PT1911763E - Composições para o tratamento de desordens gastrointestinais - Google Patents

Composições para o tratamento de desordens gastrointestinais Download PDF

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PT1911763E PT07011869T PT07011869T PT1911763E PT 1911763 E PT1911763 E PT 1911763E PT 07011869 T PT07011869 T PT 07011869T PT 07011869 T PT07011869 T PT 07011869T PT 1911763 E PT1911763 E PT 1911763E
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Shalina Mahajan-Miklos
G Todd Milne
Thea Norman
Mark G Currie
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Description

ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Composições para o tratamento de desordens gastrointestinais"
CAMPO TÉCNICO A presente divulgação refere-se a métodos e composições para o tratamento de várias desordens, incluindo desordens gastrointestinais, obesidade, insuficiência cardíaca congestiva e hiperplasia prostática benigna.
ANTECEDENTES A síndrome do cólon irritável (SCI) é uma desordem crónica comum do intestino que afecta 20 a 60 milhões de indivíduos só nos EU (Lehman Brothers, Global Healthcare-Irritable Bowel Syndrome industry update, Setembro de 1999). A SCI é a desordem mais comum diagnosticada pelos gastroenterologistas (28% dos pacientes examinados) e é responsável por 12% das visitas aos médicos de cuidados primários (Camilleri 2001, Gastroenterology 120:652-668). Nos EU, o impacto económico da SCI está estimado em 25 mil milhões de dólares anualmente, por custos directos de utilização de cuidados de saúde e custos indirectos de absentismo no trabalho (Talley 1995, Gastroenterology 109:1736-1741). Os pacientes com SCI têm três vezes mais absentismo no trabalho e relatam uma reduzida qualidade de vida. Os sofredores podem não ser capazes ou não ter vontade de comparecer em eventos sociais, manter o emprego ou viajar, mesmo curtas distâncias, (Drossman 1993, Dig Dis Sei 38:1569-1580). Existe uma tremenda necessidade médica não correspondida nesta população pois existem poucas opções de prescrições para tratar a SCI.
Os pacientes com SCI sofrem de dores abdominais e de um padrão perturbado dos intestinos. Foram definidos três subgrupos de pacientes de SCI com base no hábito predominante dos intestinos: obstipação predominante (SCI-o), diarreia predominante (SCI-d) ou alternância entre as duas (SCI-a). As estimativas dos indivíduos que sofrem de SCI-o variam de 20-50% dos pacientes de SCI sendo 30% frequentemente citados. Em contraste com os outros dois subgrupos que têm uma relação 2 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ similar entre os géneros, a SCI-o é mais comum nas mulheres (razão de 3:1) (Talley et al. 1995, Am J Epidemiol 142:76-83). A definição e os critérios de diagnóstico para a SCI foram formalizados em "Rome Criteria" (Drossman et al. 1999, Gut 45:Suppl II: 1-81), os guais são bem aceites na prática clinica. Contudo, a complexidade de sintomas não foi explicada por anomalias anatómicas ou alterações metabólicas. Isto conduziu à classificação da SCI como uma desordem GI funcional, gue é diagnosticada com base nos critérios de Rome e a avaliação limitada para excluir a doença orgânica (Ringel et al. 2001, Annu Rev Med 52: 319-338). A SCI é considerada como sendo uma desordem "biopsicossocial" resultante de uma combinação de três mecanismos interactuantes: motilidade intestinal alterada, uma sensibilidade aumentada do intestino ou do cólon a estímulos dolorosos (sensibilidade visceral) e factores psicossociais (Camilleri 2001, Gastroenterology 120:652-668). Recentemente, surgiram mais evidências de um papel de inflamação na etiologia da SCI. Os relatórios indicam que subconjuntos de pacientes de SCI têm aumentos, pequenos mas significativos, células inflamatórias colónicas e mastócitos, óxido nitrico (NO) e sintase (iNOS) indutiveis aumentadas e expressão alterada de citoquinas inflamatórias (revisto por Talley 2000, Medscape Coverage of DDW week).
SUMÁRIO A presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo: (a) um polipéptido seleccionado entre: (i) um polipéptido aminoácidos: compreendendo a sequência de Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; (ii) um polipéptido aminoácidos: compreendendo a sequência de Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; e (iii) um polipéptido aminoácidos: compreendendo a sequência de Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; (b) um agente seleccionado entre: 3 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ (i) um inibidor da bomba de protões; (ii) um agonista de receptores H2; (iii) um antagonista de receptores de opióides; e (iv) um agonista de receptores de opióides; e (c) um transportador farmaceuticamente aceitável.
Outros aspectos e concretizações da invenção, incluindo métodos para a produção dos supramencionados polipéptidos, estão estabelecidos nas reivindicações anexas.
Mais genericamente, a presente divulgação caracteriza composições e métodos relacionados para o tratamento de SCI e outras desordens e condições gastrointestinais, e.g., desordens de motilidade gastrointestinal, desordens gastrointestinais funcionais, doença de refluxo gastroesofágico (DRGE), doença de Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória dos intestinos, azia funcional, dispepsia (incluindo dispepsia funcional ou dispepsia não ulcerosa), gastroparesia, pseudo-obstrução intestinal crónica (ou pseudo-obstrução colónica), e desordens e condições associadas a obstipação, e.g., obstipação associada à utilização de analgésicos opiatos, obstipação pós-cirúrgica e obstipação associada a desordens neuropáticas assim como outras condições e desordens. As composições utilizam péptidos que activam o receptor de guanilato-ciclase C (GC-C). A presente divulgação caracteriza também composições e métodos relacionados para o tratamento de obesidade, insuficiência cardíaca congestiva e hiperplasia prostática benigna (HPB).
Sem estabelecer uma ligação a qualquer teoria particular, no caso da SCI e de outras desordens gastrointestinais, os péptidos são úteis porque podem aumentar a motilidade gastrointestinal.
Sem estabelecer uma ligação a qualquer teoria particular, no caso da SCI e de outras desordens gastrointestinais, os péptidos são úteis, em parte, porque podem diminuir a inflamação. 4 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Sem estabelecer uma ligação a qualquer teoria particular, no caso da SCI e de outras desordens gastrointestinais, os péptidos são também úteis porque podem diminuir a dor gastrointestinal ou a dor visceral. A presente divulgação caracteriza composições farmacêuticas compreendendo determinados péptidos que são capazes de activar o receptor de guanilato-ciclase C (GC-C). Estão dentro da divulgação composições farmacêuticas compreendendo um péptido da divulgação assim como composições de combinação compreendendo um péptido da divulgação e um segundo agente terapêutico, e.g., um agente para o tratamento de obstipação (e.g., SPI-0211; Sucampo Pharmaceuticals, Inc.; Bethesda, MD) ou alguma outra desordem gastrointestinal. Os exemplos de um segundo agente terapêutico incluem: agentes redutores de ácidos tais como inibidores da bomba de protões e bloqueadores de receptores H2, agentes pró-motilidade tais como agonistas dos receptores 5HT (e.g. Zelnorm®) , agentes anti-inflamatórios, agentes antiespasmódicos, antidepressivos, agentes analgésicos que actuam centralmente tais como agonistas de receptores de opióides, antagonistas de receptores opióides, agentes para o tratamento de doença inflamatória dos intestinos, doença de Crohn e colite ulcerativa (e.g., Traficet-EN™ (ChemoCentryx, Inc.; San Carlos, CA)), agentes que tratam a dor gastrointestinal ou visceral e inibidores da cGMP-fosfodiesterase (motapizona, zaprinast e sulfona de suldinac). Assim, por exemplo, as composições farmacêuticas podem incluir um agente analgésico seleccionado do grupo que consiste em: bloqueadores dos canais do Ca (e.g., ziconotida), antagonistas dos receptores 5HT (por exemplo antagonistas dos receptores 5HT3, 5HT4 e 5HT1), agonistas de receptores de opióides (e.g., loperamida, fedotozina, fentanilo, naloxona, naltrexona, metilnalozona, nalmefeno, cipridime, beta-funaltrexamina, naloxonazina, naltrindole, nor-binaltorfimina, morfina, difeniloxilato, pentapéptido encefalina e trimebutina), antagonistas do receptor NK1 (e.g., ezlopitanto e SR-14033), agonistas do receptor CCK (e.g., loxiglumida), antagonistas do receptor NK1, antagonistas do receptor NK3 (e.g., talnetanto, e osanetanto (SR-142801)), inibidores da reassimilação de norepinefrina-serotonina (NSRI; e.g., milnaciprano), agonistas de receptores vanilóides e canabinóides (e.g., arvanil), 5 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ sialorfina, péptidos relacionados com sialorfina compreendendo a sequência de aminoácidos QHNPR (SEQ ID NO:111) por exemplo, VQHNPR (SEQ ID NO:112); VRQHNPR (SEQ ID NO:113); VRGQHNPR (SEQ ID NO:114); VRGPQHNPR (SEQ ID NO:115); VRGPRQHNPR (SEQ ID NO:116); VRGPRRQHNPR (SEQ ID NO:117); e RQHNPR (SEQ ID NO:118), compostos ou péptidos que são inibidores de neprilisina, fracefamida (H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NPQ; WO 01/019849 AI), loperamida, Tyr-Arg (quiotorfina), agonistas de receptores CCK (caeruleina), péptidos de conotoxina, análogos peptidicos de timulina, loxiglumida, dexloxiglumida (o isómero R de loxiglumida) (WO 88/05774) e outros péptidos ou compostos analgésicos que podem ser utilizados com, ou ligados, aos péptidos da presente divulgação. A presente divulgação caracteriza também métodos para o tratamento de várias desordens gastrointestinais por administração de um péptido que actua como um agonista parcial ou completo do receptor GC-C. O péptido inclui pelo menos seis cisteinas que formam três ligações dissulfureto. Em certos casos as ligações dissulfureto estão substituídas por outras reticulações covalentes e em alguns casos as cisteinas estão substituídas por outros resíduos para proporcionar reticulações covalentes alternativas. Os péptidos podem também incluir pelo menos um local de clivagem para tripsina ou quimiotripsina e/ou um péptido carboxi-terminal ou uma molécula pequena analgésicos, e.g., AspPhe ou algum outro péptido analgésico. Quando presente no interior do péptido, o péptido ou a molécula pequena analgésicos podem ser precedidos por um local de clivagem para quimiotripsina ou tripsina que permite a libertação do péptido ou da molécula pequena analgésicos. Os péptidos e métodos da presente divulgação são também úteis para o tratamento da dor e da inflamação associadas a várias desordens, incluindo desordens gastrointestinais. Certos péptidos incluem um local de clivagem para quimiotripsina ou tripsina funcional localizado de modo a permitir a inactivação do péptido após a clivagem. Certos péptidos possuindo um local de clivagem funcional sofrem clivagem e inactivação gradual no tracto digestivo, e isto é desejável em algumas circunstâncias. Em certos péptidos, um local funcional para quimiotripsina está alterado, aumentando a estabilidade do péptido in vivo. 6 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ A presente divulgação caracteriza também métodos para o tratamento de outras desordens tais como insuficiência cardíaca congestiva e hiperplasia prostática benigna, por administração de um péptido ou de uma molécula pequena (por via parentérica ou oral) que actua como um agonista do receptor GC-C. Estes agentes podem ser utilizados em combinação com péptidos natriuréticos (e.g., péptido natriurético atrial, péptido natriurético cerebral ou péptido natriurético do tipo C), um diurético ou um inibidor da enzima de conversão da angiotensina. A presente divulgação caracteriza também métodos e composições para aumentar a motilidade intestinal. A motilidade intestinal envolve distensões e contracções espontâneas coordenadas do estômago, intestinos, cólon e recto, para mover os alimentos ao longo do tracto gastrointestinal durante o processo digestivo.
Em certos casos os péptidos incluem um ou dois ou mais aminoácidos carregados negativamente contíguos (e.g., Asp ou Glu) ou um ou dois ou mais resíduos carregados positivamente contíguos (e.g., Lys ou Arg) ou um ou dois ou mais aminoácidos carregados positiva ou negativamente contíguos no terminal carboxi. Nestes casos todos os aminoácidos flanqueadores no terminal carboxi estão carregados positiva ou negativamente. Noutros casos os aminoácidos carregados do terminal carboxi estão precedidos por uma Leu. Por exemplo, as seguintes sequências de aminoácidos podem ser adicionadas ao terminal carboxi do péptido: Asp; Asp Lys; Lys Lys Lys Lys Lys Lys; Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys; Leu Lys Lys; e Leu Asp. É também possível adicionar simplesmente Leu no terminal carboxi.
Num primeiro aspecto, a presente divulgação caracteriza um péptido compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente na sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Cysg Cys7 Xaas Xaa9 Cysio Cysn Xaai2Xaa43 Xaai4 Cysis Xaai6 Xaai7 Cysis Xaaig Xaa2o Xaa2i em que:
Xaa7 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr ou estão ausente ou Xaa7 Xaa2 Xaa3 Xaa4 estão ausente. Em determinados casos Xaas, Xaag, Xaai2, Xaa73, Xaa74, Xaa77 e Xaaig podem ser qualquer aminoácido. Em determinados casos Xaas é Asn, Trp, Tyr, Asp ou Phe. Noutros casos, Xaa5 pode também ser Thr ou Ile. Noutros 7 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ casos Xaa5 é Tyr, Asp ou Trp. Em alguns casos Xaa8 é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro. Noutros casos Xaa8 é Glu; em alguns casos Xaa9 é Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; em alguns casos Xaa9 é Leu, Ile, Vai, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe.
Em determinados casos, um aminoácido pode estar substituído por um aminoácido que não de ocorrência natural ou um análogo de aminoácido de ocorrência natural ou não. Por exemplo, um aminoácido aromático pode estar substituído por 3,4-di-hidroxi-L-fenilalanina, 3-iodo-L-tirosina, triiodotironina, L-tiroxina, fenilglicina (Phg) ou nor-tirosina (norTyr). Phg e norTyr e outros aminoácidos incluindo Phe e Tyr podem estar substituídos por, e.g., um halogéneo, -CH3, -OH, -CH2NH3, -C (0) H, -CH2CH3, -CN, -CH2CH2CH3, -SH ou outro grupo.
Em alguns casos Xaai2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala. Noutros casos Xaai2 é Asn. Em alguns casos Xaai3 é Ala, Pro ou Gly, e noutros casos é Pro. Em alguns casos Xaai4 é Ala, Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, Ile, Leu, Lys, Arg, ou Asp, e em outros casos é Ala ou Gly, e ainda noutros casos é Ala. Em alguns casos Xaai6 é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaai7 é Gly, Pro ou
Ala; Xaai9 é seleccionado entre Trp, Tyr, Phe, Asn e Leu ou
Xaaig é seleccionado entre Trp, Tyr, e Phe ou Xaaig é seleccionado entre Leu, Ile e Vai; ou Xaaig é His ou Xaaig é seleccionado entre Trp, Tyr, Phe, Asn, Ile, Vai, His e Leu; e Xaa2o Xaa2i é AspPhe ou não está presente ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa2i estão ausente ou Xaai9 Xaa2o Xaa2i não está presente. A presente divulgação caracteriza também métodos para o tratamento de uma desordem gastrointestinal (e.g., uma desordem de motilidade gastrointestinal, uam desordem gastrointestinal funcional, doença de refluxo gastroesophageal, azia funcional, dispepsia, dispepsia funcional, dispepsia não nulcerosa, gastroparese, pseudo-obstrução intestinal crónica ou pseudo-obstrução colónica), obesidade, insuficiência cardíaca congestiva ou hiperplasia prostática benigna por administração de uma composição compreendendo um péptido supramencionado.
Quando Xaag é Trp, Tyr ou Phe ou quando Xaai6 é Trp o péptido possui um local de cleavagem por quimiotripsina potencialmente funcional que está localizado numa posição onde 8 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ a clivagem irá inactivar a ligação ao receptor de GC-C pelo péptido. Quando Xaa9 é Lys ou Arg ou quando Xaai6 é Lys ou Arg, o péptido possui um local de clivagem por tripsina potencialmente funcional que está localizadi numa posição onde a clivagem irá inactivar a ligação ao receptor de GC-C pelo péptido.
Quando Xaaig é Trp, Tyr ou Phe, o péptido possui um local de clivagem por quimiotripsina que está localizado numa posição onde a clivagem irá libertar a porção do terminal carboxi do péptido a Xaai9. Quando Xaaig é Leu, Ile ou Vai, o péptido pode possuir um local de clivagem por quimiotripsina que está localizado numa posição onde a clivagem irá libertar a porção do terminal amino do péptido a Xaaig. A um pH relativamente elevado, observa-se o mesmo efeito quando Xaai9 é His. Quando Xaai9 é Lys ou Arg, o péptido possui um local de clivagem por tripsina que está localizado numa posição onde a clivagem irá libertar a porção do terminal do péptido a Xaaig. Assim, se o péptido incluir um terminal carboxi de um péptido analgésico para Xaaig, o péptido será libertado no tracto digestivo após exposição à protease apropriada. Entre os péptidos analgésicos que podem estar incluídos no péptido estão: AspPhe (como Xaa2oXaa2i) , endomorfina-1, endomorfina-2, nocistatina, dalargina, lupron, e substância P e outros péptidos analgésicos aqui descritos. Estes péptidos podem, por exemplo, ser utilizados para substituir Xaa2oXaa2i.
Quando Xaai ou o aminoácido amino-terminal do péptido da presente divulgação (e.g., Xaa2 ou Xaa3) é Trp, Tyr ou Phe, o péptido possui um local de clibavem por quimiotripsina que está localizado numa posição onde a clivagem irá libertar a porção do terminal amino do péptido a Xaai (ou Xaa2 ou Xaa3) juntamente com Xaai, Xaa2 ou Xaa3. Quando Xaai ou o aminoácido amino-terminal do péptido da presente divulgação (e.g., Xaa2 ou Xaa3) é Lys ou Arg, o péptido possui um local de clivagem por tripsina que está localizado numa posição onde a clivagem irá libertar a porção do terminal amino do péptido a Xaai juntamente com Xaai, Xaa2 ou Xaa3) . Quando Xaai ou o aminoácido amino-terminal do péptido da presente divulgação é Leu, Ile ou Vai, o péptido pode possuir um local de clivagem por quimiotripsina que está localizado numa posição onde a 9 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ clivagem irá liberar a porção do terminal amino do péptido a Xaai. A um pH relativamente elevado observa-se o mesmo efeito quando Xaai é His. Assim, por exemplo, se o péptido incluir um terminal amino de um péptido analgésico a Xaai, o péptido será libertado no tracto digestivo após exposição à protease apropriada. Entre os péptidos analgésicos que podem ser incluídos no peéptido estão: AspPhe, endomorfina-1, endomorfina-2, nocistatina, dalargina, lupron, e substância P e outros péptidos analgésicos aqui descritos.
Quando completamente dobrado, estão presentes ligações dissulfureto entre: Cys6 e Cysu; Cys7 e Cysi5; e Cysio e Cysi8. Os péptidos da presente divulgação possuem alguma similaridade de sequência com péptidos ST. Contudo, incluem alterações e/ou adições de aminoácidos que melhoram a funcionalidade. Estas alterações podem, por exemplo, aumentar ou diminuir a actividade (e.g., aumentar ou diminuir a capacidade do péptido estimular a motilidade intestinal), alterar a capacidade do péptido se dobrar correctamente, a estabilidade do péptido, a capacidade do péptido se ligar ao receptor de GC-C e/ou diminuir a toxicidade. Em alguns casos os péptidos podem funcionar mais desejavelmente do que o péptido ST do tipo selvagem. Por exemplo, podem limitar efeitos secundários indesejáveis tais como diarreia e desidratação.
Em alguns casos, um ou ambos os membros de um ou mais pares de residuos Cys que normalmente formam uma ligação dissulfureto podem estar substituídos por homocisteina, 3-mercaptoprolina (Kolodziej et al. 1996 Int J Pept Protein Res 48:274); β,β dimetilcisteina (Hunt et al. 1993 Int J Pept Protein Res 42:249) ou ácido diaminopropiónico (Smith et al. 1978 J Med Chem 21:117) para formar reticulações internas alternativas nas posições das ligações dissulfureto normais.
Em adição, uma ou mais ligações dissulfureto podem ser substituídas por retuculações covalentes alternativas, e.g., uma ligação amida, uma ligação éster, uma ligação alquílica, uma ligação tioéster, uma ponte de lactama, uma ligação carbamoílo, uma ligação ureia, uma ligação tioureia, uma ligação éster fosfonato, uma ligação alquílica, uma ligação alcenílica, um éter, uma ligação tioéter, ou uma ligação amino. Por exemplo, Ledu et al. (Proceedings Nat'1 Acad. Sei. 10 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 100:11263-78, 2003) descrevem métodos para a preparação de reticulações lactama e amida. Schafmeister et al. (J. Am.
Chem. Soc. 122:5891, 2000) descrevem reticulações estáveis de todos os carbonos. Em alguns casos, a geração destas reticulações alternativas requer a substituição de residuos Cys por outros residuos tais como Lys ou Glu ou aminoácidos que não de ocorrência natural.
