PT2073805E - Métodos para doseamento de um 1,2,4-oxadiazole oralmente ativo para terapia de supressão de mutações sem sentido - Google Patents

Métodos para doseamento de um 1,2,4-oxadiazole oralmente ativo para terapia de supressão de mutações sem sentido Download PDF

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PT2073805E
PT2073805E PT78527389T PT07852738T PT2073805E PT 2073805 E PT2073805 E PT 2073805E PT 78527389 T PT78527389 T PT 78527389T PT 07852738 T PT07852738 T PT 07852738T PT 2073805 E PT2073805 E PT 2073805E
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fluorophenyl
benzoic acid
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PT78527389T
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Samit Hirawat
Langdon Miller
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Ptc Therapeutics Inc
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Description

DESCRIÇÃO "Métodos para doseamento de vim 1,2,4-oxadiazole oralmente ativo para terapia de supressão de mutações sem sentido"
Este pedido de patente revindica o benefício do pedido de patente provisório dos E.U.A. n.2 60/851450, depositado em 12 de Outubro de 2006. 1. Campo do invento O presente invento refere-se a doses específicas de, e regimes de doseamento para, utilização de um composto de ácido 1,2,4-oxadiazol-benzóico no tratamento ou prevenção de doenças associadas a mutações sem sentido. Em particular, o invento refere-se a doses específicas e a regimes de doseamento para a utilização de ácido 3-[5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico em mamíferos possuindo fibrose cística ou distrofia muscular de Duchenne. 2. Antecedentes do invento
Uma nova classe de compostos de 1,2,4-oxadiazole e a sua utilização para tratar, prevenir ou gerir doenças amenizadas por modulação da terminação prematura da tradução ou decaimento de ARNm mediado sem sentido é descrita na Patente dos E.U.A. N.2 6992096 Bl, concedida em 31 de Janeiro de 2006, intitulada "1,2,4-Oxadiazole Benzoic Acid Compounds and Their Use For Nonsense Suppression and the Treatment of Disease" . A WO 2004/091502 A2 revela novos compostos de ácido 1,2,4-oxadiazol-benzóico e sua utilização no tratamento ou prevenção de uma doença amenizada por modulação da terminação prematura da tradução ou decaimento de ARNm mediado sem sentido, ou amenização de um ou mais sintomas associados à mesma. A US 2006/0148863 AI revela compostos de ácido 1,2,4-oxadiazol-benzóico e sua utilização no tratamento ou prevenção de uma doença amenizada por modulação da terminação prematura da tradução ou decaimento de ARNm mediado sem sentido, ou também amenização de um ou mais sintomas associados à mesma. A WO 2006/110483 AI revela doses específicas e regimes de doseamento para utilização de um composto de ácido 1,2,4-oxadiazol-benzóico, em particular ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico, no tratamento ou prevenção de doenças associadas a mutações sem sentido. Um destes compostos é o ácido 3-[5- (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]- benzóico. Tal como com todos os fármacos, as doses e regimes de doseamento apropriados para tratar pacientes com doenças tais como fibrose cística e distrofia muscular de Duchenne são essenciais para conseguir um efeito terapêutico desejado ou ótimo sem efeitos adversos ou indesejados.
Por conseguinte, existe uma necessidade de doses e regimes de doseamento seguros, eficazes e não tóxicos que previnam ou reduzam quaisquer efeitos adversos ou indesejados ou proporcionem um efeito terapêutico ótimo ou ambos, isto é, proporcionem um perfil terapêutico desejável. 3. Sumário do invento 0 invento refere-se a ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato para utilização num método para tratar, prevenir ou gerir uma doença associada à ausência de expressão de um gene resultante de um codão de paragem prematura, onde a referida doença é fibrose cística ou distrofia muscular de Duchenne, onde o referido método compreende a administração em três doses diárias, onde uma primeira dose, uma segunda dose e uma terceira dose são administradas num período de 24 horas de acordo com a fórmula IX, IX, 2X, onde X é 18-22 mg/kg, onde cada dose mantém o nível plasmático de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico superior a 2 pg/ml durante pelo menos 2 horas. São aqui descritos regimes de doseamento onde doses específicas de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato são administradas a intervalos de tempo específicos para modular a terminação prematura da tradução ou decaimento de ARNm mediado sem sentido, ou amenizar um ou mais sintomas associados às mesmas, ao mesmo tempo reduzindo ou evitando efeitos adversos ou efeitos indesejados. São ainda reveladas doses específicas e formas de unidade de dosagem de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato. São aqui descritos métodos para administrar a um paciente necessitado do mesmo uma quantidade eficaz de ácido 3— [5— (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato uma, duas ou três vezes no decurso de um período de 24 horas. São também descritos métodos para administrar a um paciente necessitado do mesmo uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2-fluorofenil) -[ 1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato uma, duas ou três vezes no decurso de um período de 24 horas. A dose para cada administração durante um período de 24 horas pode ser a mesma ou diferente. Como aqui revelado, quando administrada três vezes num período de 24 horas, a dose nas duas primeiras administrações é a mesma e a terceira dose é duas vezes a primeira dose. Alternativamente, todas as três doses são iguais. São aqui descritos métodos para tratar, prevenir ou gerir uma doença amenizada por modulação da terminação prematura da tradução ou decaimento de ARNm mediado sem sentido compreendendo administrar a um paciente necessitado do mesmo uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2-fluorofenil) - [1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato uma, duas ou três vezes no decurso de um período de 24 horas. Preferivelmente, a administração é efetuada três vezes por dia continuamente, ou com um período de repouso, durante um certo número de dias, semanas, meses ou anos. Métodos para tratar, prevenir ou gerir uma doença amenizada por modulação da terminação prematura da tradução ou decaimento de ARNm mediado sem sentido compreendendo administrar a um paciente necessitado do mesmo uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-l-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato uma, duas ou três vezes no decurso de um período de 24 horas. Preferivelmente, a administração é efetuada três vezes por dia continuamente, ou com um período de repouso, durante um certo número de dias, semanas, meses ou anos. É aqui descrito um método para tratar, prevenir ou reduzir a tosse, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato a um paciente necessitado do mesmo. É também aqui descrito um método para aumentar a expressão de distrofina no músculo, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato a um paciente necessitado do mesmo. É também aqui descrito um método de administração de ácido 3-[ 5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato onde o agente ativo é administrado a um paciente necessitado do mesmo uma, duas ou três vezes num período de 24 horas, onde cada administração é preferivelmente separada por cerca de 4-14 horas. Numa concretização particular, a dose de agente ativo é aumentada desde a primeira até à terceira dose. É também aqui descrita uma terapia contínua onde ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é administrado a um paciente necessitado do mesmo durante um certo período de tempo (e.g., 5, 7, 10, 14, 20, 24, 28, 60 ou 120 dias ou mais). É também aqui descrita a administração de ácido 3—[5— (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato em doses únicas ou divididas (e.g., três vezes ao dia) entre 0,1 mg/kg e 500 mg/kg, 1 mg/kg e 250 mg/kg, 1 mg/kg e 150 mg/kg, 1 mg/kg e 100 mg/kg, 1 mg/kg e 50 mg/kg, 1 mg/kg e 25 mg/kg, 1 mg/kg e 10 mg/kg ou 2 mg/kg e 10 mg/kg a um paciente necessitado do mesmo. Particularmente, o ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é administrado numa dose de cerca de 4 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 14 mg/kg ou cerca de 20 mg/kg. Alternativamente, qualquer dose do ácido 3-[5-(2- fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato descrita na concretização precedente é administrada uma, duas ou três vezes num período de 24 horas. São também aqui descritas formulações de unidade de dosagem que compreendem entre cerca de 35 mg e cerca de 1400 mg, cerca de 125 mg e cerca de 1000 mg, cerca de 250 mg e cerca de 1000 mg, ou cerca de 500 mg e cerca de 1000 mg de ácido 3-[ 5- (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato. São também aqui descritas formulações de unidade de dosagem que compreendem 35 mg, 50 mg, 70 mg, 100 mg, 125 mg, 140 mg, 175 mg, 200 mg, 250 mg, 280 mg, 350 mg, 500 mg, 560 mg, 700 mg, 750 mg, 1000 mg ou 1400 mg de ácido 3— [5— (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato.
Preferivelmente são aqui descritas formulações de unidade de dosagem que compreendem 125 mg, 250 mg ou 1000 mg de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato. Alternativamente é aqui descrito um método para manter uma concentração plasmática de ácido 3—[5— (2 — fluorofenil)[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato superior a cerca de 0,1 pg/ml, 0,5 pg/ml, 1 pg/ml, 2 pg/ml, cerca de 5 pg/ml, cerca de 10 pg/ml, cerca de 20 pg/ml, cerca de 25 pg/ml, cerca de 40 pg/ml, cerca de 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 300 pg/ml, 400 pg/ml, ou 500 pg/ml num paciente durante pelo menos cerca de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas ou mais, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato a um paciente necessitado do mesmo. 4. Descrição detalhada 4.1 Breve descrição dos desenhos A FIG. 1 proporciona os perfis de concentração plasmática de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico em função do tempo e os parâmetros PK a partir de 37 de 38 pacientes num estudo de distrofia muscular de Duchenne de Fase 2 com niveis de dose de 4, 4 e 8 mg/kg; 10, 10 e 20 mg/kg; e 20, 20 e 40 mg/kg. Os dados de um paciente foram excluídos da análise devido a dados insuficientes. A FIG. 2 proporciona o efeito sobre a frequência de tosse média durante 24 horas pela administração de ácido 3—[5— (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico a um sujeito. Estes dados indicam que a administração de ácido 3— [5— (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico proporciona uma melhoria inicial na frequência de tosse média, seguindo-se um aumento temporário na frequência de tosse média, seguindo-se uma melhoria global na frequência de tosse média. 4.2 Definições
Como aqui utilizado, "terminação prematura da tradução" refere-se ao resultado de uma mutação que altera um codão correspondente a um aminoácido para um codão de paragem.
Como aqui utilizado, "decaimento de ARNm mediado sem sentido" refere-se a qualquer mecanismo que medeia o decaimento de ARNm contendo um codão de terminação prematura da tradução. Numa concretização particular, o decaimento de ARNm mediado sem sentido resulta de uma mutação de ADN sem sentido.
Como aqui utilizado, um "codão de terminação prematura" ou "codão de paragem prematura" refere-se à ocorrência de um codão de paragem onde deveria estar um codão correspondente a um aminoácido.
Como aqui utilizado, uma "mutação sem sentido" é uma mutação pontual alterando um codão correspondente a um aminoácido para um codão de paragem. Numa concretização particular, a mutação sem sentido é uma mutação que ocorre em ADN e é depois transcrita para ARNm.
Como aqui utilizado, "supressão sem sentido" refere-se à inibição ou supressão da terminação prematura da tradução e/ou do decaimento de ARNm mediado sem sentido. Numa concretização particular, o decaimento de ARNm resulta de uma mutação sem sentido de ADN.
Como aqui utilizado, "modulação da terminação prematura da tradução e/ou decaimento de ARNm mediado sem sentido" refere-se à regulação da expressão génica por alteração do nivel de supressão sem sentido. Por exemplo, se é desejável aumentar a produção de uma proteína deficiente codificada por um gene com um codão de paragem prematura, i.e., para permitir a leitura do codão de paragem prematura do gene da doença de modo a que a tradução do gene possa ocorrer, então a modulação da terminação prematura da tradução e/ou decaimento de ARNm mediado sem sentido implica regulação ascendente da supressão sem sentido.
Como aqui utilizado, os termos "efeito(s) adverso(s)" ou "efeito(s) secundário(s)" incluem náusea, vómito, diarreia, dor de cabeça, alanina-amidotransferase (ALT) sérica elevada, aspartato-aminotransferase (AST) sérica elevada, tonturas, creatina-quinase (CK) sérica elevada, dor abdominal, gás abdominal, dor ocular, inchaço ocular, ardor ocular, sensibilidade dos mamilos, sensibilidade mamária, dor músculo-esquelética no peito, erupção cutânea, prurido, nódulo linfático submaxilar doloroso, lactato-desidrogenase (LDH) sérica elevada, aldolase sérica elevada e triglicéridos séricos elevados.
Como aqui utilizados, os termos "agente ativo", "fármaco" e "substância de fármaco" referem-se a ácido 3—[5—(2— fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato.
Como aqui utilizado, o termo "dose(s)" significa uma quantidade de agente ativo para ser administrada de uma vez.
Como aqui utilizado, o termo "forma(s) de unidade de dosagem" inclui comprimidos; caplets; cápsulas, tais como cápsulas de gelatina elástica mole; saquetas; hóstias; trociscos; pastilhas; dispersões; pós; soluções; géis; formas de dosagem liquida adequada para administração oral ou à mucosa a um paciente, incluindo suspensões (e.g., suspensões líquidas aquosas ou não aquosas), emulsões (e.g., emulsões de óleo-em- água, ou uma emulsão líquida de água-em-óleo), soluções e elixires; e sólidos estéreis (e.g., sólidos cristalinos ou amorfos) que podem ser reconstituídos para proporcionar formas de dosagem líquidas adequadas para administração oral ou parentérica a um paciente. A forma de unidade de dosagem não tem necessariamente que ser administrada como uma dose única.
Como aqui utilizados, os termos "regime de doseamento" e "dosagem(ens)" significam a quantidade do agente ativo dada por unidade de tempo e a duração de administração.
Como aqui utilizado, o termo "paciente" significa um animal (e.g., vaca, cavalo, ovelha, porco, galinha, peru, codorniz, gato, cão, ratinho, rato, coelho, porquinho-da-índia, etc.), preferivelmente um mamífero tal como um não primata e um primata (e.g., macaco e humano), muito preferivelmente um humano. Especificamente, o paciente é um feto, embrião, bebé, criança, adolescente ou adulto. Especificamente, foi determinado através de pré-rastreio que o paciente possui uma mutação sem sentido. Mais especificamente, determinou-se através de pré-rastreio qual a mutação sem sentido que o paciente tem (i.e., UAA, UGA ou UAG) .
Como aqui utilizado, uma "quantidade eficaz" refere-se aquela quantidade de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato suficiente para proporcionar um benefício terapêutico no tratamento ou gestão da doença ou para retardar ou minimizar os sintomas associados à doença. Numa concretização, o termo "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato suficiente para conseguir um nível plasmático desejado durante um certo período de tempo. Quantidades eficazes preferidas são aqui especificamente descritas.
Como aqui utilizados, os termos "gerir", "gerindo" e "gestão" referem-se aos efeitos benéficos que um paciente obtém da administração de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato, que não resultam numa cura da doença.
Como aqui utilizados, os termos "prevenir", "prevenindo" e "prevenção" referem-se à prevenção do aparecimento, recorrência, disseminação ou agravamento da doença ou de um seu sintoma num paciente resultantes da administração de ácido 3-[5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato. Porque as doenças associadas a uma mutação sem sentido podem ser genéticas, um paciente pode ser rastreado quanto à presença de uma mutação sem sentido. No caso em que através de rastreio se determina que um paciente tem uma mutação sem sentido, uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato pode ser administrada ao paciente para prevenir o aparecimento, recorrência, disseminação ou agravamento da doença ou de um seu sintoma.
Como aqui utilizados, os termos "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se à erradicação ou amenização da doença ou sintomas associados à doença. Especificamente, estes termos referem-se à minimização da disseminação ou agravamento da doença resultante da administração de ácido 3—[5—(2— fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato a um paciente com uma tal doença.
