CN103582481A - A2b腺苷受体拮抗剂用于治疗心肌梗塞后患者的心力衰竭及心律不齐的用途 - Google Patents
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Abstract
提供了改善心肌梗塞(MI)后患者的心脏病症并减少由于心力衰竭或心律不齐造成的心血管死亡和住院的方法,该方法通过给予治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂进行。
Description
相关申请的相互引用
本申请要求在35U.S.C.§119(e)下于2011年4月7日提交的美国临时申请序列号61/473,110、2011年6月7日提交的序列号61/494,222、2011年12月21日提交的序列号61/578,728以及2012年3月30日提交的序列号61/618的权益,其中每一个的全部内容通过引用结合于本公开。
技术领域
本公开涉及改善心肌梗塞(MI)后患者的心脏功能的方法,并且涉及减少由于心力衰竭或心律不齐造成的心血管死亡和住院(住院治疗,hospitalization),该方法包括给予治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
背景技术
急性心肌梗塞(AMI)的特征在于在严重炎症反应之后心肌的缺血性坏死。心肌活力初始减少的程度和炎症反应的强度是相继发生的以心脏增大及机能障碍为特征的心脏重塑的两个独立预测因子。
心肌损伤可以诱发导致心律不齐及心力衰竭的心脏纤维化。每年大约200,000人罹患急性STEMI(ST抬高心肌梗塞),急性STEMI具有一年内约20%的死亡率。在2011年,约有760万心肌梗塞后患者,并且估计他们中10-70%在5年内发展成心力衰竭。
然而,并非所有心肌梗塞(MI)后的心脏纤维化都是有害的。例如,AMI之后,梗塞区的组织立即进行具有瘢痕形成的坏死区的代偿性纤维化修复。在没有适当的纤维化修复及瘢痕的情况下,心脏可能破裂,这可能是致命的。
相反,在适应不良阶段的病理性LV重塑可能导致心力衰竭和心律不齐。因此,在没有准确定时和定位的情况下,盲目地抑制心脏纤维化将不会在修复心脏功能方面产生效果,也不会减少MI后患者的死亡。相反地,这种治疗可能造成严重的不利事件。
间质性纤维化阻止心肌细胞的正常偶联,并产生心律不齐的基质(substrate),这可能导致心脏性猝死。
心脏纤维化已与导致各种心脏病的心力衰竭过程相关,这些心脏病包括与体积和压力超负荷两者相关的那些(Weber et al.,Circ.,83:1849-1865(1991);Schaper et al.,Basic Res.Cardiol.,87:S1303-S1309(1992);Boluyt etal.,Circ.Res.,75:23-32(1994);以及Bishop et al.,J.Mol.Cell Cardiol.,22:1157-1165(1990))。在心力衰竭的情况下,纤维化包括成纤维细胞数量和基质沉积两者的增加(Cardiovasc.Res.,30:537-543(1995)),这表明在该病症发展的过程中成纤维细胞的重要性。
腺苷(Ado)是响应于组织损伤而释放的普遍存在的小分子,其通过与细胞表面膜受体的四种类型中的一种相互作用促进充血和调节炎症。在一些炎症模型中,对A2B AdoR的阻断已限制了炎症反应的强度并改善了康复,然而在其它模型中,A2B AdoR信号产生显示抑制炎症。因此,不能笼统地概括A2B AdoR的作用。
发明内容
本公开涉及以下出乎意料的和未预期的发现:A2B腺苷受体拮抗剂抑制病理性左心室(LV)重塑,并增加LV的射血分数。在心肌梗塞(MI)后的患者中,抑制LV重塑可以理解为LV功能改善和心律不齐的发病率的降低,这进而可以减少心血管(CV)死亡和住院。
也已发现A2B腺苷受体(AdoR)是在人类心脏成纤维细胞(HCF)中表达的AdoR的主要亚型,并且激活此受体增加IL-6的释放和胶原蛋白的产生、纤维化标记物的表达、以及心血管病的生物标记物(CVD)的释放。尤其是,已发现A2B腺苷受体拮抗剂可以完全消除这种激活,由此减少心脏病中的纤维化响应,致使对LV增大的抑制以及增加的LV射血分数。
根据以上所述以及在其方法中的一方面,本公开涉及一种减少心力衰竭的发展和/或减少已患有心肌梗塞(MI)的患者的心律不齐和/或心脏性猝死的发病率的方法,包括给予患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。在一些实施方式中,通过治疗心力衰竭或心律不齐减少死亡或住院。
另一个实施方式提供了一种在已患有心肌梗塞(MI)的患者中限制心力衰竭的发展、减少或治疗心力衰竭的方法,包括给予患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
另一个实施方式提供了一种在已患有心肌梗塞(MI)的患者中减少心律不齐的发病率的方法,包括给予患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
另一个实施方式提供了一种在已患有心肌梗塞(MI)的患者中减少心脏性猝死的发病率的方法,包括给予患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
另一个实施方式提供了一种在已患有心肌梗塞(MI)的患者中增加左心室射血分数(LVEF)的方法,包括给予患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
另一个实施方式提供了一种在已患有心肌梗塞(MI)的患者中抑制左心室增大的方法,包括给予患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
另一个实施方式提供了一种在已患有心肌梗塞(MI)的患者中减少左心室收缩末期容量的方法,包括给予患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
另一个实施方式提供了一种在已患有心肌梗塞(MI)的患者中减少左心室舒张期末容量的方法,包括给予患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
另一个实施方式提供了一种在已患有心肌梗塞(MI)的患者中改善左心室机能障碍的方法,包括给予患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
另一个实施方式提供了一种在已患有心肌梗塞(MI)的患者中改善心肌收缩的方法,包括给予患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
另一个实施方式提供了一种在已患有心肌梗塞(MI)的患者中减少由心脏细胞释放IL-6、TNF 、ST2(致瘤性2的抑制)或BNP的方法,包括给予患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
在一个实施方式中,该A2B腺苷受体拮抗剂是8-环黄嘌呤衍生物。在另一个实施方式中,该A2B腺苷受体拮抗剂是式I或式II的化合物或者它们的药用盐、互变异构体、异构体、异构体的混合物或前药:
其中:
R1和R2独立地选自氢、可选地取代的烷基、或基团-D-E,其中,D是共价键或亚烷基,且E是可选地取代的烷氧基、可选地取代的环烷基、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环基、可选地取代的烯基、或者可选地取代的炔基;
R3是氢、可选地取代的烷基、或者可选地取代的环烷基;
X是可选地取代的亚芳基或者可选地取代的杂亚芳基;
Y是共价键或者其中一个碳原子可以被-O-、-S-或-NH-可选地替代的亚烷基,并且Y可选地被羟基、烷氧基、可选地取代的氨基、或-COR取代,其中R是羟基、烷氧基、或氨基;
Z是可选地取代的单环芳基或者可选地取代的单环杂芳基;或者
在X是可选地取代的杂亚芳基且Y是共价键时,Z是氢。
在特定的方面中,该A2B腺苷受体拮抗剂是N-(6-氨基-1-乙基-2,4-二氧代-3-丙基-1,2,3,4-四氢-嘧啶-5-基)-1-(3-(三氟甲基)苯甲基)-1H-吡唑-4-甲酰胺,本文称为化合物A,具有以下化学式:
或者其药用盐、互变异构体、异构体、异构体的混合物或前药。在一些方面中,如在本文的进一步描述,该A2B腺苷受体拮抗剂是化合物B或者化合物C。
附图说明
图1A-D示出了通过选择性A2B AdoR拮抗剂,即化合物A(Comp A)完全消除NECA对于IL-6、胶原蛋白、ST-2和PAPPA释放的影响以及对于α-平滑肌肌动蛋白(SMAa)和α-前胶原蛋白(Col1A1)表达的影响。
图2示出了在小鼠中,与载体(vehicle)相比,使用化合物A(CompA)的治疗显著降低半胱天冬酶-1(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1,caspase-1)活性(左图)、减少舒张末期直径(左中图)、增加LV射血分数(右中图)、以及减少心肌功能指数(右图)。
图3是用于实施例4的研究的时间轴。
图4示出了在冠状动脉结扎之后(每日两次4mg/kg i.p.)立即给予A2B AdoR拮抗剂,即化合物A(Comp A)防止在手术后72小时测量的心脏组织中半胱天冬酶-1激活,并显著抑制心脏中白细胞(CD45+)补充(recruitment)。*P<0.001对比假手术(sham);#P<0.01对比载体。N=4至6每组。
图5包括示出使用A2B AdoR拮抗剂(化合物A)治疗致使与AMI相关的炎症标记物的血浆水平显著降低的图表。在手术后的第28天使用Luminex测量IL-6、TNF-α、sE-选择蛋白、sICAM及sVCAM的血浆浓度。╋P<0.05对比载体;*P<0.001对比载体。
图6示出了来自用载体(上图)治疗的小鼠和一只用A2B AdoR拮抗剂(化合物A)(下图)治疗的小鼠在急性心肌梗塞手术之后2周的示例性B模式和M模式超声心电图。
图7A-F示出了在冠状动脉结扎手术后,经载体治疗的小鼠的左心室和右心室的显著增大(左心室舒张末期直径(LVEDD)(A)、左心室收缩末期直径(LVESD)(B)、和右心室舒张末期面积RVEDA)(E))以及左心室和右心室功能的显著降低(左心室射血分数(LVEF)(C)、心肌功能指数(MPI)(D)、和三尖瓣环平面收缩期运动(tricuspidal annular planesystolic exercusion,TAPSE))(F))。使用A2B AdoR拮抗剂(化合物A)治疗(每天两次4mg i.P.)显著限制心脏增大和机能障碍。*P<0.001对比基线(或者假手术),╋P<0.001对比载体。
图8A-D示出了通过使用化合物A治疗降低了四种炎症生物标记物,即MCP-1、IL-1b、IL-2及IL-6的表达,对于它们中的两种—MCP-1和IL-1b,在10mg/kg/天的组中该降低具有统计显著性。
图9A-D示出了在第28天使用ECHO6测量的LVEDD(A)、LVESD(B)、RVEDA(C)和MPI(D)。数值以平均值±SEM来表示。n=4至9。*与假手术对照相比,P<0.05;#与MI相比,p<0.05。在邦弗兰尼(Bonferroni)测试后使用ANOVA确定统计。这些图证明了化合物A抑制不利的MI后心肌重塑并改善心肌功能。
图10A-C示出了ST2(A)、IL-6(B)和TNF-a(C)的血浆水平,并且数值以平均值±SEM来表示。n=4至8。*与假手术对照相比,P<0.05;#与MI相比,p<0.05。在邦弗兰尼测试后使用ANOVA确定统计。这些图表明在MI后心肌重塑的小鼠模型中化合物A减少血浆炎症细胞因子生物标记物。
图11A-C示出了sE-选择蛋白(A)、sICAM(B)及sVCAM(C)的血浆水平。数值以平均值±SEM来表示。n=4。*与假手术对照相比,P<0.05;#与MI相比,p<0.05。在邦弗兰尼测试之后使用ANOVA确定统计。这些图表明在MI后心肌重塑的小鼠模型中化合物A降低可溶性粘附分子的血浆水平。
图12A-B包括示出化合物A减少左心室收缩末期容量(A)以及增加左心室射血分数(B)的图表。在MI后的基线、第1周和第5周使用ECHO测量在MI和MI+化合物A组中的(A)左心室收缩末期容量(LVESV)。数值以平均值±SEM来表示。n=13。*在邦弗兰尼测试之后使用ANOVA与载体对照相比,P<0.05。在MI后的基线、第1周和第5周使用ECHO测量在载体对照(MI)和化合物A组(MI+化合物A)中的(B)LVEF。使用式(LVEDV-LVESV)/LVEDV×100计算LVEF。数值以平均值±SEM来表示。n=13。*在邦弗兰尼测试之后使用ANOVA与载体对照相比,P<0.05。
图13A-B是LV前壁的传导矢量图,其示出了与化合物A样品(B)相比在载体对照(A)中在指定的MI区附近传导速度小箭头更显著。
图14A-C示出了化合物A提高在梗塞区和梗塞边界区(IBZ)中的传导速度。在不同的起搏周期长度下,在安慰剂对照和经化合物A治疗的MI大鼠中正常区(A)、边界区(B)及梗塞区(C)的CV。*与安慰剂对照相比,p<0.05。
图15A-B是对使用固绿复染剂(浅灰)的纤维化使用天狼星红(以暗灰色示出)染色的IBZ的高倍显微(100×)图像。对于载体对照(A),纤维化以指状分布从梗塞区延伸到边界区,但是对于化合物A样品(B)程度较低。这些图像表明化合物A减少IBZ中的纤维化。
图16A-C示出了在MI后的第5周使用Luminex测量的IL-6(A)、PAI-1(B)、和BNP(C)的血浆水平。数值以平均值±SEM来表示。n=4-8。*与正常对照相比,P<0.05;#与MI相比,p<0.05。在邦弗兰尼测试之后使用ANOVA确定统计,这些图表明在MI后心肌重塑的大鼠模型中化合物A减少血浆生物标记物。
图17是示出在指定的剂量下,利用与化合物A、化合物B或者化合物C一起使用的NECA治疗人类心肌细胞的IL-6释放的图。
图18示出了提出的机制,通过该机制化合物A抑制病理性MI后LV重塑并改善心脏功能。
具体实施方式
在更详细地描述本公开之前,首先将定义以下术语。
应当理解的是,本发明不限于所描述的具体实施方式,因此自然可以变化。同时,应理解在本文使用的术语仅为了描述具体实施方式,而不意图限制,因为本公开的范围将仅由所附的权利要求限制。
应注意,如在本文及所附权利要求中使用的,单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数概念,除非上下文清楚地另外指明。