No caso de um péptido compreendendo a sequência (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9CySi0 Cysn Xaai2 Xaa73 Xaa34 Cysis Xaa2g Xaa37 Cys28 Xaa29 Xaa2o Xaa27 em que:
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4Xaa5 não está presente e/ou a sequência Xaaig Xaa2o Xaa2i não está presente, o péptido pode ainda conter aminoácidos carboxi-terminais ou amino-terminais adicionais ou ambos. Por exemplo, o péptido pode incluir uma sequência amino-terminal que facilita a produção recombinante do péptido e é clivada antes da administração do péptido a um paciente. O péptido pode também incluir outros aminoácidos amino-terminais ou carboxi-terminais. Em alguns casos, os aminoácidos adicionais protegem o péptido, estabilizam o péptido ou alteram a actividade do péptido. Em alguns casos, alguns ou todos estes aminoácidos adicionais são removidos antes da administração do péptido a um paciente. O péptido pode incluir 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 100 ou mais aminoácidos no seu terminal amino ou no terminal carboxi ou em ambos. O número de aminoácidos flanqueadores não precisa de ser igual. Por exemplo, podem haver 10 aminoácidos adicionais no terminal amino do péptido e nenhum no terminal carboxi.
Num caso da presente divulgação, o péptido compreende a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysio Cysn Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cysis Xaa76 Xaai7 Cysi8 Xaai9 Xaa2oXaa2i em que:
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 não está presente; Xaa8 é Glu; Xaa9 é Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa72 é Asn; Xaa73 é Pro; Xaai4 é Ala; Xaai6 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaai7 é Gly; Xaai9 é Tyr ou Leu; e Xaa2o Xaa27 é AspPhe ou não está presente. Quando Xaa2o Xaa27 e/ou Xaa7 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 estão ausente, podem haver aminoácidos flanqueadores adicionais em alguns casos. 11 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Os péptidos da presente divulgação que estão de acordo com a presente invenção são os péptidos que são citados nas reivindicações anexas.
Num segundo aspecto, a presente divulgação caracteriza também um método terapêutico ou profiláctico compreendendo a administração de um péptido compreendendo a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8Xaa9 Cysio Cysu Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cys15 Xaai6 Xaai7 Cysi8 Xaa49 Xaa2o Xaa27 em que:
Xaa3 Xaa2 Xaa3Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr ou não está presente ou Xaa7 Xaa2 Xaa3 Xaa4 não está presente e Xaa5 é Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr, ou Phe; Xaa8 é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaa9 é Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe;
Xaa42 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaa23 é Pro ou Gly; Xaa24 é Ala,
Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, Ile, Leu, Lys, Arg, ou Asp; Xaa46 é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa47 é Gly, Pro ou Ala;
Xaa49 é Trp, Tyr, Phe ou Leu; e Xaa2o Xaa2i é AspPhe ou não está presente ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa27 não está presente ou Xaa49 Xaa2o Xaa22 não está presente.
Em certos casos dos métodos terapêuticos ou profilácticos: o péptido compreende a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysio Cysn Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cysis XaaigXaax7 Cysi8 Xaai9 Xaa2oXaa2i em que:
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 não está presente; Xaa8 é Glu; Xaa9 é Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr, ou Phe; Xaai2 é Asn; Xaa43 é Pro; Xaai4 é Ala; Xaai6 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp ou Xaai6 é qualquer aminoácido ou Xaai6 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp ou Xaai6 é qualquer aminoácido não aromático; Xaai7 é Gly; Xaai9 é Tyr ou Leu; e Xaa2oXaa2i é AspPhe ou não está presente.
Em certos casos, a presente divulgação caracteriza, um polipéptido purificado compreendendo a sequência de aminoácidos (II):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysio Cysn Asni2 Proi3 Alai4 Cysis Xaa76 Glyi7Cysi8 Xaa79 Xaa2o Xaa2i em que
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr ou não está presente ou Xaa7 Xaa2 Xaa3 Xaa4 não está presente e Xaas é Asn; 12 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Xaas β Glu ou Asp;
Xaa9 é Leu, Ile, Vai, Trp, Tyr ou Phe;
Xaai6 é Thr, Ala, Trp;
Xaaig é Trp, Tyr, Phe ou Leu ou não está presente; e Xaa2o Xaa2i é AspPhe.
Em vários casos preferidos a presente divulgação caracteriza um polipéptido purificado compreendendo a sequência de aminoácidos (II):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Cysg Cys7 Xaas Xaag Cysio Cysn Asn72 Proi3 Alai4 CySi5Xaai6 Glyi7 Cysi8 Xaaig Xaa2o Xaa2i em que:
Xaag é Leu, Ile ou Vai e Xaai6 é Trp, Tyr ou Phe; Xaag é Trp, Tyr ou Phe, e Xaai6 é Thr ou Ala; Xaai9 é Trp, Tyr, Phe e Xaa2o Xaa2i é AspPhe; e Xaai Xaa2Xaa3 Xaa4 não está presente e Xaas é Asn; o péptido compreende menos de 50, 40, 30 ou 25 aminoácidos; ou menos de cinco aminoácidos precedendo CyS6.
Os péptidos da presente divulgação podem ser co-administrados com, ou ligados a, e.g., ligados covalentemente, a qualquer um de uma variedade de outros péptidos incluindo péptidos analgésicos ou compostos analgésicos. Por exemplo, um péptido terapêutico da presente divulgação pode ser ligado a um agente analgésico seleccionado do grupo que consiste em: bloqueadores do canal do Ca (e.g., ziconotida), antagonistas completos ou parciais do receptor 5HT (por exemplo antagonistas do receptor 5HT3, 5HT4 e 5HT1), agonistas completos ou parciais do receptor 5HT incluindo 5HT3, 5HT4 (por exemplo tegaserod, mosaprida e renzaprida) e agonistas do receptor 5HT1, agonistas do receptor CRF (NBI-34041), agonistas do adrenoreceptor β-3, agonistas de receptores de opióides (e.g., loperamida, fedotozina, fentanilo, naloxona, naltrexona, metil-nalozona, nalmefeno, cipridima, beta-funaltrexamina, naloxonazina, naltrindole, nor-binaltorfimina, morfina, difeniloxilato, pentapéptido de encefalina, asimadolina, e trimebutina), antagonistas do receptor NK1 (e.g., ezlopitant e SR-14033), agonistas do receptor CCK (e.g., loxiglumida), antagonistas do receptor NK1, antagonistas receptor NK3 (e.g., talnetant, e osanetant (SR-142801)), inibidores da reassimilação de norepinefrina-serotonina (NSRI; e.g., milnacipran), agonistas de receptores 13 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ de vanilóides e canabanóides (e.g., arvanil), sialorfina, péptidos relacionados com sialorfina compreendendo a sequência de aminoácidos QHNPR (SEQ ID NO: 111) por exemplo, VQHNPR (SEQ ID NO:112); VRQHNPR (SEQ ID NO:113); VRGQHNPR (SEQ ID NO:114); VRGPQHNPR (SEQ ID NO:115); VRGPRQHNPR (SEQ ID NO:116); VRGPRRQHNPR (SEQ ID NO:117); e RQHNPR (SEQ ID NO:118), compostos ou péptidos que são inibidores de neprilisina, fracefamida (H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH2; WO 01/019849 Al), loperamida, Tyr-Arg (quiotorfina), agonistas de receptores CCK (caeruleina), péptidos de conotoxina, análogos peptidicos de timulina, loxiglumida, dexloxiglumida (o isómro R de loxiglumida) (WO 88/05774) e outros péptidos ou compostos analgésicos podem ser utilizados com, ou ligados aos péptidos da presente divulgação.
Espaçadores aminoácidos, que não aminoácidos, peptidicos e não peptidicos, podem ser interpostos entre um péptido que é um agonista do receptor GC-C e um péptido que possui uma outra função biológica, e.g., um péptido analgésico ou um péptido utilizado para tratar a obesidade. O ligante pode ser um que é clivado dos péptidos flanqueadores in vivo ou um que permanece ligado aos péptidos flanqueadores in vivo. Por exemplo, glicina, beta-alanina, glicilglicina, glicil-beta-alanina, ácido gama-aminobutírico, ácido 6-aminocapróico, L-fenilalanina, L-triptofano e glicil-L-valil-L-fenilalanina, podem ser utilizados como espaçadores (Chaltin et al. 2003 Helvetica Chimica Acta 86:533-547; e Caliceti et al. 1993 FARMCO 48:919-32) assim como polietilenoglicóis (Butterworth et al. 1987 J. Med. Chem 30:1295-302) e derivados de maleimida (King et al. 2002 Tetrahedron Lett. 43:1987-1990). Vários outros ligantes estão descritos na literatura (Nestler 1996 Molecular Diversity 2:35-42; Finn et al. 1984 Biochemistry 23:2554-8; Cook et al. 1994 Tetrahedron Lett. 35:6777-80; Brokx et al. 2002 Journal of Controlled Release 78:115-123; Griffin et al. 2003 J. Am. Chem. Soc. 125:6517-6531; e Robinson et al. 1998 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:5929-5934).
Os péptidos podem incluir a sequência de aminoácidos de um péptido que ocorre naturalmente numa espécie de vertebrado (e.g., mamífero) ou numa espécie bacteriana. Em adição, os péptidos podem ser péptidos parcial ou completamente não naturais. Também dentro da presente divulgação estão 14 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ peptidomiméticos correspondentes aos péptidos da presente divulgação. Em vários casos, o paciente sofre de uma desordem gastrointestinal; o paciente sofre de uma desordem seleccionada do grupo que consiste em: uma desordem de motiliade gastrointestinal, sindrome do cólon irritável, obstipação crónica, uma desordem gastrointestinal funcional, doença de refluxo gastroesofágico, azia funcional, dispepsia, dispepsia funcional, dispepsia não ulcerosa, gastroparese, pseudo-obstrução intestinal crónica, doença de Crohn, colite ulcerativa, sindrome do cólon irritável, pseudo-obstrução colónica, obesidade, insuficiência cardiaca congestiva, e hiperplasia prostática benigna; a composição é administrada oralmente; o péptido compreende 30 ou menos aminoácidos, o péptido compreende 20 ou menos aminoácidos, e o péptido compreende não mais de 5 aminoácidos antes de Cyse! ou o péptido compreende 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, ou 30 ou menos aminoácidos. Noutros casos, o péptido compreende 20 ou menos aminoácidos. Noutros cass o péptido compreende não mais de 20, 15, 10, ou 5 péptidos subsequentemente a Cysis- Em certos casos Xaai9 é um local de clivagem para quimiotripsina ou tripsina e está presente um péptido analgésico imediatamente após Xaai9.
Num terceiro aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento de um paciente que sofre de obstipação. Os critério clinicamente aceites que definem a obstipação variam desde a frequência dos movimentos intestinais, a consistência das fezes e a facilidade do movimento intestinal. Uma definição comum de obstipação é de menos de três movimentos intestinais por semana. Outras definições incluem fezes anormalmente duras ou defecação que requer um esforço excessivo (Schiller 2001, Aliment Pharmacol Ther 15:749-763). A obstipação pode ser idiopática (obstipação funcional ou obstipação de trânsito lento) ou secundária a outras causas incluindo desordens neurológicas, metabólicas ou endócrinas. Estas desordens incluem diabetes mellitus, hipotiroidismo, hipertiroidismo, hipocalcemia, esclerose múltipla, doença de Parkinson, lesões da medula espinal, neurofibromatose, neuropatia autónoma, doença de Chagas, doença de Hirschsprung e fibrose cística. A obstipação pode também ser o resultado de cirurgia (íleo pós-operatório) ou devida à utilização de fármacos tais como analgésicos (como os 15 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ opióides), anti-hipertensores, anticonvulsivantes, antidepressivos, antiespasmódicos e antipsicóticos. O método compreende a administração de uma composição compreendendo um polipéptido purificado compreendendo a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysio Cysn Xaa42 Xaai3 Xaai4Cysi5 Xaa76 Xaai7 Cysi8 Xaa49 Xaa2o Xaa24 em que;
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr ou não está presente ou Xaax Xaa2 Xaa3 Xaa4 não está presente e Xaa5 é Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr, ou Phe; Xaa8 é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaa9 é Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe;
Xaai2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaai3 é Pro ou Gly; Xaai4 é Ala,
Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, Ile, Leu, Lys, Arg, ou Asp;
Xaaie é Thr, Ala, Asn, Lys; Arg, Trp; Xaai7 é Gly, Pro ou Ala;
Xaai9 é Trp, Tyr, Phe ou Leu; Xaai9 é Lys ou Arg; Xaa2o Xaa2i é
AspPhe ou não está presente ou Xaa20 é Asn ou Glu e Xaa2i não está presente ou Xaa79 Xaa2o Xaa27 não está presente.
Num caso do método, o péptido compreende a sequência de aminoácidos (I):
Xaa2 Xaa2 Xaa3 Xaa4Xaas Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysio Cysn Xaa22 Xaa23 Xaa24 Cysis Xaai6 Xaa27 Cys28 Xaa29 Xaa2o Xaa22 em que;
Xaa4 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas não está presente; Xaa8 é Glu; Xaa9 é
Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaai2 é Asn; Xaai3 é Pro;
Xaai4 é Ala; Xaa46 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaai7 é Gly;
Xaa79 é Tyr ou Leu; Xaai9 é Lys ou Arg; Xaa20 Xaa27 é AspPhe ou não está presente.
Em vários casos preferidos, a obstipação está associada à utilização de um agente terapêutico; a obstipação está associada a uma desordem neuropática; a obstipação é obstipação pós-cirúrgica (ileo pós-operatório); a obstipação é obstipação associada a uma desordem gastrointestinal; a obstipação é idiopática (obstipação funcional ou obstipação de trânsito lento); ou a obstipação é associada a uma desordem neuropática, metabólica ou endócrina (e.g., diabetes mellitus, hipotiroidismo, hipertiroidismo, hipocalcemia, esclerose múltipla, doença de Parkinson, lesões da medula espinal, neurofibromatose, neuropatia autónoma, doença de Chagas, doença de Hirschsprung ou fibrose cistica). A obstipação pode 16 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ também ser ο resultado de cirurgia (ileo pós-operatório) ou devida à utilização de fármacos tais como analgésicos (e.g., opióides), anti-hipertensores, anticonvulsivantes, antidepressivos, antiespasmódicos e antipsicóticos.
Num quarto aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento de um paciente que sofre de uma desordem gastrointestinal, o método compreendendo a administração ao paciente de uma composição compreendendo um polipéptido purificado compreendendo a sequência de aminoácidos (I) :
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Cys8 Cys7 Xaag Xaag CysioCysn Xaa72 Xaa73 Xaai4 Cysis Xaai6 Xaai7 Cysi8 Xaai9 Xaa2o Xaa2i em que:
Xaai Xaaz Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr ou não está presente ou Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 não está presente e Xaa5 é Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr, ou Phe; Xaa8 é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaa9 é Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe;
Xaai2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaai3 é Pro ou Gly; Xaa74 é Ala,
Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, Ile, Leu, Lys, Arg, ou Asp; Xaai6 é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaai7 é Gly, Pro ou Ala;
Xaaig é Trp, Tyr, Phe ou Leu; Xaai9 é Lys ou Arg; Xaa2o Xaa2i é
AspPhe ou não está presente ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa2i não está presente ou Xaaig Xaa2o Xaa2i não está presente.
Num caso do método, o péptido compreende a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4Xaas Cys6 Cys7 Xaa8 Xaag Cys7o Gysn Xaa72 Xaa73 Xaa74 Cysis Xaai6 Xaai7 Cysi8 Xaaig Xaa2o Xaa27 em que:
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas não está presente; Xaa8 é Glu; Xaag é Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa72 é Asn; Xaa73 é Pro; Xaai4 é Ala; Xaai6 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa77 é Gly; Xaaig é Tyr ou Leu; Xaa79 é Lys ou Arg; Xaa20 Xaa2i é AspPhe ou não está presente.
Em vários casos, o paciente sofre de uma desordem gastrointestinal; ou o paciente sofre de uma desordem seleccionada do grupo que consiste em: uma desordem de motilidade gastrointestinal, sindrome do cólon irritável, obstipação crónica, uma desordem gastrointestinal funcional, doença de refluxo gastroesofágico, azia funcional, dispepsia, dispepsia funcional, dispepsia não ulcerosa, gastroparese, 17 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ pseudo-obstrução intestinal crónica, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória do intestino, pseudo-obstrução colónica, obesidade, insuficiência cardiaca congestiva, e hiperplasia prostática benign.
Em vários casos preferidos, Xaag é Leu, Ile ou Vai e Xaai6 é Trp, Tyr ou Phe; Xaa9 é Trp, Tyr ou Phe e Xaai6 é Thr ou Ala; Xaaig é Trp, Tyr, Phe; Xaaig é Lys ou Arg;Xaa2o Xaa2i é AspPhe; Xaai Xaa2Xaa3 Xaa4 não está presente e Xaa5 é Asn.
Num quinto aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para aumentar a motilidade gastrointestinal num paciente, o método compreendendo: a administração ao paciente de uma composição compreendendo um polipéptido purificado compreendendo a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaag Cysio Cysn Xaai2Xaai3 Xaa44 Cysis Xaa46 Xaa37 Cysi8 Xaa49 Xaa2o Xaa2i em que:
Xaa4 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas é Asn Ser Ser Asn Tyr ou não está presente ou Xaa4 Xaa2 Xaa3 Xaa4 não está presente e Xaas é Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr, ou Phe; Xaa8is Gin, Asp, Gin, Gly ou
Pro; Xaa9 é Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe;
Xaai2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaai3 é Pro ou Gly; Xaai4 é Ala,
Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, Ile, Leu, Lys, Arg, ou Asp; Xaai6 é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaai7 é Gly, Pro ou Ala;
Xaaig é Trp, Tyr, Phe ou Leu; Xaaig é Lys ou Arg; Xaa2oXaa2i é
AspPhe ou não está presente ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa2i não está presente ou Xaaig Xaa2o Xaa2i não está presente.
Num caso o péptido compreende a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4Xaa5 Cyse Cys7Xaa8 Xaa9 Cysio Cysn Xaai2 Xaai3 Xaa44 Cysis Xaa46 Xaai7 Cysis Xaaig Xaa2o Xaa2i em que:
Xaa4 Xaa3Xaa3 Xaa4 Xaa5 não está presente; Xaa8 é Glu; Xaa9 é Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaai2 é Asn; Xaai3 é Pro;
Xaa44 é Ala; Xaai6 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaan é Gly; Xaa49 é Tyr ou Leu; Xaa49 é Lys ou Arg; Xaa2oXaa2i é AspPhe ou não está presente.
Num sexto aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para aumentar a actividade de um receptor de guanilato-ciclase (GC-C) intestinal num paciente, o método 18 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ compreendendo: a administração ao paciente de uma composição compreendendo um polipéptido purificado compreendendo a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4Xaa5 Cyse Cys7 Xaa8 Xaag Cysio Cysn Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cysis Xaaiç Xaai7 Cysis Xaa7g Xaa2o Xaa2i em que:
Xaa7 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr ou não está presente ou Xaa7 Xaa2 Xaa3 Xaa4 não está presente e Xaa5 é Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr, ou Phe; Xaa8 é Glu, Asp, Gin, Gly ou
Pro; Xaag é Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe;
Xaai2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaa73 é Pro ou Gly; Xaa74 é Ala,
Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, Ile, Leu, Lys, Arg, ou Asp;
Xaa76 é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa77 é Gly, Pro ou Ala;
Xaa7g é Trp, Tyr, Phe ou Leu; Xaa7g é Lys ou Arg; Xaa2o Xaa2 é
AspPhe ou não está presente ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa2i não está presente ou Xaa7g Xaa2o Xaa2i não está presente.
Num caso o péptido compreende a sequência de aminoácidos (I):
Xaa7 Xaa2 Xaa3 Xaa4Xaa5 Cys6 Cys7Xaa8 Xaag Cysio Cysn Xaai2 Xaai3 Xaa74 Cysis Xaa36 Xaa37 Cysis Xaa7g Xaa2o Xaa2i em que:
Xaai Xaa3Xaa3 Xaa4 Xaa5 não está presente; Xaa8 é Glu; Xaag é
Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa72 é Asn; Xaai3 é Pro;
Xaa74 é Ala; Xaa76 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaai7 é Gly; Xaaig é Tyr ou Leu; Xaaig é Lys ou Arg; Xaa2oXaa2i é AspPhe ou não está presente.
Num sétimo aspecto, a presente divulgação caracteriza uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos (I):
Xaa7 Xaa2 Xaa3 Xaa4 XaasCys6 Cys7 Xaas Xaag Cysio Cysn Xaa32 Xaa33 Xaa74 Cysis Xaa36 Xaa77 Cysis Xaa3g Xaa2o Xaa2i em que:
Xaa3 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas é Asn Ser Ser Asn Tyr ou não está presente ou Xaa3 Xaa2 Xaa3 Xaa4 não está presente e Xaas é Asn; Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr, ou Phe; Xaa8 é Glu, Asp, Gin, Gly ou
Pro; Xaag é Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe;
Xaa72 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaai3 é Pro ou Gly; Xaa34 é Ala,
Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, Ile, Leu, Lys, Arg, ou Asp; XaaiG o Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xeei7 e Gly, Pro ou Ala;
Xaa7g é Trp, Tyr, Phe ou Leu; Xaa7g é Lys ou Arg; Xaa2o Xaa2i é 19 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
AspPhe ou não está presente ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa2i não está presente ou Xaa7g Xaa2o Xaa2i não está presente.
Num caso o péptido compreende a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 CyS6 Cys7Xaas Xaag Cysio Cysn Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cysis Xaai6 Xaai7 Cysis Xaaig Xaa2oXaa2i em que:
Xaai Xaa2Xaa3 Xaa4 Xaa5 não está presente; Xaas é Glu; Xaag é Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaai2 é Asn; Xaai3 é Pro; Xaai4 é Ala; Xaai6 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaai7 é Gly; Xaaig é Tyr ou Leu; Xaaig é Lys ou Arg; Xaa2oXaa2i é AspPhe ou não está presente.
