PT2041158E - Péptido epoxicetonas para inibição de proteassoma - Google Patents

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PT2041158E
PT2041158E PT78097458T PT07809745T PT2041158E PT 2041158 E PT2041158 E PT 2041158E PT 78097458 T PT78097458 T PT 78097458T PT 07809745 T PT07809745 T PT 07809745T PT 2041158 E PT2041158 E PT 2041158E
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PT
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alkyl
mmol
quot
disease
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PT78097458T
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Guy J Laidig
Mark S Smyth
Catherine Sylvain
Han-Jie Zhou
Kevin D Shenk
Francesco Parlati
Mark K Bennett
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Onyx Therapeutics Inc
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Description

ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Péptido epoxicetonas para inibição de proteassoma" Antecedentes do invento
Em eucariotas, a degradação de proteínas é predominantemente mediada através do percurso da ubiquitina no qual proteínas visadas para destruição são ligadas ao polipéptido de 76 aminoácidos ubiquitina. Uma vez atingidas, as proteínas ligadas a ubiquitina servem então como substratos para o proteassoma 26S, uma protease multicatalitica, que cliva as proteínas em péptidos curtos através da acção das suas três actividades catalíticas principais. Ao mesmo tempo que tem uma função geral na renovação (turnover) de proteína intracelular, a degradação mediada por proteassoma desempenha também um papel chave em muitos processos tais como a apresentação do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe I, apoptose e viabilidade celular, processamento de antigénio, activação de NF-κΒ e transdução de sinais pró-inflamatórios. 0 proteassoma 20S é um complexo de protease multicatalitica de forma cilíndrica de 700 kDa constituído de 28 subunidades, classificadas como do tipo α e β, que estão dispostas em 4 anéis heptaméricos empilhados. Em levedura e noutros eucariotas 7 subunidades α diferentes formam os anéis exteriores e 7 subunidades β diferentes constituem os anéis interiores. As subunidades α servem como locais de ligação para os complexos reguladores 19S (PA700) e 11S (PA28), bem como uma barreira física para a câmara proteolítica interior formada pelos dois anéis de subunidades β. Assim, in vivo, crê-se que o proteassoma existe como uma partícula 26S ("o proteassoma 26S"). Experiências in vivo têm mostrado que a inibição da forma 20S do proteassoma pode ser prontamente correlacionada com a inibição do proteassoma 26S. A clivagem de pró-sequências amino-terminais de subunidades β durante a formação de partículas expõe residuos treonina amino-terminais, que servem como os nucleófilos catalíticos. As subunidades responsáveis pela actividade catalítica no proteassoma possuem assim um resíduo nucleófilo 2 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ amino-terminal, e estas subunidades pertencem à família das hidrolases nucleófilas N-terminais (Ntn) (onde o resíduo N-terminal nucleófilo é, por exemplo, Cys, Ser, Thr, e outras porções nucleófilas). Esta família inclui, por exemplo, penicilina G-acilase (PGA), penicilina V-acilase (PVA), glutamina PRPP-amidotransferase (GAT) e glicosilasparaginase bacteriana. Para além das subunidades β expressas ubiquamente, os vertebrados superiores possuem também três subunidades β induzíveis com interferão-γ (LMP7, LMP2 e MECLI), que substituem os seus correspondentes normais, β5, βΐ e β2, respectivamente. Quando todas as três subunidades induzíveis com IFN-γ estão presentes, o proteassoma é referido como um "imunoproteassoma". Assim, as células eucarióticas podem possuir duas formas de proteassomas em proporções variáveis.
Através da utilização de substratos peptídicos diferentes, foram definidas três actividades proteoliticas principais para os proteassomas 20S de eucariotas: actividade do tipo quimiotripsina (CT-L), que cliva após grandes resíduos hidrofóbicos; actividade do tipo tripsina (T-L), que cliva após resíduos básicos; e actividade de hidrólise de péptido peptidilglutamilo (PGPH), que cliva após resíduos ácidos. Duas actividades adicionais menos caracterizadas têm também sido atribuídas ao proteassoma: a actividade BrAAP, que cliva após aminoácido ramificados; e a actividade SNAAP, que cliva após aminoácidos neutros pequenos. Embora ambas as formas do proteassoma possuam todas as cinco actividades enzimáticas, têm sido descritas diferenças na extensão das actividades entre as formas com base em substratos específicos. Para ambas as formas do proteassoma, as principais actividades proteoliticas do proteassoma parece terem o contributo de diferentes locais catalíticos dentro do núcleo 20S. A WO 94/15956 AI refere-se a uma classe de complexos baseados em péptido que são revelados como inibidores da enzima de conversão de endotelina (ECE) e por isso úteis no tratamento de doenças cardiovasculares tais como AVC. A WO 2006/099261 A2 descreve compostos e métodos de inibição de um imunoproteassoma, que são úteis no tratamento 3 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ de cancro, inflamaçao e/ou doenças auto-imunes bem como na supressão da geração de péptido antigénico endógeno. WO 2007/056464 AI refere-se a compostos baseados em péptido incluindo anéis de três membros contendo heteroátomo revelados como inibindo actividades de hidrolases nucleófilas N-terminais (Ntn) associadas ao proteassoma. Os compostos baseados em péptido incluem um epóxido ou aziridina e funcionalização no terminal N. A WO 2005/111008 A2 e a WO 2005/105827 A2 descrevem a inibição diferencial de Ntn possuindo múltiplas actividades, tais como a actividade do tipo quimiotripsina do proteassoma 20S, pelos compostos baseados em péptido.
Elofsson et al. (Chemistry and Biology, Current Biology, 6:811-822 (1999)) revelam α',β'-epoxicetonas de péptido acetiladas no terminal amino como agentes anti-proliferativos e anti-inflamatórios inibidores de proteassoma.
Existem vários exemplos de moléculas pequenas que têm sido utilizadas para inibir a actividade de proteassoma; no entanto, falta geralmente a estes compostos a especificidade para se alocarem entre as duas formas do proteassoma. Assim, a capacidade para reconhecer e explorar os papéis de cada forma de proteassoma específica ao nível celular e molecular não tem sido possível. Deste modo, é necessária a criação de inibidores de molécula pequena que preferencialmente inibem uma única forma do proteassoma para permitir a exploração dos papéis de cada forma de proteassoma ao nível celular e molecular.
Sumário do invento
Um aspecto do invento refere-se a inibidores que preferencialmente inibem a actividade de imunoproteassoma em relação à actividade de proteassoma constitutivo. Em certas concretizações, o invento refere-se aos compostos do invento para utilização no tratamento de doenças relacionadas com o sistema imunitário, compreendendo administrar um composto do invento. Em certas concretizações, o invento refere-se aos compostos do invento para utilização no tratamento de cancro, compreendendo administrar um composto do invento. 4 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Um aspecto do invento refere-se a compostos com uma estrutura de fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável,
0) onde cada A é seleccionado independentemente entre C=0, C=S e SO2, preferivelmente C=0; ou A é opcionalmente uma ligação covalente quando adjacente a uma ocorrência de Z; B está ausente ou é N(R9)R10, preferivelmente ausente; L está ausente ou é seleccionado entre C=0, C=S e SO2, preferivelmente SO2 ou C=0; M está ausente ou é Ci_i2alquilo, preferivelmente Ci-salquilo; Q está ausente ou é seleccionado entre O, NH e N-Ci_6alquilo; X é seleccionado entre O, S, NH e N-Ci_6alquilo, preferivelmente O; cada Z é seleccionado independentemente entre O, S, NH e N—Ci_6alquilo, preferivelmente O; ou Z é opcionalmente uma ligação covalente quando adjacente a uma ocorrência de A; R1 é seleccionado entre H, -Ci-6alquil-B, Ci-6hidroxialquilo, Ci- alcoxialquilo, arilo e Ci_6aralquilo; R2 e R3 são seleccionados cada um independentemente entre arilo, Ci-6aralquilo, heteroarilo e Ci-6heteroaralquilo; R4 é N (R5) L-Q-R6; R5 é seleccionado entre hidrogénio, OH, Ci_6aralquilo e Ci_ alquilo, preferivelmente hidrogénio; R6 é seleccionado entre carbociclilo, heterociclilo, um grupo protector do terminal N, heterociclilMZAZ-Ci-salquil-, heterociclilM-, carbociclilM-, preferivelmente um grupo de cobertura de N; ou R7 e R8 são seleccionados independentemente entre hidrogénio, Ci-6alquilo e Ci-6aralquilo, preferivelmente hidrogénio; R9 é seleccionado entre hidrogénio, OH e Ci_6alquilo, preferivelmente Ci-6alquilo; e 5 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ R10 é um grupo protector do terminal N; R15 é seleccionado entre hidrogénio, Ci-6alquilo, Ci- hidroxialquilo, Ci_6alcoxi; desde que em qualquer ocorrência da sequência ZAZ, pelo menos um membro da sequência tem de ser outro que não uma ligação covalente.
Breve descrição das figuras A Figura 1 mostra o nivel de expressão de imunoproteassoma de certas linhas de células e amostras de paciente, incluindo mieloma múltiplo, leucemias, linfomas e tumores sólidos. A Figura 2A mostra o efeito do Composto 14 na progressão da doença em modelos de ratinho de artrite reumatóide (RA) onde a dosagem começou quando os animais primeiro mostraram sinais de doença (indicado por setas) e os dados mostrados são a pontuação média de doença (± SEM; N = 7/grupo) e são representativos de três experiências independentes. A Figura 2B mostra o efeito do Composto 14 na progressão da doença em modelos de ratinho de RA onde a RA foi induzida ao Dia 0 em ratinhos DBA/1 fêmeas por imunização com colagénio tipo II de bovino em CFA onde a dosagem começou quando os animais primeiro mostraram sinais de doença (indicado por setas) e os dados mostrados são a pontuação média de doença (± SEM; N = 10/grupo).
Descrição detalhada do invento O invento envolve compostos úteis como inibidores de enzima. Estes compostos são geralmente úteis para inibir enzimas possuindo um grupo nucleófilo no terminal N. Por exemplo, actividades de enzimas ou subunidades de enzima possuindo aminoácidos N-terminais com nucleófilos nas suas cadeias laterais, tais como treonina, serina ou cisteina, podem ser inibidas com sucesso pelos inibidores de enzima aqui descritos. Actividades de enzimas ou subunidades de enzima possuindo grupos nucleófilos não aminoácido nos seus terminais N, tais como, por exemplo, grupos protectores ou 6 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ carboidratos, podem também ser inibidas com sucesso pelos inibidores de enzima qui descritos.
Sem quere estar limitado por qualquer teoria de operação particular, crê-se que estes nucleófilos N-terminais de Ntn formam adutos covalentes com o grupo funcional epóxido, aziridina, aldeído ou borato dos inibidores de enzima aqui descritos. Por exemplo, na subunidade P5/Pre2 de proteassoma 20S, crê-se que a treonina N-terminal forma irreversivelmente um aduto morfolino ou piperazino por reacção com um epóxido ou aziridina de péptido tal como os aqui a seguir descritos. Esta formação de aduto envolveria a clivagem de abertura de anel do epóxido ou aziridina.
No que se refere à estereoquímica, são seguidas as regras de Cahn-Ingold-Prelog para determinação da estereoquímica absoluta. Estas regras são descritas, por exemplo, em Organic Chemistry, Fox and Whitesell; Jones and Bartlett Publishers, Boston, MA (1994); Secção 5-6, págs. 177-178, que é pelo presente incorporada por referência.
Um aspecto do invento refere-se a compostos com uma estrutura de fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, como definida acima.
Em certas concretizações, R1 é seleccionado entre - ÇL alquil-B e Ci_6aralquilo. Em certas destas concretizações, R1 está substituído com um ou mais substituintes seleccionados entre hidroxi, halogéneo, amida, amina, ácido carboxílico (ou um seu sal), éster (incluindo Ci-6alquiléster, Ci-5alquiléster e ariléster), tiol ou tioéter. Em certas destas concretizações preferidas, R1 está substituído com um ou mais substituintes seleccionados entre ácido carboxílico e éster. Em certas concretizações, R1 é seleccionado entre metilo, etilo, isopropilo, carboximetilo e benzilo. Em certas concretizações R1 é -Ci_6alquil-B e Ci_6aralquilo. Em certas destas concretizações preferidas, B está ausente.
Em certas concretizações, R2 é seleccionado entre Ci_ giralquilo e Ci_6heteroaralquilo. Em certas destas concretizações, R2 é seleccionado entre Ci_6alquil-fenilo, Ci- filquil-indolilo, Ci_6alquil-tienilo, Ci-6alquil-tiazolilo, e 7 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Ci-6alquil-isotiazolilo, onde a porção alquilo pode conter seis, cinco, quatro, três, dois ou um átomo de carbono, preferivelmente um ou dois. Em certas destas concretizações, R2 está substituído com um ou mais substituintes seleccionados entre hidroxi, halogéneo, amida, amina, ácido carboxilico (ou um seu sal), éster (incluindo Ci_6alquiléster, Ci-5alquiléster, e ariléster), tiol ou tioéter. Em certas destas concretizações, R2 está substituído com um substituinte seleccionado entre alquilo, tri-haloalquilo, alcoxi, hidroxi ou ciano. Em certas destas concretizações, R2 é seleccionado entre Ci-6alquil-fenilo e Ci_6alquil-indolilo. Em certas destas concretizações preferidas, R2 é seleccionado entre 7 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
R R = H ou qualquer grupo protector adequado onde D é seleccionado entre H, OMe, OBufc, OH, CN, CF3 e CH3. Em certas concretizações D é seleccionado entre H, OMe, OH, CN, CF3 e CH3.
Em certas destas concretizações preferidas onde D está ligado a um anel de seis membros, D está ligado na posição 4 em relação ao ponto de ligação, preferivelmente excluindo concretizações onde a posição 4 do anel está ocupada pelo azoto de um anel de piridina.
Em certas concretizações, R3 é seleccionado entre Ci_ giralquilo e Ci-6heteroaralquilo, onde a porção alquilo pode conter seis, cinco, quatro, três, dois ou um átomo de carbono, preferivelmente um ou dois. Em certas destas concretizações, R3 está substituído com um ou mais substituintes seleccionados entre hidroxi, halogéneo, amida, amina, ácido carboxilico (ou um seu sal), éster (incluindo Ci_6alquiléster, Ci-salquiléster, e ariléster) , tiol ou 8 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ tioéter. Em certas destas concretizações, R3 está substituído com um substituinte seleccionado entre alquilo, tri-haloalquilo, alcoxi, hidroxi ou ciano. Em certas destas concretizações, R3 é seleccionado entre Ci_ ^lquil- fenilo e Ç_ 6alquil-indolilo. Em certas destas concretizações preferidas, R3 é seleccionado entre
D
e
R R = H, qualquer grupo protector adequado onde D é seleccionado entre H, OMe, OBu11, OH, CN, CF3 ou CH3. Em certas concretizações, D é seleccionado entre H, OMe, OH, CN, CF3 ou CH3.
Em certas concretizações, R5 é hidrogénio, Q está ausente, L é C=0 ou SO2, e R6 é heterociclilo. Em certas destas concretizações preferidas, o heterociclilo é seleccionado entre cromonilo, cromanilo, morfolino e piperidinilo.
Em certas concretizações, L é C=0 e R6 é seleccionado entre heterociclilMZAZ-Ci-salquil-, heterociclilM-, carbociclilM-, onde cada ocorrência de Z e A é independentemente outro que não uma ligação covalente.
Em certas concretizações, L é C=0, Q está ausente ou é O, e R6 é carbociclilM-, onde M é Co-ialquilo. Em certas destas concretizações, R6 é ciclopropilo ou ciclo-hexilo.
Em certas concretizações, L e A são C=0, Q está ausente, Z é O, M é Ci-salquilo, preferivelmente metileno, e R6 é heterociclilMZAZ-Ci-salquil-, onde cada ocorrência de A é independentemente outra que não uma ligação covalente. Em certas destas concretizações, R6 é heterociclilMZAZ- Ç_ plquil- onde heterociclilo é oxodioxolenilo substituído ou não substituído ou N (R16) (R17) , onde R16 e R17 em conjunto são Ci_ gilquil-Y-Ci_6alquilo, preferivelmente Ci-3alquil-Y-Ci- alquilo, formando por isso um anel. 9 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Em certas concretizações preferidas, L é C=0, Q está ausente, M é Ci-salquilo e R6 é heterociclilM-. Em certas outras destas concretizações, R6 é heterociclilM-, onde heterociclilo é seleccionado entre morfolino, piperidino, piperazino e pirrolidino.
Em certas concretizações, R7 e R8 são seleccionados independentemente entre hidrogénio e Ci-6alquilo. Em certas destas concretizações preferidas, R7 e R8 são seleccionados independentemente entre hidrogénio e metilo. Em concretizações destas mais preferidas, R7 e R8 são ambos hidrogénio.
Em certas concretizações, X é O, R2 e R3 são cada um independentemente Ci_6aralquilo e R1 é seleccionado entre Ci_ alquilo, Ci-6hidroxialquilo, Ci_6alcoxialquilo, arilo e Ci- giralquilo, qualquer dos quais está opcionalmente substituído com um ou mais substituintes amida, amina, ácido carboxílico (ou um seu sal), éster (incluindo Ci_6alquiléster, Ci- glquiléster e ariléster), tiol ou tioéter.
Grupos protectores do terminal N adequados conhecidos na especialidade da síntese peptídica incluem t-butoxicarbonilo (Boc), benzoilo (Bz), fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc), trifenilmetilo (tritilo) e tricloroetoxicarbonilo (Troe) e outros. A utilização de vários grupos protectores de N, e.g., o grupo benziloxicarbonilo ou o grupo t-butiloxicarbonilo (Boc), vários reagentes de acoplamento, e.g., diciclo-hexilcarbodi-imida (DCC), 1,3-di-isopropilcarbodi-imida (DIC), 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodi-imida (EDC), N-hidroxiazabenzotriazole (HATU), carbonildi-imidazole ou 1-hidroxibenzotriazole (HOBT) monoidrato, e várias condições de clivagem: por exemplo, ácido trifluoroacético (TFA), HC1 em dioxano, hidrogenação sobre Pd-C em solventes orgânicos (tais como metanol ou acetato de etilo), tris(trifluoroacetato) de boro e brometo de cianogénio, e reacção em solução com isolamento e purificação de intermediários, são bem conhecidos na especialidade da síntese peptídica, e são igualmente aplicáveis à preparação dos presentes compostos. Grupos protectores adequados para protecção do terminal N podem também ser encontrados, por exemplo, em Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. "Protective Groups in Organic Synthesis", 3.a 10 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ ed.; Wiley: New York, 1999 ou Kociehski, P. J., "Protecting Groups", Georg Thieme Verlag, 1994.
Em certas concretizações, a configuração estereoquimica dos carbonos portadores de R1, R2 ou R3 é independentemente D ou L. Em certas concretizações preferidas, a configuração estereoquimica de pelo menos um dos carbonos portadores de R1, R2 e R3 respect ivamente é D. Em certas destas concretizações preferidas, a configuração estereoquimica do carbono portador de R1 é D. Em certas destas concretizações, a configuração estereoquimica do carbono portador de R2 é D. Em certas destas concretizações, a configuração estereoquimica do carbono portador de R3 é D. Em certas concretizações a configuração estereoquimica de pelo menos dois dos carbonos portadores de R1, R2 e R3 respectivamente é D. Ainda noutra concretização preferida, a configuração estereoquimica de todos os três carbonos portadores de R1, R2 e R3 respectivamente é D.