1、定义
除非另外定义,否则在本文使用的所有技术和/或科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。如在本文中所使用的,以下术语具有以下含义。
如在本文中使用的,术语“包括”或“包含”意指包括所述要素的组合物和方法,而不排除其它。当“基本由...组成”用于限定组合物和方法时,其应意指排除对于所述目的的组合具有任何本质重要性的其它要素。因此,如本文中定义的基本由该要素组成的组合物将不排除不实质上影响要求保护的公开的基本特征和新特征的其它材料或步骤。“由...组成”应意指排除其它成分和基本方法步骤的微量要素。由每个这些连接术语限定的实施方式在本发明的范围内。
当在诸如温度、时间、量和浓度的指定数字(包括范围)之前使用术语“约”时,其表示可以改变(+)或(-)10%、5%或1%的近似值。
术语“治疗”意指患者中疾病的任何治疗,包括:(i)预防疾病,即,使临床症状不发展;(ii)抑制疾病,即,延缓临床症状的发展;和/或(iii)减轻疾病,即,促使临床症状减少。仅举例来说,治疗可以包括改善右心室的功能和/或减轻症状,包括,但不限于,劳力性呼吸困难、疲劳、胸痛、以及它们的组合。
如本文所使用的,当参考病理疾病的严重性使用术语“改善”时,其意指与该疾病有关的体征或者症状减轻或者受试者的病状的改善。待监测的体征或症状将以特定的病理病状为特征,并且将是临床医生所熟知的,对于监测体征及病状的方法同样如此。
术语“患者”通常是指哺乳动物,如,例如,人类。
如上所定义的,术语“治疗有效量”是指当给予需要此种治疗的患者时足以影响治疗的化合物(如A2B腺苷受体拮抗剂)的量。治疗有效量将根据使用的试剂的具体活性或递送途径、患者病状的严重性、以及患者的年龄、身体状况、其它病状的存在和营养状况改变。另外,患者可能正接受的其它药物将影响待给予的治疗剂的治疗有效量的确定。
如本文中所使用的,“药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和药剂用于药物活性物质在本领域是公知的。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容,否则设想其用于治疗组合物。增补活性成分也可以加入(并入)到组合物中。
2、方法
如上所述,本公开涉及在已患有心肌梗塞(MI)的患者中治疗心力衰竭和/或心律不齐的方法。在一个实施方式中,本文描述的方法可以通过治疗心力衰竭或心律不齐减少患者的死亡或住院。而且,这种方法实现心肌梗塞(MI)后患者的心脏病状的改善。该方法需要给予需要其的患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
本文已发现A2B腺苷受体(AdoR)是在人类心脏成纤维细胞(HCF)中表达的AdoR的主要亚型,并且激活该受体增加IL-6的释放和胶原蛋白的产生、纤维化标记物的释放、和心血管病的生物标记物(CVD)的释放。
此外,N-乙基甲酰胺腺苷(NECA),一种腺苷的稳定类似物,以浓度依赖的方式显著增加IL-6的释放。此外,NECA增加α-平滑肌肌动蛋白和α-1前胶原蛋白的表达,增加由HCF生成胶原蛋白,并且增加CVD的两种新型生物标记物可溶ST-2和PAPPA(与妊娠相关的血浆蛋白A)的释放。然而,NECA对HCF的影响通过A2B AdoR拮抗剂完全消除(实施例2)。
在生理学水平上,腺苷水平在缺血性心肌中升高。随后,增加的腺苷水平激活巨噬细胞、心肌细胞和心脏成纤维细胞上的A2B受体,导致有利于左心室机能障碍的炎性和纤维化介导物(mediator)的释放。A2B AdoR拮抗剂抑制这种激活的能力,进而可以致使对这种炎性及纤维化介导物的释放的抑制。同样,A2B AdoR拮抗剂可以抑制受损的心脏组织中的巨噬细胞活化。总之,本公开的A2B腺苷受体拮抗剂示出能够减少心脏病中的纤维化响应,致使左心室功能改善。
与这些机制发现(mechanistic finding)相一致,在大鼠和小鼠ST抬高心肌梗塞(STEMI)模型中,现已观察到A2B腺苷受体拮抗剂抑制左心室(LV)增大(以减小的LV收缩末期容量及舒张末期容量增大示出)并增加LV射血分数。因为对LV增大的抑制致使LV功能的改善以及对梗塞边界区(IBZ)的纤维化的抑制,致使更少的心律不齐,所以A2B腺苷受体拮抗剂可以减少由于心力衰竭或心律不齐导致的心血管死亡和住院。在这方面,设想了间质性纤维化生成心律不齐的基质。通过降低间质性纤维化,因此,A2B腺苷受体拮抗剂可以减少心律不齐及心脏性猝死的发病率。
这些发现未预期的方面是在梗塞区中A2B腺苷受体拮抗剂的活性不影响MI后代偿性纤维化响应。如图18中所示,在心肌梗塞的急性期(例如,STEMI)的过程中,梗塞区的细胞坏死。在急性期之后(例如,在MI之后约1周),梗塞区变薄并伸长以补偿由来自坏死细胞的纤维瘢痕造成的损失。这种代偿机理(也称为LV扩大)有益于维持LV的功能。
然而,进一步地,在适应不良阶段LV的增大可能导致心力衰竭和心律不齐。在这方面,在此阶段LV增大出现在梗塞区的外部区域,这导致球形心室扩大。进一步,增大的LV导致以减小的射血分数为特征的LV机能障碍。
出乎意料地,本公开的A2B腺苷受体拮抗剂具体地抑制在梗塞区外部的心脏组织中炎性及纤维化介导物的释放,这减少炎症和纤维化引发的组织损伤,并提高射血分数及改善LV功能。因此,与关于腺苷的心脏保护功能的常规认知相反,本公开的实验数据证明在MI后心脏的保护和复原中利用A2B腺苷受体拮抗剂对腺苷活性的抑制的疗效。
因此,当用于MI后的患者时,即使在代偿性心脏纤维化结束之前,也可以将A2B腺苷受体拮抗剂给予患者,这不会引起抑制这种代偿性响应的风险。而且,设想在接受该治疗时MI后患者是血液动力学稳定的。进一步地,设想了可以早在MI的过程中或MI之后立即给予拮抗剂。
同样出乎意料的是A2B腺苷受体拮抗剂的疗效的程度。例如,当与其它抗纤维化药物(如,仅减缓LVEF减低的吡非尼酮)相比时,本公开的A2B腺苷受体拮抗剂能够终止甚至逆转这种降低(实施例6和图12B)。
而且,对于包括化合物A、化合物B(以下定义)、和化合物C(以下定义)的多种化合物都观察到A2B腺苷受体拮抗剂的这种影响,这证明总的来说A2B腺苷受体拮抗剂具有这种治疗能力。这进一步在实施例7中示出。除了体内和临床研究,在本文使用的试验可以进一步针对它们用于临床用途的适用性确定这些或其它A2B腺苷受体拮抗剂的选择性和PK曲线。
因此,本公开提供了用于在心肌梗塞(MI)后的患者中治疗心力衰竭和/或心律不齐的方法。设想了通过治疗心力衰竭和/或心律不齐减少心血管死亡和住院。还提供了用于降低心力衰竭的风险或发展或者减少心力衰竭、减少或改善心律不齐、增加左心室射血分数(LVEF)、抑制左心室扩大、降低左心室收缩末期容量、降低左心室舒张末期容量、改善左心室机能障碍、改善心肌收缩性或者减少心脏纤维化的方法。在某些方面,提供的方法治疗MI后患者中的心脏纤维化,然而该治疗达到在梗塞区以外的区域的纤维化减少的目标以及在代偿性纤维化响应阶段之后的纤维化减少和改善的恢复的目标。在一些实施方式中,如在此使用的减少、提高、促进、改善或抑制是与不接受A2B腺苷受体拮抗剂给予的患者的类似情形下相比。
在一个实施方式中,该方法包括给予患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
在一方面中,MI是急性的MI。在另一方面中,MI是ST抬高MI(STEMI)。在又一方面中,MI是非ST抬高MI(NSTEMI)。
在一方面中,早在MI的过程中或MI之后立即开始给予A2B腺苷受体拮抗剂。在一些实施方式中,当患者被诊断为患有MI时进行给予。在另一方面中,在MI之后约1小时或者可替换地约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时开始给予。在又一方面中,在MI之后约1天或者可替换地约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或者1、2、3或4周开始给予。在特定的方面中,在MI患者稳定后立刻开始给予。在一个方面中,在MI后1天内开始给予。在另一个方面中,在MI后1至5天开始给予。在立即给予不可行的情况下,当前数据表明在MI后1或2周开始给予依旧有效。
在一些方面中,在MI之后不迟于约3天或者可替换地5天、7天、2周、3周或4周开始给予。
在一些方面中,MI后患者在血液动力学上稳定。确定血液动力学稳定性的方法及标准是本领域已知的。如在本文中使用的术语“血液动力学稳定”指的是使一种或多种或所有测量的血液动力学参数恢复至其正常范围。在下表中提供了这种正常范围的实例。
典型值 | 正常范围 | |
舒张末期容量 | 120mL | 65-240mL |
收缩末期容量 | 50mL | 16-143mL |
心搏量 | 70mL | 55-100mL |
射血分数 | 0.58 | 55%-70% |
心率 | 75BPM | 60-100BPM |
心输出量 | 5.25L/min | 4-8L/min |
如下更详细地描述的,拮抗剂可以以不同的方式给予,包括:全身、口服、静脉内、肌内、腹膜内、和吸入。
在其方法的另一方面中,本公开涉及一种抑制人类心脏成纤维细胞中的α-平滑肌肌动蛋白和/或α-1前胶原蛋白的超表达的方法,该方法包括使这些细胞与有效量的A2B腺苷受体拮抗剂接触。
在其方法的又一方面中,本公开涉及一种减少IL-6、胶原蛋白、ST-2、PAPPA(与妊娠相关的血浆蛋白A)和/或来自人类心脏成纤维细胞的半胱天冬酶-1的表达和/或释放的方法,该方法包括使这些细胞与有效量的A2B腺苷受体拮抗剂接触。
3、A2B腺苷受体拮抗剂
术语“A2B腺苷受体”或“A2B受体”指的是腺苷受体的亚型。其它亚型包括A1、A2A和A3。
术语“A2B腺苷受体拮抗剂”或“A2B受体拮抗剂”指的是抑制或者另外调节A2B腺苷受体的活性的任何化合物、肽、蛋白质(例如,抗体)、siRNA。在一个实施方式中,该拮抗剂相对于腺苷受体的其它亚型选择性抑制A2B受体。在另一个实施方式中,拮抗剂对于A2B受体是部分选择性的。可以利用在实施例1中的程序筛选作为假定拮抗剂的化合物。可以利用如实施例2至7所示的实验筛选适用于本公开的方法的化合物。例如,如果化合物减少NECA诱导的IL-6释放,则认为该化合物适用于本公开的目的。在一个方面中,该减少为至少约10%、20%、30%、40%、或50%。拮抗剂的示例包括,但不限于,以下部分中所述的那些。
设想多种A2B腺苷受体拮抗剂可用于本发明中。在其内容整体通过引用结合至此的美国专利6,825,349、7,105,665和6,997,300中,描述了该化合物。在一个实施方式中,本发明涉及以下式I或式II的化合物或者它们的药用盐、互变异构体、异构体、异构体的混合物、或前药的用途:
其中:
R1和R2独立地选自氢、可选地取代的烷基、或者基团-D-E,其中D是共价键或亚烷基,并且E是可选地取代的烷氧基、可选地取代的环烷基、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环基、可选地取代的烯基、或者可选地取代的炔基;
R3是氢、可选地取代的烷基、或者可选地取代的环烷基;
X是可选地取代的亚芳基或者可选地取代的杂亚芳基;
Y是共价键或者其中一个碳原子可以可选地被-O-、-S-、或-NH-替代的亚烷基,并且Y可选地被羟基、烷氧基、可选地取代的氨基、或-COR取代,其中R是羟基、烷氧基、或氨基;
Z是可选地取代的单环芳基或者可选地取代的单环杂芳基;或者
在X是可选地取代的杂亚芳基且Y是共价键时,Z是氢。
对于式I或式II或者它们的药用盐、互变异构体、异构体、异构体的混合物、或前药,在一些实施方式中,
R1和R2独立地选自氢、可选地取代的烷基或者基团-D-E,其中D是共价键或亚烷基,并且E是可选地取代的烷氧基、可选地取代的环烷基、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环基、可选地取代的烯基、或者可选地取代的炔基,条件是当D为共价键时E不能为烷氧基;
R3是氢、可选地取代的烷基、或者可选地取代的环烷基;
X是可选地取代的亚芳基或者可选地取代的杂亚芳基;
Y是共价键或者其中一个碳原子可以可选地被-O-、-S-、或-NH-替代的亚烷基,并且Y可选地被羟基、烷氧基、可选地取代的氨基、或-COR取代,其中R是羟基、烷氧基、或氨基;
条件是在当可选取代基为羟基或者氨基时,其不能与杂原子邻接;以及
Z是可选地取代的单环芳基或者可选地取代的单环杂芳基;或者
在X是可选地取代的杂亚芳基且Y是共价键时,Z是氢;
条件是当X是可选地取代的亚芳基时,Z是可选地取代的单环杂芳基。
在一个实施方式中,式I和式II的化合物是以下化合物:其中,R1和R2独立地选自氢、可选地取代的低级烷基、或者基团-D-E,其中D是共价键或亚烷基,并且E是可选地取代的苯基、可选地取代的环烷基、可选地取代的烯基、或者可选地取代的炔基,尤其是其中R3是氢的那些化合物。
在此基团内,化合物的类别包括以下化合物:其中,R1及R2为可选地被环烷基取代的独立的低级烷基,优选正丙基,并且X是可选地取代的亚苯基。在此种类内,化合物的亚类是以下化合物:其中,Y是亚烷基,包括其中碳原子被氧替代的亚烷基,优选O-CH2-,更具体地,其中氧是至亚苯基的连接点。在此亚类内,在一个实施方式中,Z是可选地取代的噁二唑、尤其是可选地取代的[1,2,4]-噁二唑-3-基,特别地被可选地取代的苯基或可选地取代的吡啶基取代的[1,2,4]-噁二唑-3-基。
另一类化合物包括其中X是可选地取代的1,4-亚吡唑(pyrazolene)的那些。在此种类内,化合物的亚类是以下化合物:其中,Y是共价键、亚烷基、低级亚烷基,并且Z是氢、可选地取代的苯基、可选地取代的吡啶基、或可选地取代的噁二唑。在此亚类内,一个实施方式包括以下化合物:其中,R1是可选地被环烷基取代的低级烷基,并且R2是氢。另一个实施方式包括以下化合物:其中,Y是-(CH2)-或-CH(CH3)-且Z是可选地取代的苯基,或者Y是-(CH2)-或-CH(CH3)-且Z是可选地取代的噁二唑(特别是3,5-[1,2,4]-噁二唑),或者Y是-(CH2)-或-CH(CH3)-且Z是可选地取代的吡啶基。在此亚类内,还包括以下化合物:其中,R1和R2为可选地被环烷基取代的独立的低级烷基,特别是正丙基。在其它实施方式中是以下化合物:其中,Y是共价键、-(CH2)-、或-CH(CH3)-且Z是氢、可选地取代苯基、或者可选地取代的吡啶基,尤其是其中Y是共价键且Z是氢。
目前,可用于本发明的化合物包括,但不限于:
1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]-甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-丙基-8-[1-苄基吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-丁基-8-(1-{[3-氟苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-丙基-8-[1-(苯乙基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[5-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-3-基)]甲基}吡唑-4-基)-1-丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[5-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-3-基)]甲基}吡唑-4-基)-1-丁基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-吡唑-4-基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-甲基-3-仲丁基-8-吡唑-4-基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-环丙基甲基-3-甲基-8-{1-[(3-三氟甲氧基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二甲基-8-{1-[(3-氟苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-甲基-1-丙基-8-{1-[(3-三氟甲基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-乙基-1-丙基-8-{1-[(3-三氟甲基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(3-氟苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-乙基-3-甲基-8-{1-[(3-氟苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(2-甲氧基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)-苯基]乙基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(4-羧基苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
2-[4-(2,6-二氧代-1,3-二丙基(1,3,7-三氢嘌呤-8-基))吡唑基]-2-苯乙酸;
8-{4-[5-(2-甲氧基苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基甲氧基]苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-{4-[5-(3-甲氧基苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基甲氧基]苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-{4-[5-(4-氟苯基)-[1,2,4]噁二唑-3-基甲氧基]苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-(环丙基甲基)-8-[1-(2-吡啶甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-正丁基-8-[1-(6-三氟甲基吡啶-3-基甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[3-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-5-基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-[1-({5-[4-(三氟甲基)苯基]异噁唑-3-基}甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-[1-(2-吡啶甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-{[4-(2,6-二氧代-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-8-基)吡唑基]甲基}苯甲酸;
1,3-二丙基-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1,3-二丙基-8-{1-[(3-(1H-1,2,3,4-四唑(tetraazol)-5-基)苯基)甲基]吡唑-4-基}-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
6-{[4-(2,6-二氧代-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-8-基)吡唑基]甲基}吡啶-2-羧酸;
3-乙基-1-丙基-8-[1-(2-吡啶甲基)吡唑-4-基]-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[5-(4-氯苯基)异噁唑-3-基]甲基}吡唑-4-基)-3-乙基-1-丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
8-(1-{[3-(4-氯苯基)(1,2,4-噁二唑-5-基)]甲基}吡唑-4-基)-3-乙基-1-丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
3-乙基-1-丙基-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;
1-(环丙基甲基)-3-乙基-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮;以及
3-乙基-1-(2-甲基丙基)-8-(1-{[6-(三氟甲基)(3-吡啶基)]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮,
或者它们的药用盐、互变异构体、异构体、异构体的混合物、或前药。
设想了上述A2B腺苷受体拮抗剂的前药在本发明的方法中也是有用的。在其全部内容通过引用结合至此的美国专利7,625,881中,教导了示例性前药。因此,在一个实施方式中,在本发明的方法中有用的化合物包括具有以下式的式III的前药:
其中:
R10和R12是独立的低级烷基;
R14是可选地取代的苯基;
X1为氢或甲基;以及
Y1是-C(O)R,其中R是独立地可选地取代的低级烷基、可选地取代的芳基、或可选地取代的杂芳基;或者
Y1是-P(O)(OR5)2,其中R15是氢或可选地被苯基或杂芳基取代的低级烷基;
以及其药用盐。
式III的化合物的一组是以下化合物:其中,R10和R12是乙基或正丙基,特别是其中R10是正丙基且R12是乙基的那些化合物。在另一个实施方式中,R14是3-(三氟甲基)苯基且X1是氢。
一个亚组包括其中Y1是-C(O)R的式III的化合物,具体为以下化合物:其中,R是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、或正戊基,更具体地,其中,R是甲基、正丙基、或叔丁基。另一个亚组包括其中Y1是-P(O)(OR5)2特别是其中R15是氢的那些式III的化合物。
式III的化合物或前药包括,但不限于,以下化合物:
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-7-基]甲基乙酸酯;
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-7-基]甲基2,2-二甲基丙酸酯;
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-7-基]甲基丁酸酯;以及
[3-乙基-2,6-二氧代-1-丙基-8-(1-{[3-(三氟甲基)苯基]甲基}-吡唑-4-基)(1,3,7-三氢嘌呤-7-基)]甲基二氢磷酸酯,
或它们的药用盐。
在一个实施方式中,A2B腺苷受体拮抗剂是N-[5-(1-环丙基-2,6-二氧代-3-丙基-2,3,6,7-四氢-1H-嘌呤-8-基)-吡啶-2-基]-N-乙基-尼克酰胺(化合物B),也被称为ATL-801,其具有以下化学式:
在Kolachala et al.Br J Pharmacol.155(1):127-37(2008)和美国专利申请第2007-0072843号可以找到更多有关该化合物的信息。
在另一个实施方式中,A2B腺苷受体拮抗剂是(2-(4-苄氧基-苯基)-N-[5-(2,6-二氧代-1,3-二丙基-2,3,6,7-四氢-1H-嘌呤-8-基)-1-甲基-1H-吡唑-3-基]-乙酰胺(化合物C),也被称为AS-16,其具有以下化学式:
在Baraldi, P.G. et. al. Journal of Medicinal Chemistry 47:1434-47 (2004)中可以找到更多有关该化合物及制备该化合物的方法的信息。
A2B腺苷受体拮抗剂是抑制或者另外调节A2B受体的活性的任何化合物。A2B腺苷受体拮抗剂是本领域已知的。例如,已识别了该受体的几种小分子抑制剂。示例性化合物包括:
另外的A2B腺苷受体拮抗剂是8-环状黄嘌呤衍生物,其中该环状取代基可以为芳基、杂芳基、环烷基、或杂环,所有这些环状基团可选地被如上定义的取代。8-环状黄嘌呤衍生物的实例可以在整个文献中找到,参见,例如,Baraldi,P.et al.,“Design,Synthesis,and Biological Evaluation of New8-Heterocyclic Xanthine Derivatives as Highly Potent and Selective HumanA2B adenosine receptor antagonists”,J.Med.Chem.,(2003),也可以在WO02/42298、WO03/02566、WO2007/039297、WO02/42298、WO99/42093、WO2009/118759、和WO2006/044610中找到,其全部内容通过引用全部结合至此。
在一个实施方式中,该A2B腺苷受体拮抗剂是具有以下化学式的化合物:
并且其名称为3-乙基-1-丙基-8-(1-(3-(三氟甲基)苯甲基)-1H-吡唑-4-基)-1H-嘌呤-2,6(3H,7H)-二酮或者3-乙基-1-丙基-8-(1-((3-(三氟甲基)苯基)甲基)吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮。在本文中其有时称为“化合物A”或者“CVT-6833”。该化合物在其全部内容通过引用结合至此的美国专利6,825,349中描述。
术语“烷基”指的是具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的单价支链或者无支链的饱和烃链。该术语的实例为诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基、正癸基、十四烷基等的基团。
术语“取代的烷基”是指:
1)以上所定义的烷基,具有1、2、3、4或者5个取代基,优选1至3个取代基,该取代基选自由以下各项组成的组:烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基(-N3)、氰基(CN)、卤素、羟基(OH)、酮(keto)(=O)、硫代羰基(-C(S))、羧基(-C(O)OH)、羧基烷基、芳基硫基、杂芳基硫基、杂环硫基、硫醇、烷基硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基和-SO2-杂芳基。除非另外通过定义限定,否则所有取代基可以可选地进一步被1、2、或3个选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR’中的取代基取代,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2;或者
2)如上所定义的烷基,该基团被1-10个独立地选自氧、硫和NRa-中的原子中断,其中Ra选自氢、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、和杂环基。所有取代基可以可选地进一步被烷基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、或-S(O)nR’取代,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基并且n是0、1或2;或者
3)如上所定义的烷基,该烷基具有1、2、3、4或5个如上所定义的取代基并且被如上所定义的1-10个原子中断。
术语“羟基氨基”是指基团–NHOH。
术语“烷氧基氨基”是指基团–NHOR,其中R是可选地取代的烷基。
术语“低级烷基”是指具有1、2、3、4、5、或6个碳原子的单价支链或无支链的饱和烃链。该术语的实例为诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基等的基团。
术语“取代的低级烷基”是指如上所述的低级烷基,具有如对取代的烷基定义的1至5个取代基,优选1、2或3个取代基,或者是如上所述的低级烷基,其被如对取代的烷基所定义的1、2、3、4或5个原子中断,或者是如上所述的低级烷基,其具有如上所定义的1、2、3、4或5个取代基并且也被如上所定义的1、2、3、4或5个原子中断。