Como aqui utilizado, o termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais preparados a partir de ácidos ou bases não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis incluindo ácidos e bases inorgânicos e ácidos e bases orgânicos. Sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis adequados para ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[l,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico incluem sais metálicos produzidos a partir de alumínio, cálcio, lítio, magnésio, potássio, sódio e zinco ou sais orgânicos produzidos a partir de lisina, N,N'-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, meglumina (N-metilglucamina) e procaína. Ácidos não tóxicos adequados incluem ácidos inorgânicos e orgânicos tais como ácido acético, algínico, antranílico, benzenossulfónico, benzóico, canforsulfónico, cítrico, etenossulfónico, fórmico, fumárico, furóico, galacturónico, glucónico, glucurónico, glutâmico, glicólico, bromídrico, clorídrico, isetiónico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanossulfónico, múcico, nítrico, pamóico, pantoténico, fenilacético, fosfórico, propiónico, salicílico, esteárico, sucínico, sulfanílico, sulfúrico, tartárico e p-toluenossulfónico. Ácidos não tóxicos específicos incluem ácidos clorídrico, bromídrico, fosfórico, sulfúrico e metanossulfónico. Exemplos de sais específicos incluem assim sais de cloridrato e mesilato. Outros exemplos de sais são bem conhecidos na especialidade, ver, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed., Mack Publishing, Easton PA (1990).
Como aqui utilizado, o termo "hidrato" significa ácido 3-[5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, que inclui adicionalmente uma quantidade estequiométrica ou não estequiométrica de água ligada por forças intermoleculares não covalentes.
Como aqui utilizado, o termo "solvato" significa ácido 3-[5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, que inclui adicionalmente uma quantidade estequiométrica ou não estequiométrica de um solvente ligado por forças intermoleculares não covalentes. 4.3 Doenças associadas com a terminação prematura da tradução São aqui descritos métodos para tratar, prevenir ou gerir doenças ou perturbações amenizadas pela supressão da terminação prematura da tradução e/ou decaimento de ARNm mediado sem sentido num paciente que compreendem administrar a um paciente necessitado do mesmo uma quantidade eficaz de um composto biodisponível oralmente (i.e., ácido 3—[5— (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato) de acordo com as dosagens e/ou regimes de doseamento aqui descritos. São também aqui descritos o tratamento, prevenção ou gestão de qualquer doença que está associada a um gene exibindo terminação prematura da tradução e/ou decaimento de ARNm mediado sem sentido. Especificamente, a doença é devida, em parte, à ausência de expressão do gene resultante de um codão de paragem prematura. Exemplos específicos de genes que podem exibir terminação prematura da tradução e/ou decaimento de ARNm mediado sem sentido e doenças associadas a terminação prematura da tradução e/ou decaimento de ARNm mediado sem sentido são encontrados no Pedido de Patente dos E.U.A. 60/390747, intitulado: "Methods For Identifying Small Molecules That Modulate Premature Translation Termination And Nonsense Mediated mRNA Decay", depositado em 21 de Junho de 2002 .
Especificamente, os métodos, composições, doses, formas de unidade de dosagem e regimes de doseamento aqui proporcionados são úteis para o tratamento, prevenção ou gestão de uma doença associada a uma mutação sem sentido num gene num embrião ou feto que tem ou está predisposto ou é susceptivel a uma doença associada a uma mutação sem sentido num gene, tal como as aqui descritas. Administra-se a uma fêmea grávida uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato que passa através da placenta para o embrião ou feto. Numa concretização particular, uma quantidade eficaz de ácido 3—[5—(2— fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é administrada oralmente à fêmea grávida.
Doenças ou perturbações associadas ou amenizadas pela supressão da terminação prematura da tradução e/ou decaimento de ARNm mediado sem sentido incluem: uma doença genética, cancro, uma doença autoimune, uma doença sanguínea, uma doença de colagénio, diabetes, uma doença neurodegenerativa, uma doença proliferativa, uma doença cardiovascular, uma doença pulmonar, uma doença inflamatória ou uma doença do sistema nervoso central.
Doenças genéticas específicas dentro do âmbito dos métodos do invento incluem neoplasia endócrina múltipla (tipo 1, 2 e 3) , amiloidose, mucopolissacaridose (tipo I e III), hipoplasia adrenal congénita, polipose adenomatosa coli, doença de Von Hippel Landau, Síndrome de Menkes, hemofilia A, hemofilia B, colagénio VII, Síndrome de Alagille, Síndrome de
Townes-Brocks, tumor rabdóide, epidermólise bolhosa, Síndrome de Hurler, Síndrome de Coffin-Lowry, aniridia, Doença de Charcot-Maria-Tooth, miopatia miotubular, miopatia miotubular ligada ao X, condrodisplasia ligada ao X, agamaglobulinemia ligada ao X, doença renal policística, atrofia muscular espinal, polipose adenomatosa familiar, deficiência de piruvato-desidrogenase, fenilcetonúria, neurofibromatose 1, neurofibromatose 2, doença de Alzheimer, doença de Tay Sachs, Síndrome de Rett, Síndrome de Hermansky-Pudlak, displasia ectodérmica/síndrome de fragilidade de pele, discondrosteose de Leri-Weill, raquitismo, adrenoleucodistrofia hipofosfatémica, atrofia girata, aterosclerose, surdez neurossensorial, distonia, doença de Dent, porfiria aguda intermitente, Doença de Cowden, epidermólise bolhosa de Herlitz, Doença de Wilson, Síndrome de Treacher-Collins, deficiência de piruvato-quinase, gigantismo, nanismo, hipotiroidismo, hipertiroidismo, envelhecimento, obesidade, doença de Parkinson, doença de Niemann-Pick C, fibrose cística, distrofia muscular, doença cardíaca, pedras nos rins, ataxia-telangiectasia, hipercolesterolemia familiar, retinite pigmentosa, doença de depósito lisossómico, esclerose tuberosa, distrofia muscular de Duchenne e Síndrome de Marfan.
Especificamente, a doença genética é uma doença autoimune. Preferivelmente, a doença autoimune é artrite reumatóide ou doença de enxerto versus hospedeiro.
Alternativamente, a doença genética é uma doença sanguínea. Preferivelmente, a doença sanguínea é hemofilia A, doença de Von Willebrand (tipo 3), ataxia-telangiectasia, b-talassemia ou pedras no rim.
Alternativamente, a doença genética é uma doença de colagénio. Preferivelmente, de doença de colagénio é osteogénese imperfeita ou cirrose.
Alternativamente, a doença genética é diabetes.
Alternativamente, e doença genética é uma doença inflamatória. Preferivelmente, a doença inflamatória é artrite.
Alternativamente a doença genética é uma doença do sistema nervoso central. Preferivelmente a doença do sistema nervoso central é uma doença neurodegenerativa. Preferivelmente, a doença do sistema nervoso central é esclerose múltipla, distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne, doença de Alzheimer, doença de Tay Sachs, lipofuscinose ceróide neuronal infantil tardia (LINCL) ou doença de Parkinson.
Alternativamente, a doença genética é cancro. Preferivelmente, o cancro é cancro da cabeça e pescoço, olhos, pele, boca, garganta, esófago, tórax, ossos, pulmão, cólon, cólon sigmoide, reto, estômago, próstata, mama, ovários, rins, fígado, pâncreas, cérebro, intestino, coração ou glândulas suprarrenais. 0 cancro pode ser primário ou metastático. Os cancros incluem tumores sólidos, cancros hematológicos e outras neoplasias.
Preferivelmente, o cancro está associado a genes supressores de tumor (ver e.g. Garinis et al. 2002, Hum. Gen. 111:115-117; Meyers et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95: 15587-15591; Rung et al. 2000, Nature Medicine 6(12) : 1335-1340. Estes genes supressores de tumor incluem APC, ATM, BRAC1, BRAC2, MSH1, pTEN, Rb, CDKN2, NF1, NF2, WT1 e p53.
Particularmente, o gene supressor de tumor é o gene p53. Têm sido identificadas mutações sem sentido no gene p53 e têm sido implicadas em cancros. Têm sido identificadas várias mutações sem sentido no gene p53 (ver, e.g., Masuda et al., 2000, Tokai J. Exp. Clin. Med. 25(2):69-77; Oh et al., 2000,
Mol. Cells 10(3):275-80; Li et al., 2000, Lab. Invest. 80 (4) :493 — 9; Yang et al. , 1999, Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 21(2) :114 — 8; Finkelstein et al., 1998, Mol. Diagn. 3(1) :37 — 41; Kajiyama et al., 1998, Dis. Esophagus. 11 (4) : 279-83; Kawamura et al. , 1999, Leuk. Res. 23 (2) : 115-26; Radig et al., 1998,
Hum. Pathol. 29(11) :1310-6; Schuyer et al. , 1998, Int. J.
Cancer 76 (3) :299-303; Wang-Gohrke et al., 1998, Oncol. Rep. 5(1) :65 — 8; Fulop et al., 1998, J. Reprod. Med. 43 (2) : 119-27; Ninomiya et al. , 1997, J. Dermatol. Sei. 14(3) :173-8; Hsieh et al., 1996, Cancer Lett. 100 (1-2) :107-13; Rail et al., 1996,
Pancreas. 12(1) :10-7; Fukutomi et al. , 1995, Nippon Rinsho. 53(11) :2764-8; Frebourg et al., 1995, Am. J. Hum. Genet. 56 (3) : 608-15; Dove et al., 1995, Cancer Surv. 25:335-55;
Adamson et al., 1995, Br. J. Haematol. 89(1) : 61 — 6; Grayson et al. , 1994, Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 16(4) :341-7; Lepelley et al., 1994, Leukemia. 8(8):1342-9; McIntyre et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12 (5) :925-30; Horio et al., 1994, Oncogene. 9(4) :1231-5; Nakamura et al. , 1992, Jpn. J. Cancer Res. 83(12):1293-8; Davidoff et al., 1992, Oncogene. 7(1):127-33; e Ishioka et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 177 (3) :901-6) .
Doenças a serem tratadas, prevenidas ou geridas por administração a um paciente necessitado do mesmo de uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[ 1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato incluem tumores sólidos, sarcoma, carcinoma, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiossarcoma, sarcoma endotelial, linfangiossarcoma, linfangiossarcoma endotelial, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, cancro do pâncreas, cancro da mama, cancro do ovário, cancro da próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma da glândula sudorípara, carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistoadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do dueto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, cancro cervical, tumor testicular, carcinoma do pulmão, carcinoma pulmonar de células pequenas, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, sarcoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma de Kaposi, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, urn tumor sanguíneo, leucemia linfoblástica aguda, leucemia de células B linfoblástica aguda, leucemia de células T linfoblástica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia monoblástica aguda, leucemia eritroleucémica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia não linfocítica aguda, leucemia indiferenciada aguda, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas ou mieloma múltiplo. Ver e.g.,
Harrison's Principles of Internal Medicine, Eugene Braunwald et al., eds., pp. 491-762 (15.a ed. 2001) . É aqui descrito um método para tratar, prevenir ou reduzir a tosse, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato a um paciente necessitado do mesmo. Particularmente, o paciente tem fibrose cística. Noutra concretização, a tosse é tosse crónica. Alternativamente, administra-se ácido 3— [5— (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato como uma forma de dosagem aqui proporcionada ou de acordo com um regime de doseamento aqui proporcionado. É também aqui descrito um método para aumentar a expressão de distrofina no músculo, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato a um paciente necessitado do mesmo. É também aqui descrito um método para aumentar expressão de distrofina em células de músculo, compreendendo contacto das células de músculo com uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2-fluorofenil) - [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato.
Especificamente, as células de músculo são postas em contacto in vitro. Numa concretização específica, o paciente tem distrofia muscular de Duchenne. Alternativamente, administra-se ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato como uma forma de dosagem aqui proporcionada ou de acordo com um regime de doseamento aqui proporcionado. 4.4 Doses e regimes de doseamento
Particularmente são aqui descritas doses específicas e regimes de doseamento para ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato que otimizam a supressão da terminação prematura da tradução e/ou decaimento de ARNm mediado sem sentido. Preferivelmente, o decaimento de ARNm mediado sem sentido resulta de uma mutação sem sentido de ADN. É também aqui descrito o tratamento, prevenção e gestão de doenças tratáveis ou evitáveis pela supressão da terminação prematura da tradução e/ou decaimento de ARNm mediado sem sentido ou seus sintomas ao mesmo tempo reduzindo ou evitando efeitos adversos ou indesejados, e.g. toxicidades ou efeitos secundários. A via de administração preferida para as doses e regimes de doseamento aqui descritos é a via oral (i.e., ingestão de uma solução, uma solução coloidal ou uma solução com um agente ativo adicional, acima da concentração de saturação de agente ativo).
Pensa-se que as doses e regimes de doseamento aqui descritos são úteis devido à sua capacidade para conseguir e manter uma concentração plasmática desejável do agente ativo. Pensa-se que conseguir e manter uma concentração plasmática relativamente constante de agente ativo (tais como as descritas na secção 4.4) durante, por exemplo, um período de 24 horas ou mais, proporciona um efeito terapêutico benéfico para o paciente. As doses e regimes de doseamento aqui descritos são úteis para conseguir e manter tais concentrações plasmáticas terapêuticas de agente ativo. É aqui descrito um método de administração de ácido 3 —[5 — (2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato onde o agente ativo é administrado a um paciente necessitado do mesmo uma vez num período de 12 ou 24 horas. É também aqui descrito um método de administração de ácido 3-[ 5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato onde o agente ativo é administrado a um paciente necessitado do mesmo duas vezes num período de 12 ou 24 horas, onde cada administração é preferivelmente separada por cerca de 4-14 horas, numa concretização 12 horas. Especificamente, o agente ativo pode ser administrado, por exemplo, às refeições, tal como ao pequeno-almoço e ao jantar. É também aqui descrito um método de administração de ácido 3-[ 5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato onde o agente ativo é administrado a um paciente necessitado do mesmo três vezes num período de 12 ou 24 horas, onde cada administração é preferivelmente separada por cerca de 4-14 horas. Particularmente, o agente ativo é administrado uma vez de manhã, uma vez à tarde e uma vez à noite. Intervalos preferidos entre doses incluem 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14 horas.
Especificamente, a dose de agente ativo é aumentada ao longo de um período de 24 horas. Alternativamente, a segunda dose administrada é aumentada (e.g., duplicada). Alternativamente, a primeira e segunda dose administradas são mantidas constantes e a terceira dose administrada é aumentada (e.g., duplicada). Particularmente, as três doses num período de 24 horas são administradas de acordo com a fórmula: IX, IX, 2X, onde X é uma dose inicial particular (e.g., 4 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg ou 50 mg/kg). Alternativamente, o agente ativo é administrado dentro de (i.e., antes ou depois) cerca de 10, 15, 30, 45 ou 60 minutes da ingestão de comida pelo paciente. Especificamente, uma quantidade eficaz do agente ativo é aspergido sobre ou misturado na comida. Alternativamente, o agente ativo é administrado sem comida.
Um regime de dosagem particularmente preferido é aquele onde o agente ativo é administrado a um paciente dentro de 30 minutes após uma refeição com intervalos de aproximadamente 6, 6 e 12 horas (e.g., às 7:00 AM após o pequeno-almoço, 1:00 PM após o almoço, e às 7:00 PM após o jantar).