Um aspecto do invento refere-se a inibidores que preferencialmente inibem a actividade de imunoproteassoma em relação à actividade de proteassoma constitutivo. Em certas concretizações, a razão EC50 de um composto de qualquer uma das fórmulas I a IV num ensaio de actividade de proteassoma constitutivo em comparação com a EC50 do mesmo composto num ensaio de actividade de imunoproteassoma é superior a 1. Em certas destas concretizações, a EC50 é superior a 2, 3, 4 ou mesmo 5. São aqui descritos ensaios adequados para a determinação da actividade de proteassoma constitutivo e da actividade de imunoproteassoma (ver Exemplo 18). 0 termo "Cx-yalquilo" refere-se a grupos hidrocarboneto saturados substituídos ou não substituídos, incluindo grupos alquilo de cadeia linear e alquilo de cadeia ramificada que contêm de x a y carbonos na cadeia, incluindo grupos haloalquilo tais como trifluorometilo e 2,2,2-trifluoroetilo, etc. Coalquilo indica um hidrogénio onde o grupo está numa posição terminal, ou uma ligação se for interno. Os termos "C2- ^lcenilo" e "C2-yalcinilo referem-se a grupos alifáticos insaturados substituídos ou não substituídos análogos em comprimento e possivel substituição aos alquilos descritos 11 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ acima, mas que contêm pelo menos uma ligaçao dupla ou tripla respectivamente. O termo "alcoxi" refere-se a um grupo alquilo possuindo um oxigénio ligado ao mesmo. Grupos alcoxi representativos incluem metoxi, etoxi, propoxi, terc-butoxi e outros. Um "éter" consiste em dois hidrocarbonetos ligados covalentemente por um oxigénio. Por conseguinte, o substituinte de um alquilo que torna esse alquilo num éter é ou assemelha-se a um alcoxi. 0 termo "Ci_6alcoxialquilo" refere-se a um grupo Ci_ alquilo substituído com um grupo alcoxi, formando desse modo um éter. 0 termo "Ci_6aralquilo", como aqui utilizado, refere-se a um grupo Ci_6alquilo substituído com um grupo arilo.
Os termos "amina" e "amino" são reconhecidos na especialidade e referem-se a aminas não substituídas e também a aminas substituídas e seus sais, e.g., uma porção que pode ser representada pelas fórmulas gerais: R9 R9 —·Ν ou —N-R10 R10 Ri* onde R9, R10 e R10' representam cada um independentemente um hidrogénio, um alquilo, um alcenilo, -(CH2)m-R8, ou R9 e R10 considerados em conjunto com o átomo de N ao qual estão ligados completam um heterociclo possuindo de 4 a 8 átomos na estrutura de anel; R8 representa um arilo, um cicloalquilo, um cicloalcenilo, um heterociclilo ou um policiclilo; e m é zero ou um inteiro de 1 a 8. Em concretizações preferidas, apenas um de R9 ou R10 pode ser um carbonilo, e.g., R9, R10 e o azoto em conjunto não formam uma imida. Em concretizações ainda mais preferidas, R9 e R10 (e opcionalmente R10 ) representam cada um independentemente um hidrogénio, um alquilo, um alcenilo ou - (C0)m-R8. Em certas concretizações, um grupo amino é básico, significando que este tem um pKa > 7,00. As formas protonadas destes grupos funcionais têm pKas acima de 7,00. 12 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Os termos "amida" e "amido" são reconhecidos na especialidade como um carbonilo substituído com amino e incluem uma porção que pode ser representada pela fórmula geral:
O Λ·-"* R9 onde R9, R10 são como definidos acima. Concretizações preferidas da amida não incluirão imidas que podem ser instáveis. 0 termo "arilo" como aqui utilizado inclui grupos aromáticos de anel simples de 5, 6 e 7 membros substituídos ou não substituídos nos quais cada átomo do anel é carbono. O termo "arilo" inclui também sistemas de anel policíclicos possuindo dois ou mais anéis cíclicos nos quais dois ou mais carbonos são comuns a dois anéis adjacentes onde pelo menos um dos anéis é aromático, e.g., os outros anéis cíclicos podem ser cicloalquilos, cicloalcenilos, cicloalcinilos, arilos, heteroarilos e/ou heterociclilos. Grupos arilo incluem benzeno, naftaleno, fenantreno, fenol, anilina, e outros.
Os termos "carbociclo" e "carbociclilo", como aqui utilizados, referem-se a um anel não aromático substituído ou não substituído no qual cada átomo do anel é carbono. O termo "carbonilo" é reconhecido na especialidade e inclui porções tais como as que podem ser representadas pela fórmula geral: Λ
ou
Rlr onde X é uma ligação ou representa um oxigénio ou um enxofre, e R11 representa um hidrogénio, um alquilo, um alcenilo, - (Cg)m-R8 ou um sal f armaceut icamente aceitável, R11 representa um hidrogénio, um alquilo, um alcenilo ou -(CH2)m~ R8, onde m e R8 são como definidos acima. Onde X é um oxigénio e R11 ou R11' não é hidrogénio, a fórmula representa 13 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ um "éster". Onde X é um oxigénio e R11 é um hidrogénio, a fórmula representa um "ácido carboxilico".
Como aqui utilizado, "enzima" pode ser qualquer molécula parcialmente ou totalmente proteica que realiza uma reacção química de um modo catalítico. Estas enzimas pode ser enzimas nativas, enzimas de fusão, pró-enzimas, apoenzimas, enzimas desnaturadas, enzimas famesiladas, enzimas ubiquitinadas, enzimas aciladas gordas, enzimas geranilgeraniladas, enzimas ligadas a GPI, enzimas ligadas a lípido, enzimas preniladas, enzimas mutantes de ocorrência natural ou geradas artificialmente, enzimas com modificações na cadeia lateral ou na cadeia principal, enzimas possuindo sequências líder e enzimas complexadas com material não proteico, tais como proteoglicanos, proteolipossomas. As enzimas podem ser preparadas por quaisquer meios, incluindo expressão natural, expressão promovida, clonagem, várias sínteses peptídicas baseadas em solução e baseadas em fase sólida, e métodos similares conhecidos dos peritos na especialidade. 0 termo "Ci_6heteroaralquilo", como aqui utilizado, refere-se a um grupo Ci-6alquilo substituído com um grupo heteroarilo. 0 termo "heteroarilo" inclui estruturas de anel aromáticas substituídas ou não substituídas de 5 a 7 membros, mais preferivelmente anéis de 5 a 6 membros, estruturas de anel que incluem um a quatro heteroátomos. 0 termo "heteroarilo" inclui também sistemas de anel policíclicos possuindo dois ou mais anéis cíclicos nos quais dois ou mais carbonos são comuns a dois anéis adjacentes onde pelo menos um dos anéis é heteroaromático, e.g., os outros anéis cíclicos podem ser cicloalquilos, cicloalcenilos, cicloalcinilos, arilos, heteroarilos e/ou heterociclilos. Grupos heteroarilo incluem, por exemplo, pirrole, furano, tiofeno, imidazole, isoxazole, oxazole, oxadiazole, tiazole, tiadiazole, triazole, pirazole, piridina, pirazina, piridazina e pirimidina, e outros. O termo "heteroátomo" como aqui utilizado significa um átomo de qualquer outro elemento que não carbono ou 14 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ hidrogénio. Heteroátomos preferidos são azoto, oxigénio, fósforo e enxofre.
Os termos "heterociclilo" ou "grupo heterocíclico" referem-se a estruturas de anel não aromáticas substituídas ou não substituídas de 3 a 10 membros, mais preferivelmente de 3 a 7 membros, estruturas de anel que incluem um a quatro heteroátomos. Grupos heterociclilo incluem, por exemplo, tetra-hidropirano, piperidina, piperazina, pirrolidina, morfolina, lactonas, lactamas e outros. O termo "Ci_6hidroxialquilo" refere-se a um grupo Ci- alquilo substituído com um grupo hidroxi.
Como aqui utilizado, o termo "inibidor" pretende descrever um composto que bloqueia ou reduz uma actividade de uma enzima (por exemplo, inibição de clivagem proteolítica de substratos peptídicos fluorogénicos padrão tais como suc-LLVY-AMC, Box-LLR-AMC e Z-LLE-AMC, inibição de várias actividades catalíticas do proteassoma 20S). Um inibidor pode actuar com inibição competitiva, não competitiva ou anti-competitiva. Um inibidor pode-se ligar reversivelmente ou irreversivelmente, e por este motivo o termo inclui compostos que são substratos suicidas de uma enzima. Um inibidor pode modificar um ou mais locais no centro activo da enzima ou na sua proximidade, ou pode causar uma alteração de conformação em qualquer outro local na enzima.
Como aqui utilizado, o termo "péptido" inclui não apenas elementos de ligação amida padrão com substituintes α padrão, mas também peptidomiméticos habitualmente utilizados, outros elementos de ligação modificados, cadeias laterais não de ocorrência natural e modificações de cadeia lateral, como descrito em detalhe abaixo.
Os termos "policiclilo" ou "policíclico" refere-se a dois ou mais anéis (e.g., cicloalquilos, cicloalcenilos, cicloalcinilos, arilos, heteroarilos e/ou heterociclilos) nos quais dois ou mais carbonos são comuns a dois anéis adjacentes, e.g., os anéis são "anéis fundidos". Cada um dos anéis do policiclo pode estar substituído ou não substituído. 15 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ Ο termo "prevenção" é reconhecido na especialidade, e quando utilizado em relação a uma condição, tal como uma recorrência local (e.g., dor), uma doença tal como cancro, uma sindrome complexa tal como insuficiência cardiaca ou qualquer outra condição médica, é bem entendido na especialidade, e inclui administração de uma composição que reduz a frequência de, ou retarda o aparecimento de, sintomas de uma condição médica num sujeito em relação a um sujeito que não recebeu a composição. Assim, prevenção de cancro inclui, por exemplo, redução do número de crescimentos cancerosos detectáveis numa população de pacientes que receberam um tratamento profiláctico em relação a uma população de controlo não tratada, e/ou retardamento do aparecimento de crescimentos cancerosos detectáveis numa população tratada versus uma população de controlo não tratada, e.g., por uma quantidade estatisticamente e/ou clinicamente significativa. Prevenção de uma infecção inclui, por exemplo, redução do número de diagnósticos da infecção numa população tratada versus uma população de controlo não tratada, e/ou retardamento do aparecimento de sintomas da infecção numa população tratada versus uma população de controlo não tratada. Prevenção de dor inclui, por exemplo, redução da magnitude, ou alternativamente retardamento, de sensações de dor experimentadas por sujeitos numa população tratada versus uma população de controlo não tratada. 0 termo "pró-fármaco" abrange compostos que, sob condições fisiológicas, são convertidos em agentes terapeuticamente eficazes. Um método comum para preparação de um pró-fármaco é incluir porções seleccionadas que são hidrolisadas sob condições fisiológicas para revelar a molécula desejada. Noutras concretizações, o pró-fármaco é convertido por uma actividade enzimática do animal hospedeiro. 0 termo tratamento "profiláctico ou terapêutico" é reconhecido na especialidade e inclui administração ao hospedeiro de uma ou mais das presentes composições. Se for administrado antes da manifestação clínica da condição indesejada (e.g., doença ou outro estado indesejado do animal hospedeiro) então o tratamento é profiláctico (i.e., protege o hospedeiro contra o desenvolvimento da condição 16 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ indesejada), enquanto se for administrado após manifestação da condição indesejada, o tratamento é terapêutico (i.e., pretende diminuir, aliviar ou estabilizar a condição indesejada existente ou os seus efeitos secundários). 0 termo "substituído" refere-se a porções possuindo substituintes que substituem um hidroqénio em um ou em mais carbonos da cadeia principal. Será entendido que "substituição" ou "substituído com" inclui a condição implícita de que uma tal substituição está de acordo com a valência permitida do átomo substituído e do substituinte, e de que a substituição resulta num composto estável, e.g., que não sobre espontaneamente transformação tal como por rearranjo, ciclização, eliminação, etc. Como aqui utilizado, o termo "substituído" é contemplado para incluir todos os substituintes admissíveis de compostos orgânicos. Num aspecto genérico, os substituintes admissíveis incluem substituintes aciclicos e cíclicos, ramificados e não ramificados, carbocíclicos e heterocíclicos, aromáticos e não aromáticos de compostos orgânicos. Os substituintes admissíveis podem ser um ou mais e o mesmo ou diferentes para compostos orgânicos apropriados. Para os propósitos deste invento, os heteroátomos tais como azoto pode ter substituintes hidrogénio e/ou quaisquer substituintes admissíveis de compostos orgânicos aqui descritos que satisfaçam as valências dos heteroátomos. Substituintes podem incluir, por exemplo, um halogéneo, um hidroxilo, um carbonilo (tal como um carboxilo, um alcoxicarbonilo, um formilo ou um acilo), um tiocarbonilo (tal como um tioéster, um tioacetato ou um tioformato), um alcoxilo, um fosforilo, um fosfato, um fosfonato, um fosfinato, um amino, um amido, uma amidina, uma imina, um ciano, um nitro, um azido, um sulfidrilo, um alquiltio, um sulfato, um sulfonato, um sulfamoilo, um sulfonamido, um sulfonilo, um heterociclilo, um aralquilo ou uma porção aromática ou heteroaromática. Deverá ser entendido pelos peritos na especialidade que as porções substituídas na cadeia de hidrocarboneto podem elas próprias estar substituídas, se apropriado.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um composto no que se refere ao presente método de tratamento, refere-se a uma quantidade do composto ou compostos numa preparação 17 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ que, quando administrada como parte de um regime de dosagem desejado (para um mamífero, preferivelmente um humano) alivia um sintoma, alivia uma condição ou retarda o aparecimento de condições de doença de acordo com padrões clinicamente aceitáveis para a perturbação ou condição a ser tratada ou para o fim cosmético, e.g., com uma relação benefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento médico. O termo "tioéter" refere-se a um grupo alquilo, como definido acima, possuindo uma porção enxofre ligada ao mesmo. Em concretizações preferidas, o "tioéter" é representado por -S-alquilo. Grupos tioéter representativos incluem metiltio, etiltio, e outros.
Como aqui utilizado, o termo "tratar" ou "tratamento" inclui reverter, reduzir ou parar os sintomas, sinais clínicos, e patologia subjacente de uma condição de modo a melhorar ou estabilizar uma condição num sujeito.
Utilizações de inibidores de enzimas
As consequências biológicas da inibição de proteassoma são inúmeras. A inibição de proteassoma tem sido sugerida como uma prevenção e/ou tratamento de uma multiplicidade de doenças incluindo, mas não limitadas a, doenças proliferativas, doenças neurotóxicas/degenerativas, condições isquémicas, inflamação, doenças relacionadas com o sistema imunitário, HIV, cancros, rejeição de transplante de órgãos, choque séptico, infecções virais e parasitárias, condições associadas com acidose, degeneração macular, condições pulmonares, doenças de perda muscular, doenças fibróticas, doenças de crescimento ósseo e capilar.
Podem-se utilizar inibidores de proteassoma para tratar condições mediadas directamente pela função proteolítica do proteassoma, tais como perda muscular, ou mediadas indirectamente através de proteínas que são processadas pelo proteassoma tais como NF-κΒ. O proteassoma participa na eliminação rápida e no processamento pós-tradução de proteínas (e.g., enzimas) envolvidas na regulação celular (e.g., ciclo celular, transcrição génica e percursos 18 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ metabólicos), na comunicação intercelular e na resposta imunitária {e.g., apresentação de antigénio).
Ao nivel celular, têm sido reportadas a acumulação de proteinas poliubiquitinadas, alterações de morfologia celular e apoptose após tratamento das células com vários inibidores proteassoma. No entanto, será de notar que os inibidores proteassoma disponíveis comercialmente inibem ambas as formas de proteassoma constitutivo e imunoproteassoma. Mesmo o bortezomib, o único inibidor de proteassoma aprovado pela FDA para o tratamento de pacientes de mieloma múltiplo em relapso, não distingue entre as duas formas (Altun et al., Câncer Res 65:7896, 2005). Assim, o que é conhecido acerca da inibição terapêutica de proteassoma é baseado em trabalho com moléculas que inibem ambas as formas do proteassoma. Por conseguinte, compostos do invento podem ser benéficos para reduzir a gravidade de efeitos secundários associados a moléculas que inibem ambas as formas do proteassoma. A expressão de imunoproteassoma ocorre predominantemente em células e órgãos que constituem o sistema linfático, tais como os glóbulos brancos (leucócitos), medula óssea e o timo, baço e nódulos linfáticos. Ainda que alguns órgãos expressem preferencialmente proteassomas constitutivos (e.g., coração), outros tais como glândulas supra-renais, fígado, pulmão e intestino, parecem expressar ambas as formas. O sistema imunitário, no qual leucócitos e tecidos linfóides desempenham um papel principal, é responsável pela protecção de um organismo de influências biológicas externas. Quando funciona bem, protege o corpo contra infecções bacterianas e virais. O sistema imunitário pesquisa também células autólogas que sofreram transformação oncogénica. A proteólise intracelular gera pequenos péptidos para apresentação a linfócitos T para induzir respostas imunitárias mediadas por MHC classe I. O proteassoma é o principal fornecedor destes péptidos precursores, no entanto, têm sido observadas diferenças entre péptidos antigénicos entre células com quantidades variáveis de cada forma de proteassoma (Caseio et al., EMBO J. 20:2357-2366, 2001). Em certas concretizações, o invento refere-se a um método para inibir a apresentação de antigénio numa célula, incluindo 19 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ expor da célula a um composto aqui descrito. Em certas concretizações, o invento refere-se a um método para alterar o repertório de péptidos antigénicos produzidos pelo proteassoma ou outras Ntn com actividade multicatalitica. Por exemplo, se a actividade do proteassoma imunoproteassoma for inibida selectivamente, um conjunto diferente de péptidos antigénicos pode ser produzido pelo proteassoma constitutivo restante, e apresentado em moléculas de MHC sobre as superfícies das células, diferente do que seria produzido e apresentado sem qualquer inibição de enzima. Várias perturbações e estados de doença têm sido associados à função aberrante do sistema imunitário, aqui referidas como condições relacionadas com o sistema imunitário. Talvez a condição relacionada com o sistema imunitário mais comum são as perturbações alérgicas tais como, asma e dermatites atópicas tais como o eczema. Estas ocorrem quando o sistema imunitário reage de modo excessivo a exposição a antigénios no ambiente. Assim, uma concretização adicional é um método para suprimir o sistema imunitário de um sujeito incluindo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um composto inibidor de proteassoma de um modo aqui descrito.
As perturbações de imunodeficiência ocorrem quando uma parte do sistema imunitário não está a trabalhar apropriadamente ou não está presente. Podem afectar linfócitos B, linfócitos T ou fagócitos e podem ser quer hereditárias (e.g., deficiência de IgA, imunodeficiência combinada severa (SCID), disfasia timica e granulomatosa crónica) quer adquiridas (e.g., sindrome de imunodeficiência adquirida (SIDA), vírus de imunodeficiência de humano (HIV) e imunodeficiência induzida por fármacos). Pode-se utilizar uma estratégia de dosagem utilizando inibidores de proteassoma selectivos do invento para tratar condições relacionadas com o sistema imunitário tais como perturbações de imunodeficiência.