Num oitavo aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento de obstipação, o método compreendendo a administração de um agonista do receptor da guanilato-ciclase (GC-C) intestinal. Em vários casos: o agonista é um péptido, o péptido inclui quatro Cys que formam duas ligações dissulfureto, e o péptido inclui seis Cys que formam três ligações dissulfureto.
Num nono aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento de uma desordem gastrointestinal, uma desordem de motilidade gastrointestinal, sindrome do cólon irritável, obstipação crónica, uma desordem gastrointestinal funcional, doença de refluxo gastroesofágico, azia funcional, dispepsia, dispepsia funcional, dispepsia não ulcerosa, gastroparese, pseudo-obstrução intestinal crónica, pseudo-obstrução colónica, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatório dos intestinos, obesidade, insuficiência cardiaca congestiva ou hiperplasia prostática benigna, o método compreendendo a administração de um agonista do receptor da guanilato-ciclase (GC-C) intestinal quer oralmente, por supositório rectal, ou parentericamente. Em vários casos: o agonista é um péptido, o péptido inclui quatro Cys que formam duas ligações dissulfureto, e o péptido inclui seis Cys que formam três ligações dissulfureto.
Num décimo aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento de uma desordem gastrointestinal seleccionada do grupo que consiste em: uma desordem de motilidade gastrointestinal, sindrome do cólon irritável, 20 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ obstipação crónica, uma desordem gastrointestinal funcional, doença de refluxo gastroesofágico, azia funcional, dispepsia, dispepsia funcional, dispepsia não ulcerosa, gastroparese, pseudo-obstrução intestinal crónica, pseudo-obstrução colónica, doença de Crohn, colite ulcerativa e doença inflamatória dos intestinos, o método compreendendo a administração de um agonista do receptor da guanilato-ciclase (GC-C) intestinal. Em vários casos a composição é administrada oralmente; o péptido compreende 30 ou menos aminoácidos, o péptido compreende 20 ou menos aminoácidos, ou o péptido compreende não mais de 5 aminoácidos antes de Cys5.
Em vários casos: o agonista é um péptido, o péptido inclui quatro Cys que formam duas ligações dissulfureto, ou o péptido inclui seis Cys que formam três ligações dissulfureto.
Num décimo primeiro aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento de obesidade, o método compreendendo a administração de um agonista do receptor da guanilato-ciclase (GC-C) intestinal. Em vários casos: o agonista é um péptido, o péptido inclui quatro Cys que formam duas ligações dissulfureto, ou o péptido inclui seis Cys que formam três ligações dissulfureto.
Num décimo segundo aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento de obesidade, o método compreendendo a administração de um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7Xaas Xaag Cysio Cysn Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cysis Xaaie Xaai7 Cysis Xaai9 Xaa2o Xaa2i em que:
Xaai Xaa2Xaa3 Xaa4 Xaas é Asn Ser Ser Asn Tyr ou não está presente ou Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 não está presente e Xaa5 é Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr, ou Phe; Xaas é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaa9 é Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaai2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaai3 é Pro ou Gly; Xaai4 é Ala, Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, Ile, Leu, Lys, Arg, ou Asp; Xaai6 é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaai7 é Gly, Pro ou Ala; Xaaig é Trp, Tyr, Phe ou Leu; e Xaa2o Xaa2i é AspPhe ou não está presente ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa2i não está presente ou Xaaig Xaa2o Xaa2i não está presente. O péptido pode ser administrado sozinho ou em combinação com outro agente para o 21 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ tratamento de obesidade, e.g., sibutramina ou outro agente, e.g.r um agente aqui descrito.
Num caso, o péptido compreende a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4Xaa5 Cys6 Cys7Xaa8 Xaag Cysio Cysn Xaai2 Xaai3 Xaa44 Cysis Xaai6 Xaa47 Cys4s Xaa79 Xaa2o Xaa2i em que:
Xaa7 Xaa2Xaa3 Xaa4 Xaa5 não está presente; Xaa3 é Glu; Xaag é Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa42 é Asn; Xaai3 é Pro; Xaa44 é Ala; Xaa46 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa47 é Gly; Xaa4g é Tyr ou Leu; e Xaa2o Xaa2i é AspPhe ou não está presente.
Num décimo terceiro aspecto, a presente divulgação caracteriza uma composição farmacêutica compreendendo um polipéptido aqui descrito.
Num décimo quarto aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento de insuficiêmcia cardíaca congestiva, o método compreendendo: a administração ao paciente de uma composição compreendendo um polipéptido purificado compreendendo a sequência de aminoácidos (I):
Xaa4 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Cys6 Cys7 Xaas Xaa9 Cysio Cysn Xaa42 Xaa i3 Xaai4Cysi5 Xaan Xaa47 Cysis Xaa4g Xaa2o Xaa2i em que:
Xaa4 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas é Asn Ser Ser Asn Tyr ou não está presente ou Xaa4 Xaa2 Xaa3 Xaa4 não está presente e Xaa5 é Asn,
Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr, ou Phe; Xaas é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaa9 é Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe;
Xaa42 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaa43 é Pro ou Gly; Xaa74 é Ala,
Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, Ile, Leu, Lys, Arg, ou Asp; Xaa46 é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa47 é Gly, Pro ou Ala;
Xaaig é Trp, Tyr, Phe ou Leu; e Xaa2o Xaa2i é AspPhe ou não está presente ou Xaa2o é Asn Ou Glu e Xaa2i não está presente ou
Xaaig Xaa2o Xaa2i não está presente. 0 péptido pode ser administrado em combinação com outro agente para o tratamento de insuficiência cardíaca congestiva, por exemplo, um péptido natriurético (tal como o péptido natriurético atrial, o péptido natriurético cerebral ou o péptido natriurético do tipo C) , um diurético, ou um inibidor da enzima de conversão da angiotensina. 22 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Num caso ο péptido compreende a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Cysg Cys7Xaas Xaa9 Cysio Cysn Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cysis Xaai6 Xaai7 Cysis Xaai9 Xaa2o Xaa2i em que:
Xaai Xaa2Xaa3 Xaa4 Xaa5 não está presente; Xaas é Glu; Xaag é Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa42 é Asn; Xaai3 é Pro; Xaa44 é Ala; Xaa46 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaan é Gly; Xaa49 é Tyr ou Leu; Xaa49 é Lys ou Arg; Xaa2oXaa2i é AspPhe ou não está presente.
Num décimo quinto aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento de hiperplasia prostática benigna, o método compreendendo: a administração ao paciente de uma composição compreendendo um polipéptido purificado compreendendo a sequência de aminoácidos (I):
Xaa4 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas CyS6 Cys7 Xaas Xaa9 Cys4o Cysn Xaa42 Xaa43 Xaai4Cysi5 Xaa46 Xaa47 Cysis Xaa49 Xaa2o Xaa2i em que:
Xaa4 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas é Asn Ser Ser Asn Tyr ou não está presente ou Xaa4 Xaa2 Xaa3 Xaa4 não está presente e Xaas é Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr, ou Phe; Xaag é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaa9 é Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe;
Xaa42 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaa73 é Pro ou Gly; Xaai4 é Ala,
Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, Ile, Leu, Lys, Arg, ou Asp; Xaai6 é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa47 é Gly, Pro ou Ala;
Xaai9 é Trp, Tyr, Phe ou Leu; Xaa79 é Lys ou Arg; Xaa2o Xaa2i é
AspPhe ou não está presente ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa2i não está presente ou Xaa79 Xaa2o Xaa2i não está presente. 0 péptido pode ser administrado em combinação com outro agente para o tratamento de HPB, por exemplo, um inibidor de 5-alfa-redutase (e.g., finasterida) ou um inibidor alfa-adrenérgico (e.g., doxazosina).
Num caso o péptido comprende a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Cys6 Cys7Xaag Xaa9 Cysio Cysn Xaa42 Xaa43 Xaa i4 Cysis Xaai6 Xaa47 Cysis Xaa49 Xaa2o Xaa2i em que:
Xaa7 Xaa2Xaa3 Xaa4 Xaa5 não está presente; Xaas é Glu; Xaa9 é Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaai2 é Asn; Xaai3 é Pro; 23 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Xaai4 é Ala; Xaai6 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaai7 é Gly; Xaaig é Tyr ou Leu; e Xaa2o Xaa2i é AspPhe ou não está presente.
Num décimo sexto aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento, ou redução, da dor, incluindo dor visceral, dor associada a uma desordem gastrointestinal ou dor associada a uma outra desordem, o método compreendendo: a administração ao paciente de uma composição compreendendo um polipéptido purificado compreendendo a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Cys6 Cys7 Xaas Xaag Cysm Cysn Xaai2 Xaai3 Xaai4Cysi5 Xaa4g Xaa^7 Cys^s Xaa^g Xaa2o Xaâ2i, e.g., um polipéptido purificado compreendendo uma sequência de aminoácidos aqui divulgada.
Num décimo sétimo aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento de inflamação, incluindo inflamação do tracto gastrointestinal, e.g., inflamação associada a uma desordem gastrointestinal ou infecção ou uma outra desordem, o método compreendendo: a administração ao paciente de uma composição compreendendo um polipéptido purificado compreendendo a sequência de aminoácidos (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 CyS6 Cys7 Xaa8 Xaag CysioCysn Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cysis Xaa4g Xaa47 Cysis Xaai9 Xaa2oX9-9-2if e.g., um polipéptido purificado compreendendo uma sequência de aminoácidos aqui divulgada.
Em certos casos o péptido inclui um péptido compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys Cys Glu Xaa9 Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Xaa2o Xaa2i (II) (SEQ ID NO: 66) em que Xaa9 é qualquer aminoácido, em que Xaa9 é qualquer aminoácido que não Leu, em que Xaa9 é seleccionado entre Phe, Trp e Tyr; em que Xaag é seleccionado entre qualquer outro aminoácido aromático natural ou não natural, em que Xaa9 é Tyr; em que Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr; em que Xaai, Xaa2, Xaa3, Xaa4 e Xaa5 não estão presentes; em que Xaa4, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 não estão presentes; em que Xaa4, Xaa2 e Xaa3 não estão presentes; em que Xaai e Xaa2 não estão presentes; em que Xaai não está presente; em que Xaa2o Xaa2i é AspPhe ou não estão presentes ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa2i não está presente, ou Xaai9 Xaa2o Xaa2i não 24 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ estão presentes. No caso de um péptido compreendendo a sequência (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Cys6 Cys7 Xaas Xaa9 Cysio Cysn Xaai2 Xaai3 Xaai4Cysi5 Xaai6 Xaai7 Cysig Xaaig Xaa2o Xaa2i om que:
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas não estão presentes e/ou a sequência Xaai9 Xaa2oXaa2i não está presente, o péptido pode ainda conter aminoácidos carboxi-terminais ou amino-terminais adicionais ou ambos. Entre os péptidos úteis estão os péptidos compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente na sequênci a de aminoácidos Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Cys Cys Glu Xaag Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Xaa2 :o Xaa2i ( II) (SEQ ID NO:66) que são os péptidos seguintes: Gin Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID : NO:-67) Asn Thr Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID : NO:68) Asn Leu Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID : NO:69) Asn Ile Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID : NO:70) Asn Ser Ser Gin Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ id : NO:71) Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ id : NO:72) Gin Ser Ser Gin Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala ( Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO : 73) Ser Ser Gin Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 74). Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Ala Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO : 75) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ed : NO:7 6) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Asn Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID : NO:77) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Asp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ id : NO:78) Asn Ser Ser Asn yr Cys Cys Glu Cys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:7 9) 25 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Gin Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:80) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Glu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:81) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Gly Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:82) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu His Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:83) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:84) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 85) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Met Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 86) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 87) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Pro Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 88 ) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Ser Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 89 ) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Thr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 90 ) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 91 ) Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 92 ) Cys Cys Glu Ala Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 93 ) Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 94 ) Cys Cys Glu Asn Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 95 ) Cys Cys Glu Asp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 96) Cys Cys Glu Cys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID ΝΟ: 97 ) 26 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Cys Cys Glu ID NO: 98) Gin Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ Cys Cys Glu ID NO: 99 ) Glu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ Cys Cys Glu ID NO: 100 ) Gly Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ Cys Cys Glu ID NO: 101) His Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ Cys Cys Glu ID NO: 102) Ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ Cys Cys Glu ED NO: 103) Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ Cys Cys Glu ID NO: 104) Met Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ Cys Cys Glu ID NO: 105) Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ Cys Cys Glu ID NO : 10 6) Pro Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ Cys Cys Glu ID NO: 107) Ser Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ Cys Cys Glu ID NO: 108) Thr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ Cys Cys Glu ID NO: 109) Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ Cys Cys Glu ID NO: 110) Vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ
Num décimo oitavo aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento de insuficiêmcia cardíaca congestiva, o método compreendendo a administração de um agonista completo ou parcial do receptor de guanilato-ciclase (GC-C) intestinal. 0 agonista pode ser administrado em combinação com outro agente para o tratamento de insuficiência cardíaca congestiva, por exemplo, um péptido natriurético tal como o péptido natriurético atrial, o péptido natriurético cerebral ou o péptido natriurético do tipo C) , um diurético, ou um inibidor da enzima de conversão da angiotensina. 27 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Num décimo nono aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento de HPB, o método compreendendo a administração de um agonista completo ou parcial do receptor da guanilato-ciclase (GC-C) intestinal. 0 agonista pode ser administrado em combinação com outro agente para o tratamento de HPB, por exemplo, um inibidor de 5-alfa-redutase (e.g., finasterida) ou um inibidor alfa-adrenérgico (e.g., doxazosina).
Num vigésimo aspecto, a presente divulgação caracteriza um método para o tratamento de obesidade, o método compreeendendo a administração de um agonista completo ou parcial do receptor da guanilato-ciclase (GC-C) intestinal. 0 agonista pode ser administrado em combinação com outro agente para o tratamento de obesidade, por exemplo, péptido fragmento da hormona intestinal YY3-36 (PYY3-36) (N. Engl. j. Med. 349:941, 2003; ikpeapge daspeelnry yaslrhylnl vtrqry) glp-1 (péptido-1 semelhante a glucagone), exendina-4 (um inibidor de glp-1), sibutramina, fentermina, fendimetrazina, cloridrato de benzfetamina (Didrex) , orlistat (Xenical), cloridrato de dietilpropiona (Tenuate), fluoxetina (Prozac), bupropiona, efedra, crómio, Garcinia cambogia, benzocaina, bodelha (Fucus vesiculosus), quitosano, Nomame herba, galega (arruda caprária, falso-anil), ácido linoleico conjugado, L-carnitina, fibra (psilio, plantago, fibra de guár), cafeina, desidroepiandrosterona, carvalhinha (Teucrium chamaedrys), B-hidroxi^-metilbutirato e piruvato. Um péptido útil para o tratamento de obesidade pode ser administrado como co-terapia com um péptido da presente divulgação na forma de uma molécula distinta ou como parte de uma proteína de fusão com um péptido da presente divulgação. Assim, por exemplo, PYY3-36 pode ser fundido com o terminal carboxi ou amino de um péptido da presente divulgação. Esta proteína de fusão pode incluir um local de clivagem para quimiotripsina ou tripsina que pode permitir a clivagem para separar os dois péptidos.
Os péptidos e agonistas do receptor da guanilato-ciclase (GC-C) intestinal podem ser utilizados para tratar a obstipação ou a motilidade intestinal reduzida, a digestão lenta ou o esvaziamento lento do estômago. Os péptidos podem ser utilizados para aliviar um ou mais sintomas de SCI 28 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ (meteorismo, dor, obstipação), DRGE (refluxo ácido para o esófago), dispepsia funcional ou gastroparesia (náuseas, vómitos, meteorismo, atraso do esvaziamento gástrico) e outras desordens aqui descritas.
Os detalhes de uma ou mais concretizações da invenção estão apresentados na presente descrição.
FIGURAS A Figura la representa os resultados da análise LCMS de péptido MM-416776 e péptido MD-915 recombinantes.
As Figuras lb e c representam os resultados da análise LCMS de péptido MD-1100 sintético e do branco. A Figura 2 representa os resultados do ensaio à actividade do receptor GC-C intestinal de péptido MM-416776 sintético, péptido MD-915 e dois diferentes péptidos MD-1100. A Figura 3a representa o efeito de péptido MM-416776 recombinante e Zelnorm® num modelo murino do trânsito gastrointestinal. A Figura 3b representa o efeito de péptido MD-1100 sintético e Zelnorm® num modelo murino agudo de trânsito gastrointestinal. A Figura 3b representa o efeito de péptido MD-1100 sintético e Zelnorm® num modelo murino crónico de trânsito gastrointestinal.
As Figuras 4a e 4b representam o efeito de péptidos MD-915, MD-1100 e MM-416776 num modelo murino agudo de trânsito gastrointestinal. A Figura 4c representa o efeito de péptido MD-1100 num modelo murino crónico de trânsito gastrointestinal. A Figura 5a representa o efeito de péptido MM-416776 e Zelnorm® num modelo de secreção intestinal em ratinho lactente. 29 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ A Figura 5b representa os efeitos de péptido MD-1100 e Zelnorm® num modelo de secreção intestinal em ratinho.
As Figuras 6a e 6b representam os efeitos de péptidos MM-416776, MD-1100 e MD-915 num modelo de secreção intestinal em ratinho. A Figura 7 mostra os resultados de uma experiência em que a actividade de MD-1100 foi analisada no modelo de distensão colónica por TNBS.
As Figuras 8a e 8b mostram os efeitos de diferentes doses de MD-915 e MD-1100 no ensaio de torções por PBQ. A Figura 9 mostra os resultados da análise de determinação de Kd utilizando MD-1100 num ensaio de ligação competitiva de radioligandos.
As Figuras 10a e 10b mostram resultados de biodisponibilidade para MD-1100 administrado por via IV e oral como detectado por um ensaio ELISA e LCMS.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Os péptidos da presente divulgação incluindo os péptidos que estão de acordo com a invenção, ligam-se ao receptor intestinal guanilato-ciclase (GC-C), um regulador chave do balanço de fluidos e electrólitos no intestino. Quando estimulado, este receptor, que está localizado na membrana apical da superfície epitelial intestinal, provoca um aumento do GMP cíclico (GMPc) epitelial intestinal. Crê-se que este aumento de GMPc causa uma diminuição da absorção de água e sódio e um aumento da secreção de iões cloreto e potássio, conduzindo a alterações no fluido intestinal e no transporte de electrólitos e a motilidade intestinal aumentada. O receptor intestinal GC-C possui uma região de ligação ao ligando extracelular, uma região transmembranar, uma região semelhante a proteína-quinase intracelular e um domínio catalítico de ciclase. As funções propostas para o receptor GC-C são homeostasia de fluidos e electrólitos, a regulação da 30 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ proliferação de células epiteliais e a indução de apoptose (Shalubhai 2002 Curr Opin Drug Dis Devei 5:261-268).
Em adição a ser expresso no intestino por células epiteliais gastrointestinais, a GC-C é expressa em tecidos extra-intestinais incluindo rim, pulmão, pâncreas, pituitária, supra-renal, figado em desenvolvimento (revisto em Vaandrager 2002, Mol Cell Biochem 230:73-83) e tecidos reprodutivos de machos e fêmeas (revisto em Vaandrager 2002 Mol Cell Biochem 230:73-83)). Isto sugere que os agonistas do receptor GC-C podem ser utilizados no tratamento de desordens fora do tracto GI, por exemplo, insuficiência cardíaca congestiva e hiperplasia prostática benigna. A grelina, uma hormona peptídica segregada pelo estômago, é um regulador chave do apetite em seres humanos. Os níveis de expressão da grelina são regulados pelo jejum e pelo esvaziamento gástrico (Kim et ai., 2003, Neuroreprt 14:1317-20; Gualillo et ai., 2003, FEBS Letts 552: 105-9). Assim, aumentando a motilidade gastrointestinal, os agonistas do receptor GC-C podem também ser utilizados para regular a obesidade.
Em seres humanos, o receptor GC-C é activado por guanilina (Gn) (Patente U.S. 596097), uroguanilina (Ugn) (Patente U.S. 5140102) e linfoguanilina (Forte et ai., 1999, Endocrinology 140:1800-1806). É interessante que estes agentes são 10-100 vezes menos potentes do que uma classe de péptidos de origem bacteriana, denominados ST (revisto em Gianella 1995 J Lab Clin Med 125:173-181). Os péptidos ST são considerados super-agonistas de GC-C e são muito resistentes a degradação proteolítica. O péptido ST é capaz de estimular o sistema nervoso entérico (Rolfe et ai., 1994, J Physiolo 475: 531-537; Rolfe et ai., 1999, Gut 44: 615-619; Nzegwu et ai., 1996, Exp Physiol 81: 313-315). Também, foi relatado que o GMPc possui efeitos antinociceptivos em múltiplos modelos animais de dor (Lazaro Ibanez et al., 2001, Eur J Pharmacol 426: 39-44; Soares et al., 2001, British J Pharmacol 134: 127-131; Jain et ai., 2001, Brain Res 909:170-178; Amarante et ai., 2002, Eur J Pharmacol 454:19-23). Assim, os agonistas de GC-C podem ter efeito analgésico assim como anti-inflamatório. 31 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Em bactérias, os péptidos ST são derivados de uma pré-pró-proteina que geralmente possui pelo menos 70 aminoácidos. As regiões pré- e pró- são clivadas como parte do processo de secreção, e a proteína madura resultante, que geralmente inclui menos de 20 aminoácidos, é biologicamente activa.
