre la liberacion de IL-6, colageno, ST-2 y PAPPA, y la expresion de a-actina de musculo liso y procolageno a-1 fueron completamente inhibidos por un antagonista selectivo del AdoR de A2B, el Compuesto A (Fig. 1A- D).

El presente ejemplo, por tanto, indica que el AdoR de A2B es el subtipo predominante de AdoR expresados en los FCH humanos primarios, y que la activation de este receptor aumenta la liberacion de IL-6 y la produccion de colageno, la expresion de marcadores fibroticos y la liberacion de biomarcadores de ECV. Estos hallazgos sugieren que AdoR de A2B podrla mediar la respuesta fibrotica en las enfermedades del corazon. Por lo tanto, los antagonistas del AdoR de A2B, a traves de la inhibition de la activacion del AdoR de A2B, se pueden usar para el tratamiento de la fibrosis cardiaca.

Ejemplo 3: Mejora de la remodelacion cardiaca por parte del antagonista de A2B

El presente ejemplo demuestra que el bloqueo selectivo del receptor de la adenosina A2B puede mejorar la remodelacion cardiaca despues de un infarto agudo de miocardio en el raton. La adenosina se libera en respuesta a la lesion del tejido, y potencia la hiperemia y la inflamacion. Los efectos proinflamatorios de la adenosina a traves del receptor de A2B provocan mayores danos en el tejido. El presente ejemplo prueba si el bloqueo selectivo del receptor de A2B durante el infarto agudo de miocardio podrla conducir a una remodelacion cardiaca mas favorable.

Se sometieron ratones macho ICR a cirugla de ligadura de la arteria coronaria o a tratamiento simulado (N = 8-10 por grupo). Se les administro un antagonista selectivo de A2B, el Compuesto A a 4 mg/kg en una suspension de dosificacion formulada, cada 12 horas i.p., comenzando inmediatamente despues de la cirugla y se continuo durante 14 dlas. Se realizo una ecocardiografla transtoracica antes de la cirugla y despues, 7, 14 y 28 dlas mas tarde. Se sacrifico un subgrupo de ratones 72 horas despues de la cirugla, y se midio la actividad de la caspasa-1, un mediador proinflamatorio clave, en el tejido cardiaco.

Todos los ratones con operation simulada estaban vivos a las 4 semanas, mientras que el 42 % de los ratones tratados con vehlculo y el 25 % de los tratados con el Compuesto A murieron durante las 4 semanas posteriores a la cirugla. El tratamiento con el Compuesto A redujo significativamente la actividad de la caspasa-1, el diametro telediastolico y el Indice de funcion miocardica, y aumento la fraction de eyeccion del VI, en comparacion con el vehlculo (FIG. 2).

Por lo tanto, el presente ejemplo demuestra que el bloqueo selectivo del receptor de la adenosina A2B con un antagonista selectivo de A2B, el Compuesto A, limita la activacion de caspasa-1 en el corazon y conduce a una remodelacion cardiaca mas favorable despues de un infarto agudo de miocardio en el raton.

Ejemplo 4: Atenuacion de la remodelacion cardiaca tras un infarto agudo de miocardio mediante el antagonista de A2B

El presente ejemplo usa un modelo de raton in vivo para demostrar que el bloqueo selectivo del AdoR de A2B con antagonista reduce la actividad de la caspasa-1 en el corazon, conduciendo a una remodelacion cardiaca mas favorable despues de un infarto agudo de miocardio (IAM).

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Metodos

Modelo experimental del IAM

Se adquirieron ratones CD1 macho exogamicos adultos (8-12 semanas de vida) en Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN). Los experimentos se realizaron segun las directrices de los animales de laboratorio para la investigation biomedica, publicados por los Institutos Nacionales de Salud (n.° 85-23, revisado en 1996). El protocolo del estudio fue aprobado por el Comite Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Estado de Virginia. Se indujo IAM experimental mediante la ligadura de la arteria coronaria permanente para inducir un infarto no reperfundido de gran tamano que afectara aproximadamente al 30 % del ventrlculo izquierdo y que diera lugar a una miocardiopatla dilatada isquemica (Mezzaroma et al. Proc Natl Acad Sci 2011 - en prensa, y Abbate et al. Circulation 2008; 117:2670-83). En resumen, se intubaron los ratones orotraquealmente bajo anestesia (de 50 a 70 mg/kg de pentobarbital), se colocaron en position de decubito lateral derecho, y luego se sometieron a una toracotomla izquierda, pericardiectomla y ligadura de la arteria coronaria izquierda proximal. Se cerro el pecho, y se dejo que los animales se recuperaran. Se asignaron aleatoriamente los ratones que sobrevivieron a la cirugla a los diferentes grupos de tratamiento (N = 6-15 por grupo). Se realizaron operaciones simuladas en las que los animales se sometieron al mismo metodo quirurgico sin ligadura de la arteria coronaria (N = 4-8 por grupo). En la FIG. 3, se muestra una llnea temporal del protocolo del estudio.