Em perturbações auto-imunes, o sistema imunitário ataca inapropriadamente órgão e tecidos saudáveis do corpo como se fossem invasores estranhos. Um exemplo de uma doença auto-imune é a Síndroma de Sjogren, que é caracterizado por 20 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ infiltração e acumulação focal de linfócitos nas glândulas exócrinas. Um estudo que examinou o nivel de expressão de proteassoma revelou uma regulação ascendente significativa de beta5i (LMP7) exclusivamente nas glândulas salivares de pacientes de SS (Egerer et al., Arthritis Rheum. 54:1501-8, 2006). Outros exemplos destas condições relacionadas com o sistema imunitário incluem lúpus, artrite reumatóide, escleroderma, espondilite anquilosante, dermatomiosite, psoriase, esclerose múltipla e doença inflamatória do intestino (tal como colite ulcerosa e doença de Crohn). A rejeição de tecidos/órgãos ocorre quando o sistema imunitário de modo errado ataca as células introduzidas no corpo do hospedeiro. A doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD), resultante de transplantação alogénica, surge quando as células T do tecido do doador passam à ofensiva e atacam os tecidos do hospedeiro. Em todas as três circunstâncias, doença auto-imune, rejeição de transplante e GVHD, a modulação do sistema imunitário por tratamento do sujeito com uma composição do invento poderia ser benéfica. A inflamação é a primeira resposta do sistema imunitário a infecção ou irritação. Um componente celular de inflamação envolve o movimento de leucócitos, que expressam imunoproteassoma, dos vasos sanguíneos para o tecido inflamado. Estas células assumem o papel importante de remoção dos resíduos irritantes de bactérias, parasitas ou células. Os inibidores de proteassoma são já conhecidos por terem actividade anti-inflamatória (Meng et al.r PNAS 96:10403-10408, 1999). Em casos de inflamação crónica, que é caracterizada por uma presença dominante de macrófagos; as células que originalmente serviram como agentes defensivos começam a libertar toxinas e citoquinas, incluindo TNF-a, tornam-se agora nocivas para o corpo, resultando em danos e perda de tecido. Em certas concretizações, o invento refere-se a um método de tratamento de inflamação e doenças inflamatórias compreendendo administrar ao sujeito necessitado de um tal tratamento uma quantidade eficaz de um composto inibidor de proteassoma aqui descrito. Doenças inflamatórias incluem condições agudas (e.g., bronquite, conjuntivite, pancreatite) e condições crónicas (e.g., colecistite crónica, bronquiectasia, estenose da válvula aórtica, restenose, psoriase e artrite), em conjunto com 21 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ condições associadas com inflamação tais como fibrose, infecção e isquemia.
Após danificação do tecido, incluindo danificação devida ao processo de inflamação, inicia-se a progressão da regeneração e reparação. Durante o passo de regeneração, o tecido perdido é substituído por proliferação de células do mesmo tipo, que reconstroem a arquitectura normal. No entanto, a regeneração inadequada da arquitectura do tecido pode ter consequências graves. Em alguns casos de doença hepática inflamatória crónica, o tecido regenerado forma uma arquitectura nodular anormal conduzindo a cirrose e a hipertensão portal. O processo de reparação é onde o tecido perdido é substituído por uma cicatriz fibrosa que é produzida a partir da granulação do tecido. A fibrose é a formação excessiva e persistente de tecido de cicatriz resultante do crescimento hiperproliferativo de fibroblastos e está associada com a activação do percurso de sinalização de TGF-β. A fibrose envolve extensa deposição de matriz extracelular e pode ocorrer em virtualmente qualquer tecido ou através de vários tecidos diferentes. Normalmente, o nível de proteína de sinalização intracelular (Smad) que activa a transcrição de genes alvo após estimulação de TGF-β é regulado por actividade de proteassoma (Xu et al., 2000). No entanto, a degradação acelerada dos componentes de sinalização de TGF-β tem sido observada em cancros e noutras condições hiperproliferativas. Assim, certas concretizações do invento referem-se a um composto para utilização no tratamento de condições hiperproliferativas, tais como retinopatia diabética, degeneração macular, nefropatia diabética, glomeruloesclerose, nefropatia por IgA, cirrose, atresia biliar, insuficiência cardíaca congestiva, esclerodermia, fibrose induzida por radiação e fibrose pulmonar (fibrose pulmonar idiopática, doença vascular do colagénio, sarcoidose, doenças intersticiais do pulmão e distúrbios pulmonares extrínsecos). O tratamento de vítimas de queimaduras é muitas vezes dificultado por fibrose, e assim, em certas concretizações, o invento refere-se à administração tópica ou sistémica de inibidores para tratar queimaduras. A cicatrização de feridas após cirurgia está frequentemente associada a cicatrizes desfigurantes, o que pode ser prevenido por inibição de fibrose. Assim, em certas 22 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ concretizações, ο invento refere-se a um composto para utilização na prevenção ou redução de cicatrizes.
As infecções por bactérias, parasitas ou vírus resultam todas na iniciação do processo inflamatório. Quando a inflamação resultante domina todo o organismo, ocorre a síndroma de resposta inflamatória sistémica (SIRS). O termo sepsia é aplicado quando isto é devido a infecção. A sobreprodução de citoquinas induzidas por lipopolissacárido (LPS) tais como TNFa é considerada como crucial para os processos associados ao choque séptico. Não surpreendentemente, o LPS induz também um aumento em todos os componentes do percurso de MHC-1 incluindo as subunidades de imunoproteassoma LMP2 e LMP7 (MacAry et al. , PNAS 98:3982 — 3987, 2001) . Além disso, é geralmente aceite que o primeiro passo na activação de células por LPS é a ligação de LPS a receptores de membrana específicos. As subunidades oí e β do complexo de proteassoma 20S foram identificadas como proteínas que se ligam a LPS, sugerindo que a transdução de sinal induzida por LPS pode ser um alvo terapêutico importante no tratamento ou prevenção de sepsia (Qureshi, N. et ai., J. Immun. (2003) 171: 1515-1525). Por conseguinte, em certas concretizações, os inibidores de proteassoma aqui revelados podem ser utilizados para a inibição de TNFa para prevenir e/ou tratar o choque séptico.
Noutra concretização, as composições reveladas são úteis para o tratamento de uma infecção parasitária, tal como infecções causadas por parasitas protozoários. Considera-se que o proteassoma destes parasitas está envolvido principalmente em actividades de diferenciação e replicação celular (Paugam et al., Trends Parasitol. 2003, 19(2): 55-59). Para além disso, foi mostrado que espécies de Entamoeba perdem capacidade de enquistamento quando expostas a inibidores de proteassoma (Gonzales, et al., Arch. Med. Res. 1997, 28, Spec No: 139-140). Em certas destas concretizações, as presentes composições de inibidor de proteassoma são úteis para o tratamento de infecções parasitárias em humanos causadas por um parasita protozoário seleccionado entre espécies Plasmodium (incluindo P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale, que causam malária), espécies Trypanosoma (incluindo T. cruzi, que causa doença de Chagas, 23 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ e Τ. brucei que causa doença do sono africana), espécies Leishmania (incluindo L. amazonesis, L. donovani, L. infantum, L. mexicana, etc.)λ Pneumocystis carinii (um protozoário conhecido por causar pneumonia em pacientes com SIDA e noutros pacientes imunossuprimidos), Toxoplasma gondii, Entamoeba histolytica, Entamoeba invadens e Giardia lamblia. Em certas concretizações, as composições reveladas são úteis para o tratamento de infecções parasitárias em animais e em gado causadas por um parasita protozoário seleccionado entre Plasmodium hermani, espécies Cryptosporidium, Echinococcus granulosus, Eimeria tenella, Sarcocystis neurona e Neurospora crassa. Outros compostos úteis como inibidores de proteassoma no tratamento de doenças parasitárias são descritos na WO 98/10779, que é aqui incorporada na sua totalidade.
Em certas concretizações, as composições de inibidor de proteassoma inibem a actividade de proteassoma num parasita sem recuperação em glóbulos brancos. Em certas destas concretizações, a meia-vida de células sanguíneas pode proporcionar protecção prolongada no que se refere a terapia contra exposições recorrentes a parasitas. Em certas concretizações, os inibidores de proteassoma aqui descritos podem proporcionar protecção prolongada no que se refere a quimioprofilaxia contra infecções futuras.
As infecções virais contribuem para a patologia de muitas doenças. Condições cardíacas tais como miocardite em curso e cardiomiopatia dilatada têm sido associadas ao vírus de Coxsackie B3. Numa análise comparativa de microarranjo de genomas inteiros de corações de ratinho infectados, todas as três subunidades de imunoproteassoma estavam uniformemente reguladas de modo ascendente em corações de ratinhos que desenvolveram miocardite crónica (Szalay et al., Am. J. Pathol. 168:1542-52, 2006). Alguns vírus utilizam o sistema de ubiquitina-proteassoma no passo de entrada virai onde o vírus é libertado a partir do endossoma para o citosol. O vírus da hepatite de ratinho (MHV) pertence à família Coronaviridae, que também inclui o coronavirus da síndrome respiratória aguda severa (SARS). Yu e Lai (J Virol 79:644-648, 2005) demonstraram que o tratamento de células infectadas com MHV com um inibidor de proteassoma resultou 24 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ numa diminuição na replicação virai, em correlação com um titulo virai reduzido em comparação com o de células não tratadas. O virus da hepatite B de humano (HBV), um membro da familia do virus Hepadnaviridae, requer proteínas de envelope codificadas viralmente para se propagar. A inibição do percurso de degradação de proteassoma causa uma redução significativa na quantidade de proteínas de envelope segregadas (Simsek et al., J. Virol. 79:12914-12920, 2005). Para além do HBV, outros vírus de hepatite (A, C, D e E) podem também utilizar o percurso de degradação de ubiquitina-proteassoma para secreção, morfogénese e patogénese. A bactéria Listeria monocytogenes causa uma condição conhecida como listeriose, cujas manifestações vão desde moderadas (náusea, vómitos e diarreia) a severas (septicemia, meningite, encefalite). Uma análise quantitativa de alterações na composição de subunidades de proteassoma revelou que a infecção de ratinhos com virus de coriomeningite linfocítica ou Listeria monocytogenes conduziu a uma substituição quase completa de proteassomas constitutivos por imunoproteassomas no fígado em sete dias (Khan et al., J. Immunol. 167:6859-6868, 2001) . Os procariotas possuem o que é equivalente à partícula de proteassoma 20S de eucariota. Ao mesmo tempo que a composição de subunidades da partícula 20S de procariota é mais simples do que a de eucariotas, não tem a capacidade para hidrolisar ligações peptídicas de um modo similar. Por exemplo, o ataque nucleófilo na ligação peptídica ocorre através do resíduo treonina no terminal N das subunidades β. Assim, uma concretização deste invento refere-se a uma composição para utilização no tratamento de infecções procarióticas, compreendendo administrar a um sujeito uma quantidade eficaz de uma composição de inibidor de proteassoma aqui revelado. Infecções procarióticas podem incluir doenças causadas quer por mycobacteria (tais como tuberculose, lepra ou úlcera de Buruli) ou archaebacteria.
Por conseguinte, em certas concretizações, o invento refere-se a um composto para utilização no tratamento de uma infecção (e.g., bacteriana, parasitária ou virai), incluindo contacto de uma célula com (ou a administração a um sujeito) uma quantidade eficaz de um composto aqui revelado. 25 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ A lesão de isquemia e reperfusão resulta em hipoxia, uma condição na qual existe uma deficiência de oxigénio que atinge os tecidos do corpo. Esta condição causa degradação aumentada de Ικ-Βα, resultando por esse motivo na activação de NF-κΒ (Koong et al., 1994). De um modo interessante, factores que têm sido identificados como capazes de melhorar a expressão de imunoproteassoma, TNF-α e lipopolissacárido, estimulam também a activação de NF-κΒ. Foi demonstrado que a gravidade de lesões resultando em hipoxia pode ser reduzida com a administração de um inibidor de proteassoma (Gao et al., 2000; Bao et al., 2001; Pye et al., 2003). Deste modo, certas concretizações do invento referem-se a um composto para utilização no tratamento de uma condição isquémica ou lesão de reperfusão compreendendo administrar a um sujeito necessitado de um tal tratamento uma quantidade eficaz de um composto inibidor de proteassoma aqui revelado. Exemplos de tais condições ou lesões incluem, mas não estão limitadas a, sindrome coronária aguda (placas vulneráveis), doença oclusiva arterial (oclusões arteriais e vasculares cardíacas, cerebrais ou periféricas), aterosclerose (esclerose coronária, doença da artéria coronária), enfartes, insuficiência cardíaca, pancreatite, hipertrofia miocárdica, estenose e restenose. A caquexia é uma sindrome caracterizada por perda de músculo esquelético associada a proteólise melhorada devida ao percurso de ubiquitina-proteassoma. A inibição do proteassoma reduz a proteólise, por esse motivo reduzindo tanto a perda de proteína muscular como a carga azotada sobre rins ou fígado (Tawa et al., JCI 100:197-203, 1997). Em caquexia, tem sido reportada uma expressão elevada de citoquinas pró-inflamatórias, TNF-α e IFN-γ, que estimulam ambas a expressão de subunidades de imunoproteassoma (Acharyya et al., JCI 114:370-378, 2004). De facto, muitos tipos de atrofia muscular exibem taxas elevadas de degradação de proteína (Lecker et al., FASEB J 18:39-51, 2004). A perda muscular manifesta-se ela própria em várias doenças com ameaça para a vida, incluindo cancro, sepsia, insuficiência renal, SIDA, fome, atrofia de denervação, acidose, diabetes, atrofia por desuso e insuficiência cardíaca congestiva. Uma concretização do invento refere-se ao tratamento de caquexia 26 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ e de doenças de perda muscular. Compostos do invento são úteis para tratamento de condições tais como cancro, doenças infecciosas crónicas, febre, desuso muscular (atrofia) e denervação, lesão nervosa, fome, insuficiência renal associada a acidose e insuficiência hepática. Ver, e.g., Goldberg, Patente dos E.U.A. N.° 5340736. A degradação de certas proteínas pelo proteassoma afecta mecanismos de sinalização que, por sua vez, afectam a transcrição génica, o ciclo celular e percursos metabólicos. Como notado acima, inibidores de proteassoma bloqueiam não só a degradação mas também o processamento de NF-κΒ ubiquitinado in vitro e in vivo. Os inibidores de proteassoma bloqueiam também a degradação de ΙκΒ-α e a activação de NF-kB (Palombella, et al. Cell (1994) 78:773-785; e Traenckner, et ai., EMBO J. (1994) 13:5433-5441). Uma concretização do invento é um composto para utilização na inibição da degradação de ikB-oí, incluindo contacto das células com um composto aqui descrito.
Em certas concretizações, o invento refere-se a compostos para utilização na afectação de ciclos celulares eucarióticos dependentes de ciclina, incluindo exposição de uma célula (in vitro ou in vivo) a um inibidor de proteassoma aqui revelado. As ciclinas são proteínas envolvidas no controlo do ciclo celular. O proteassoma participa na degradação de ciclinas. Exemplos de ciclinas incluem ciclinas mitóticas, ciclinas G1 e ciclina B. A degradação de ciclinas possibilita a uma célula sair de uma fase do ciclo celular (e.g., mitose) e entrar numa outra (e.g., divisão) . Crê-se que todas as ciclinas estão associadas a proteína-quinase p34cdc2 ou quinases relacionadas. 0 sinal de direccionamento de proteólise está localizado nos aminoácidos 42-RAALGNISEN-50 (caixa de destruição). Existe evidência de que a ciclina é convertida numa forma vulnerável a uma ubiquitina-ligase ou que uma ligase específica de ciclina é activada durante a mitose (Ciechanover, A., Cell, (1994) 79:13-21). A inibição do proteassoma inibe a degradação de ciclina, e por isso inibe a proliferação celular, por exemplo, em cancros relacionados com ciclina (Kumatori et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1990) 87:7071-7075). Em certas concretizações, o invento refere-se a um método para tratamento de uma doença 27 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ proliferativa num sujeito (e.g., cancro, psoríase ou restenose), compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma composição de inibidor de proteassoma de um modo aqui revelado. O invento refere-se também a composições para utilização no tratamento de inflamação relacionada com ciclina num sujeito, compreendendo administrar a um sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de inibidor de proteassoma de um modo aqui descrito.
Na maturação de reticulócitos e fibroblastos em crescimento, células privadas de insulina ou soro, a velocidade de proteólise quase duplica, sugerindo um papel para o proteassoma no metabolismo celular. Em certas concretizações, o invento refere-se a composições para utilização na redução da velocidade de degradação de proteína intracelular numa célula, compreendendo pôr em contacto uma célula (in vivo ou in vitro, e.g., um músculo num sujeito) com uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor de proteassoma aqui revelado. A doença de Alzheimer (AD) é uma doença neurodegenerativa progressiva associada a uma perda de função cognitiva superior. Marcas patológicas da doença incluem placas amilóides senis, emaranhados neurofibrilares, neurites distróficas e perda neuronal significativa em regiões seleccionadas do cérebro. As microglias, os macrófagos residentes no cérebro, libertam numerosas citoquinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-α, quando activadas por Αβ42, um péptido associado a placas amilóides vasculares e neuríticas. Esta resposta inflamatória de mediação microglial contribui para uma perda neuronal significativa. Estudos baseados em células demonstraram que neurónios corticais primários tratados com meios condicionados a partir de células microgliais BV2, quer estimuladas com LPS/INF-γ quer sonicadas com péptidos Αβ42, resultaram numa diminuição de aproximadamente 60% em viabilidade celular (Gan et al., J. Biol. Chem. 279:5565-5572, 2004). Uma expressão de imunoproteassoma mais elevada é encontrada em tecido de cérebro de pacientes com AD do que em tecido de cérebro de adultos idosos não dementes (Mishto et al., Neurobiol. Aging 27:54-66, 2006) . 28 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Pacientes padecendo de doença de Huntington (HD), outra perturbação neurodegenerativa, exibem disfunção motora e declínio cognitivo durante um período de anos até à morte. Na autópsia, pode ser detectada a presença de inclusões ou agregados intraneuronais, causados por uma mutação de expansão de polyQ (também referida como uma expansão de repetição do tripleto CAG), acompanhada por atrofia significativa nas porções do estriado e do córtex do cérebro. A imuno-histoquímica revelou que existiu uma melhoria significativa da expressão de imunoproteassoma no estriado e no córtex frontal de cérebros de pacientes com HD em comparação com os de adultos normais de idade correspondente (Diaz-Hernandez et al., J. Neurosci. 23:11653-1161, 2003). Após análise posterior, constatou-se que a melhoria ocorria predominantemente nos neurónios degenerativos. Utilizando um modelo de HD em ratinho, os investigadores notaram um aumento selectivo em ambas as actividades do tipo quimiotripsina e tripsina nas regiões afectadas e contendo agregados do cérebro, principalmente no córtex e no estriado (Diaz-Hernandez et al., J. Neurosci. 23:11653-1161, 2003).
Por conseguinte, certas concretizações do invento referem-se à utilização de composições de inibidor de proteassoma aqui reveladas para o tratamento de doenças neurodegenerativas. Doenças e condições neurodegenerativas incluem, mas não estão limitadas a, AVC, danos isquémicos no sistema nervoso, trauma neural (e.g., danos cerebrais percussivos, lesão da medula espinal e danos traumáticos do sistema nervoso), esclerose múltipla e outras neuropatias mediadas pelo sistema imunitário (e.g., síndrome de Guillain-Barre e suas variantes, neuropatia axonal motora aguda, polineuropatia desmielinante inflamatória aguda, e síndrome de Fisher), complexo de demência de HIV/AIDS, axonomia, neuropatia diabética, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose múltipla, meningite bacteriana, parasitária, fúngica e virai, encefalite, demência vascular, demência de multi-infarto, demência de corpos de Lewy, demência do lobo frontal tal como doença de Pick, demências subcorticais (tais como palsia supranuclear progressiva ou de Huntington), síndromes de atrofia cortical focal (tais como afasia primária), demências metabólicas-tóxicas (tais como 29 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ hipotiroidismo crónico ou deficiência B12), e demências causadas por infecções (tais como sífilis ou meningite crónica).