Alternativamente, o invento refere-se à administração de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato numa dose única ou em doses divididas (e.g., três vezes num período de 24 horas) entre 0,1 mg/kg e 500 mg/kg, 1 mg/kg e 250 mg/kg, 1 mg/kg e 150 mg/kg, 1 mg/kg e 100 mg/kg, 1 mg/kg e 50 mg/kg, 1 mg/kg e 25 mg/kg, 1 mg/kg e 10 mg/kg ou 2 mg/kg e 10 mg/kg a um paciente necessitado do mesmo. Numa concretização particular, o ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é administrado numa dose de cerca de 2-6 mg/kg, cerca de 5-9 mg/kg, cerca de 6-10 mg/kg, cerca de 8-12 mg/kg, cerca de 12-16 mg/kg ou cerca de 18-22 mg/kg. Particularmente, o ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é administrado numa dose de cerca de 4 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 14 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg ou cerca de 50 mg/kg. Noutra concretização, qualquer dose do ácido 3-[5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato descrito na concretização precedente é administrada três vezes num período de 24 horas. É também aqui descrita a terapia contínua onde ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é administrado diariamente a um paciente necessitado do mesmo durante um certo período de tempo (e.g. , 5, 7, 10, 14, 20, 24, 28, 60 ou 120 dias ou more). Especificamente, o agente ativo é administrado continuamente três vezes por período de 24 horas. Alternativamente, o agente ativo é administrado continuamente diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente. Especificamente, o agente ativo é administrado continuamente três vezes por período de 24 horas em doses de cerca de 4 mg/kg, cerca de 4 mg/kg e cerca de 8 mg/kg durante dias, semanas, meses ou anos. Especificamente, o agente ativo é administrado continuamente três vezes por período de 24 horas em doses de cerca de 7 mg/kg, cerca de 7 mg/kg e cerca de 14 mg/kg durante dias, semanas, meses ou anos. Especificamente, o agente ativo é administrado continuamente três vezes por período de 24 horas em doses de cerca de 10 mg/kg, cerca de 10 mg/kg e cerca de 20 mg/kg durante dias, semanas, meses ou anos. Especificamente, o agente ativo é administrado continuamente três vezes por período de 24 horas em doses de cerca de 30 mg/kg, cerca de 30 mg/kg e cerca de 60 mg/kg durante dias, semanas, meses ou anos. Especificamente, o agente ativo é administrado continuamente três vezes por período de 24 horas em doses de cerca de 10 mg/kg, cerca de 10 mg/kg e cerca de 20 mg/kg durante dias, semanas, meses ou anos. Especificamente, o agente ativo é administrado continuamente três vezes por período de 24 horas em doses de cerca de 40 mg/kg, cerca de 40 mg/kg e cerca de 80 mg/kg durante dias, semanas, meses ou anos. Em cada período de 24 horas que o agente ativo é administrado, este é preferivelmente administrado três vezes com intervalos de aproximadamente 6, 6 e 12 horas (e.g., às -7:00 AM após o pequeno-almoço, -1:00 PM após o almoço, e às 7:00 PM após o jantar). A terapia contínua é preferivelmente utilizada para o tratamento, prevenção ou gestão de fibrose cística e de distrofia muscular de Duchenne.
Os períodos de tratamento para um curso de terapia podem abranger uma semana, duas semanas, três semanas, quatro semanas, cinco semanas, seis semanas, sete semanas, oito semanas, nove semanas, dez semanas, onze semanas, doze semanas, treze semanas, catorze semanas, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, um ano, dois anos, três anos, quatro anos, cinco anos ou mais. Os períodos de tratamento podem ser interrompidos por períodos de repouso que podem abranger um dia, uma semana, duas semanas, três semanas, quatro semanas, cinco semanas, seis semanas, sete semanas, oito semanas, nove semanas, dez semanas, onze semanas, doze semanas, treze semanas, catorze semanas, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, um ano, dois anos, três anos, quatro anos, cinco anos ou mais. Estas determinações podem ser efetuadas por um perito da especialidade (e.g., um médico).
Particularmente, o tratamento é contínuo durante 14 dias, seguindo-se nenhum tratamento durante 14 dias, seguindo-se tratamento contínuo durante 14 dias adicionais. Especificamente, a dose dada durante os segundos 14 dias de tratamento é maior do que a dada durante os primeiros 14 dias de tratamento. Como exemplo, administram-se a um paciente necessitado do mesmo três doses de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4 ] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato (e.g., 4 mg/kg, 4 mg/kg e 8 mg/kg) num período de 24 horas durante 14 dias contínuos, seguindo-se 14 dias sem tratamento, seguindo-se a administração de três doses de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato (e.g., 10 mg/kg, 10 mg/kg e 20 mg/kg) num período de 24 horas durante 14 dias contínuos adicionais.
Especificamente, o tratamento é contínuo durante 28 dias. O tratamento contínuo pode ser interrompido por um ou mais dias, meses, semanas ou anos. O tratamento contínuo pode também ser seguido por um período de repouso com a duração de um ou mais dias, meses, semanas ou anos, com o tratamento contínuo depois retomado após o período de repouso.
Especificamente, o ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é administrado de acordo com as doses e programas de doseamento aqui descritos em combinação com um segundo agente ativo (e.g., simultaneamente ou sequencialmente). Particularmente, o ácido 3-[ 5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é administrado de acordo com as doses e programas de doseamento aqui descritos em combinação com um aminoglicósido, um corticosteroide, uma enzima pancreática, um antibiótico, insulina, um agente hipoglicémico, um ácido gordo omega-3, um agente quimioterapêutico, ou uma terapia de substituição enzimática. A administração do segundo agente ativo pode ser tópica, entérica (e.g. oral, duodenal, rectal), parentérica (e.g., intravenosa, intra-arterial, intramuscular, subcutânea, intradérmica ou intraperitoneal) ou intratecal. Especificamente, o ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é administrado de acordo com as doses e programas de doseamento aqui descritos em combinação com terapia de radiação.
Será entendido que as quantidades de agente ativo administradas a um paciente necessitado do mesmo são ou podem ser calculadas com base no peso real do paciente em questão ou no peso médio da população de pacientes em questão (e.g., homens brancos, mulheres brancas, homens afro-americanos, mulheres afro-americanas, homens asiáticos ou mulheres asiáticas, incluindo adultos e crianças). 4.5 Concentrações plasmáticas
Numa concretização, o invento refere-se a um método para manter uma concentração plasmática de ácido 3—[5—(2— fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato superior a cerca de 0,1 pg/ml, cerca de 0,5 pg/ml, cerca de 2 pg/ml, cerca de 5 pg/ml, cerca de 10 pg/ml, cerca de 20 pg/ml, cerca de 25 pg/ml, cerca de 40 pg/ml, cerca de 50 pg/ml, cerca de 100 pg/ml, cerca de 150 pg/ml, cerca de 200 pg/ml, cerca de 250 pg/ml ou cerca de 500 pg/ml num paciente durante pelo menos cerca de 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas ou mais, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato a um paciente necessitado do mesmo. Numa concretização particular, a administração é oral. Os niveis de ácido 3—[5—(2— fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC).
Noutra concretização, o invento refere-se a um método para manter uma concentração plasmática de ácido 3— [5— (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato de cerca de 0,1 pg/ml a cerca de 500 pg/ml ou cerca de 2 pg/ml a cerca de 10 pg/ml num paciente durante pelo menos cerca de 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas ou mais, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de ácido 3—[5—(2— fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato a um paciente necessitado do mesmo uma, duas ou três vezes por dia da mesma dose ou de dose aumentadas (e.g., IX, IX, 2X como aqui descrito). Numa concretização particular, a administração é oral.
Numa concretização particular, o nivel plasmático num paciente de ácido 3-[5- (2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é mantida a cerca de 2 pg/ml durante pelo menos cerca de 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas ou mais por administração do agente ativo uma, duas ou três vezes por dia a um paciente necessitado do mesmo. Noutra concretização, o nível plasmático num paciente de ácido 3 —[5 — (2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é mantido entre cerca de 2 pg/ml a cerca de 10 pg/ml durante pelo menos cerca de 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas ou mais horas por administração do agente ativo uma, duas ou três vezes por dia a um paciente necessitado do mesmo. Numa concretização particular, o nível plasmático num paciente de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é mantido acima de cerca de 10 pg/ml durante pelo menos cerca de 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 8, 12 ou 24 horas ou mais por administração do agente ativo uma, duas ou três vezes por dia a um paciente necessitado do mesmo. Numa concretização particular, a administração é oral. São aqui proporcionados métodos para conseguir uma Cmax de 1 pg/mL a 1000 pg/mL, 1 pg/mL a 750 pg/mL, 1 pg/mL a 500 pg/mL, 1 pg/mL a 400 pg/mL, 1 pg/mL a 300 pg/mL, 1 pg/mL a 250 pg/mL, 1 pg/mL a 200 pg/mL, 1 pg/mL a 150 pg/mL, 1 pg/mL a 100 pg/mL, 1 pg/mL a 50 pg/mL, 1 pg/mL a 40 pg/mL, 1 pg/mL a 30 pg/mL, 1 pg/mL a 20 pg/mL, 1 pg/mL a 10 pg/mL ou 10 pg/mL a 30 pg/mL de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato num paciente compreendendo administrar uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato uma, duas ou três vezes por dia a um paciente necessitado do mesmo.
Particularmente, são aqui proporcionados métodos para conseguir uma AUC0-24 de 50 pg.hora/mL a 1000 pg.hora/mL, 50 pg.hora/mL a 750 pg.hora/mL, 50 pg.hora/mL a 500 pg.hora/mL, 50 pg.hora/mL a 400 pg.hora/mL, 50 pg.hora/mL a 300 pg.hora/mL, 50 pg.hora/mL a 250 pg.hora/mL, 50 pg.hora/mL a 200 pg.hora/mL, 50 pg.hora/mL a 150 pg.hora/mL ou 50 pg.hora/mL a 100 pg.hora/mL de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato num paciente compreendendo administrar uma quantidade eficaz de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il)-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato uma, duas ou três vezes por dia a um paciente necessitado do mesmo. É também aqui descrito um método de administração de ácido 3-[5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato a um paciente necessitado do mesmo que proporciona um perfil plasmático in vivo com um intervalo de confiança (IC) a 90% para uma razão com transformação logarítmica natural dentro de 80% a 125%, 90% a 115% ou 95% a 110% para pelo menos um dos parâmetros de biodisponibilidade seguintes para ácido 3—[5—(2— fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato: (a) uma AUC0-24 média de 87 pg.hora/mL ao dia 1 de administração ou 91 pg.hora/mL ao dia 28 de administração; (b) uma Cmax média de 10 pg/mL ao dia 1 de administração ou 11 pg/mL ao dia 28 de administração; e (c) uma Cmin média de 0,5 pg/mL ao dia 1 de administração ou 0,6 pg/mL ao dia 28 de administração. É também aqui descrito um método de administração de ácido 3-[ 5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato a um paciente necessitado do mesmo que proporciona um perfil plasmático in vivo com um IC a 90% para uma razão com transformação logarítmica natural dentro de 80% a 125%, 90% a 115% ou 95% a 110% para pelo menos um dos parâmetros de biodisponibilidade seguintes para ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato: (a) uma AUC0-24 média de 291 pg.hora/mL ao dia 1 de administração ou 235 pg.hora/mL ao dia 28 de administração, (b) uma Cmax média de 27 pg/mL ao dia 1 de administração ou 22 pg/mL ao dia 28 de administração; e (c) uma Cmin média de 3,8 pg/mL ao dia 1 de administração ou 3,4 pg/mL ao dia 28 de administração. É também aqui descrito um método de administração de ácido de 3-[5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato a um paciente necessitado do mesmo que proporciona um perfil plasmático in vivo com um IC a 90% para uma razão com transformação logarítmica natural dentro de 80% a 125%, 90% a 115% ou 95% a 110% para pelo menos um dos parâmetros de biodisponibilidade seguintes para ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzdico ou urn seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato: (a) uma AUC0-24 média de 866 pg.hora/mL ao dia 1 de administração ou 490 pg.hora/mL ao dia 28 de administração; (b) uma Cmax média de 7 6 pg/mL ao dia 1 de administração ou 46 pg/mL ao dia 28 de administração; e (c) uma Cmin média de 9, 6 pg/mL ao dia 1 de administração ou 6,7 pg/mL ao dia 28 de administração. 4.6 Populações de pacientes
Populações de pacientes particulares para as quais os métodos e composições aqui descritos são úteis incluem adultos e crianças que têm ou são suscetíveis de terem (e.g., devido a fatores ambientais ou genéticos) uma doença associada a uma mutação sem sentido, tais como as aqui descritas.
Através de pré-rastreio determinou-se que um paciente ou um familiar do paciente tem mutação sem sentido (i.e., UAA, UGA ou UAG). 4.7 Composições farmacêuticas e formulações de unidade de dosagem São também aqui descritas composições farmacêuticas e formas de unidade de dosagem individuais compreendendo ácido 3-[5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato. Formas de dosagem individual aqui descritas podem ser adequadas para administração oral, mucosa (incluindo sublingual, bucal, rectal, nasal ou vaginal) ou parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, injeção de bólus, intra-arterial, ou intravenosa). Composições farmacêuticas e formas de unidade de dosagem individual preferidas são adequadas para administração oral.
Como aqui revelado, a composição farmacêutica é uma forma de dosagem oral sólida. Especificamente, a composição farmacêutica é uma forma de dosagem oral líquida. São também aqui reveladas doses, formulações de unidade de dosagem e composições farmacêuticas onde o ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato está biodisponível oralmente. Vantagens da administração oral podem incluir facilidade de administração, maior adesão pelo paciente ao regime de doseamento, eficácia clínica, menos complicações, estadias mais curtas no hospital e sobretudo economias de custos. São também aqui reveladas formulações de unidade de dosagem que compreendem entre cerca de 35 mg e cerca de 1400 mg, cerca de 125 mg e cerca de 1000 mg, cerca de 250 mg e cerca de 1000 mg, ou cerca de 500 mg e cerca de 1000 mg de ácido 3-[5- (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato. Especificamente, a formulação de unidade de dosagem compreende ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato e um ou mais transportadores ou excipientes adequados para suspensão num solvente farmaceuticamente aceitável (e.g., água, leite, uma bebida carbonatada, sumo, puré de maça, comida para bebé ou formulação para bebé) num frasco. São também aqui reveladas formulações de unidade de dosagem que compreendem 35 mg, 50 mg, 70 mg, 100 mg, 125 mg, 140 mg, 175 mg, 200 mg, 250 mg, 280 mg, 350 mg, 500 mg, 560 mg, 700 mg, 750 mg, 1000 mg ou 1400 mg de ácido 3— [5— (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato. Formulações de unidade de dosagem preferidas compreendem cerca de 125 mg, cerca de 250 ou cerca de 1000 mg de ácido 3-[5- (2-fluorofenil]- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato. Especificamente, a formulação de unidade de dosagem compreende ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato e um ou mais transportadores ou excipientes adequados para suspensão num solvente farmaceuticamente aceitável (e.g., água, leite, uma bebida carbonatada, sumo, puré de maça, comida para bebé ou formulação para bebé) num frasco. Formulações de unidade de dosagem preferidas são pós e saquetas. É também aqui revelada uma forma de dosagem sólida compreendendo 250 mg, 500 mg, 750 mg ou 1000 mg de ácido 3 —[5 — (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato que quando administrada a um paciente necessitado do mesmo em três doses diárias de 4 mg/kg, 4 mg/kg e 8 mg/kg, respetivamente, proporciona um perfil plasmático in vivo com um intervalo de confiança (IC) a 90% para uma razão com transformação logarítmica natural dentro de 80% a 125%, 90% a 115% ou 95% a 110% para pelo menos um dos parâmetros de biodisponibilidade seguintes para ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato: (a) uma AUC0-24 média de 87 pg.hora/mL ao dia 1 de administração ou 91 pg.hora/mL ao dia 28 de administração; (b) uma Cmax média de 10 pg/mL ao dia 1 de administração ou 11 pg/mL ao dia 28 de administração; e (c) uma Cmin média de 0,5 pg/mL ao dia 1 de administração ou 0,6 pg/mL ao dia 28 de administração. É também aqui revelada uma forma de dosagem sólida compreendendo 250 mg, 500 mg, 750 mg ou 1000 mg de ácido 3 —[5 — (2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato que quando administrada a um paciente necessitado do mesmo em três doses diárias de 10 mg/kg, 10 mg/kg e 20 mg/kg, respetivamente, proporciona um perfil plasmático in vivo com um IC a 90% para uma razão com transformação logarítmica natural dentro de 80% a 125%, 90% a 115% ou 95% a 110% para pelo menos um dos parâmetros de biodisponibilidade seguintes para ácido 3—[5—(2— fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato: (a) uma AUC0-24 média de 291 pg.hora/mL ao dia 1 de administração ou 235 pg.hora/mL ao dia 28 de administração; (b) uma Cmax média de 27 pg/mL ao dia 1 de administração ou 22 pg/mL ao dia 28 de administração; e (c) uma Cmin média de 3,8 pg/mL ao dia 1 de administração ou 3,4 pg/mL ao dia 28 de administração. É também aqui revelada uma forma de dosagem sólida compreendendo 250 mg, 500 mg, 750 mg ou 1000 mg de ácido 3 — [5 — (2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato que quando administrada a um paciente necessitado do mesmo em três doses diárias de 20 mg/kg, 20 mg/kg e 40 mg/kg, respetivamente, proporciona um perfil plasmático in vivo com um IC a 90% para uma razão com transformação logarítmica natural dentro de 80% a 125%, 90% a 115% ou 95% a 110% para pelo menos um dos parâmetros de biodisponibilidade seguintes para ácido 3—[5—(2— fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato: (a) uma AUC0-24 média de 866 pg.hora/mL ao dia 1 de administração ou 490 pg.hora/mL ao dia 28 de administração; (b) uma Cmax média de 7 6 pg/mL ao dia 1 de administração ou 46 pg/mL ao dia 28 de administração; e (c) uma Cmin média de 9, 6 pg/mL ao dia 1 de administração ou 6,7 pg/mL ao dia 28 de administração.