Entre os péptidos ST bacterianos conhecidos encontram-se: ST Ib de E. coli (Moseley et al. (1983) Infect. Immun. 39:1167) possuindo a sequência de aminoácidos madura Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:_l); ST Ia de E. coli (So e McCarthy (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4011) possuindo a sequência de aminoácidos madura Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:2_) ST I* de E. coli (Chan e Giannella (1981) J. Biol. Chem. 256:7744) possuindo a sequência de aminoácidos madura Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn (SEQ ID NO:3_) péptido ST de C. freundii (Guarino et al. (1989) Infect.
Immun. 57:649) possuindo a sequência de aminoácidos madura Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:_4); péptidos ST de Y. enterocolitica, Y-ST(Y-STa), Y-STb, e Y-STc (revisto em Huang et al. (1997) Microb. Pathog. 22:89) possuindo as seguintes sequências de aminoácidos da forma pró-: Gin Ala Cys Asp Pro Pro Ser Pro Pro Ala Glu Vai Ser Ser Asp Trp Asp Cys Cys Asp Vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys (SEQ ID NO:_5) (assim como uma variante Ser-7 a Leu-7 de Y-STa (SEQ ID NO :124), (Takao et al. (1985)
Eur. J. Biochem. 152:199); Lys Ala Cys Asp Thr Gin Thr Pro Ser Pro Ser Glu Glu Asn Asp Asp Trp Cys Cys Glu Vai Cys Cys Asn
Pro Ala Cys Ala Gly Cys (SEQ ID NO:6); Gin Glu Thr Ala Ser Gly
Gin Vai Gly Asp Vai Ser Ser Ser Thr Ile Ala Thr Glu Vai Ser
Glu Ala Glu Cys Gly Thr Gin Ser Ala Thr Thr Gin Gly Glu Asn
Asp Trp Asp Trp Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Phe
Gly Cys (SEQ ID NO:7_), respectivamente; péptido ST de Y. kristensenii possuindo a sequência de aminoácidos madura Ser Asp Trp Cys Cys Glu Vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys (SEQ ID NO:8_); péptido ST non-01 de V. cholerae (Takao et al. (1985) FEBS lett. 193:250) possuindo a sequência de aminoácidos madura Ile Asp Cys Cys Glu Ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Phe Gly Cys Leu Asn (SEQ ID NO:9); e péptido ST de V. mimicus (Arita (1991) et al. FEMS Microbiol. Lett. 79:105) possuindo a sequência de aminoácidos madura Ile Asp Cys Cys 32 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Glu Ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Phe Gly Cys Leu Asn (SEQ ID NO:1_0). A Tabela adiante proporciona sequências da totalidade ou de uma porção de vários péptidos ST maduros.
Acesso GenBank® GI GenBank® Sequência QHECIB 69638 NSSNYCCELCCNPACTGCY (SEQ ID NO:1) P01559 123711 NTFYCCELCCNPACAGCY (SEQ ID NO:2) AAA24653 147878 NTFYCCELCCNPACAPCY (SEQ ID NO:11) P01560 123707 NTFYCCELCCYPACAGCN (SEQ ID NO:3) AAA27561 295439 IDCCEICCNPACFGCLN (SEQ ID NO:9) P04429 123712 IDCCEICCNPACFGCLN (SEQ ID NO:10) S34671 421286 IDCCEICCNPACF (SEQ ID NO:12) CAA522 0 9 395161 IDCCEICCNPACFG (SEQ ID NO:13) A54534 628844 IDCCEICCNPACFGCLN (SEQ ID NO:14) AAL02159 15592919 IDRCEICCNPACFGCLN (SEQ ID NO:15) AAA18472 487395 DWDCCDVCCNPACAGC (SEQ ID NO:16) S25659 282047 DWDCCDVCCNPACAGC (SEQ ID NO:17) P74977 3913874 NDDWCCEVCCNPACAGC (SEQ ID NO:18) BAA23656 2662339 WDWCCELCCNPACFGC (SEQ ID NO:19) P31518 399947 SDWCCEVCCNPACAGC (SEQ ID NO:8) A forma imatura (incluindo as regiões pré- e pró-) da proteina ST-1A (ST-P) de E. coli possui a sequência: mkklmlaif isvlsfpsfsqstesldsskekitletkkedvvknnsekksenmnntfyccelccnpacagc y (SEQ ID NO:2_0; veja-se n.° de Acesso GenBank® P01559 (gi:123711)) . A sequência pré- estende-se dos aa 1-19. A sequência pró- estende-se dos aa 20-54. A proteina madura estende-se de 55-72. A forma imatura (incluindo as regiões pré- e pró-) da proteina ST-1B (ST-H) de E. coli possui a sequência: mkksilfiflsvlsfspfaqdakpvesskekitleskkcniakksnksgpe smnssnyccelccnpactgcy (SEQ ID NO:2_l; veja-se n.° de Acesso GenBank® P07965 (gi:3915589)). A forma imatura (incluindo as regiões pré- e pró-) da proteina ST de Y. enterocolitica possui a sequência: mkkivfvlvlmlssfgafgqetvsgqfsdalstpitaevykq acdpplppaevssdwdccdvccnpacagc (SEQ ID NO:22; veja-se n.° de Acesso GenBank® S25659 (gi:282047). 33 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Os péptidos da presente divulgação, incluindo os péptidos de acordo com a invenção, tal como os péptidos ST bacterianos, possuem seis residuos Cys. Estes seis resíduos Cys formam três ligações dissulfureto na forma madura e activa do péptido. Se os seis resíduos Cys forem identificados, do terminal amino para o carboxi do péptido, como A, B, C, D, E, e F, então as ligações dissulfureto formam-se como se segue: A-D, B-E e C-F. Pensa-se que a formação destas ligações é importante para a ligação ao receptor GC-C. Determinados péptidos da presente divulgação incluem um local de clivagem para quimiotripsina potencialmente funcional, i.e., um Trp, Tyr ou Phe localizados entre Cys B e Cys D ou entre Cys E e Cys F. A clivagem num local de clivagem para quimiotripsina reduz ou elimina a capacidade do péptido se ligar ao receptor GC-C.
No corpo humano uma forma inactiva de quimiotripsina, o quimiotripsinogénio, é produzida no pâncreas. Quando esta enzima inactiva atinge o intestino delgado é convertida na quimiotripsina activa pela excisão de dois dipéptidos. A quimiotripsina activa pode potencialmente clivar péptidos na ligação peptídica do lado carboxi-terminal de Trp, Tyr ou Phe. A presença de quimiotripsina activa no tracto intestinal pode potencialmente conduzir a clivagem de certos dos péptidos da invenção possuindo um local de clivagem para quimiotripsina funcional apropriadamente posicionado. É de esperar que a clivagem pela quimiotripsina vá moderar a acção de um péptido da divulgação possuindo um local de clivagem para quimiotripsina apropriadamente posicionado à medida que o péptido passa através do tracto intestinal. 0 tripsinogénio, tal como a quimiotripsina, é uma serina-protease que é produzida no pâncreas e está presente no tracto digestivo. A forma activa, a tripsina, irá clivar péptidos possuindo uma Lys ou Arg. A presença de tripsina activa no tracto intestinal pode conduzir a clivagem de certos dos péptidos da presente divulgação possuindo um local de clivagem para tripsina funcional apropriadamente posicionado. É de esperar que a clivagem pela quimiotripsina vá moderar a acção de um péptido da divulgação possuindo um local de clivagem para tripsina apropriadamente posicionado à medida que o péptido passa através do tracto intestinal. 34 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Muitas desordens gastrointestinais, incluindo SCI, estão associadas a dor abdominal ou visceral. Certos dos péptidos da presente divulgação incluem marcadores analgésicos ou antinociceptivos tais como a seguência carboxi-terminal AspPhe imediatamente após Trp, Tyr ou Phe, que cria um local de clivagem para quimiotripsina funcional, ou após Lys ou Arg, que cria um local de clivagem para tripsina funcional. A quimiotripsina no tracto intestinal pode potencialmente clivar estes péptidos imediatamente carboxi-terminais ao residuo Trp, Phe ou Tyr, libertando o dipéptido, AspPhe. Mostrou-se que este dipéptido possui actividade analgésica em modelos animais (Abdikkahi et al. 2001, Fundam Clin Pharmacol 15:117-23;
Nikfar et al 1997, 29:583-6; Edmundson et al 1998, Clin Pharmacol Ther 63:580-93). Desta maneira, estes péptidos podem tratar tanto a dor como a inflamação. Outros péptidos analgésicos podem estar presentes no terminal carboxi do péptido (após um local de clivagem funcional) incluindo: endomorfina-1, endomorfina-2, nocistatina, dalargina, lupron e substância P. Vários dos péptidos úteis são baseados na suquência nuclear: Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:29) . Para criar uma variante possuindo um local de clivagem para quimiotripsina potencialmente funcional capaz de inactivar o péptido, a Leu (sublinhada) ou a Thr (sublinhada) pode ser substituída por Trp, Phe ou Tyr ou ambas a Leu e a Thr podem ser substituídas por (independentemente) Trp, Phe ou Tyr. Para criar uma variante possuindo um dipéptido analgésico, a sequência nuclear é seguida por Asp Phe. A Tyr carboxi-terminal na sequência nuclear pode permitir que o dipéptido Asp Phe seja libertado pela quimiotripsina no tracto digestivo. A sequência nuclear pode opcionalmente ser precedida por Asn Ser Ser Asn Tyr (SEQ ID NO: 123) ou Asn.
Assim, as variantes úteis baseadas na sequência nuclear incluem:
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:26; MM-416776)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:-27)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:-28; MD-915) 35 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:2S >; MM4167’ 74) Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:3C Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:31 MD '-110i 0) Asn Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:32) Asn Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr (SEQ ID ] NO:33) Asn Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:- 34) Asn Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:35) Asn Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: - 36) Asn Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:37) Asn Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID ΝΟ:38)
Aso Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ DD NO: 5¾)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ DD NO:<*o)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:41)
Asn Ser Ser Asn l^r Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ED NO: Vi) 36 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tip Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys TyrAsp Phe (SEQ EDNO:l£)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys TyrAsp Phe (SEQIDNO:<4)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys TyrAsp Phe (SEQ JDNOr/jX)
Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 46) Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:47) Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:48) Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 4 9) Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 50 Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ DO NO:51) Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:52) Asn Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:53) Asn Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:54) Asn Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:55) Asn Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:56) Asn Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:57) Asn Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:58) 37 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Asn Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO:59)
Em alguns casos, os péptidos da presente divulgação são produzidos na forma de uma pré-pró-proteína que inclui a sequência de comando amino-terminal: mkksilfiflsvlsfspfaqdakpv esskekitleskkcniakksnksgpesmn (SEQ ID NO:23). Quando o péptido é produzido por uma célula bacteriana, e.g., E. coli, a anterior sequência de comando será clivada e o péptido maduro será eficientemente segregado da célula bacteriana. A Patente U.S. 5395490 descreve vectores, sistemas de expressão e métodos para a eficiente produção de péptidos ST em célula bacterianas e métodos para se conseguir a eficiente secreção de péptidos ST maduros. Os vectores, sistemas de expressão e métodos descritos na Patente U.S. 5395490 podem ser utilizados para produzir os péptidos ST e péptidos ST variantes da presente divulgação. Péptidos Variantes A presente disclosure divulgação inclui ainda péptidos variantes que podem incluir uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez (em alguns casos menos de 5 ou menos de 3 ou 2 ou menos) substituições de aminoácidos comparativamente com péptidos específicos aqui divulgados. A (s) substituição (ões) podem ser conservativas ou não conservativas. Os aminoácidos de ocorrência natural podem ser substituídos por isómeros D de qualquer aminoácido, aminoácidos não naturais, e outros grupos. Uma substituição de aminoácidos conservativa resulta na alteração de um aminoácido por um aminoácido de actuação similar, ou aminoácido com a mesma carga, polaridade ou hidrofobicidade. Em algumas posições, mesmo substituições de aminoácidos conservativas podem reduzir a actividade do péptido. Entre as substituições de aminoácidos de ocorrência natural genericamente consideradas conservativas encontram-se: 38 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Para ο Aminoácido Código Substituir por qualquer de
Alanina Ala Gly, Cys, Ser Arginina Arg Lys, His Asparagina Asn Asp, Glu, Gin Ácido Aspártico Asp Asn, Glu, Gin Cisterna Cys Met, Thr, Ser Glutamina Gin Asn, Glu, Asp Ácido Glutâmico Glu Asp, Asn, Gin Glicina Gly Ala Histidina His Lys, Arg Isoleucina Ile Vai, Leu, Met Leucina Leu Vai, Ile, Met Lisina Lys Arg, His Metionina Met Ile, Leu, Vai Fenilalanina Phe Tyr, His, Trp Prolina Pro Serina Ser Thr, Cys, Ala Treonina Thr Ser, Met, Vai Triptofano Trp Phe, Tyr Tirosina Tyr Phe, His Valina Vai Leu, Ile, Met
Em algumas circunstâncias pode ser desejável tratar pacientes com um péptido variante que se liga a, e activa, o receptor de GC-C intestinal, mas é menos activo do que a forma não variante do péptido. Esta reduzida actividade pode surgir da reduzida afinidade para com o receptor ou a uma reduzida capacidade para activar o receptor depois de ligado ou reduzida estabilidade do péptido.
Em alguns péptidos, nos pares de residuos Cys que normalmente formam uma ponte de dissulfureto, um ou ambos os membros do par podem ser substituídos por homocisteina, 3-mercaptoprolina (Kolodziej et al. 1996 Int J Pept Protein Res 48:274); β,β-dimetilcisteina (Hunt et al. 1993 Int J Pept 39 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Protein Res 42:249) ou ácido diaminopropiónico (Smith et al. 1978 J Med Chem 21:117) para formar reticulações internas alternativas nas posições das ligações dissulfureto normais.
Produção de péptidos
Os péptidos úteis podem ser produzidos quer em bactérias incluindo, sem limitação, E. coli, quer em outros sistemas existentes para a produção de péptidos ou proteínas (e.g., Bacillus subtilis, sistemas de expressão de baculovírus utilizando células de Drosophila Sf9, sistemas de expressão de levedura ou fungos filamentosos, sistemas de expressão de células de mamífero), ou podem ser quimicamente sintetizados.
Quando se pretende produzir o péptido ou o péptido variante em bactérias, e.g., E. coli, a molécula de ácido nucleico que codifica o péptido irá preferivelmente também codificar uma sequência de comando que permite a secreção do péptido maduro pela célula. Assim, a sequência que codifica o péptido pode incluir a sequência pré- e a sequência pró- de, por exemplo, um péptido ST bacteriano de ocorrência natural. 0 péptido maduro segregado pode ser purificado a partir do meio de cultura. A sequência que codifica um péptido da presente divulgação, e.g., que codifica um péptido de acordo com a invenção é preferivelmente inserida num vector capaz de entregar e manter a molécula de ácido nucleico numa célula bacteriana. A molécula de ADN pode ser inserida num vector de replicação autónoma (os vectores adequados incluem, por exemplo, pGEM3Z e pcDNA3, e seus derivados). 0 ácido nucleico do vector pode ser um ADN bacteriano ou bacteriofágico tal como de bacteriófago lambda ou M13 e seus derivados. A construção de um vector contendo um ácido nucleico aqui descrito pode ser seguida por transformação de uma célula hospedeira tal como uma bactéria. Os hospedeiros bacterianos adequados incluem, mas não se lhes limitam, E. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Salmonella. A construção genética também inclui, em adição à molécula de ácido nucleico codificante, elementos que permitem a expressão, tais como um promotor e sequências reguladoras. Os vectores de expressão podem conter sequências de controlo da transcrição que 40 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ controlam a iniciação da transcrição, tais como sequências promotoras, potenciadoras, operadoras e repressoras. Uma variedade de sequências de controlo da transcrição são bem conhecidas dos peritos na especialidade. O vector de expressão pode também incluir uma sequência reguladora da tradução (e.g., uma sequência não traduzida a 5', uma sequência não traduzida a 3' ou um local de entrada no ribossoma interno). O vector pode ser capaz de replicação autónoma ou pode integrar-se no ADN do hospedeiro para assegurar a estabilidade durante a produção do péptido. A sequência de codificação da proteina que inclui um péptido da presente divulgação, e.g., um péptido de acordo com a invenção, pode também ser fundida com um ácido nucleico que codifica um marcador de afinidade polipeptidico, e.g., glutationa-S-transferase (GST), proteina de ligação a maltose E, proteina A, marcador FLAG, hexa-histidina, marcador myc ou o marcador HA de influenza, de modo a facilitar a purificação. O marcador de afinidade ou fusão repórter une o quadro de leitura do péptido de interesse ao quadro de leitura do ácido nucleico que codifica o marcador de afinidade de modo a gerar uma fusão de tradução. A expressão do gene de fusão resulta na tradução de um único polipéptido que inclui tanto o péptido de interesse como o marcador de afinidade. Em alguns casos em que os marcadores de afinidade são utilizados, uma sequência de ADN que codifica um local de reconhecimento para protease será fundida entre os quadros de leitura para o marcador de afinidade e o péptido de interesse.
As construções genéticas e métodos adequados para a produção de formas imaturas e maduras dos péptidos e variantes da presente divulgação, e.g., dos péptidos de acordo com a invenção, em sistemas de expressão de proteínas que não bactérias, e bem conhecidos dos peritos na especialidade, podem também ser utilizados para produzir péptidos num sistema biológico.
Os péptido maduros e suas variantes podem ser sintetizados pelo método em fase sólida utilizando um sintetizador automático de péptidos. Por exemplo, o péptido pode ser sintetizado sobre resina Cyc (4-CH2Bxl) -OCH2-4-(oximetil)fenilacetamidometilo utilizando um programa de 41 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ acoplamento duplo. Têm que ser utilizados apropriadamente grupos protectores para criar o padrão correcto de ligações dissulfureto. Por exemplo, podem utilizar-se os seguintes grupos protectores: t-butiloxicarbonilo (grupos alfa-amino); acetamidometilo (grupos tiol de resíduos Cys B e E) ; 4-metilbenzilo (grupos tiol de resíduos Cys C e F) ; benzilo (y-carboxilo de ácido glutâmico e o grupo hidroxilo da treonina, se presente); e bromobenzilo (grupo fenólico da tirosina, se presente). 0 acoplamento é realizado com anidrido simétrico de t-butoxilcarbonilaminoácidos ou éster hidroxibenzotriazole (para resíduos de asparagina ou glutamina), e o péptido é desprotegido e clivado do suporte sólido em fluoreto de hidrogénio, dimetilsulfureto, anisole, e p-tiocresol utilizando uma razão 8/1/1/0,5 (v/v/v/p) a 0°C durante 60 min. Após remoção do fluoreto de hidrogénio e do dimetilsulfureto por pressão reduzida e do anisole e do p-tiocresol por extracção com éter etílico e acetato de etilo, sequencialmente, extraem-se os péptidos em bruto com uma mistura de tampão de fosfato de sódio 0,5 M, pH 8,0 e N,N-dimetilformamida utilizando uma razão 1/1, v/v. A ligação dissulfureto para resíduos Cys B e E é formada utilizando dimetilsulfóxido (Tarn et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6657-62). O péptido resultante é purificado por cromatografia de fase inversa. A ligação dissulfureto entre resíduos Cys C e F é formada dissolvendo primeiro o péptido em ácido acético a 50% em água. Adiciona-se solução de iodo saturada em ácido acético glacial (1 ml de solução de iodo por 100 ml de solução). Após incubação à temperatura ambiente durante 2 dias num recipiente de vidro fechado, a solução é diluída de cinco vezes com água desionizada e extractada com éter etílico quatro vezes para remoção de iodo que não reagiu. Após a remoção da quantidade residual de éter etílico por evaporação rotativa, a solução de produto em bruto é liofilizada e purificada por sucessiva cromatografia de fase inversa.
Ensaio de ligação ao receptor GC-C intestinal A capacidade de péptidos e outros agentes se ligarem ao receptor GC-C intestinal pode ser testada como se segue. Células da linha celular de carcinoma do cólon humano T84 (American Type Culture Collection (Bethesda, Md.)) são crescidas até à confluência em placas de cultura de 24 poços 42 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ com uma mistura 1:1 de meio F12 de Ham e meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado com soro fetal de vitelo a 5%. As células utilizadas no ensaio são tipicamente de entre as passagens 54-60. Sucintamente, monocamadas de células T84 em placas de 24 poços foram lavadas duas vezes com 1 ml de tampão de ligação (DMEM contendo 0,05% de albumina sérica bovina e HEPES 25 mM, pH 7,2), e depois incubadas durante 30 min a 37°C na presença de péptido ST de E. coli maduro marcado radioactivamente e o material de teste em várias concentrações. As células são então lavadas quatro vezes com 1 ml de DMEM e solubilizadas com 0,5 ml/poço de NaOH IN. O nivel de radioactividade no material solubilizado é então determinado utilizando métodos Standard.
Exemplo 1: Preparação de péptidos ST variantes e péptido ST do tipo selvagem la: Preparação de péptidos ST variantes recombinantes e péptido ST do tipo selvagem
Um péptido ST variante, referido como MD-915, foi reproduzido recombinantemente e testado num modelo animal. O MD-915 possui a sequência: Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:28) . Foi também criado um péptido possuindo a sequência do péptido ST do tipo selvagem (MM-416776).