Tratamiento

El antagonista del AdoR de A2B, el Compuesto A, se obtuvo en Gilead Sciences, Foster City, CA. Los ratones se asignaron aleatoriamente al tratamiento con el Compuesto A (4 mg/kg) o a dosis correspondientes de vehlculo administradas por via intraperitoneal (volumen final de 0,13 ml) cada 12 horas durante 14 dlas, empezando inmediatamente despues de la cirugla de ligadura de la arteria coronaria. Un grupo adicional de ratones recibio una dosis mas baja del Compuesto A (2 mg/kg) para examinar una relation dosis-respuesta. Dos grupos adicionales de ratones recibieron el Compuesto A (4 mg/kg) comenzando 1 hora despues de la cirugla para simular un escenario cllnico de retraso del tratamiento. Un grupo adicional de ratones se trato con 0,13 ml de NaCl al 0,9 % como un control adicional; sin embargo, dado que los datos del tratamiento con vehlculo no fueron significativamente diferentes a los del tratamiento con NaCl, en el presente ejemplo, solo se incluyen los resultados del tratamiento con vehlculo. Para simular un escenario cllnicamente relevante en el que el tratamiento farmacologico puede ocurrir con cierto retraso despues de un IAM, el presente ejemplo comparo el tratamiento con el Compuesto A sin demora con los grupos en los que el antagonista del AdoR de A2B se habla administrado con 1 hora de retraso.

Activacion de la Caspasa-1

Se sacrifico un subconjunto adicional de ratones 72 horas despues de la cirugla (N = 4-6 por grupo de tratamiento). Se extirpo el corazon como se ha descrito anteriormente. Se determino la actividad tisular de la caspasa-1 mediante la escision de un sustrato fluorogenico (CaspACE, Promega, Madison, WI) (Abbate et al. Circulation 2008; 117:267083). Despues de la homogenization usando tampon RIPA (Sigma Aldrich) que contenla un coctel de inhibidores de proteasa (Sigma Aldrich) y la centrifugation a 16.000 rpm durante 20 minutos, se usaron 75 mg de protelna de cada muestra para el ensayo de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se midio la fluorescencia despues de 60 minutos, y se expreso como unidades de fluorescencia arbitrarias producidas por un microgramo de muestra por minuto (fluorescencia/pg/min), y se calculo como las veces de cambio en comparacion con la actividad de la caspasa-1 en los corazones homogenizados de los ratones con operation simulada.

Infiltracion inflamatoria

Para cuantificar la infiltracion inflamatoria en el corazon durante un IAM, el presente ejemplo mide la expresion de CD45 (un marcador de leucocitos) en el corazon usando transferencia Western. Se homogenizaron los corazones extraldos a las 72 h del IAM en tampon RIPA (Sigma Aldrich, St Louis, MO) suplementado con un coctel inhibidor de proteasa (Sigma Aldrich), y se centrifugaron a 16.200 x g durante 20 minutos. Se diluyeron treinta microgramos de cada muestra en tampon de Laemmli, se desnaturalizaron durante 10 minutos a 96 °C y se resolvieron con SDS/PAGE usando un gel de acrilamida al 8 % para permitir la separation de las protelnas. Las protelnas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Tras la saturation con leche al 5 % en solution salina tamponada con fosfato, se incubo la membrana con un anticuerpo anti-raton de rata generado contra CD45 (R&D system, Miniapolis, MN). Para normalizar la carga de protelna, se uso un anticuerpo monoclonal para la b-actina (Sigma Aldrich).

Se usaron el ensayo de aumento de la quimioluminiscencia (ECL) y la autorradiografla para detectar las bandas correspondientes a CD45 y a la b-actina. La intensidad de la banda se determino mediante analisis densitometricos usando el software Scion Image, y los resultados se expresaron como el porcentaje de aumento de la intensidad en comparacion con las muestras de control con simulation.

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Medicion de los niveles de citocinas y moleculas de adhesion solubles circulantes

Se determinaron las concentraciones en plasma de la IL-p y la interleucina-1 (IL-6), factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) y moleculas de adhesion solubles (E-selectina, molecula-1 de adhesion intercelular [ICAM-1] y molecula de adhesion celular vascular [VCAM]), que se inducen mediante la IL-p, el dla 28 despues de la cirugla usando kits Luminex obtenidos en Millipore (Billerica, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se obtuvo una muestra de sangre a traves de una puncion cardiaca directa inmediatamente antes de sacrificar a los animales.