术语“亚烷基”指的是二价支链或无支链饱和烃链,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子,优选1-10个碳原子,更优选1、2、3、4、5或6个碳原子。该术语的实例为诸如亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基异构体(例如,-CH2CH2CH2-和-CH(CH3)CH2-)等的基团。
术语“烷氧基”是指基团R’-O-,其中R’是可选地取代的烷基或可选地取代的环烷基,或者R’是基团-Y’-Z’,其中Y’是可选地取代的亚烷基并且Z’是可选地取代的烯基、可选地取代的炔基;或者可选地取代的环烯基,其中烷基、烯基、炔基、环烷基、和环烯基如本文所定义。优选的烷氧基是可选地取代的烷基-O-,并且包括,例如,甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基、1,2-二甲基丁氧基、三氟甲氧基等。
术语“烷基硫基”是指基团R’-S-,其中R’如对烷基所定义。
术语“烯基”是指单价支链或无支链的不饱和烃基,优选具有2至20个碳原子,更优选2至10个碳原子,甚至更加优选2至6个碳原子,并且具有1-6个、优选1个双键(乙烯基)。优选烯基包括乙烯基(-CH=CH2)、1-丙烯基或烯丙基(-CH2CH=CH2)、异丙烯基(-C(CH3)=CH2)、双环[2.2.l]庚烯等。
术语“取代的烯基”指的是如上所定义的烯基,其具有1、2、3、4或5个取代基,优选1、2或3个取代基,该取代基选自由以下各项组成的组:烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳基硫基、杂芳基硫基、杂环硫基、硫醇、烷基硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基、和-SO2-杂芳基。除非另外由定义限定,否则所有取代基可以可选地进一步被1、2、或3个选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR’中的取代基取代,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基且n是0、1或2。
术语“炔基”是指单价不饱和烃,优选具有2至20个碳原子,更优选2至10个碳原子甚至更加优选2至6个碳原子,并且具有至少1个且优选1至6个部位的乙炔(三键)不饱和度。优选炔基包括乙炔基,(-C≡CH),丙炔基(丙-1-炔-3-基(prop-1-yn-3-yl),-CH2C≡CH)等。
术语“取代的炔基”指代如上所定义的炔基,其具有1、2、3、4或5个取代基,优选1、2或3个取代基,该取代基选自由以下各项组成的组:烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳基硫基、杂芳基硫基、杂环硫基、硫醇、烷基硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基、和-SO2-杂芳基。除非另外通过定义限定,否则所有取代基可以可选地进一步被1、2、或3个选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR’中的取代基取代,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基且n是0、1或2。
术语“氨基羰基”是指基团-C(O)NR’R’,其中每个R’独立地是氢、烷基、芳基、杂芳基、杂环基,或者其中两个R’基团相连以形成杂环基团(例如,吗啉基)。除非另外通过定义限定,否则所有取代基可以可选地进一步被1至3个选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR’中的取代基取代,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基且n是0、1或2。
术语“酰氨基”是指基团-NR’C(O)R’,其中每个R’独立地是氢、烷基、芳基、杂芳基或杂环基。除非另外通过定义限定,否则所有取代基可以可选地进一步被1至3个选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR’中的取代基取代,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基且n是0、1或2。
术语“氨基羰基氨基”指代基团-NR’-C(O)-NR’R’,其中每个R’独立地是H或如对于取代的氨基所定义的。
术语“酰氧基”是指基团-O(O)C-烷基、-O(O)C-环烷基、-O(O)C-芳基、-O(O)C-杂芳基、和-O(O)C-杂环基。除非另外通过定义限定,否则所有取代基可以可选地进一步被选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、或者-S(O)nR’中的取代基取代,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基且n是0、1或2。
术语“烷氧基羰基氨基”是指基团烷基-O-C(O)-NR’,其中R’是如对于酰氨基所定义的。
术语“芳基”指代具有单环(例如,苯基)或多环(例如,联苯基)或者多稠(稠合)环(例如,萘基或蒽基)的6至20个碳原子的芳族碳环基团。优选的芳基包括苯基、萘基等。
术语“亚芳基”是指二价的如上文所定义的芳基。该术语的实例为诸如1,4-亚苯基、1,3-亚苯基、1,2-亚苯基、1,4’-亚联苯基等的基团。
除非另外通过对芳基或亚芳基取代基的定义限定,否则这种芳基或者亚芳基可以可选地被1至5个取代基、优选1至3个取代基取代,该取代基选自由以下各项组成的组:烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳基硫基、杂芳基硫基、杂环硫基、硫醇、烷基硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基、和-SO2-杂芳基。除非另外通过定义限定,否则所有取代基可以可选地进一步被1至3个选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR’中的取代基取代,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基且n是0、1或2。
术语“芳氧基”是指基团芳基-O-,其中芳基如上所定义,并且包括也如上所定义的可选取代的芳基。术语“芳基硫基”是指基团R’-S-,其中R’是如对芳基所定义的。
术语“氨基”是指基团-NH2。
术语“取代的氨基”指代基团-NR’R’,其中每个R’独立地选自由氢、烷基、环烷基、羧基烷基(例如,芐氧基羰基)、芳基、杂芳基、和杂环基组成的组,条件是两个R’基团不都是氢或基团-Y’-Z’,其中Y’是可选地取代的亚烷基且Z’是烯基、环烯基或炔基)。除非另外通过定义限定,否则所有取代基可以可选地进一步被1至3个选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR’中的取代基取代,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基且n是0、1或2。当R’是-OH时,则这指代羟基氨基。类似地,当R’是烷氧基时,则这是“烷氧基氨基”。
术语“羧基烷基”是指基团-C(O)O-烷基或-C(O)O-环烷基,其中烷基和环烷基是如本文中所定义的,并且可以可选地进一步被烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、或-S(O)nR’取代,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基且n是0、1或2。
术语“环烷基”是指具有单环或多个稠环的3至20个碳原子的碳环基团。这种环烷基包括,例如,单环结构,如环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等,或者多环结构,如金刚烷基、二环[2.2.1]庚烷、1,3,3-三甲基二环[2.2.1]庚-2-基、2,3,3-三甲基二环[2.2.1]庚-2-基,或者芳基稠合至其上的碳环基团(例如二氢化茚等))。
术语“取代的环烷基”是指代具有1、2、3、4或5个取代基,优选1、2或3个取代基的环烷基基团,该取代基选自由以下各项组成的组:烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳基硫基、杂芳基硫基、杂环硫基、硫醇、烷基硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基、和-SO2-杂芳基。除非另外通过定义限定,否则所有取代基可以可选地进一步被1、2或3个选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR’中的取代基取代,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基且n是0、1或2。
术语“环烯基”指代如上所定义的环烷基,其具有至少1个或2至6个位点的不饱和度(或者双链)。
术语“卤素”或“卤基”是指氟代、溴代、氯代、和碘代。
术语“酰基”是指基团-C(O)R’,其中R’是氢、可选地取代的烷基、可选地取代的环烷基、可选地取代的杂环基、可选地取代的芳基、和可选取代的杂芳基。
术语“杂芳基”是指衍生自芳族环状基团(即,充分不饱和)的基团,其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个碳原子,并且在至少一个环中具有选自氧、氮和硫的1、2、3、或4个杂原子。这种杂芳基可以具有一个单环(例如,吡啶基或呋喃基)或多个稠环(例如,吲嗪基、苯并噻唑基、或苯并噻吩基)。杂芳基的实例包括,但不限于,[1,2,4]噁二唑、[1,3,4]噁二唑、[1,2,4]噻二唑、[1,3,4]噻二唑、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉等,以及包含杂芳基化合物的N-氧化物和N-烷氧基-氮衍生物(例如,吡啶-N-氧化物衍生物)。
术语“杂亚芳基”是指二价的如上文所定义的杂芳基。该术语的实例为诸如2,5-咪唑啉(imidazolene)、3,5-[1,2,4]噁二唑酮(oxadiazolene)、2,4-噁唑酮(oxazolene)、1,4-吡唑啉酮(pyrazolene)等的基团。例如,1,4-吡唑啉酮是:
其中A表示连接点。
除非另外通过对杂芳基或杂亚芳基取代基的定义限定,否则这种杂芳基或者杂亚芳基可以可选地进一步被1至5个取代基、优选1至3个取代基取代,该取代基选自由以下各项组成的组:烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳基硫基、杂芳基硫基、杂环硫基、硫醇、烷基硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基、和-SO2-杂芳基。除非另外通过定义限定,否则所有取代基可以可选地进一步被1至3个选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR’中的取代基取代,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基且n是0、1或2。
术语“杂芳基氧基”指代基团杂芳基-O-。
术语“杂环基”是指具有单环或多个稠环的单价饱和或部分不饱和基团,其具有1至40个碳原子,并且在环内具有1至10个杂原子,优选1、2、3或4个杂原子,该杂原子选自氮、硫、磷、和/或氧。杂环基团可以具有一个单环或多个稠环,并且包括四氢呋喃基、吗啉代、哌啶基、哌嗪基、二氢吡啶基等。
除非另外通过对杂环取代基的定义限定,否则这种杂环基团可以可选地进一步被1、2、3、4或5个取代基,优选1、2、或3个取代基取代,该取代基选自由以下各项组成的组:烷基、烯基、炔基、烷氧基、环烷基、环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基羰基、烷氧基羰基氨基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、酮、硫代羰基、羧基、羧基烷基、芳基硫基、杂芳基硫基、杂环硫基、硫醇、烷基硫基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、氨基羰基氨基、杂芳基氧基、杂环基、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO2-烷基、SO2-芳基、和-SO2-杂芳基。除非另外通过定义限定,否则所有取代基可以可选地进一步被1至3个选自烷基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、羟基、烷氧基、卤素、CF3、氨基、取代的氨基、氰基、和-S(O)nR’中的取代基取代,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基且n是0、1或2。
术语“杂环基氧基”是指-O-杂环基。
术语“取代的烷基硫基”是指基团-S-取代的烷基。
术语“杂芳基硫基”是指基团-S-杂芳基,其中杂芳基是如上所定义的,包括也如上所定义的可选地取代的杂芳基。
术语“杂环硫基”是指基团杂环-S-。
术语“亚砜”是指基团-S(O)R’,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基。“取代的亚砜”是指基团-S(O)R’,其中R’是取代的烷基、取代的芳基、或取代的杂芳基,如本文中所定义。
术语“砜”是指基团-S(O)2R’,其中R’是烷基、芳基、或杂芳基。“取代的砜”是指基团-S(O)2R’,其中R’是取代的烷基、取代的芳基、或取代的杂芳基,如本文中所定义。
术语“氨基磺酰基”是指基团-SO2-可选地取代的氨基。
术语“酮”是指基团-C(O)-。术语“硫代羰基”是指基团-C(S)-。术语“羧基”是指基团-C(O)-OH。
“可选的”或“可选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生,并且该描述包括其中所述事件或情况发生的实例以及其中其不发生的实例。