Os péptidos MD-915 e MM-416776 foram produzidos na forma de pré-pró-proteínas utilizando vectores produzidos como se segue. Uma sequência que codifica uma sequência pré-pró da enterotoxina estável ao calor foi amplificada a partir de pGK51/pGSK51 (ATCC 67728) utilizando o oligonucleótido M03514 (5'CACACCATATGAAGAAATCAATATTATTTATTTTTCTTTCTG3' (SEQ IDNO:60)) e o oligonucleótido M03515 (5'CACACCTCGAGTTAGGTCTCCATGCTTTCAGG ACCACTTTTATTAC3' (SEQ ID NO:61)). O fragmento produto da amplificação foi digerido com Ndel/Xhol e ligado ao vector de expressão de T7, pET26b(+) (Novagen) digerido com Ndel/Xhol, criando deste modo o plasmídeo MB3976. A região que codifica a pré-pró-proteína foi sequenciada e verificou-se que codificava a sequência de aminoácidos: mkksilfiflsvlsfspfaqdakpagsskekitl eskkcnivkksnkscjpesm (SEQ ID NO:2_4) que difere da sequência de aminoácidos do precursor a2 da enterotoxina estável ao calor (sta2; mkksilfiflsvlsfspfaqdakpagsskekitleskkcnivkknnesspesm 43 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ (SEQ ID NO:25); Ν.° de Acesso GenBank® Q47185, GI: 3913876) em três posições (indicadas com sublinhado e negrito) próximo do terminal C. Para criar vectores de expressão com a sequência pré-pró-, hibridaram-se oligos complementares que codificam cada variante do péptido ST ou o péptido ST do tipo selvagem e clonaram-se no vector de expressão MB3976. Para criar MB3984 (que codifica o péptido ST do tipo selvagem de comprimento completo, péptido MM-416776, na forma de uma pré-pró-proteina), contendo a sequência de aminoácidos, NSSNYCCELCCNPACTGCY (SEQ ID NO:26) fundida a jusante da sequência pré-pró-, digeriu-se MB 3976 com Bsal/Xhol e ligou-se aos oligos hibridados M03621 (5'GCATGAATAGTAGCAATTACTGCTGTGAATTGTGTTGTAATCCTGCTTGTACCGGGTGC TATTAATAAC3' (SEQ ID NO:62) e M03622 (5'TCGAGTTATTAATAGCACCCGGTA CAAGCAGGATTACAACACAATTCACAGCAGTAATTGCTACTATTC3' (SEQ ID NO: 63)). Para criar MB3985 (que codifica MD-915 na forma de uma pré-pró-proteína) contendo a sequência de aminoácidos seguinte, NSSNYCCEYCCNPACTGCY (SEQ ID NO:28) fundida a jusante da sequência pré-pró-, digeriu-se MB 3976 com Bsal/Xhol e ligou-se aos oligos hibridados M03529 (5'GCATGAATAGTAGCAATTACTGCTGTGAATATTGTTGTAATCCTGCTTGTACCGGGTGC TATTAATAAC3' (SEQ ID NO:64) ) e MO3530 (5'TCGAGTTATTAATAGCACCCGGT ACAAGCAGGATTACAACAATATTCACAGCAGTAATTGCTACTATTC3' (SEQ ID NO:65) . 0 péptido MD-915 e o péptido MM-416776 foram produzidos como se segue. Os vectores de expressão foram transformados no hospedeiro bacteriano E. coli BL21 λ, DE3 (Invitrogen). Inoculou-se uma única colónia e cresceu-se com agitação durante a noite a 30°C em caldo L + 25 mg/1 de canamicina. A cultura da noite foi adicionada a 3,2 L de lote de meio (Glucose a 25 g/1, Caseaminoácidos a 5 g/1, Extracto de
Levedura a 5 g/1, KH2PO4 a 13,3 g/1, (ΝΗ4)2ΗΡ04 a 4 g/1, MgS04- 7H20 a 1,2 g/1, Ácido Cítrico a 1,7 g/1, EDTA a 8,4 mg/1, CoCl2-6H20 a 2,5 mg/1, MnCl2-4H20 a 15 mg/1, CuCl2-4H20 a 1,5 mg/1, H3BO3 a 3 mg/1, Na2Mo04-2H20 a 2,5 mg/1, Acetato de
Zn-2H20 a 13 mg/1, Citrato Férrico a 100 mg/1, Canamicina a 25 mg/1, Antiespuma DF 204 a 1 ml/1) e fermentou-se utilizando os seguintes parâmetros de processo: pH 6,7 - controlo apenas com base (NH4OH a 28%), 30°C, arejamento: 5 litros por minuto. Após o consumo da glucose do lote inicial (baseado na monitoração dos níveis de oxigénio dissolvido (OD)), 1,5 ( de meio de alimentação (Glucose a 700 g/1, Caseaminoácidos a 44 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 10 g/1, Extracto de levedura a 10 g/1, MgS04-7H20 a 4 g/1, EDTA a 13 mg/1, C0CI2-6H2O a 4 mg/1, MnCl2-4H20 a 23,5 mg/1, CuC12-4H20 a 2,5 mg/1, H3BO3 a 5 mg/1, Na2Mo04-2H20 a 4 mg/1,
Acetato de Zn-2H20 a 16 mg/1, Citrato Férrico a 40 mg/1,
Antiespuma DF 204 a 1 ml/1) adicionou-se a uma taxa de alimentação controlada para manter 20% de OD. Adicionou-se IPTG a 0,2 mM 2 horas após o inicio da alimentação. O tempo total de operação foi de aproximadamente 40-45 horas (até ao esgotamento da alimentação).
Recolheram-se as células por centrifugação a 5000 g durante 10 minutos. Rejeitou-se a pelete celular e passou-se o sobrenadante através de uma unidade de ultrafiltração de 50 Kd. O filtrado de 50 Kd (0,6 litros) foi carregado numa coluna Fast Flow de Q-Sepharose de 110 ml (Amersham Pharmacia, equilibrada com Tris-HCl 20 mM, pH 7,5) a um caudal de 400 ml/hora. Lavou-se a coluna com seis volumes de Tris-HCl 20 mM, pH 7,5 e eluíram-se as proteínas com ácido acético 50 mM recolhendo fracções de 50 ml. Reuniram-se as fracções contendo a variante de péptido ST ou péptido ST do tipo selvagem e removeu-se o solvente por evaporação rotativa. Ressuspenderam-se as proteínas secas em 10 ml de ácido acético a 8%, ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% e carregaram-se numa coluna Varian Polaris C18-A (250 X 21,2 mm 10 ym, equilibrada com o mesmo tampão) a um caudal de 20 ml/min. Lavou-se a coluna com 100 ml de metanol a 8%, TFA a 0,1% e desenvolveu-se com um gradiente (300 ml) de 24 a 48% de metanol, TFA a 0,1%, recolhendo fracções de 5 ml. Reuniram-se as fracções contendo péptido e removeu-se o solvente por evaporação rotativa. Dissolveram-se os péptidos em TFA a 0,1% e liofilizaram-se.
Analisaram-se as fracções do péptido MD-915 e do péptido MM-416776 por LCMS e HPLC Standard. A análise LCMS revelou que o péptido MD-915 é mais homogéneo do que MM-416776 (veja-se a Figura la; note-se que o péptido MD-915 exibe menos picos (Painel B) do que o péptido MM-416776 (Painel A)). lb: Preparação de péptidos ST de variantes sintéticos e péptido ST do tipo selvagem
Os péptidos foram sintetizados quimicamente por uma firma comercial de síntese de péptidos. Obtiveram-se vários rendimentos de péptidos dependendo da eficiência da síntese 45 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ química. Assim, os quatro péptidos, por ordem decrescente de rendimento eram: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID N0:31; MD-1100), rendimento de 10-20%; Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:29; MM-416774); Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:28; MD-915) ; Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (; MM-416776), rendimento <5%. Assim, as alterações específicas de aminoácidos introduzidas nos péptidos podem criar propriedades de fabrico melhoradas. A Figura lb mostra o perfil total obtido em cromatógrafo iónico de MD-1100 fabricado sinteticamente. A Figura lc mostra o perfil total obtido em cromatógrafo iónico da amostra de branco de controlo. Há um pico principal presente na amostra de MD-1100 que não está também presente na amostra de controlo. A análise quantitativa sugere que MD-1100 é >98% puro.
Exemplo 2: Activação do receptor GC-C intestinal por vim péptido ST variante e pelo péptido ST A capacidade de MD-915, MM-416776 E MD-1100 activarem o receptor GC-C intestinal foi avaliada num ensaio que emprega a linha celular de carcinoma do cólon humano T84 (American Type Culture Collection (Bethesda, Md.)). Para os ensaios, cresceram-se as células até à confluência em placas de cultura de 24 poços com uma mistura 1:1 de meio F12 de Ham e Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado com 5% de soro fetal de vitelo e utilizaram-se entre as passagens 54 e 60.
Sucintamente, lavaram-se monocamadas de células T84 em placas de 24 poços, duas vezes, com 1 ml/poço de DMEM, depois incubaram-se a 37°C durante 10 min com 0,45 ml de DMEM contendo isobutilmetilxantina (IBMX) 1 mM, um inibidor de fosfodiesterase para nucleótidos cíclicos. Adicionaram-se então os péptidos de teste (50 μΐ) e incubaram-se durante 30 minutos a 37°C. Aspiraram-se os meios e terminou-se depois a reacção por adição de 0,5 ml de HCl 0,1N gelado. Mantiveram-se as amostras em gelo durante 20 minutos e depois evaporaram-se até à secura utilizando um canhão de calor ou centrifugação sob vácuo. Suspenderam-se as amostras secas em 0,5 ml de 46 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ tampão de fosfato fornecido no kit de EIA para GMP cíclico da Cayman Chemical (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) . Mediu-se o GMP cíclico por EIA de acordo com os procedimentos delineados no kit de EIA para GMP cíclico da Cayman Chemical. A Figura 2 mostra a actividade de variantes peptídicas sintetizadas quimicamente neste ensaio à actividade do receptor GC-C. Neste ensaio, MM-416776 e dois péptidos MD-1100 diferentes (MD-1100 (a) e MD-1100 (b) , sintetizados por dois métodos diferentes) tinham actividade comparável A MM-416776. Os péptidos MD-915 E MM-416776 foram sintetizados quimicamente de uma maneira idêntica à de MD-1100 (b).
Exemplo 3: MD-915 e MM-416776 aumentam o trânsito intestinal em ratinhos
De modo a determinar se os péptidos aumentam a taxa de trânsito gastrointestinal, testaram-se os péptidos e controlos utilizando um ensaio ao trânsito gastrointestinal (TGI) murino (Moon et al. Infection and Immunity 25:127, 1979). Neste ensaio, carvão activado, que pode ser facilmente visualizado no tracto gastrointestinal é administrado a ratinhos após a administração de um composto de teste. A distância percorrida pelo carvão activado é medida e expressa em percentagem do comprimento total do cólon.
Os ratinhos foram mantidos em jejum com livre acesso a água durante 12 a 16 horas antes do tratamento com péptido ou tampão de controlo. Os péptidos foram administrados oralmente a lyg/kg - lmg/kg de péptido em tampão (Tris 20mM, pH 7,5) 7 minutos antes de lhes ser dada uma dose oral de carvão activado a 5% (Aldrich 242276-250G). Aos ratinhos de controlo administrou-se apenas tampão antes de uma dose de carvão activado. Após 15 minutos, sacrificaram-se os ratinhos e dissecaram-se os intestinos do estômago até ao cego. Mediram-se o comprimento total do intestino assim como a distância percorrida do estômago até à frente de carvão activado para cada animal e expressaram-se os resultados como percentagem do comprimento total do intestino percorrido pela frente de carvão activado. Todos os resultados foram registados como a média de 10 ratinhos ± desvio padrão. Fez-se uma comparação da distância percorrida pelo carvão activado 47 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ entre os ratinhos tratados com péptido versus os ratinhos tratados com apenas veiculo utilizando um teste t de Student e considerou-se uma diferença estatisticamente significativa para P<0,05. Os valores P são calculados utilizando um teste t bilateral assumindo variâncias desiguais.
Como se pode observar na Figura 3a, b, o péptido ST do tipo selvagem (MM-416776; Sigma-Aldrich, St Louis, MO; 0,1 mg/kg), MD-1100 fabricado sinteticamente e Zelnorm® (0,1 mg/kg), um fármaco aprovado para SCI que é um agonista para o receptor de serotonina 5HT4, aumentam a taxa de trânsito gastrointestinal neste modelo. A Figura 4a mostra o resultado de um estudo que demonstra que a taxa de trânsito intestinal aumenta com um aumento da dosagem quer de MM-416776 sintetizado recombinantemente quer de MD-915. A Figura 4b mostra os resultados de um estudo que demonstra que ambos os péptidos MM-416776 sintetizado quimicamente ou MD-1100 aumentam as taxas de trânsito intestinal mais do que apenas tampão Tris ou uma dose equivalente de Zelnorm®.
Uma experiência idêntica foi realizada para determinar se MD-1100 é eficaz num regime de tratamento de dosagem crónica. Sucintamente, ratinhos fêmea CD1 de 8 semanas de idade recebem doses orais uma vez por dia durante 5 dias de MD-1100 (0,06 mg/kg ou 0,25 mg/kg em Tris 20 mM, pH 7,5) ou apenas veiculo (Tris 20 mM, pH 7,5). No 5.° dia, realizou-se um ensaio ao TGI, idêntico ao anterior excepto administrando 200 μΐ de uma solução de carvão activado a 10%. A Figura 4c mostra os resultados de um estudo que demonstra que tanto o MD-1100 quimicamente sintetizado como o Zelnorm® são eficazes num ensaio de motilidade gastrointestinal no ratinho após dosagem crónica (diária durante 5 dias). Os resultados estão apresentados lado a lado com a dosagem aguda (1 dia).
Exemplo 4: O péptido MD-915 e péptido MM-416776 aumentam a secreção intestinal em ratinhos lactentes (ensaio SuMi)
Testaram-se o MM-416776 e o MD-915 quanto à sua capacidade para aumentar a secreção intestinal utilizando um modelo de secreção intestinal em ratinho lactente. Neste modelo administra-se um composto de teste a ratinhos lactentes que têm entre 7 e 9 dias de idade. Depois dos ratinhos 48 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ sacrificados, dissecou-se ο tracto gastrointestinal do estômago até ao ceco ("intestinos"). Os restos ("carcassa") assim como os intestinos foram pesados e calculou-se a razão de intestinos para carcassa. Se a razão for superior a 0,09, pode-se concluir que o composto de teste aumenta a secreção intestinal. A Figura 5a mostra uma curva de resposta à dose para o péptido ST do tipo selvagem (MM-416776) neste modelo. A Figura 5b mostra a curva de resposta à dose para o péptido MD-1100 neste modelo. Estes resultados mostram que o péptido ST do tipo selvagem (adquirido a TDT, Inc. West Chester, PA) e o péptido MD-1100 aumentam a secreção intestinal. O efeito de Zelnorm® também foi estudado. Como se pode observar da Figura 5, o Zelnorm® a 0,2 mg/kg não aumenta a secreção intestinal neste modelo. A Figura 6a mostra uma curva de resposta à dose para o péptido MM-416776 recombinante descrito acima e o péptido MD-915 recombinante descrito atrás. Como se pode observar da Figura 6a, ambos os péptidos aumentam a secreção intestinal neste modelo. Similarmente, a Figura 6b mostra uma curva de resposta à dose para os péptidos MD-915, MD-1100 e MM-416776 quimicamente sintetizados assim como para o péptido ST do tipo selvagem (adquirido a Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
Hiperalgesia colónica em modelos animais A hipersensibilidade à distensão colorrectal é comum em pacientes com SCI e pode ser responsável pelo sintoma principal de dor. Desenvolveram-se modelos animais, inflamatórios e não inflamatórios, de hiperalgesia visceral à distensão, para investigar o efeito de compostos sobre a dor visceral em SCI. I. Modelo de alodínia rectal induzida por ácido trinitrobenzenossulfónico (TNBS)
Ratos Wistar machos (220-250 g) foram pré-medicados com 0,5 mg/kg de acepromazina injectada intraperitonealmente (IP) e anestesiados por administração intramuscular de 100 mg/kg de cetamina. Implantaram-se pares de eléctrodos de arame de cromoniquel (60 cm de comprimento e 80 ym de diâmetro) no músculo estriado do abdómen, lateralmente a 2 cm da linha branca. Exteriorizaram-se as pontas livres dos eléctrodos na 49 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ parte detrás do pescoço e protegeram-se com um tubo de plástico fixado na pele. Iniciaram-se os registos electromiográficos (EMG) 5 dias após a cirurgia. Registou-se a actividade eléctrica do músculo estriado abdominal com uma máquina electroencefalográfica (Mini VIII, Alvar, Paris, França) utilizando uma constante de tempo curto (0,03 s) para remover os sinais de baixa frequência (<3 Hz).
Dez dias após a implantação cirúrgica, administrou-se ácido trinitrobenzenossulfónico (TNBS) para induzir a inflamação rectal. Administrou-se TNBS (80 mg kg-1 em 0,3 ml etanol a 50%) intra-rectalmente através de um cateter de borracha de silicone introduzido a 3 cm do ânus sob anestesia leve com éter dietilico, como descrito (Morteau et al. 1994 Dig Dis Sei 39:1239). Após a administração de TNBS, colocaram-se os ratos em túneis de plástico, onde ficaram severamente limitados em mobilidade durante vários dias antes da distensão colorrectal (DCR). Administrou-se o composto experimental uma hora antes da DCR que foi realizada por inserção no recto, a 1 cm do ânus, de um balão longo de 4 cm feito de um preservativo de látex (Gue et al., 1997 Neurogastroenterol. Motil. 9:271). O balão foi fixado sobre um cateter rígido tomado de uma sonda de embolectomia (Fogarty). O balão fixado no cateter foi fixado na base da cauda. O balão, ligado a um baróstato, foi inflado progressivamente por passos de 15 mmHg, desde 0 até 60 mmHg, durando cada passo de inflação 5 min. A avaliação da sensibilidade rectal, medida por EMG, foi realizada antes (1-2 dias) e 3 dias depois da instilação rectal de TNBS. O número de surtos de potenciais que correspondem a contracções abdominais foi determinado por períodos de 5 min. A análise estatística do número de contracções abdominais e da avaliação das relações de efeitos das doses foi realizada com uma análise de variância de uma via (ANOVA) seguida de um post-hoc (testes de Student ou Dunnett) e análise de regressão para ED50 se apropriado. A Figura 7 mostra os resultados da experiência em que a actividade de MD-1100 foi analisada no modelo colorrectal com TNBS. Observaram-se diminuições significativas na resposta abdominal com 0,3 yg/kg e 3 yg/kg de MD-1100. Estes resultados 50 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ demonstram que MD-1100 reduz a dor associada à distensão colorrectal neste modelo animal. II. Modelo de hiperalgesia induzida por stress
Implantaram-se em ratos Wistar machos (200-250 g), cirurgicamente, eléctrodos de arame de cromoniquel como no modelo com TNBS. Dez dias após a implantação cirúrgica, aplica-se stress por constrangimento parcial (PRS - Partial Restraint Stress), como descrito por Williams et al. durante duas horas (Williams et al. 1988 Gastroenterology 64:611).
Sucintamente, sob anestesia leve com éter etilico, ligaram-se os ombros, os membros dianteiros superiores e o tronco torácico com uma firmeza de constrangimento com fita de papel para os constranger, mas sem impedir os movimentos corporais. Anestesiaram-se animais de controlo submetidos a stress simulado mas não constrangidos. Trinta minutos antes do final da sessão de PRS, administrou-se aos animais o composto de teste ou o veiculo. Trinta minutos a uma hora depois de completado o PRS, realizou-se o procedimento de distensão DCR como descrito atrás para o modelo com TNBS com o baróstato a pressões de 15, 30, 45 e 60 mm Hg. A análise estatística do número de surtos é determinada e analisada como no modelo com TNBS anterior.
Modelo de torções induzidas por fenilbenzoquinona O modelo de torções induzidas por PBQ pode ser utilizado para avaliar a actividade de controlo da dor dos péptidos e agonistas da presente divulgação, e.g., dos péptidod de acordo com a invenção. Este modelo é descrito por Siegmund et al. (1957 Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 95:729-731). Sucintamente, uma hora após doses orais de um composto de teste, e.g., um péptido, morfina ou veiculo, injectou-se solução de fenilbenzoquinona (PBQ) a 0,02% (12,5 mL/kg) por via intraperitoneal no ratinho. Os números de distensões e torções são registados desde o 5.° ao 10.° minuto após a injecção de PBQ, e podem também ser contados entre o 35.° e o 40.° minuto e entre o 60.° e o 65.° minuto para proporcionar uma avaliação cinética. Os resultados são expressos como o número de distensões e torções (média ± SEM) e a percentagem de variação do limiar nociceptivo é calculada a partir do valor médio do 51 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ grupo tratado com veículo. A significância estatística de guaisguer diferenças entre os grupos tratados e o grupo de controlo é determinada por um teste de Dunnett utilizando a variância residual após análise de variância de uma via (P <0,05) utilizando o Software SigmaStat.
As Figuras 8a e 8b mostram o efeito de diferentes doses de MD-915 e MD-1100 no ensaio de torções com PBQ. Utilizou-se indometacina, um ΑΙΝΕ (fármaco anti-inflamatório não esteróide) com actividade de controlo da dor conhecida, como controlo positivo no ensaio. Observaram-se reduções significativas nas torções para MD-915 (dose de 1 mg/kg) e para MD-1100 (dose de 2,5 mg/kg) em comparação com o controlo de veículo. Observou-se também uma perda de eficácia com a maior dose testada para múltiplos outros compostos (tais como antagonistas de 5HT-3) testados em ensaios similares. Os resultados deste estudo sugerem que ambos, o MD-915 E O MD-1100, têm efeitos antinociceptivos neste modelo de dor visceral comparáveis com as doses intermédias de indometacina.