Ecocardiograffa

Se sometieron todos los ratones a una ecocardiografla transtoracica al inicio del estudio (antes de la cirugla), y a los 7, 14 y 28 dlas de la cirugla (antes sacrificarlos). La ecocardiografla se realizo usando el sistema de imagenes Vevo770 (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Canada) con una sonda de 30 MHz. El corazon se visualizo en modo B desde las vistas del eje corto paraesternal y apical. En el presente ejemplo, se midieron las superficies telediastolica y telesistolica del ventrlculo izquierdo (VI) en modo B, y el diametro telediastolico del VI (DTDVI), los diametros telesistolicos del VI (DTSVI), el espesor diastolico de la pared anterior del VI (EDPAVI) y el espesor diastolico de la pared posterior del VI (EDPPVI) en el modo M, como se ha descrito anteriormente (Abbate et al. Circulation 2008; 117:2670-83; Toldo et al. PloS One 2011;6:e18102) y de acuerdo con las recomendaciones de la Sociedad Americana de Ecocardiografla (Gardin et al. J Am Soc Echocardiogr 2002; 15:272-90). Se calcularon el acortamiento fraccional (AF) del VI, la fraccion de eyeccion (FE) del VI, la masa y la excentricidad del VI (relacion DTDVI/EDPPVI) (Abbate et al. Circulation 2008; 117: 2670-83; Toldo et al. PloS One 2011; 6:e18102; Gardin et al. J Am Soc Echocardiogr 2002; 15:272-90). Se registraron los espectros Doppler del tracto de salida transmural y ventricular izquierdo a partir de vistas de 4 camaras apicales, y se calculo el Indice de funcion miocardica (IFM o el Indice de Tei) como la relacion entre el tiempo de contraccion y relajacion isovolumetrica dividida entre el tiempo de eyeccion (Tei et al. Am J Cardiol 1995; 26:357-366). Se calculo el volumen de impulso del ventrlculo izquierdo usando la integral de la curva velocidad-tiempo (VTI) del flujo del tracto de salida del Vi multiplicado por la superficie del tracto de salida del VI, y el gasto cardiaco se calculo multiplicando el volumen de impulso del VI por la frecuencia cardiaca (Abbate et al. Circulation 2008; 117:2670-83; Toldo et al. PloS One 2011 ;6: e18102; Gardin et al. J Am Soc Echocardiogr 2002; 15:272-90). La dilatacion del ventrlculo derecho (VD) se evaluo midiendo la superficie telediastolica del VD en la seccion ventricular media del eje corto paraesternal, y la funcion sistolica del VD se estimo usando el modo M y midiendo el desplazamiento sistolico del plano del anillo tricuspldeo (DSPAT) (Toldo et al. PloS One 2011 ;6: e18102; Gardin et al. J Am Soc Echocardiogr 2002; 15:272-90). El investigador que realizo y leyo el ecocardiograma tuvo ocultacion de la asignacion del tratamiento.

Evaluacion del tamano del infarto

Despues del ecocardiograma de 28 dlas, se sacrificaron todos los ratones con una sobredosis de pentobarbital y/o dislocacion cervical. Se extirparon los corazones y se fijaron en formalina al 10 % durante al menos 48 horas. Se disecciono una seccion transversal de la tercera mediana del corazon, se introdujo en parafina, se corto en cortes de 5 pm, y se tineron con tricromico de Masson (Sigma-Aldrich) (Abbate et al. Circulation 2008; 117:2670-83). Se determinaron las zonas de fibrosis y todo el ventrlculo izquierdo usando morfometrla por ordenador con el software Image Pro Plus 6.0.

Mediciones hemodinamicas

En un subgrupo de ratones (N = 4 por cada grupo) se realizo una puncion en el apice VI 1 hora despues de la cirugla y se inserto un cateter Millar conectado a un transductor de presion para medir la presion sistolica maxima del VI, y la frecuencia cardiaca (Toldo et al. PloS One 2011 ;6: e18102).

Analisis estadfstico

Se analizaron las diferencias entre los grupos usando el ANOVA de una via seguido de la prueba de Bonferroni. Se analizaron los cambios en las mediciones repetidas de los datos ecocardiograficos mediante ANOVA de efectos aleatorios para medidas repetidas, para determinar el efecto principal del tiempo, del grupo y de la interaccion del tiempo por grupo. Se realizo el analisis de supervivencia mediante la generacion de una curva de supervivencia de Kaplan-Meyer y el uso del analisis de regresion loglstica. Los calculos se realizaron usando el paquete informatico SPSS 15.0 para Windows (SPSS, Chicago, IL).