术语“式I、式II、或式III的化合物”旨在涵盖所公开的本发明的化合物,以及这种化合物的药用盐、药用酯、前药、水合物和多形体。另外,本发明的化合物可以具有一个或多个不对称中心,并且可以作为外消旋混合物或作为单独的对映异构体或非对映异构体产生。在本发明的任何给定化合物中存在的立体异构体的数目取决于存在的不对称中心的数目(存在2n种可能的立体异构体,其中n是不对称中心的数目)。单独的立体异构体可以通过拆分处于合成的某一合适阶段的中间体的外消旋或非外消旋混合物,或者通过常规方式拆分本发明的化合物来获得。单独的立体异构体(包括单独的对映异构体和非对映异构体)以及立体异构体的外消旋和非外消旋混合物包括在本发明的范围内,除非另有明确指明,否则所有这些旨在通过本说明书的结构来描述。
“异构体”是具有相同分子式的不同化合物。
“立体异构体”是仅原子的空间排列方式不同的异构体。
“对映异构体”是一对彼此不能重叠的镜像的立体异构体。一对对映体的1:1混合物是“外消旋”混合物。在适当的情况下,术语“(±)”用来表示外消旋混合物。
“非对映异构体”是这样的立体异构体,其具有至少两个不对称原子,但其彼此不是镜像。
绝对立体化学是按照Cahn-Ingold-Prelog R-S系统规定的。当化合物是纯对映体时,可以用R或S来规定在每个手性碳处的立体化学。其绝对构型未知的拆分化合物取决于它们在钠D线的波长处旋转偏振光的平面的方向(右旋-或左旋)指定为(+)或(-)。
术语“互变异构体”是指质子位置不同的化合物的可替换形式,如烯醇、酮和亚胺烯胺互变异构体,或者包含附接至环NH部分和环=N部分的环原子的杂芳基的互变异构体形式,如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑、和四唑。
在本文中使用的术语“前药”是指包括在体内可以转化和/或可以由其余分子分解以提供活性药物、其药用盐或其生物活性代谢物的化学基团的本公开的化合物。适当的基团是本领域中所熟知的,尤其包括:对于羧酸部分,前药选自,例如,包括但不限于衍生自烷基醇、取代的烷基醇、羟基取代的芳基、和杂芳基等的酯;酰胺;羟甲基、醛和它们的衍生物。这种前药的结构可以为以下所示的式III。
本文所给出的任何化学式或结构也意在表示化合物的未标记形式以及同位素标记形式。同位素标记的化合物具有由本文所给出的化学式所表示的结构,只不过一个或多个原子被具有所选定的原子质量或质量数的原子所替代。可以并入本发明的化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、和氯的同位素,例如,但不限于2H(氘,D)、3H(氚)、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl、和125I。本公开的各种同位素标记的化合物,例如放射性同位素如3H、13C、和14C并入到这些化合物中。这样的同位素标记的化合物可以用于代谢研究、反应动力学研究、检测或成像技术,如正电子发射断层扫描成像(PET)或单光子发射计算机断层成像(SPECT),包括药物或底物组织分布分析,或在患者中放射性治疗。
本公开也包括在本文中公开的任何式的化合物,其中附接至碳原子的1至“n”个氢由氘替代,其中n是该分子中氢的数目。这种化合物显示对代谢的增加的耐受性,因此在给予哺乳动物时可用于增加任何化合物的半衰期。参见,例如,Foster,“Deuterium Isotope Effects in Studies of DrugMetabolism”,Trends Pharmacol.Sci.5(12):524-527(1984)。这种化合物通过在本领域中所熟知的方法合成,例如通过采用其中一个或多个氢已被氘替代的起始物料。
本公开氘标记的或取代的治疗化合物具有改善的DMPK(药物代谢和药代动力学)性质,涉及分布、代谢、和排泄(ADME)。用较重的同位素如氘取代可以提供因更高的代谢稳定性而产生的某种治疗优点,例如,体内半衰期增加或所需的剂量减少。18F标记的化合物对PET或SPECT研究是有用的。本公开的同位素标记的化合物和其前药通常可以通过以下方法制备:进行在如下所述的方案或实施例和制备例中公开的程序,用容易获得的同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂。另外,用较重的同位素,尤其是氘(即,2H或D)替代,可以提供因更高的代谢稳定性而产生的某种治疗优点,例如,体内半衰期增加或所需的剂量减少或治疗指数增加。应当理解,在本文中的氘被认为是在本文中公开的式I或者任何式的化合物的取代基。
这种较重同位素(尤其是氘)的浓度可以通过同位素富集因子来定义。在本公开的化合物中,任何没有明确指明为具体同位素的原子是指该原子的任何稳定的同位素。除非另外指明,当一个位置明确指明为“H”或“氢”时,该位置应理解为具有在其天然丰度同位素组成下的氢。因此,在本公开的化合物中,明确指明为氘(D)的任何原子是指氘。
在许多情况下,本发明的化合物借助于氨基和/或羧基或与其类似基团的存在可以形成酸式盐和/或碱式盐。术语“药用盐”是指这样的盐,其保持式I、式II或式III的化合物的生物有效性和性质,并且在生物学上或在其它方面并非是不期望的。药用碱加成盐可以由无机碱和有机碱制备。衍生自无机碱的盐包括,仅举例说明,钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、和镁盐。衍生自有机碱的盐包括,但不限于,伯胺、仲胺和叔胺的盐,这样的胺例如,烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、取代的烷基胺、二(取代的烷基)胺、三(取代的烷基)胺、烯基胺、二烯基胺、三烯基胺、取代的烯基胺、二(取代的烯基)胺、三(取代的烯基)胺、环烷基胺、二(环烷基胺)胺、三(环烷基胺)胺、取代的环烷基胺、二取代的环烷基胺、三取代的环烷基胺、环烯基胺、二(环烯基)胺、三(环烯基)胺、取代的环烯基胺、二取代的环烯基胺、三取代的环烯基胺、芳基胺、二芳基胺、三芳基胺、杂芳基胺、二杂芳基胺、三杂芳基胺、杂环胺、二杂环胺、三杂环胺、混合的二胺和三胺,其中胺上的至少两个取代基不同,并且选自由以下各项组成的组:烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、杂芳基、杂环等。还包括其中两个或三个取代基与氨基氮一起形成杂环或杂芳基的胺。
合适的胺的具体实例包括,仅举例说明,异丙胺、三甲胺、二乙胺、三(异丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、氨丁三醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、吗啉、N-乙基哌啶等。
药用酸加成盐可以由无机酸和有机酸制备。由其衍生盐的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。由其衍生盐的有机酸包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
命名
本发明的化合物的命名及编号以式I的代表性化合物说明,该式中R1为正丙基、R2为正丙基、R3为氢、X为亚苯基、Y为-O-(CH2)且Z为5-(2-甲氧基苯基)-[1,2,4]-噁二唑-3-基,该代表性化合物命名为8-{4-[5-(2-甲氧基苯基)-[1,2,4]-噁二唑-3-基甲氧基]-苯基}-1,3-二丙基-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮。
4、联合治疗
联合治疗也提供在此。在一个实施方式中,该方法进一步包括给予患者血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂。ACE抑制剂的非限制性实例包括卡托普利、依那普利、赖诺普利、培哚普利、雷米普利等。
在另一个实施方式中,该方法进一步包括给予该患者血管紧张素II受体拮抗剂,也称为血管紧张素受体阻断剂(ARB)。ARB的非限制性实例包括氯沙坦、EXP3174、坎地沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、替米沙坦、依普罗沙坦、奥美沙坦、阿齐沙坦等。
A2B腺苷受体拮抗剂可以结合其它心脏纤维化治疗剂或药剂一起给予,其包括,但不限于,白藜芦醇(3,5,4’-三羟基-反式-二苯乙烯)(Sutraet al.,J Agric Food Chem56(24):11683–11687(2008))。白藜芦醇是一种芪类化合物,一类天然酚,并且当受到诸如细菌或真菌的病原体攻击时由几种植物天然产生的植物抗毒素。
由于它们各自不同的治疗机制,因而设想在A2B腺苷受体拮抗剂和其它心脏纤维化治疗剂之间有协同作用(synergism)。例如,ACE抑制剂阻断血管紧张素I至血管紧缩素II的转化。因此,它们降低小动脉阻力并提高静脉容量;增加心脏输出量、心脏指数、每搏作功、和容量;降低肾血管阻力;并且导致增加的尿钠排泄(小便中排泄钠)。相反,A2B腺苷受体拮抗剂减少心脏炎症及纤维化。结合来说,因此,A2B腺苷受体拮抗剂及ACE抑制剂可以增强心脏功能并减少每一个单独试剂的治疗剂量。进而,治疗剂量的减少有助于减少或预防潜在不利事件。
就给予来说,预期可以同时或连续给予两种或多种试剂。如果同时给予两种或多种试剂,可以将它们作为单剂量或分开的剂量给予。进一步地,设想了主治医生将能够容易地判断其它试剂所需的剂量、给药方案、和优选给予途径。这种组合物以制药领域所熟知的方法制备(参见,例如:Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mace Publishing Co.,Philadelphia,PA17th Ed.(1985)和“Modern Pharmaceutics”,Marcel Dekker,Inc.3rd Ed.(G.S.Banker&C.T.Rhodes,Eds.)。
5、给予
本发明中适合给予的组合物可以口服、玻璃体内、局部、舌下、含服(bucally)、经鼻、非肠道(例如,肌内)、腹膜内、静脉内或皮下注射、脑池内、阴道内、舌下、含服、作为口腔喷雾、或鼻喷雾给予需要其的个体。该组合物可以配制成适合每一种给予途径的剂型。
该药物组合物可以是口服、鼻内、眼内、非肠道给予或通过吸入疗法给予,并可以采取片剂、锭剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、针剂、栓剂、或气雾剂的形式。它们也可采用在关键成分(含水或非水的稀释剂、糖浆剂、颗粒剂、或散剂)的混悬剂、溶液剂及乳剂的形式。除了本发明的试剂外,该药物组合物也可以包含其它药用活性化合物或者多种化合物。
在一些实施方式中,可以通过任何适当的途径,包括口服、经鼻、局部(包括透皮、气雾剂、含服、舌下)、非肠道(包括皮下、肌内、静脉内、和皮内)、和肺部途径给予在本文中也称为活性成分的本发明的组合物用于治疗。也将理解,优选的途径将随受体的状况和年龄以及治疗的疾病而改变。
A、注射
给予的一个模式是非肠道(parental),尤其是通过注射,如静脉内(IV)注射。可以并入本公开的组合物的形式用于通过注射给予,包括含水或油混悬剂、或乳剂,含有芝麻油、玉米油、棉子油、或花生油、以及酏剂、甘露醇、右旋糖、或无菌含水溶液、以及类似的药物载体。通常也将盐水中的含水溶液用于注射,但在本公开上下文中是不太优选的。也可以使用乙醇、丙三醇、丙二醇、液态聚乙二醇等(以及合适的它们的混合物),环糊精衍生物,和植物油。可以通过如下方法保持适当的流动性,例如,通过使用包衣,如卵磷脂,在分散的情况下通过保持所需的颗粒尺寸,以及通过使用表面活性剂。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用,例如,对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。
在一个方面中,本公开提供了包括A2B腺苷受体拮抗剂的选定浓度的IV溶液。具体地,优选IV溶液包括每毫升药用含水溶液约1至约5000mg的A2B腺苷受体拮抗剂。可替换地,在IV溶液中A2B腺苷受体拮抗剂的浓度是约5至约1000mg,或者可替换地约10至约800mg,或者可替换地约20至约800mg、或者可替换地约50至约700mg、或者可替换地约50至约500mg。在另一个方面中,在IV溶液中A2B腺苷受体拮抗剂的浓度是约100至约1000mg,或者可替换地约100至约800mg,或者可替换地约100至约500mg、或者可替换地约200至约500mg、或者可替换地约200至约400mg、或者可替换地约200至约300mg。在又一个方面中,浓度为约250mg。为了使得A2B腺苷受体拮抗剂快速静脉内流动至患者,优选IV溶液不包含粘性组分,包括,通过举例说明,丙二醇或聚乙二醇(例如,聚乙二醇400)。应理解,不实质上改变粘度的少量粘性组分可以包含在本公开的静脉注射制剂中。在特别优选的实施方式中,IV溶液的粘度优选在20℃下低于10cSt,更优选在20℃下低于5cSt,甚至更优选在20℃下低于2cSt。
可注射的无菌溶液的制备如下:在具有以上所列举的各种其它成分的适当溶剂中并入所需量的本公开的化合物,如果需要,随后过滤灭菌。通常,分散剂的制备如下:将各种经灭菌的活性成分并入无菌载体中,其包含基础分散介质和以上所列举的所需的其它成分。在无菌粉末用于制备可注射无菌溶液的情况下,优选的制备方法是采用真空干燥和冷冻干燥技术,其由之前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。
B、口服给予
口服给予是给予本公开的化合物的另一种途径。给予可以通过胶囊剂或肠溶衣片剂等。在制备包括至少一种本公开的化合物的药物组合物时,活性成分通常用赋形剂稀释和/或封装在以下载体中,所述载体可以为胶囊、香囊、纸、或其它包装物的形式。当赋形剂用作稀释剂时,它可以是固体、半固体、或液体材料(如上所述),就活性成分而言,其充当载体、运载体、或介质。因此,该组合物的形式可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、香囊剂、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、含有例如可达按重量计10%的活性化合物的软膏剂、软胶囊剂和硬胶囊剂、可注射无菌溶液剂、和无菌封装的散剂。
合适赋形剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐/酯、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆、以及甲基纤维素。此外,该制剂可以包含:润滑剂如滑石粉、硬脂酸镁、矿物油;润湿剂;乳化剂和悬浮剂;防腐剂如甲基羟基苯甲酸酯和丙基羟基苯甲酸酯;甜味剂;以及调味剂。