Exemplo 5: Determinação de Kd de MD-1100
Para determinar a afinidade de MD-1100 para com receptores GC-C encontrados na mucosa intestinal do rato, realizou-se um ensaio de ligação competitiva utilizando células epiteliais intestinais de rato. As células epiteliais do intestino delgado de ratos foram obtidas como descrito por Kessler et al. (J. Biol. Chem. 245: 5281-5288 (1970)).
Sucintamente, sacrificaram-se os animais e expuseram-se as suas cavidades abdominais. Enxaguou-se o intestino delgado com 300 ml de solução salina ou PBS gelados. Removeram-se 10 cm do intestino delgado, medidos a partir de 10 cm do piloro, e cortaram-se em segmentos de 1 polegada. Extrudiu-se a mucosa intestinal do intestino por pressão suave entre um pedaço de parafilme e uma ponta de pipeta P-1000. Colocaram-se as células epiteliais intestinais em 2 ml de PBS e pipetaram-se para cima e para baixo com uma pipeta de 5 ml para preparar uma suspensão de células. A concentração de proteína na suspensão foi medida utilizando o método de Bradford (Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976)). 52 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Realizou-se um ensaio de ligação competitiva com base no método de Giannella et al. (Am. J. Physiol. 245: G492-G498) entre MM-416776 marcado com [1251 ] e MD-1100. A mistura de ensaio continha: 0,5 ml de DME com HEPES 20 mM-KOH pH 7,0, 0,9 mg da suspensão celular atrás enumerada, 21,4 fmol de [1251] — MM-416776 (42,8 pM) , e diferentes concentrações de MD-1100 como competidor (0,01 a 1000 nM) . Incubou-se a mistura à temperatura ambiente durante 1 hora, e parou-se a reacção aplicando a mistura em filtros de fibra de vidro GF/B (Whatman) . Lavaram-se os filtros com 5 ml de PBS gelado e mediu-se a radioactividade. A Figura 9 mostra que a Kd para MD-1100 neste ensaio é de 4,5 nM. %B/Bo é a percentagem da razão de radioactividade aprisionada em cada amostra (B) em comparação com a radioactividade retida numa amostra de controlo sem competidor frio (Bo) . Giannella et al. (Am. J. Physiol. 245: G492-G498) observaram que a Kd para o péptido ST do tipo selvagem neste mesmo ensaio foi de ~13 nM.
Exemplo 6: Propriedades farmacocinéticas de MD-1100
Para estudar a farmacocinética de MD-1100, realizaram-se estudos de absortividade em ratinhos por administração de MD-1100 intravenosamente por injecção na veia da cauda ou oralmente por sonda esofágica a ratinhos CD1 de 8 semanas de idade. Recolheu-se o soro dos animais em vários pontos de tempo e testou-se quanto à presença de MD-1100 utilizando um ensaio competitivo de imunossorção com enzima ligada (Oxoid, kit ST EIA, n.° de Cat. TD0700). O ensaio utilizou anticorpos monoclonais contra o péptido ST (os anticorpos são fornecidos no kit Oxoid) e MD-1100 fabricado sinteticamente. A Figura 10a mostra os resultados de absorção para MD-1100 administrado intravenosa e oralmente, como detectado pelo ensaio ELISA. O MD-1100 parece ser minimamente absorvido sistemicamente e está <2,2% biodisponivel.
Realizou-se um estudo de biodisponibilidade similar em que se utilizou LCMS em vez de ELISA para detectar o MD-1100. Inicialmente, extrairam-se amostras de soro do sangue completo de ratinhos expostos e de controlo, depois injectaram-se directamente (10 mL) numa coluna de extracção em fase sólida (SPE) em linha (coluna HLB Waters Oásis de 25mm, 2,0 x 15 mm em ligação directa) sem outro processamento. Lavou-se a 53 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ amostra na coluna SPE com uma solução de metanol a 5%, dH20 a 95% (2,1 mL/min, 1,0 minuto), depois carregou-se numa coluna analítica utilizando um comutador de válvula que coloca a coluna de SPE numa via de fluxo invertido sobre a coluna analítica (coluna Waters Xterra MS C8 5mm IS, 2,1 x 20mm). Eluiu-se a amostra a partir da coluna analítica com um gradiente de fase inversa (fase móvel A: hidróxido de amónio 10 mM em dH20, fase móvel B: hidróxido de amónio 10 mM em acetonitrilo a 80% e metanol a 20%; 20% de B durante os primeiros 3 minutos, depois aumento gradual até 95% de B ao longo de 4 min. e manutenção durante 2 min., todos a um caudal de 0,4 mL/min.). Aos 9,1 minutos o gradiente retorna às condições iniciais de 20% de B durante 1 min. O MD-1100 eluiu da coluna analítica a 1,45 minutos, e foi detectado por espectrometria de massa de triplo-quadrapolo (MRM, 764 (estado de carga +2) >182 (estado de carga +1) Da; voltagem do cone = 30V; colisão = 20 eV; resolução aparente = 2 Da no pico de base; resolução filha = 2 Da no pico de base) . A resposta do instrumento foi convertida em unidades de concentração por comparação com uma curva padrão utilizando quantidades conhecidas de MD-1100 sintetizado quimicamente preparado e injectado em soro de ratinho utilizando o mesmo procedimento. A Figura 10b mostra os resultados de absorção para MD-1100 administrado por via IV e oral, como detectado por LCMS. Neste ensaio, MD-1100 parece do mesmo modo minimamente absorvido sistemicamente e está <0,11% biodisponivel.
Administração de péptidos e agonistas do receptor GC-C
Para o tratamento de desordens gastrointestinais, os péptidos e agonistas da presente divulgação, e.g. os péptidos de acordo com a invenção, são preferivelmente administrados oralmente, e.g., na forma de comprimido, gel, pomada, pasta, liquido, pó ou numa outra forma. As composições administradas oralmente podem incluir aglutinantes, agentes aromatizantes e umectantes. Os péptidos e agonistas podem ser co-administrados com outros agentes utilizados para tratar desordens gastrointestinais incluindo, mas não se lhes limitando, agentes supressores de ácidos tais como agonistas do receptor de histamina-2 (H2As) e inibidores da bomba de protões (PPI). Os péptidos e agonistas podem também ser administrados por 54 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ supositório rectal. Para o tratamento de desordens fora do tracto gastrointestinal tais como insuficiência cardiaca congestiva e hipertrofia prostática benigna, os péptidos e agonistas são preferivelmente administrados por via parentérica ou oral.
Os péptidos aqui descritos podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com outros agentes. Por exemplo, os péptidos podem ser administrados juntamente com um péptido ou composto analgésico. 0 péptido ou composto analgésico pode ser covalentemente ligado a um péptido aqui descrito ou pode ser um agente separado que é administrado juntamente com, ou sequencialmente a, um péptido aqui descrito, numa terapia de combinação. A terapia de combinação pode ser conseguida por administração de dois ou mais agentes, e.g., um péptido aqui descrito e um péptido ou composto analgésico, cada um formulado e administrado separadamente, ou por administração de dois ou mais agentes numa única formulação. Outras combinações estão também abrangidas pela terapia de combinação. Por exemplo, dois agentes podem ser formulados conjuntamente e administrados em conjunto com uma formulação separada contendo um terceiro agente. Embora os dois ou mais agentes na terapia de combinação possam ser administrados simultaneamente, isto não é necessário. Por exemplo, a administração de um primeiro agente (ou combinação de agentes) pode preceder a administração de um segundo agente (ou combinação de agentes) em minutos, horas, dias ou semanas. Assim, os dois ou mais agentes podem ser administrados com intervalo de minutos uns dos outros ou intervalo de 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18 ou 24 horas uns dos outros ou intervalo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 dias uns dos outros ou intervalo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 semanas uns dos outros. Em alguns casos são mesmo possíveis intervalos mais longos. Embora em muitos casos seja desejável que os dois ou mais agentes utilizados numa terapia de combinação estejam presentes no corpo do paciente ao mesmo tempo, isto não é necessário. A terapia de combinação pode também incluir duas ou mais administrações de um ou mais dos agentes utilizados na 55 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ combinação. Por exemplo, se o agente X e o agente Y forem utilizados numa combinação, podem administrar-se sequencialmente em qualquer combinação uma ou mais vezes, e.g., pela ordem X-Y-X, X-X-Y, Y-X-Y, Y-Y-X, X-X-Y-Y, etc.
Os agentes, sozinhos ou em combinação, podem ser combinados com qualquer transportador ou meio farmaceuticamente aceitável. Assim, podem ser combinados com materiais que não produzem uma reacção adversa, alérgica ou de outro modo indesejada quando administrados a um paciente. Os transportadores ou meios utilizados podem incluir solventes, dispersantes, revestimentos, agentes promotores da absorção, agentes de libertação controlada, etc.
Os agentes, quer na sua forma livre quer na forma de sal, podem ser combinados com um polímero tal como poli (ácido láctico-ácido glicólico) (PLGA), poli-(I)-ácido láctico-ácido glicólico-ácido tartárico (P(I)LGT) (WO 01/12233), poli(ácido glicólico) (U.S. 3773919), poli(ácido láctico) (U.S. 4767628); poli(ε-caprolactona) para criar uma formulação de libertação sustentada. Estas formulações podem ser utilizadas para implantes que libertam um péptido ou outro agente ao longo de um período de alguns dias, algumas semanas ou vários meses, dependendo do polímero, do tamanho de partícula do polímero e do tamanho do implante (veja-se, e.g., U.S. 6620422). Outras formulações de libertação sustentada são descritas em EP 0467389 A2, WO 93/241150, U.S. 5612052; WO 97/40085, WO 94/155587, U.S. 5672659, U.S. 5893985, U.S. 5134122, U.S. 5192741, U.S. 5192741 e U.S. 5445832. Nestas formulações de libertação sustentada, micropartículas de péptido são combinadas com micropartículas de polímero. Um ou mais implantes de libertação sustentada podem ser colocados no intestino grosso, no intestino delgado ou em ambos.
Os agentes podem ser administrados, e.g., por injecção intravenosa, injecção intramuscular, injecção subcutânea, ou por outras vias. Os agentes podem ser administrados oralmente, e.g., na forma de comprimido, gel, pomada, pasta, líquido, pó ou numa outra forma. As composições administradas oralmente podem incluir aglutinantes, agentes aromatizantes e umectantes. Os agentes podem ser incluídos em dentífricos ou elixires orais. Assim, as formulações orais podem incluir 56 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ agentes abrasivos e espumantes. Os agentes podem também ser administrados transdermicamente ou na forma de um supositório.
Os agentes podem ser um ácido ou uma base livres, ou ser um seu sal farmacologicamente aceitável. Os sólidos podem ser dissolvidos ou dispersos imediatamente antes da administração ou antes. Em algumas circunstâncias as preparações incluem um conservante para prevenir o crescimento de microorganismos. As formas farmacêuticas adequadas para injecção podem incluir soluções ou dispersões estéreis, aquosas ou orgânicas, que incluem, e.g., água, um álcool, uma solvente orgânico, um óleo ou outro solvente ou dispersante (e.g., glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol, e óleos vegetais). Os agentes farmacêuticos podem ser esterilizados por esterilização por filtração ou por outros meios adequados.
As composições farmacêuticas adequadas de acordo com a presente divulgação, e.g. composições farmacêuticas de acordo com a invenção, incluirão geralmente uma quantidade do(s) composto(s) activo(s) com um diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis, tais como uma solução aquosa estéril, para originar uma gama de concentrações finais, dependendo da utilização pretendida. As técnicas de preparação são geralmente bem conhecidas na especialidade, como exemplificado em Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Edition, Mack Publishing Company, 1995).
Os agentes aqui descritos e os agentes de terapia de combinação podem ser embalados na forma de um kit que inclui doses únicas ou múltiplas de dois ou mais agentes, cada um embalado ou formulado individualmente, ou doses únicas ou múltiplas de dois ou mais agentes embalados ou formulados em combinação. Assim, podem estar presentes um ou mais agentes num primeiro recipiente, e o kit pode opcionalmente incluir um ou mais agentes num segundo recipiente. 0 recipiente ou os recipientes são colocados no interior de uma embalagem, e a embalagem pode opcionalmente incluir instruções para administração ou dosagem. Um kit pode incluir componentes adicionais tais como seringas ou outros meios para a administração dos agentes, assim como diluentes ou outros meios para formulação. 57 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Agentes Analgésicos
Os péptidos aqui descritos podem ser utilizados em terapia de combinação com um agente analgésico, e.g., um composto analgésico ou um péptido analgésico. 0 agente analgésico pode opcionalmente estar ligado covalentemente a um péptido aqui descrito. Entre os agentes analgésicos úteis incluem-se: bloqueadores dos canais do Ca, antagonistas dos receptores 5HT (por exemplo antagonistas do receptor 5HT3, 5HT4 e 5HT1), agonistas de receptores de opióides (loperamida, fedotozina e fentanilo), antagonistas do receptor NK1, agonistas do receptor CCK (e.g., loxiglumida), antagonistas do receptor NK1, antagonistas do receptor NK3, inibidores de reassimilação de norepinefrina-serotonina (NSRI), agonistas dos receptores vanilóides e canabinóides, e sialorfina. Os agentes analgésicos nas várias classes estão descritos na literatura.
Entre os péptidos analgésicos úteis encontram-se péptidos relacionados com sialorfina, incluindo os que compreendem a sequência de aminoácidos QHNPR (SEQ ID N0:111), incluindo: VQHNPR (SEQ ID N0:112); VRQHNPR (SEQ ID N0:113); VRGQHNPR (SEQ ID NO:114); VRGPQHNPR (SEQ ID N0:115); VRGPRQHNPR (SEQ ID NO:116); VRGPRRQHNPR (SEQ ID NO:117); e RQHNPR (SEQ ID NO:118). Os péptidos relacionados com sialorfina ligam-se a neprilisina e inibem a quebra mediada por neprilisina da substância P e Met-encefalina. Assim, os compostos ou péptidos que são inibidores de neprilisina são agentes analgésicos úteis que podem ser administrados com os péptidos da presente divulgação numa co-terapia ou ligados aos péptidos da presente divulgação, e.g. os péptidos de acordo com a invenção, e.g., através de uma ligação covalente. A sialofina e péptidos relacionados estão descritos na Patente U.S. 6589750; em U.S. 20030078200 AI; e WO 02/051435 A2.
Os antagonistas e agonistas de receptores de opióides podem ser administrados com os péptidos da presente divulgação, e.g. os péptidos de acordo com a invenção em co-terapia, ou ligados aos péptidos da presente divulgação, e.g. os péptidos de acordo com a invenção, e.g., através de uma ligação covalente. Por exemplo, pensa-se que os antagonistas de receptores de opióides tais como naloxona, 58 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ naltrexona, metilnalozona, nalmefeno, cipridima, beta-funaltrexamina, naloxonazina, naltrindole e nor-binaltorfimina, são úteis no tratamento de SCI. Pode ser útil formular os antagonistas de opióides deste tipo numa formulação de libertação retardada e sustentada de tal modo que a libertação inicial do antagonista seja no intestino delgado médio a distai e/ou no cólon ascendente. Estes antagonistas estão descritos em WO 01/32180 A2. O pentapéptido encefalina (HOE825; Tyr-D-Lys-Gly-Phe-L-homoserina) é um agonista dos receptores de opióides mu e delta e pensa-se que é útil para aumentar a motilidade intestinal (Eur. J. Pharm. 219:445, 1992), e pode utilizar-se este péptido em conjunto com os péptidos da presente divulgação, e.g. os péptidos de acordo com a invenção. Também é útil a trimebutina, que se pensa que se liga a receptores de opióides mu/delta/capa e activa a libertação de motilina e modula a libertação de gastrina, péptido intestinal vasoactivo, gastrina e glucagones. Os agonistas de receptores capa de opióides como a fedotozina, a cetociclazocina, e compostos descritos em WO 03/097051 A2, podem ser utilizados com, ou ligados, aos péptidos da presente divulgação, e.g. os péptidos de acordo com a invenção. Em adição, podem utilizar-se agonistas do receptor mu de opióides como a morfina, o difeniloxilato, a fracefamida (H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NPb; WO 01/019849 Al) e a loperamida.
Tyr-Arg (quiotorfina) é um dipéptido que actua por estimulação da libertação de met-encefalinas para evocar um efeito analgésico (J. Biol. Chem 262:8165, 1987). A quiotorfina pode ser utilizada com, ou ligada, aos péptidos da da presente divulgação.
Os agonistas do receptor CCK tais como a caeruleina de anfibios e outras espécies são agentes analgésicos úteis que podem utilizar-se com, ou ligados, aos péptidos da presente divulgação.
Os péptidos de conotoxina representam uma vasta classe de péptidos analgésicos que actuam nos canais do Ca controlados por voltagem, receptores de NMDA ou receptores nicotinicos. Estes péptidos podem ser utilizados com, ou ligados, aos péptidos da presente divulgação. 59 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Os análogos peptídicos de timulina (Pedido de patente FR 2830451) podem ter actividade analgésica e podem ser utilizados com, ou ligados, aos péptidos da presente divulgação.
Os antagonistas do receptor CCK (CCKa ou CCKb), incluindo loxiglumida e dexloxiglumida (o isómero R de loxiglumida) (WO 88/05774) podem ter actividade analgésica e podem ser utilizados com, ou ligados, aos péptidos da presente divulgação.
Outros agentes analgésicos úteis incluem agonistas de 5-HT4 tais como tegaserod/zelnorm e lirexaprida. Estes agonistas estão descritos em: EP1321142 Al, WO 03/053432A1, EP 505322 Al, EP 505322 Bl, US 5510353, EP 507672 Al, EP 507672 Bl e US 5273983.
Os bloqueadores dos canais do cálcio como ziconotida e compostos relacionados descritos, por exemplo, em EP625162B1, US 5364842, US 5587454, US 5824645, US 5859186, US 5994305, US 6087091, US 6136786, WO 93/13128 Al, EP 1336409 Al, EP 835126 Al, EP 835126 Bl, US 5795864, US 5891849, US 6054429, WO 97/01351 Al, podem ser utilizados com, ou ligados, aos péptidos da presente divulgação. Vários antagonistas dos receptores NK-1, NK-2 e NK-3 (para uma revisão veja-se Giardina et al. 2003 Drugs 6:758) podem ser utilizados com, ou ligados, aos péptidos da presente divulgação.
Os antagonistas do receptor NK1 tais como: aprepitant (Merck & Co Inc), vofopitanto, ezlopitanto (Pfizer, Inc.), R-673 (Hoffmann-La Roche Ltd), SR-14033 e compostos relacionados descritos, por exemplo, em EP 873753 Al, US 20010006972 Al, US 20030109417 Al, WO 01/52844 Al, podem ser utilizados com, ou ligados, aos péptidos da presente divulgação.
Os antagonistas do receptor NK-2 tais como nepadutant (Menarini Ricerche SpA), saredutant (Sanofi-Synthelabo), SR-144190 (Sanofi-Synthelabo) e UK-290795 (Pfizer Inc) podem 60 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ ser utilizados com, ou ligados, aos péptidos da presente divulgação.
Os antagonistas do receptor NK3 tais como osanetant (Sanofi-Synthelabo), talnetanto e compostos relacionados descritos, por exemplo, em WO 02/094187 A2, EP 876347 Al, WO 97/21680 Al, US 6,277,862, WO 98/11090, WO 95/28418, WO 97/19927, e Boden et al. (J Med Chem. 39:1664-75, 1996) podem ser utilizados com, ou ligados, aos péptidos da presente divulgação.
Os inibidores da reassimilação de norepinefrina-serotonina tais como milnaciprano e compostos relacionados descritos em WO 03/077897 Al podem ser utilizados com, ou ligados, aos péptidos da presente divulgação.
Os antagonistas dos receptores vanilóides tais como arvanil e compostos relacionados descritos em WO 01/64212 Al podem ser utilizados com, ou ligados, aos péptidos da presente divulgação.
Quando o analgésico é um péptido e está ligado covalentemente a um péptido aqui descrito, o péptido resultante pode também incluir pelo menos um local de clivagem para tripsina ou quimiotripsina. Quando presente no interior do péptido, o péptido analgésico pode ser precedido (se estiver no terminal carboxi) ou seguido (se estiver no terminal amino) por um local de clivagem para quimiotripsina ou tripsina, o qual permite a libertação do péptido analgésico.