Resultados

El antagonismo hacia el AdoR de A2B no tuvo efectos hemodinamicos durante el infarto agudo de miocardio

Como Ado es un vasodilatador, y para excluir que una diferencia en la remodelacion se debla a los cambios hemodinamicos secundarios al antagonismo hacia el AdoR de A2B, el presente ejemplo midio la presion sistolica maxima ventricular izquierda (PSMVI) y la frecuencia cardiaca (FC) en ratones tratados con antagonista del AdoR de A2B Compuesto A y en los tratados con vehlculo. La PSMVI se redujo significativamente 1 hora despues de la

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ligadura de la arteria coronaria, pero no fue afectada por el tratamiento (Tabla 1).

Tabla 1. Datos brutos y hemodinamicos

Grupo

Simulacion IM con antagonista de AdoR de A2B IM con vehiculo

Edad (semanas)

11 ± 1 12 ± 1 11 ± 1

Peso (g)

32 ± 1 34 ± 1 32 ± 1

PSVI (mm Hg)

99 ± 3 57 ± 9 * 58 ± 8 *

FC (/min)

417 ± 13 428 ± 32 434 ± 18

Los datos hemodinamicos se registraron 1 hora despues de la cirugla.

Abreviaturas: AdoR de A2B = receptor de la adenosina A2b; FC = frecuencia cardiaca; VI = ventrlculo izquierdo; PSMVI = presion sistolica maxima del ventrlculo izquierdo; IM = infarto de miocardio; * P < 0,001 frente a la simulacion.

El antagonismo hacia el AdoR de A2B inhibe la activacion de la caspasa-1 y la inflamacion

La activacion de la caspasa-1 forma parte de un mecanismo proinflamatorio clave en respuesta a la lesion isquemica. El tratamiento con el Compuesto A impidio la activacion de la caspasa-1 en el corazon durante el IAM (FIG. 4). La intensidad de la infiltracion de los leucocitos (CD45+), medida como la expresion de CD45 en la transferencia Western, tambien se redujo significativamente mediante el tratamiento con el Compuesto A 72 horas despues del IAM (FIG. 4). La activacion de la caspasa-1 da lugar al procesamiento y a la liberacion de la IL-p activa que normalmente esta presente a una concentracion tisular muy baja, y amplifica con rapidez la respuesta inflamatoria mediante la induccion de la expresion de citocinas secundarias y moleculas de adhesion. Los niveles de IL-p en plasma fueron indetectables en todos menos en 2 ratones con IAM, mientras que los niveles en plasma de citocinas secundarias, es decir, de IL-6, aumentaron 28 dlas despues de la cirugla en el grupo de IAM (FIG. 5). El tratamiento con el Compuesto A redujo significativamente los niveles en plasma de IL-6, TNF-a, E-selectina, ICAM-1 y VCAM (FIG. 5).

Efectos del antagonismo hacia el AdoR de A2B sobre la supervivencia despues de la cirugla de ligadura de la arteria coronaria

Ninguno de los ratones con operacion simulada murio. La mitad de los ratones tratados con vehlculo (50 %) sobrevivio hasta 28 dlas despues de la cirugla de ligadura de la arteria coronaria (P < 0,001 frente a la simulacion), mientras que el 75 % de los ratones tratados con el Compuesto A estaban vivos (P = 0,14).

Efectos del antagonismo hacia el AdoR de A2B en la remodelacion cardiaca

La remodelacion cardiaca se midio de forma no invasiva mediante ecocardiografla transtoracica. En la FIG. 6, se muestran ejemplos de registros en modo B y modo M. La administracion de Compuesto A cada 12 horas a partir del momento de la cirugla dio lugar a una atenuacion significativa de la dilatacion y de la disfuncion ventricular izquierda y derecha a los 7 dlas, que se mantuvo a los 14 dlas y tambien a los 28 dlas, 14 dlas despues de la administracion de la ultima dosis de farmaco (FIG. 7). A los 28 dlas, la dilatacion del VI despues de un IAM se redujo en aproximadamente un 40 % mediante el Compuesto A. La funcion sistolica del VI tambien fue significativamente superior en el grupo de Compuesto A (diferencia absoluta en la FEVI media del 5 %). La atenuacion de la remodelacion cardiaca fue paralela a la preservacion la funcion diastolica/sistolica miocardica (Indice de funcion miocardica) (FIG. 7A-F). Los corazones de los ratones tratados con el Compuesto A tambien mostraron menor dilatacion y disfuncion del ventrlculo derecho (FIG. 7A-F).

Se sabe que la isquemia miocardica y la lesion celular acompanante provocan la liberacion de los contenidos celulares que desencadenan una respuesta inflamatoria esteril que potencia aun mas la disfuncion y la insuficiencia cardiacas. Este estudio demuestra por primera vez que la inhibition de la union de Ado al AdoR de A2B limita la respuesta inflamatoria y conduce a una remodelacion cardiaca mas favorable.