Foi também demonstrado que inibidores que se ligam ao proteassoma 20S estimulam a formação óssea em culturas de órgãos de osso. Para além disso, quando estes inibidores foram administrados sistemicamente a ratinhos, certos inibidores de proteassoma aumentaram o volume ósseo e as velocidades de formação óssea em mais de 70% (Garrett, I. R. et al.r J. Clin. Invest. (2003) 111: 1771-1782), sugerindo por esse motivo que a maquinaria de ubiquitina-proteassoma regula a diferenciação de osteoblasto e a formação óssea. Por conseguinte, as composições de inibidor de proteassoma reveladas podem ser úteis no tratamento e/ou prevenção de doenças associadas a perda óssea, tais como osteoporose.
Cancro é um termo geral para doenças caracterizadas por crescimento anormal não controlado de células. Muitos cancros surgem através de percursos em múltiplos passos envolvendo a inactivação de proteínas supressoras de tumor e a activação de péptidos oncogénicos. As células de cancro podem espalhar-se para outras partes do corpo através do sistema linfático ou da corrente sanguínea. Usualmente, o cancro é classificado de acordo com os tipos de tecido ou células mais proeminentemente envolvidos. Como notado anteriormente, a inibição de proteassoma já foi validada como uma estratégia terapêutica para o tratamento de cancro, particularmente de mieloma múltiplo. Como se mostra na Figura 1, as células de mieloma múltiplo possuem ambas as formas do proteassoma, ainda que a proporção possa variar um pouco. O mieloma múltiplo é uma doença hematológica caracterizada por um número excessivo de células de plasma anormais na medula óssea. As células de plasma desenvolvem-se a partir de células B, e assim não é surpreendente que outras malignidades de células B expressem também imunoproteassoma em alguma extensão. Excepto para duas linhas de células de leucemia mielógena crónica, os cancros relacionados com o sangue (e.g., mieloma múltiplo, leucemias e linfomas) parecem expressar em geral imunoproteassoma (Figura 1). As células de cancro originárias de células linfóides expressam 30% ou mais imunoproteassoma. Em certas concretizações, o invento refere- 30 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ se a um composto para utilização no tratamento de cancro, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos aqui descritos. Em certas concretizações preferidas, o cancro é uma perturbação relacionada com o sangue.
Curiosamente, alguns cancros (e.g., tumores sólidos, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma cervical e carcinoma do pulmão de células pequenas) parecem ter a expressão de imunoproteassoma regulada de modo descendente (Evans et al., J. Immunol. 167:5420, 2001; Meissner et al., Clin. Câncer Res. 11:2552, 2005; Restifo et al., J. Exp. Med. 177:265-272, 1993). Isto parece estar correlacionado com um processamento de antigénio deficiente e pode ser uma estratégia utilizada pelas células de tumor para se escaparem à vigilância do sistema imunitário. O tratamento das células com INF-γ poderia induzir a expressão de imunoproteassoma. Deste modo, certas concretizações do invento referem-se a um composto útil no tratamento de cancros compreendendo administrar a um sujeito necessitado de um tal tratamento uma quantidade eficaz de INF-γ ou TNF-α e de um composto inibidor de proteassoma aqui revelado.
Administração
Compostos preparados como aqui descrito podem ser administrados de várias formas, dependendo da perturbação a ser tratada e da idade, condição e peso corporal do paciente, como é bem conhecido na especialidade. Por exemplo, quando se pretende administrar os compostos oralmente, estes podem ser formulados como comprimidos, cápsulas, grânulos, pós ou xaropes; ou para administração parentérica, podem ser formulados como injecções (intravenosa, intramuscular ou subcutânea), preparações de perfusão de gota, ou supositórios. Para aplicação pela via da membrana mucosa oftálmica, podem ser formulados como gotas oculares ou pomadas oculares. Estas formulações podem ser preparadas por meios convencionais e, se desejado, o ingrediente activo pode ser misturado com qualquer aditivo ou excipiente convencional, tal como um ligante, um agente de desintegração, um lubrificante, um corrigente, um agente de solubilização, um auxiliar de suspensão, um agente de 31 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ emulsificação, um agente de revestimento, uma ciclodextrina e/ou um tampão. Ainda que a dosagem varie dependendo dos sintomas, idade e peso corporal do paciente, da natureza e severidade da perturbação a ser tratada ou prevenida, da via de administração e da forma do fármaco, em geral, uma dosagem diária de 0,01 a 2000 mg do composto é recomendada para um paciente humano adulto, e esta pode ser administrada numa única dose ou em doses divididas. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem individual será em geral aquela quantidade do composto que produz um efeito terapêutico. 0 tempo de administração e/ou a quantidade da composição exactos que produzirão os resultados mais eficazes em termos da eficácia do tratamento num dado paciente dependerão da actividade, farmacocinética e biodisponibilidade de um composto particular, da condição fisiológica do paciente (incluindo idade, sexo, tipo e fase da doença, condição física geral, responsividade a uma dada dosagem, e tipo de medicação), via de administração, etc. No entanto, as linhas de orientação anteriores podem ser utilizadas como a base para o ajustamento fino do tratamento, e.g., determinação do tempo e/ou da quantidade de administração óptimos, o que necessitará não mais do que experimentação de rotina consistindo da monitorização do sujeito e ajustamento da dosagem e/ou tempo. A expressão "farmaceuticamente aceitável" é aqui utilizada para referir aqueles ligandos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que, dentro do âmbito do são juízo médico, são adequados para utilização em contacto com os tecidos de seres humanos e animais sem excessiva toxicidade, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, comensurado com uma relação benefício/risco razoável. A expressão "transportador farmaceuticamente aceitável" como aqui utilizada significa material, composição ou veiculo farmaceuticamente aceitável, tal como uma carga, diluente, excipiente, solvente ou material de encapsulação líquido ou sólido. Cada transportador tem de ser "aceitável" no sentido 32 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não nocivo para o paciente. Alguns exemplos de materiais que podem servir como transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, tais como lactose, glucose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho, amido de batata e β-ciclodextrina substituída ou não substituída; (3) celulose, e seus derivados, tais como carboximetilcelulose sódica, etilcelulose e acetato de celulose; (4) goma adragante em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositório; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de algodão, óleo de açafroa, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tais como propilenoglicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; (12) ésteres, tais como oleato de etilo e laurato de etilo; (13) ágar; (14) agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água isenta de pirogénio; (17) solução salina isotónica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções tampão de fosfato; e (21) outras substâncias não tóxicas compatíveis utilizadas em formulações farmacêuticas. Em certas concretizações, composições farmacêuticas do presente invento são não pirogénicas, i.e., não induzem elevações de temperatura significativas quando administradas a um paciente. 0 termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se aos sais de adição de ácidos inorgânicos e orgânicos relativamente não tóxicos dos inibidores. Estes sais podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais dos inibidores, ou separadamente fazendo reagir um ou mais inibidores purificados na sua forma de base livre com um ácido orgânico ou inorgânico adequado, e isolamento do sal assim formado. Sais representativos incluem os sais de bromidrato, cloridrato, sulfato, bissulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartarato, naftilato, mesilato, gluco-heptonato, lactobionato, laurilsulfonato, e sais de aminoácido, e outros. (Ver, por exemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sei. 66: 1-19.) 33 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Noutros casos, os inibidores do presente invento podem conter um ou mais grupos funcionais ácidos e assim são capazes de formarem sais farmaceuticamente aceitáveis com bases farmaceuticamente aceitáveis. O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" nestes casos refere-se aos sais de adição de bases inorgânicas e orgânicas relativamente não tóxicos de um ou mais inibidores. Estes sais podem do mesmo modo ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais dos inibidores, ou separadamente fazendo reagir um ou mais inibidores purificados na sua forma de ácido livre com uma base adequada, tal como o hidróxido, carbonato ou bicarbonato de um catião de metal farmaceuticamente aceitável, com amónia, ou com uma amina primária, secundária ou terciária orgânica farmaceuticamente aceitável. Sais de metal alcalino ou metal alcalino-terroso representativos incluem os sais de litio, sódio, potássio, cálcio, magnésio e alumínio, e outros. Aminas orgânicas representativas úteis para a formação de sais de adição de base incluem etilamina, dietilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, e outras (ver, por exemplo, Berge et al., supra).
Podem também estar presentes nas composições agentes molhantes, emulsionantes e lubrificantes, tais como laurilsulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de libertação, agentes de revestimento, agentes edulcorantes, aromatizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes.
Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e outros; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propilo, alfa-tocoferol, e outros; e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e outros.
Formulações adequadas para administração oral podem estar na forma de cápsulas, hóstias, pílulas, comprimidos, 34 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ pastilhas (utilizando uma base aromatizada, usualmente sacarose e goma-arábica ou adragante), pós, grânulos, ou como uma solução ou uma suspensão num liquido aquoso ou não aquoso, ou como uma emulsão liquida de óleo-em-água ou água-em-óleo, ou como um elixir ou xarope, ou como pastilhas (utilizando uma matriz inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e goma-arábica) e/ou como soluções para lavagem da boca, e outras, cada uma contendo uma quantidade predeterminada de um ou mais inibidores como um ingrediente activo. A composição pode também ser administrada como um bólus, electuário ou pasta.
Em formas de dosagem sólidas para administração oral (cápsulas, comprimidos, pilulas, drageias, pós, grânulos, e outros), o ingrediente activo é misturado com um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como citrato de sódio ou fosfato dicálcio, e/ou qualquer dos seguintes: (1) cargas ou extensores, tais como amidos, ciclodextrinas, lactose, sacarose, glucose, manitol, e/ou ácido silícico; (2) ligantes, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose, e/ou goma-arábica; (3) humectantes, tais como glicerol; (4) agentes de desintegração, tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido alginico, certos silicatos e carbonato de sódio; (5) agentes de retardamento de solução, tais como parafina; (6) aceleradores de absorção, tais como compostos de amónio quaternário; (7) agentes molhantes, tais como, por exemplo, álcool acetilico e monoestearato de glicerol; (8) absorventes, tais como caulino e argila de bentonite; (9) lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietilenoglicóis sólidos, laurilsulfato de sódio, e suas misturas; e (10) agentes corantes. No caso de cápsulas, comprimidos e pilulas, as composições farmacêuticas podem também compreender agentes tamponantes. Composições sólidas de um tipo similar podem também ser utilizadas como cargas em cápsulas cheias de gelatina mole e dura utilizando excipientes tais como lactose ou açúcares de leite, bem como polietilenoglicóis de peso molecular elevado, e outros. 35 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Um comprimido pode ser preparado por compressão ou modelagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Comprimidos prensados podem ser preparados utilizando um agente ligante (por exemplo, gelatina ou hidroxipropilmetilcelulose), lubrificante, diluente inerte, conservante, desintegrante (por exemplo, glicolato de amido sódico ou carboximetilcelulose sódica reticulada), tensioactivo ou dispersante. Comprimidos modelados podem ser preparados por modelagem numa máquina adequada de uma mistura dos inibidores em pó humedecidos com um diluente liquido inerte.
Comprimidos, e outras formas de dosagem sólidas, tais como drageias, cápsulas, pílulas e grânulos, podem ser opcionalmente entalhados ou preparados com revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na especialidade da formulação farmacêutica. Podem também ser formulados de modo a proporcionar a libertação lenta ou controlada do ingrediente activo aí contido utilizando, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose em várias proporções para proporcionar o perfil de libertação desejado, outras matrizes poliméricas, lipossomas e/ou microsferas. Podem também ser esterilizados, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou por incorporação de agentes de esterilização na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas em água estéril, ou nalgum outro meio injectável estéril imediatamente antes do uso. Estas composições podem também conter opcionalmente agentes opacificantes e podem ter uma composição tal que libertam os ingredientes activos apenas, ou preferencialmente, numa certa porção do tracto gastrointestinal, opcionalmente, de um modo retardado. Exemplos de composições de incrustação que podem ser utilizadas incluem substâncias poliméricas e ceras. O ingrediente activo pode também estar numa forma microencapsulada, se apropriado, com um ou mais dos excipientes acima descritos.
Formas de dosagem líquida para administração oral incluem emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Para além do ingrediente activo, as formas de dosagem líquidas podem 36 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ conter diluentes inertes habitualmente utilizados na especialidade, tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes de solubilização e emulsionantes tais como álcool etilico, álcool isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, álcool benzilico, benzoato de benzilo, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, óleos (em particular, óleos de algodão, amendoim, milho, gérmen, azeite, rícino e sésamo), glicerol, álcool tetra-hidrofurilico, polietilenoglicóis, e ésteres de ácido gordo de sorbitano, e suas misturas.
Para além de diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes tais como agentes molhantes, agentes emulsionantes e de suspensão, agentes edulcorantes, aromatizantes, corantes, perfumantes e conservantes.
Para além dos inibidores activos, as suspensões podem conter agentes de suspensão tais como, por exemplo, álcoois de isoestearilo etoxilado, ésteres de polioxietileno-sorbitol e sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonite, ágar-ágar e goma adragante, e suas misturas.
Formulações para administração rectal ou vaginal podem ser apresentadas como um supositório, que pode ser preparado por mistura de um ou mais inibidores com um ou mais excipientes ou transportadores não irritantes adequados compreendendo, por exemplo, manteiga de cacau, polietilenoglicol, uma cera de supositório ou um salicilato, que são sólidos à temperatura ambiente, mas líquidos à temperatura corporal e, por esse motivo, derreterão no recto ou cavidade vaginal e libertarão o agente activo.
Formulações que são adequadas para administração vaginal incluem também pessários, tampões, cremes, geles, pastas, espumas ou formulações em spray contendo aqueles transportadores conhecidos na especialidade como apropriados.
Formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de um ou mais inibidores incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, geles, soluções, pensos e inalantes. O componente activo pode ser misturado sob 37 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ condições estéreis com um transportador farmaceuticamente aceitável, e com quaisquer conservantes, tampões ou propulsores que possam ser requeridos.
As pomadas, pastas, cremes e qeles podem conter, para além de um ou mais inibidores, excipientes, tais como gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, goma adragante, derivados de celulose, polietilenoglicóis, silicones, bentonites, ácido silicico, talco e óxido de zinco, ou suas misturas.
Os pós e sprays podem conter, para além de um ou mais inibidores, excipientes tais como lactose, talco, ácido silicico, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio e pó de poliamida, ou misturas destas substâncias. Os sprays podem conter adicionalmente propulsores habituais, tais como clorofluoro-hidrocarbonetos e hidrocarbonetos não substituídos voláteis, tais como butano e propano.
Os inibidores podem ser administrados alternativamente por aerossol. Isto é conseguido por preparação de um aerossol aquoso, preparação lipossómica ou partículas sólidas contendo a composição. Pode-se utilizar uma suspensão não aquosa (e.g., propulsor de fluorocarboneto). Preferem-se nebulizadores sónicos porque estes minimizam a exposição do agente a atrito, o que pode resultar em degradação do composto.
Usualmente, um aerossol aquoso é produzido por formulação de uma solução ou suspensão aquosa do agente em conjunto com transportadores e estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis convencionais. Os transportadores e estabilizantes variam com os requisitos da composição particular, mas tipicamente incluem tensioactivos não iónicos (Tweens, Pluronics, ésteres de sorbitano, lecitina, Cremophors), co-solventes farmaceuticamente aceitáveis tais como polietilenoglicol, proteínas inócuas tais como albumina de soro, ácido oleico, aminoácidos tais como glicina, tampões, sais, açúcares ou álcoois de açúcar. Os aerossóis são em geral preparados a partir de soluções isotónicas. 38 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Os sistemas transdérmicos têm a vantagem acrescida de proporcionar a entrega controlada de um ou mais inibidores ao corpo. Estas formas de dosagem podem ser preparadas por dissolução ou dispersão do agente no meio apropriado. Podem-se também utilizar intensificadores de absorção para aumentar o fluxo dos inibidores através da pele. A velocidade deste fluxo pode ser controlada quer proporcionando uma membrana de controlo de velocidade quer dispersando os inibidores numa matriz polimérica ou gel.
As composições farmacêuticas deste invento adequadas para administração parentérica compreendem um ou mais inibidores em combinação com uma ou mais soluções, dispersões, suspensões ou emulsões aquosas ou não aquosas estéreis farmaceuticamente aceitáveis, ou pós estéreis que podem ser reconstituídos em soluções ou dispersões injectáveis estéreis imediatamente antes do uso, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do receptor pretendido ou agentes de suspensão ou espessantes.
Exemplos de transportadores aquosos ou não aquosos adequados que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas do invento incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol, e outros), e suas misturas adequadas, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis, tais como oleato de etilo. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pela utilização de tensioactivos.
Estas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes molhantes, agentes emulsionantes, e agentes dispersantes. A prevenção da acção de microrganismos pode ser assegurada pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e outros. Pode também ser desejável incluir nas composições agentes de ajustamento da tonicidade, tais como açúcares, cloreto de sódio, e outros. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injectável pode ser conseguida pela inclusão de 39 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ agentes que retardam a absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
Em alguns casos, de modo a prolongar o efeito de um fármaco, é desejável retardar a absorção do fármaco a partir da injecção subcutânea ou intramuscular. Por exemplo, a absorção retardada de uma forma de fármaco administrada parentericamente é realizada por dissolução ou suspensão do fármaco num veículo oleoso.
Formas depot injectáveis são preparadas por formação de matrizes de microencapsulação de um ou mais inibidores em polímeros biodegradáveis tais como poliláctido-poliglicólido. Dependendo da proporção de fármaco para polímero, e da natureza do polímero particular utilizado, pode-se controlar a velocidade de libertação de fármaco. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações injectáveis depot são também preparadas por aprisionamento do fármaco em lipossomas ou microemulsões que são compatíveis com o tecido corporal.
As preparações de agentes podem ser dadas oralmente, parentericamente, topicamente ou rectalmente. Obviamente que são dadas em formas adequadas para cada via de administração. Por exemplo, são administradas em comprimidos ou forma de cápsula, por injecção, inalação, loção ocular, pomada, supositório, perfusão; topicamente por loção ou pomada; e rectalmente por supositórios. A administração oral é preferida.
As expressões "administração parentérica" e "administrado parentericamente" como aqui utilizadas significam outros modos de administração que não administração entérica e tópica, usualmente por injecção, e incluem, sem limitação, injecção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intraespinal e intraesternal, e perfusão.
As expressões "administração sistémica", "administrado sistemicamente", "administração periférica" e "administrado 40 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ perifericamente" como aqui utilizadas significam a administração de um ligando, fármaco ou outro material por outra via que não directamente ao sistema nervoso central, tal que este entra no sistema nervoso do paciente e assim é sujeito a metabolismo e a outros processos similares, por exemplo, administração subcutânea.
Estes inibidores podem ser administrados a humanos e outros animais para terapia por qualquer via de administração adequada, incluindo oralmente, nasalmente, tal como, por exemplo, um spray, rectalmente, intravaginalmente, parentericamente, intracisternalmente e topicamente, tal como por pós, pomadas ou gotas, incluindo bucalmente e sublingualmente.