Embora seja recomendado que as formulações de unidade de dosagem aqui descritas sejam armazenadas a entre cerca de 2°C a cerca de 8°C, as formulações de unidade de dosagem podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante cerca de 48 horas antes da reconstituição. Especificamente, a reconstituição de uma formulação de unidade de dosagem de 250 mg de ácido 3 —[5 — (2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é realizada pela adição de cerca de 10 mL de água diretamente a um frasco contendo ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato para conseguir uma concentração de cerca de 25 mg/mL no volume total de suspensão. Para uma formulação de unidade de dosagem de 1000 mg de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato, adicionam-se cerca de 20 mL de água diretamente ao frasco contendo ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato para conseguir uma concentração de cerca de 50 mg/mL no volume total de suspensão. Imediatamente após se adicionar a água, o frasco é tapado e agitado ligeiramente à mão durante pelo menos cerca de 30 segundos para conseguir uma suspensão homogénea. Ainda que a suspensão reconstituída possa permanecer no frasco de plástico original durante até 24 horas antes da ingestão, é recomendado que o fármaco seja tomado pouco tempo após a reconstituição. Se existir um atraso de mais do que cerca de 15 minutos entre a reconstituição e o doseamento, é recomendado que o frasco seja de novo agitado ligeiramente à mão durante pelo menos cerca de 30 segundos. É recomendado que a suspensão seja administrada diretamente a partir do frasco. Se se pretende administrar a totalidade da forma de unidade de dosagem, é ainda recomendado que o frasco seja enxaguado uma vez com água e que esta água de enxaguamento seja ingerida para assegurar que nenhum pó é deixado no frasco. Se se pretende administrar uma quantidade parcial da forma de unidade de dosagem, pode-se utilizar uma colher ou seringa para obter a dose apropriada.
Formas de unidade de dosagem individual aqui reveladas e adequadas para administração oral a um paciente incluem: saquetas; hóstias; comprimidos; caplets; cápsulas, tais como cápsulas de gelatina elástica mole; trociscos; pastilhas; dispersões; pós; soluções; formas de dosagem liquidas, incluindo suspensões (e.g., suspensões líquidas aquosas ou não aquosas); emulsões (e.g., emulsões de óleo-em-água, ou uma emulsão líquida de água-em-óleo); e elixires. É também aqui revelada uma solução coloidal ou uma solução com um agente ativo adicional, acima da concentração de saturação. Estes e outros modos segundo os quais formas de dosagem específicas variarão umas em relação às outras serão prontamente evidentes para os peritos na especialidade. Ver, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed., Mack Publishing, Easton PA (1990). São aqui adicionalmente reveladas composições farmacêuticas e formas de dosagem anidras compreendendo ácido 3-[ 5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato. Composições farmacêuticas e formas de dosagem anidras do invento podem ser preparadas utilizando ingredientes anidros ou contendo um baixo teor de humidade e condições de baixa hidratação ou de baixo teor de humidade.
Formas de dosagem oral típicas aqui descritas são preparadas combinando o(s) ingrediente(s) ativo(s) numa mistura íntima com pelo menos um transportador ou excipiente de acordo com técnicas convencionais de composição farmacêutica. Os excipientes podem tomar uma ampla variedade de formas dependendo da forma de preparação desejada para administração. Por exemplo, excipientes adequados para utilização em formas de dosagem oral líquidas ou de aerossol incluem água, glicóis, óleos, álcoois, agentes aromatizantes (e.g., extrato de baunilha), conservantes e agentes corantes. Exemplos de excipientes adequados para utilização em formas de dosagem oral sólidas (e.g., pós, comprimidos, saquetas, cápsulas e caplets) incluem amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, ligantes e agentes de desintegração.
Formulações de unidade de dosagem particularmente preferidas são formulações de pó compreendendo uma quantidade eficaz do agente ativo que é adequada para reconstituição num solvente farmaceuticamente aceitável (e.g., água, leite, uma bebida carbonatada, sumo, puré de maça, comida para bebé ou formulação para bebé) e administração oral subsequente. Particularmente, o pó pode conter opcionalmente um ou mais transportadores ou excipientes em combinação com o agente ativo. Alternativamente, o pó pode ser armazenado num recipiente fechado antes da administração ou reconstituição. Alternativamente, o pó pode ser encapsulado (e.g., numa cápsula de gelatina). 5. Exemplos 5.1 Exemplo 1: Preparação de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico
Processos para a preparação de ácido 3—[5— (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico são descritos na Patente dos E.U.A. N.2 6 992 096 B2, concedida em 31 de Janeiro de 2006, e no Pedido de Patente dos E.U.A. N.2 11/899813, depositado em 9 de Setembro de 2007. Apresenta-se a seguir um exemplo representativo de um processo para a preparação de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico. A uma solução de ácido 3-cianobenzóico (44,14 g, 300 mmol) em DMF (0,6 L) adicionou-se K2CO3 (62,19 g, 450 mmol) e depois agitou-se durante 30 min à temperatura ambiente. Adicionou-se à suspensão iodeto de metilo (28 mL, 450 mmol) durante 20 min, e agitou-se a mistura reacional mais 4 h à temperatura ambiente. Verteu-se a mistura reacional em 1,2 L de gelo-água e agitou-se durante 30 min, e removeu-se o precipitado por filtração. Dissolveu-se o bolo branco em metanol (70 mL) , e depois precipitou-se outra vez em água fria. O produto desejado foi obtido como um pó branco com 79% de rendimento (38 g, 99% de pureza por LC/UV) . RMN-1]! (CDC13) 8,85 (2H) , 8,28 (1H), 8,02 (1H) , 4,17 (3H) . A uma solução de éster de metilo de ácido 3-cianobenzóico (50 g, 310 mmol) em etanol (500 mL) adicionou-se hidroxilamina aquosa a 50% (41 mL, 620 mmol) à temperatura ambiente. Agitou-se a mistura reacional durante lha 100°C e removeram-se os solventes sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo oleoso em etanol/tolueno 20/80 (50 mL x 2) e depois concentrou-se outra vez. Obteve-se o éster desejado (61 g, rendimento quantitativo) como um pó branco com 98% de pureza (LC/UV) . RMN-1H (CDCI3) 9,76 (1H), 8,24 (1H), 7,82 (2H) , 7,51 (1H), 5, 92 (2H) , 3,82 (3H) . A uma solução de éster de metilo de ácido 3-(N-hidroxicarbamimidoil)-benzóico (60 g, 310 mmol) em THF anidro (200 mL) adicionou-se di-isopropiletilamina (75 mL, 434 mmol) a 5°C, e depois adicionou-se à mistura cloreto de 2-fluorobenzoilo (48,1 mL, 403 mmol) durante 20 min. Agitou-se a mistura reacional durante 1 h à temperatura ambiente. Removeu-se o precipitado por filtração e concentrou-se o filtrado sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo (400 mL) e depois lavou-se com água (200 mL x 2) . Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e cristalizou- se o produto desejado em acetato de etilo a 60% em hexano para dar o produto desejado (81 g, 83% de rendimento) como um sólido branco. RMN-1H (CDC13) 8,18 (1H), 8,03 (3H), 7,48 (2H), 7,18 (2H) , 5,61 (2H) , 3,82 (3H) .
Levaram-se ao refluxo 44 g de éster de metilo de ácido 3-(N-2-fluorobenzoilcarbamimidoil)-benzóico em tolueno (500 mL) durante 4 h a 130°C utilizando uma montagem de Dean-Stark. Agitou-se a mistura reacional a 5°C durante 18 h. Removeu-se o precipitado branco por filtração e concentrou-se o filtrado, e cristalizou-se outra vez em tolueno. Obteve-se o oxadiazole desejado (38 g, 92% de rendimento) como um sólido branco com 99% de pureza (LC/UV) . RMN-1H (CDC13) 8,91 (1H), 8,38 (1H), 8,15 (2H) , 7,62 (2H) , 7,35 (2H) , 3,95 (3H).
A uma solução de éster de metilo de ácido 3— [5— (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico (3,3 g, 11 mmol) em THF (40 mL) adicionou-se NaOH aquoso 1,5 M (10 mL, 14 mmol). Levou-se a mistura reacional ao refluxo durante 2 h a 100°C. Removeu-se o solvente orgânico e diluiu-se a solução aquosa com água (50 mL) , e depois acidificou-se com HC1 aquoso. Removeu-se o precipitado branco por filtração e lavou-se o bolo branco com água fria e depois secou-se utilizando um liofilizador. Obteve-se o ácido desejado (3,0 g, 96% de rendimento) como um pó branco com 98% de pureza (LC/UV). Ponto de fusão 242°C; IV 3000 (C-H aromático), 1710 (C=0) ; RMN-1H (Ds-DMSO) 8,31 (1H), 8,18 (2H) , 8,08 (1H), 7,88 (2H) , 7,51 (2H) ; RMN-13C (D6-DMSO) 172,71, 167,38, 166,48, 161,25, 135,80, 132,24, 131,79, 131,79, 131,08, 130,91, 129,81, 127,76, 125,48, 117,38, 111,70; RMN-19F (D6-DMSO) 109,7.
Sais farmaceuticamente aceitáveis de ácido 3—[5—(2— fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico podem ser preparados utilizando métodos conhecidos dos peritos na especialidade. O sal de sódio pode ser preparado como se segue. A uma solução de éster de metilo de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico (33 g, 111 mol) em THF (400 mL) adicionou-se NaOH aquoso a 1,5 M (100 mL, 144 mmol) . Levou-se a mistura reacional ao refluxo durante 2 h a 100°C. Removeu-se o solvente orgânico sob pressão reduzida e agitou-se a solução aquosa 2 h a 5°C. Removeu-se o precipitado branco por filtração e concentrou-se o filtrado e precipitou-se outra vez em água. Lavou-se o bolo branco com água fria e depois secou-se utilizando um liofilizador. Obteve-se o sal desejado (33 g, 96% de rendimento) como um pó branco com 98,6% de pureza (LC/UV). 5.2 Exemplo 2: Tratamento oral de fibrose cística mediada por mutação sem sentido 0 presente exemplo apresenta um regime de doseamento ilustrativo útil para o tratamento de fibrose cística mediada por mutação sem sentido. 0 ácido 3-[5- (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]- benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é proporcionado como um pó de sabor a baunilha para suspensão. 0 fármaco é fabricado sob condições correntes de boa prática de fabrico (cGMP, current Good Manufacturing Practice conditions) . A formulação pode incluir agentes de ligação e suspensão, tensioativos e vários excipientes menores que auxiliam no processo de fabrico. A mistura pode ser embalada em frascos de plástico (polietileno de alta densidade [HPDE]) de 40 mL vedados com um vedante de película e uma tampa de segurança de plástico branco. Cada frasco pode conter 125, 250 ou 1000 mg da substância de fármaco, que é 25,0% do peso total de formulação. Alternativamente, a mistura pode ser proporcionada numa formulação de saqueta, tal como apresentada no Exemplo 6. Excipientes (e as suas proporções do peso total de formulação) incluem um agente de suspensão (Litesse® Ultra [polidextrose refinada] - 25,7%), um agente ligante que pode também disfarçar o sabor (manitol - 25,0%), agentes tensioativos (polietilenoglicol 3350 - 12,8% e Lutrol® micro F127 [pó de poloxâmero 407] - 3,7%), um desintegrante (crospovidona - 5,0%), e podem estar presentes outros excipientes, cada um com menos de 2% (hidroxietilcelulose, aroma de baunilha, estearato de magnésio [não bovino], e sílica coloidal). Os rótulos do frasco indicam a identidade da substância de fármaco, o número de lote, a quantidade da substância de fármaco, e as condições de armazenamento (e.g., temperatura ambiente ou refrigeração a 5 a 8°C). O doseamento da substância de fármaco é baseado nos miligramas de fármaco por quilograma de peso corporal de paciente. A dose da substância de fármaco pode ser arredondada para ser consistente com os tamanhos de frasco disponíveis. 0 esquema de dosagem assegura que a dose real total dada nunca é <50 mg abaixo ou >250 mg acima da dose pretendida (i.e., está sempre dentro de 5 mg/kg do nível de dose prevista). Por exemplo, um paciente pesando 40 kg a ser tratado com a dose de 4 mg/kg teria uma dose calculada de 160 mg. Este paciente receberia um frasco de 250 mg (total de 250 mg) ou 6,25 mg/kg/dose. O mesmo paciente quando tratado com a dose de 8 mg/kg à noite teria uma dose calculada de 320 mg e receberia dois frascos de 250 mg (total de 500 mg) ou 12,5 mg/kg. O mesmo paciente tratado com a dose de 10 mg/kg teria uma dose calculada de 400 mg e receberia dois frascos de 250 mg (total de 500 mg) ou 12,5 mg/kg. O mesmo paciente quando tratado com a dose de 20 mg/kg à noite teria uma dose calculada de 800 mg e receberia um frasco de 1000 mg (total de 1000 mg) ou 25 mg/kg. A reconstituição e doseamento do produto de fármaco é efectuado à temperatura ambiente. Não é necessário qualquer aquecimento específico do produto de fármaco antes da reconstituição. O produto de fármaco pode ser reconstituído com qualquer solvente farmaceuticamente aceitável (e.g., água, leite, uma bebida carbonatada, sumo, puré de maça, comida para bebé ou formulação para bebé) . Para cada frasco de 250 mg fornecido, adicionam-se ~10 mL de água ou outro solvente farmaceuticamente aceitável para conseguir uma concentração de cerca de 25 mg/mL no volume total de suspensão. Para cada frasco de 1000 mg fornecido, adicionam-se 20 mL de água ou outro solvente farmaceuticamente aceitável para conseguir uma concentração de cerca de 50 mg/mL no volume total de suspensão. Imediatamente após se adicionar água ou outro solvente farmaceuticamente aceitável à medicação de estudo seca, tapam-se os frascos e agitam-se vigorosamente à mão durante cerca de 60 segundos para conseguir homogeneidade da suspensão. Ainda que a suspensão possa permanecer no frasco de plástico original durante até 24 horas antes da ingestão, recomenda-se que o fármaco seja tomado pouco tempo após a reconstituição. Se existir um atraso de mais de 15 minutos entre a reconstituição e o doseamento, o frasco deverá ser de novo agitado vigorosamente à mão durante cerca de 60 segundos. 0 tratamento administrado continuamente enquanto necessário a um paciente com ou susceptível de ter fibrose cística. A Tabela 1 apresenta regimes de doseamento diário ilustrativos para ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato onde a administração ocorre três vezes por dia com intervalos de 6, 6 e 12 horas (e.g., 7:00 AM, -1:00 PM e 7:00 PM) com a comida. Numa concretização particular, administra-se ao paciente ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato como indicado na Tabela 1 continuamente durante 14 dias, seguindo-se 14 dias sem tratamento, seguindo-se 14 dias adicionais de administração, seguindo-se 14 dias adicionais sem tratamento. Alternativamente, administra-se ao paciente ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato como indicado na Tabela 1 continuamente durante 14 dias com três doses diárias de 4 mg/kg, 4 mg/kg e 8 mg/kg, seguindo-se 14 dias sem tratamento, seguindo-se 14 dias adicionais de administração com três doses diárias de 10 mg/kg, 10 mg/kg e 20 mg/kg, seguindo-se 14 dias adicionais sem tratamento. Alternativamente, é seguido em cada dia um regime de doseamento diário único apresentado na Tabela 1. Alternativamente, podem ser seguidos regimes de doseamento diferentes apresentados na Tabela 1 em dias diferentes.