通过采用本领域已知的程序可以配制出本公开的组合物,以便在对患者给予后,可以提供活性成分的快速、持续、或延缓释放。用于口服给予的控释递送系统包括含有聚合物涂布的贮囊或药物-聚合物基质制剂的渗透泵系统和溶解系统。控释系统的实例在美国专利第3,845,770、4,326,525、4,902514和5,616,345号中给出。用于本公开的方法的另一种制剂采用透皮递送装置(“贴剂”)。这类透皮贴剂可以用于以控制量提供本公开的化合物的连续或不连续注入。用于药物试剂递送的透皮贴剂的构造和使用是本领域熟知的。参见,例如,美国专利第5,023,252、4,992,445和5,001,139号。这类贴剂可以被构造成用于连续、脉冲、或按需递送药物试剂。
组合物优选配制成单位剂型。术语“单位剂型”是指物理上分离的单位,适用于人类对象和其它哺乳动物的单位剂量,每个单位包括预定量的活性物质,其经计算以产生所需要的疗效,结合合适的药物载体(例如,片剂、胶囊剂、和针剂)。本公开的化合物在广泛的剂量范围内有效,并且通常以药物有效量给予。
在一些方面中,对于口服给予,每一剂量单位包含10mg至2g、或者可替换地10至200mg、或者可替换地约10mg、20mg、40mg、80mg或160mg的本公开的化合物。对于非肠道给予,剂量单位可以为10至700mg或者约50至200mg的本公开的化合物。然而,需要理解的是,实际给予的化合物的量将由医生根据相关情况决定,所述相关情况包括将治疗的疾病,选择的给予途径,给予的实际化合物和其相对活性,每个患者的年龄、体重和反应,患者症状的严重程度等。
为了制备诸如片剂的固体组合物,将主要活性成分与药物赋形剂混合以形成含有本公开化合物的均相混合物的固体预制剂组合物。当提及这些预制剂组合物为均相时,它是指活性成分均匀地分散到整个组合物中,从而使该组合物可以容易地再分成等效的单位剂型,如片剂、丸剂、和胶囊剂。
本公开的片剂或丸剂可以进行包衣或通过其它方式进行混合以提供剂型,其具有作用时间长或保护免受胃的酸性条件作用的优点。例如,片剂或丸剂可以包括内部剂量组分和外部剂量组分,后者以包封的形式包在前者上。这两种组分可以用肠溶层隔开,该肠溶层用于阻止在胃中的崩解并使得内部组分完整地通过十二指肠或被延缓释放。各种材料都可以用于肠溶层或包衣,这些材料包括多种高分子酸以及高分子酸与诸如紫胶(shellac)、十六烷醇、和乙酸纤维素的材料的混合物。
C、吸入和吹入
用于吸入或吹入的组合物包括在药用、含水或有机溶剂或者它们的混合物中的溶液剂和混悬剂,以及散剂。液体或固体组合物可以包含适当的如上文所述的药用赋形剂。优选地,这些组合物可以通过口服或经鼻吸入途径给予,用于局部或全身效应。优选的药用溶剂中的组合物可以通过使用惰性气体进行雾化。雾化溶液可以通过雾化装置直接吸入或者雾化装置可以与面罩吸入器、或间歇式正压呼吸机相连。可以以适当方式由递送制剂的装置给予溶液剂、混悬剂、或散剂组合物,优选口服或经鼻给予。
包括以下实施例以证明本公开的优选实施方式。本领域技术人员应当理解,以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的技术,其在本公开的实施发挥良好功效,因此可以认为构成用于本发明实施的优选模式。然而,本领域技术人员应当理解,根据本公开,在没有背离本发明的精神和范围的情况下,可以在所公开的具体实施方式中进行许多改变,并且仍然获得相同或相似的结果。
制剂实施例1
制备含有以下成分的硬胶囊:
将以上成分混合并填充至硬胶囊中。
制剂实施例2
利用以下成分制备片剂药方:
将各组分掺混并压制以形成片剂。
制剂实施例3
制备含有以下成分的干粉吸入制剂:
成分 wt%
活性成分 5
乳糖 95
将活性成分与乳糖混合,并将混合物添加入干粉吸入设备中。
制剂实施例4
制备以下片剂,每片含有30mg的活性成分:
将活性成分、淀粉和纤维素通过第20号目的美国筛,并充分混合。将聚乙烯吡咯烷酮溶液与得到的粉末混合,接着通过16目的美国筛。将如此生产的颗粒在50℃至60℃下干燥,并通过16目的美国筛。然后,将之前通过第30号目的美国筛的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石粉加入至上述颗粒中,其在混合之后在压片机上压制以产生每片重量为120mg的片剂。
制剂实施例5
制备如下栓剂,每个含有25mg活性成分:
成分 量
活性成分 25mg
饱和脂肪酸甘油酯至 2,000mg
使活性成分通过第60号目的美国筛,并悬浮在之前利用最小必需热量融化的饱和脂肪酸甘油酯中。然后将混合物倒入标称2.0g容量的栓剂模具中,并使其冷却。
制剂实施例6
制备如下栓剂,每个含有每5.0mL剂量50mg活性成分:
将活性成分、蔗糖、和黄原胶掺混,通过第10号目的美国筛,接着与之前制备的在水中的微晶纤维素和羟甲基纤维素钠的溶液混合。将苯甲酸钠、调味剂和着色剂用一些水稀释并在搅拌下添加。然后加入足量水以产生所需的体积。
制剂实施例7
可以制备如下的皮下制剂:
成分 量
活性成分 5.0mg
玉米油 1.0mL
制剂实施例8
制备具有以下组成的可注射制剂:
制剂实施例9
制备具有以下组成的局部制剂:
将以上除水之外的所有成分合并,并在搅拌下加热至60℃。然后,在强烈搅拌下加入60℃的足量的水以乳化各成分,接着加入适量水至100g。
实施例
通过参照以下实施例进一步限定本发明。对本领域技术人员显而易见的是,可以实施对本公开的思路及方法的多种修改而不背离本公开的范围。
缩写
除非另有说明,否则所有温度是以摄氏度(℃)为单位。同样,在这些实施例和其它地方,缩写词具有以下含义:
μg | = | 微克 |
μL | = | 微升 |
μM | = | 微摩尔 |
Ado | = | 腺苷 |
AdoR | = | 腺苷受体 |
AMI | = | 急性心肌梗塞 |
BPM | = | 每分钟搏动 |
CV | = | 心血管 |
CVD | = | 心血管病 |
EF | = | 射血分数 |
ELISA | = | 酶联免疫吸附试验 |
g | = | 克 |
HCF | = | 人类心脏成纤维细胞 |
IBZ | = | 梗塞边界区 |
hr | = | 小时 |
ip或i.p. | = | 腹膜内 |
LV | = | 左心室 |
LVEDD | = | 左心室舒张末期直径 |
LVEF | = | 左心室射血分数 |
LVESD | = | 左心室收缩末期直径 |
LVESV | = | 左心室收缩末期容量 |
LVPWDT | = | 左心室后壁舒张厚度 |
mg | = | 毫克 |
mL | = | 毫升 |
mM | = | 毫摩尔 |
MI | = | 心肌梗塞 |
MPI | = | 心肌功能指数 |
NECA | = | N-乙基甲酰胺腺苷 |
nM | = | 纳摩尔 |
RVEDA | = | 右心室舒张末期面积 |
RT-PCR | = | 反转录聚合酶链式反应 |
STEMI | = | ST抬高心肌梗塞 |
SV | = | 心搏量 |
TAPSE | = | 三尖瓣环平面收缩期运动 |
方法和试剂
细胞和试剂
如同美国专利6,825,349中所提供,化合物A是通过Gilead Sciences,Inc.(Foster City,California)合成。其它化合物获自Sigma-Aldrich(St.Louis,Missouri)。
实时RT-PCR
使用Stratagene PCR设备(La Jolla,California)如所公开地进行实时RT-PCR。Zhong H.,et al.,“A2B adenosine receptors increase cytokine releaseby bronchial smooth muscle cells,“American Journal of Respiratory Cell andMolecular Biology,30(1):118-125(2004)。
实施例1:腺苷受体测定
为了筛选A2B受体拮抗剂,一般使用两种类型的试验:1)放射性配体结合试验,以确定给定的化合物能够结合至以下所述的A2B受体,以及2)功能试验(cAMP试验或者其它试验)以确定化合物是激动剂(激活受体)还是拮抗剂(抑制受体的激活)。
对A2B腺苷受体的放射性配体结合试验用于确定化合物对A2B腺苷受体的亲和力。同时,对其它腺苷受体进行的放射性配体结合试验旨在确定化合物对A1、A2A和A3腺苷受体的亲和力。该化合物应对A2B受体具有比其它腺苷受体高(至少3倍)的亲和力。
对A2B受体的cAMP试验通常用于确定该化合物为拮抗剂并且将阻止A2B受体介导的cAMP增加。
对A2B腺苷受体的放射性配体结合
基于以下试验,可以对假定为A2B受体的拮抗剂的化合物筛查必要的活性。人类A2B腺苷受体cDNA稳定地传染至HEK-293细胞(称为HEK-A2B细胞)。单层HEK-A2B细胞用PBS洗涤一次并在包含10mMHEPES(pH7.4)、10mM EDTA和蛋白酶抑制剂的缓冲液中收获。这些细胞在设置4下在Polytron(均质器)中均质化1分钟并在4℃下以29000g离心15分钟。细胞粒用包含10mM HEPES(pH7.4)、10mM EDTA和蛋白酶抑制剂的缓冲液洗涤一次,并在补充有10%蔗糖的相同缓冲液中再悬浮。将冷冻的等分部分保持在-80℃下。通过以下步骤开始竞争试验:将10nM3H-ZM241385(Tocris Cookson)与各种浓度的检测化合物及在补充有1单位/mL的腺苷脱氨酶的TE缓冲液(50mM Tris和1mM EDTA)中的50μg膜蛋白混合。该试验保温90分钟,通过使用Packard采集器过滤终止并用冰冷的TM缓冲液(10mM Tris、1mM MgCl2、pH7.4)洗涤四次。在10μM ZM241385存在下确定非特异性结合。利用GraphPad软件计算化合物的亲和力(即,Ki值)。
其它腺苷受体的放射性配体结合
将人类A1、A2A、A3腺苷受体cDNA稳定地传染至CHO或HEK-293细胞(称为CHO-A1、HEK-A2A、CHO-A3)。利用如上所述的相同方案,由这些细胞制备膜。通过以下步骤开始竞争试验:将0.5nM的3H-CPX(用于CHO-A1)、2nM3H-ZM241385(CHO-HEK-A2A)或0.1nM125I-AB-MECA(CHO-A3)与各种浓度的检测化合物及在补充有1单位/mL的腺苷脱氨酶的TE缓冲液(CHO-A1和HEK-A2A的50mM Tris和1mM EDTA)或TEM缓冲液(CHO-A3的50mM Tris、1mM EDTA和10mM MgCl2)中的透视膜(perspective membrane)混合。该试验保温90分钟,通过使用Packard采集器过滤终止并用冰冷的TM缓冲液(10mM Tris、1mM MgCl2、pH7.4)洗涤四次。在10μM CPX(CHO-A1)、1μM ZM214385(HEK-A2A)和1μM IB-MECA(CHO-A3)存在下确定非特异性结合。利用GraphPad软件计算化合物的亲和力(即,Ki值)。
cAMP测量
将单层的转染细胞收集在包含5mM EDTA的PBS中。细胞用DMEM洗涤一次并在100,000500,000细胞/mL的密度下在包含1单位/mL的腺苷脱氨酶的DMEM中再悬浮。100μL的细胞悬浮液与25μL包含各种激动剂和/或拮抗剂混合,且反应在37℃下持续15分钟。在15分钟结束时,添加125μL的0.2N HCl以停止反应。在1000rpm下将细胞离心10分钟。去除100μL的上清液并乙酰化。利用来自Assay Design的直接cAMP试验测量在上清液中的cAMP的浓度。
A2A和A2B腺苷受体结合至Gs蛋白质,因此A2A腺苷受体(如CGS21680)或A2B腺苷受体(如NECA)的激动剂增加cAMP积聚物,然而这些受体的拮抗剂预防由激动剂诱导的cAMP积聚物的增加。A1和A3腺苷受体结合至Gi蛋白质,因此A1腺苷受体(如CPA)或A3腺苷受体(如IB-MECA)的激动剂抑制由福司柯林(forskolin)诱导的cAMP积聚物的增加。A1和A3受体的拮抗剂预防cAMP积聚物的抑制。
基于以上所述的试验方案,确定化合物是否是A2B受体的拮抗剂在本领域技术人员的能力范围内。相对于其它腺苷受体,对于A2B受体具有3倍或者在某些情况下10倍的选择性可以认为该化合物是合格的选择性A2B受体拮抗剂。
实施例2:A2B腺苷受体削弱心脏纤维化生物标记物
本实施例证明A2B腺苷受体(AdoR)是在主要人类心脏成纤维细胞(HCF)中表达的AdoR的主要亚型,并提出A2B AdoR介导在心脏病中的纤维化响应。因此,A2B AdoR拮抗剂可用于治疗心脏纤维化。
使用实时RT-PCR确定AdoR、α-平滑肌肌动蛋白、和α-1前胶原蛋白的表达。使用ELISA测量细胞上清液中IL-6、可溶ST-2、和PAPPA(与妊娠相关血浆蛋白A)的浓度,并使用SircolTM胶原蛋白试验确定可溶胶原蛋白的浓度。
在AdoR的四种亚型中,在HCF中,A2B AdoR以最高的水平表达。N-乙基甲酰胺腺苷(NECA)(腺苷的一种稳定类似物)以浓度依赖的方式显著地增加IL-6的释放,并且相对于基础水平最大增加2.4±0.1倍。另外,NECA(10μM)增加α-平滑肌肌动蛋白和α-1前胶原蛋白的表达以及由HCF产生的胶原蛋白(1.8±0.1倍诱导,从3.4±0.2到6.0±0.4μg/mL,p<0.05)。此外,NECA增加心血管病(CVD)的两种新型生物标记物可溶ST-2(1.7±0.1倍诱导,从1.5±0.1到2.6±0.1ng/mL,p<0.05)和PAPPA(4.4±0.6倍诱导,从1.4±0.5到6.2±0.8ng/mL,p<0.05)的释放。通过选择性A2B AdoR拮抗剂化合物A完全消除了NECA对IL-6、胶原蛋白、ST-2和PAPPA的释放以及α-平滑肌肌动蛋白(SMAa)和α-1前胶原蛋白的表达的影响(图1A-D)。
因此,本实施例表明A2B AdoR是在主要人类(HCF)中表达的AdoR的主要亚型,并且激活此受体增加IL-6的释放及胶原蛋白的产生、纤维化标记物的表达和CVD的生物标记物的释放。这些发现提出A2B AdoR可以介导在心脏病中的纤维化响应。因此,通过抑制A2B AdoR的激活,A2BAdoR拮抗剂可以用于治疗心脏的纤维化。
实施例3:A2B拮抗剂改善心脏重塑
本实施例证明了在小鼠中急性心肌梗塞之后对腺苷A2B受体的选择性阻断可以改善心脏重塑。腺苷响应于组织损伤释放并促进充血及炎症。通过A2B受体的腺苷的前炎性影响进一步诱导组织损伤。本实施例检测在急性心肌梗塞过程中选择性阻断A2B受体是否将致使更有利的心脏重塑。