De hecho, Ado se libera rapidamente durante la hipoxia tisular y la isquemia, y se une rapidamente a los receptores acoplados a la protelna G especlficos omnipresentes (AdoR). Hay 4 subtipos de AdoR, que son: AdoR de A1, principalmente expresado en el corazon, regula la conduction electrica; AdoR de A3, que se expresa en los mastocitos de roedores, y regula la activacion y la desgranulacion en el raton; mientras que el AdoR de A2A y AdoR de A2B se han relacionado con el tono vascular y la inflamacion. AdoR de A2A son AdoR de alta afinidad expresados en la membrana de varios tipos de celulas, incluyendo las celulas endoteliales, los leucocitos y los cardiomiocitos. Los AdoR de A2B son receptores de baja afinidad a veces coexpresados en las mismas celulas que expresan AdoR de A2A, pero en un numero bajo y, por lo tanto, se consideran mlnimamente relevantes para la serialization de Ado en estas celulas, al menos en condiciones no estresadas. Mientras que ambos receptores acoplados a la protelna G AdoR de A2A y AdoR de A2B pueden senalar a traves de la adenil ciclasa, AdoR de A2B tambien senaliza a traves de

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la fosfolipasa C y las protelnas de union a GTP pequenas P21ras, que participan en la senalizacion inflamatoria que implica a la fosfoquinasa activada por el mitogeno p38 (MAPK) y las quinasas reguladas por senales extracelulares (ERK). Es importante destacar que la expresion de AdoR de A2B depende de la estabilizacion del factor-a inducible por la hipoxia (HIF-a) y que, por lo tanto, es muy sensible a la hipoxia y la inflamacion.

Por lo tanto, aunque en condiciones no estresadas, la senalizacion de Ado a traves de AdoR de A2B probablemente no es significativa, en el contexto de la lesion tisular, el AdoR de A2B puede desempenar un papel importante.

El presente ejemplo muestra que el bloqueo selectivo de AdoR de A2B usando el Compuesto A suavizo la respuesta inflamatoria durante el infarto como se refleja por una reduccion casi completa de la actividad de la caspasa-1, y una reduccion significativa de la infiltracion de celulas inflamatorias temprano en el curso del IAM, y una reduccion significativa de las citocinas y de las moleculas de adhesion en plasma 28 dlas despues del IAM. La caspasa-1 es el componente enzimaticamente activo de la inflamasoma, una estructura macromolecular que funciona como un sensor del "peligro" y que participa en el procesamiento de la IL-1 p madura y en la muerte celular. La formacion de la inflamasoma y la activacion de la caspasa-1 en el corazon conducen a la insuficiencia cardiaca. La reduccion significativa en la actividad de la caspasa-1 en el corazon con el bloqueo selectivo de AdoR de A2B coincide con la senalizacion proinflamatoria de AdoR de A2B. El papel de AdoR de A2B en la isquemia miocardica es, sin embargo, controvertido. En los modelos de lesion miocardica aguda debida a la isquemia/reperfusion, Ado reproduce sistematicamente los efectos beneficiosos del preacondicionamiento isquemico. Los efectos similares al preacondicionamiento de Ado se eliminan cuando se interrumpe la senalizacion a traves de AdoR de A2B. Sin embargo, el bloqueo de AdoR de A2B en ausencia de preacondicionamiento isquemico no tuvo efectos sobre el corazon en dichos modelos. Esto sugiere que, aunque pueda mediar en algunos aspectos del preacondicionamiento, la senalizacion de AdoR de A2B no es inherentemente protectora, y es poco probable que sea el unico mediador del preacondicionamiento.

En el modelo de raton actual de infarto de miocardio sin reperfusion de gran tamano, el antagonismo hacia AdoR de A2B limito significativamente la dilatacion y la disfuncion sistolica y diastolica del ventrlculo izquierdo. Los efectos protectores de AdoR de A2B fueron independientes de un efecto sobre el tamano del infarto. Esto demuestra que, en el infarto de miocardio sin reperfusion en la rata, la adenosina no tiene efectos sobre el tamano del infarto.

En este modelo de infarto de miocardio sin reperfusion, la remodelacion cardiaca es global, y afecta al infarto y a las zonas limltrofes, as! como al ventrlculo izquierdo lejano no afectado y al ventrlculo derecho. El bloqueo de AdoR de A2B no parecio tener ningun efecto sobre el tamano del infarto, mientras que el bloqueo de AdoR de A2B parecio proteger la zona limltrofe y el miocardio alejado, como lo demuestra una mejora en las dimensiones de tanto el ventrlculo izquierdo como el ventrlculo derecho, y, lo que es mas importante, en la funcion del VI.