Preferivelmente os pacientes tomam o fármaco nos 30 minutos após uma refeição; idealmente o fármaco será tomado com intervalos de aproximadamente 6, 6 e 12 horas (e.g., às -7:00 AM após o pequeno-almoço, 1:00 PM após o almoço, e às -7:00 PM após o jantar) . Os pacientes ingerem o fármaco enchendo cada frasco com a quantidade requerida de água ou outro solvente farmaceuticamente aceitável, tapando e agitando cada frasco durante cerca de 60 segundos, e depois ingerindo o conteúdo do número e tamanho requerido de frascos por dose. A dose total de fármaco reconstituída deve ser tomada de uma só vez. Após ingestão, cada frasco de doseamento é meio cheio com água ou outro solvente farmaceuticamente aceitável, tapado e agitado, e esta água ou outro solvente farmaceuticamente aceitável a partir do frasco é ingerido pelo paciente. Este procedimento de enxaguamento é realizado uma vez. Especificamente, o fármaco é proporcionado como uma saqueta. Em particular, a quantidade apropriada do fármaco pode ser pesada ou medida e combinada com um solvente farmaceuticamente aceitável apropriado antes da administração. 5.3 Exemplo 3: Tratamento oral de distrofia muscular de Duchenne mediada por mutação sem sentido O presente exemplo apresenta um regime de doseamento ilustrativo útil para o tratamento de distrofia muscular de Duchenne mediada por mutação sem sentido. O ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é proporcionado como um pó de sabor a baunilha para suspensão. O fármaco é fabricado sob condições correntes de boa prática de fabrico (cGMP, current Good Manufacturing Practice conditions). A formulação pode incluir agentes de ligação e suspensão, tensioativos e vários excipientes menores que auxiliam no processo de fabrico. A mistura pode ser embalada em frascos de plástico (polietileno de alta densidade [HPDE]) de 40 mL vedados com um vedante de película e uma tampa de segurança de plástico branco. Cada frasco pode conter 125, 250 ou 1000 mg da substância de fármaco, que é 25,0% do peso total de formulação. Alternativamente, a mistura pode ser proporcionada numa formulação de saqueta, tal como apresentada no Exemplo 6. Excipientes (e as suas proporções do peso total de formulação) incluem um agente de suspensão (Litesse® Ultra [polidextrose refinada] - 25,7%), um agente ligante que pode também disfarçar o sabor (manitol - 25,0%), agentes tensioativos (polietilenoglicol 3350 - 12,8% e Lutrol® micro F127 [pó de poloxâmero 407] - 3,7%), um desintegrante (crospovidona - 5,0%), e podem estar presentes outros excipientes, cada um com menos de 2% (hidroxietilcelulose, aroma de baunilha, estearato de magnésio [não bovino], e sílica coloidal). Os rótulos do frasco indicam a identidade da substância de fármaco, o número de lote, a quantidade da substância de fármaco, e as condições de armazenamento (e.g., temperatura ambiente ou refrigeração a 5 a 8°C). O doseamento do fármaco é baseado nos miligramas de fármaco por quilograma de peso corporal de paciente. Deverá ser calculado o volume total correspondendo à quantidade total de fármaco em miligramas a ser administrada a um paciente. Por exemplo, se um paciente de 30 kg deve receber 4 mg/kg, então a dose a ser entregue será 30 x 4 = 120 mg. Este paciente deverá ser doseado utilizando o frasco da dose de 250 mg. Uma vez que cada mL da suspensão no frasco da dose de 250 mg contém 250/10 = 25 mg do fármaco, este paciente deverá obter 120/25 = 5 mL da suspensão para cada dose de 4 mg/kg) . O mesmo paciente quando tratado com a dose de 8 mg/kg dose à noite teria uma dose calculada de 240 mg e receberia um frasco de 250 mg (10 mL de suspensão) . Estes volumes das suspensões para as doses respectivas deverão ser retirados do frasco de fármaco utilizando uma seringa de plástico para doseamento oral. Para transferência de volumes fraccionários de <10 ml (para o frasco de 250 mg) ou <20 mL (para o frasco de 1000 mg), a quantidade desejada deverá ser retirada do frasco de medicação de estudo para uma seringa de doseamento de um tipo e tamanho apropriados (e.g., uma seringa de doseamento oral, de plástico, isenta de látex, calibrada, Baxa, Exacta-Med) e doseada utilizando a mesma seringa. Durante as mesmas 24 horas após reconstituição, >1 dose pode ser retirada do mesmo frasco de suspensão; no entanto, o fármaco reconstituído não deverá ser armazenado para além de 24 horas com a intenção de se utilizar este material outra vez para múltiplas doses no mesmo paciente. Se a quantidade total de fármaco a ser tomada ao dia 1 exceder 10 mL (para o frasco de 250 mg) ou 20 mL (para o frasco de 1000 mg) do fármaco reconstituído, então um novo frasco de fármaco deverá ser utilizado para cada doseamento. A reconstituição e doseamento do produto de fármaco é efetuada à temperatura ambiente. Não é necessário qualquer aquecimento específico do produto de fármaco antes da reconstituição. 0 fármaco pode ser reconstituído com qualquer solvente farmaceuticamente aceitável (e.g., água, leite, uma bebida carbonatada, sumo, puré de maça, comida para bebé ou formulação para bebé). Para cada frasco de 250 mg fornecido, adicionam-se ~10 mL de água ou outro solvente farmaceuticamente aceitável para conseguir uma concentração de cerca de 25 mg/mL no volume total de suspensão. Para cada frasco de 1000 mg fornecido, adicionam-se ~20 mL de água ou outro solvente farmaceuticamente aceitável para conseguir uma concentração de cerca de 50 mg/mL no volume total de suspensão. Imediatamente após de adicionarem água ou outro solvente farmaceuticamente aceitável à medicação de estudo seca, tapam-se os frascos e agitam-se vigorosamente à mão durante cerca de 60 segundos para conseguir homogeneidade da suspensão. Ainda que a suspensão possa permanecer no frasco de plástico original durante até 24 horas antes da ingestão, recomenda-se que o fármaco seja tomado pouco tempo após a reconstituição. Se existir um atraso de mais de 15 minutos entre a reconstituição e o doseamento, o frasco deverá ser de novo agitado vigorosamente à mão durante cerca de 60 segundos. O tratamento é administrado continuamente enquanto necessário a um paciente com ou susceptível de ter distrofia muscular de Duchenne. A Tabela 2 apresenta regimes de doseamento diário ilustrativos para ácido 3—[5—(2— fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato onde a administração ocorre três vezes por dia com intervalos de 6, 6 e 12 horas (e.g., -7:00 AM, -1:00 PM e -7:00 PM) com a comida. Numa concretização particular, administra-se ao paciente ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato em um dos regimes de doseamento apresentados na Tabela 2 continuamente durante 28 dias. Em certas concretizações, um regime de dosagem diária única apresentado na Tabela 2 é seguido a cada dia. Noutras concretizações, diferentes regimes de doseamento apresentados na Tabela 2 podem ser seguidos em dias diferentes. Em certas concretizações, o fármaco é proporcionado como uma saqueta. Nestas concretizações, a quantidade apropriada do fármaco pode ser pesada ou medida e combinada com um solvente farmaceuticamente aceitável apropriado antes da administração.
Administra-se o fármaco aos pacientes nos 30 minutos após uma refeição; idealmente o fármaco será tomado com intervalos de aproximadamente 6, 6 e 12 horas (e.g., às 7:00 AM após o pequeno-almoço, -1:00 PM após o almoço, e às 7:00 PM após o jantar). Os pacientes ingerem o fármaco enchendo cada frasco com a quantidade requerida de água ou outro solvente farmaceuticamente aceitável, tapando e agitando cada frasco durante cerca de 60 segundos, retirando a quantidade apropriada de volume do frasco utilizando uma seringa de doseamento oral e ingerindo o conteúdo diretamente a partir da seringa de doseamento. O volume total calculado de fármaco reconstituído correspondendo à dose deve ser tomado de uma só vez. Após ingestão do fármaco, a seringa de doseamento deverá ser cheia com o mesmo volume de água ou outro solvente farmaceuticamente aceitável que o volume da dose, e deverá ser ingerido pelo paciente. Este procedimento de enxaguamento deverá ser realizado uma vez. A eficácia do tratamento pode ser determinada por medição da alteração a partir de uma medição de linha de base dos niveis de distrofina numa biópsia do músculo extensor do pé digitorum brevis (EDB). 5.4 Exemplo 4: Preparação de dosagens não aromatizadas de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato (apenas para referência) 0 ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é fornecido como um pó para suspensão. 0 fármaco é fabricado sob condições correntes de boa prática de fabrico (cGMP, current Good Manufacturing Practice conditions). 0 fármaco pode ser infimamente misturado com agentes de ligação e suspensão, tensioativos e vários excipientes menores que auxiliam no processo de fabrico. A mistura é embalada num frasco de plástico (polietileno de alta densidade [PEAD]) de 40 ml vedado com um vedante de película e uma tampa de segurança de plástico branco. Cada frasco pode conter cerca de 35 mg, cerca de 70 mg, cerca de 125 mg, cerca de 140 mg, cerca de 175 mg, cerca de 250 mg, cerca de 280 mg, cerca de 350 mg, cerca de 560 mg, cerca de 700 mg, cerca de 1000 mg ou cerca de 1400 mg de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato. Excipientes (e as suas proporções do peso total de formulação) incluem opcionalmente um agente de suspensão (Litesse® Ultra [polidextrose refinada] - 25,7%), um agente ligante que pode também disfarçar o sabor (manitol - 25,0%), agentes tensioativos (polietilenoglicol 3350 - 12,8% e Lutrol® micro F127 [pó de poloxâmero 407] - 3,7%), um desintegrante (crospovidona - 5,0%), e podem estar presentes outros excipientes, cada um com menos de 2% (cab-o-sil, hidroxietilcelulose, estearato de magnésio [não bovino], e sílica coloidal). O frasco é depois rotulado para indicar a identidade da substância de fármaco, o número de lote, a quantidade da substância de fármaco, e as condições de armazenamento (e.g., refrigeração a 5 a 8°C) . Antes da administração, o produto de fármaco é reconstituído num volume apropriado de um solvente farmaceuticamente aceitável (e.g., água, leite, uma bebida carbonatada, sumo, puré de maça, comida para bebé ou formulação para bebé). 5.5 Exemplo 5: Preparação de dosagens aromatizadas de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato (apenas para referência) 0 ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-l-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato é fornecido como um pó com aroma de baunilha (e.g., por adição de extrato de baunilha) para suspensão. 0 fármaco é fabricado sob condições correntes de boa prática de fabrico (cGMP, current Good Manufacturing Practice conditions). 0 fármaco pode ser infimamente misturado com agentes de ligação e suspensão, tensioativos e vários excipientes menores que auxiliam no processo de fabrico. A mistura é embalada num frasco de plástico (polietileno de alta densidade [PEAD]) de 40 ml vedado com um vedante de película e uma tampa de segurança de plástico branco. Cada frasco pode conter cerca de 35 mg, cerca de 70 mg, cerca de 125 mg, cerca de 140 mg, cerca de 175 mg, cerca de 250 mg, cerca de 280 mg, cerca de 350 mg, cerca de 560 mg, cerca de 700 mg, cerca de 1000 mg ou cerca de 1400 mg de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato. Excipientes (e as suas proporções do peso total de formulação) incluem opcionalmente um agente de suspensão (Litesse® Ultra [polidextrose refinada] - 25,7%), um agente ligante que pode também disfarçar o sabor (manitol - 25,0%), agentes tensioativos (polietilenoglicol 3350 - 12,8% e Lutrol® micro F127 [pó de poloxâmero 407] - 3,7%), um desintegrante (crospovidona - 5.0%), e podem estar presentes outros excipientes, cada um com menos de 2% (cab-o-sil, hidroxietilcelulose, aroma de baunilha, estearato de magnésio [não bovino], e sílica coloidal). O frasco é depois rotulado para indicar a identidade da substância de fármaco, o número de lote, a quantidade da substância de fármaco, e as condições de armazenamento (e.g., refrigeração a 2 a 8°C) . Antes da administração, o produto de fármaco é reconstituído num volume apropriado de um solvente farmaceuticamente aceitável (e.g., água, leite, uma bebida carbonatada, sumo, puré de maça, comida para bebé ou formulação para bebé). O produto de fármaco pode ser armazenado à temperatura ambiente durante até 48 horas antes da reconstituição. 5.6 Exemplo 6: Formulação de saquetas de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato (apenas para referência) A mistura é embalada utilizando uma bolsa ou saqueta que é constituída de múltiplas camadas laminadas que podem incluir uma camada de papel, uma camada de película de alumínio e uma camada de Surlyn. Cada saqueta pode conter cerca de 125 mg, cerca de 250 mg, cerca de 500 mg ou cerca de 1000 mg de ácido 3-[5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou hidrato. Excipientes (e as suas proporções do peso total de formulação) incluem opcionalmente qualquer dos seguintes como apresentado na Tabela 3 e na Tabela 4.