将雄性ICR小鼠进行冠状动脉结扎或者假手术(N=8-10每组)。选择性A2B拮抗剂,即在配制的剂量悬浮液中的4mg/kg化合物A,在手术之后立即开始以每12小时i.p.给予并持续14天。在手术之前进行经胸超声心动描记术,然后在7、14和28天后进行经胸超声心动描记术。小鼠的亚组在手术之后72小时死亡,并在心脏组织中测量到半胱天冬酶-1的活性(一种关键的前炎性介质)。
所有假手术的小鼠在4周时存活,然而42%的经载体治疗的小鼠及25%的化合物A在手术后4周期间死亡。与载体相比,使用化合物A的治疗显著地减少了半胱天冬酶-1的活性、舒张末期直径、和心肌功能指数,并增加了LV射血分数(图2)。
因此,本实施例证明了在小鼠中,使用选择性A2B拮抗剂(化合物A)选择性地阻断腺苷A2B受体限制了在心脏中的半胱天冬酶-1的激活,并致使在急性心肌梗塞之后更有利的心脏重塑。
实施例4:急性心肌梗塞之后A2B拮抗剂削弱心脏重塑
本实施例使用体内小鼠模型证明了通过拮抗剂选择性地阻断A2BAdoR降低心脏中的半胱天冬酶-1活性,致使在急性心肌梗塞(AMI)之后更有利的心脏重塑。
方法
实验性AMI模型
由Harlan Sprague Dawley(Indianapolis,IN)提供成年的杂交雄性CD1小鼠(年龄8-12周)。根据由国立卫生研究院(National Institutes of Health)出版用于生物医学研究的实验动物的指南(第85-23号,修订版1996)进行实验。研究方案经弗吉尼亚联邦大学公共动物保健和使用委员会(Virginia Commonwealth University Institutional Animal Care and UseCommittee)批准。实验性AMI通过诱发永久性冠状动脉结扎以引发涉及大约30%的左心室的较大非再灌注梗塞,从而致使局部缺血扩张型心肌病(Mezzaroma等Proc Natl Acad Sci2011(出版中)和Abbate等Circulation2008;117:2670-83)。简要地,小鼠在麻醉(戊巴比妥50至70mg/kg)下被气管内插管,以右侧卧位放置,然后进行左胸廓切开术、心包切除术、和近侧左冠状动脉结扎。胸腔闭合并且使得动物能够复原。将小鼠存活手术随机分配为不同的治疗组(N=6-15每组)。进行假手术,其中动物进行相同的外科程序而没有进行冠状动脉结扎(N=4-8每组)。图3中示出了本研究方案的时间轴。
治疗
A2B AdoR拮抗剂(化合物A)从Gilead Sciences,Foster City,CA获得。将小鼠随机分配为使用化合物A(4mg/kg)治疗或匹配腹膜内给予载体的剂量治疗(最终体积0.13mL),在冠状动脉结扎手术之后立即开始以每12小时一次给予持续14天。另一组小鼠接受较低剂量的化合物A(2mg/kg)以研究剂量-响应关系。另两组小鼠在手术之后1小时开始接受化合物A(4mg/kg)以模拟治疗延迟的临床情境。另外一组小鼠用0.13mL的NaCl0.9%治疗作为另外对照,然而,因为载体治疗的数据与NaCl治疗的那些数据区别不显著,所以本实施例中仅包含载体治疗的结果。为了模拟其中药物治疗可以与AMI之后的某种延迟一起发生的临床相关的情境,本实施例将使用化合物A而没有延迟的治疗与延迟1小时后给予A2BAdoR拮抗剂的组相比。
半胱天冬酶-1激活
小鼠的另外亚组在手术之后72小时死亡(N=4-6每治疗组)。如上所述摘除心脏。通过荧光底物(CaspACE,Promega,Madison,WI)的切割确定半胱天冬酶-1的组织活性(Abbate等Circulation2008;117:2670-83)。在使用包含蛋白酶抑制剂的混合物的RIPA缓冲液(Sigma Aldrich)均质化并以16,000rpm离心20分钟之后,根据供应商的使用说明将来自每一样本的75μg的蛋白质用于本试验。60分钟之后测量荧光,并且将荧光表示为由1微克样本每分钟产生的任何荧光单位(荧光/μg/min)并计算为与假手术小鼠的心脏的均匀混合物中的半胱天冬酶-1活性相比的倍数变化。
炎性浸润
为了量化AMI期间心脏中的炎性浸润,本实施例使用蛋白质印迹(Western Blot)测量心脏中CD45表达(白细胞的标记物)。在AMI之后72h收集的心脏在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Aldrich)的Ripa缓冲液(Sigma Aldrich,St Louis,MO)中均质化并以16,200x g离心20分钟。30微克的各样本在Laemmli缓冲液中稀释,使其在96℃下变性10分钟,并使用8%丙烯酰胺凝胶用SDS/PAGE溶解从而使蛋白质分离。将蛋白质转移至硝酸纤维膜上。在用磷酸盐缓冲液中的5%牛乳浸润之后,使用针对CD45培养的大鼠抗小鼠抗体(R&D system,Minneapolis,MN)温育膜。为了使蛋白质标准化,对使用b-肌动蛋白(Sigma Aldrich)加载单克隆抗体。增强的化学发光(ECL)试验和射线自显迹法用于检测对应CD45和b-肌动蛋白的频带。使用Scion Image软件通过光密度分析确定该频带的强度,并将该结果表示为与对照假手术样本相比的强度增长百分数。
细胞因子和可溶粘附分子的循环水平的测量
在手术之后第28天,根据制造商的使用说明,通过从Millipore(Billerica,MA)获得的Luminex试剂盒测定IL-1β和白介素-1(IL-6)的血浆浓度、由IL-1β诱导的肿瘤坏死因子α(TNF-α)和可溶粘附分子(E-选择蛋白、细胞间粘附分子-1[ICAM-1]和血管细胞粘附分子[VCAM])。在处死动物之前通过直接心脏穿刺立即获得血样。
超声心动描记术
所有小鼠在基线下(手术之前)并在手术之后(在死亡之前)7、14和28天进行经胸超声心动描记术。使用Vevo770成像系统(VisualSonicsInc,Toronto,Ontario,Canada)通过30-MHz探针进行超声心动描记术。心脏从胸骨旁短轴和顶部视图以B-模式图像化。如上所述(Abbate等Circulation2008;117:2670-83;Toldo等PloS One2011;6:e18102)并根据美国超声心电图学会(Gardin等J Am Soc Echocardiogr2002;15:272-90),本实施例测量在B-模式下的左心室(LV)舒张末期和LV收缩末期面积以及在M-模式下的LV舒张末期直径(LVEDD)、LV收缩末期直径(LVESD)、LV前壁舒张厚度(LVAWDT)和LV后壁舒张厚度(LVPWDT)。计算LV缩短分数(FS)、LV射血分数(EF)、LV质量和偏心率(LVEDD/LVPWDT比例)(Abbate et al.Circulation2008;117:2670-83;Toldo et al.PloS One2011;6:e18102;Gardin et al.J Am Soc Echocardiogr2002;15:272-90)。由顶部4-腔室视图记录反二尖瓣和左心室流出道多普勒谱,并且心肌功能指数计算为等容收缩与弛豫时间除以射血时间的比率(Tei et al.Am J Cardiol1995;26:357-366)。使用LV流出道流动的速度-时间积分(VTI)乘以LV流出道的面积计算LV心搏量,并通过将LV心搏量乘以心率计算心输出量(Abbate et al.Circulation2008;117:2670-83;Toldo et al.PloS One2011;6:e18102;Gardin et al.J Am Soc Echocardiogr2002;15:272-90)。通过测量在胸骨旁短轴线视图中心室部分,评估右心室(RV)增大,并使用M-模式并测量三尖瓣环平面收缩期运动(TAPSE)测量RV心脏收缩功能(Toldo et al.PloS One2011;6:e18102;Gardin et al.J Am Soc Echocardiogr2002;15:272-90)。盲化治疗分配,调查员进行并读取超声心电图。
梗塞面积评估
在28天的超声心电图之后,通过戊巴比妥过剂量和/或颈脱位法处死所有小鼠。移植心脏并固定在福尔马林10%中至少48小时。将心脏的中间第三(median third)的横截面切开,包含在石蜡中,切为5μm的滑片并用马森三色(Sigma-Aldrich)着色(Abbate et al.Circulation2008;117:2670-83)。使用计算机形态测量通过Image Pro Plus6.0软件确定纤维化和整个左心室的面积。
血液动力学测量
在小鼠的亚组(N=4每个组)中,手术之后1小时穿刺LV顶部,插入连接至压力传感器的Millar导管以测量LV峰值收缩压和心率(Toldo etal.PloS One2011;6:e18102)。
统计分析
在邦弗兰尼测试之后使用单向ANOVA分析组之间的差异。对重复测量使用随机效应ANOVA分析超声心电图数据的复量测量的改变以确定时间、组、时间分组(time-by-group)相互影响的主要效应。通过生成Kaplan-Meyer存活曲线并使用数理回归分析进行存活分析。使用用于Windows的SPSS15.0安装包(SPSS,Chicago,IL)进行计算。
结果
急性心肌梗塞过程中A2B AdoR拮抗性没有血液动力学效应
由于Ado为血管扩张剂,并且为了将由于次于A2B AdoR拮抗性的血液动力改变导致的重塑差异排除,本实施例测量用A2B AdoR拮抗剂化合物A治疗的小鼠和用载体治疗的小鼠中的左心室峰值收缩压(LVPSP)和心率(HR)。LVPSP在冠状动脉结扎之后1小时显著减少,但不受治疗影响(表1)。
表1.总结和血液动力学数据
在手术之后1小时记录血液动力学数据。
缩写:A2B AdoR=腺苷A2B受体;HR=心率;LV=左心室;LVSP=峰值LV收缩压;MI=心肌梗塞
*P<0.001对假手术
A2B AdoR拮抗性抑制半胱天冬酶-1激活及炎症
半胱天冬酶-1激活是响应于局部缺血损伤的关键前炎性机制的部分。使用化合物A的治疗在AMI过程中预防心脏中半胱天冬酶-1激活(图4)。通过在AMI之后72小时用化合物A治疗,以在蛋白质印迹下的CD45表达测量的白细胞(CD45+)浸润的强度也显著减少(图4)。半胱天冬酶-1活化导致活性IL-1β的处理和释放,活性IL-1β通常以非常低的组织浓度存在并通过诱导次级细胞因子及粘附分子表达迅速扩大炎性反应。IL-1β血浆水平在除2只患有AMI的小鼠之外的所有小鼠中都未检测到,而次级细胞因子(即,IL-6)的血浆水平在AMI手术之后的28天增加(图5)。使用化合物A的治疗显著降低了IL-6、TNF-α、E-选择蛋白、ICAM-1及VCAM血浆水平(图5)。
A2B AdoR拮抗性对冠状动脉结扎手术之后存活的影响
经假手术的小鼠都未死亡。经载体治疗的小鼠的一半(50%)存活至冠状动脉结扎手术之后的28天(P<0.001对假手术),然而用化合物A治疗的小鼠的75%存活(P=0.14)。
A2B AdoR拮抗性对心脏重塑的影响
使用经胸超声心动描记术非侵入地测量心脏重塑。图6中示出了B模式和M模式记录的实例。在手术时起每12小时给予化合物A致使在第7天左心室和右心室增大和机能障碍的明显减少,这在第14天和第28天、给予最终剂量的药物之后的第14天(图7)仍保持。在第28天,通过化合物A,AMI之后的LV增大减少大约40%。LV收缩功能在化合物A组中也显著较大(在平均LVEF中绝对差异为5%)。心脏重塑的减弱与心肌舒张/收缩性能(心肌功能指数)类似(图7A-F)。用化合物A治疗的小鼠的心脏也示出较少的右心室增大和机能障碍(图7A-F)。
已知心肌缺血和伴随的细胞损伤引起细胞内含物的释放,这引起进一步促进机能障碍和心力衰竭的无菌炎性反应。本研究第一次示出了对Ado结合至A2B AdoR的抑制限制了炎性反应并致使更有利的心脏重塑。
实际上在组织缺氧和局部缺血的过程中Ado快速释放并快速结合至普遍存在的特异性G蛋白结合受体(AdoR)。AdoR存在4种亚型。它们是:A1AdoR,大部分在心脏中表达并调节导电;A3AdoR,在啮齿动物的肥大细胞中表达并调节小鼠中的激活及脱粒作用;而A2A AdoR和A2B AdoR已与血管紧张度和炎症相关。A2AAdoR是表达在各种细胞类型(包括内皮细胞、白细胞及向心肌细胞)的膜上的高亲和力AdoR。A2B AdoR是低亲和力受体,其有时以低数量在表达A2A AdoR的相同细胞中共表达,因此认为至少在不受应力的条件下最低程度地与在这些细胞中的Ado信号化相关。尽管A2A AdoR和A2B AdoR G蛋白结合受体可以通过腺嘌呤环化酶信号化,A2B AdoR也通过磷脂酶C和小GTP-结合蛋白p21ras信号化,其涉及包括p38丝裂原激活磷酸激酶(MAPK)和胞外信号调节激酶(ERK)的炎性信号化。重要地,A2B AdoR的表达取决于缺氧诱发因子α(HIF-α)的稳定化,由此对缺氧和炎症高度敏感。
因此,在不受应力的条件下通过A2B AdoR的Ado信号化不太重要,在组织损伤的背景下A2B AdoR可能发挥重大的作用。
本实施例示出了如由半胱天冬酶-1活性几乎完全减少所反映的在梗塞过程中使用化合物A选择性阻断A2B AdoR钝化的炎性反应,AMI过程初期浸润炎性细胞的显著减少、以及AMI之后28天血浆细胞因子和粘附分子的显著减少。半胱天冬酶-1是炎性体的酶促活性组分,即发挥‘危险’感测器功能并且涉及成熟IL-1β处理和细胞死亡的大分子结构。心脏中炎性体的形成和半胱天冬酶-1的激活导致心力衰竭。通过选择性阻断A2B AdoR,心脏中半胱天冬酶-1活性显著降低,与A2B AdoR的前炎性信号化一致。然而,心肌缺血中A2B AdoR的作用备受争议。由于缺血/再灌注的急性心肌损伤模型中,Ado一致地产生缺血预处理的有益效果。当通过A2B AdoR的信号化被打断时,Ado的预处理类效应消除。然而,在这种模型,在没有缺血预处理的情况下A2B AdoR的阻断对心脏没有影响。这暗示了当其可以介导预处理的一些方面时,A2B AdoR信号化不是固有地保护性的,并不太可能是预处理的唯一介导物。
在较大的非再灌注心肌梗塞的当前小鼠模型中,A2B AdoR拮抗性显著地限制左心室增大以及收缩和舒张机能障碍。A2B AdoR的保护作用与对梗塞尺寸的影响无关。由此可见,在大鼠中非再灌注的心肌梗塞中,腺苷对梗塞尺寸没有影响。
在此非再灌注的心肌梗塞模型中,心脏重塑是整体性的,并且包括梗塞区和边界区以及未受影响的远左心室和远右心室。阻断A2B AdoR显现出对梗塞尺寸没有影响,然而A2B AdoR阻断显示保护边界区和远心肌层,如通过左心室和右心室尺寸增加以及重要地LV功能的改善所证明的。