Em adição a péptidos relacionados com sialorfina, os péptidos analgésicos incluem: AspPhe, endomorfina-1, endomorfina-2, nocistatina, dalargina, lupron, ziconotida e substância P. Métodos de Tratamento
Os péptidos da presente divulgação, e.g. os péptidos de acordo com a invenção podem ser utilizados para o tratamento ou prevenção do cancro, crescimentos pré-cancerosos ou crescimentos metastáticos. Por exemplo, podem ser utilizados 61 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ para a prevenção ou tratamento de: cancro colorrectal local/cancro colorrectal metastizado, cancro do tracto gastrointestinal, cancro do pulmão, cancro ou crescimentos pré-cancerosos ou crescimentos metastáticos de células epiteliais, pólipos, carcinoma da mama, colorrectal, do pulmão, ovariano, pancreático, prostático, renal, do estômago, da bexiga, do figado, esofágico e testicular, carcinoma (e.g., de células basais, de basoscamosas, de Brown-Pearce, carcinoma ductal, tumor de Ehrlich, Krebs, de células de Merkel, do pulmão de células pequenas e de células não pequenas, de células grão de aveia, papilar, brônquico, de células histiocitose, plasmacitoma, adenofibroma, hiperplasia esclerosante, carcinóide escamosas, de células transicionais, ou de Walker), leucemia (e.g., de células B, de células T, de HTLV, linfocitica aguda ou crónica, de mastóctios, ou mielóide) , histiocitonia, doença de Hodgkin, linfoma não de Hodgkin, reticuloendoteliose, adenoma, adenocarcinoma, adenolinforna, ameloblastoma, angioceratoma, angiolinfóide com eosinofilia, angioma angiomatose, apudoma, branquionia, sindrome maligna, doença carcinóide do coração, carcinossarcoma, cementoma, colangioma, colesteatoma, condrossarcoma, condroblastoma, condrossarcoma, cordoma, coristoma, craniofaringioma, crondroma, cilindroma, cistadenocarcinoma, cistadenoma, cistossarconia filodes, disgeninoma, ependimoma, sarcoma de Ewing, fibroma, fibrossarcoma, tumor de células gigantes, ganglioneuroma, glioblastoma, glomangioma, tumor de células granulosas, ginandroblastoma, hamartoma, hemangioendotelioma, hemangioma, hemangio-pericitoma, hemangiossarcoma, hepatoma, tumor de células dos ilhéus, sarcoma de Kaposi, leiomioma, leiomiossarcoma, leucossarcoma, tumor de células de Leydig, lipoma, lipossarcoma, linfaugioma, linfangiomioma, linfangiossarcoma, meduloblastoma, meningioma, mesenquimoma, mesonefroma, mesotelioma, mioblastoma, mioma, miossarcoma, mixoma, mixossarcoma, neurilemoma, neuroma, neuroblastoma, neuroepitelioma, neurofibroma, neurofibromatose, odontoma, osteoma, osteossarcoma, papiloma, paraganglioma, paraganglioma não cromafinico, pinealoma, rabdomioma, rabdomiossarcoma, tumor de células de Sertoli, teratoma, tumor de células teçais, e outras doenças em que células se tornaram displásicas, imortalizadas ou transformadas. 62 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Os péptidos da presente divulgação, e.g. os péptidos de acordo com a invenção, podem ser utilizados para o tratamento ou prevenção de: Polipose Adenomatosa Familiar (PAF) (sindrome autossómica dominante) que precede o cancro do cólon, cancro colorrectal não poliposo hereditário (CCNPH), e sindrome autossómica dominante hereditária.
Para o tratamento ou prevenção do cancro, crescimentos pré-cancerosos e crescimentos metastáticos, os péptidos podem ser utilizados em terapia de combinação com radiação ou agentes quimioterapêuticos, um inibidor de uma fosfodiesterase dependente de GMPc ou um inibidor selectivo de ciclo-oxigenase-2 (vários inibidores selectivos de ciclo-oxigenase-2 estão descritos em WO02062369).
Os péptidos podem ser para o tratamento ou prevenção de inflamação. Assim, podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com um inibidor de fosfodiesterase dependente de GMPc ou um inibidor selectivo de ciclo-oxigenase-2 para o tratamento de: inflamação de órgãos, DII (e.g, doença de Crohn, colite ulcerativa), asma, nefrite, hepatite, pancreatite, bronquite, fibrose cística, doenças isquémicas intestinais, inflamações/alergias intestinais, doença celíaca, proctite, gastroenterite eosinofílica, mastocitose, e outras desordens inflamatórias.
Os péptidos podem também ser utilizados para tratar ou prevenir desordens relacionadas com insulina, por exemplo: diabetes mellitus II, hiperglicemia, obesidade, desordens associadas a perturbações no transporte de glucose ou de electrólitos e secreção de insulina em células, ou desordens endócrinas. Podem também ser utilizados no tratamento de resistência à insulina e da diminuição pós-cirúrgica e não pós-cirúrgica da responsividade à insulina.
Os péptidos podem ser utilizados para prevenir ou tratar desordens respiratórias, incluindo, desordens de inalação, ventilação e secreção de muco, hipertensão pulmonar, obstrução crónica de vasos e vias respiratórias e obstruções irreversíveis de vasos e brônquios. 63 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
Os péptidos podem ser utilizados em terapia de combinação com um inibidor de fosfodiesterase (exemplos destes inibidores podem ser encontrados na Patente US 6333354).
Os péptidos podem também ser utilizados para prevenir ou tratar: retinopatia, nefropatia, angiopatia diabética e formação de edemas.
Os péptidos podem também ser utilizados para prevenir ou tratar desordens neurológicas, por exemplo, cefaleia, ansiedade, desordens dos movimentos, agressão, psicose, ataques, ataques de pânico, histeria, desordens do sono, depressão, desordens esquizoafectivas, apneia do sono, sindromes de défice de atenção, perda de memória e narcolepsia. Podem também ser utilizados como sedativos.
Os péptidos e péptidos marcados de forma detectável podem ser utilizados como marcadores para identificar, detectar, categorizar ou diagnosticar doenças e condições do intestino delgado, incluindo: doença de Crohn, colite, doença inflamatória dos intestinos, tumores, tumores benignos, tais como tumores estromais benignos, adenoma, angioma, pólipos adenomatosos (pedunculados e sésseis), tumores malignos, carcinóides, tumores de células endócrinas, linfoma, adenocarcinoma, carcinoma do intestino anterior, intestino médio e intestino posterior, tumor estromal gastrointestinal (TEGI), tal como leiomioma, leiomioma celular, leiomioblastoma e leiomiossarcoma, tumor do nervo gastrointestinal autónomo, sindromes de malabsorção, doenças celiacas, diverticulose, diverticulo de Meckel, diverticulos colónicos, megacólon, doença de Hirschsprung, sindrome do cólon irritável, isquemia mesentérica, colite isquémica, cancro colorrectal, polipose colónica, sindrome poliposa, adenocarcinoma intestinal, sindrome de Liddle, miopatia de Brody, convulsões infantis e coreoatetose.
Os péptidos podem ser conjugados com outra molécula (e.g., uma molécula de diagnóstico ou terapêutica) para atingir células portadoras do receptor GC-C, e.g., lesões de fibrose cística e células específicas que revestem o tracto intestinal. Assim, podem ser utilizados para direccionar porções radioactivas ou porções terapêuticas para o intestino 64 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ para auxiliar a obtenção de uma imagem e diagnosticar ou tratar cancro colorrectal local/metastizado e para entregar cópias normais do gene supressor de tumores p53 no tracto intestinal.
Os péptidos podem ser utilizados sozinhos ou em terapia de combinação para tratar a disfunção eréctil.
Os péptidos podem ser utilizados sozinhos ou em terapia de combinação para tratar desordens do ouvido interno, e.g., para tratar a doença de Meniere, incluindo sintomas da doença tais como vertigens, perda de audição, tinite, sensação de ouvido cheio, e para manter a homeostasia de fluidos no ouvido interno.
Os péptidos podem ser utilizados sozinhos ou em terapia de combinação para tratar desordens associadas com retenção de fluidos e de sódio, e.g., doenças do sistema de transporte de electrólitos-água/electrólitos no interior do rim, dos intestinos e do sistema urogenital, insuficiência cardíaca congestiva, hipertensão, hipotensão, cirrose hepática e síndrome nefrótica. Em adição, podem ser utilizados para facilitar a diurese ou o controlo de fluidos intestinais.
Os péptidos podem ser utilizados sozinhos ou em terapia de combinação para tratar desordens associadas com a secreção de bicarbonato, e.g., fibrose cística.
Os péptidos podem ser utilizados sozinhos ou em terapia de combinação para tratar desordens associadas com a regeneração de células do fígado.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Microbia, Inc
<120> COMPOSIÇÕES PARA 0 TRATAMENTO DE DESORDENS GASTROINTESTINAIS
<130> 114-148 TI <140> EP 07 011 869.0 <141> 2004-01-28 <150> US 60/471, 288 <151> 2003-05-15 <150> US 60/519,460 <151> 2003-11-12 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 65 <150> <151> US 60/443,098 2003-01-28 <160> 124 <17 0> FastSEQ for Windows versão 4.0 <210> <211> <212> <213> 1 19 PRT Escherichia coli <400> 1
Asn Ser ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu cys Cys Asn pro Ala Cys Thr 15 10 15
Gly Cys Tyr <210> <211> <212> <213> 2 18 PRT Escherichia coli <400> 2
Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly 1 5 10 15
Cys Tyr <210> <211> <212> <213> 3 18 PRT Escherichia coli <400> 3>
Asn Thr Phe Tyr cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly 15 10 15
Cys Asn <210> <211> <212> <213> 4 18 PRT Citrohacter freundii <400> 4
Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly 15 10 15
Cys Tyr <210> <211> <212> <213> 5 30 PRT Yersinia enterocolitica <400> 5
Gin Ala cys Asp Pro Pro Ser Pro Pro Ala Glu Vai Ser Ser Asp Trp 1 5 10 15
Asp Cys cys Asp vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys 20 25 30 66 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
<210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Yersinia enterocolitica <400> 6
Lys Ala cys A5p Thr Gin Thr Pro ser pro Ser Glu Glu Asn Asp Asp 15 10 15
Trp cys Cys Glu vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys 20 25 30
<210> 7 <211> 53 <212> PRT <213> Yersinia enterocolitica <400> 7
Gin Glu Thr Ala Ser Gly Gin vai Gly Asp Vai Ser ser ser Thr Ile 1 5 10 15
Ala Thr Glu vai ser Glu Ala Glu Cys Gly Thr Gin Ser Ala Thr Thr 20 25 30
Gin Gly Glu Asn Asp Trp Asp Trp cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro 35 40 45
Ala Cys Phe Gly Cys 50 <210> 8
<211> 16 <212> PRT <213> Yersinia kristensenii <400> 8
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<210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 9
Ile Asp Cys Cys Glu ile Cys Cys Asn Pro Ala cys Phe Gly Cys Leu 1 5 10 15
Asn
<210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Vibrio mimicus <400> 10
Ile Asp cys Cys Glu Ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Phe Gly Cys Leu 15 10 15
Asn
<210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Escherichia coli 67 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <4 Ο 0> 11
Asn Thr Phe Tyr cys cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Pro 1 5 10 15
Cys Tyr <210> <211> <212> <213> 12 13 PRT Vibrio cholerae <400> 12 lie Asp Gys cys Glu Ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Phe 15 10 <210> <211> <212> <213> 13 14 PRT Vibrio cholerae <400> 13
Ile Asp Cys Cys Glu ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Phe Gly 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 14 17 PRT Vibrio mimicus <400> 14 ile Asp Cys cys Glu ile Cys Cys Asn pro Ala Cys Phe Gly Cys Leu 15 10 15
Asn <210> <211> <212> <213> 15 17 PRT Vibrio mimicus <400> 15
Ile Asp Arg Cys Glu Ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Phe Gly Cys Leu 15 10 15
Asn <210> <211> <212> <213> 16 16 PRT Yersinia enterocolitica <400> 16
Asp Trp Asp Cys Cys Asp vai cys cys Asn Pro Ala cys Ala Gly Cys 15 10 15 <210> <211> <212> <213> 17 16 PRT Yersinia enterocolitica 68 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <400> 17
Asp Trp Asp Cys Cys Asp vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly cys 1 5 10 15
<210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Yersinia enterocolitica <400> 18
Asn Asp Asp Trp Cys Cys Glu Vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly 1 5 10 15
Cys
<210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Yersinia enterocolitica <400> 19
Trp Asp Trp Cys cys Glu Leu Cys 1 5
<210> 20 <211> 72 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 20
Cys Asn Pro Ala Cys Phe Gly cys 10 15
Met 1 Lys Lys Leu Met 5 Leu Ala Ile Ser Phe Ser Gin 20 Ser Thr Glu Ser Thr Leu Glu 35 Thr Lys Lys Cys ASp 40 Lys ser 50 Glu Asn Met Asn Asn 55 Thr Asn 65 pro Ala Cys Ala Gly 70 Cys Tyr
Phe lie Ser vai Leu ser Phe Pro 10 15
Leu Asp ser ser Lys Glu Lys lie 25 30 vai vai Lys Asn Asn ser Glu Lys 45
Phe Tyr cys Cys Glu Leu Cys cys 60
<210> 21 <211> 72 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 21 Met Lys 1 Pro Phe Thr Leu Gly Pro 50 Asn Pro 65
Lys Ser lie Leu Phe ile Phe Leu Ser Vai Leu Ser Phe ser , , 5 , 10 15
Ala Gin Asp Ala Lys Pro vai Glu Ser Ser Lys Glu Lys ile ,20 25 30
Glu Ser Lys Lys Cys Asn lie Ala Lys Lys Ser Asn Lys Ser II 40 45
Glu Ser Met Asn Ser ser Asn Tyr cys Cys Glu Leu Cys Cys 55 60
Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 70
<210> 22 <211> 71 <212> PRT <213> Yersinia enterocolitica 69 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <4 Ο Ο> 22
Met Lys Lys ile vai Phe vai Leu vai Leu Met Leu ser ser Phe Gly 15 10 15 ATa Phe Gly Gin Glu Thr Vai Ser Gly Gin Phe ser Asp Ala Leu ser 20, 25 30
Thr Pro ile Thr Ala Glu vai Tyr Lys Gin Ala cys Asp Pro pro Leu 35 40 45 pro pro Ala Glu vai ser ser Asp Trp Asp cys Cys Asp vai cys cys 50 55 60
Asn Pro Ala cys Ala Gly Cys 65 70
<210> 23 <211> 54 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de comando amino-terminal gerada sinteticamente <400> 23
Met Lys Lys Ser lie Leu Phe lie Phe Leu Ser vai Leu Ser Phe Ser 15 10 15
Pro Phe Ala Gin Asp Ala Lys Pro vai Glu Ser Ser Lys Glu Lys Ile 20 25 30
Thr Leu Glu Ser Lys Lys cys Asn Ile Ala Lys Lys Ser Asn Lys Ser 35 40 45
Gly Pro Glu Ser Met Asn 50
<210> 24 <211> 53 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 24
Met Lys Lys ser ile Leu Phe Ile Phe Leu ser vai Leu ser Phe Ser 15 10 15 pro Phe Ala Gin Asp Ala Lys Pro Ala Gly Ser Ser Lys Glu Lys ile 20 25 30
Thr Leu Glu Ser Lys Lys Cys Asn ile vai Lys Lys ser Asn Lys ser 35 40 45
Gly Pro Glu Ser Met 50
<210> 25 <211> 53 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 25
Met Lys Lys ser ile Leu Phe ile Phe Leu Ser vai Leu Ser Phe ser 1 5 10 15
Pro Phe Ala Gin Asp Ala Lys Pro Ala Gly ser Ser Lys Glu Lys Ile 20 25 30
Thr Leu Glu ser Lys Lys cys Asn ile vai Lys Lys Asn Asn Glu Ser 35 40 45
Ser Pro g!u ser Met 50 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 70 <210> <211> <212> <213> 26 19 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 26
Asn ser ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr 1 5 '10 15
Gly Cys Tyr <210> <211> <212> <213> <220> 27 19 PRT Sequência Artificial <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 27
Asn ser ser Asn Tyr cys cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp 15 10 15
Gly Cys Tyr <210> <211> <212> <213> 28 19 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 28
Asn ser ser Asn Tyr cys cys Glu Tyr cys Cys Asn pro Ala cys Thr 15 10 15
Gly Cys Tyr <210> <211> <212> <213> 29 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 29
Cys Cys Glu Leu Cys cys Asn pro Ala cys Thr Gly cys Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 30 14 PRT Sequência Artificial 71 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 30
Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly cys Tyr 15 10
<210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 31
Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 15 10
<210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 32
Asn Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 15 10 15
<210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 33
Asn cys cys Glu Leu cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr 15 10 15
<210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 34
Asn cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 15 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 72 <210> <211> <212> <213> 35 15 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 35
Asn cys cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1.5 10 15 <210> <211> <212> <213> <220> 36 15 PRT Sequência Artificial <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 36
Asn cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 15 <210> <211> <212> <213> 37 15 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 37
Asn cys cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly cys Tyr 1 5 10 15 <210> <211> <212> <213> 38 15 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 38
Asn Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 15 <210> <211> <212> <213> 39 21 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente 73 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <4Ο0> 39
Asn Ser ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr 15 10 15
Gly Cys Tyr Asp Phe 20
<210> 40 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 40
Asn ser ser Asn Tyr cys cys Glu Leu cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp 15 10 15
Gly Cys Tyr Asp Phe 20
<210> 41 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 41
Asn ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Phe Cys cys Asn Pro Ala Cys Thr 15 10 15
Gly Cys Tyr Asp Phe 20
<210> 42 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 42
Asn ser ser Asn Tyr cys cys Glu Tyr cys Cys Asn Pro Ala cys Thr 1 5 10 15
Gly Cys Tyr Asp Phe 20
<210> 43 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 43
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala cys Thr 1 5 10 15
Gly Cys Tyr Asp Phe 20 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 74 <210> <211> <212> <213> 44 21 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 44
Asn Ser ser Asn Tyr cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr 1 5 10 15
Gly cys Tyr Asp Phe 20 <210> <211> <212> <213> 45 21 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 45
Asn Ser ser Asn Tyr Cys cys Glu Lys cys cys Asn pro Ala cys Thr 15 10 15
Gly Cys Tyr Asp Phe 20 <210> <211> <212> <213> <220> 46 16 PRT Sequência Artificial <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 46
Cys Cys Glu Leu Cys cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe 15 10 15 <210> <211> <212> <213> 47 16 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 47
Cys Cys Glu Leu cys cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly cys Tyr Asp Phe 15 10 15 <210> <211> <212> <213> 48 16 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente 75 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <400> 48
Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe 15 10 15 <210> <211> <212> <213> 49 16 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 49
Cys Cys Glu Tyr Cys cys Asn Pro Ala cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe 1 5 10 15 <210> <211> <212> <213> 50 16 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 50
Cys Cys Glu Trp cys cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe 1 5 10 15 <210> <211> <212> <213> 51 16 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 51
Cys Cys Glu Arg Cys cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe 1 5 10 15 <210> <211> <212> <213> 52 16 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 52 cys Cys Glu Lys cys cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe 1 5 10 15 <210> <211> <212> <213> 53 17 PRT Sequência Artificial ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 76 <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 53
Asn cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp 15 10 15 phe <210> <211> <212> <213> 54 17 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 54
Asn cys Cys Glu Leu cys cys Asn Pro Ala cys Trp Gly cys Tyr Asp 15 10 15
Phe <210> <211> <212> <213> 55 17 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 55
Asn Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp 1 5 10 15
Phe <210> <211> <212> <213> 56 17 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 56
Asn cys cys Glu Tyr Cys cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp 15 10 15
Phe <210> <211> <212> <213> 57 17 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 57
Asn cys Cys Glu Trp cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp 1 5 10 15
Phe ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 77 <210> <211> <212> <213> 58 17 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 58
Asn Cys Cys Glu Arg cys cys Asn Pro Ala cys Thr Gly Cys Tyr Asp 1 5 10 15 phe <210> <211> <212> <213> 59 17 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 59
Asn cys Cys Glu Lys cys cys Asn pro Ala cys Thr Gly cys Tyr Asp 1 5 10 15
Phe <210> <211> <212> <213> 60 42 ADN Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido gerado sinteticamente <400> 60 cacaccatat gaagaaatca atattattta tttttctttc tg 42 <210> <211> <212> <213> 61 46 ADN Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido gerado sinteticamente <400> 61 cacacctcga gttaggtctc catgctttca ggaccacttt tattac 46 <210> <211> <212> <213> 62 69 ADN Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido gerado sinteticamente <400> 62 gcatgaatag tagcaattac tgctgtgaat tgtgttgtaa tcctgcttgt accgggtgct 60 attaataac 69 78 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <210> <211> <212> <213> 63 69 ADN Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido gerado sinteticamente <400> 63 tcgagttatt aatagcaccc ggtacaagca ggattacaac acaattcaca gcagtaattg 60 ctactattc 69 <210> <211> <212> <213> 64 69 ADN Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido gerado sinteticamente <400> 64 gcatgaatag tagcaattac tgctgtgaat attgttgtaa tcctgcttgt accgggtgct 60 attaataac 69 <210> <211> <212> <213> 65 69 ADN Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido gerado sinteticamente <400> 65 tcgagttatt aatagcaccc ggtacaagca ggattacaac aatattcaca gcagtaattg 60 ctactattc 69 <210> <211> <212> <213> 66 21 PRT Sequência Artificial <220> <223> péptido gerado sinteticamente <220> <221> <222> <223> VARIANTE 1 /replace="" <220> <221> <222> <223> VARIANTE 1. .2 /replace="" <220> <221> <222> <223> VARIANTE 1. .3 /replace="" 79 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <220> <221> VARIANTE <222> 1..4 <223> /replace="" <220> <221> VARIANTE <222> 1..5 <223> /replace="" <220> <221> VARIANTE <222> 9 <223> Xaa = qualquer aminoácido; ou Xaa = qualquer aminoácido outro que não Leu; ou Xaa = Phe, Trp ou Tyr; ou seleccionado entre qualquer outro aminoácido aromático natural ou não natural; ou Xaa = Tyr <220> <221> VARIANTE <222> 19..21 <223> /replace="" <220> <221> VARIANTE <222> 20..21 <223> /replace="" <220> <221> VARIANTE <222> 20 <223> /replace="Asn" ou "Glu" /note="quando Xaa21 não está presente, então Xaa20 é Asn ou Glu" <220> <221> VARIANTE <222> 21 <223> /replace="" /note="quando Xaa21 não está presente, então Xaa20 é Asn ou Glu" <400> 66