A saqueta é depois rotulada para indicar a identidade da substância de fármaco, o número de lote, a quantidade da substância de fármaco, e as condições de armazenamento (e.g., refrigeração a 2 a 8°C) . Antes da administração, uma quantidade apropriada do produto de fármaco é reconstituída num volume apropriado de um solvente farmaceuticamente aceitável (e.g., água, leite, uma bebida carbonatada, sumo, puré de maça, comida para bebé ou formulação para bebé). 0 produto de fármaco pode ser armazenado à temperatura ambiente durante até 48 horas antes da reconstituição. 5.7 Exemplo 7: Ensaio de diferença de potencial transepitelial (TEPD) (apenas para referência) A medição da diferença de potencial transepitelial (TEPD, Transepithelial Potential Difference), também conhecida como diferença de potencial nasal, proporciona uma avaliação sensível do transporte de sódio e cloreto diretamente nas células epiteliais secretoras através da avaliação das propriedades bioeléctricas transepiteliais (Knowles et al.r 1981, N. Engl. J. Med. 305(25) :1489-95; Knowles et ai., 1995, Hum. Gene Ther. 6:445) . O TEPD é realizado em cada narina utilizando técnicas padrão (Standaert et ai., 2004, Ped. Pulm. 37:385-92). No procedimento, utiliza-se um pequeno cateter de plástico para avaliar as diferenças eléctricas através da membrana celular exterior de células da mucosa nasal na narina. Os valores de TEPD são expressos em milivolts, ou mV. Uma condutância de cloreto igual a ou mais eletricamente negativa do que -5,0 mV é geralmente considerada como estando na gama normal. As avaliações de TEPD são efetuadas nas células do epitélio nasal que revestem o corneto inferior porque estas células são mais fáceis de aceder do que as células epiteliais respiratórias que revestem as vias aéreas inferiores, e foi mostrado que possuem as mesmas caracteristicas de transporte de iões (Knowles et al., 1981, Am. Rev. Respir. Dis. 124(4) :484-90) . As avaliações de TEPD podem também ser efetuadas em células epiteliais rectais e células epiteliais respiratórias inferiores. Por causa do papel da proteína CFTR no transporte de iões cloreto através de membranas celulares, e por causa da ausência desta proteína, os pacientes de fibrose cística têm condutância de cloreto de TEPD anormal. Como parâmetro, o TEPD tem a vantagem de poder detetar alterações de transporte de cloreto que são uma integração quantitativa da presença, atividade funcional, e localização apical da CFTR nas células das vias aéreas. Adicionalmente, é uma medida directa da atividade de CFTR que não é provavelmente afectada por tratamento suportivo ou paliativo para a CF (com a possível excepção de antibióticos de aminoglicósido administrados sistemicamente). É importante a evidência de que os valores de TEPD podem estar correlacionados com o grau de disfunção pulmonar e anormalidade radiográfica (Ho et al. , 1997, Eur. Respir. J. 10 ( 9) : 2018-22; Fajac et al., 1998, Eur. Respir. J. 12 ( 6) : 1295-300; Sermet-Gaudelus et al. , 2005, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 171(9) :1026-1031) . Em particular, a avaliação de TEPD da atividade de cloreto de CFTR induzida por isoproterenol tem demonstrado melhor valor preditivo do que o genótipo na determinação de FEV1 e pontuação radiológica (Ho et al. , 1997, Eur. Respir. J. 10(9):2018-22). Sob condições de linha de base, a atividade do canal de cloreto avaliada por TEPD muito improvavelmente se normalizará espontaneamente em pacientes com CF; é de esperar que quaisquer melhorias observadas na atividade do canal de cloreto avaliada por TEPD indiquem especificamente atividade farmacológica de terapias de correcção de CFTR. Por conseguinte, este tem-se tornado o parâmetro principal em estudos farmacológicos de Fase 1-2 e de substituição génica visando a correcção da disfunção de CFTR (Peckham et al., 1995, AJ. Clin. Sci (London) . 89(3) :277-84;
Wilschanski et al., 2003, N. Engl. J. Med. 349(15) :1433-41) . 5.8 Exemplo 8: Imunofluorescência de CFTR (apenas para referência) A colheita e processamento de curetagem da mucosa nasal a partir de cada narina de um paciente para medição da proteína CFTR, por imunof luorescência e por quantificação de ARNm de CFTR, é realizada utilizando técnicas padrão (Clancy et al., 2001, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163(7) :1681-92; Amaral et al., 2004, J. Cyst. Fibros. 3 Suppl 2:17-23) . A coloração de imunofluorescência de células epiteliais normais (por exemplo, a partir de raspagens da mucosa nasal) revela a presença da maior parte da proteína CFTR na superfície apical. Em modelos animais de CF mediada por mutação sem sentido ou em pacientes com CF mediada por mutação sem sentido, a coloração de CFTR está ausente (e.g., em pacientes homozigóticos em relação a uma mutação de paragem prematura) ou é principalmente observada na região perinuclear (e.g., em pacientes com uma mutação F508 que impede o tráfego intracelular normal de CFTR). A produção bem-sucedida de proteína CFTR do tipo não selvagem ou selvagem funcional tanto em modelos animais como em pacientes tem sido associada ao reaparecimento de proteína CFTR epitelial apical conforme avaliado por imunofluorescência (Clancy et al. , 2001, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163(7):1683-92; Wilschanski et al., 2003, N. Engl. J. Med. 349(15):1433-41). 5.9 Exemplo 9: Testes de função pulmonar (apenas para referência)
Testes da função pulmonar, incluindo FEVi, FVC e MEF25- 75 são medidos utilizando procedimentos de espirometria padrão.
As avaliações da função pulmonar (incluindo MEF25-75, FVC e, particularmente, FEVi) têm sido reconhecidas como parâmetros clínicos definitivos em pacientes com CF (Food and Drug Administration, 62nd Anti-Infective Drugs Advisory Committee. "Discussion of NDA for tobramycin solution for inhalation (Tobi®) for the management of cystic fibrosis patients". Novembro de 1997; Tiddens, 2002, Pediatr. Pulmonol. 34(3) : 228-31) . Tem sido mostrado que o FEVi e outras medidas de ensaio de função pulmonar estão correlacionadas com a gravidade da doença, morbilidade prevista em termos de utilização dos cuidados de saúde e utilização de antibióticos IV, e indicam o risco de mortalidade relacionada com CF (Food and Drug Administration, 62nd Anti-Infective Drugs Advisory Committee. "Discussion of NDA for tobramycin solution for inhalation (Tobi®) for the management of cystic fibrosis patients". Novembro de 1997). 0 ensaio da função pulmonar é simples de administrar (mesmo em pacientes tão novos quanto os com 7 anos de idade), e utiliza equipamento padrão e técnicas que estão amplamente disponíveis. A interpretação é realizada utilizando equações normativas bem estabelecidas que têm em conta a idade, altura e género do paciente. A melhoria em FEVi tem sido reconhecida como demonstrando quantitativamente o benefício clínico significativo na CF, e tem servido como a base para a aprovação reguladora de dornase alfa e tobramicina inalada (Food and Drug Administration, 62nd Anti-Infective Drugs Advisory Committee. "Discussion of NDA for tobramycin solution for inhalation (Tobi®) for the management of cystic fibrosis patients". Novembro de 1997). 5.10 Exemplo 10: Estudo de Fase 2 de ácido 3-[5-(2- fluorofenil) - [1, 2,4] oxadiazol-3-il] -benzóico_como_um tratamento oral para fibrose cística mediada por mutação sem sentido
Os pacientes têm que ter satisfeito todas as condições seguintes para serem elegíveis para arrolamento no estudo: 1. Diagnóstico de CF com base em evidência documentada de um teste de suor conclusivamente anormal (cloreto do suor >60 mEq/litro por iontoforese de pilocarpina (LeGrys, Sweat testing: Sample collection and quantitative analysis: Approved guidelines - Second edition. National Committee for Clinical Laboratory Standards 2000; Vol 20:14)); 2. Secreção de cloreto anormal conforme medido pelo TEPD (uma avaliação de TEPD de secreção de cloreto mais positivo do que -5 mV com amilorida isenta de cloreto e isoproterenol); 3. Presença de uma mutação sem sentido num dos alelos do gene cftr; 4. Documentação de que a sequenciação do gene cftr foi realizada; 5. Idade > 18 anos; 6. Peso corporal >40 kg; 7. FEVi >40% do previsto para a idade, género e altura (normas Knudson) (Knudson, 1983, Am. Rev. Respir. Dis. 127: 725-734); 8. Saturação de oxigénio (conforme medida por oximetria de pulso >92% em ar ambiente; 9. Vontade dos pacientes masculinos e femininos, se não cirurgicamente estéreis, para se absterem de terem relações sexuais ou utilizar um método de contraceção de barreira ou médico durante o estudo de administração de fármaco e períodos de seguimento; 10. Teste de gravidez negativo (para mulheres com potencial para engravidar); 11. Vontade e capacidade para cumprirem o programa de visitas, plano de administração de fármaco, procedimentos de estudo (incluindo medições de TEPD, testes laboratoriais clínicos, e amostragem PK), e restrições do estudo; 12. Capacidade para fornecer consentimento informado por escrito; e 13. Evidência de terem assinado e datado pessoalmente o documento de consentimento informado indicando que o paciente foi informado de todos os aspetos pertinentes do ensaio. A presença de qualquer das condições seguintes excluía um paciente do arrolamento no estudo: 1. Condição médica anterior ou em curso (e.g., doença concomitante, condição psiquiátrica, alcoolismo, abuso de drogas), história médica, resultados de exame físico, resultados de ECG, ou resultado laboratorial anormal que, na opinião do investigador, possa afetar adversamente a segurança do paciente, que torne improvável que o curso de tratamento ou seguimento sejam completados, ou possam prejudicar a avaliação dos resultados do estudo; 2. Doença aguda em curso incluindo infecções respiratórias agudas superiores ou inferiores nas 2 semanas antes do início do tratamento de estudo; 3. História de complicações importantes de doença pulmonar (incluindo hemoptise maciça ou pneumotórax recentes) nos 2 meses antes do início do tratamento de estudo; 4. Anomalias no rastreio de raios x torácico sugerindo outra doença pulmonar activa clinicamente significativa que não CF, ou novas anomalias significativas tais como atelectasia ou efusão pleural que podem ser indicativas de envolvimento pulmonar ativo clinicamente significativo secundário à CF; 5. Antigénio de superfície da hepatite B, teste de anticorpo de hepatite C ou teste de vírus de imunodeficiência de humano (VIH), positivos; 6. Hemoglobina <10 g/dL; 7. Albumina de soro <2,5 g/dL; 8. Função hepática anormal (bilirrubina total no soro > o limite superior do normal, ou ALT, AST ou GGT no soro >2,0 vezes o limite superior do normal); 9. Função renal anormal (creatinina no soro >1,5 vezes o limite superior do normal); 10. Gravidez ou em amamentação; 11. História de transplante hematológico ou de órgãos sólidos; 12. Exposição a outro fármaco de investigação nos 14 dias antes do início do tratamento de estudo; 13. Participação em curso em qualquer outro ensaio clínico terapêutico; 14. Utilização em curso de agonistas de recetor gama ativado por proliferador de peroxissoma (PPAR ) tiazolidinadiona, e.g., rosiglitazona (Avandia® ou equivalente) ou pioglitazona (Actos® ou equivalente); 15. Alteração em medicações intranasais (incluindo utilização de corticosteroides, cromolina, brometo de ipratrópio, fenilefrina ou oximetazolina) nos 14 dias antes do início do tratamento de estudo; 16. Alteração no tratamento com corticosteroides sistémicos ou inalados nos 14 dias antes do início do tratamento de estudo; 17. Utilização de ou necessidade de gentamicina ou amicacina inaladas nos 14 dias antes do início do tratamento de estudo ou durante o tratamento de estudo; ou 18. Necessidade de antibióticos de aminoglicósido sistémicos nos 14 dias antes do início do tratamento de estudo. O ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]- benzóico foi fornecido numa formulação aqui descrita. A 15 pacientes (12 de um ensaio de Fase 2 conduzido em Israel e 3 de um ensaio de Fase 2 conduzido nos Estados Unidos; sete pacientes eram do sexo masculino e 8 do sexo feminino; os pacientes tinham uma idade mediana de 22 anos; e todos os pacientes tinham múltiplos sinais e sintomas de fibrose cística, incluindo algum grau de disfunção pulmonar) administrou-se oralmente ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico de acordo com o programa de 56 dias seguinte: administração de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[ 1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico três vezes por dia (TID) com 4 mg/kg, 4 mg/kg e 8 mg/kg durante 14 dias, seguindo-se nenhum tratamento durante 14 dias (Ciclo 1, consistindo de 28 dias), seguindo-se a administração de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[ 1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico três vezes por dia (TID) com 10 mg/kg, 10 mg/kg e 20 mg/kg durante 14 dias, seguindo-se nenhum tratamento durante 14 dias (Ciclo 2, consistindo de 28 dias).
Os parâmetros clínicos foram avaliados utilizando os procedimentos apresentados acima. As medições de TEPD foram efetuadas antes do início do tratamento e aos dias 14 e 28 do Ciclo 1 e do Ciclo 2. A curetagem da mucosa nasal foi colhida a partir de cada narina de cada paciente antes do tratamento e aos dias 14 e 28 do Ciclo 1 e do Ciclo 2. Os testes pulmonares, incluindo FEVi, FVC e MEF25-75, foram efectuados antes do tratamento, ao dia -1 do Ciclo 2, aos dias 13 ou 14 do Ciclo 1 e aos dias 13 ou 14 do Ciclo 2 no estudo conduzido em Israel e os mesmos parâmetros foram medidos antes do tratamento e aos dias 13 ou 14 do Ciclo 2 no estudo conduzido nos Estados Unidos.
Alteração média na condutância de cloreto de TEPD. Esta é a média das alterações desde o início até ao final do período de tratamento na condutância de cloreto de TEPD em cada participante no estudo. Por exemplo, se as alterações em condutância de cloreto de TEPD em cada um de três participantes foram -7,0 mV, -2,0 mV e -9,0 mV, a alteração média em condutância de cloreto de TEPD entre estes participantes seria -6,0 mV.
Percentagem de pacientes com uma resposta de condutância de cloreto. Esta é a percentagem de pacientes que demonstraram uma resposta de condutância de cloreto de TEPD no final do tratamento com ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico. Para efeitos dos ensaios, uma resposta de condutância de cloreto é definida como uma melhoria da condutância de cloreto de TEPD de pelo menos -5 mV. Por exemplo, num paciente com um valor de condutância de cloreto de TEPD de +1,0 mV na linha de base e um valor de condutância de cloreto de TEPD de -6,0 mV no final do tratamento, a melhoria da condutância de cloreto de TEPD seria -7,0 mV, representando uma resposta de condutância de cloreto.
Percentagem de pacientes com melhorias de valores de condutância de cloreto de TEPD no intervalo normal. Como notado acima, uma condutância de cloreto igual a ou mais eletricamente negativa do que -5,0 mV é geralmente considerada como no intervalo normal. Como tal, um paciente com um valor de condutância de cloreto de TEPD de +1,0 mV na linha de base seria considerado como tendo um nível anormal porque o valor é mais eletricamente positivo do que -5,0 mV. Se, no final do tratamento, o valor de condutância de cloreto de TEPD desse paciente tiver melhorado para -6,0 mV, isto representaria uma melhoria no intervalo normal porque o valor melhorado é mais eletricamente negativo do que -5,0 mV.
Com base no género, idade e altura do paciente, o valor de FEVi médio na entrada do estudo era 66% do normal e o valor de FVC médio na entrada do estudo era 80% do normal. Catorze dos 15 pacientes incluídos na análise tinham colonização das vias aéreas com Pseudomonas aeruginosa, uma infeção bacteriana comum em pacientes de fibrose cística que pode conduzir a pneumonia grave. Catorze dos 15 pacientes tinham também insuficiência pancreática e necessitavam de terapia de substituição de enzima pancreática crónica. Os pacientes tinham pesos corporais baixos, com um peso médio de 58,3 kg na entrada do estudo. A Tabela 5 apresenta os resultados de TEPD para os 15 pacientes. Para cada medição, os resultados são apresentados baseados na melhor das narinas e na média de ambas as narinas. Historicamente, os resultados de testes de TEPD tem tipicamente sido apresentados baseados na melhor das narinas. No entanto, linhas de orientação recentes estabelecidas pela Cystic Fibrosis Therapeutics Development Network recomendam que os resultados de TEPD sejam apresentados em ambas as bases. Notaram-se melhorias na condutância de cloreto de TEPD em pacientes com diferentes tipos de mutações sem sentido no gene de CFTR.