Independentemente da via da administração seleccionada, os inibidores, que podem ser utilizados numa forma hidratada adequada, e/ou as composições farmacêuticas do presente invento, são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos dos peritos na especialidade.
Os níveis de dosagem reais dos ingredientes activos nas composições farmacêuticas deste invento podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente activo que é eficaz para conseguir a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particulares, sem ser tóxica para o paciente. A concentração de um composto revelado numa mistura farmaceuticamente aceitável variará dependendo de vários factores, incluindo a dosagem do composto a ser administrada, as características farmacocinéticas dos compostos utilizados, e a via de administração. Em geral, as composições deste invento podem ser proporcionadas numa solução aquosa contendo cerca de 0,1-10% p/v de um composto aqui revelado, entre outras substâncias, para administração parentérica. As gamas de dose típicas vão desde cerca de 0,01 a cerca de 50 mg/kg de peso corporal por dia, dados em 1-4 doses divididas. Cada dose dividida pode conter os mesmos ou diferentes compostos do invento. A dosagem será uma quantidade eficaz dependendo de vários factores incluindo o estado de saúde geral de um 41 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ paciente, e a formulação e a via de administração dos compostos seleccionados.
Outro aspecto do invento proporciona uma terapia conjunta onde um ou mais outros agentes terapêuticos são administrados com o inibidor de proteassoma. Um tal tratamento conjunto pode ser conseguido através de dosagem simultânea, sequencial ou separada dos componentes individuais do tratamento.
Em certas concretizações, um composto do invento é administrado conjuntamente com um ou mais outros inibidores de proteassoma.
Em certas concretizações, um composto do invento é administrado conjuntamente com um agente quimioterapêutico. Agentes quimioterapêuticos adequados podem incluir, produtos naturais tais como alcaloides vinca (i.e. vinblastina, vincristina e vinorrelbina) , paclitaxel, epidipodofilotoxinas (i.e. etopósido, tenipósido), antibióticos (dactinomicina (actinomicina D) daunorrubicina, doxorrubicina e idarrubicina), antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) e mitomicina, enzimas (L-asparaginase que metaboliza sistemicamente L-asparagina e priva as células que não têm a capacidade para sintetizar a sua própria asparagina); agentes antiplaquetas; agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos tis como mostardas de azoto (mecloretamina, ciclofosfamida e análogos, melfalano, clorambucil), etileniminas e metilmelaminas (hexametilmelamina e tiotepa), alquilsulfonatos (bussulfano), nitrosoureias (carmustina (BCNU) e análogos, estreptozocina), trazenos-dacarbazinina (DTIC); antimetabolitos antiproliferativos/antimitóticos tais como análogos de ácido fólico (metotrexato) , análogos de pirimidina (fluorouracilo, floxuridina e citarabina) , análogos de purina e inibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentoestatina e 2-clorodesoxiadenosina) ; inibidores de aromatase (anastrozole, exemestano e letrozole); e complexos de coordenação de platina (cisplatina, carboplatina), procarbazina, hidroxiureia, mitotano, aminoglutetimida; hormonas (i.e. estrogénio) e agonistas de hormona tais como agonistas de hormona de libertação de hormona luteinizante (LHRH) 42 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ (goserelina, leuprolida e triptorrelina). Outros agentes quimioterapêuticos podem incluir mecloretamina, camptotecina, ifosfamida, tamoxifeno, raloxifeno, gencitabina, navelbina, ou qualquer análogo ou variante derivada dos anteriores.
Em certas concretizações, um composto do invento é administrado conjuntamente com um esteróide. Esteróides adequados podem incluir, mas não estão limitados a, 21-acetoxipregnenolona, alclometasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacort, desonida, desoximetasona, dexametasona, diflorasona, difiucortolona, difuprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, flunisolida, fluocinolona acetonida, fluocinonida, fluocortina butilo, fluocortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandrenolida, propionato de fluticasona, formocortal, halcinonida, propionato de halobetasol, halometasona, hidrocortisona, etabonato de loteprednol, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 2,5-dietilaminoacetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolona, prednisona, prednival, prednilideno, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, triamcinolona acetonida, triamcinolona benetonida, triamcinolona hexacetonida, e seus sais e/ou derivados.
Em certas concretizações, um composto do invento é administrado conjuntamente com um agente imunoterapêutico. Agentes imunoterapêuticos adequados podem incluir, mas não estão limitados a, ciclosporina, talidomida e anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem estar quer nus quer conjugados tais como rituximab, tositumomab, alemtuzumab, epratuzumab, ibritumomab tiuxetano, gemtuzumab ozogamicina, bevacizumab, cetuximab, erlotinib e trastuzumab. 43 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Exemplificação
Esquema 1: Síntese de Composto 1
Cbz
XrrY" 1) tbsci, Me-im. omf — . 1 >·η ^ (**Ky 2) KjCOj. HjO. THF N Π
OTBS
Dimetil-hidroxiamina.HCI
IBCF. NMM. TEA. OCM
Isopropenil.MgBr THF (8)
Cbz
CeCly7H}0. NaBH» MeOH,THF (C)
Cbz
(D)
VCKacac),. t-auOOH OCM (E)
Razão 4/1
Cbz
(P)
Cbz
Periodinano de Dess-Martin (6)
DCM
Razão 4/1 Cbz
Cbz
(D
p<vc.h2 TFA
Síntese de (A) A uma solução de Cbz-Trp-OH (10 g, 29 mmol) em DMF (150 mL) adicionou-se gota a gota Me-Im (25,2 mL, 458 mmol). Deixou-se a solução agitar durante 10 minutos seguindo-se a adição de TBSCI (23,9 g,158 mmol). Deixou-se a solução resultante agitar de um dia para o outro. Adicionou-se depois água (100 mL) e extraiu-se a mistura com EtOAc (3 x 50 mL) . Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com água (3 x 50 mL) e salmoura (50 ml), secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar um óleo que foi 44 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ dissolvido em água/THF 1:1 (200 mL) , e adicionou-se K2CO3 (440 mg, 0.031 mmol) à solução. Deixou-se a solução resultante agitar de um dia para o outro. Removeu-se então o solvente orgânico sob pressão reduzida e depois ajustou-se o pH a 2 com HC1 1 N. Extraiu-se a solução resultante com EtOAc (3 x 75 mL) e secaram-se as fases orgânicas combinadas sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar (A). Síntese de (B) A uma solução de cloridrato de dimetil-hidroxilamina (3,6 g, 36,9 mmol) em DCM (20 mL) a 0°C adicionou-se gota a gota di-isopropiletilamina (DIEA) (5 mL, 54,7 mmol). Deixou-se a solução resultante agitar durante 20 minutos. A uma solução de (A) em DCM (20 mL) a 0°C adicionou-se gota a gota cloroformato de isobutilo (IBCF) (5 mL, 51,5 mmol), seguindo-se a adição gota a gota de N-metilmorfolina (NMM) (4,0 mL, 56,7 mmol). Deixou-se a solução resultante agitar durante 10 minutos antes de adicionar esta à solução de cloridrato de dimetil-hidroxilamina/DIEA preparada anteriormente. Deixou-se a mistura agitar durante 3 h a 0°C, seguindo-se a adição de água (50 mL). Separaram-se as fases e lavou-se a fase aquosa com DCM (3 x 15 mL) . Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com HC1 1 N (3 x 20 mL) e salmoura (20 mL) , secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar um óleo que foi purificado por cromatografia flash utilizando 20 a 40% de EtOAc/hexanos como o eluente para dar (B). Síntese de (C) A uma solução de (B) (6,82 g, 14,4 mmol) numa solução de THF (40 mL) a -20°C adicionou-se uma solução de brometo de isopropenilmagnésio (90 mL, 0,5 M in THF) mantendo a temperatura interna abaixo de -5°C. Deixou-se a solução agitar durante 3 h a 0°C seguindo-se a adição de HC1 1 N (20 mL). Filtrou-se a solução através de Celite 521 e lavou-se o bolo de filtração com EtOAc. Removeu-se depois o solvente orgânico sob pressão reduzida e extraiu-se a solução aquosa restante com EtOAc (3 x 20 mL) . Lavaram-se as fases orgânicas 45 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ combinadas com NaHCCh saturado (3 x 15 mL) e salmoura (15 mL) , secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para proporcionar um óleo que foi purificado por cromatografia flash utilizando 10 a 20% de EtOAc/hexanos como o eluente para dar (C). Síntese de (D) e (E) A uma solução de (C) (3,06 g, 6,75 mmol) em MeOH (40 mL) e THF (40 mL) adicionou-se CeCl3.7H20 (3,64 g, 9,77 mmol). Deixou-se a mistura resultante agitar até esta estar homogénea. Arrefeceu-se depois a solução até 0°C e adicionou-se NaBH4 (369 mg, 9,75 mmol) durante 10 minutos. Deixou-se a solução agitar durante 1 h seguindo-se a adição de AcOH (5 mL) com continuação da agitação durante 20 minutos. Evaporou-se o solvente sob pressão reduzida e diluiu-se o resíduo resultante com água (30 mL) e extraiu-se com EtOAc (3 x 10 mL) . Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com água (3 x 10 mL) e salmoura (10 mL), secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar uma mistura 4/1 de (D) e (E) . Síntese de (F) e (G)
A uma solução de (D) e (E) em DCM (90 mL) a 0°C adicionou-se VO(acac)2 (63 mg, 0,23 mmol) e após agitação durante 5 minutos adicionou-se gota a gota t-BuOOH (2,25 mL, 6,0 M em decano). Deixou-se a solução resultante agitar durante 2 h e depois filtrou-se através de Celite 521, e lavou-se o bolo de filtração com DCM (20 mL) . Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com NaHCCb saturado (3 x 20 mL) e salmoura (20 mL) , secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar uma mistura 4/1 de (F) e (G) . Síntese de (H) A uma solução de periodinano de Dess-Martin (6,75 g, 15,9 mmol) em DCM (75 mL) a 0°C adicionou-se gota a gota uma solução de (F) e (G) em DCM (35 mL) . Deixou-se a solução aquecer à temperatura ambiente e agitar de um dia para o outro. Concentrou-se depois o solvente sob pressão reduzida e 46 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ diluiu-se ο resíduo com EtOAc (20 mL) e NaHCC>3 saturado (20 mL). Filtrou-se a mistura resultante através de Celite 521 e lavou-se o bolo de filtração com EtOAc (20 mL). Separaram-se as fases e lavou-se a fase orgânica com água (3 x 10 mL) e salmoura (10 mL), secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para proporcionar uma mistura de (H) e (I) (4/1) que foi purificada por cromatografia flash utilizando 15 a 40% de EtOAc/hexanos como o eluente para dar (H). Síntese de 1 A uma solução de (H) (50 mg, 1,06 mmol) em TFA (5 mL) adicionou-se Pd/C (14 mg, 10%) . Deixou-se a mistura resultante agitar sob 1 atmosfera de H2 durante 2 h seguindo-se diluição com DCM (10 mL). Filtrou-se a mistura através de Celite 521 e lavou-se o bolo de filtração com DCM (10 mL) . Concentrou-se o filtrado sob pressão reduzida e diluiu-se o resíduo resultante com DCM (10 mL) e concentrou-se sob pressão reduzida uma segunda vez. Colocou-se o resíduo sob vácuo elevado durante 2 h para proporcionar 1. 47 ΕΡ 2 041 158/ρτ 47 ΕΡ 2 041 158/ρτ Esquema 2: ^tese de Exemplo 2 Η Ο
OH
Μθ-lm, MSNT, OCM Boc
O h*n^A
Η O to
Cbz-D-Ala-OH Dl EA. HOBT BOP. DMF
' Boc <K)-TfVv^ O
OH
Cbz
OrY-.vp «*.) ·? Boc
M (M)
XP H DIEA. HOBT HBTU, DMF, Mqçn Õt^~* 5. Λ 1
Cbz.
HFPyr
Piridina
Síntese de (J) A uma solução de Fmoc-Trp (Boc)-OH (2,4 mmoí, 1,0 g) em DCM (20 mL) adicionou-se Me-Im (6,7 mmol, 0,370 mp) e agitou-se a mistura até a solução estar homogénea, momento em que se adicionou 1-(mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-l,2,4-triazole (MSNT) (2,9 mmol, 0,870 g) . Uma vez dissolvido o MSNT, adicionou-se a mistura reaccional a resina HMPB-BHA (0,8 mmol, 1,25 Çf) e deixou-se a solução resultante com agitação durante 45 minutos. Filtrou-se a resina e lavou-se com DMF (50 mL), MeOH (50 mL) e DCM (50 mL) . Deixou-se depois a resina secar ao ar para proporcionar (J)· 48 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ Síntese de (Κ) A (J) (0,40 iranol, 0,62 g) adicionou-se 20% de piperidina/DMF (10 mL) e deixou-se depois a solução heterogénea resultante com agitação durante 20 minutos. Filtrou-se a mistura e lavou-se a resina com DMF (20 mL) , MeOH (20 mL) e DCM (20 mL) , e deixou-se secar ao ar antes de a submeter à condição de reacção anterior uma segunda vez para dar (K). Síntese de (L) A (K) (0,40 mmol) adicionaram-se DMF (20 mL), Cbz-D-Ala- OH (0,40 mmol, 0,090 g), DIEA (1,6 mmol, 0,12 mL), HOBT (0,64 mmol, 0,062 mg) e BOP (0,64 mmol, 0,178 g) e deixou-se a mistura reaccional com agitação durante 45 minutos. Filtrou-se a mistura reaccional e lavou-se a resina com DMF (40 mL) , MeOH (40 mL) e DCM (40 mL) , e deixou-se secar ao ar para dar (L) . Síntese de (M) A (L) (0,08 mmol) adicionou-se 5% de TFA/DCM (2 mL) e deixou-se a mistura com agitação durante 20 minutos. Filtrou-se a mistura reaccional e lavou-se a resina com DCM (10 mL). Removeram-se os voláteis sob pressão reduzida e diluiu-se o óleo resultante com DCM (10 mL) e evaporou-se um total de três vezes para dar (M). Síntese de (N)
A uma solução agitada de (M) (0,11 mmol, 0,019 g) e MeCN (4 mL) e DMF (1 mL) adicionou-se (M) (0,1 mmol), DIEA (2,9 mmol, 0,5 mL) , HOBT (0,2 mmol, 0,032 g) e HBTU (0,23 mmol, 0, 087 g) e agitou-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Diluiu-se a mistura reaccional com NaHC03 saturado (15 mL) e extraiu-se com EtOAc. Lavou-se a fase orgânica com NaHC03 saturado e salmoura, secou-se sobre MgS04, e removeram-se os voláteis sob pressão reduzida. Purificou-se o material em bruto por cromatografia flash utilizando 20 a 40% de EtOAc/hexanos como o eluente para proporcionar (N). 49
ΕΡ 2 041 158/pT Síntese de 2 A uma solução agitada de (N) (0,1 mmol) em piridina (1,5 mL) e thf (3^0 mL) a 0°C adicionou-se gota a gota uma solução de HF/Piridina> Deixou-se a solução agitar durante 2 horas a 0°C antes da acjição de água (5,0 mL) e extracção com EtOAc.
Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com NaHC03 saturado e salmoura ·, r.^ ' secou-se sobre MgS04, filtrou-se e removeram-se os voláteio „ , ~ , . , . sob pressão reduzrda. Purificou-se o material em bruto por ,
EtOAc/hex Crornatografia flash utilizando 30 a 60% de c exanos como o eluente para Proporcionar 2 (4,2 mg).
Esquema 3. Síntese de Exemplo 3
Resina HMPB-BHA Me-lm. MSNT. DCM
Fmoc'
Piperidina
DMF
Cbz
O
C hz-p.Ala-O H Η OvA o = O1 -snrvVc <Q)
TFA DCM OMa DIEA, ΗΟΘΤ OMe SOP.DMF (P) Cbz
DIEA. HOBT HBTU. DMF.
3 50 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ Síntese de (Ο) A uma solução de Fmoc-Tyr (Me)-OH (1,9 inmol, 0,80 g) em DCM (20 mL) adicionou-se Me-Im (6,7 mmol, 0,370 mL) . Assim que a solução ficou homogénea, adicionou-se MSNT (2,9 mmol, 0, 870 g) e agitou-se a mistura até o MSNT estar dissolvido, momento em que se adicionou resina HMPB-BHA (0,64 mmol, 1,00 g) e deixou-se a solução resultante com agitação durante 45 minutos. Filtrou-se a resina e lavou-se com DMF (50 mL), MeOH (50 mL) e DCM (50 mL) e depois deixou-se a resina secar ao ar para dar (0). Síntese de (P) A (0) (0,40 mmo1, 0,62 g) piperidina/DMF (10 mL) e depois heterogénea resultante com agitação adicionou-se deixou-se a durante 20 20% de solução minutos.