El hallazgo de la reduccion de la actividad de la caspasa-1 en el corazon y la remodelacion cardiaca mas favorable confirma el papel central de la caspasa-1 en la respuesta del miocardio a la isquemia miocardica. La sobreexpresion de la caspasa-1 en el corazon del raton conduce a mayores superficies de dano isquemico, a la dilatacion cardiaca mas grave y a una reduccion de la supervivencia despues de un IAM; mientras que los ratones deficientes en caspasa-1 quedan protegidos tras un IAM.

Estos datos sugieren que, en la curacion del infarto tras una isquemia miocardica, el AdoR de A2B tiene un importante papel proinflamatorio y perjudicial.

En conclusion, el bloqueo selectivo del AdoR de A2B con el Compuesto A administrado tras el inicio de la isquemia reduce la actividad de la caspasa-1 en el corazon y conduce a una remodelacion cardiaca mas favorable tras un IAM en un modelo de raton de infarto de miocardio sin reperfusion.

Ejemplo 5: Efecto del Compuesto A en un modelo de raton de infarto de miocardio

Se administro el antagonista de A2B, el Compuesto A (3 mg/kg/dla o 10 mg/kg/dla), a ratones de modelo ob/ob de 6 semanas de vida durante 28 dlas. Al final de la dosificacion de 28 dlas, se midio la expresion de una serie de biomarcadores inflamatorios, MCP-1, IL-1b, IL-2 e IL-6 en estos ratones en comparacion con el control (vehlculo).

Como se muestra en la FIG. 8A-D, la expresion de los cuatro biomarcadores inflamatorios se redujo, y para dos de los cuales, MCP-1 e IL-1b, la reduccion para el grupo de 10 mg/kg/dla fue estadlsticamente significativa. Estos datos demuestran que el antagonista de A2B, el Compuesto A, inhibe la inflamacion en los animales tratados.

Tambien se determino el efecto del Compuesto A en un modelo de raton de infarto de miocardio. Se sometieron ratones macho a ligadura de la arteria coronaria permanente o a cirugla simulada. Se administro el Compuesto A (4 mg/kg) por via i.p. dos veces al dla comenzando de inmediato o 1 hora despues de la cirugla, y se siguio durante 14 dlas. Se realizo un ECO transtoracico para medir el diametro telediastolico/telesitolico del VI (DTDVI o DTSVI), la superficie telediastolica del VI (STDVI) y el Indice de funcion miocardica (IFM) antes de la cirugla y despues de 7, 14 y 28 dlas. El analisis de los biomarcadores de inflamacion y lesion tisulares se realizo en los 28 dlas despues del IM.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Todos los ratones con operacion simulada estaban vivos a las 4 semanas. El 42 % de los ratones tratados con vehlculo con IM fallecieron durante las 4 semanas. Por el contrario, la tasa de mortalidad de los ratones tratados con el Compuesto A con IM solo fue del 25 %.

Los ratones con IM desarrollaron la remodelacion tisular adversa y el deterioro de la funcion miocardica como se demuestra por los aumentos significativos del DTDVI y DTSVI, de la STDVD y del IFM en comparacion con los de los ratones simulados (FIG. 9A-D). El tratamiento con el Compuesto A de inmediato o 1 h despues de la cirugla redujo significativamente las dimensiones del VI/VD y redujo el IFM, lo que sugiere que el Compuesto A inhibio la remodelacion del miocardio adversa y mejoro la funcion miocardica en ratones con IM. El Compuesto A no tuvo ningun efecto sobre la remodelacion/funcion miocardica en ratones con simulacion.

Se analizaron los biomarcadores en plasma de la inflamacion y la lesion miocardica el dla 28 despues del IM. Las concentraciones en plasma de IL-6, TNF-a y ST2 aumentaron significativamente en los ratones con IM en comparacion con ratones con operacion simulada. El tratamiento con el Compuesto A inmediatamente despues de la cirugla redujo significativamente las concentraciones de todos los biomarcadores en plasma en ratones con IM (FIG. 10A-C). El Compuesto A no tuvo ningun efecto sobre los biomarcadores en plasma en los ratones con operacion simulada. Las moleculas solubles de adhesion celular (CAM), tales como sE-selectina, sICAM y sVCAM, son importantes biomarcadores en circulacion para los procesos inflamatorios en las enfermedades cardiovasculares. El tratamiento con el Compuesto A inhibio significativamente el aumento de los niveles en plasma de las moleculas de adhesion celular solubles en los ratones con IM (FIG. 11A-C).

En resumen, estos resultados indican que el tratamiento con el Compuesto A mejora significativamente la funcion miocardica, reduce los biomarcadores inflamatorios en circulacion y, por lo tanto, reduce la mortalidad en el modelo de raton de remodelacion tras un IM.