Os efeitos do tratamento para os níveis de dose inferior e superior de ácido 3-[5-(2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico não foram estatisticamente significativos, sugerindo que pode não ser necessário um aumento adicional da dose e que mesmo doses mais baixas de ácido 3— [5— (2 — fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico podem ser eficazes em melhorar a condutância de cloreto de TEPD. Observaram-se também resultados estatisticamente significativos e tendências positivas para parâmetros secundários. Em particular, ainda que os ensaios não estivessem capacitados para detetar alterações estatisticamente significativas em parâmetros secundários, observaram-se melhorias estatisticamente significativas desde a entrada no estudo até ao final do ciclo de tratamento com a dose mais elevada em FEVi, FVC e peso médios dos pacientes. A Tabela 6 apresenta os resultados. Para as alterações na função pulmonar, um paciente não foi incluído porque esse paciente não teve a função pulmonar medida no final do ciclo de tratamento com a dose mais elevada.
Adicionalmente, ainda que as alterações nos sintomas do paciente não fossem formalmente medidas através da utilização de um questionário de qualidade de vida, foi solicitado aos investigadores do ensaio que averiguassem alterações nos sintomas de fibrose cística dos pacientes. Nos 15 pacientes incluídos na análise intermédia, 6 reportaram melhorias gerais de bem-estar, 6 reportaram diminuição de tosse e 10 reportaram espessura de muco diminuída e eliminação de muco mais fácil. 5.11 Exemplo 11: Expressão de distrofina, sarcoglicano e distroglicano por imunofluorescência e Western Blotting (apenas para referência) É realizada biópsia do músculo EDB e da pele sobrejacente a partir de um pé sob anestesia local e sedação consciente (em alguns casos, pode ser requerida anestesia geral) antes do tratamento, e a partir do outro pé no último dia de tratamento. O procedimento de biópsia é realizado utilizando técnicas padrão (Stedman, 2000, Human Gene Therapy 11:777-90) . O ventre do músculo inteiro (sempre que possível) é removido no procedimento. No momento da colheira da biópsia antes do tratamento, a amostra de músculo é dividida em pelo menos 3 fragmentos e a amostra de biópsia colhida no último dia de tratamento é dividida em pelo menos 2 fragmentos. A amostra de biópsia é colocada sobre uma esponja de gaze Telfa humedecida com solução salina de Ringer. A amostra de biópsia é observada a baixa potência ao microscópio estéreo de dissecção para estabelecer a orientação das fibras. 0 músculo é então seccionado utilizando um bisturi afiado de modo transversal (perpendicular à orientação das fibras) sempre que possível e deixou-se repousar durante 2 minutos para permitir a cessação do espasmo. A amostra é depois congelada em isopentano arrefecido em azoto líquido, transferida para um reservatório de azoto líquido e mantida 1 polegada acima da interface líquido/vapor durante 2 minutos de arrefecimento lento e evaporação de isopentano, antes da imersão no azoto líquido, e envolta em película pré-arrefecida (em azoto líquido e armazenada em gelo seco) marcada com o número do estudo, número do local, número do paciente, data, iniciais do paciente e lado do pé (pé direito ou pé esquerdo).
Todos os recipientes de amostra são claramente rotulados de um modo que identifique o sujeito e a data da colheita. Os rótulos são fixados aos recipientes de amostra de uma maneira que impede que o rótulo se desprenda. As amostras são expedidas para análise/cultura/revisão central imediatamente após o procedimento ser realizado. Para a deteção de distrofina, utilizam-se três anticorpos disponíveis comercialmente que reconhecem o terminal C, o terminal N e o domínio haste da proteína. Para deteção do complexo sarcoglicano e distroglicano, utilizam-se sempre que possível anticorpos disponíveis comercialmente contra , , e -sarcoglicai -distroglicano. Utiliza-se microscopia de epifluorescência na análise; as imagens são captadas pela câmara CCD, após normalização da intensidade de fluorescência contra uma amostra de músculo normal. As imagens são armazenadas digitalmente e preservadas para avaliação futura, e avaliação final no fim do estudo. Os tecidos são também processados para deteção de distrofina, dos sarcoglicanos e de -distroglicano por Western blotting utilizando os mesmos anticorpos. As imagens microscópicas são capturadas e preservadas para avaliação futura, e para avaliação final no fim do estudo. As restantes amostras de tecido muscular são preservados para testes de confirmação de ARNm e proteínas envolvidas na DMD. Utilizam-se imunocoloração e Western blotting para a deteção de proteínas.
As biópsias de músculo são realizadas habitualmente em sujeitos com DMD como um componente de diagnóstico e como medidas do efeito terapêutico no contexto de estudos de investigação. 0 EDB foi escolhido porque este não é um músculo essencial para as atividades diárias e por conseguinte a amostragem deste músculo não tem consequência funcional adversa para o sujeito. Porque é pouco utilizado, é improvável que o músculo EDB demonstre substituição fibrótica substancial de músculo e assim proporciona um tecido apropriado para deteção da produção de distrofina. A amostragem do músculo EDB oferece vantagens práticas adicionais porque é fácil de identificar, pode ser dissecado sob anestesia local e proporciona quantidades suficientes de tecido para a realização das análises necessárias. Imunofluorescência e Western blotting são testes de rotina realizados em amostras de biópsia de músculo para confirmar a presença ou ausência de distrofina a todo o comprimento. Uma ausência de distrofina é considerada como a confirmação do diagnóstico de DMD. A restauração da distrofina, com localização na membrana muscular, tem sido considerada uma medida directa da atividade farmacodinâmica pré-clinica e clinica (Barton-Davis, 1999, J. Clin. Invest. 104 (4) : 375-81; Politano, 2003, Acta Myol. 22(1) : 15-21) . 5.12 Exemplo 12: Miometria de extremidade superior e inferior (apenas para referência) A miometria superior e inferior é realizada utilizando um miómetro de mão seguindo procedimentos padrão (Beenakker, 2001, Neuromuscul. Disord. 11 (5) :441 — 6; Hyde, 2001, Neuromuscul. Disord. 11(2) :165-70) . Recomenda-se (dependendo do estado funcional de linha de base do sujeito) que os grupos de músculos avaliados incluam abdutores do quadril, extensores do joelho, flexores e extensores do cotovelo, e aperto de mão. Podem ser efetuadas avaliações bilaterais, e podem ser registados três medições a partir de cada grupo de músculos de cada lado. Estes parâmetros são monitorizados antes do tratamento, desde o segundo até ao último dia de tratamento, e durante um período de seguimento após o tratamento. Durante os períodos de pré-tratamento e de tratamento, os procedimentos de miometria são realizados antes da biópsia do músculo.
Avaliações de miometria utilizando um dinamómetro de mão são uma medida sensível e reprodutível da força muscular em sujeitos de ambulatório e não ambulatório (Beenakker, 2001, Neuromuscul. Disord. ll(5):441-6; Hyde, 2001, Neuromuscul. Disord. 11(2):165-70). A fiabilidade entre avaliadores em sujeitos com distrofia muscular é elevada (Stuberg, 1988, Phys. Ther. 1988, 68(6): 977-82; Hyde, 2001, Neuromuscul. Disord. 11(2): 165-70). Em comparação com o teste de força muscular manual, a miometria é uma medida mais sensível e menos complexa da função muscular (McDonald, 1995, Am. J. Phys. Med. Rehabil. (5 Suppl): S70-92). O teste pode ser facilmente administrado pelo avaliador (por exemplo, médico ou fisioterapeuta). 5.13 Exemplo 13: Testes de função cronometrada (apenas para referência)
Os testes de função temporizados incluem o tempo necessário para ficar de pé a partir de uma posição de deitado, o tempo necessário para caminhar 10 metros e o tempo necessário para subir 4 degraus de tamanho padrão (Mendell, 1989, N. Engl. J. Med. 320(24) :1592-7; Griggs, 1991, Arch. Neurol. 48(4) :383-8) . Estes parâmetros são monitorizados antes do tratamento, desde o segundo até ao último dia de tratamento, e durante um período de seguimento após o tratamento. Durante os períodos de pré-tratamento e de tratamento, os testes de função cronometrada são realizadas antes da biópsia do músculo.
Estes testes (tempo necessário para ficar de pé a partir de uma posição de deitado, tempo necessário para caminhar 10 metros e tempo necessário para subir 4 degraus de tamanho padrão) fornecem uma medida adicional da capacidade funcional em pacientes de ambulatório. Os testes são reprodutíveis, habitualmente utilizados, fáceis de administrar e têm resposta documentada à intervenção terapêutica com esteróides (Mendell, 1989, N. Engl. J. Med. 320(24) :1592-7; Griggs, 1991, Arch. Neurol. 48(4) :383-8) . 5.14 Exemplo 14: Níveis de CK no soro (apenas para referência) A atividade de CK no soro é avaliada utilizando um ensaio cinético ligado a NADH disponível comercialmente (Diagnostic Chemicals Ltd., Oxford, CT) . Os níveis séricos de CK são medidos antes do tratamento, ao dia 1 (antes da primeira dose), dia 7, dia 14, dia 21 e dia 27 durante o período de tratamento, e ao dia 42 e dia 56 após o tratamento. A CK no soro está aumentada na distrofia muscular de Duchenne e por isso é um marcador de diagnóstico facilmente mensurável para a doença e pode servir como um biomarcador potencial para a atividade farmacológica do fármaco (Mendell et al. , 1989, New Eng. J. Med. 320(24):1592-1597). CK no soro fornece uma medida da integridade muscular em todo o corpo. As concentrações desta enzima no soro estão aumentadas 50 a 100 vezes em sujeitos com DMD e medições dos seus níveis são utilizadas no diagnóstico precoce da doença (Worton, "The muscular dystrophies", Em: Scriver C.R., Beaudet A. L., Sly W.S., Valle D, eds. "The metabolic and molecular basis of inherited disease". 8.a ed. Vol. 4. New York: McGraw-Hill, 2001:5493-523) . Os níveis de CK no soro são medidos para monitorizar a progressão da doença e servem como um marcador da lesão muscular. Embora alterações induzidas pelo exercício introduzam variabilidade (Politano, 2003, Acta Myol. 22(1):15-21), o marcador tem vantagens porque pode ser avaliado facilmente, repetidamente e frequentemente com um ensaio amplamente disponível e fiável. Estudos clínicos anteriores mostraram decréscimos na CK sérica coincidentes com melhorias na força muscular durante o tratamento com esteróides (Reitter, 1995, Brain Dev. 17 Suppl:39-43) . 5.15 Example 15: Cultura de fibroblastos dérmicos e células de músculo (apenas para referência) São realizados estudos em tecido muscular e pele de pacientes para determinar se a produção de distrofina em culturas primárias do músculo dos pacientes corresponde à produção de distrofina in vivo. Estas experiências avaliam se fibroblastos dérmicos a partir de pacientes, quando diferenciados em células musculares in vitro por transfecção com uma construção de expressão produzindo Myo-D (Wang, 2001, Development 128: 4623-33), demonstram a produção de distrofina em resposta ao tratamento. Correlações de resposta das células da pele com atividade clínica podem oferecer um teste preditivo fácil de obter na selecção de futuros pacientes para terapia ou no rastreio de novos agentes para o tratamento de DMD. As células são cultivadas como se segue. Material de biópsia é armazenado durante o transporte em meio de proliferação de humano (ou PBS), e em gelo durante períodos de tempo mais longos, se necessário. Se o tecido não é preparado em 24 horas, o material pode ser congelado em meio de proliferação de humano contendo 10% de DMSO e armazenado em azoto líquido (ou gelo seco) . No momento em que o tecido deve ser preparado para estabelecimento da cultura de mioblastos, o material de biopsia é lavado em PBS. Adiciona-se PBS suficiente a uma placa de cultura para manter o tecido húmido. O material da biópsia é triturado exaustivamente com lâminas de barbear, no sentido de uma suspensão quase homogénea. Adicionam-se aproximadamente 2 ml de solução de colagenase/dispase/CaCl2 por grama de tecido e continua-se a trituração durante vários minutos (e.g., para uma biópsia de músculo de 5 x 5 x 5 mm utiliza-se 1 ml de solução enzimática). A suspensão é transferida para um tubo estéril e incubada a 37°C num banho de água até a mistura ser uma pasta fina (e.g., cerca de 20 a 30 minutos). A suspensão é homogeneizada adicionalmente por pipetagem para cima e para baixo várias vezes durante a incubação. Podem ser realizados se necessário ciclos adicionais de ressuspensão por pipetagem para cima e para baixo com uma seringa. Adicionam-se 8 ml de meio de proliferação de humano à suspensão e mistura-se. A mistura é centrifugada durante 10 minutos a 1200 rpm. Ressuspende-se o sedimento celular em 3 ml de meio de proliferação de humano. As células são plaqueadas num poço de uma placa de 6 poços revestidos a colagénio, ou, dependendo da quantidade de material, num balão T25 revestido as colagénio. As células são cultivadas durante 48 horas, a 37°C e 5% de CO2. Células não fixadas são removidas e transferidas para outro poço revestido a colagénio (como reserva). Adiciona-se meio de proliferação fresco ao primeiro poço (3 mL) . As células são cultivadas a partir do primeiro poço até à confluência e até serem obtidos dois balões T75 confluentes. Para armazenamento, as células podem ser congeladas a partir de um balão T75 em 4 criotubos com 1 ml de meio de congelação. O teor da cultura em células miogénicas é determinado através da realização de uma coloração por desmina. O pré-plaqueamento das culturas é necessário se a percentagem de células positivas em relação a desmina for muito baixa. 5.16 Exemplo 16: Estudo de Fase 2 de ácido 3-[5-(2- fluorofenil) - [1, 2,4] oxadiazol-3-il] -benzóico_como_um tratamento oral para distrofia muscular de Duchenne
Os sujeitos têm que ter satisfeito todas as condições seguintes para serem elegíveis para arrolamento no estudo: 1. Diagnóstico de distrofia muscular de Duchenne (DMD) com base num fenótipo clínico evidenciado aos 5 anos de idade, com CK sérica aumentada e ausência de distrofina numa biópsia de músculo (coloração sarcolemal negativa com um anticorpo em relação à porção C-terminal da proteína distrofina); 2. Presença de uma mutação sem sentido no gene da distrofina; 3. Documentação de que a sequenciação do gene da distrofina foi realizada ou, se a sequenciação não tiver sido ainda realizada, de que uma amostra de sangue foi enviada para a sequenciação de confirmação do gene de distrofina; 4. Exame físico ou evidência de imagiologia radiográfica de músculos EDB em ambos os pés; 5. Capacidade para caminhar; 6. Sexo masculino; 7. Idade >5 anos; 8. Vontade para se absterem de terem relações sexuais ou utilizar um método de contraceção de barreira ou médico durante o estudo de administração de fármaco e períodos de seguimento em sujeitos reconhecidos como sexualmente ativos; 9. Vontade e capacidade para cumprirem o programa de visitas, plano de administração de fármaco, testes de laboratório, restrições do estudo e procedimentos de estudo (incluindo biópsias de músculo, miometria e amostragem PK); 10. Capacidade para fornecer consentimento informado por escrito se >18 anos de idade, ou acordo informado por escrito (com consentimento parental/tutor) se >7 anos de idade. Se o sujeito tem <7 anos se idade, será somente obtido o consentimento parental/tutor; e 11. Evidência de terem assinado e datado pessoalmente o documento de consentimento informado (acordo também requerido para crianças com >7 anos de idade) indicando que o sujeito/progenitor/tutor legal foram informados de todos os aspetos pertinentes do ensaio que deverão ser seguidos. A presença de qualquer das condições seguintes excluirá um paciente do arrolamento no estudo: 1. Condição médica anterior ou em curso (e.g., doença concomitante, condição psiquiátrica, alcoolismo, abuso de drogas), história médica, resultados de exame físico, resultados de ECG, ou resultado laboratorial anormal que, na opinião do investigador, possa afetar adversamente a segurança do paciente, que torne improvável que o curso de tratamento ou seguimento sejam completados, ou possam prejudicar a avaliação dos resultados do estudo; 2. Sintomas clínicos e sinais de insuficiência cardíaca congestiva (Fase C ou Fase D do American College of Cardiology/American Heart Association) (Hunt, 2001, J. Am. Coll. Cardiol. 38:2101-13); 3. Antigénio de superfície da hepatite B, teste de anticorpo de hepatite C ou teste de vírus de imunodeficiência de humano (VIH), positivos; 4. Hemoglobina <10 g/dL; 5. Albumina de soro <2,5 g/dL; 6. GGT ou bilirrubina total anormais (>limite superior do normal de laboratório); 7. Função renal anormal (creatinina no soro >1,5 vezes o limite superior do normal de laboratório); 8. História de transplante hematológico ou de órgãos sólidos; 9. Terapia imunossupressora em curso (outra que não corticosteroides); 10. Exposição a outro fármaco de investigação nos 28 dias antes do início do tratamento de estudo; 11. Participação em curso em qualquer outro ensaio clínico terapêutico; 12. Utilização em curso de agonistas de recetor gama ativado por proliferador de peroxissoma (PPAR ) tiazolidinadiona, e.g., rosiglitazona (Avandia® ou equivalente) ou pioglitazona (Actos® ou equivalente); 13. Alteração na terapia sistémica com corticosteroides (e.g., início de tratamento; cessação de tratamento; alteração de dose, programa ou tipo de esteróide) nos 3 meses antes do início do tratamento de estudo; ou 14. Tratamento com antibióticos de aminoglicósido sistémicos nos 3 meses antes do início do tratamento de estudo. 0 3-[5-(2-fluorofenil)-[l,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico foi fornecido numa formulação aqui descrita. 0 tratamento foi administrado durante 28 dias para cada grupo de tratamento. Um grupo inicial de pacientes (n=6) foram tratados diariamente durante 28 dias com ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico com 4, 4 e 8 mg/kg TID. Após revisão dos resultados de segurança clinica, um segundo grupo de pacientes (n=20) foram tratados diariamente durante 28 dias com ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico com 10, 10 e 20 mg/kg TID. Assim, cada paciente recebeu um total de 84 doses de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico. A restauração parcial ou aumento da distrofina na membrana do músculo extensor digitorum brevis por coloração em relação ao domínio C-terminal da proteína foi demonstrada em alguns pacientes para ambos os níveis de dose ao dia 28 em relação à linha de base. Os parâmetros farmacocinéticos médios obtidos no estudo são apresentados abaixo na Tabela 7 e são também mostrados na FIG. 1.