Filtrou-se a mistura e lavou-se a resina com DMF (20 mL) , MeOH (20 mL) e DCM (20 mL) e deixou-se secar ao ar. Submeteu-se depois a resina à condição de reacção anterior uma segunda vez para dar (P). Síntese de (Q) A (P) (0.40 mmol) adicionaram-se DMF (20 mL), Cbz-D-Ala- OH (0,40 mmol, 0,090 g), DIEA (1,6 mmol, 0,12 mL), HOBT (0,64 mmol, 0,062 mg) e BOP (0,64 mmol, 0,178 g) , e deixou-se a mistura reaccional com agitação durante 45 minutos. Filtrou-se a mistura reaccional e lavou-se a resina com DMF (40 mL), MeOH (40 mL) e DCM (40 mL) , e deixou-se secar ao ar para dar (Q) . Síntese de (R) A (Q) (0.08 mmol) adicionou-se 5% de TFA/DCM (2 mL) e deixou-se a mistura com agitação durante 20 minutos. Filtrou-se a mistura reaccional e lavou-se a resina com DCM (10 mL) . Removeram-se depois os voláteis sob pressão reduzida e diluiu-se o óleo resultante com DCM (10 mL) e evaporou-se um total de três vezes para dar (R). 51 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ Síntese de (S) A uma solução agitada de 1 (0,11 mmol, 0,019 g) em MeCN (4 mL) e DMF (1 mL) adicionaram-se (R) (0,1 mmol), DIEA (2,9 mmol, 0,5 mL) , HOBT (0,2 mmol, 0, 032 g) e HBTU (0,23 mmol, 0, 087 g) e agitou-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Diluiu-se a mistura reaccional com NaHCCg saturado (15 mL) e extraiu-se com EtOAc. Lavou-se a fase orgânica com NaHCC>3 saturado e salmoura, secou-se sobre MgSCg, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida. Purificou-se o material resultante por cromatografia flash utilizando 20 a 40% de EtOAc/hexanos como o eluente para proporcionar (S). Síntese de 3 A uma solução agitada de (S) (0,1 mmol) em piridina (1,5 mL) e THF (3,0 mL) a 0°C adicionou-se gota a gota uma solução de HF/piridina. Deixou-se a solução agitar durante 2 horas a 0°C seguindo-se a adição de água (5,0 mL) e extracção com EtOAc. Lavou-se depois a fase orgânica com NaHC03 saturado e salmoura, secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida. Purificou-se o material resultante por cromatografia flash utilizando 30 a 60% EtOAc/hexanos como o eluente, para proporcionar 3 (6,7 mg). 52 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Esquema 4: Síntese de Composto 4 52 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Síntese de (U) dimetil-hidroxilamina 0°C adicionou-se gota Deixou-se a solução A uma solução de cloridrato de (18,4 g, 226,3 mmol) em DCM (400 mL) a a gota DIEA (25,8 mL, 282 mmol). resultante agitar durante 20 minutos. A uma solução de Cbz-Phe-OH (50 g, 169 mmol) em DCM (400 mL) a 0°C adicionou-se gota a gota IBCF (24,4 mL, 266 mmol), seguindo-se a adição gota a gota de NMM (20,7 mL, 293 mmol). Deixou-se a solução resultante agitar durante 10 minutos e depois adicionou-se à solução de cloridrato de dimetil-hidroxilamina/DIEA preparada anteriormente. Deixou-se a mistura agitar durante 3 h a 0°C seguindo-se a adição de água (250 mL) . Separaram-se depois as fases e lavou-se a fase aquosa com DCM (3 x 100 mL) . Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com HC1 1 N (3 x 100 mL) e salmoura (100 mL) , secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar um óleo que foi purificado por cromatografia flash utilizando 20 a 40% de EtOAc/hexanos como o eluente, para dar (U). 53 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ Síntese de (V) A uma solução de (U) (47 g, 145 mmol) numa solução de THF (400 mL) a -20°C adicionou-se uma solução de brometo de isopropenilmagnésio (800 mL, 0,5 M em THF) mantendo a temperatura interna abaixo de -5°C. Deixou-se a solução agitar durante 3 h a 0°C seguindo-se a adição de HC1 1 N (200 mL). Filtrou-se a solução através de Celite 521 e lavou-se o bolo de filtração com EtOAc. Removeu-se depois o solvente orgânico sob pressão reduzida e extraiu-se a solução aquosa restante com EtOAc (3 x 200 mL). Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com NaHC03 saturado (3 x 150 mL) e salmoura (150 mL) , secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar um óleo que foi purificado por cromatografia flash utilizando 20 a 40% de EtOAc/hexanos como o eluente para dar (V). Síntese de (W) e (X) A uma solução de (V) (30,03 g, 92,0 mmol) em MeOH (500 mL) e THF (500 mL) adicionou-se CeCl3.7H20 (48,04 g, 130 mmol). Deixou-se a solução resultante agitar até esta estar homogénea. Arrefeceu-se depois a solução até 0°C e adicionou-se NaBH4 (4,90 mg, 129 mmol) durante um período de 10 minutos. Deixou-se a solução agitar durante 1 h seguindo-se a adição de AcOH (70 mL) com continuação da agitação durante 20 minutos. Concentrou-se depois a mistura sob pressão reduzida e diluiu-se o resíduo resultante com água (400 mL) e extraiu-se com EtOAc (3 x 130 mL) . Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com água (3 x 130 mL) e salmoura (130 mL) , secou- se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar uma mistura 5/1 de (W) e (X). Síntese de (Y) e (Z)
A uma solução de (W) e (X) em DCM (500 mL) a 0°C adicionou-se VO(acac)2 (900 mg, 3,26 mmol), e após agitação durante 5 minutos adicionou-se gota a gota t-BuOOH (30 mL, 6,0 M em decano). Deixou-se a solução resultante agitar durante 2 h, depois filtrou-se através de Celite 521 e lavou-se o bolo de filtração com DCM (200 mL) . Lavou-se depois o 54 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ filtrado com NaHCCg saturado (3 x 200 mL) e salmoura (200 mL) , secou-se sobre MgSCq, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar uma mistura 5/1 de (Y) e (Z). Síntese de (AA) A uma solução de periodinano de Dess-Martin (40 g, 94,2 mmol) em DCM (300 mL) a 0°C adicionou-se gota a gota uma solução de (Y) e (Z) em DCM (100 mL) . Deixou-se depois a solução aquecer à temperatura ambiente e agitar de um dia para o outro. Concentrou-se depois a mistura reaccional sob pressão reduzida e diluiu-se o resíduo com EtOAc (120 mL) e NaHCOs saturado (120 mL) . Filtrou-se a mistura resultante através de Celite 521 e lavou-se o bolo de filtração com EtOAc (120 mL) . Separaram-se as fases e lavou-se a fase orgânica com água (3 x 60 mL) e salmoura (60 mL), secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar um óleo que foi purificado por cromatografia flash utilizando 15 a 40% de EtOAc/hexanos como o eluente para dar (AA) . Síntese de 4 A uma solução de (AA) (50 mg, 1,06 mmol) em TFA (5 mL) adicionou-se Pd/C (14 mg, 10%). Deixou-se a mistura resultante agitar sob 1 atmosfera de H2 durante 2 h, e depois diluiu-se com DCM (10 mL) . Filtrou-se a mistura através de Celite 521 e lavou-se o bolo de filtração com DCM (10 mL) . Concentrou-se depois o filtrado sob pressão reduzida e diluiu-se o resíduo com DCM (10 mL) e concentrou-se sob pressão reduzida uma segunda vez. Colocou-se o resíduo sob vácuo elevado durante 2 h para dar 4. 55 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Esquema 5: Sintese de Exemplo 5 55 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ h2n
Cbz-D-Abu-OH OIEA. HOBT BOP.DMF I Boc
TFA DCM (ΘΘ)
Síntese de (CC) A (BB) (0,06 mmol) adicionaram-se DMF (2 mL), Cbz-D-Abu-OH (0,12 mmol, 0,032 g) , DIEA (0,256 mmol, 0, 075 mL) , HOBT (0,102 mmol, 0,010 mg) e BOP (0,102 mmol, 0,075 g) e deixou-se a mistura reaccional com agitação durante 45 minutos. Filtrou-se depois a mistura reaccional e lavou-se a resina com DMF (4 mL) , MeOH (4 mL) e DCM (4 mL) , e deixou-se secar ao ar, para dar (CC). Síntese de (DD) A (CC) (0,08 mmol) adicionou-se 50% de TFA/DCM (2 mL) e deixou-se a mistura com agitação durante 20 minutos. Filtrou-se a mistura reaccional e lavou-se a resina com DCM (10 mL) . Concentrou-se depois a solução sob pressão reduzida e diluiu-se o óleo resultante com DCM (10 mL) e evaporou-se um total de três vezes para dar (DD). Síntese de 5 A uma solução agitada de 4 (0,11 mmol, 0,019 g) em MeCN (4 mL) e DMF (1 mL) adicionaram-se (DD) (0,1 mmol), DIEA (2,9 mmol, 0,5 mL) , HOBT (0,2 mmol, 0, 032 g) e HBTU (0,23 mmol, 0, 087 g) e agitou-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Diluiu-se depois a mistura reaccional com 56 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
NaHC03 saturado (15 mL) e extraiu-se com EtOAc. Lavou-se a fase orgânica com NaHC03 saturado e salmoura, secou-se sobre MgS°4'_ filtrou-se e concentrou-se Sob pressão reduzida. Purificou-se o material resultante por cromatografia flash utilizando 25 a 55% de EtOAc/hexanos como o eluente para proporcionar 5 (12,0 mg).
Esquema 6: Síntese de Exemplo 6
Cbz-O-Leu-OH
X
Boc (BB>
DIEA, HOBT BOP, DMF H Ϊ
VP
TFA OCM N \ Boc <EE)
Síntese de (EE) A (BB) (0,06 mmol) adicionaram-se DMF (2 mL), Cbz-D-Leu-OH (0,12 mmol, 0,032 g) , DIEA (0,256 mmol, 0, 075 mL) , HOBT (0,102 mmol, 0,010 mg) e BOP (0,102 mmol, 0,075 g)r e deixou-se a mistura reaccional com agitação durante 45 minutos. Filtrou-se depois a mistura reaccional e lavou-se a resina com DMF (4 mL) , MeOH (4 mL) e DCM (4 mL) , e deixou—se secar ao ar para dar (EE). Síntese de (FF) A (FF) (0,08 mmol) adicionaram-se 50% de TFA/DCM (2 mL) e deixou-se a mistura com agitação durante 20 minutos. Filtrou-se a mistura reaccional e lavou-se a resina com DCM (10 mL) . Removeram-se os voláteis sob pressão reduzida e diluiu-se o óleo resultante com DCM (10 mL) e evaporou-se um total de três vezes para dar (FF). 57 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ Síntese de 6 A uma solução agitada de 4 (0,11 mmol, 0,019 g) em MeCN (4 mL) e DMF (1 mL) adicionaram-se (FF) (0,1 mmol), DIEA (2,9 mmol, 0,5 mL) , HOBT (0,2 mmol, 0,032 g) e HBTU (0,23 mmol, 0, 087 g) e agitou-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Diluiu-se depois a mistura reaccional com NaHCCg saturado (15 mL) e extraiu-se com EtOAc. Lavou-se a fase orgânica com NaHCCb saturado e salmoura, secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida. Purificou-se depois o material resultante por cromatografia flash utilizando 25 a 55% de EtOAc/hexanos como o eluente para proporcionar 20 (14,0 mg).
Esquema 7: Síntese de Exemplo 7
Síntese de 7 A uma solução agitada de 4 (0,11 mmol, 0,019 g) em MeCN (4 mL) e DMF (1 mL) adicionaram-se (R) (0,1 mmol), DIEA (2,9 mmol, 0,5 mL) , HOBT (0,2 mmol, 0,032 g) e HBTU (0,23 mmol, 0, 08 7 g) , e agitou-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Diluiu-se depois a mistura reaccional com NaHCCb saturado (15 mL) e extraiu-se com EtOAc. Lavou-se a fase orgânica com NaHC03 saturado e salmoura, secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida. Purificou-se o material resultante por cromatografia flash utilizando 25 a 55% de EtOAc/hexanos como o eluente para proporcionar 7 (10,5 mg). 58 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Esquema δ: Síntese de Composto 8
Síntese de (HH) A uma solução de cloridrato de dimetil-hidroxilamina (331 mg, 3,4 mmol) em DCM (20 mL) a 0°C adicionou-se gota a gota trietilamina (343 mg, 3,4 mmol). Deixou-se a solução resultante agitar durante 20 minutos. A uma solução de Cbz-HomoPhe-OH (1,0 g, 3,2 mmol) em DCM (100 mL) a 0°C adicionou-se gota a gota IBCF (460 mg, 3,35 mmol), seguindo-se a adição gota a gota de NMM (343 mg, 3,4 mmol). Deixou-se a solução resultante agitar durante 10 minutos e depois adicionou-se à solução de dimetil-hidroxilamina .HC1/TEA preparada anteriormente. Agitou-se a mistura resultante a 0°C durante 3 h seguindo-se a adição de água (50 mL) . Separaram-se as fases e extraiu-se a fase aquosa com DCM (3 x 100 mL) . Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com HC1 1 N (30 mL) e salmoura (30 mL) , secou-se sobre MgSCg, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida. 59 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Purificou-se depois ο material resultante por cromatografia flash utilizando EtOAc/hexanos (1:3) como o eluente para dar o intermediário (HH) (0,92 g). Síntese de (II) A uma solução de (HH) (92 0 mg, 2,6 mmol) em THF (50 mL) a -20°C adicionou-se uma solução de brometo de isopropenilmagnésio (26 mL, 12,9 mmol, 0,5 M em THF). Deixou-se a solução resultante agitar a 0°C durante 6 horas seguindo-se a adição de HC1 1 N (10 mL). Filtrou-se a mistura resultante através de Celite 521 e lavou-se o bolo de filtração com acetato de etilo. Separaram-se as fases e extraiu-se a fase aquosa com acetato de etilo (3 x 20 mL) . Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com NaHCCh saturado (30 mL) e salmoura (30 mL) , secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida. Purificou-se o material resultante por cromatografia flash utilizando EtOAc/hexanos (1:3) como o eluente para dar (II) (700 mg). Síntese de (JJ) e (KK) A uma solução de (II) (700 mg, 2,1 mmol) em DCM (50 mL) a 0°C adicionaram-se sucessivamente CeCl3.7H20 (942 mg, 2,52 mmol) e NaBH4 (98 mg, 2,52 mmol). Agitou-se a solução à temperatura ambiente de um dia para o outro seguindo-se a adição de AcOH (5 mL) . Concentrou-se a mistura sob pressão reduzida e depois diluiu-se com EtOAc (100 mL) e NaHC03 saturado (50 mL) . Extraiu-se depois a fase aquosa com EtOAc (2 x 50 mL) e secaram-se as fases orgânicas combinadas sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida até se obter um óleo amarelo que foi purificado por cromatografia flash utilizando EtOAc/hexanos (1:3) como o eluente para dar (JJ) e (KK) numa razão de 5/1. Síntese de (LL) e (MM) A uma solução de (JJ) e (KK) em THF (50 mL) a 0°C adicionaram-se sucessivamente VO(acac)2 (18 mg, 0,066 mmol) e t-BuOOH (0,9 mL, 6,0 M em decano). Agitou-se a solução resultante à temperatura ambiente durante 10 horas depois filtrou-se através de Celite 521 e lavou-se o bolo de 60 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ filtração com EtOAc (100 mL) . Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com NaHCCh saturado (10 mL) e salmoura (10 mL) , secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar (LL) e (MM) (585 mg) numa razão de 5/1. Síntese de (NN) A uma solução de periodinano de Dess-Martin (1,40 g, 3,3 mmol) em DMSO (20 mL) a 0°C adicionou-se (LL) e (MM) (585 mg) em DMSO (10 mL) . Agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 6 horas, e depois diluiu-se com EtOAc (100 mL) e NaHC03 saturado (50 mL) , extraiu-se depois a fase aquosa com EtOAc (2 x 50 mL) e secaram-se as fases orgânicas combinadas sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar um óleo amarelo que foi purificado por cromatografia flash utilizando EtOAc/hexanos (2:3) como o eluente para dar (NN) (465 mg). Síntese de 8 A uma solução de (NN) (290 mg, 0,82 mmol) em TFA (5 mL) adicionou-se Pd/C (14 mg, 10%). Deixou-se a mistura resultante agitar sob 1 atmosfera de H2 durante 2 h, e depois diluiu-se com DCM (10 mL) . Filtrou-se a mistura através de Celite 521 e lavou-se o bolo de filtração com DCM (10 mL) . Concentrou-se sob pressão reduzida e diluiu-se o resíduo com DCM (10 mL) e concentrou-se sob pressão reduzida. Concentrou-se o resíduo resultante sob vácuo elevado durante 2 h para dar 8. 61 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Esquema 9: Síntese de Exemplo 9
61 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ o Cbz-Ala-OH
Boc
TFA DCM \ Boc
Dl EA, HOBT BOP. DMF
Síntese de (00)
A (K) (0.06 mmol) adicionaram-se DMF (2 mL), Cbz-Ala-OH (0,12 mmol, 0, 032 g) , DIEA (0,256 mmol, 0, 075 mL) , HOBT (0,102 mmol, 0,010 mg) e BOP (0,102 mmol, 0,075 g) e deixou-se a mistura reaccional com agitação durante 45 minutos. Filtrou-se depois a mistura reaccional e lavou-se a resina com DMF (4 mL) , MeOH (4 mL) e DCM (4 mL), e deixou-se secar ao ar para dar (00). Síntese de (PP) A (00) (0,08 mmol) adicionou-se 50% de TFA/DCM (2 mL) e deixou-se a mistura com agitação durante 20 minutos. Filtrou-se depois a mistura reaccional e lavou-se a resina com DCM (10 mL) . Removeram-se os voláteis sob pressão reduzida e diluiu-se o óleo resultante com DCM (10 mL) e evaporou-se um total de três vezes para dar (PP). Síntese de 9 A uma solução agitada de 8 (0,11 mmol, 0,019 g) em MeCN (4 mL) e DMF (1 mL) adicionaram-se (PP) (0,1 mmol), DIEA (2,9 mmol, 0,5 mL) , HOBT (0,2 mmol, 0, 032 g) e HBTU (0,23 mmol, 0,087 g) e agitou-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Diluiu-se depois a mistura reaccional com 62 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
NaHCC>3 saturado (15 mL) e extraiu-se com EtOAc. Lavou-se depois a fase orgânica com NaHCCd saturado e salmoura, secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida. Purificou-se o material resultante por cromatografia flash utilizando 25 a 55% de EtOAc/hexanos como o eluente, para proporcionar 9 (7,8 mg).
Esquema 10: Síntese de Exemplo 10 (Exemplo de Referência)
Cbz
Resina Phe-HMPB-BHA
DIEA. HOBT HBTU. DMF
(OQ)
TFA DCM
Cbz
DIEA, HOBT HBTU. DMF.THF
Síntese de (QQ) A uma solução de Cbz-Asp(t-Bu)-OH (0,32 mmol, 108 mg) em DMF (2 mL) a 0°C adicionaram-se HOBT (0,51 mmol, 78 mg), HBTU (0,51 mmol, 194 mg) e DIEA (1,2 mmol, 0,2 mL) . Assim que a mistura resultante ficou uma solução homogénea, adicionou-se resina Phe-HMPB-BHA (0,13 mmol, 200 mg) e deixou-se a mistura reaccional resultante sob agitação a 0~4°C de um dia para o outro. Removeu-se a resina por filtração e lavou-se com DMF (3x5 mL) e DCM (3x5 mL) . Deixou-se a resina secar ao ar para dar (QQ). 63 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ Síntese de (RR) A (QQ) (0,13 mmol) adicionou-se TFA/DCM (5 mL, 5:95) e deixou-se a mistura sob agitação a 0~4°C durante 30 minutos. Filtrou-se depois a mistura reaccional e lavou-se a resina com DCM (3 x 10 mL) . Removeram-se os voláteis sob pressão reduzida a 0°C para dar (RR). Síntese de (SS) A uma solução a 0°C solução de (RR) (0,13 mmol) e 4 (0,12 mmol) em THF (5 mL) adicionaram-se HOBT (0,18 mmol, 31 mg), HBTU (0,18 mmol, 76 mg) e DIEA (0,6 mmol, 0,1 mL) , e agitou-se a mistura reaccional resultante a 0~4°C de um dia para o outro. Diluiu-se depois a mistura reaccional com EtOAc (100 mL) e NaHCCb saturado, e extraiu-se a fase aquosa com EtOAc. Secaram-se as fases orgânicas combinadas sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar um óleo amarelo que foi purificado por HPLC, por eluição com uma solução de MeCN/NH4OAc aquoso, para dar (SS) . Síntese de 10 A uma solução a 0°C de (SS) em DCM (5 mL) adicionou-se gota a gota ácido TFA (5 mL) e agitou-se a solução resultante durante 3 h. Concentrou-se depois a mistura reaccional sob pressão reduzida e purificou-se o resíduo resultante por HPLC, por eluição com uma solução de MeCN/NH4OAc aquoso, para dar 10. 64 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Esquema 11: Síntese de Exemplo 11
Síntese de (TT) A uma solução a 0°C de Z-Ala-OH (0.32 mmol, 71 mg) em DMF (2 mL) adicionaram-se HOBT (0,51 mmol, 78 mg), HBTU (0,51 mmol, 194 mg) e di-isopropiletilamina (1,2 mmol, 0,2 mL). Assim que a mistura resultante ficou homogénea, adicionou-se Phe(4-MeO)-resina Wang (0,13 mmol, 200 mg) e deixou-se a mistura reaccional resultante sob agitação de um dia para o outro. Removeu-se depois a resina por filtração e lavou-se com DMF (3x5 mL) e DCM (3x5 mL) . Deixou-se a resina resultante secar ao ar para dar (TT). Síntese de (UU) A (TT) (0,13 mmol) adicionou-se 50% de TFA/DCM (5 mL) e deixou-se a mistura com agitação durante 30 minutos. Filtrou-se depois a mistura reaccional e lavou-se a resina com DCM (3 x 10 mL). Removeram-se os voláteis sob pressão reduzida para dar (UU). Síntese de 11 A uma solução a 0°C de (UU) (0,13 mmol) e 4 (0,12 mmol) em THF (5 mL) adicionaram-se HOBT (0,18 mmol, 31 mg), HBTU (0,18 mmol, 76 mg) e DIEA (0,6 mmol, 0,1 mL) . Agitou-se a mistura reaccional resultante a 0~4°C de um dia para o outro seguindo-se diluição com EtOAc (100 mL) e NaHC03 saturado. Extraiu-se depois a fase aquosa com EtOAc e secaram-se as 65 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ fases orgânicas combinadas sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou se sob pressão reduzida para dar um óleo amarelo TU,™ purlflcad° por HPLC, por eluição com uma solução de MeCN/NH4OAc aquoso^ para dar 11.