Ejemplo 6: Evaluacion precifnica de Compuesto A

El presente ejemplo incluye varios experimentos precllnicos que muestran la eficacia del Compuesto A en el cuidado de los animales tras un infarto de miocardio (IM).

Modelo de rata de remodelacion tras un infarto de miocardio (IM) y taquicardia ventricular (TV).

Se determinaron los efectos del Compuesto A en un modelo de rata de remodelacion tras un IM y VT. Se provoco el IM mediante la oclusion durante 25 minutos en la ligadura coronaria descendente anterior izquierda seguida de reperfusion. Una semana mas tarde, las ratas recibieron vehlculo o Compuesto A (100 mg/kg) una vez al dla mediante alimentacion por sonda oral. Se obtuvieron ecocardiogramas (ECO) en serie para medir la fraccion de eyeccion del ventrlculo izquierdo (FEVI), el volumen de impulso y el volumen telesistolico del VI (VTSVI) al inicio del estudio, 1 semana y 5 semanas despues del IM. Se realizaron estudios electrofisiologicos, cartografla optica, histologla y analisis de biomarcadores a las 5 semanas del IM.

Los ECO obtenidos al inicio, 1 semana y 5 semanas despues de un IM mostraron evidencias de remodelacion progresiva del VI incluyendo una reduccion significativa de la fraccion de eyeccion del VI y el volumen de impulso, y un aumento significativo del volumen telesistolico del VI en las ratas con IM. En este modelo, se ha observado la reduccion adicional de la FEVI de manera sistematica entre 1 semana y 5 semanas despues del IM. Por consiguiente, en el estudio actual, la FEVI se reduce de 56,0 ± 2,1 % en 1 semana despues del IM a 40,7 ± 2,2 % a las 5 semanas del IM. Por el contrario, en los animales tratados con el Compuesto A, la FEVI aumento ligeramente de 53,1 ± 3,2 % a 55,6 ± 2,6 % (FIG. 12B). Ademas, el Compuesto A redujo significativamente el aumento del VTSVI (FIG. 12A). Todos estos resultados sugieren que el Compuesto A mejoro significativamente la funcion cardiaca y la remodelacion tras el IM en la rata. Por el contrario, la pirfenidona, que no es un antagonista de A2B, pero que ha demostrado ser capaz de mitigar la fibrosis ventricular izquierda, no aumento el VTSVI, sino que solo inhibio ligeramente su reduccion posterior (FIG. 12B).

La taquicardia ventricular (TV) es una causa frecuente de mortalidad en los pacientes que han sufrido un infarto, incluso con el tratamiento de revascularizacion coronaria actual. En este modelo de rata de remodelacion posterior al IM, la TV fue inducible de manera sistematica en mas de la mitad de los animales. Por lo tanto, se determino el efecto del Compuesto A en la induccion de la TV a las 5 semanas del IM. Como se muestra en la Tabla 3, la tasa de induccion de la TV fue del 54 % (6 de 11) en los controles de vehlculo, mientras que el Compuesto A redujo de manera significativa la induccion de la TV al 9 % (1 de 11).

Tabla 3. Capacidad de induccion de la TV en modelo de rata de remodelacion tras un IM

N total TV Sin TV % de TV

Placebo

11 6 5 54 %

Compuesto A

11 1 10 9 %

*, p < 0,05 en comparacion con el control de vehlculo usando la prueba de ji-cuadrado

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La conduccion del impulso electrico anormal en la zona limltrofe del infarto (ZLI) es importante en la patogenesis de las arritmias posteriores a un IM. Como se muestra en los mapas de vectores de conduccion (FIG. 13A-B), el grupo de control de vehlculo tiene una velocidad de conduccion mucho menor que los animales tratados con el Compuesto A. Para cuantificar el impacto del Compuesto A en las propiedades de conduccion, se midieron las velocidades de conduccion (VC) para las zonas infartadas, limltrofes y normales del miocardio del VI. Las VC en las zonas normales fueron superiores entre todas las zonas y fueron similares entre los grupos de placebo y de Compuesto A (FIG. 14A). Por otra parte, las VC de las zonas infartadas del grupo de control con placebo fueron inferiores entre todas las zonas, y se mejoraron significativamente con el Compuesto A (FIG. 14C). Por ultimo, las VC en las ZLI de ambos grupos resultaron estar entre las de las zonas no infartadas y las zonas infartadas. Sin embargo, las VC en las ZLI del grupo de Compuesto A fueron significativamente superiores a las de las ZLI del control de placebo (FIG. 14B).