O sangue para determinação das concentrações de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico é colhido imediatamente pré-dose e às 3 horas após administração da primeira dose diária de fármaco de estudo no segundo dia de cada visita.
Registam-se o doseamento de fármaco de estudo e os tempos de colheita de amostras. Se se utiliza um cateter venoso heparinizado para colheita de amostras, de modo a evitar repetidas picadas de agulha, são removidos e rejeitados pelo menos 2 mL de sangue antes de cada colheita de amostra de modo a evitar a contaminação da amostra com heparina. São realizados todos os esforços para colher as amostras de sangue no tempo programado, ou dentro de ±5 minutos. 0 tempo da colheita de sangue é em relação ao tempo de doseamento do fármaco de estudo.
Cada amostra compreende 2 mL de sangue venoso colhido para um tubo Vacutainer® de 5 mL ou equivalente com K3-EDTA como anticoagulante. Imediatamente após a colheita, o tubo é suavemente invertido 8 a 10 vezes para misturar o anticoagulante com a amostra de sangue. O tubo é armazenado na vertical sobre gelo até à centrifugação; a centrifugação e o processamento da amostra são executados no prazo de 1 hora da colheita da amostra. A fração de plasma é separada colocando o tubo de colheita numa centrifugadora refrigerada (4 a 8°C) num rotor horizontal (com uma cabeça oscilante) durante um minimo de 15 minutos a uma força centrífuga relativa (RCF) de 1500 a 1800. A fração de plasma é retirada com uma pipeta e dividida em 2 tubos de congelação de polipropileno (com cada tubo recebendo alíquotas aproximadamente iguais). Todos os tubos de colheita de amostras e congelação são claramente rotulados de um modo que identifica o sujeito, o período de estudo, bem como a data e o tempo de colheita. Os rótulos são fixados aos tubos de congelação de modo a impedir que o rótulo se desprenda após a congelação. Após o processamento, as amostras são colocadas num congelador a cerca de -20°C (ou inferior).
Para proteção contra a perda de amostras, as amostras são divididas em duas remessas, cada uma contendo 1 alíquota de plasma para cada ponto temporal (1 alíquota pré-dose e 1 alíquota pós-dose). As primeiras alíquotas das amostras são expedidas nos 28 a 30 dias após a colheita. Amostras de múltiplos sujeitos podem ser enviadas em conjunto como parte de uma única remessa. Antes da expedição, as amostras são embaladas em recipientes isolados termicamente com gelo seco suficiente para assegurar que estas permanecem congeladas e são protegidas contra quebra durante o transporte. As amostras são expedidas durante a noite através de correio prioritário.
As amostras são armazenadas para análise de ácido 3 — [5 — (2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico no final do estudo, utilizando um método validado de cromatografia liquida de alta eficiência com espectrometria de massa em tandem (HPLC/MS-MS). Posteriormente, as amostras são mantidas para eventuais análises posteriores. 0 parâmetro principal no ensaio era a proporção de pacientes com um aumento na expressão de distrofina no músculo durante 28 dias de tratamento com ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico. Estavam disponíveis dados de imunofluorescência pré e pós-tratamento de músculos EDB a partir de todos os 38 pacientes. Como se mostra na Tabela 8, os dados mostraram que, para ambos os níveis de dose, os pacientes evidenciaram melhorias qualitativas na coloração para distrofina. No geral, quatro dos seis (67%) (IC a 90%, 27-94%) pacientes tratados com os níveis de dose de 4, 4, 8 mg/kg, 10 dos 20 (50%) (IC a 90%, 30-70%) pacientes tratados com os níveis de dose de 10, 10, 20 mg/kg, e 6 dos 12 (50%) (IC a 90%, 50-75%) dos pacientes tratados com os níveis de dose 20, 20, 40 mg/kg evidenciaram um aumento na expressão de distrofina pós-tratamento. A resposta não pareceu estar dependente da expressão de distrofina pré-tratamento (ausente vs. mínima), idade, uso de esteróides, ou localização ou tipo de mutação sem sentido. Células musculares primárias pré-tratamento de 24 dos 26 rapazes nos 2 primeiros grupos estavam disponíveis para cultura de miotubo in vitro. Quando cultivadas na presença de ácido 3-[5- (2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico, as culturas de miotubos evidenciaram um aumento dependente da dose na expressão de distrofina em resposta ao tratamento com ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[l,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico. Para uma concentração de 10 g/ml, 24 de 24 (100%) mostraram produção de distrofina a todo o comprimento, sugerindo o potencial para supressão da mutação sem sentido em todos os indivíduos se forem atingidas concentrações suficientes. A maioria dos indivíduos que receberam os níveis de dose 4, 4, 8 mg/kg; os níveis de dose 10, 10, 20 mg/kg; ou os níveis de dose 20, 20, 40 mg/kg apresentou diminuições na CK quando se compararam os valores de fim-de-tratamento com os valores de pré-tratamento. Estas alterações eram estatisticamente significativas (p = 0,03, p = 0,002, p = 0,001 para as doses baixa, intermédia e elevada, respetivamente). O retorno dos valores médios de volta à linha de base após cessação do tratamento proporcionou suporte adicional para a atividade farmacológica.
Para variações deste protocolo, para cada nível de dose, é recomendado que o ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico seja tomado TID com intervalos de 6, 6 e 12 horas (± 30 minutos) . Idealmente cada dose é tomada nos 30 minutos após uma refeição (e.g., -7:00 AM após o pequeno-almoço, 1:00 PM após o almoço e -7:00 PM após o jantar). Embora se reconheça que possam ocorrer variações no programa de doseamento em ambiente de ambulatório, recomenda-se que o regime prescrito (incluindo intervalos de doseamento e a relação entre doseamento e refeições) seja seguido de perto nos dias de colheita de amostras PK. Parâmetros clínicos são avaliados utilizando os procedimentos estabelecidos acima. 5.17 Exemplo 17: Avaliação quantitativa de tosse É geralmente reconhecido que a tosse excessiva compromete como as pessoas se sentem e funcionam. Entre as razões mais frequentes pelas quais os pacientes procuram tratamento de cuidados de saúde primários nos Estados Unidos está a tosse (Hing et al., 2006, Adv. Data 374:1-33) . Os pacientes com tosse crónica descrevem frustração, irritabilidade, ira com a natureza disruptiva da tosse, e o impacto negativo no sono e nas interações sociais (Kuzniar et al., 2007, Mayo Clin. Proc. 82(1):56-60). Em pacientes com fibrose cística (CF), a tosse está entre os sintomas relacionados com doença mais proeminentes, e aumentos da tosse nos períodos diurno e nocturno, em conjunto com aumentos na produção de expectoração, são as razões mais comuns para procurar cuidados médicos não programados (Sawicki et al. , 2006, Ped. Pulm., Suppl. 29:344 (#388)) . A tosse na CF está provavelmente relacionada com a obstrução das vias aéreas com secreções mucopurulentas e com a inflamação crónica das vias aéreas; tosse substancialmente aumentada anuncia geralmente uma exacerbação pulmonar e está associada com diminuições em FEV1 e aumentos nos marcadores inflamatórios (Smith et al. , 2006, Thorax 61(5):425-9). Frequências de tosse crónica diurna de 2 a 5 tossidas por hora foram documentadas em pacientes com CF logo após terem completado o tratamento para uma exacerbação pulmonar (Id.), mas são provavelmente mais elevados num ambiente de ambulatório; indivíduos normais têm geralmente menos tossidas num dia inteiro (Hsu et al., 1994, Eur. Respir. J. 7(7); 1246-1253) . A avaliação subjetiva da tosse é muitas vezes comprometida por acomodação do paciente ao carácter crónico do evento e consequente incapacidade de recordar quanta tosse ocorreu; os pacientes tendem a não reportar episódios de tosse e muitas vezes há pouca correlação entre uma avaliação da tosse objetiva e subjetiva Id.; Coyle et al., 2005, Cough 1:3; Smith et al., 2006, Thorax 61(5):425-9). O VivoMetrics, Inc. LifeShirt® incorpora transdutores com sensores de movimento, elétrodos, um microfone de garganta, um saco de calibração, e um acelerómetro de 3 eixos num colete lavável leve que está disponível para pacientes com >5 anos de idade (ver LifeShirt® Monitoring System QuickStart Guide). Usando a entrada integrada a partir dos sensores de movimento e o microfone, a frequência e a intensidade da tosse podem ser medidas. Os dados com data e hora são armazenados num cartão de memória alojado no interior do registador e podem ser enviados para o fabricante, VivoMetrics, Inc., para análise usando software especializado. Os dados podem ser transferidos para Excel, Oracle ou SAS. O dispositivo provou ser altamente exato para avaliar a tosse quando comparado com as avaliações de vídeo/áudio de pacientes com doença pulmonar obstrutiva crónica (Coyle et al., 2005, Cough 1:3). O dispositivo foi utilizado para obter os dados apresentados na FIG.2 e será utilizado para proporcionar dados suplementares substanciais em relação aos benefícios clínicos de ácido 3-[5-(2-fluorofenil) - [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico durante o ensaio de Fase 3 em CF. Dados de sintomas colhidos informalmente existentes a partir de estudos de Fase 2 de ácido 3-[5-(2-fluorofenil)- [1.2.4] oxadiazol-3-il]-benzóico suportam este conceito. Notavelmente, durante o estudo vários pacientes descreveram diminuições na tosse. Com base na hipótese de que a indução mediada por ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico da função de CFTR reduziria a obstrução das vias aéreas e a inflamação, uma diminuição na frequência de tosse poderia servir como uma integração sintomática destes efeitos farmacológicos e poderá proporcionar uma avaliação mais exata e quantitativa do que o relato verbal do paciente.
Lisboa, 2015-06-04

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto para utilização num método para tratar, prevenir ou gerir uma doença associada à ausência de expressão de um gene resultante de um codão de paragem prematura, onde o composto é ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico ou um seu sal, solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitáveis, onde a referida doença é fibrose cística ou distrofia muscular de Duchenne, onde o referido método compreende a administração do composto em três doses diárias, onde uma primeira dose, uma segunda dose e uma terceira dose são administradas num período de 24 horas de acordo com a fórmula IX, IX, 2X, onde X é 18-22 mg/kg, e onde cada dose mantém o nível plasmático de ácido 3—[5—(2— fluorofenil)-[1,2,4]oxadiazol-3-il]-benzóico superior a 2 pg/ml durante pelo menos 2 horas.
  2. 2. Composto para utilização da reivindicação 1, onde as doses são administradas oralmente a um ser humano.
  3. 3. Composto para utilização da reivindicação 1, onde o gene é o gene CFTR.
  4. 4. Composto para utilização da reivindicação 1, onde o gene é o gene distrofina.
  5. 5. Composto para utilização da reivindicação 1, onde o composto é administrado utilizando uma ou mais formulações de unidade de dosagem cada uma compreendendo o referido composto numa guantidade na gama entre 35 mg e 1400 mg.
  6. 6. Composto para utilização da reivindicação 5, onde a guantidade do referido composto em cada formulação de unidade de dosagem é selecionada entre 35 mg, 50 mg, 70 mg, 100 mg, 125 mg, 140 mg, 175 mg, 200 mg, 250 mg, 280 mg, 350 mg, 500 mg, 560 mg, 700 mg, 750 mg, 1000 mg e 1400 mg.
  7. 7. Composto para utilização da reivindicação 1, onde a primeira dose é administrada de manhã, a segunda dose é administrada à tarde e a terceira dose é administrada na noite do período de 24 horas.
  8. 8. Composto para utilização da reivindicação 1, onde as doses são administradas com intervalos entre doses de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 horas.
  9. 9. Composto para utilização da reivindicação 1, onde a segunda dose é administrada cerca de 6 horas após a primeira dose ser administrada, onde a terceira dose é administrada cerca de 6 horas após a segunda dose ser administrada e onde a primeira dose é administrada cerca de 12 horas após a terceira dose ser administrada num período precedente de 24 horas, onde a primeira dose, a segunda dose ou a terceira dose são administradas cerca de 30 minutos após uma refeição.
  10. 10. Composto para utilização da reivindicação 1, onde as três doses diárias são administradas numa terapia contínua compreendendo uma pluralidade de períodos de 24 horas. Lisboa, 2015-06-04
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