Esquema 12: Síntese de Exempio 12
Síntese de 12 0 mg) e 4 (0,12 A uma solução a 0°C de (VV) (0,18 mmol, 5 mmol) em THF (5 mL) adicionaram-se HOBT (0,l< Λ Λ mmol, 31 mg) , HBTU (0,18 mmol, 76 mg) e DIEA (0,6 mmol, 0,i ttLL) . Agitou-se a mistura reaccional resultante a 0~4°C de bm dia para o outro segumdo-se diluição com EtOAc (10 0 v mL) e NaHC03 saturado. Extraiu-se depois a fase aquosa com EtOAc, e secaram-se as fases orgânicas combinadas sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduz-; ,
Ca para dar um óleo amarelo que foi purificado por HPLC, por . _ ^luiçao com uma solução de MeCN/NH4OAc aquoso, para proporcioq^ ΕΡ 2 041 15r 66
Esquema ^ : Síntese de Exemplo 13
Fmoc
1) Piperidina, DMF 2) Fmoc-Ala-OH, HOBt, HBTU. DEA. DMF
1) Piperidina, Dmie 2) HOBt HBnTiwT~ x-s. · D|Ea. OMF
t)6». HQ8T HBTU. OMF/MeCN
A uma solução de Fmoc-O-t-butil-L-tirosina (6,4 mmol, 2,94 g) em DCM (22 mL) adicionou-se 1-metil-imidazole (4,8 mmol, 0,380 mL) e agitou-se a mistura até a solução estar homogénea, momento em que se adicionou l-(mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-l,2,4-triazole (MSNT) (6,4 mmol, 1,9 g) . Uma vez dissolvido o MSNT, adicionou-se a mistura reaccional a resina HMPB-BHA (1,28 mmol, 2 g) e deixou-se a mistura resultante com agitação durante 45 minutos. Filtrou-se a resina e lavou-se com DMF (50 mL) , MeOH (50 mL) e DCM (50 67 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ mL). Deixou-se depois a resina secar ao ar para proporcionar (WW) . Síntese de (XX) A (WW) (0,40 mmol, 0,62 g) adicionou-se 20% de piperidina/DMF (50 mL) e deixou-se a mistura resultante com agitação durante 20 minutos. Filtrou-se a mistura e lavou-se a resina com DMF (20 mL) , MeOH (20 mL) e DCM (20 mL) e deixou-se secar ao ar antes de a submeter à condição de reacção anterior uma segunda vez. À resina resultante adicionaram-se DMF (64 mL) , Fmoc-Ala-OH (32 mmol, 1,05 g) , DIEA (12,8 mmol, 2,2 mL) , HOBT (5,12 mmol, 692 mg) e HBTU (5,12 mmol, 1,94 g) e deixou-se a mistura reaccional com agitação durante 45 minutos. Filtrou-se a mistura reaccional e lavou-se a resina com DMF (40 mL), DCM (40 mL), MeOH (40 mL) , H20 (40 mL) MeOH (40 mL) , H20 (40 mL), MeOH (40 mL) e DCM (40 mL), e deixou-se secar ao ar para dar (XX). Síntese de (YY) A (XX) (0,192 mmol, 0,3 g) adicionou-se 20% de piperidina/DMF (10 mL) e deixou-se a mistura resultante com agitação durante 20 minutos. Filtrou-se a mistura e lavou-se a resina com DMF (20 mL) , MeOH (20 mL) e DCM (20 mL) e deixou-se secar ao ar antes de a submeter à condição de reacção anterior uma segunda vez. À resina resultante adicionou-se DMF (12 mL) , ácido morfolinoacético (0,48 mmol, 70 mg), DIEA (1,92 mmol, 334 pL), HOBT (0,768 mmol, 104 mg) e HBTU (0,768 mmol, 291 mg), e deixou-se a mistura reaccional com agitação durante 45 minutos. Filtrou-se a mistura reaccional e lavou-se a resina com DMF (40 mL) , DCM (40 mL), MeOH (40 mL), H20 (40 mL) , MeOH (40 mL) H20 (40 mL), MeOH (40 mL) e DCM (40 mL), e deixou-se secar ao ar para dar (YY). 68 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ Síntese de (ΖΖ) A (ΥΥ) (0,192 mmol) adicionou-se 5% de TFA/DCM (10 mL) e deixou-se a mistura com agitação durante 10 minutos a 0°C. Filtrou-se a mistura reaccional e lavou-se a resina com DCM (10 mL) . Removeram-se os voláteis sob pressão reduzida e diluiu-se o óleo resultante com DCM (10 mL) e evaporou-se um total de três vezes para dar (ZZ). Síntese de 13 A uma solução agitada de (ZZ) (0,192 mmol, 83 mg) em MeCN (6 mL) e DMF (2 mL) adicionaram-se 4 (0,384 mmol, 79 mg), DIEA (0,768 mmol, 133 pL) , HOBT (0,3 mmol, 41 mg) e HBTU (0,3 mmol, 116 mg) e agitou-se a mistura a 0°C durante 2 horas. Diluiu-se a mistura reaccional com NaHCCp saturado (15 mL) e extraiu-se com EtOAc (3 x) . Lavou-se a fase orgânica com NaHC03 saturado e salmoura, secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida. Purificou-se o material em bruto resultante por cromatografia flash utilizando EtOAc e depois EtOAc/MeOH/TEA (98/1/1) como o eluente para proporcionar 13 como um sólido branco que foi caracterizado por LC/MS (LCRS (MH) m/z: 623,80). 69 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Esquema 14: Síntese de Exemplo 14
Síntese de (AAA)
Uma suspensão de Boc-Tyr(Me)-OH (10 g) em diclorometano anidro (450 mL) foi arrefecida a -5°C num banho de gelo/acetona. A esta suspensão adicionou-se trietilamina (9,4 mL, 67,8 mmol) e DMAP (600 mg) . Adicionou-se depois gota a gota uma solução de cloroformato de benzilo (5,7 mL, 40,6 mmol) em diclorometano (50 mL) . Deixou-se a solução resultante agitar a -5°C durante três horas, e depois deixou-se aquecer à temperatura ambiente. Adicionou-se depois uma solução de bicarbonato de sódio aquoso saturado (200 mL). Separou-se a fase orgânica e lavou-se a fase aquosa com diclorometano (200 mL) . Lavaram-se as fases orgânicas combinadas com uma solução de bicarbonato de sódio aquoso saturado, secou-se sobre sulfato de sódio, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida. Purificou-se o resíduo resultante por cromatografia em coluna de sílica gel utilizando 80% de hexanos/20% de acetato de etilo para 70 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ proporcionar 11,43 g de um sólido branco (88% de rendimento) que foi caracterizado por LC/MS (LCRS (MH) m/z: 386,42).
Dissolveu-se Boc-Tyr(Me)-OBn (2 g, 5,2 mmol) em diclorometano (15 mL) e arrefeceu-se a 0°C seguindo-se a adição gota a gota de TFA (15 mL) . Deixou-se a mistura reaccional aquecer à temperatura ambiente e agitou-se durante 2 horas. Removeram-se os solventes sob pressão reduzida para dar (AAA) como um óleo claro (1,4 g, 95% de rendimento) que foi caracterizado por LC/MS (LCRS (MH) m/z: 286,42) e utilizado sem qualquer purificação adicional. Síntese de (BBB) A uma solução a 0°C de Boc-Ala-OH (750 mg, 3,9 mmol), H-Tyr(Me)-0Bn (950 mg, 3,3 mmol), HOBT (712 mg, 5,3 mmol) e HBTU (2,0 g, 5,3 mmol) em acetonitrilo (60 mL) e DMF (6 mL) adicionou-se gota a gota N,N-di-isopropiletilamina (2,3 mL) . Agitou-se a mistura a 0°C durante 2 horas e depois diluiu-se com acetato de etilo (300 mL) e lavou-se com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (2 x 100 mL) e salmoura (100 mL). Secaram-se as fases orgânicas sobre sulfato de sódio, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar um óleo opaco que foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel utilizando 50% de hexanos/50% acetato de etilo para dar 600 mg de (BBB) como uma espuma branca (40% de rendimento) que foi caracterizada por LC/MS (LCRS (MH) m/z: 457,52). Síntese de (CCC) A uma solução a 0°C de (BBB) (5,9 g, 12,9 mmol) em tetra-hidrofurano (120 mL) adicionou-se 10% de Pd/C (1,2 g) e deixou-se a mistura resultante agitar sob 1 atmosfera de hidrogénio durante 2 horas. Filtrou-se depois a mistura através de Celite-545 e lavou-se o bolo de filtração com tetra-hidrofurano. Concentrou-se depois o filtrado orgânico sob pressão reduzida e colocou-se sob vácuo elevado para proporcionar 4,53 g (95% de rendimento) de (CCC) que foi utilizado sem qualquer purificação. 71 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ Síntese de (DDD) A uma solução a 0°C de (CCC) (4 g, 10,9 mmol) , 4 (2,23 g, 10,9 mmol), HOBT (2,36 g, 17,4 mmol) e HBTU (6,6 g, 17,4 mmol) em acetonitrilo (200 mL) e DMF (5 mL) adicionou-se N,N-di-isopropiletilamina (7,6 mL) e agitou-se a mistura a 0°C durante 2 horas. Diluiu-se depois com acetato de etilo (400 mL) e lavou-se com bicarbonato de sódio aquoso saturado (2 x 100 mL) e salmoura (100 mL) . Secaram-se as fases orgânicas sobre sulfato de sódio, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida. Purificou-se o residuo resultante por HPLC (acetato de amónio aquoso (0,02 M) e acetonitrilo) para proporcionar (DDD) (4,47 g, 74% de rendimento) conforme caracterizado por LC/MS (LCRS (MH) m/z: 554,79). Síntese de (EEE) A uma solução a 0°C de (DDD) (2 g, 3,6 mmol) em diclorometano (32 mL) adicionou-se ácido trifluoroacético (8 mL), e agitou-se a solução resultante a essa temperatura durante outra hora. Concentrou-se depois a solução sob pressão reduzida e colocou-se sob vácuo elevado para proporcionar (EEE) conforme confirmado por LC/MS (LCRS (MH) m/z: 454,72) que foi utilizado sem qualquer purificação. Síntese de 14 A uma solução a 0°C de (EEE), ácido morfolin-4-il-acético (1,048 g, 7,22 mmol), HOBT (780 mg, 5,76 mmol) e HBTU (2,2 g, 5,76 mmol) em acetonitrilo (60 mL) e DMF (3 mL) adicionou-se gota a gota N,N-di-isopropiletilamina (2,5 mL). Agitou-se a mistura a 0°C durante 2 horas e depois diluiu-se com acetato de etilo (300 mL) e lavou-se com bicarbonato de sódio aquoso saturado (2 x 100 mL) e salmoura (100 mL) . Secaram-se as fases orgânicas sobre sulfato de sódio, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida. Purificou-se o residuo resultante por HPLC (acetato de amónio aquoso (0,02 M) e acetonitrilo) para proporcionar 14 (620 mg, 29% de rendimento) que foi caracterizado por LC/MS (LCRS (MH) m/z: 581,83) . 72 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Esquema 15: Síntese de Exemplo 15 (Exemplo de referência) 72 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
A uma solução a 0°C de (EEE) (65 mg, 0,144 mmol), cloridrato de ácido (2R,6S)-2,6-dimetilmorfolin-4-ii)acético (FFF) (50 mg, 0,288 mmol), HOBT (32 mg, 0,23 mmol) e HBTU (88 mg 0,23 mmol) em acetonitrilo (15 mL) e DMF (1 mL), adicionou-se gota a gota N,N-di-isopropiletilamina (100 pL) e agitou-se a mistura a 0°C durante 2 horas. Diluiu-se depois com acetato de etilo (30 mL) e lavou-se com bicarbonato de sódio aquoso saturado (2 x 15 mL) e salmoura (15 mL) . Secaram-se as fases orgânicas sobre sulfato de sódio, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar um resíduo que foi purificado por HPLC (acetato de amónio aquoso (0,02 M) e acetonitrilo) para proporcionar 15 (32 mg, 36% de rendimento) conforme caracterizado por LC/MS (LCRS (MH) m/z: 609,83).
Esquema 16: Síntese de Exemplo 16 (Exemplo de Referência)
A uma solução a 0°C de (EEE) (62 mg, 0,14 mmol), ácido (2-metil-l,3-tiazol-5-il)acético (GGG) (25 mg, 0,15 mmol), HOBT (30 mg, 0,2 2 mmol) e HBTU (84 mg, 0,2 2 mmol) em acetonitrilo (15 mL) e DMF (1 mL) adicionou-se gota a gota N,N-di-isopropiletilamina (143 pL) e agitou-se a mistura resultante a 0°C durante 2 horas. Diluiu-se depois com acetato de etilo (30 mL) e lavou-se com bicarbonato de sódio aquoso saturado (2 x 15 mL) e salmoura (15 mL). Secaram-se as fases orgânicas sobre sulfato de sódio, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar um resíduo que 73 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ foi purificado por HPLC (acetato de amónio aquoso (0,02 M) e acetonitrilo) para proporcionar 16 que foi caracterizado por LC/MS (LCRS (MH) m/z: 593,72).
Esquema 17: Síntese de Exemplo 17 (Exemplo de Referência)
DIEA. CHjCN/DMF H08T. HBTU
Síntese de (III) A uma solução a 0°C de (HHH) (2 g, 5,9 mmol), 4 (2,44 g, 11,89 mmol), HOBT (1,28 g, 9,5 mmol) e HBTU (3,6 g, 9,5 mmol) em acetonitrilo (180 mL) e DMF (10 mL) adicionou-se gota a gota N,N-di-isopropiletilamina (4,14 mL) e agitou-se a mistura a 0°C durante 2 horas. Diluiu-se depois com acetato de etilo (200 mL) e lavou-se com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (2 x 50 mL) e salmoura (50 mL) . Secaram-se as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar um resíduo que foi purificado por HPLC (acetato de amónio aquoso (0,02 M) e acetonitrilo) para proporcionar (III) (1,5 g, 50% de rendimento) conforme caracterizado por LC/MS (LCRS (MH) m/z: 524,71). 74 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ Síntese de (JJJ) A uma solução a 0°C de (III) (60 mg, 0,1 mmol) em diclorometano (2 mL) adicionou-se ácido trifluoroacético (0,5 mL) , e agitou-se a solução resultante a essa temperatura durante outra hora. Concentrou-se depois a solução sob pressão reduzida e colocou-se sob vácuo elevado para proporcionar (JJJ) conforme confirmado por LC/MS (LCRS (MH) m/z: 424.51) que foi utilizado sem qualquer purificação. Síntese de 17 A uma solução a 0°C de (JJJ), ácido (2,4-dimetil-l, 3- tiazol-5-il-acético (40 mg, 0,23 mmol), HOBT (25 mg, 0,183 mmol) e HBTU (70 mg, 0,183 mmol) em acetonitrilo (6 mL) e DMF (1 mL) adicionou-se gota a gota N,N-di-isopropiletilamina (80 pL) . Agitou-se depois a mistura a 0°C durante 2 horas. Diluiu-se depois com acetato de etilo (50 mL) e lavou-se com bicarbonato de sódio aquoso saturado (2 x 10 mL) e salmoura (10 mL). Secaram-se as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida para dar um resíduo que foi purificado por HPLC (acetato de amónio aquoso (0,02 M) e acetonitrilo) para proporcionar 17 (29 mg, 44% de rendimento) que foi caracterizado por LC/MS (LCRS (MH) m/z: 577,86).
Exemplo 18: Ensaios para determinar a preferência inibidora
Existem três tipos de ensaios que podem ser utilizados quando se determina se uma molécula inibe ou não preferencialmente a actividade de CT-L do proteassoma constitutivo ou do imunoproteassoma. Ensaios de cinética enzimática tais como aqueles revelados no pedido de patente dos E.U.A. número de série 09/569748, Exemplo 2 e Stein et al., Biochem. (1996), 35, 3899-3908 utilizam preparações de proteassoma 20S isolado com mais de 90% de subunidades de proteassoma constitutivo ou de subunidades de imunoproteassoma. A preferência inibidora da molécula é então baseada na razão EC5o da actividade do tipo quimiotríptica do proteassoma constitutivo em relação ao imunoproteassoma (razão 20S). 75 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Alternativamente, a EC5o de CT-L de um composto pode ser determinada utilizando proteassoma 26S no contexto de um lisado celular. Adiciona-se composto ao lisado gerado a partir de células que expressam predominantemente quer proteassoma constitutivo (e.g., HT29) quer imunoproteassoma (e.g., THP1) . Mais uma vez, a preferência inibidora é então baseada na razão EC50 (razão de lisado).
Finalmente, pode-se utilizar uma abordagem mais baseada em células. Células expressando quantidades aproximadamente equivalentes de imunoproteassoma e proteassoma constitutivo (e.g., RPMI-8226) são tratadas com composto de teste, seguindo-se um método para determinação da actividade de um inibidor de proteassoma como descrito no pedido de patente número de série 11/254541. A razão da EC50 gerada no ensaio baseado em ELISA utilizando anticorpo β5 e anticorpos LMP7 (razão ELISA) proporciona a base para determinar a preferência inibidora do composto de teste. Em todos os casos, uma razão de um indica que a molécula funciona igualmente bem na inibição da actividade de CT-L de ambas as formas de proteassoma. Em todos os três ensaios, uma razão menor do que um significa que a molécula inibe a actividade de CT-L do proteassoma constitutivo melhor do que a do imunoproteassoma. Razões superiores a um significam que a molécula inibe a actividade do tipo quimiotripsina do imunoproteassoma melhor do que a do proteassoma constitutivo.