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu xaa cys Cys Asn pro Ala cys Thr 1 5 10 15
Gly Cys Tyr Asp Phe 20
<210> 67 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 67
Gin Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn pro Ala Cys Thr 15 10 15
Gly Cys Tyr 80 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
<210> 68 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 68
Asn Thr Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys cys Asm Pro Ala cys Thr 15 10 15
Gly Cys Tyr
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Asn Leu Ser Asn Tyr cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr 15 10 15
Gly Cys Tyr
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Gly Cys Tyr
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Asn Ser Ser Gin Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr 1 5 10 15
Gly cys Tyr
<210> 72 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial 81 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 72
Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly 1 5 10 15
Cys Tyr
<210> 73 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 73
Gin Ser ser Gin Tyr cys cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala cys Thr 15 10 15
Gly Cys Tyr
<210> 74 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 74
Ser ser Gin Tyr cys cys Glu Tyr cys cys Asn pro Ala cys Thr Gly 1 5 10 15 cys Tyr <210> 75 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 75
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Ala Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr 1 5 10 15
Gly Cys Tyr
<210> 76 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente 82 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <400> 76 Asn ser ser 1 Gly Cys Tyr
Asn Tyr cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr 5 10 15
<210> 77 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 77
Asn ser ser Asn Tyr cys Cys Glu Asn Cys Cys Asn Pro Ala cys Thr 1 5 lô 15
Gly Cys Tyr
<210> 78 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 78
Asn Ser ser Asn Tyr Cys Cys Glu Asp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr 1 5 10 15
Gly Cys Tyr
<210> 79 <211> 19 <212> PRT <2l3> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 79
Cys Cys Asn Pro Ala cys Thr 10 15
Asn ser ser Asn T^r Cys Cys Glu cys Gly Cys Tyr <2l0> 80 <2H> 19
<2l2> PRT <213> Sequência Artificial <22°> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 80
Asn ser Ser Asn Tyr cys Cys Glu Gin cys Cys Asn pro Ala Cys Thr 1 5 10 15
Gly cys Tyr 83 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
<210> 81 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 81
Asn Ser ser Asn Tyr Cys cys Glu Glu cys Cys Asn Pro Ala cys Thr 15 10 15
Gly Cys Tyr
<210> 82 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 82
Asn ser ser Asn Tyr cys cys Glu Gly cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr 1 5 10 15
Gly Cys Tyr
<210> 83 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 83
Asn ser ser Asn Tyr cys Cys Glu His cys Cys Asn Pro Ala cys Thr 15 io 15
Gly Cys Tyr
<210> 84 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 84
Asn 1 Gly
Ser Ser Asn Tyr 5 Cys Tyr
Cys Cys Glu Πe Cys Cys Asn Pro Ala cys Thr 10 15
<210> 85 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente 84 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <4 Ο Ο> 85
Asn Ser Ser Asn 1 Gly Cys Tyr
Tyr cys cys Glu uys Cys Cys Asn Pro Ala cys Thr 5 10 15 <210> 86 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 86
Asn Ser ser Asn 1 Gly Cys Tyr
Tyr cys Cys Glu Met cys cys Asn Pro Ala Cys Thr 5 10 15 <210> 87 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> péptido gerado sinteticamente <400> 87 Asn ser ser Asn 1 Gly Cys Tyr
Tyr cys Cys Glu phe cys cys Asn pro Ala cys Thr S 10 15 <210> 88 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> péptido gerado sinteticamente <400> 88
Asn ser ser Asn 1' Gly Cys Tyr
Tyr cys Cys Glu Pro Cys cys Asn Pro Ala Cys Thr 5 10 15 <210> 89 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 89 Asn ser ser Asn Tyr cys Cys Glu Ser Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly cys Tyr 5 10 Ú ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 85 <210> <211> <212> <213> 90 19 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 90
Asn Ser ser Asn Tyr cys cys Glu Thr cys cys Asn Pro Ala cys Thr 15 10 15
Gly Cys Tyr <210> <211> <212> <213> 91 19 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 91
Asn ser ser Asn Tyr Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr 1 5 10 15
Gly Cys Tyr <210> <211> <212> <213> 92 19 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 92
Asn ser Ser Asn Tyr cys Cys Glu vai cys cys Asn Pro Ala cys Thr 15 10 15
Gly Cys Tyr <210> <211> <212> <213> 93 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 93
Cys Cys Glu Ala Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 94 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente 86 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <4Ο0> 94
Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 95 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 95
Cys Cys Glu Asn Cys cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 15 10 <210> <211> <212> <213> 96 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 96
Cys Cys Glu Asp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 15 10 <210> <211> <212> <213> 97 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 97 cys cys Glu Cys Cys Cys Asn Pro Ala cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 98 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 98 cys cys Glu Gin cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 99 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente 87 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <4Ο0> 99
Cys Cys Glu Glu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 15 10 <210> <211> <212> <213> 101 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 101 Cys Cys Glu His Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr <210> <211> <212> <213> 100 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 100
Cys Cys Glu Gly Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 102 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 102
Cys Cys Glu Ile Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 103 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 103
Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 104 14 PRT Sequência Artificial 88 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <4 0 0> 104Cys cys Glu Met Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10 <210> 105 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteti camente <400> 105 Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 · 5 10 <210> 106 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteti< samente <400> 106 cys cys Glu Pro cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly cys Tyr 15 10
<210> 107 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 107
Cys Cys Glu Ser cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10
<210> 108 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 108
Cys cys Glu Thr cys Cys Asn Pro Ala cys Thr Gly cys Tyr 15 10 89 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
<210> 109 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <4 0 0> 109
Cys cys Gl.u Trp cys cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 1 5 10
<210> 110 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 110 cys cys Glu vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr 15 10
<210> 111 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 111
Gin His Asn Pro Arg 15
<210> 112 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 112 vai Gin His Asn Pro Arg 1 5
<210> 113 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 113
Vai Arg Gin His Asn Pro Arg 1 5 90 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <210> 114 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 114 val 1 Arg Gly Gin His Asn Pro Arg 5 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 115 val Arg Gly Pro Gin His Asn Pro Arg 1 5 <210> 116 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 116 val Arg Gly Pro Arg Gin His Asn Pro 1 5 Arg 10 <210> 117 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 117 val Arg Gly Pro Arg Arg Gin His Asn 1 5 Pro Arg 10 <210> 118 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 118
Arg Gin His Asn Pro Arg 1 5 91 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
<210> 119 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <2 2 0 > <221> VARIANTE <222> 1..4 <223> /replace="" /note="quando Xaal a Xaa4 não estão então Xaa5 é qualquer aminoácido" <220> <221> VARIANTE <222> 5 <223> /replace="qualquer aminoácido" /note="quando Xaal estão presentes, então Xaa5 é qualquer aminoácido" <220> <221> VARIANTE <222> 1..5 <223> /replace="" <220>
<221> VARIANT <222> 8, 9, 12, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 21 <223> Xaa = qualquer aminoácido <400> 119
Asn ser Ser Asn Tyr Cys Cys Xaa xaa Cys cys xaa xaa xaa Cys xaa 15 10 15
Xaa Cys xaa xaa xaa 20
<210> 120 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <220> <221> VARIANTE <222> 4 <223> Xaa = Leu, Ile, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe <220> <221> VARIANTE <222> 11 <223> Xaa = Thr, Ala, Lys, Arg or Trp; ou Xaa aminoácido; ou Xaa = Thr, Ala, Lys, Arg ou Trp; ou Xaa aminoácido não aromático <220> <221> VARIANTE <222> 14 <223> Xaa = Tyr ou Leu presentes, a Xaa4 não = qualquer = qualquer 92 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <220> <221> VARIANTE <222> 15..16 <223> /replace="" <4 Ο 0> 120 cys Cys Glu Xaa Cys cys Asn Pro Ala cys xaa Gly Cys xaa Asp Phe 1 5 10 15
<210> 121 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <220> <221> VARIANTE <222> 1..4 <223> /replace="" /note="quando Xaal a Xaa4 não estão presentes, então Xaa5 é Asn" <220> <221> VARIANTE <222> 5 <223> /replace="Asn" /note="quando Xaal a Xaa4 não estão presentes, então Xaa5 é Asn" <220> <221> VARIANTE <222> 1..5 <223> /replace="" <220> <221> VARIANTE <222> 8 <223> Xaa = Glu ou Asp <220> <221> VARIANTE <222> 9 <223> Xaa = Leu, Ile, Vai, Trp, Tyr ou Phe <220> <221> VARIANTE <222> 16 <223> Xaa = Thr, Ala ou Trp <220> <221> VARIANTE <222> 19 <223> Xaa = Trp, Tyr or Leu <220> <221> VARIANTE <222> 19 <223> /replace="" 93 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <400> 121
Asn Ser ser Asn Tyr cys Cys xaa xaa Cys Cys Asn Pro Ala Cys xaa 1 5 10 15
Gly Cys xaa Asp Phe 20
<210> 122 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <220> <221> VARIANTE <222> 1..4 <223> /replace="" /note="quando Xaal a Xaa4 não estão presentes, então Xaa5 é Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr ou Phe" <220> <221> VARIANTE <222> 5 <223> /replace="Asn", "Trp", "Asp", "Ile", "Thr" ou "Phe" /note="Quando Xaal a Xaa4 não estão presentes, então Xaa5 é Asn, Trp, Tyr, Asp, Ile, Thr ou Phe" <220> <221> VARIANTE <222> 1..5 <223> /replace="" <220> <221> VARIANTE <222> 8 <223> Xaa = Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro <220> <221> VARIANTE <222> 9 <223> Xaa = Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe <220> <221> VARIANTE <222> 12 <223> Xaa = Asn, Tyr, Asp ou Ala <220> <221> VARIANTE <222> 13 <223> Xaa = Pro ou Gly <220> <221> VARIANTE <222> 14 <223> Xaa = Ala, Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, Ile, Leu, Lys, Arg ou Asp 94 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ <220> <221> VARIANTE <222> 16 <223> Xaa = Thr, Ala, Asn, Lys, Arg ou Trp <220> <221> VARIANTE <222> 17 <223> Xaa = Gly, Pro ou Ala <220> <221> VARIANTE <222> 19 <223> Xaa = Trp, Tyr, Phe ou Leu; ou Xaa = Lys ou Arg <220> <221> VARIANTE <222> 19..21 <223> /replace=",, <220> <221> VARIANTE <222> 20..21 <223> /replace="" <220> <221> VARIANTE <222> 20 <223> /replace="Asn" ou "Glu" /note="quando Xaa21 não presente, então Xaa20 é Asn ou Glu" <220> <221> VARIANTE <222> 21 <223> /replace="" /note="quando Xaa21 não está presente, Xaa20 é Asn ou Glu" <400> 122
Asn ser ser Asn Tyr cys Cys xaa xaa Cys Cys xaa xaa xaa Cys xaa 1 5 10 15 xaa Cys xaa Asp Phe 20
<210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido gerado sinteticamente <400> 123 Asn Ser Ser Asn Tyr 15 está então 95 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ
<210> 124 <211> 30 <212> PRT <213> Yersinia enterocolitica <4 0 0> 124
Gin Ala Cys Asp Pro Pro Leu Pro Pro Ala Glu vai Ser Ser Asp Trp 1 5 10 15
Asp Cys Cys Asp vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys 20 25 30
Lisboa, 2010-11-11

Claims (6)

  1. ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo: (a) um polipéptido seleccionado entre: (i) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; (ii) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; e (iii) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; (b) um agente seleccionado entre: (i) um inibidor da bomba de protões; (ii) um agonistas do receptor H2; (iii) um antagonista de receptores de opióides; e (iv) um agonista de receptores de opióides; e (c) um transportador farmaceuticamente aceitável.
  2. 2. Composição farmacêutica da reivindicação 1 em que o agonista de receptores de opióides é fentanilo ou morfina.
  3. 3. Composição farmacêutica da reivindicação 1 ou 2 em que o polipéptido compreende a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
  4. 4. Composição farmacêutica da reivindicação 1 ou 2 em que o polipéptido consiste essencialmente na sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
  5. 5. Composição farmacêutica da reivindicação 1 ou 2 em que o polipéptido consiste na sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    6. Composição farmacêutica da reivindicação 1 ou 2 em que o polipéptido compreende a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr. ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 2/6
    7. Composição farmacêutica da reivindicação 1 ou 2 em que o polipéptido consiste essencialmente na sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    8. Composição farmacêutica da reivindicação 1 ou 2 em que o polipéptido consiste na sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    9. Composição farmacêutica da reivindicação 1 ou 2 em que o polipéptido compreende a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    10. Composição farmacêutica da reivindicação 1 ou 2 em que o polipéptido consiste essencialmente na sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    11. Composição farmacêutica da reivindicação 1 ou 2 em que o polipéptido consiste na sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    12. Método para a produção de um polipéptido seleccionado entre: (i) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; (ii) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; e (iii) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; o método compreendendo: (a) a sintese química do polipéptido; e (b) a purificação do polipéptido quimicamente sintetizado.
    13. Método para a produção de uma composição farmacêutica compreendendo um polipéptido seleccionado entre: (i) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; (ii) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; e (iii) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos: ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 3/6 Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; o método compreendendo: (a) a síntese química do polipéptido; (b) a purificação do polipéptido quimicamente sintetizado; e (c) a mistura do polipéptido purificado com um transportador farmaceuticamente aceitável.
    14. Método para a produção de um polipéptido seleccionado entre: (i) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; (ii) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; e (iii) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; o método compreendendo: (a) proporcionar uma célula portadora de uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipéptido; (b) cultivar a célula sob condições em que o polipéptido é expresso; e (c) isolar o polipéptido expresso.
    15. Método para a produção de uma composição farmacêutica compreendendo um polipéptido seleccionado entre: (i) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; (ii) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; e (iii) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; o método compreendendo: (a) proporcionar uma célula portadora de uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipéptido; (b) cultivar a célula sob condições em que o polipéptido é expresso; ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 4/6 (c) isolar ο polipéptido expresso; e (d) misturar o polipéptido isolado com um transportador farmaceuticamente aceitável.
    16. Método de qualquer uma das reivindicações 12 a 15 em que o polipéptido compreende a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    17. Método de qualquer uma das reivindicações 12 a 15 em que o polipéptido consiste essencialmente na sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    18. Método de qualquer uma das reivindicações 12 a 15 em que o polipéptido consiste na sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    19. Método de qualquer uma das reivindicações 12 a 15 em que o polipéptido compreende a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    20. Método de qualquer uma das reivindicações 12 a 15 em que o polipéptido consiste essencialmente na sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    21. Método de qualquer uma das reivindicações 12 a 15 em que o polipéptido consiste na sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    22. Método de qualquer uma das reivindicações 12 a 15 em que o polipéptido compreende a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    23. Método de qualquer uma das reivindicações 12 a 15 em que o polipéptido consiste essencialmente na sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    24. Método de qualquer uma das reivindicações 12 a 15 em que o polipéptido consiste na sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr.
    25. Péptido purificado compreendendo a sequência de aminoácidos (I): ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 5/6 Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Cys6 Cys7 Xaas Xaag Cysio Cysn Xaa72 Xaai3 Xaai4 Cysis Xaai6 Xaai7 Cysis Xaa7g Xaa2o Xaa2i em que: Xaa7 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas é Asn Ser Ser Asn Tyr ou não está presente ou Xaa7 Xaa2 Xaa3 Xaa4 não está presente.
    26. Péptido purificado da reivindicação 25 em que Xaa5 é Asn, Trp, Tyr, Asp ou Phe. 27 Péptido purificado da reivindicação 25 em que Xaa5 é Thr ou Ile.
    28. Péptido purificado da reivindicação 25 em que Xaa5 é Tyr, Asp ou Trp.
    29. Péptido purificado da reivindicação 25 em que Xaag é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro.
    30. Péptido purificado da reivindicação 25 em que Xaag é Leu, Ile, Vai, Ala, Lys, Arq, Trp, Tyr ou Phe.
    31. Péptido purificado da reivindicação 25 em que Xaag é Leu, Ile, Vai, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe. Asn, Ala, AI a,
    32. Péptido purificado da reivindicação 25 em que Xaa72 é Tyr, Asp ou Ala.
    33. Péptido purificado da reivindicação 25 em que Xaa43 é Pro ou Gly.
    34. Péptido purificado da reivindicação 25 em que Xaa44 é Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, Ile, Leu, Lys, Arg ou Asp.
    35. Péptido purificado da reivindicação 25 em que Xaai6 é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg ou Trp.
    36. Péptido purificado da Gly, Pro ou Ala. 37. Péptido purificado da Trp, Tyr, Phe, Asn ou Leu. 38. Péptido purificado da Lys ou Arg. reivindicação 25 em que Xaai7 é reivindicação 25 em que Xaa7g é reivindicação 25 em que Xaa7g é ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 6/6 que está
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    σ> 1 ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 2/19 0 ϋ Η -Ρ Ό) -μ ti Η (0 ο ο λ ι—1 λ γΗ U 1 H ρ EH § φ iH TJ rd μ C0 0 g EH υ η! 0 0 Ο) H W ti Η Ό rH H '«d ti 0 «d • μ Λ D» rH Ό μ (U td u 6 ti 0 M rl U Eu
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    (% do Total) 0.03 0.13· 0.25 0.75. Concentração (mg/kg) EP 1 911 763/PT 7/19 4a. MD-915 e MM-416776 purificados no Modelo (d h U O 3 eh H <D
    Distância percorrida (% do Total) EP 1 911 763/PT 8/19 4b. Péptidos Sintetizados Quimicamente no H CJ) Η (Dd
    ooooooooooo OOOOSCDIO^CONt- Distância percorrida (% do Total) (d o ^1 rH P φ Η O ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 9/19 Ο cd Τ3 33? 10 \> (d ο 'γ\ tíΌΜ υ ο ϋι cd ω ο η ρ Οd (ϋ ^ Τίcd ο &) -Η β cd Φ w rl β b W
    0 o rH H 1 *3* O O τ- O o O o Distância percorrida (% do Total) V V V α α α
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    o LO CM O CM LO 'ví' LO CM O H P O Ή (D > o o o Secreção Dose(ug/kg) ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 12/19 co r* in CO rH rH (Λ Μ* I I β Φ Η (d β Η -μ 0)A φ -μβ Η α) Η> U Ο W οτι <ϋ uφ οο νο Γ" r* rH I Μ LT) γΗ σ>ι ϋ Φ Wφ Ί3ο γΗ Φ Ό Ο Sοβ
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    C3) E $ Q S Φ μ• β Φ Φνο β γ| co co 'xj- OJ v* o OOP co -ΝΪ- CM 'S— "Τ 'τ O o o o o O o Ο ο o o o o Razão G/C ο Λ β β Ο ·Η Φ Ο -μ Η Φ π) A Μ tó st
    —ή—veículo (-controlo) 50ug/kg Sigma ST(toltrolo) o H- CD 1—* 1-5 O O» CTv fl> cr co CD *-o O CD" n Ό CD c-t- tO H- O O CO 1—1 Ϊ3 co ri- 1— - CD tJ CO ct- r-t- CD H- <-*- 1-*- P> M 1— PI C*- (D o co o> •s c-l- 1—* - H- Í3 1-*- tr- o o §> £3 C-t- CD £3 O β τ / ε χ icí / ε 9 /. T L 6 T <33 EP 1 911 763/PT 14/19 Efeito do MD-1100 sobre a dor num Ensaio O-P (d u o c UiPQ 5 Eh o 0 (d-P u 0) u u o H O U O *(d Ui • β Γ" φ -P (d m P -H&Q Η d) fc Ό
    o o . + O) m z Número de contracções abdominais (5 min) p<0,05 em comparação com valor de veiculo' * ΕΡ 1 911 763/ΡΤ 15/19 Ο TJ ω Η (ϋ Μ 0 0 w CO 0 H Λ > ϋ Η co P 0 (d > u H -P g A d) (D 0 10 rl (D 0 *0 0 O tí n rl 0 •P d < <D T3 W 0 0 -P H H (d 0 (0 M-l G H (d 00 c (d LT) U rH P cr» 1 rl b §
    MD-915 Indcmetacina Número de torções MD-1100
    J.d/Ç. 9 /. TX6 T <33 EP 1 911 763/PT 17/19 Ligação Competitiva de Radioligandos do
    -1100, Log (M) (M ® h» W3 CSJ 125 I-MM-416776 (%B/B0) • <7> O (0 O u rl 3 H D) 1 H Q § Tempo (ιίη) * Limite de deteeção 0,061 pg/ml (40 nM) * Dosagem a 10 mg/kg tr o> ca a> pj Cu o
    (χτιι/βτΐ) o-eí>-Bccq.u©ouo3 ——e» CD «=»
    ca >- Figura 10a. Absorção Sistémica Mínima do MD-1100 β T / 8 X J.<3/e 9 Z. X T 6 X da EP 1 911 763/PT 19/19 10b. Absorção Sistémica Minima do MD-1100 W SN U A I § í d <d u Q) P w as η Λ
    de detecção 0,00063 pg/ml (0,6 nM) i a 10 mg/kg Concentração (pg/ml) <1) -P H a H PI bi π) w o Q * *
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