在心脏中半胱天冬酶-1活性的降低和更有利的心脏重塑的发现,确定了在对心肌缺血的心肌响应中半胱天冬酶-1的中心作用。在小鼠心脏中半胱天冬酶-1的过表达导致较大面积的缺血损伤,更严重的心脏增大以及AMI之后降低的存活率;然而,在AMI之后,缺乏半胱天冬酶-1的小鼠受到保护。
这些数据表明,心肌缺血之后的梗塞复原中,A2B AdoR具有明显的前炎性和有害作用。
总之,在非再灌注心肌梗塞的小鼠模型中,在缺血发作之后通过给予化合物A选择性阻断A2B AdoR降低心脏中半胱天冬酶-1活性并致使AMI之后更有利的心脏重塑。
实施例5:化合物A在心肌梗塞的小鼠模型中的效果
给予6周龄的ob/ob模型小鼠A2B拮抗剂(化合物A)(3mg/kg/天或者10mg/kg/天)持续28天。在28天的剂量结束时,与对照(载体)相比,测量在这些小鼠中多种炎性生物标记物,即MCP-1、IL-1b、IL-2和IL-6的表达。
如图8A-D所示,四种炎性生物标记物的表达降低,对于它们中的两个—MCP-1和IL-1b,10mg/kg/天的组的降低具有统计显著性。这些数据证明A2B拮抗剂(化合物A)抑制经治疗的动物的炎症。
也确定了心肌梗塞的小鼠模型中化合物A的影响。将雄性小鼠进行永久冠状动脉结扎或假手术。在手术之后立即或者1小时后开始i.p.BID给予化合物A(4mg/kg)并持续14天。在手术之前和在7、14和28天之后进行经胸ECHO以测量LV舒张末期/收缩末期直径(LVEDD或者LVESD)、RV舒张末期面积(RVEDA)和心肌功能指数(MPI)。在MI之后28天进行组织炎症和损伤的生物标记物的分析。
所有经假手术的小鼠在4周存活。42%的经载体治疗的患有MI的小鼠在4周过程中死亡。相反,经化合物A治疗的患有MI的小鼠的死亡率仅为25%。
与假手术小鼠相比,如通过LVEDD和LVESD、RVEDA和MPI的显著增加证明的,患有MI的小鼠发展不利的组织重塑和减弱的心肌功能(图9A-D)。手术之后立即或者1小时后使用化合物A治疗显著降低LV/RV尺寸并降低MPI,意味着在患有MI的小鼠中化合物A抑制不利的心肌重塑并改善心肌功能。化合物A没有影响假手术小鼠中的心肌重塑/功能。
在MI后第28天分析炎症和心肌损伤的血浆生物标记物。与假手术的小鼠相比,患有MI的小鼠中IL-6、TNF-α和ST2的血浆浓度显著增加。在手术之后立即使用化合物A治疗显著降低患有MI的小鼠中所有血浆生物标记物的浓度(图10A-C)。化合物A没有影响假手术小鼠的血浆生物标记物。在心血管病中,诸如sE-选择蛋白、sICAM和sVCAM的可溶细胞粘着分子(CAM)是炎性过程中重要的循环生物标记物。使用化合物A的治疗显著抑制患有MI的小鼠中可溶细胞粘着分子的血浆水平的增加(图11A-C)。
总之,这些结果表明在MI后重塑的小鼠模型中,使用化合物A的治疗显著改善心肌功能、降低炎性循环生物标记物,因此降低死亡率。
实施例6:化合物A的潜伏期评估
本实施例包括示出了在护理心肌梗塞(MI)后动物中化合物A的疗效的各种潜伏期实验。
心肌梗塞(MI)后重塑和室性心动过速(VT)的大鼠模型
确定MI后重塑和VT的大鼠模型中化合物A的影响。由在左前降支冠状动脉结扎之后再灌注处闭塞25分钟引起MI。一周以后,通过口服填喂以每天一次给予大鼠载体或者化合物A(100mg/kg)。在基线、MI后1周和5周获得用于测定LV射血分数(LVEF)、心搏量和LV收缩末期容量(LVESV)的系列超声心电图(ECHO)。在MI后5周进行电生理学研究、光学映像(mapping)、组织学、和生物标记物分析。
在基线、MI后1周和5周获得的ECHO示出了MI大鼠中包括LV射血分数和心搏量的明显减少以及LV收缩末期容量的明显增加的逐渐LV重塑的证据。在此模型中,已经一致地观察到LVEF在MI后1周至5周进一步降低。与此一致,在本研究中,LVEF从在MI后1周的56.0±2.1%降低至在MI后5周的40.7±2.2%。相反,用化合物A治疗的动物中,LVEF从53.1±3.2%稍微增加至55.6±2.6%(图12B)。此外,化合物A显著降低了LVESV的增加(图12A)。所有这些结果表明,化合物A显著地改善了MI后大鼠的心脏功能和重塑。相反,不是A2B拮抗剂但已显示能够缓解左心室纤维化的吡非尼酮没有增加LVESV,而是仅稍微抑制了其进一步减少(图12B)。
即使使用目前的冠状血管再生治疗,室性心动过速(VT)也是MI后患者死亡的常见原因。在此MI后重塑的大鼠模型中,在一大半动物中VT是一致地可诱导的。因此,测定了在MI后5周时化合物A对VT诱导性的影响。如表3所示,在载体对照中,VT诱导率是54%(11个中有6个);然而化合物A将VT诱导显著降低至9%(11个中有1个)。
表3.MI后重塑的大鼠模型中的VT诱导性
*与使用卡方检验的载体相比,P<0.05。
在梗塞边界区(IBZ)中的异常电脉冲传导在MI后心律不齐的发病机理中是重要的。如传导矢量图所示(图13A-B),载体对照组具有比经化合物A治疗的动物慢得多的传导速度。为了量化化合物A对传导性质的影响,针对梗塞、边界和LV心肌层的正常区测量传导速度(CV)。正常区的CV在所有区中最快,并在安慰剂组和化合物A组之间相似(图14A)。此外,安慰剂对照的梗塞区中的CV是所有区中最慢的,并通过化合物A显著地改善(图14C)。最后,两组的IBZ中的CV处于非梗塞区和梗塞区之间。然而,化合物A组的IBZ中的CV比安慰剂对照IBZ的CV明显更快(图14B)。
IBZ中的异常传导是由于组织重塑。IBZ中的过量纤维化是VT易损性的重要基质。如图15A-B中所示,载体对照IBZ的分析显示从梗塞区至IBZ的纤维化的更多不同种类的不协调的突出。这些纤维化突出在经化合物A治疗的组的IBZ中较少,表明化合物A抑制与改善的传导速度相关的IBZ中的纤维化,这可以解释VT诱导性的显著降低。
在MI后5周分析炎症的血浆生物标记物(IL-6)和组织损伤的血浆生物标记物(BNP和PAI-1)。与常规大鼠相比,MI后大鼠的IL-6和PAI-1的血浆浓度显著增加。化合物A的治疗显著地降低在MI后大鼠中的所有这些血浆生物标记物。另外,存在化合物A抑制MI后大鼠的BNP(P=0.16)增加的趋势。(图16A-C)
进一步,本实例使用临床相关的治疗计划,其中在再灌注治疗之后给药,并且已建立了LV机能障碍。此外,使用诸如左心室收缩末期容量和LVEF的临床相关端点测量治疗的影响。
在MI后重塑的大鼠模型中的研究结果表明化合物A的治疗显著改善心肌功能并降低VT易损性。这很可能是由于减少炎性介导物并抑制在缺血心肌层的边界区中的纤维化。
实施例7:其它A2B腺苷受体拮抗剂
本实施例使用人类心脏肌细胞测试两种其它A2B腺苷受体拮抗剂对NECA诱导的IL-6释放的影响。
用单独的NECA或者结合化合物A、化合物B(N-[5-(1-环丙基-2,6-二氧代-3-丙基-2,3,6,7-四氢-1H-嘌呤-8-基)-吡啶-2-基]-N-乙基-尼克酰胺,也被称为ATL-801)或化合物C(2-(4-苄氧基-苯基)-N-[5-(2,6-二氧代-1,3-二丙基-2,3,6,7-四氢-1H-嘌呤-8-基)-1-甲基-1H-吡唑-3-基]-乙酰胺)治疗人类心脏肌细胞(HCM)。如图17所示,NECA显著增加由人类心脏肌细胞(HCM)的IL-6释放。然而,通过每种测试的A2B AdoR拮抗剂,即化合物A、化合物B、和化合物C完全消除了NECA对HCM的影响。
因此,该实施例证明了A2B AdoR拮抗剂总体具有抑制NECA诱导的由人类心脏肌细胞的IL-6释放的能力。
应理解,尽管未明确地在本文中描述或示出,本领域中的技术人员将能够想到各种体现本公开的原理的设置,并且该设置包含在本公开的精神和范围内。此外,在本文中引用的所有条件性语言主要意在帮助读者理解本公开的原理以及由本发明人提出的构思以深入本领域,而不应解释为将本公开限制在这种具体引用的条件内。而且,在本文中引用的本公开的原理、方面和实施方式的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等价物两者。另外地,希望这种等价物包括目前已知的等价物和将来发展的等价物两者,即不考虑结构而开发以进行相同功能的任何要素。因此,本公开的范围不旨在限于在本文中所示和描述的示例性实施方式。相反,本公开的范围和精神通过所附加的权利要求体现。
Claims (29)
1.一种治疗已患有心肌梗塞(MI)的患者中的心力衰竭和/或心律不齐的方法,包括给予所述患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,通过治疗所述心力衰竭和/或心律不齐减少死亡或住院。
3.一种降低已患有心肌梗塞(MI)的患者中的心力衰竭的进展的方法,包括给予所述患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
4.一种降低已患有心肌梗塞(MI)的患者中的心律不齐的方法,包括给予所述患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
5.一种降低已患有心肌梗塞(MI)的患者中的心脏性猝死的发病率的方法,包括给予所述患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
6.一种增加已患有心肌梗塞(MI)的患者中的左心室射血分数(LVEF)的方法,包括给予所述患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
7.一种抑制已患有心肌梗塞(MI)的患者中的左心室增大的方法,包括给予所述患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
8.一种降低已患有心肌梗塞(MI)的患者中的左心室收缩末期容量的方法,包括给予所述患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
9.一种降低已患有心肌梗塞(MI)的患者中的左心室舒张末期容量的方法,包括给予所述患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
10.一种改善已患有心肌梗塞(MI)的患者中的左心室机能障碍的方法,包括给予所述患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
11.一种改善已患有心肌梗塞(MI)的患者中的心肌收缩性的方法,包括给予所述患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
12.一种减少由已患有心肌梗塞(MI)的患者的心脏细胞释放IL-6、TNFa、BNP、或ST2(致瘤性2的抑制)的方法,包括给予所述患者治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
13.根据权利要求1至12中的任一项所述的方法,其中,所述A2B腺苷受体拮抗剂是8-环黄嘌呤衍生物。
14.根据权利要求1至12中的任一项所述的方法,其中,所述A2B腺苷受体拮抗剂是以下式I或II的化合物或者它们的药用盐、互变异构体、异构体、异构体的混合物或前药:
其中:
R1和R2独立地选自氢、可选地取代的烷基、或基团-D-E,其中,D是共价键或亚烷基,并且E是可选地取代的烷氧基、可选地取代的环烷基、可选地取代的芳基、可选地取代的杂芳基、可选地取代的杂环基、可选地取代的烯基、或可选地取代的炔基;
R3是氢、可选地取代的烷基、或可选地取代的环烷基;
X是可选地取代的亚芳基或可选地取代的杂亚芳基;
Y是共价键或其中一个碳原子可以被-O-、-S-、或-NH-可选地替代的亚烷基,并且Y可选地被羟基、烷氧基、可选地取代的氨基、或-COR取代,其中R是羟基、烷氧基、或氨基;以及
Z是可选地取代的单环芳基或可选地取代的单环杂芳基;或者当X是可选地取代的杂亚芳基且Y是共价键时,Z是氢。
15.根据权利要求1至12中的任一项所述的方法,其中,所述A2B腺苷受体拮抗剂具有以下化学式的化合物或者其药用盐、互变异构体、异构体、或异构体的混合物:
并且其名称为3-乙基-1-丙基-8-(1-(3-(三氟甲基)苯甲基)-1H-吡唑-4-基)-1H-嘌呤-2,6(3H,7H)-二酮或3-乙基-1-丙基-8-(1-((3-(三氟甲基)苯基)甲基)吡唑-4-基)-1,3,7-三氢嘌呤-2,6-二酮。
16.根据权利要求1至12中的任一项所述的方法,其中,所述A2B腺苷受体拮抗剂是N-[5-(1-环丙基-2,6-二氧代-3-丙基-2,3,6,7-四氢-1H-嘌呤-8-基)-吡啶-2-基]-N-乙基-尼克酰胺。
17.根据权利要求1至12中的任一项所述的方法,其中,所述A2B腺苷受体拮抗剂是(2-(4-苄氧基-苯基)-N-[5-(2,6-二氧代-1,3-二丙基-2,3,6,7-四氢-1H-嘌呤-8-基)-1-甲基-1H-吡唑-3-基]-乙酰胺。
18.根据权利要求1至17中的任一项所述的方法,其中,所述MI是急性MI。
19.根据权利要求18所述的方法,其中,所述MI是ST抬高MI(STEMI)或非ST抬高MI(NSTEMI)。
20.根据权利要求1至19中的任一项所述的方法,其中,所述患者是血液动力学稳定的。
21.根据权利要求1至20中的任一项所述的方法,其中,在所述MI期间或在所述MI之后立即开始给予所述A2B腺苷受体拮抗剂。
22.根据权利要求1至20中的任一项所述的方法,其中,在所述MI后至少约24小时之后开始给予所述A2B腺苷受体拮抗剂。
23.根据权利要求22所述的方法,其中,在所述MI后至少约3天之后开始给予所述A2B腺苷受体拮抗剂。
24.根据权利要求22所述的方法,其中,在所述MI后至少约5天之后开始给予所述A2B腺苷受体拮抗剂。
25.根据权利要求22所述的方法,其中,在所述MI后至少约7天之后开始给予所述A2B腺苷受体拮抗剂。
26.根据权利要求1至25中的任一项所述的方法,进一步包括向所述患者给予血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂。
27.根据前述权利要求中的任一项所述的方法,其中,所述ACE抑制剂选自由卡托普利、依那普利、赖诺普利、培哚普利、和雷米普利组成的组。
28.根据前述权利要求中的任一项所述的方法,其中,所述患者是人。
29.根据前述权利要求中的任一项所述的方法,其中,所述给予是全身的、口服的、静脉内的、肌内的、腹膜内的、或者通过吸入。
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