Exemplo 19: Ensaio ELISA
Um ensaio ELISA adequado pode ser encontrado na U.S. 2006/0088471 Al, aqui incorporada na sua totalidade. Resumidamente, células RPMI-8226 foram tratadas com 0,1 nM a 1 μΜ de Inibidor B de proteassoma. Lavaram-se depois as amostras com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e lisaram-se em tampão hipotónico (Tris 20 mM pH 8, EDTA 5 mM) (Tris-HCl e EDTA estão disponíveis na Teknova, Inc., Hollister, CA). Removeram-se os resíduos celulares por centrifugação a 14000 rpm numa microcentrifugadora (4°C) durante 2 min. Transferiu-se o sobrenadante para um tubo fresco, congelou-se instantaneamente em azoto líquido e armazenou-se a -80°C. Após descongelação sobre gelo, trataram-se as amostras (30 μΐ para ensaios em triplicado) 76 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ com 500 ηΜ de Inibidor A durante 1 h à temperatura ambiente. Após tratamento com Inibidor A, o lisado foi desnaturado por adição de sete volumes de SDS a 1% (210 μΐ) (disponível na Bio-Rad, Hercules, CA) e aquecimento a 99°C com agitação vigorosa durante 5 min. Deixou-se a amostra arrefecer e adicionaram-se dois volumes (60 μΐ) de Triton X-100 a 10% (disponível na Bio-Rad, Hercules, CA). 76 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Inibidor A
Pérolas de estreptavidina-Sepharose (6,5 μΐ/poço) (disponíveis na Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) foram lavadas três vezes com 1 ml de PBS (disponível na Mediatech, Inc., Herndon, VA) num tubo de microcentrifugadora. Ressuspenderam-se as pérolas em tampão de bloqueio/lavagem ELISA (PBS + 0,1% de Tween 20 + 1% de albumina de soro de bovino; 20 μΐ/poço) e transferiram-se para os poços de uma placa de filtro de 96 poços (BSA está disponível na Sigma, St. Louis, MO; Tween está disponível na Calbiochcm, San Diego, CA). Aos poços da placa de filtro contendo as pérolas de estreptavidina-Sepharose (cada amostra ensaiada em triplicado) adicionaram-se lisados de sangue inteiro desnaturado ou de PBMC que foram tratados com Inibidor 3 e incubaram-se durante 1 h à temperatura ambiente com agitação (Placas MultiScreen-DV Opaque com membrana Durapore de baixa ligação de proteína; disponível na Millipore, Billerica, MA). Removeu-se o material não ligado por filtração suave e lavaram-se as pérolas seis vezes com tampão de bloqueio/lavagem ELISA (200 μΐ cada).
Anticorpo primário para a subunidade β5 de proteassoma 20S humano (anticorpo policlonal de coelho; disponível na Biomol, Plymouth Meeting, PA) ou para a subunidade LMP7 de imunoproteassoma 20S humano (anticorpo policlonal de coelho; disponível na Affinity BioReagents, Golden, CO) foi diluído 1:1000 em tampão de bloqueio/lavagem ELISA, adicionou-se às pérolas (100 μΐ/poço) e incubou-se durante 1 h à temperatura 77 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ ambiente num agitador orbital. Lavaram-se as pérolas seis vezes com tampão de bloqueio/lavagem ELISA com filtração suave. O tratamento com anticorpo secundário (1:5000) e a lavagem são como descrito para o anticorpo primário (anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com HRP; disponível na Biosource, Camarillo, CA) . Ressuspenderam-se depois as pérolas em 100 μΐ de reagente de detecção quimiluminescente (Super Signal Pico Chemiluminescent Substrate ; disponível na Pierce, Rockford, 1L) e leu-se a luminescência num leitor de placas Tecan. A ocupação dos centros activos do proteassoma com o inibidor de péptido epoxicetona resulta não só numa diminuição da actividade catalítica do tipo quimiotríptica mas também numa diminuição na ligação da sonda biotinilada (Inibidor A) . Estes dados sugerem que o ensaio baseado em ELISA utilizando a sonda biotinilada reflecte com exactidão a actividade inibidora do Inibidor B.
Um aspecto exemplar do ensaio de PD baseado em ELISA é que este permite a diferenciação entre a inibição de proteassoma constitutivo (β 5) e a inibição de imunoproteassoma (LMP7) porque utiliza anticorpos específicos da subunidade. A utilização de uma sonda de um centro activo diferente (Inibidor C) expande a utilidade do ensaio baseado em ELISA para medição da ocupação de múltiplos centros activos de proteassoma constitutivo (β5, βΐ, β2) e de imunoproteassoma (LMP7, LMP2) na linha de células de mieloma múltiplo 8226 que co-expressa ambas as formas de proteassoma. 0 ensaio de centro activo expandido pode ser utilizado para medir a selectividade relativa do inibidor não só entre imunoproteassoma e proteassoma constitutivo mas também entre os três centros activos de cada proteassoma. Adicionalmente, o ensaio baseado em ELISA é capaz de determinar a potência e a selectividade de outras classes de inibidores de proteassoma, incluindo os inibidores baseados em péptido ácido borónico. 78 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Inibidor C
Para conduzir uma avaliação farmacodinâmica de um inibidor, colhem-se amostras de sangue inteiro e de PBMC antes da dosagem e em múltiplos instantes após dosagem. Preparam-se lisados e realizam-se ensaios da concentração de proteína para normalizar a proteína total em cada lisado. 0 nível de ligação de inibidor às subunidades β5 e LMP7 em células de sangue inteiro e PBMC RPMI-8226, respectivamente, é determinado pelo ELISA de captura com estreptavidina como descrito acima. Utilizam-se curvas de calibração com proteassoma constitutivo e imunoproteassoma purificados para assegurar o intervalo de linearidade/dinâmico do ensaio e para converter o sinal de quimiluminescência numa quantidade absoluta (pg) de subunidade ligada. A razão da EC5o gerada no ensaio baseado em ELISA utilizando anticorpo β5 e anticorpos LMP7 (razão ELISA) proporciona a base para determinação da preferência inibidora do composto de teste. 0 inibidor acima (B) tem uma razão maior do que 20 e assim é muito mais selectivo na inibição da actividade do tipo quimiotríptica associada ao imunoproteassoma.
Para determinar o nível de inibição de proteassoma para um dado paciente, a quantidade de β5 ou de LMP7 detectada na amostra pós-dose é comparada com a da amostra pré-dose. A inibição de proteassoma é determinada após uma única dose ou após um ciclo de dosagem, ou é utilizada para monitorizar a inibição logo após a dosagem bem como para monitorizar a recuperação de actividade de proteassoma após um curso de dosagem. 79 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Exemplo 20: Resultados biológicos
Estrutura Razão 20S (constante: imuno) Razão de lisado (HT29: Sultan/Thpl) Razao ELISA (beta5:LMP7) O O > 1,0 >2,0 >5,0 >o p “A^nV^ o V._ o JL ,nh > 1,0 >5,0 >1,0 0 V, 0 > 1,0 > 1,0 >3,0 Η H = Μ Π O \ o ^Λ^,ΝΗ >2,0 >5,0 >3,0 O V. O x> >5,0 >3,0 >3,0 ^'vTr*y^v/r^ 0 "v O Χϊ >3,0 >5,0 >2,0 80 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Estrutura Razão 20S (constante : imuno) Razão de lisado (HT29: Sultan/Thpl) Razao ELISA (beta5:LMP7) Π J[ : Η » Ο \ 0 >5,0 >3,0 >2,0 “yVyVt^ ’ Όβ >5,0 >5,0 >3,0 “yÇSrVv^ • Ό° >3,0 >3,0 >2,0 Μ » 1 Η Η ο ν___ ο ΟΜο >5,0 >2,0 >5,0 “-^"r^s-Ç^0 ‘ Ό* OMe >5,0 >3,0 >5,0 Cte'K'SrBrS'a^^> ο V ο ΟΜ© >5,0 >3,0 >5,0 81 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Estrutura Razão 20S (constante : imuno) Razão de lisado (HT29: Sultan/Thpl) Razao ELISA (beta5:LMP7) 0 \ ο jL vNH >5,0 >5,0 >5,0 Ch* Η » 1 Η Μ Ο ν _ Ο 1 -ΚΗ >3,0 >3,0 >1,0 “ΑΜΑ* Ο V Ο d >2,0 >5,0 >5,0 Obr. Η ]| : Η j[ 0 \_ ° 1 ΝΗ >5,0 >5,0 >3,0 ρ ρ -yVAV* ον 0 Ρ >5,0 >2,0 >3,0 ο V_ ο ί ΝΗ >5,0 >3,0 >5,0 82 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Estrutura Razão 20S (constante : imuno) Razão de lisado (HT29: Sultan/Thpl) Razao ELISA (beta5:LMP7) “AsvS Οχ Ο Ό CM > 1,0 >2,0 >5,0 “-AVA* Οχ Ο >2,0 >2,0 >3,0 ° \_ 0 I ;νμ >5,0 >3,0 >5,0 “,Ή'ΛΥ·ΒίΛβ^^? Ο V_ ο >5,0 >5,0 >5,0 cs\syv*y^° Οχ Ο OMe >2,0 >2,0 >5,0 “YVlArÇ^ Ο ν_ 0 . >5,0 >2,0 >2,0 83 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Estrutura Razão 20S (constante : imuno) Razão de lisado (HT29: Sultan/Thpl) Razao ELISA (beta5:LMP7) Ο "ν__ο CF, >5,0 >2,0 >1,0 Cta'ífVr^!f^r^0 Ο Ο 1 .NH >5,0 >5,0 >5,0 '“-ΛβΛν^ Ον ο χ> >2,0 >3,0 >3,0 -yWÃ* Ον Ο X) >1,0 >5,0 >1,0 0 \ ο 1^-ΝΗ > 1,0 >2,0 >5,0 Ον Ο >2,0 >2,0 >3,0 84 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ
Estrutura Razão 20S (constante: imuno) Razão de lisado (HT29: Sultan/Thpl) Razão ELISA (beta5:LMP7) oh H li · H II O v. O >3,0 >3,0 >5,0 P p O \ 0 1 O CM Λ >3,0 >1,0 O \—1 Λ >1,0 >3,0
Exemplo 21: Utilização de inibidor de imunoproteassoma mim modelo de artrite reumatóide 0 efeito do Composto 14 na progressão da doença foi avaliado em 2 modelos de ratinho de artrite reumatóide (Figura 2) . No modelo de anticorpo artrogénico, no qual a
doença é induzida pela administração de anticorpos anti-colagénio e lipopolissacárido (LPS) (Terato et al., J. Immunol. 148:2103-2108, 1992), o Composto 14 inibiu a progressão da doença de um modo dependente da dose (Figure 2A) . A artrite reumatóide foi induzida ao Dia 0 em ratinhos Balb/c fêmeas por administração IV de anticorpos anti-colagénio do tipo II seguindo-se 3 dias mais tarde por LPS. O
Composto X foi administrado IV 3 vezes/semana durante 2 semanas com inicio no Dia 4, ao primeiro dia os animais mostraram evidência de doença. Para cada ratinho, mediu-se cada pata para avaliar a doença numa escala de 0-4 e atribuiu-se uma pontuação clinica total para cada animal 85 ΕΡ 2 041 158/ΡΤ (pontuação máxima = 16) . A administração de 6 mg/kg de Composto 14 reduziu a severidade da doença -50% enquanto o nível de dose de 20 mg/kg inibiu a doença em mais de 75%. 0 efeito da administração de Composto 14 na progressão da doença foi também avaliado num modelo alternativo em ratinho para RA, no qual a doença se desenvolve 21 - 30 dias após a imunização com colagénio tipo II de bovino (Kagari et al., J. Immunol. 169:1459-1466, 2002). A administração de 6 ou 20 mg/kg de Composto 14 com início após os primeiros sinais de doença inibiu a progressão da doença em comparação com o controlo de veículo (Figura 2B) . De novo, mediu-se a progressão da doença utilizando uma pontuação clínica total da condição da pata por ratinho. Como se observou anteriormente, quantidades crescentes de Composto 14 resultaram numa redução melhorada da severidade da doença.
Lisboa, 2013-07-11

Claims (33)

  1. ΕΡ 2 041 158/ΡΤ 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Composto com uma estrutura de fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável,
    onde cada A é seleccionado independentemente entre C=0, C=S e SO2; ou A é opcionalmente uma ligação covalente quando adjacente a uma ocorrência de Z; B está ausente ou é N(R9)R10; L está ausente ou é seleccionado entre C=0, C=S e SO2; M está ausente ou é Ci_2alquilo; Q está ausente ou é seleccionado entre O, NH e N-Ci_6alquilo; X é seleccionado entre 0, S, NH e N-Ci-6alquilo; cada Z é seleccionado independentemente entre 0, S, NH e N- ÇL alquilo; ou Z é opcionalmente uma ligação covalente quando adjacente a uma ocorrência de A; R1 é seleccionado entre H, -Ci_6alquil-B, Ci-6hidroxialquilo, Ci- alcoxialquilo, arilo e Ci-6aralquilo; R2 e R3 são seleccionados cada um independentemente entre arilo, Ci_6aralquilo, heteroarilo e Ci_6heteroaralquilo; R4 é N (R5) L-Q-R6; R5 é seleccionado entre hidrogénio, OH, Ci_6aralquilo e Ci_ alquilo; R6 é seleccionado entre carbociclilo, heterociclilo, um grupo protector do terminal N, heterociclilMZAZ-Ci-salquil-, heterociclilM- e carbociclilM-, onde o termo "carbociclilo" se refere a um anel não aromático, onde cada átomo do anel é carbono e o termo "heterociclilo" se refere a estruturas de anel não aromático de 3 a 10 membros incluindo um a quatro heteroátomos; R7 e R8 são seleccionados independentemente entre hidrogénio, Ci-6alquilo e Ci-garalquilo; R9 é seleccionado entre hidrogénio, OH e Ci_6alquilo; e R10 é um grupo protector do terminal N; e ΕΡ 2 041 158/ΡΤ 2/6 R15 é seleccionado entre Ci-6alquilo e Ci-6hidroxialquilo; desde que em qualquer ocorrência da sequência ZAZ, pelo menos um membro da sequência tem de ser outro que não uma liqação covalente; onde cada Ci_i2alquilo, Ci_6alquilo, Ci-6hidroxialquilo, Ci_ gilcoxialquilo, arilo, Ci_6aralquilo, heteroarilo, Ci- heteroaralquilo, carbociclilo, heterociclilo e Ci-salquilo pode estar substituído ou não.
  2. 2. Composto da reivindicação 1, onde R7 e R8 são seleccionados independentemente entre hidrogénio e Ci_ alquilo.
  3. 3. Composto da reivindicação 2, onde R7 e R8 são ambos hidrogénio.
  4. 4. Composto da reivindicação 1, onde R15 é seleccionado entre metilo, etilo, hidroximetilo e 2-hidroxietilo.
  5. 5. Composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, onde R5 é hidrogénio.
  6. 6. Composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, onde L e Q estão ausentes.
  7. 7. Composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, onde R6 é um grupo protector do terminal N.
  8. 8. Composto da reivindicação 7, onde R6 é seleccionado entre t-butoxicarbonilo e benziloxicarbonilo.
  9. 9. Composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, onde o carbono portador de R1 tem uma configuração estereoquímica D.
  10. 10. Composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, onde R1 é seleccionado entre -Ci-6alquilB e Ci-6aralquilo.
  11. 11. Composto da reivindicação 10, onde R1 é seleccionado entre metilo, etilo, isopropilo, carboximetilo e benzilo. ΕΡ 2 041 158/ΡΤ 3/6
  12. 12. Composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 11, onde R2 é seleccionado entre Ci-6aralquilo e Ci- tieteroaralquilo.
  13. 13. Composto da reivindicação 12, onde R2 é seleccionado entre Ci-6alquil-f enilo, Ci_6alquil-indolilo, Ci_6alquil-tienilo, Ci-6alquil-tiazolilo e Ci_6alquil-isotiazolilo.
  14. 14. Composto da reivindicação 13, onde R2 é seleccionado entre
    onde D é seleccionado entre hidrogénio, metoxi, t-butoxi, hidroxi, ciano, trifluorometilo e C1_4alquilo, onde Ci-4alquilo pode estar substituído ou não com substituintes seleccionados entre o grupo consistindo de um halogéneo, um hidroxilo, um carbonilo, um tiocarbonilo, um alcoxilo, um fosforilo, um fosfato, um fosfonato, um fosfinato, um amino, um amido, uma amidina, uma imina, um ciano, um nitro, um azido, um sulfidrilo, um alquiltio, um sulfato, um sulfonato, um sulfamoilo, um sulfonamido, um sulfonilo, um heterociclilo, um aralquilo, ou uma porção aromática ou heteroaromática; e R é hidrogénio ou um grupo protector adequado.
  15. 15. Composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 14, onde R3 é seleccionado entre Ci_6aralquilo e Ci- heteroaralquilo. ΕΡ 2 041 158/ΡΤ 4/6 seleccionado
  16. 16. Composto da reivindicação 15, onde R3 é entre Ci-6alquil-f enilo e Ci-6alquil-indolilo.
  17. 17. Composto da reivindicação 16, entre onde R3 é seleccionado
    onde D é seleccionado entre hidrogénio, metoxi, t-butoxi, hidroxi, ciano, trifluorometilo e Ci-4alquilo, onde Ci_4alquilo pode estar substituído ou não com substituintes seleccionados entre o qrupo consistindo de um halogéneo, um hidroxilo, um carbonilo, um tiocarbonilo, um alcoxilo, um fosforilo, um fosfato, um fosfonato, um fosfinato, um amino, um amido, uma amidina, uma imina, um ciano, um nitro, um azido, um sulfidrilo, um alquiltio, um sulfato, um sulfonato, um sulfamoilo, um sulfonamido, um sulfonilo, um heterociclilo, um aralquilo, ou uma porção aromática ou heteroaromática; e R é hidrogénio ou um grupo protector adequado.
  18. 18. Composto da reivindicação 1, onde Rb é seleccionado entre carbociclilo, heterociclilo, heterociclilMZAZ-Ci_ gLlquil-, heterociclilM- e carbociclilM-.
  19. 19. Composto da reivindicação 18, onde R é seleccionado entre heterociclilo, heterociclilMZAZ-Ci-8alquil- e heterociclilM-.
  20. 20. Composto da reivindicação 19, onde L é C=0, Q está ausente, M é Ci_8alquilo e R6 é heterociclilM- e a porção heterociclilo é seleccionada entre morfolino, piperidino, piperazino e pirrolidino.
  21. 21. Composto da reivindicação 20, onde L é C=0, Q está ausente, M é Ci_8alquilo e R6 é heterociclilM- e a porção heterociclilo é morfolino. ΕΡ 2 041 158/ΡΤ 5/6
  22. 22. Composto de acordo com a reivindicação 1 que é
    ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
  23. 23. Composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável para utilização no tratamento de uma doença relacionada com o sistema imunitário, cancro, inflamação, infecção, uma doença proliferativa ou uma doença neurodegenerativa.
  24. 24. Composto da reivindicação 23 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento de uma doença relacionada com o sistema imunitário.
  25. 25. Composto da reivindicação 24 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde a doença relacionada com o sistema imunitário é seleccionada entre asma, doença auto-imune, doença inflamatória do intestino, diabetes, lúpus, esclerose múltipla, miosite, psoriase e artrite reumatóide.
  26. 26. Composto da reivindicação 23 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde a doença ou condição é cancro.
  27. 27. Composto da reivindicação 26 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde o cancro é seleccionado entre leucemia, linfoma e mieloma múltiplo.
  28. 28. Composto da reivindicação 23 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde a doença ou condição é inflamação.
  29. 29. Composto da reivindicação 23 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde a doença ou condição é uma infecção. ΕΡ 2 041 158/ΡΤ 6/6
  30. 30. Composto da reivindicação 23 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde a doença ou condição é uma doença proliferativa.
  31. 31. Composto da reivindicação 23 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde a doença ou condição é uma doença neurodegenerativa.
  32. 32. Composição farmacêutica compreendendo um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável e um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 22 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
  33. 33. Composto da reivindicação 25 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde a doença inflamatória do intestino é seleccionada entre doença de Crohn e colite ulcerosa. Lisboa, 2013-07-11
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