La conduccion anormal en la ZLI se debe a la remodelacion tisular. La fibrosis excesiva en la ZLI es un importante sustrato para la vulnerabilidad a la TV. Como se muestra en la FIG. 15A-B, el analisis de las ZLI del control de vehlculo revelo mas proyecciones heterogeneas, en parches, de fibrosis desde las zonas infartadas a las ZLI. Estas proyecciones fibroticas son menores en las ZLI del grupo tratado con el Compuesto A, lo que sugiere que el Compuesto A inhibio la fibrosis en la ZLI asociada con la mejora de la velocidad de conduccion, lo que puede explicar la notable reduccion de la capacidad de induction de la Tv.

Los biomarcadores de inflamacion (IL-6) y de lesion tisular (BNP y (PAI-1) en plasma se analizaron a las 5 semanas del IM. Las concentraciones de IL-6 y pAI-1 en plasma aumentaron significativamente en las ratas despues del IM en comparacion con las ratas normales. El tratamiento con el Compuesto A redujo significativamente todos estos biomarcadores en plasma en ratas despues del IM. Ademas, hubo una tendencia del Compuesto A a inhibir el aumento de BNP (P = 0,16) en ratas despues del IM. (FIG. 16A-C)

Ademas, el presente ejemplo uso un plan de tratamiento cllnicamente relevante en el que el farmaco se administro despues de la terapia de reperfusion y una vez establecida la disfuncion del VI. Por otra parte, los efectos del tratamiento se midieron usando criterios de valoracion cllnicamente relevantes tales como el volumen telesistolico del ventrlculo izquierdo y la FEVI.

Los resultados del estudio del modelo de rata de remodelacion despues de un IM indican que el tratamiento con el Compuesto A mejora significativamente la funcion miocardica y reduce la vulnerabilidad a la TV. Esto probablemente se debe a la reduccion de los mediadores inflamatorios y a la inhibition de la fibrosis en la zona limltrofe del miocardio isquemico.

Ejemplo comparative 7: Otros antagonistas del receptor de la adenosina A2B

El presente ejemplo usa miocitos cardiacos humanos para ensayar otros dos antagonistas del receptor de la adenosina A2B sobre su efecto sobre la liberation de IL-6 inducida por NECA.

Se trataron miocitos cardiacos humanos (HCM) solo con NECA, o en combination con el Compuesto A, el Compuesto B (N-[5-(1-ciclopropil-2,6-dioxo-3-propil-2,3,6,7-tetrahidro-1H-purin-8-il)-piridin-2-il]-N-etil-nicotinamida, tambien conocido como ATL-801) o el Compuesto C (2-(4-benciloxi-fenil)-N-[5-(2,6-dioxo-1,3-dipropil-2,3,6,7- tetrahidro-1H-purin-8-il)-1-metil-1H-pirazol-3-il]acetamida). Como se muestra en la FIG. 17, la NECA aumento significativamente la liberacion de IL-6 desde los miocitos cardiacos humano (HCM). Sin embargo, el efecto de la NECA en los HCM fue inhibido por completo por cada uno de los antagonistas de AdoR de A2B ensayados, el Compuesto A, B y C.

El presente ejemplo, por lo tanto, demuestra que estos otros antagonistas de AdoR de A2B tienen la capacidad de inhibir la liberacion de IL-6 inducida por NECA desde miocitos cardiacos humanos.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto que tiene la formula quimica:

   imagen1

   o una sal farmaceuticamente aceptable, para su uso en la reduccion de una arritmia en un paciente humano que ha sufrido un infarto de miocardio (IM).
2. 2. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el IM es IM agudo.
3. 3. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el IM es IM con elevacion de ST (IMEST) o IM sin elevacion de ST (IMSEST).
4. 4. El compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el paciente esta hemodinamicamente estable.
5. 5. El compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el uso comprende la administracion del compuesto al paciente, y la administracion comienza durante el IM o inmediatamente despues del IM.
6. 6. El compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el uso comprende la administracion del compuesto al paciente, y la administracion comienza tras al menos aproximadamente 24 horas del IM.
7. 7. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde la administracion del compuesto comienza tras al menos aproximadamente 3 dlas del IM.
8. 8. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde la administracion del compuesto comienza tras al menos aproximadamente 5 dlas del IM.
9. 9. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde la administracion del compuesto comienza tras al menos aproximadamente 7 dlas del IM.
10. 10. El compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el uso comprende ademas la administracion al paciente de un inhibidor de la enzima conversora de la angiotensina (ACE).
11. 11. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde el inhibidor de la ACE se selecciona del grupo que consiste en captopril, enalapril, lisinopril, perindopril y ramipril.
12. 12. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en donde el compuesto se administra al paciente por una via seleccionada entre la administracion sistemica, oral, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, o la administracion por inhalacion.